INTRODUCCION

En el pasado laboratorio trabajamos con enzimas más específicamente con la fosfatasa ácida de aorta de bovino en donde medimos la velocidad enzimática, determinamos la temperatura y la concentración a la cual la enzima tiene un mayor grado de eficacia.

Antes de iniciar la parte experimentar tenemos que tener claro que es una enzima, esta la podríamos determinar como una sustancia en su mayoría proteica en donde su función más conocida es la de catalizadoras, es decir en palabras más simples son facilitadoras de muchas reacciones químicas que ocurren en nuestro organismo en donde podríamos dar como dato que existen más de tres mil clases de ellas.

En cualquier r4eaccion enzimática, si la concentración de enzima es mayor, el porcentaje que se genera también es mayor por unidad de tiempo y la velocidad de la reacción es directamente proporcional al incrementar la concentración de la enzima, todo esto a condiciones optimas del sustrato (que no se agote). (1)

Distintos factores pueden ser participe en la variación de la velocidad con la que la enzima transforma el sustrato en producto, por ende, las variaciones en estos factores pueden ocasionar cambios en dicha velocidad de transformación. (2)

Dentro del laboratorio se trabajara con p-nitrofenilfosfato, MgCl2, buffer (pH= 5.6), agua y enzima. Fueron sometidos a distintos procesos metódicamente ordenados, tomando en cuenta la absorbancia ( con el espetrofometro a 410 nm), de esta forma poder determinar la variación de reacción según la concentración de la muestra.

Objetivos:

- Cuantificar la velocidad de una reacción enzimática- Aplicar los conceptos teóricos adquiridos en la caracterización de una enzima.- Determinar Km. y Vmáx de la fosfatasa ácida de aorta de bovino- Cuantificar la velocidad de la reacción enzimática en presencia de un inhibidor.

Finalmente teniendo en claro estas propiedades al utilizar una enzima pudimos comenzar con nuestro laboratorio.

MATERIALES Y REACTIVOS

1 Materiales

30 tubos de ensayo.

3 gradillas. Set de micropipetas.

Pipeta de 5ml.

Unespectrofotómetro Baño

termorregulador

Placa calefactora. Hielo.

Parafilms

2 a) Reactivos para medir los efectos de la temperatura en la reacción:

- Solución tampón citrato pH: 3; 4; 5, 6; 7,5; 9.

- Solución p-nitrofenilfosfato 30 mM

- Solución MgCl2 50 mM

- Solución de TCA al 30%

- Solución de NaOH 0,1

2 b) Reactivos para medir los efectos de la concentración en la reacción:

- solución tampón citrato pH: 5,6

- solución p-nitrofenilfosfato 30 mM

- solución de TCA al 30%

- solución de NaOH 0,1 M

METODO

1) Efectos de la temperatura en la reacción enzimatica

- Se prepararon 7 tubos de ensayo y se le aplicaron los siguientes reactivos por triplicado:

Volumen reactivo Blanco Control (0°c, 37°C,

80°c)

Muestra (0°c, 37°c,

80°c)

p-nitrofenilfosfato 0 1.0 1.0

MgCl2 0.5 0.5 0.5

buffer pH 5,6 2.5 2.5 2.5

Agua 2.0 2.0 2.0

Enzima 0 0 1.0

- Se mezclo cada tubo por inversión suavemente e incubo por 30 minutos a las temperaturas indicadas: a 0°c (en hielo), a 37°c (t° ambiente) y a 80°c (en un baño termo regulado).- Ya transcurridos los 30 minutos, se agrego a los tubos 1 mL de TCA al 30% y se dejaron en hielo por 5 minutos.

- Pasado los 5 minutos se tomo una alícuota de 1ml de cada tubo y se agrego a un tubo nuevo (uno para cada muestra) y a cada uno de estos se les agrego 5ml de NaOH 1M.

- Luego procedimos a medir la absorvancia de cada muestra en el espectrofotómetro.

2) Efectos de la concentración en la reacción enzimatica.

- Tomamos 5 tubos de ensayos y le aplicamos los siguientes reactivos con los mL indicados. Los tubos los identificamos previamente

Volumen Blanco 1 2 3 4p-nitrofenilfosfato - 0.5 1 1.5 2

MgCl2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5buffer pH 5,6 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5

Agua 2 1.5 1 0.5 0Enzima 1 1 1 1 1

- Incubamos por 30 minutos a temperatura ambiente

- Pasados los 30 minutos le aplicamos 1ml de TCA al 30%* y lo dejamos en hielo por 5 minutos.

- Tomamos 5 tubos y le agregamos 5 mL de NaOH 1 molar y un 1 mL de los tubos previamente trabajados.

- Tomamos los tubos y los sometimos al espectrofotómetro a 410nm y anotamos los resultados de la Absorbancia que nos dio.

RESULTADOS Y DISCUSIONES

1) Resultados:

a) Efectos de la temperatura en la reacción enzimatica.

Absorvancia real de la muestra: (formula: abs. Mayor – abs. Menor)

Muestra a 0°C = 0,193 – 0,113 = 0,08.

Muestra a 37°C = 0,387 – 0,347 = 0,04.

Muestra a 80°C = 2,212 – 2,165 = 0,05.

Concentración del producto: (formula: Abs. / 17500)

muestra a 0°C : 0,08 / 17500 = 4,571^-6

muestra a 37°C: 0,04 / 17500 = 2,285^-6

muestra a 80°C: 0,05 / 17500 = 2,857^-6

Velocidad de la reacción: (formula: V = C / t) ( t= 3º min

muestra a 0°C: 4,571^-6 / 30 = 3,65^-6

muestra a 37°C: 2,285^-6 / 30 = 2.34^-4

muestra a 80°C: 2,857^-6 / 30 = 6,13^-5

concentración muestra: (formula: C1 * V1 = C2 * V2)

30mM * 7ml = XmM * 6ml 30mM * 7ml = 35mM

6ml

Tabla con resultados finales

N° de tubo a T°C Abs 410nm a T° [muestra inicial] [producto] Vel. De reacción

Muestra Abs 410nm

Blanco 0

Control 0°C 0,193

Control 37°C 0,387

Control 80°C 2,212

Muestra 0°C 0,113

Muestra 37°C 0,347

Muestra 80°C 2,165

0°C 0.08 35mM 4,571^-6 3,65^-6

37°C 0.04 35mM 2.34^-4 2.34^-4

80°C 0.05 35mM 2,857^-6 6,13^-5

Discusión

Luego de analizar los resultados y comparándolos con lo que nos dice la bibliografía de referencia nos damos cuenta que existen datos que n o reflejan lo que se supone de viese pasar.

Se supone que según el comportamiento de la enzima, la temperatura tiene un efecto proporcional en la reacción, por lo que si la temperatura aumenta la reacción enzimatica también; por ende la velocidad de reacción debería haber sido mayor a los 80°C que a los 37°C (T° ambiente). En nuestro caso el resultado fue otro: a los 37°C nos dio una Vmax de 2.34^-4 (0,000234) y a los 80°C la Vmax resultante fue de 6,13^-5 (0,0000613), valor mucho menor al de la otra temperatura; lo que nos da a pensar que durante la realización del practico pudieron haber ocurrido 2 “ fenómenos”:

1. Que entre la temperatura existente entre 37°C a los 80°C se haya llegado al punto máximo de la reacción por lo que si se aumenta la T° esta no seguirá aumentando ( la velocidad de reacción); pero esta idea fue rechazada, ya que se supone que al alcanzar la Vmax la T° no varia si no que se mantiene constante. (3)

2. Haber incurrido en una falla de manejo del laboratorio, una falla humana.

Recordando la sucesión de los pasos que se realizaron durante el experimento y lo que dictaba el protocolo de la guía nos dimos cuenta que hubo un error al momento de prepara los controles; la composición de estos debía ser: p-nitrofenilfosfato 1ml; MgCl2 0,5ml; buffer pH 5,6 2,5ml; H2O 2ml y no se le agregaba enzima. Nuestro error fue agregar 1ml de enzima a los controles, lo cual provoco que al momento de calcular la absorvancia real para realizar los otros cálculos, fuese mucho lo que debimos restarle a la absorvancia obtenida de la muestra por lo que la absorvancia real obtenida fue menor y por ende todos los otros resultados de los cálculos siguientes fuesen menores.

b) Efecto de la concentración del sustrato

Para realizar esta parte del laboratorio fue necesario tener 5 tubos de ensayo con los siguientes químicos.

Volumen Blanco 1 2 3 4p-nitrofenilfosfato - 0.5 1 1.5 2

MgCl2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

buffer pH 5,6 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5Agua 2 1.5 1 0.5 0

Enzima 1 1 1 1 1

.Para calcular la concentración de sustrato fue necesario utilizar la siguiente formula:

C1 * V1 = C2 * V2

Teniendo en cuenta que la concentración de p-nitrofenilfosfato es de 30 nM (C1) y que el volumen 2 de todos los tubos fue de 6ml

Cálculos

TUBOS DESARROLLO RESULTADO

1 30*0.5= C2 * 6 15=C2*6 15/6= C2 2.5 = C2

2 30* 1 = C2 * 6 30=C2*6 30/6= C2 5= C2

3 30*1.5 = C2 * 6 45=C2*6 45/6= C2 7.5= C2

4 30* 2 = C2 * 6 60=C2*6 60/6= C2 10= C2

TUBOS Concentración del sustrato

1 2.52 53 7.54 10

Dadas las concentraciones de sustratos procedimos a calcular la Absorbancia a 410nm, para lo cual es necesario utilizar un espectrofotómetro. El tubo Blanco se leyó en el espectrofotómetro pero no se le realizan más cálculos. Los valores de Absorbancia fueron de:

TUBOS Concentración del sustrato

Absorbancia a 410 nm

1 2.5 0.2192 5 0.2503 7.5 0.2714 10 0.280

Para calcular la concentración producto Nm, es necesario dividir la Absorbancia en 17500, teniendo los siguientes resultados:

TUBOS Concentración del sustrato

Absorbancia a 410 nm

Concentración Producto nM

Velocidad de

reacción1 / [ S] 1/V

1 2.5 0.219 1.251-5 *2 5 0.250 1.429-5 *3 7.5 0.271 1.549-5 *4 10 0.280 1.6-5

* Valores aproximados en el tercer decimal

Para realizar el cálculo de la Velocidad de reacción es necesario dividir la concentración de producto nM con la delta tiempo, la cual es 30.

Tubos Calculo Resultados

1 1.251-5 * /30 4.17-7

2 1.429-5 * /30 4.763-7

3 1.549-5 * /30 5.163-7

4 1.6-5 /30 5.33-7

Entonces tenemos:

TUBOS Concentración del sustrato

Absorbancia a 410 nm

Concentración Producto nM

Velocidad de reacción 1 / [ S] 1/V

1 2.5 0.219 1.251-5 * 4.17-7

2 5 0.250 1.429-5 * 4.763-7

3 7.5 0.271 1.549-5 * 5.163-7

4 10 0.280 1.6-5 5.33-7

Para calcular el cuadro de 1/ [S] y el de 1/V fue necesario dividir 1 con el cuadro de concentración del sustrato y 1 con el cuadro de velocidad de reacción respectivamente.

Cálculos

Tubos

1 divididoConcentración

del sustrato

1 dividido velocidad de

reacción

1 0.4 2398081.535

2 0.2 2099517.11

3 0.13- 1936858.416

4 0.1 1.876172.608

De esta es como completamos el cuadro

TU

BO

S

Co

ncen

trac

ión

del s

ustr

ato

Abs

orb

anc

ia a

41

0 nm

Co

ncen

trac

ión

Pro

duct

o nM

Vel

ocid

ad

d

e re

acci

ón

1 / [

S]

1/V

1 2.5 0.219 1.251-5 * 4.17-7 0.4 2398081.535

2 5 0.250 1.429-5 * 4.763-7 0.2 2099517.11

3 7.5 0.271 1.549-5 * 5.163-7 0.13 1936858.416

4 10 0.280 1.6-5 5.33-7 0.1 1876172.608

Grafico

Fue necesario hacer un grafico para poder entender la relación de concentración de sustrato con la velocidad que la enzima tiene para crear producto. Al iniciar la actividad el grafico nos mostró el comportamiento de la enzima, la cual al aumentar la concentración la velocidad aumenta, pero llega un punto en que por mas concentración que se aplique la velocidad no varia demasiado; esta es la Vmax.

La V max corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental, y la KM corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax. 1

Al traspasar los datos a ls unidades de medida correspondientes y graficar según lineweaver – burk obtenemos el siguiente grafico (aportado por compañero de laboratorio).

Discusión:

2.665e-7

En el trabajo práctico tuvimos algunas complicaciones al realizar el trabajo.

El tiempo no fue el indicado para llevar a cabo todo el laboratorio, por lo que fue necesario repartirnos en 2 grandes grupos, los cuales hicimos una parte el trabajo de concentración y el otro grupo el trabajo de temperatura. Aun así con el trabajo repartido el desarrollo del laboratorio fue estrecho ya que al final de este teníamos que sacar los cálculos y esto dificulto mucho, ya que en la guía no explicaba todo como debía ser y el tiempo de los profesores también fue corto.

CONCLUSION

El trabajo práctico fue realizado satisfactoriamente, utilizando los distintos recursos entregados en el laboratorio y tomando en cuenta los distintos riesgos y medidas de seguridad.

Pudimos comprobar con claridad como a una mayor concentración del sustrato, genera mayor producto y por ende la reacción enzimatica aumenta, tomando en cuenta en las distintas muestras la absorbancia, tomándola como referencia para los cálculos básicos que nos ayudaron a determinar la Vmax de la reacción y la concentración tanto de la muestra como la de los productos finales.

En el caso de la temperatura fue solo el hecho de realizar mal la preparación del control lo que no nos permitió ver de manera exacta que a mayor temperatura la reacción alcanzara una mayor velocidad; sin embargo a pesar de eso logramos junto con la bibliografía y lo aprendido en el práctico detectar el error.

BIBLIOGRAFIA

http://books.google.cl/books?id=8SAtkthrFEkC&pg=PA7-IA4&dq=efecto+de+la+concentracion+enzima-sustrato&hl=es&ei=iBXPTZnRKoqDtgfHmejuDQ&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=3&ved=0CDcQ6AEwAg#v=onepage&q&f=false ___________1

http://books.google.cl/books?id=cKGyh_81v-oC&pg=PA448&dq=efecto+de+la+concentracion+enzima-sustrato&hl=es&ei=iBXPTZnRKoqDtgfHmejuDQ&sa=X&oi=book_result&ct=book-thumbnail&resnum=1&ved=0CC8Q6wEwAA#v=onepage&q&f=true___________ 2

González Mañas Juan Manuel “CURSO DE BIOMOLECILAS”. Sección: Calculo de la Km y de la Vmax de una enzima. Disponible en la web: http://www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/enz3.htm#kv _ _ _ _ _ _ _3

INDICE

Introducción y Objetivos 2

Materiales y reactivos 3

Método 5

Resultados y discusión 7

Conclusión 15

Bibliografía 16

LABORATORIO Nº4

ENZIMOLOGIA : Extracción y Caracterización de la Fosfatasa

Ácida de Aorta de Bovino

Integrantes

Bárbara Aguilar

Claudia Araos

Tamy Arriaza

Mitssy Iturriaga

Entrega: 16/05/11