Practica N09NUMERACION, AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE ENTEROCOCCUSI-INTRODUCCIONLos enterococos son bacterias esfricas que forman sus colonias en grupos o cadenas. Se encuentran de manera natural en muchos organismos, incluidos los humanos, como parte de su flora intestinal. Son microorganismos muy resistentes, capaces de tolerar concentraciones relativamente altas de sales y cidos.En muchos estudios, los niveles de concentracin de los enterococos se relacionan con la incidencia de enfermedades adquiridas por baistas y constituyen un indicador muy importante de la contaminacin en las playas y de las aguas salobres. Por presentar una mayor resistencia a la salinidad del agua marina y por el riesgo a la salud que representan, tambin se cuantifican los enterococos.Se han identificado ms de 22 especies del gnero enterococcus; una de las especies que lo constituyen son E faecalis y E. faecium.Estas especies son muy parecidas entre s, pero pueden diferenciarse mediante pruebas fisiolgicas.E. faecalis es resistente al calor y suele ser ms veces de prudencia humana, mientras que E. faecium acta ms en vegetales.Las bacterias de este grupo crecen tanto a 10 C como a 45 C. Los Enterococcus poseen ciertas caractersticas en comn que los convierte en Enterococcus muy particulares, son: termodricos resistiendo fcilmente a temperaturas de pasteurizacin de la leche o incluso otros ms altos. Toleran un % de sal de 65% o superior, crecen a pH de 9,6. Se desarrollan a un intervalo de T amplia, algunos desde los 5-8 C la mayora incluso pueden hacerlo a los 48-55 C.Los enterococcus son cocos Gram. + De cadenas cortas o largas y que se diferencian de los dems cocos Gram. + En que son Catalasa (-).Los enterococcus al igual que los coliformes son de origen fecal y tambin estn presente en vegetales, insectos y en el suelo.

II-OBJETIVOS Familiarizarse con la tcnica de aislamiento de Enterococcus a partir de aguas y alimento deshidratado.

Determinar la numeracin e identificar Enterococcus a partir de aguas y alimentos deshidratados.

Conocer la metodologa ms adecuada para anlisis.

III-FUNDAMENTO TEORICO

El recuento de Enterococcus en los alimentos se lleva a cabo, por lo general, como medio para evaluar la eficacia de los mtodos de limpieza y desinfeccin en las industrias de alimentos, en particular de superficies, para corroborar otras indicaciones de contaminacin fecal y como ndice de calidad microbiolgica general

El procedimiento considerado de modo general como ms satisfactorio lleva consigo tres fases o estadios:a. Recuento presuntivo utilizando Agar Sangre Azida Cristal Violetada de Packer y por la tcnica de recuento Standard en placa por siembra en profundidad.

b. Identificacin confirmativa de las colonias sospechosas, previa purificacin, en agar glucosa tetrazolium acetato de talio (TTC).

IV-MATERIALES Muestra biolgica: agua de acequia (Santa Rosa), leche en polvo a granel.

Medios de cultivo:

Medio para deteccin presuntiva: Caldo Glucosa Azida. Medio de deteccin confirmativa: Caldo EVA. Medio para aislamiento: Agar Enterococcus Pruebas bioqumicas: Caldo triptosa para pH 9.6; NaCl 6.5%, supervivencia a 65C/35, crecimiento a 45C.

Diluyentes: agua estril (para la leche) Tubos de dilucin Placas Petri Gradillas Frascos Tubos para pruebas bioqumicas Pipetas de 1 y 10 mL. Mechero Balanza Incubadora

V-PROCEDIMIENTOPara Leche en polvo1. Primero, pesar 10g y lo diluimos en 90 ml de agua destilada estril, obteniendo la dilucin 10-3

2. Luego, Realizamos diluciones hasta 10-3.

3. Sembrar cada dilucin por duplicado en una placa con Agar selectivo para Enterococos por siembra en profundidad (1 mL de inoculo).

4. Incubar a 35-38C por 24-48 horas.5. Lectura: Deben observarse colonias rojas, con centro rojo o colonias blancas. 6. Luego realizar la identificacin de las colonias a travs de la tincion Gram y otras pruebas como catalasa, crecimiento a 45 C, crecimiento en NaCl 6.5%, crecimiento a pH 9.6, resistencia a 65C/ 35, entre otras.

PRUEBA CONFIRMATIVA Se siembra en medio TTC unas u colonias Se hace las pruebas respectivas : Creen a 45c Crecimiento en bilis Catalasa pH 9.6

Para Agua de acequia1. Para esta muestra, se utilizara el mtodo del NMP (agua) de 3 tubos.

2. Prueba presuntiva: Sembrar diferentes alcuotas de 10 mL, 1mL y 0.1mL en Caldo Glucosa Azida.3. Incubar a 37 C x 24-48 horas.4. Prueba confirmativa: De los tubos positivos en deteccin presuntiva, sembrar una asada en Caldo EVA (Confirmativo).5. Incubar a 37 C x 24-48 horas.6. Lectura: Observar crecimiento o presencia de turbidez con sedimento rojo ladrillo.7. De los tubos turbios continuar el aislamiento llevando al Agar Enterococcus por agotamiento y estra.8. Realizar aislamiento y las pruebas de identificacin respectivas.VI-RESULTADOSPara la muestra de leche en polvo:

10-33310-210-1

No hubo crecimiento de colonias en ninguna de las placas de agar Enterococcus sembradas con la muestra de leche en polvo, lo que nos indica ausencia de Enterococcus en la muestra.

Para la muestra de agua de acequia: Prueba presuntiva:

Sedimento (+)

Se observ crecimiento con sedimento en los 3 primeros tubos de la primera alcuota (10 mL). Por lo que la Numeracin es:3-3-3

Prueba confirmativa y Aislamiento

Tincin GRAM

Se observ crecimiento y precipitado en los tubos con caldo presuntivo, sembrados con la muestra (agua de acequia, y finalmente al sembrar en agar enterococos desarrollaron colonias blancas pequeas, y realizar tincin de GRAM se observ la morfologa propia de Enterococcus sp. Por lo tanto esto nos indica que hay presencia de Enterococcus sp en la muestra analizada.

VII-CONCLUSIONES Se aprendi la Tcnica para el aislamiento de Enterococos a partir de Alimentos (leche en polvo) y aguas (agua de acequia). Se logr la numeracin en tubos con la muestra de agua de acequia. Se logr la deteccin y aislamiento de Enterococcus sp a partir de la muestra de agua de acequia. No se pudo identificar la cepa de Enterococcus sp por falta de las pruebas bioqumicas necesarias. La muestra de leche en polvo a granel no tiene presencia de Enterococcus sp por lo tanto la muestra es apta para el consumo humano.

VIII-REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Medios de Cultivo en Microbiologa: Manual de Laboratorio. Editora Tricelm S.A. 3 Edic. Lima. http://es.wikipedia.org/wiki/Enterococcus http://tierra.rediris.es/hidrored/ebooks/ripda/contenido/capitulo13.html Granados, R. 1997. Microbiologa. Bacteriologa, Medios de Cultivo y Pruebas Bioqumicas. Micologa General. Parasitologa General. Editorial Paraninfo. Aurazo de Zumaeta, Margarita. Lima. Per 2004. Manual Anlisis Bsicos de Calidad del gua de Bebida.

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