epidemiología de las infecciones asociadas a shigatoxinas dr. eduardo l. lópez hospital de niños...

Epidemiología de las Infecciones asociadas a

Shigatoxinas

Dr. Eduardo L. López

Hospital de Niños “Dr. Ricardo Gutiérrez”

Universidad Del Salvador

E.coli Enterohemorrágica (EHEC)Caracterización

Se les ha dado el nombre de EHEC por su capacidad de producir brotes de colitis hemorrágica

Como producen una potente citotoxina, Shigatoxina, también se las ha llamado STEC

Estas bacterias se diseminan por vía fecal-oral

Es muy bajo el número de organismos necesarios para producir infección (102 - 202)

EHECPatogenia y Factores de Virulencia

Shigatoxinas (Stxs)

Factor de adherencia intestinal: “intimina”, proteína de membrana externa

Enterohemolysina

Plásmido de O157?

Otros factores de virulencia potenciales: LPS, transporte de Fe++

Shiga Toxins (Stxs): Major Characteristics

Stxs: Are the major virulence factor and a defining property of EHEC. They are a family of shigatoxins, being the most common members Stx1 and Stx2

Structure:

Two unitsTwo units

AA

B: binds the toxin to the specific B: binds the toxin to the specific

receptor Gbreceptor Gb33

AA11 peptide: contains the activity peptide: contains the activity

AA22 peptide: binds the A peptide: binds the A11 to B to B

Stxs are encoded on a phase inserted into the chromosome

Comparison of Stx1 and Stx2

Citrobacter freundii, Enterobacter

S. dysenteriaeOther bacteria

More toxicLess toxicHRMVE

====Verocell toxicity

No affected by iron conc.

High iron conc.Synthesis

idem55 % vs. Stx2AA Homology

Stx2Stx1Factor

Infecciones por STEC en humanosEspectro Clínico

Portadores asintomáticos Diarrea acuosa Diarrea con sangre colitis hemorrágica Cólicos abdominales (50-70%); prolapso rectal (10%);

vómitos (30-50%) Complicaciones Invaginación intestinal

Apendicitis

Formas Incompletas SUH

SUH

Clinical Illness in STEC Infection

Incubation period: 2-4 days (inoculum: 102-202

organisms)

First manifestations are usually non-bloody

diarrhea, abdominal cramps. At the 2nd/3rd day of

illness bloody diarrhea develops with low fever.

Cramps are an important findings in infants and

children

If no complication develops, the disease usually

resolves within a week

Epidemiologic Patterns in HUS

Three epidemiologic patterns have been described:

Outbreaks and clusters cases: mainly associated with water and food-borne infection with diarrhea, ie: USA, U. Kingdom, Japan,etc

Endemic cases: with an increase of number of cases during spring and summer seasons, ie: Buenos Aires (Argentina), Alberta (Canada), Baviera (Germany)

Sporadic cases: are observed throughout the world

Incidence of Hemolytic Uremic Syndrome in Different Areas of the World

0

5

10

15

20

25

Children 4 years. Incidence per 100,000

King CountyWashington

Oregon AlbertaCanada

UnitedKingdom

Buenos AiresArgentina

Chile Uruguay

Etiological agents in patients with Diarrhea in Buenos Aires

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Shigella EHEC Salmonella Campy EPEC Other

Microbiology and infectious Diseases Division

%

Características y Objetivos del Estudio

• Estudio Prospectivo Estacional de Niños con Diarrea, seguidos los días 0,2,3, 5 y 10 días.

Objetivo

• Para establecer incidencia de diarrea por E.coli productores de Shigatoxinas y factores de riesgo de desarrollar SUH.

STEC Infections in Argentina

• Site: Hospital de Niños “Ricardo Gutiérrez”

Buenos Aires• Screened Patients: N= 1692

• Screening Methods:– Premier O157/Immunocard STAT– Premier EHEC – PCR (stx1 and stx2)

Buenos Aires, Argentina

Riesgo de SUH en pacientes con Diarrea

Población en Estudio*

Período de Estudio: 1/98 - 12/00

Pacientes estudiados N=1338

Diarrea con sangre N= 819 (61.2%)

Diarrea acuosa N= 519 (38.8%)

* Centro: Hospital de Niños “Ricardo Gutiérrez” - Buenos Aires

Synsorb Study - Site Buenos Aires Patients Enrollment

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Jan Feb Mar Apr May Jun Jul Aug Sep Oct Nov Dec

Period of Study: Jan 1998 - May 2000Cumulative Data by Month


Riesgo de SUH en pacientes con Diarrea

Población en Estudio

62.1

38.8

0

10

20

30

40

50

60

70

Diarrea con sangre Diarrea acuosa

Período de Estudio: Enero´98 - Diciembre´00

N=1338

Hospital de Niños - Buenos Aires

%

Diarrea asociada a STECPoblación en Estudio

819

199

519

41

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

Diarrea con sangre Diarea acuosa

Nú

mer

o d

e ca

sos

N=1338

Período de Estudio: Enero´98 - Diciembre´00

Diarrea asociada a STEC


24,3% 7,9%

STEC Associated DiarrheaO157 vs. NON-O157 Infections

34.5

65.5

10.5

89.5

0

20

40

60

80

100

Bloody Diarrhea Watery Diarrhea

O157 NON- O157

%


STEC Infections Rate of O157 strains

Site: Hospital de Niños “R. Gutiérrez”

34.5

65.6

30

70

10.5

89.5

0102030405060708090

BD (60/174) HUS (32/107) WD (4/38)

O157 Infections NON-O157 Infections

%


STEC Infections in ArgentinaAge Distribution

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0-6 13-18 19-36 37-48 49-72 73-96 97-120 >120

BD-Stx(+) (N=224) WD-Stx(+) (N=99) HUS (N=69)

7-12

%

BD: p<0.03

HUS: p=0.00002

months

Hospital de Niños - Buenos AiresIDSA 1999 - Philadelphia, USA

Diarrea Sanguinolenta y Riesgo de SUH

Diarrea con sangre: N=819

STEC-Diarrea con sangre: N= 199

SUH

si no

si 19 180

D.S.

no 1 619

p<0.0000001 X2= 51.84


Risk of HUS in STEC-Diarrhea

Nº of patients: 668*

* Prospective follow-up in STEC-Diarrhea (Day 0, Day 3, Day8, and Day 14)

NoYes

1571WD-Stx(+)

48723BD-Stx(+)

HUS

p=0.04RR:7.1OR:7.4


Risk of HUS in Bloody Diarrhea

Nº of patients: 1318+

NoYes

8035Stx(-)

48723Stx(+)

HUSBloody Diarrhea

* Prospective follow-up in STEC-Diarrhea (Day 0, Day 3, Day 8, and Day 14)

p<0.000005RR:7.3OR:7.6


Tipo de Shigatoxinas aisladas en Pacientes con SUH (I)

Stx(+): 149 (62.1%)

N= 240

Stx (-): 91 (37.9%)

Técnicas de detección de toxina: Cultivo Celular (Ensayo de citotoxicidad con neutralización)Métodos de Diagnóstico RápidoPCR

Se identificó tipo de toxina en 104/149 (69.8%)


Tipo de Shigatoxinas aisladas en pacientes con SUH (II)*

22,6

50,9

17

0

10

20

30

40

50

60

Stx-I Stx-II Stx-I/II

%

(n=24) (n=54) (n=18)

* Hubo 8 pacientes con SUH que presentaron cepas con Stx-II y cepas con Stx-I/II En 2 pacientes no se pudo identificar tipo de toxina


N=106

Metodología: Cultivo Celular c/neutralización y/o PCR

Type of Toxin in Patients with HUSCenter: Hospital de Niños “R. Gutiérrez”

5.7

68.6

25.7

0

10

20

30

40

50

60

70

I II I/II

N=70*%

*PCR positivePeriod of Study 1997 - 2000 Buenos Aires, Argentina

Riesgo de SUH en pacientes con Diarrea con Sangre según Tipo de Toxina

18

0

132

19 152

0

20

40

60

80

100

120

140

I II I/II

Nú

mer

o d

e ca

sos

N=165

Período de Estudio: Enero´98 - Diciembre´00Definición tipo de Toxina: PCR Hospital de Niños - Buenos Aires

SUH

Evidencia de Citotoxinas en Convivientes

Correlación entre tipo de toxina en caso índice (SUH) vs. convivientes = x2 35.32

p < 0.0001

Citotoxina libre en materia fecal (+) se correlacionó con serología (+) en convivientes 18/20 (90%) vs. 21/35 (60%)

p < 0.02

SLT-I y/o II en

Materia fecal

Madres: 16/30

Hermanos: 5/9vs. Padres: 4/25

López EL y col. Pediatr Infect Dis J 1991; 10:20-4

p < 0.05

Value of Rapid Methods to Detect Shigatoxin-producing E.coli (STEC) Infections in Children

with Diarrhea and HUS in Buenos Aires From Jan, 1998 to Dec, 2000, 1338 stool samples from patients less than 5 days of diarrhea, were studied for diagnosis of STEC infections. During the same period 105 HUS patients also were studied.

All samples were tested by:• SMAC Culture

• Premier E.coli O157 or Immunocard STAT O157

• Premier EHEC

• PCR for stx genes (swab from MacConkey sorbitol plates culture or E.coli isolates)

IDSA 2001 - San Francisco, USA Hospital de Niños - Buenos Aires

Sensitivity and specificity of SMAC Culture vs. Premier O157/Immunocard STAT O157

in Patients with Diarrhea and HUS

No. of cases: 1443SMAC Culture(+) (-)

(+) 63 14Premier O157

ImmunocardSTAT (-) 2 1364

OR: 30.69 Chi square:1130.3 p< 0.0001

Sensitivity: 96.9%Specificity: 98.9%Predictive Positive Value: 81.8%Predictive Negative Value: 99.8%

Hospital de Niños - Buenos AiresIDSA 2001 - San Francisco, USA

Sensitivity and specificity of Premier O157/ Immunocard STAT O157 vs. PCR in HUS patients

No. of cases: 105Premier O157/Immunocard STAT O157

(+) (-)(+) 13 21

PCR(-) 1 62

OR: 38.38 Chi square: 24.02

p< 0.0001Sensitivity: 92.8%Specificity: 74.6%Predictive Positive Value: 38.2%Predictive Negative Value: 98.4%


Sensitivity and specificity of Premier EHEC vs. PCR in E.coli O157 Diarrhea Children

No. of cases: 69/1338Premier EHEC(+) (-)

(+) 56 3PCR

(-) 2 8 OR:74.67

Chi square: 35.81

p<0.0001Sensitivity: 97%Specificity: 73%Predictive Positive Value: 95%Predictive Negative Value: 80%


Sensitivity and specificity of Premier EHEC vs. PCR in E.coli NON-O157 Diarrhea Children

No. of cases: 1269Premier EHEC(+) (-)

(+) 95 24PCR

(-) 46 1104

OR: 95 Chi square: 627.89 p<0.0001

Sensitivity: 73%Specificity: 98%Predictive Positive Value: 80%Predictive Negative Value: 96%


Factores de Riesgo Hematológicos

en Análisis de Rutina

White Blood Cell Count as Risk to Develop HUS/Incomplete HUS in BD-Stx(+)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

BD-Stx(+) HUS

WB

C c

ount

(Mea

n) (x

109 /L

)

(N= 118) (N=62) P<0.000001Chi: 26.9BD: WBC (X ± SD): 11.5 ± 4.6 (x109/L)

HUS: WBC (X ± SD): 15.9 ± 5.8 (x109/L)

IDSA 1999 - Philadelphia, USA Hospital de Niños - Buenos Aires

Valores de Plaquetas en pacientes con Formas Incompletas de SUH*

0

50

100

150

200

250

4.2 (±1.8) 13.8 (±5.8)

Pla

qu

etas

x 1

000

Días después del comienzo de la Diarrea

p=0.02

* López E L et al: J of Pediatrics, 1995Hospital de Niños - Buenos Aires

Risk Factors to develop HUS

Age: < 5 years

Bloody Diarrhea

Bloody Diarrhea Stx(+)

Shigatoxin Type II (Stx-II)

White Blood Cells Count >15.000/mm3


Síndrome Urémico Hemolítico:Es una Enfermedad Prevenible ?

Opciones:

• Cambios culturales en la cocción de la carne

• Uso de antibióticos y/o quimioterápicos que no

causen aumento en la producción de toxina

• Decontaminación de carnes y/o ganado en pie

• Uso de análogos del receptor (Synsorb-Pk®)

• Anticuerpo monoclonales: TMA-15 (contra VT2)

• Vacunas

Análisis Preliminar del Estudio Fase III de SYNSORB PK

TIPO DE ESTUDIO: ESTUDIO FASE III, MULTICENTRICO, RANDOMIZADO DOBLE CIEGO VERSUS PLACEBO

OBJETIVO DEL ESTUDIO: DETERMINAR LA EFICACIA DE SYNSORB EN LA PREVENCION DE SUH

PUNTO PRIMARIO DE EVALUACION: DESARROLLO DE SUH

POBLACION ESTUDIADA: 526 niños

PACIENTES ESTUDIADOS EN ARGENTINA: 306 niños (58.2%)

263 (50%) SYNSORB

263 (50%) PLACEBO

526 niños con diarrea

RESULTADOS PRELIMINARES DEL ESTUDIO SYNSORB PK VS. PLACEBO

RESULTADOS PRELIMINARES DEL ESTUDIO

SYNSORB PK VS. PLACEBO

RESULTADOS EN EL TOTAL DE PACIENTES ENROLADOS:

En los 526 niños con diarrea STEC (+) tratados dentro de los cinco días de comienzo de la diarrea, no hubo diferencias significativas entre el grupo que recibió SYNSORB PK vs. PLACEBO.

Solo se observó una tendencia limitada de mayor eficacia en el grupo SYNSORB PK.

RESULTADOS PRELIMINARES DEL ESTUDIO SYNSORB PK VS. PLACEBO

PACIENTES INCORPORADOS DENTRO DE LAS 48 HORAS DE APARICION DE LA DIARREA

N= 152 niños con Diarrea STEC (+)

SYNSORB PK

N = 71

PLACEBO

N = 81

0102030405060708090

100

Synsorb Pk Placebo

Evolución Adecuada

SUH

Resultados Preliminares del Estudio Fase III de

SYNSORB PK VS. PLACEBO

P =0.05

N=67

N=14

N=5

N=66

SYNSORB PK DISMINUYO EL RIESGO VS. PLACEBO EN 59%, EN PACIENTES CON 48hs DE DIARREA

%

Diarrea asociada a STECOpciones Terapéuticas

Análogos del Receptor para Shigatoxinas (Gb3)? (Synsorb-Pk™), “Starfish”.

Solamente?Asociado con antibióticos?

Antibióticos solamente?

Anticuerpos Monoclonales Humanizados?

Vacunas?

Tratamiento C/ATB de Diarrea por Tratamiento C/ATB de Diarrea por E.coliE.coli O157 y Riesgo de SUH * O157 y Riesgo de SUH *

Nº de infectados por Nº de infectados por E. coliE. coli O157: 71 niños O157: 71 niños SUH: 10 (14%) SUH: 10 (14%)

* Wong C., et al: N- Engl. J. Med 2000; 342 : 1930-6* Wong C., et al: N- Engl. J. Med 2000; 342 : 1930-6

Característica % de SUH Nº de Casos/Total pac.

p

Diarreasanguinolenta

12 8/64 ns

Rto de blancos(> 9.000/mm3)

19.3 10/53 0.005

Antibióticos Si 56 5/9 0.001

Antibióticos No 8 5/62 0.001

Uso de TMS-SMX y Riesgo de SUH en Uso de TMS-SMX y Riesgo de SUH en pacientes con diarrea sanguinolentapacientes con diarrea sanguinolenta

COTRIMOXAZOL

SISI

NONO

11 411 4

223 17223 17

p=0.025p=0.025

SUHSUH

SI NO

Efecto de ATB/ Quimioterápicos vs. Efecto de ATB/ Quimioterápicos vs. Riesgo de SUH en niños con diarrea Riesgo de SUH en niños con diarrea

sanguinolentasanguinolenta

ATB

SISI

NONO

38 238 2

196 18196 18

p=0.74p=0.74

SUHSUHSI NO

O157 O111 O26 O103

Stx Stx

1 2 1 2

Stx-1 Stx-1

Ciprofloxacina

TMP-SMX

Ampicilina

Fosfomicina

Efecto de los antibióticos sobre la Efecto de los antibióticos sobre la producción de Shigatoxinas producción de Shigatoxinas in vitroin vitro

Quinolonas y Producción de Toxinas Quinolonas y Producción de Toxinas in vitro **in vitro **

Stx Concentración ng/ml Nº de cell (ufe/ml x 106)

Tiempo(hs.)

Control Cpx Fosf. Control Cpx Fosf.

0 30 30 30 114 114 114

3 301 5.325 231 1930 4.5 34

6 1406 81.800 522 4600 0.3 4.200

Se utiliza E.coli O157 (cepa 1:361 R) en cultivo de 8-12 hs.

** Zhang X. et al. JID 2000; 181:664-70

Quinolonas y Producción de Toxinas Quinolonas y Producción de Toxinas en Ratones * en Ratones *

* Zhang X. et al. JID 2000; 181:664-70

• Aumento de la excreción fecal de StxAumento de la excreción fecal de Stx

* * CIPROFLOXACINACIPROFLOXACINA en 6/6 ratonesen 6/6 ratones

* * FOSFOMICINA FOSFOMICINA en 6/6en 6/6

• Mortalidad en ratonesMortalidad en ratones

* * CIPROFLOXACINACIPROFLOXACINA: : 4/6 muertes, aquellos con mayor 4/6 muertes, aquellos con mayor excreciónexcreción

* * FOSFOMICINAFOSFOMICINA: : no mortalidadno mortalidad

* * PBSPBS: : no mortalidadno mortalidad

Caracterización Genes de Shigatoxina circulante en Buenos Aires

• Estudio realizado en cepas de STEC aisladas de pacientes con Diarrea con Sangre y en pacientes con SUH

• Característica de las cepas: PCR-Stx (+)

• Método de Estudio: PCR y análisis RFLP (enzimas de restricción)

Abstract Submission IDSA 2002 Hospital de Niños - Buenos Aires

Tipos de ToxinaMuestras de Materia Fecal PCR (+)

12.1

87.9

7.9

92.1

0

20

40

60

80

100

Diarrea con Sangre SUH

Stx-1 Stx-2

%

Abstract Submission IDSA 2002 Hospital de Niños - Buenos Aires

(n= 99) (n=38)

Caracterización de genes para Shigatoxina*

Diarrea conSangre

SUH

Pacientes 53 27

AislamientosPCR (+)

225 114

* Aislamientos con PCR-Stxs (+)

Hospital de Niños - Buenos AiresAbstract Submission IDSA 2002

Variantes de Genes de Stx-2según cuadro clínico

63,1

28,5

7,11,3

69,3

30,7

0 00

10

20

30

40

50

60

70

Diarrea con sangre SUH

Stx-2 + Stx-2a Stx-2 Stx-2 + Stx-2b Stx-2b

Hospital de Niños Buenos Aires

%

Abstract Submission IDSA 2002

Variantes de genes para Stx-2en cepas de E.coli O157 vs. No- O157

Pacientes con Diarrea con Sangre

30

20

21

0

5

10

15

20

25

30

E.coli O157 E.coli No-O157

Stx-2 + Stx-2a Otras variantesP<0.0000001


Nú

mer

o d

e ce

pas

Abstract Submission IDSA 2002

Conclusiones El genotipo Stx-2 + STx-2a fue prevalente en

pacientes con Diarrea con Sangre (63.1% y en pacientes con SUH (69.3%)

El genotipo Stx-2 + Stx-2b y Stx-2b no se encontraron en pacientes con SUH

El genotipo STx-2 + Stx-2a fue más frecuentemente encontrado en cepas de E.coli O157 que en cepas No-O157 (p<0.0000001)


Estos datos preliminares sugieren que el uso de Anticuerpos Monoclonales como terapéutica potencial, deberían neutralizar los genotipos stx-2 y/o stx2 + stx-2a en Argentina


Infecciones por STEC Estudio prospectivo en niños de 6 meses a 14 años

Período de estudio: Enero 1998 - Abril 2000

(septiembre-abril)

Pacientes en Screening: n=1654

Tipo de diarrea: Con sangre 61.8%Acuosa 38.2%

Risk of HUS/Incomplete HUS in STEC-Diarrhea

HUS/Incomplete HUS

Yes No

BD-Stx(+) 25 306

WD-Stx(+) 1 131P<0.008

RR: 10OR: 10.7

+Prospective follow-up in STEC-Diarrhea (Day 0, Day 3, Day 8, and Day 14)

No. of patients: 463+

Risk of HUS/Incomplete HUS in Bloody Diarrhea

HUS/Incomplete HUS

Yes No

Stx(+) 25 306Bloody

Diarrhea

Stx(-) 9 624

P<0.000002RR: 5.3OR: 5.7+Prospective follow-up in STEC-Diarrhea (Day 0, Day 3, Day 8, and Day 14)

No. of patients: 964+

Métodos de Estudio

Métodos de Screening SMAC agar Premier O157 (Meridian Diagnostic, Co.) Immunocard Stat O157 Plus (Meridian

Diagnostic, Co) Premier EHEC (Meridian Diagnostic, Co) Latex Test Agglutination E.coli O157 (Oxoid)

Tests Confirmatorios PCR (para genes stxs-I y II, eaeA y hlyA )

Study Population

Patients were studied during spring and summer season

13.5 %317.9 (118.2)51Healthy Adults

42.7 %73.6 (47.6)202Healthy Children

57.1 %29.7 (30.2)811Watery Diarrhea

54.2 %33.4 (28.2)1318Bloody Diarrhea

48.2 %17.9 (11.3)240HUS

Sex (Male)Age (months)

X ( SD)

NºGroup

STEC Infections: Outbreaks and Endemic Disease

Reported

outbreaks

USA: 139 E.coli O157 between 1982-1996

England and Wales: 55 STEC between 1983-

1996

Canada: 316 E.coli O157 between 1982-1995

Continental Europe: 17 STEC were reported

from nine countries

Endemic

disease

Argentina

Chile

Baviera (Germany)

Type of Toxin in Patients with BD (Synsorb Study)

Center: Hospital de Niños “R. Gutiérrez”

6,7

80,9

12,4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

I II I/II

N=89*%

*PCR positivePeriod of Study 1998 - 2000 Buenos Aires, Argentina

Riesgo de SUH Según Tipo de Toxina

0

14,413,3

0

2

4

6

8

10

12

14

16

I II I/II

N=165

Período de Estudio: Enero´98 - Diciembre´00Definición tipo de Toxina: PCR Hospital de Niños - Buenos Aires

%

• Premier E.coli O157/Immunocard STAT O157: directly from raw stool. The test is a rapid invitro microwell procedure for the qualitative determiantions of Escherichia coli O157 antigen in feces. It was used as a screening tool to allow rapid presumptive determination follows SMAC culture plates.

• SMAC Culture: for identification of non-sorbitol fermenter colonies, and E.coli strains isolation (sorbitol fermenters and non-fermenters).

• Premier EHEC: it was used as a rapid in vitro microwell EIA for detection of stx-1 and stx-2 in stool specimens and MacConkey broth culture.

• PCR assay: it was performed on DNA obtained from swab of SMAC culture plates and/or 10-20 E.coli isolated strains. Multiplex PCR using Strockbine´s primers were used to detect stx-1 and stx-2 genes. After amplification, a 894 bp and 478 bp fragment for Stx-1 and 2 were observed, respectively.

Conclusions

STEC infections are more frequent in Bloddy Diarrhea than Watery Diarrhea (p<0.0001)

Non-O157 STEC infections are more common than O157 infections in Argentina (p=0.003)

Premier EHEC sensitivity and specificity was 97% and 73% in O157 infections in children with diarrhea and 92.3% and 98.8% in HUS with O157 infections

Premier EHEC sensitivity and specificity was 73% and 98% in Non-O157 infections in diarrhea patients and 65% and 84.5% in HUS patients with Non-O157 intfections, respectively

There is a high correlation between SMAC Culture (confirmed by Oxoid Latex Agglutination test for E.coli O157) vs. Premier O157 / Immunocard STAT O157, in children with Diarrhea and HUS patients

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