ENSAYOS MEDICO SOBRE GENTICALa gentica molecular en la medicina ecuatoriana

Fabricio Gonzlez Andrade

ENSAYOS MDICOS SOBRE GENTICA

La gentica molecular en la medicina ecuatoriana

Fabrcio Gonzlez Andrade 2006

Ensayos mdicos sobre genticaLa g e n t i c a m o l e c u l a r e n la m e d i c i n a e c u a t o r i a n a Fabricio Gonzlez Andrade Derecho d e autor: 023766 Derechos reservados de acuerdo a la ley I S 8 N : 9978-44-646-X Primera e d i c i n : octubre d e 2006

Ficha catalogrfica 575(66) G643

G o n z l e z Andrade, Fabricio Ensayos mdicos sobre gentica; ta gentica molecular en la medicina ecuatoriana i Fabricio Gonzlez Andrade. - Q u i l o , Imprenta N o c i n , 2000. 260,|J: i I us,; tab, 1 . G E N T I C A 2. M E D I C I N A F O R E N S E 3. G E N T I C A M O L E C U L A R 4. E C U A D O R 5. B I O T E C N O L O G A 6, I N V E S T I G A C I N 7. A D N B. P O B L A C I N !. l. II. coa.

J a n e * Cornejo i Ana LMfiadt)

C o r r e c c i n d e testo: Paulina Rodrguez Prohibida BU reproduccin o almacenamiento en un sistema d e recuperacin transmisin de- forma alguna por medio d e cualquier procedimiento sea este me cdnico, electrnico d e fotocopia, grabacin o cualquier otro, sin autorizacin es crita d e los autores. Este documento est protegido por las leyes de propiedad in telectual a nivel internacional. Impreso e n Ecuador - Printcd in Ecuador

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Imprenta N o u n

Coautoras

DORA SNCHEZ Es b i o q u m i c a graduada e n la Universidad Estaial d e Cuenca. Realiz su maestra en Gentica en la Universidad Javcriana (Colombia) y luego un Fellow en Inmunogentica en la Universidad de Harvard EE U U ) . Trabaja actualmente en el Laboratorio de Gentica Molecular del Hospital Metropolitano. MA. B E G O A MARTNEZ-JARRETA Es catedrtica hbililada de Medicina Legal y Forense y Directora del Laboratorio de Gentica Forense d e la Facultad d e M e d i c i n a , e n la Universidad d e Zaragoza (Espaa). Es autora de varias publicaciones a nivel internacional e n el c a m p o de la Gentica Forense y de la M e d i c i n a del Trabajo.

El autor expresa su agradecimiento a adre. forge Luis Borges

Definiciones bsicas Legislacin ecuatoriana e n el campo civil El A D N y el nuevo Cdigo de la Niez y Adolescencia La herramienta i ientffica Control d e calidad Valoracin e interpretacin d e la prueba |>or el luez Probabilidad d e paternidad e ndice d e paternidad Nuestra perspectiva nacional

La prueba de A D N (cido Desoxirribo Nucleico) ms frecuente y ms solicitada e n los actuales momentos es el estudio de paternidad. Los exmenes fsicos, somticos o hematolgicos comparados, muy utilizados en dcadas pasadas, ya no tienen validez cientfica ni legal. El anlisis del A D N es la prueba g o / d e n tod o el mundo para la identificacin humana y, desde luego, para los estudios de paternidad. Los estudios d e filiacin siempre son concuyentes y no dan margen d e error. No hay trminos intermedios. D e b i d o a la contundencia d e la prueba en el sistema judicial, vamos a analizar algunos aspectos d e inters sobre todo en e l c a m p o de la filiacin. La f i l i a c i n El ncleo bsico de toda sociedad es la familia, instituida a travs del matrimonio. As el matrimonio rene dos cualidades: la del vnculo religioso y la del estad o civil. N a c e all la familia, eje de la estabilidad social, en la q u e el padre del nio es el marido d e la madre. Se desprende entonces que la filiacin es Ja relacin jurdica entre padres e hijos originada en el hecho biolgico de la procreacin o en un acto jurdico familiar. En este mbito, el problema ms c o m n es la presuncin legal d e la paternidad y la demostracin biolgica de la misma. La sociedad actual permite, fuera del concepto inicial, redamar o impugnar la paternidad o maternidad d e un individuo. Sin embargo, el ser humano es complejo en esencia, por lo que aquel n d e o del cual hablamos se puede disgregar en un sinfn d e situaciones. Por redamacin La impugnacin

de la paternidad

debe entenderse la accin de delerminar la

paternidad biolgica de un hombre para un nio nacido de una mujer concreta. fie la paternidad

seria la accin interpuesta por un hombre q u e

se encamina a rechazar o rebatir su paternidad biolgica, con respecto a un niu (a), la misma que hasta ese momento era considerada c o m o legtima. En la legislacin actual, cuando se establece un litigio sobre la filiacin el Juez designa un perito responsable d e analizar genticamente a todos los individuos involucrados;

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para d e esta manera testimoniar el vnculo entre la madre dei Dio, el presuntt padre y el produelo de sus relaciones afectivas. La razn ms c o m n para deter minar el parentesco es la disputa d e paternidad, aunque existen otras siruacione: donde establecer la relacin biolgica es importante, tales como las preferencia? dadas a inmigrantes, problemas de herencias, los intentos para identificar a lo? padres de un nio adoptado y los casos de cambios d e nios e n las maternidades. Los polimorfismos del A D N tienen un gran potencial para brindar informacin crtica a este respecto, I n v e s t i g a c i n g e n t i c a d e la p a t e r n i d a d Los [H.)l i modismos de A D N se consideran como caracteres hereditarios q u e S transmiten d e padres a hijos siguiendo las leyes d e M e n d e l (J>0 % d e la informacin gentica procede d e cada padre), por lo q u e la prueba se basa en el anal si; del perfil gentico de las distintas personas que integran la investigacin y la comparacin d e los mismos. Por ejemplo, en el caso ms sencillo, si realizamos un prueba de paternidad entre tres individuos: ta madre (que se supone cierta!, el h jo y el padre, primero comparamos el perfil gentico del hijo c o n el de la madre y los a lelos que no comparte con ella habrn sido transmitidos y estarn presente; en el padre biolgico, 5i no estn presentes, podemos excluir a esa persona come padre. En el caso contrario cuando los aleles coinciden, para induirto si es el p a dre biolgico, se realiza el estudio matemtico-estadstico para calcular la prohabilidad de esa paternidad, Aunque en la investigacin biolgica de la palernidac se obtenan buenos resultados mediante la aplicacin de marcadores convencionales, la prueba de A D N ha permitido alcanzar una mayor seguridad en los m i s mos, a la vez que ha posibilitado la investigacin e n casos complejos que antes n i tenan solucin. Entre Jas situaciones que hoy en da se pueden investigar estariar aquellas en las que el anlisis se realiza: con ambos progenitores e hijos, en au sene i a d e la madre pero c o n presencia del padre (paternidad), e n ausencia del pa> dre pero con presencia d e la madre (maternidad).

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Cuando no podemos contar c o n el progenitor en estudio, ya sea por ausencia o fallecimiento, se puede recurrir al estudio d e restos seos o piezas dentales procedentes d e la exhumacin del cadver; el estudio d e muestras o vestigios biolgicos d e cuando viva (biopsias clnicas, objetos con restos de clulas); el estudio d e familiares directos de donde se d e d u c e el perfil gentico del progenitor, por ejemplo, en el caso d e una investigacin de paternidad c o n el padre fallecido, la informacin podra ser deducida d e la madre e hijos legales (dos o ms), los abuelos paternos, los hermanos legales y la madre respectiva. La investigacin de la maternidad Se puede suponer a una invesligacin biolgica d e paternidad y puede ser requerida en distintas situaciones como en casos d e sustitucin d e nios, cambio d e nios en centros sanitarios y en casos de abortos. El A D N e n el c a m p o c i v i L La legislacin e c u a t o r i a n a s o b r e la f i l i a c i n El artculo 90 del Cdigo d e Menores anterior deca: Cuando

el

demandado Desoxide

negare la paternidad fibo Nucleico (ADN)

del menor o fuese necesario para determinar

el examen

del cido

ta misma, el costo correr de cuenta

quien to solicita. Este constitua el nico artculo e n toda nuestra legislacin enel cual se peda la prueba del A D N c o m o una prueba de paternidad, Por otro Jado, la Ley d e Casacin en su artcuJo 19, inciso segundo, establece q u e la triple reiteracin de un fallo d e casacin constituye precedente jurisprudencial obligatorio y vinculante para la interpretacin y aplicacin de las leyes, c o m o es el caso d e "Jas resoluciones judiciales dictadas en los juicios d e filiacin en las que no conste haberse practicado la prueba del A D N , no causan autoridad d e cosa j u g a d a sustancial", segn la Corte Suprema d e Justicia, En el anlisis judicial realizado por la Corte Suprema a este respecto se recalcan c i n c o p u n tos de inters. Primero, q u e la prueba del A D N ha alcanzado un grado d e conilabilidad muy alto por lo que negar su valor sera desconocer los estudios c i e n tficos mundiales al respecto. Segundo, se excluyen Jos exmenes somticos y hematolgicos comparados. Tercero, se resolvi que para declarar Ja paternidad basta con una prueba d e A D N al menor y a su padre, que tenga una certeza igual o mayor al 99,99 % . Cuarto, se asigna un valor adicional a la prueba d e A D N e n aquellos casos en los cuales las resoluciones dictadas sin la m e n cionada prueba no causaran autoridad d e cosa juzgada sustancial o material. V quinto. Ja Corte deja abierta la posibilidad d e que otras pruebas d e mayor v a lor cientfico, q u e se v a y a n descubriendo, tengan el mismo valor probatorio y efecto procesal. A p r o x i m a c i o n e s al n u e v o C d i g o d e la Niez y la A d o l e s c e n c i a En el Registro O f i c i a l 7 3 ? d e l 3 d e e n e r o d e 2003, se public el nuevo C digo d e la N i e z y la Adolescencia q u e entr e n vigencia el i d e julio del mismo a o . Este n u e v o cdigo establece en eJ artculo 131 una serie d e elementos

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v i n c u l a d o s a la situacin d e los presuntos progenitores, o a los casos d e filia cin disputada. A l respecto har algunas puntuatizaciones d e inters para est documento. Ll Juez debe tener la conviccin o certeza d e la paternidad o materni dar! del demandado o demandada, Es necesario por lo tanto tener elementos de jui c i que permitan establecerlo, No se debe juzgar sin una certeza absoluta sobre k filiacin, la nica prueba que determina esta certeza es e ! A D N que nos da una pro habilidad mnima del 99,99 % . El |uez dispondr a peticin de parte la realizador del examen de A D N del derecho habiente y la demandada. Q u e d a claro que el ni c o examen indispensable es el A D N entre el presunto padre o madre y el menor d( edad- C o n el resultado del examen no solo se fija la prestacin de alimentos, sinc que tambin se declara Ja paternidad "legal", H a y que sealar q u e se puede realizar el examen d e A D N entre el presunt padre y el nio(aJ, y tambin incluir a la madre en el estudio. Nuestro laborato rio prefiere el anlisis del tro completo ya que disponemos d e ms elememos di anlisis, aunque se puede hacer entre presunto padre e hijo c o n igual calidad 1 garanta en los resultados, ya que tcnicamente tan solo se necesita aumentar e nmero d e marcadores genticos analizados para alcanzar Ja prohabilidad mni ma d e paternidad. I.a negativa a realizarse la prueba ser considerada c o m o pro suncrn d e paternidad o maternidad y, por lo tanto, se declarar la filiacin "le gal". Solo son necesarias dos citaciones judiciales para la practica d e la pericia con una diferencia d e 1U das. El resultado d e una prueba de A D N toma come promedio 5 das hbiles, por lo que se puede cumplir cabalmente c:on esle requi silo en un liempo mnimo. La Junta Cantonal d e Ja .Niez debe cancelar el eos to d e la prueba, cuando el presunto padre no lo pueda hacer. H a y que recorda que la prueba se realiza una sola vez en la vida de un individuo. Por lo que a lar go plazo el costo d e la misma es mnimo. Si el resultado del examen es negativo la parte demandante tendr que devolver al demandado el costo del examen. S prohibe realizar estudios de A D N para casos d e filiacin prenatales, pero s s e a u (oriza a realizarlos con personas fallecidas, mediante los procedimientos d e exhumacin. El artculo 132 establece que se debe realizar un reglamento que c o n temple tres aspeclos: cadena d e custodia de las muestras, identidad personal dlos actores y dems c o n d i c i o n e s tcnicas. A l g u n o s d e t a l l e s h i s t r i c o s s o b r e las p r u e b a s d e A D N El estudio d e la variabilidad gentica c o m o medio de identiticacin h u m a n ; se inici con el anlisis d e los grupos sanguneos (antgenos erilrocitarios). Pos teriormente, se continu a travs del anlisis de protenas sricas, enzimas leu cocitarias y eritrocitarias y del sistema H L A (antgenos I cu coc i tari os humanos) En 1935, Alee leffreys y colaboradores describan un mtodo d e irientiiicacir individual q u e d e n o m i n a r o n PNA

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ta ser In solucin definitiva al anlisis de la diversidad humana desde la M e d i c i n a Legal, lanto e n investigacin biolgica d e la paternidad c o m o e n c r i m i nalstica, En ese primer m o m e n t o , se pens q u e la incorporacin d e esta m e todologa a la prctica forense se retrasara debido a problemas estrictamente legales, sin embargo, la historia demostrara q u e esta prediccin era extremad a m e n t e pesimista. En abril d e ese mismo a o , se resolva satisfactoriamente un problema d e inmigracin por esta tecnologa y precisamente e n el pas d o n d e esa tcnica vio la luz, Inglaterra- M u y p o c o tiempo despus, se admitira tambin e n un tribunal britnico la investigacin biolgica d e la paternidad basada e n la prueba del A D N . En 1987, el uso d e la d e n o m i n a d a huella

gensica

o DNA fingerpriming

haba sido ya admitida e n los procesos penales, tanto en

Inglaterra c o m o en EE U U , y e n 1988 el Ministerio d e l Interior Britnico, as c o m o el d e Asuntos Exteriores y C o m m o n w e a l t h ratificaron el uso d e esta t c nica para la resolucin d e casos d e inmigracin e n los que hubiera que d i l u c i dar la existencia o no d e relaciones familiares. Actualmente, se puede afirmar que la prueba d e A D N est consolidada cientficamente y su v a l o r a n t e los tribunales no deja lugar a dudas. Para estudiar los problemas d e a p l i c a c i n f o rense d e nuevos polimorfismos A D N , c o n el animo d e estandarizar metodologas y establecer un riguroso control de calidad surgieron h a c e ya varios aos la T W G D A M (Technical W o r k G r o u p for D N A Analysis Methods) en EE U U y en Europa Ja E D N A P (European D N A Profiiing Cirup) c o n representantes d e cada uno d e los pases miembros d e la U n i n Europea ( U E X Los estudios d e A D N estn disponibles en nuestro pas desde 1997, Antes d e este perodo los casos de filiacin, que eran muy pocos, se resolvan mediante el estudio d e protenas sricas y subgrupos sanguneos. En los actuales momentos, D I A G E N Ca. Ltda., una compaa privada sin fines de lucro, mantiene tres laboratorios d e referencia para paternidades en el pas. En Q u i t o , e n el Hospital M e tropolitano; en G u a y a q u i l , en Ja Cruz Roja Provincial del G u a y a s , y en Cuenca. Dichos laboratorios absorben el 90 % d e toda la demanda del pas. Es notorio el crecimiento de la demanda d e estudios d e paternidad desde el advenimiento del anlisis del A D N . En los actuales momentos, se encuentra en discusin, en el Consejo Nacional d e la Niez y Adolescencia, el borrador del Reglamento G e n e ral del Cdigo d e la Niez y la Adolescencia, el mismo que contiene varias normas reglamentarias para los laboratorios de A U N y para los peritos. La h e r r a m i e n t a c i e n t f i c a : e l A D N La variabilidad biolgica individual constituye la base fundamental de la pericia d e identificacin gentica y en la actualidad se efecta rutinariamente m e diante el estudio de los llamados polimorfismos del A D N ; entre ellos estn los

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El total d e casos analizados fue d e 2 758, c o n un promedio anual d e 344,75 casos. El promedio d e pericias privadas es del 42,72 % (n = 1 I T S ) . El promedio d e pericias solicitadas por tribunales 57,28 (n - 1 580). Se observa un aumento relativo de las pericias privadas en los ltimos 3 aos.

Tabla 3. Tipo de anlisis realizado segn cada casoAno analizado Casas / .nt) rim completo* TuMl 2 7St.' ;::h

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A D N c o m o pericia en un proceso judicial. Primero., e l anlisis de ADiV elimina toda subjetividad prueba cientfica, contundente y d e certeza casi absoluta. Segundo, el anlisis dt

individual, desaparece el criterio personal y se utiliza c o m o un

A U N aporta a cada caso una mayor informacin c o n un menor esfuerzo tcnico, ya que en un solo estudio se llega a resolver un problema propuesto. Tercero, e A D N permite la individualizacin de caractersticas personales y, por lo tanto, c ms fcil identificar a un determinado individuo. Cuarto, por todo lo antcrioi constituye un valioso a p o y o a la Justicia, ya que nos permite lograr procesos giles y cientficos, que facilitan la sentencia judicial. Los polimorfismos genticos El a v a n c e tecnolgico y el conocimiento d e la transmisin hereditaria d e IO marcadores genticos han permitido e l desarrollo de una nueva especialidad denominada gentica forense, sobre todo en lo referente a la identificacin de personas y restos cadavricos, el anlisis de vestigios biolgicos d e inters crimina y la investigacin d e la paternidad. En los ltimos artos, el anlisis de los polimor fismos d e A D N por medio d e la reaccin en cadena d e la poli me rasa (PCR) es sin duda, el procedimiento ms eficiente e n la prctica forense. El estudio de A D N se basa en diferenciar un individuo d e otro. Se parte del hecho que todo; los individuos somos iguales en un 99,9 % , y a que partimos de la misma s e c u e n cia genmica, mientras que somos diferentes en el 0,1 % restante, lo que se cogin del A D N muy variable y frecuente en la poblacin en genera!. El polimorfismo es la base de la identificacin forense, y a que si se estudia una regin d e A D r . determinada, no siempre se encuentra la misma secuencia gentica, sino que existen varias posibilidades, denominadas alelos. Es estadsticamente imposibk q u e una persona lenga exactamente los mismos alelos en todos los (ramenlos de A D N analizados que oir persona, siempre que se estudien un nmero suficiente d e locus, El verdadero poder del anlisis de A D N est en el grado de polimorfismo del marcador gentico y del nmero d e locus analizados. Para estimar la> frecuencias genotpicas, los alelos d e cada locus delien ser heredados de torm independiente (equilibrio de I lardy Weinberg). y los alelos entre loci (equilibrio d e ligamiento). Identificacin cadavrica En muchas situaciones donde, por las circunstancias del hecho, la posibilidat de la identificacin es muy complicada, c o m o ante muestras biolgicas antiguas restos o fragmentos humanos, etc., la prueba del A D N va a ser la nica va de in vestigacin, El tipo de muestras a analizar depende del estado del cadver o lo; restos encontrados pudindose hallar situaciones diversas. En muchos casos, e uso del A D N ofrece una respuesta definitiva en la identificacin humana, sin e m bargo, aunque es una tcnica altamente discriminativa. no es aulosuiciente y nt tambir n o c e c o m o diversidad gentica individual. U n polimorfismo gentico es una fe-

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podra reemplazar totalmente a la evaluacin antropolgica. El anlisis de A D N puede ser utilizado para i d e n t i f i c a r u n individuo O para excluir falsos positivos d e identificacin humana. La identificacin d e cuerpos se hace utilizando muestras sanguneas d e familiares y la informacin derivada del rbol g e n e a l gico (pedigr), d e tal manera que se pueda comparar el genotipo del familiar c o n el genotipo del desaparecido c o m o si se tratase d e un c a s o estndar d e paternidad o maternidad. El nmero d e familiares analizados tendr influencia d i recta e n el coeficiente d e verosimilitud obtenido luego del esludio realizado. D i c h o coeficiente se calcula utilizando bases d e datos poblacionales d e cada grupo tnico especfico. U s o de efectos personales S e pueden utilizar los efectos personales d e los individuos desaparecidos, c o mo cepillos d e dientes, peines, maquinillas de afeitar y otros, en los cuales exista la certeza de encontrar tejidos o clulas d e la persona que buscamos. N o siempre podremos establecer un perfil gentico nico, en ocasiones, podremos obtener varios perfiles, lo q u e descarta el uso del efecto analizado. Olro recurso interesante es el uso de muestras biolgicas previamente obtenidas del desaparecido c o m o muestras de sangre o biopsias, que reposan en casas asistenciales. Desde luego, es notoria la importancia que tiene conocer c o n certeza d e dnde proceden dichas muestras. Tipos d e estudios para identificacin Clsicamente, existen dos situaciones establecidas. Los estudios C E R R A D O S , e n los cuales los restos d e un miembro de la familia son reconocidos por un efecto personal, por una caracterstica fsica personal individual (ante mrtcm y post mrtem), o por un documento o credencial personal (Cdula d e Identidad) e n contrado cerca del cuerpo. En estos casos, el estudio d e A D N liene el carcter d e confirmatorio d e la identidad ya que existe un familiar reclamante, e n otras palabras, conocemos la identidad a priori. Los estudios A B I E R T O S involucran restos en los cuales tenemos poca o ninguna informacin previa, o se desea contrastar un nmero incierto d e desaparecidos c o n un nmero determinado d e restos c a davricos, c o n la participacin de algunos posibles familiares reclamantes. D e s do luego, en este segundo caso las probabilidades de identificacin positiva disminuyen.

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mayor dificultad para recoger la muestra, mayor riesgo de perdidas y menor cantidad d e A D N ' recuperado. Precauciones C o n el fin d e evitar el contacto de la pulpa c o n el medio externo y prevenir contaminaciones, se han llegado a disear sofisticados sistemas c o m o la inclusin de la pieza dental en siiicona para acceder a la pulpa por seccin radicular. Para minimizar el riesgo d e c o n t a m i n a c i n exlerna, es siempre recomendable someter el diente a tratamientos de limpieza previos a la pulverizacin y extraccin d e A D N . S e utilizan indistintamente soluciones jabonosas, alcohlicas (etanol al 70 % } , hipoclorilo al 5 1 % , etc. El hervido de las piezas dentales no es recomendable ya que se sabe que las altas temperaturas afectan a la recuperacin de A D N . Los dientes encerrados en hueso y tejido blando son mas resistentes al efecto d e la temperatura que los dientes aislados. El t e j i d o s e o

Caractersticas-

La mayor parte del A D N del hueso compacto est localizado

en los osteocitos, restas de los osleoblastos q u e secretaron hueso alrededor de ellos y se aislaron de la matriz extracelular, Existen aproximadamente d e 20 000 a 26 000 osteocitos por m m d e matriz de hueso calcificado.1

Recuperacin terica de A D N En muestras de laboratorio, huesos control entre 3,3 y 16 ug A D N por gramil de polvo d e hueso extrado; huesos expuestos a factores ambientales externos, cerrados en bolsas d e plstico, inmersos en agua o enterrados en suelo: entre 2.5 n^ y 1,7 pg de A D N de peor calidad que en los anteriores por gramo de polvo de hueso.En muestras forenses, con "historia desconocida", la produccin media dec a e hasta tres rdenes de magnitud, movindonos en el rango de nanogramos en el mejor de los casos o picogramos. A u n q u e la cantidad de A D N recuperad de huesos suele ser alta cuando se analiza A D N total en gel de agarosa c o n bromuro de etidio. el anlisis de A D N humano r o n sondas especficas muestra qtie en especmenes deteriorados el A D N humano puede suponer hasta menos d e un 1 % del total, correspondiendo el resto a A D N bacteriano y fngico. Fn cuanto a su degradacin, es normal en muestras deterioradas que se obtenga un A D N c o n un tamao medio de fragmento inferior a 500 pares d e bases. Se observa que la variabilidad de produccin de A D N depende del tipo de hueso, incluso dentro de un mismo individuo. Procesado previo de huesos

za del espcimen, al igual q u e e n las piezas dentales, [jara liberarlo d e cualquiei resto d e tejido blando y descontaminarlo, Ln muchos protocolos publicados, st

El procesado previo d e los restos seos debe comenzar siempre por la limpie-

f j t u i f t i i fiinT.ilrr Andp.idV

contempla la eliminacin de una capa superficial de 1 2 m m por Jijado para evitar la contaminacin c o n A D N exgeno depositado en el exterior del hueso. Tambin se utiliza el lavado c o n agua destilada eslril, soluciones jabonosas, elanol al 70 % 95 % , etil ter o h i p o d o rito al 5 10 % , la irradiacin con LJV etc.r

Tras la limpieza, el hueso se fragmenta y se sumerge e n nitrgeno lquido para su pulverizado. Para minimizar la frecuencia d e contaminacin dentro del laboratorio, el G r u p o Europeo de Perfiles d e A D N (European D N A Profile Group) ha d e sarrollado una serie d e recomendaciones que deben tenerse e n cuenta e n el m o mento d e procesar una muestra con fines d e identificacin humana: Usar un control negativo tanto en el proceso (Je extraccin reas separadas para la pre-PCR y la posi-PCR. U s o de pipetas c o n presin positiva o puntas resistentes a aerosoles durante todo el proceso d e amplificacin. Todo el material de plstico debe ser previamente esterilizado, preferiblemente mediante UV. Adems, todas las soluciones usadas en las operaciones d e pre-PCR deben esterilizarse mediante autoclavado o con UV. N o amplificar conjuntamente muestras que a priori tengan mucha o poca c a n tidad de A D N o muestras de referencia con muestras dubitadas. En aquellos casos en q u e se disponga de muestra suficiente debera duplicarse e l proceso de extraccin y el d e amplificacin flor personas diferentes. Es necesario disponer del tipado gentico d e todo el personal que trabaja dentro del laboratorio. Estos criterios no el minan por completo la contaminacin, pero minimizan su frecuencia, hacen q u e s e a fcilmente tragable y la poltica de duplicacin d e anlisis asegura que no se emitan resultados errneos. Extraccin 1 . P u l v e r i z a c i n : el paso previo obligado para acceder al A D N presente e n los huesos y dientes es la pulverizacin. sta puede llevarse a cabo d e forma manual tras la inmersin de los fragmentos seos en nitrgeno lquido, aunque hoy e n da est muy extendido el uso de criopulvcrizadores magntkos. 2. DeseaIcifcacin: una vez obtenido et polvo, ste puede o no someterse a procesos c o m o

en el de a m -

plificacin y, e n este ltimo paso, usar tambin un control positivo.

d e descalcificacin con una solucin quelante, tema q u e conlleva cier-

ta controversia entre los distintos autores consultados (cuadro f > ) . 3. El protocolo de extraccin ms extendido: admitiendo pequeas variaciones, es el propuesto por Hochmeister. A d e m s d e este mtodo clsico, se han e n sayado otros mtodos alternativos para conocer su eficacia en la extraccin,

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Fahrn.iu G I J I I I , I W A m l ^ i f *,

Cuadro $. Cor>'i-e i v e c e s c r i n a p u a i'l p r o d u c t o d e * . d c i t i - r a d r ) : .

M a y o r r e n d i m i e n t o e n liije*os antiguris : nw'?'(-l 1 aosi. En c o n t r a C o n s u m e t i e m p o , es I n n e c e s a r i a , se d u p l i c a rendimienio.

Inhibidores Los exlraelos fie restos seos pueden contener, al igu;il que otras muestras forenses, componentes d e bajo peso molecular, supuestamente derivados del medio de enterramiento, que copuriican con el A D N e inhiben la reaccin d e I; P C R . Los inhibidores pueden proceder riel suelo, madera, tintes textiles, etc. Muchos grupos han experimentado sistemas de limpieza postc\traccin para eliminar inhibidores. Existen distintas estrategias para resolver la presencia de inhibidores en el exiracio d e A D N . Cuadro 7. Posibles soluciones frente a la presencia de inhibidoresa) Eliminacin:Purificacin con c o l u m n a s rir1

Invade* intensivos

IpI A D N

c a n l m i m e m b r a n a * 1po C e n l d i - r i n o

en

slice. A P N .

Ret-slraccin del

P u r i l i c m n |ior c r o m a Inorara. Winkulumnas j>uiinnlma:. rie sr'lke que, en presencia con de ajenies clolrpkus Humo el i sol ociaran.) como el1

de

forman

puente

salmos

polmeros

cardados

negativamente

AD -!. de

p e r m i l k - n d o el lavarlo d e los (.outarniruinles y poslerior elucin apropiado.

ret uperat ion del A D N

con

un l a m p n

b) Inactivacin o bloqueo de ta actividad del inhibidor medanle:Choque lrmico

V-

M

=11

mirie

-u\rrc-utcion u R a j o L i n i d k itim.-t ol a l i a s , i'l A P . V i s i ' r m iH.'ntra e n c a d e n a la limpie,

m u c h o s d e l o s i n h i b i d o r e s se i n t e r c a l a n e n la d o b l e c a d e n a d e a d . m .

de*naioral7ann

p u e d e d i s m i n u i r s i n n i f r c a l i v a m e n t e m i a f i n i d a d |ierf t.-l A p N , extracto. Sin ernUirgti. y con i-l esla lcnka de tiene una bapi

p c - r f m l i - e n r k i su d i l u c i n limitada que la para muestra*

y retiradalimite, de A D N simple

riel muy e* por

aplit a b i l i d a d di-birlu a

degradada*

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copias

recuperacin

apruniniadamenle

d e l i n i c i a l y a l a d e g r a d a r Vn r u e s u r r e e l A D N dcrecliirisa.

de cadena

roturas re la c a d e n a y r c n a r u r a l i A H ' i n

d) Titular la cantidad mnima del inhibidor capaz de bloquear la reaccin de PCRSi no es posible retirar, n o e l iva i i> l i l i q u e a r mnima riel al inhibidor prsenle en nueslro la entrarlo, rkotra fCH 1a* un esliutcgia realizando tondu.iiiih-s iiIisILc lllu si-ia titilar d d u c ioiit-S dila la c a n t i d a d seriada* inhibidor con de un rapa? d> b l o q u e a r l1

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conocido. en la que

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y:

[dhriri-rh C r t m i l c j AiidrjiF

Fnuyuri medien* abre jmEicj

L j genliej fntrftiuljj a TtediLinJ k uJHtfrirttl

Nuestra experiencia en anlisis de restos seosEn Ecuador, el anlisis del A D N lleva casi una dcada, y son los estudios de filiacin y paternidad los que ms solicitud han tenido hasta el momento. Sin e m bargo, hemos resuelto varios casos d e identificacin d e desaparecidos c o n el anlisis de A D N procedente d e restos humanos, c o m o cito a continuacin, Caso 1 : Desastres El mircoles 20 d e noviembre d e 2002 ocurri una explosin e n el interior de una de las bodegas d e municiones d e la Brigada de Caballera Blindada G a l p a fallecidos, ms de 100 heridos y 4 individuos desaparecidos. La explosin se progos, en la ciudad d e Riobamba, provincia de Chirnborazo, q u e dej 7 individuos

dujo en el interior de una bodega c o n armamento y municin militar, y se cree que fue por una detonacin accidental, El anlisis estuvo a cargo d e nuestro e q u i po de laboratorio utilizando los protocolos internos para este fin. Se analizaron 20 muestras de restos seos y 1 muestra d e tejidos blandos procedentes de la zona cera d e la explosin, los mismos que fueron entregados por el medico forencidos. Los resultados encontrados fueron: Tabla 1 .Tipo e Muestra tejido Hueso Hueso Hueso Hueso Huesi'i,

se d e la Fiscala. S e tomaron muestras d e los familiares de los posibles desapare-

DcscrirKion inicial, realizada por mdico forense Fragment de hueso largo no identi 1 V a d o

Descripcin real realizada en laboraluriu de ADN Epfisis distal lie peron derecho

t2 3 4

Cabeza ele articulacin sin determinar Calx'za de hmero derecho Fragmento de costilla Articulacin de rodilla Reflua 1 ramenlo de crneo Fragmento de crneo Fragmento de cnolla Epfisis dista) de fmur derecho Kfula Crneo, parietales isulura sagital i Crneo, fragmento temporal Calcinado, no se identifica Fragmento ele fmur exhumacin] 1 ragmeorn ele msculo lexhumacinl Epfisis distal de fmur izquierdo Calcreo izquierdo Pedazo de uniforme' con manchas de sanareISis identificado

Hueso Hueso Hueso HuesoMUS U I I i

"

7

a1

Cabeza de peronFragmento de fmur lexhunwinl Fragmento de m s ulo (exhumacin} < Articulacin de rodilla Fragmento de aslragalo Heelazo ele uniforme - marchas de sangre

0

111J

Hueso Hueso lpelos Hueso

i

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idenliicado

15 l.17

HUESO

Fragmento de mueca Hueso plano no identifiejeta Fragmento re hmero

Fragmento de carpo izquierdo Hue-sn plano, fragmentos rie ilaco derecho Fragmento*, de astrgalo y calcneo izquierdo

Hueso Hueso

Cantinaj...

f j b r i m G u f L T j J AndrjdV

CtitinaMi^..,

1 Tipa de Muestra B 19 2(1 21 repido Hueso Hueso Hueso Hiif-sii

Thl 1 . Descripcin inicial, realizada por medico forense Fragmento de radio izquierdo Nlu itfetttlfletfa No i' - . i -1- i .V1.ijul.ir superior Tabla 2, Descripcin real realizada en laboratorio de Fragmentos de epiiisis dislal riel cubito izquierdo No idcnliicado No identificado MaxilarmperiiK

ADN

izquierdo ton seis dientes

Sistemagentica analizado m s i 35B HUMTHO 1 D21S11 D18S51 flema F D5SB1P 01JSJ17 07Sc2(>

Muestras M4-1fv1H M*|5 6-7 29-11,3 15-17 1140 10-11 n-i! 10-11 -14

Pcril l

Perfil iMuestra 17 tS-13 7-o,3 294Q-

PerfilaMuestras .t-5.b-7-e-9-1 LM 2-15-21 1546 7*1.1 31,2-32.2 14-15 12-19 -2 >1

Muestras 14 15-16 7-fl jH-n.2 13-14111 i 5

Perfil 4

Muesiras 11-20 16-1729-3 1,2

Perfil 5

6-9

14-H

12-14 I- -?!1

1-2 119-9 11-11 10-12 11-12 t-n 16-17 B-l 1 19-23 XY 8-11

11-12

11-12 11-12 Ca rhon izado

Negativo fusin Positivo

Presunta hija Presuma hija

Secuestro ms homicidio posterior Secuestro mis homicidio posterior

Enterramiento Enlerramienlo Reslns

Positivo Positivo Negativo

izquierdo . Fnr 2-04 a Hueso curio; ftajinieiitris liseiis For 2 04

$ 7 familiares Identificacin de

catlve desapareado Idenlilcacion de cadver desaparecido

putrefactos Restos putrefactos

difuntos b Hueso iprlHi: i r :\ l,.i i oferior Dientes; i pinza-. dentales di si i nas

Presuma hija

Positivo

En la labia precdeme se muestran fi cosos ci extraccin d e A D N de huesos y dientes, para identificacin de desaparecidos. Tan solo e l 75 % fueron identificaciones positivas c o n A D N , en el reslo no se logr una adecuada identificacin por A D N , ni por ningn otro mtodo. Segn la fiscala y oirs O N C se calcula que en Ecuador desaparecen 100 personas en promedio al mes, d e ellos un 1U % se presume q u e han fallecido por causas violentas. En todos los casos analizados la Fiscala, luego del informe emitido, dict resolucin y cerr el caso, C a s o 3: i n v e s t i g a c i n d e p a t e r n i d a d ( f i l i a c i n ) c o n r e s t o s s e o s Se utiliza sobre lodo en casos de difcil solucin c o m o identificacin de restos fetales por violacin o muerte del recin nacido, en estudios d e paternidad post mrtem, identificacin en ausencia d e padres biolgicos, para establecer relaciones entre hermanos con u n o de los progenitores.

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Figura 3. Presencia de dos o ms alelos en varios loe i-mezcla

Enuyua mticm

vAm ^ w t i c j

L j L^ n$ j nicilt^t irljr era laJ

roerftpnaecuatoriana

Fattririn C i M i j a l ^ Andradi

La presencia d e una mezcla se establece por la existencia d e bandas exiras (p eos extras e n el grfico) y por el desbalance d e los alelos. Luego, se identifica e nmero d e contribuyentes, estimando el nmero de alelos exlra por locus a s c o mo sus proporciones relativas. Para una mezcla d e dos personas, el mximo n mero de alelos que se puede detectar es cuatro, si ambos individuos son helero cigotos y no existe un fenmeno gentico. Para estimar la proporcin relativa d( cada componente, hay que considerar cundo existe una contribucin claramen te mayoritaria, y cundo hay un componente mayoritario y minoritario, difcile: d e diferenciar. S e recomienda hacer lecturas por duplicado y e n forma indepen diente. Finalmente, hay que comparar los perfiles genticos obtenidos con la: muestras indubitadas y proceder a su valoracin. La posibilidad de detectar mil 1 pies contri huyen les en una mezcla (ms d e dos) depende de la proporcin d( cada componente en la mezcla, de la combinacin especfica d e los genotipos ya q u e e n individuos relacionados puede existir enmascaramiento d e Jos alelos \ d e la cantidad total del A D N molde.m

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Fraccin temenina deEvidencia

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Figura 4. Electroferograma que muestra una exlraccirt diferencial de esperma ifraccin masculina! de las clulas epiteliales vaginales (fraccin femenina) Ejemplo t de anlisis en un perfil mezcla La vctima refiere una agresin sexual por un nico individuo. S e analiza un; toma vaginal donde se haban deteclado restos de semen y muestras de referen cia d e la vctima y un sospechoso. En la imagen siguiente se puede observar e resultado compatible c o n una mezcla entre vctima y sospechoso.

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la i T H H i i n i u r t t i a l n r i a

D7SA2

Figura 5. Mezcla de vctima e imputadoTabla 2. Perfiles genticos encontrados Muestra Hbopacte vaginal Vfclim.i AmrlogenifH XY XX[

THtll 7,9.3 7.7

SospechiHU

XV

.3.').

TPOX 1 1 (8) ' 11.11

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I . I h

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12.

M I II i m1

L.ilnn.ri.i

La nacionalidad kichwa d e Ecuador aparece luego d e un proceso d e "quiehuisa c i n " de mltiples grupos diferentes, que tuvieron contacto durante el perorJt preincsico y adptaron el " q u i c h u a " corno un segundo lenguaje materno. El qui chua fue el diurna de los incas (Moya A. 2000f.r

Los a f r o a m e r i c a n o s La poblacin afro d e Ecuador desciende de los esclavos africanos trados des d e la costa atlntica d e frica a Amrica, Es posible que originalmente hayan si d o trados primero desde Guinea a Colombia, y desde all a nuestro pas en bar eos re esclavos, alrededor del a o 1 S.li, ao en que se registran los mayores car gamentos de esclavos. Ploy en da, viven en dos regiones,, en la zona andina, ei el valle del Chota, y e n la provincia d e Esmeraldas en la Cosa ecuatoriana. Tie nen una poblacin d e -.l 00 0110 individuos, dispersos en todo el pas. Hablan es panol y tiene una rica cultura d e I r a d k i o n e s afroamericanas entre las que S cuentan la msica, la danza y las prcticas religiosas ancestrales. Viven de las ac tividades agrcolas en las zonas rurales, y e n las ciudades han sido asimilados la cultura urbana (Vsquez, L., Saltos, N . 20011.r

Anlisis gentico de mestizaje en grupos tnicos de EcuadorEn Ecuador viven [res grupos tnicos principales: mestizos, nativos amerindio y afroecuatorianos. C o m o citamos antes, los mestizos son el grupo mas numero so, con -El 000 000 de habitantes (o el W tendientes hispanohablantes d e los europeos (en su mayora espaoles) y d e na

% d e la poblacin total); son los des

tivos amerindios. La proporcin y la dinmica cJe los procesos que causaron est mearla siguen siendo desconocidas. Varias de las diferentes poblaciones nativa'

amerindias cunservan su cultura, idioma y clara identidad en Ecuador. D e ellas la mas numerosa, como se dice previamente, son los kichwas (tambin conoc dos c o m o quichuas), en nmero d e ~ J 0 000, El idioma kichwa es et resulta d o de la absorcin de poblaciones locales en el antiguo imperio Inca (el idiom; relacionado, pero diferente, hablado por los incas en las regiones incaicas cern trales de Per y Bolivia se llama quechua). Los kichwas viven principalmente er la regin interandina de la Sierra, pero algunos grupos se encuentran en la regir amaznica ( M a y a , 2000; Vsquez y col-, 2003). En ambos grupos existe una con siderable variacin cultural y dialctica. Finalmenle, medio milln de ecualoria nos descienden d e esclavos africanos y conservan claras caractersticas fenotpi cas as c o m o rasgos culturales alcanos c o m o la msica, el baile y la religin, Vi ven en zonas rurales en dos provincias separadas; en el valle del Chota (en loi Andes) y en la provincia costera d e Esmeraldas (Maya, 2000; Vsquez y col. 2003), La medida e n la que han absorbido contribuciones genticas europeas i

F J D F L U C u n d k ' i andrade

[njta& mdi.'h mbre- &Mir1La

jimt^ii .L mi ik-ci.l.ir u* m e d i t u * u t b r t n e f i H r u

L.i jjenelK .I i m l e i u b r Lfi l.i medie lira K ualuri.in.1

Ti paje Los 11 STRs en ei cromosoma " Y * e n el kil Power Plex " Y " fueron upados cor un secuenciador automtico A B I Prism 310. El tamao del fragmento y la desig marcadores d e peso molecular y escaleras allicas distribuidos c o n el kit. Se si nacin de los alelos de los diferentes loci se determin por comparacin c o n lo guieron las recomen daciones d e la D N A Commission of the International Socieh of Forensic Haemogenetics para el anlisis d e sistemas STRs (liar y c o l . , 1997 I S F G , 1992). Tambin utilizamos en el anlisis la experiencia previa d e nuestrt equipo d e investigacin (Bell, B. y col-, 2000; Martnez Jarreta, ES, 1999), Control de calidad Nuestro laboratorio participa anualmente en el Test d e Proeicencia del Grupo de Trabajo G E P - I S F G thttpi//www.gep-isfg.org). Anlisis de los datos Se calcularon el nmero de haplotipos diferentes, la diversidad haplotpica las diferencias pareadas de haplotipos y la varianza del tamao d e los alelos er las STRs en el cromosoma " Y " , c o n Arlequn 2000 Schneider y c o l . , 2000). S( generaron median-foining work 4,1.0,8 (disponible e n www.fluxus-engineerinj'.com)- A los STRs se les asig' naron ponderaciones que fueron inversamente proporcionales a las varianzas er el tamao d e sus alelos. Las proporciones d e mezcla en los STRs autosmicos st calcularon c o n el programa Admiv. 2.0 (Dupanloup y Redore lie, 2001). Resultados y discusin 1 . S T R s en el c r o m o s o m a " Y " D i v e r s i d a d d e n t r o d e la p o b l a c i n Tipamos los STRs D Y S 1 9 , 3B9I, 38911, 390, 391, 392, 393, 385, 437, 438 ^ 439 del cromosoma " Y " en 94 afroecuatorianos, 102 kichwas y 102 mestizos, to dos d e Ecuador. Las frecuencias allicas se pueden e n c o n t r a r e n las tablas c o m plemenlarias 1 a 2 y las frecuencias haplobpicas en la tabla complementaria 5 Los descriptores generales d e la diversidad gentica intrapoblacional se pueder encontrar en la tabla 1 . La diversidad haplotpica es alta y bastante prxima ; uno, e n las tres poblaciones; se d e b e observar q u e este parmetro, en los sistema: haploidcs como A D N milocondial y el cromosoma " Y " , es numricamente idn tico a los parmetros forenses d e informacin a prior i como el poder d e discrimi te conjunto de 11 hc tiene el amplio poder de discriminar individuos varones nt nacin t> el poder d e exclusin e n los casos d e paternidad, Por consiguiente, es

networks (Bandeft y c o l . , 1999) con el programa Net

relacionados e n todas las tres poblaciones y se puede usar e n situaciones come delitos sexuales o donde sea ms apropiado. Los mestizos y afroecuatoriano: muestran ligeramente {y no significativamente) una diversidad ms alta m e d i d ;

Fabricio

Cmuilu

Andrade

Enuym mediten mitre enMiu Lj uentlkj nidti.ul.ir en \,\ nurlu.in.i uU.1

JHJ

por el nmero medio d e toc q u e muestran alelos diferentes e n un par de c r o m o somas aleatorios y la varianza media del tamao del alelo. Esta tendencia a m a yor diversidad se espera en las poblaciones mezcladas. Tabla 1 . Diversidad gentica intrapoblaconalN k Hd a

v l.LUI.Nl.JUI.Ofc 1.41 t i ,20

KichwasMestizos Aroear.ilnrianris

102102 < J >

91HT}5 j m e f k j m f t y |Hjd*.hirc> h5fwnk>: ^ l r k j " "*M.lifi>t: J l r k * * y publjt k m de descendienle* de alircjncH que v i w i ur> Amerai a Eurcpa.

Distribucin haplotpica dentro de EcuadorSiete haplotipos diferentes fueron compartidos entre kichwas y mestizos, uno entre mestizos y afroecuatorianos, y uno erilre kichwas, afroecuatorianos y mestizos. Este ltimo resulta ser el haplolipo ms frecuente en los europeos y, particularmente, en los espaoles. El nmero total de haplotipos diferentes es 2 7 1 . Distribucin haplotpica mnima c o n poblaciones globales Se han definido haplotipos mnimos (.es decir, DYS19-3891-38911-390-391392-393-385) para la prctica forense y dichos haplotipos de poblaciones globales se conservan en Ja Y H R D (base d e datos de referencia de haplotipos del cromosoma Y ; http://www.yhrd.org). Los haplotipos mnimos e n las poblaciones ecuatorianas se buscaron en la Y H R D (versin 16); esta versin contena los haplotipos mnimos para 32 196 cromosomas d e 271 poblaciones mundiales. S e

Ei^tu* indita wbre ^tmiilk la Jseniica rnolecul*

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Id redlciia mt^luii.in.'i

Fjljnu {kmeAlff Anilr^d*

contaron las coincidencias perfectas; para los haplotipos sin coincidencia, st consideraron los one-sfep nergbbours e n una repeticin solamente en un Icx'us). Los resultados se encuentran e n I, (es decir, haplotipos que son diferente!

labia 2. Ningn haplotipo mostr c o i n c i d e n c i a s c o n ms d e un grupo continental. N o se pudo encontrar una c o i n c i d e n c i a ni un one-step neighbour er ms de la mitad de los haplotipos k i c h w a s . Tambin es notable que solo se encontraron c i n c o c o i n c i d e n c i a s c o n otras poblaciones d e nativos americanos, pero 2u haplotipos tenan one-slcp

nefghbours.

Estos dos hechos se pueder

explicar por dos fenmenos no c x c l u y c n t c s entre s: la diferenciacin interpob l a c i o n a l entre los amerindios (Salzano, 2002) y la menor representacin de d e europeos). Esto h a c e ms probable q u e los c r o m o s o m a s q u e no c o i n c i d e r (los c u a l e s , a prori, podran tener cualquier p o b l a c i n origen) fuesen de origen nativos americanos. En conjunto, el n m e r o de c o i n c i d e n c i a s c o n Europ es llamativo. Este mtodo sera ms sensible a la mezcla d e europeos, ya qu Europa (y Espaa en particular) est representada en exceso e n la Y H R D . A pe sar de ello, se encontraron c o i n c i d e n c i a s perfectas o casi perfectas e n Europi para un 14 % d e los cromosomas " Y " d e k i c h w a s , b7 % de mestizos y 27 A d e afroecuatorianos. Estimaciones de meslizaje La proporcin de cromosomas " Y " d e origen americano, europeo y africanc en cada poblacin se estim intentando predecir el grupo haploide d e cada ero mosoma, ya que la mayora de los grupos hapoides estn restringidos feogrfi camente (Jobling y Tyler-Smth, 2003). Esta tarea se realiz usando conjuntos dt datos en los que se haban tipado ambos marcadores biallicos y STRs (Bortoli ni y col,, 2003; Zegura y c o l , , 2004; B e l e M y c o l , en prensa; Beleza y col., c o municacin |jersonal), y se obtiene c o m o ventaja el h e c h o de que la variacin de STR en el cromosoma " Y " est fuertemente repartida por el fondo del grupo ha ploide iBosch y c o l , , 1990). U n cromosoma fue asignado a un grupo ha.ploid( cuando se encontr una coincidencia perfecta o casi perfecta d e un cromosom; con un grupo haploide conocido, o cuando estaba presente un alelo o subhaplo tipo diagnstico ( c o m o el 14 o alelos ms grandes en el D Y S 3 9 2 combinado cor D Y S 1 9 * 1 3 para el ^rupo haploide Q, o DYS19*15 - DYS390*21 para E3a, t D Y S 3 9 2 * 1 3 - D Y S 3 8 5 * 1 1 , 14 para R1b). Ya que estamos interesados en los am plios orgenes d e cada cromosoma ms que en una filogeografa exacta y come este mtodo puede ser propenso a errores, asignamos cada cromosoma a una dt las siguientes categoras: Q (nativos americanos), R1 b (europeos), Otros europeo; (incluyen E3b, C , I, J , R1a), E3a (africanos). Las frecuencias de cada clase e n ca da poblacin se pueden encontrar en la tabla 3 y las asignaciones de clase par; cada haplotipo en la labia complementaria 5, estas p o b l a c i o n e s en la base d e datos (seis, c o m p a r a d a con 201 p o b l a c i o n e ;

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M a t e r i a l y m t o d o s u t i l i z a d o s e n la e l a b o r a c i n d e la b a s e d e d a t o s Seleccin de muestras Las muestras fueron recudidas a lo J r>o de f i arios, d e ios individuos que a c u L

dieron a realizarse pruebas d e paternidad en nuestro laboratorio. Otras muestras fueron recolecladas expresamente en grupos especficos, algunos procedentes d e bancos de sangre, y otras fueron tomadas in situ en las poblaciones mismas, c o mo el caso d e los huaoranis. Tortas las muestras fueron tomadas en tubos vacutainer con anticoagulante EDTA, por venopunciones. Los individuos seleccionados fueron de ambos sexos, sanos, nacidos y residentes en Ecuador. Extraccin d e A D N S e extrajo el A D N utilizando el sistema W i z a r d G e n o m i c D N A Puritication Kit SysremC (Proniega), y se t u a n t i k mediante absorvancia U V . utilizando el sis1

tema G e n e Quant Calculalor i Pharmacia, Uppsala. Svveden). PCR La ampfificacin utilizaron termoci dadores Techne, modelo G e n i u s , siguiendo las recomendaciones del fabricante. Anlisis manual de microsatlites autosmicos En la poblacin kichwa realizamos un anlisis mulliplex usando los sistemas CTT (HUMCSFlPO, HUMTPOX y HUMTHU1) y Gamma STR {DHS317, D ^ S f l l f i , U165539 y D75B20.I de Promesa. Los productos d e la PCR fueron tipados en un sistema de eleciroforesis vertical, geles rie poliacrilamidi y tincin con nitrato d e plata. Anlisis automatizado de microsatlites autosmicos Utilizamos el sistema PovvcrPlex 16 (Promoga), en un analizador automtico A B I .310. Anlisis automatizado de microsatlites d e l cromosoma Y Utilizamos el sistema PowerFlex Y (Promegai, en un analizador automtico ABIn o

C o n t r o l d e calidad Test de proericencia del C E P - I S F G (btt|>^Avww.fiep-isf{,org), Seguimos las rec o m e n d a d ones de la Irtlematronal Society o Forensic Haemoj^enetics para anlisis d e STRs ( B r e t a l , 1997; I S F G , 1992). Anlisis estadstico La evaluacin del equilibrio de Hardy-Wei liberar el test exacto y otros parmetros

11

E n s J t i * mM( ifci ffaUnn Ld lenMid molecular i la medicina pcualciri,in.i '

fibfifo r^mj'jlf'j > n r i V dj d

esladisticos forenses habituales se calcularon c o n en el software HWE-analysi: versin 3.3 (Chrisloph Puers, Institutefor Legal M e d i c i n e , Universry of Mnstcr) La diversidad gentica de cada loci, el nmero de haplotipos y la diversidad ha

plotpica del cromosoma " Y " se analizaron utilizando un software desarrollad; ligamiento se analiz utilizando el mismo programa, c o n 50 permutaciones, i

por Chakraborfy and Lee (httpv'/cgi.Ljc.edu/download/haplo). 1 desequilibrio di partir del test exacto d e Fischer en tablas de contingencia, El locus D Y S 3 8 5 fui

tratado c o m o un locus simple para estimar la frecuencia allica. P r e s e n t a c i n d e la b a s e d e d a t o s p o b l a c i o n a l d e E c u a d o r

parmetros estadsticos forenses ms habituales. P min = frecuencia allica mnl

En todos Jos cuadros utilizaremos las siguientes siglas, que corresponden a lo:

M E C = probabilidad acumulativa d e exclusin, M E P = probabilidad de exclusii paterna significativa. P I C = contenido d e informacin polimrfic, P M - proba acumulativo Je discriminacin. bilidad d e emparejamiento (match}, P D - poder de discriminacin, P D = pode

ma, O b s H = heterocigozidad observada, Exp H - heterocigozidad esperada

Cuadro 1 . Distribucin gentica de 7 STRs de la poblacin kichwa (n=l SO) - an&lisi manual Alelo 6 7

(n- 150)

CSFtPO

TPQX (n=150) ... 0,5130

TH01 (BolSO) 0,4800 0,3200 0.O070 0,0230 0,1330 0,1230 0,0370

D135317 ......

(n= 102)

165539 ...

{n= 104)M

D5SBI8 .KI92 0,5800 0.5936 D.306S 0,51N

...

...

0,1 160 0,0420 0,5740 0,1320 0,0260 0,894fl 0,946* 0,9548 0,62flfi (1.41 8 (1.'.2UH 0,5941 0,1742 ~ l ZtOL

IR A 3 z. CD D D

-r

S ^

T

f

3

N O OD D

;

;

S

C

O

C5 CD C

OD

D

D

OD

C

D

3

A

O'

D

3 5D

.0

i 8

C

C C

S

= 3 C C- t EO D C

2c R p ?C

3 Q 3

? "-i O"2

5

c d'D C

w

n

pn

-J o k C= D

fl* C; D D

fi

S

U

4

1

*

i

-

'

d d

d d = d

d

-

_

...ContinuacinAkb 27 D5HI i-iil TH01 021511 0,0140 0,06 )UL

Peni* i

D5S818 D13S317 D7S82Q D I 65539 C S F l P O

Penli D

VWA

D8S1179

TPOX

FGA 0.037O 0,0020 0,0020

m19,2 10 M\l 31 11,1

-

0,19641 0,0040 0,24 O 0,0260 0,0770 0,1490 0,0060 0,0520 0,0040

-

-

-

-

-

-

_

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

*

li,233,2 34 15 Test

-

-

-

" 0,0062

0,4696 0,0396 0,6456

6749t0,004 0,0916 0,1120 0,0690

0.0066 0,0312 0,0090

...

- "

-

-

-

-

-

-

0,0198 0,0026 0,0120

:

-

-

-

0,1422 0.2690 0,2224 0,5048 0,6670 0,1101 0,6897

\,l! Ii) l'i-i ii r 0,0374 ada Cien MEC PK hm PD 0.0092

0,114 0,2966 0,4610

-

-

0,8664 0,8172 0,8040

-

-

-

0,4094 0,2 696 O H Id

0.0B6.6 0,0458 0.1 318 0,5272 0.7129 0,1042 0.8957

0,8828 0,9340 0,9090

-

0,2828 0,3272 0,4940

0.0146 0,1606 0,1252 0,5994 0.7635 0,0726 0,9274

0,31 10 0,0276 0,3586 0,3386 0, (481 0,5425 0,2270 0,7729 (1,0596 0,0142 0,7509 0,8635 0,0106 0,9694 '

-

-

"0,4551 0,6456 0,1432 0.8566

0 5 2 7 F 0,6871 0,7125 0,6235 0,1065 0,0469 0.8935 0,95.31

0,7211 0,6442 0,0411 0,9585

0,8215 0,9054 0,1719 0,9824

0,6652 O.EHOS 0,0126 0,9473

0,5928 0,7634 0,0761 0,9239

0,4689 0,6690 0,1262 0,8737

0,6523 0.B04.1 0,0524 0,9476

0,5116 0,6948 0,1164 0,8836

En el cuadro 3, el poder acumulativo de discrimiracin (PD) fue de 0.9999 y probabilidad acumulaliva de exclusin ( M E O fue de 0,9999.

...Continitcit)AlMc 17 21 28.2 21 M. 31 31-2 32 32.2 111J.2-

PENME

D3S135B

FCA (1.0510 0.0190 "

D18&51

021 Sil 0.0370 0.1590

PINTAD

VWA

D4S117S

D7S20

D13S317

D5S818 DI 65539

THOl

C5F1P0

TPOX

-

-

-

0.0090

"-'":

-

0.0050 0.1590 0.2570 0.0370 O.09&O 0.1070 0,0140 0.0650 0.0140 0.0230

-

...

-

-

:

-

-

-

*

-

-

-

-

-

r

-

-

-

_

"... ,

-

-

-

-

34 341,3 35 TestSICtO

-

-

-

-

-

-

*

-

-

0J9976 ri.'i 0.6280 0.B3S1 0.9088 0,0186

1.0000

0.47"!!! 0.6246 0.6638 0.4794 0.4640 0.6716 0.1221

(1,7260 " 0.6590 0.1506 0.7710 0.7H8S 0.8825 (1.9724 0.5794 0.8184 0.7526 0.8620 0.9659 DIBS5I

-

-

-

-

0.9942 0.9790 0.9800 0,6094 0.6043 0.7710 0,0717 0,9282 VWA

(1.6'H-l 0.1706 0.6904 0.5297 0.5195 0.7125 0.1050 D8S1179

-

:

0.00900.0010 0.4532 0.3662 0,4754 0,7120 0.71 08 0.8386 0.0453 0.9546 0,0090

-

II. 1 lOfl 0.5976 0-2620 0.47340.51.13

0.2368 0.1282 0.2416 0,7538 0.7584 0.8655 0.0374 0.9625

0.7994 0.7551 0.9142 0-5779 0,5779' 0.7513 0.0820 D7320 0,9179

-

0.2482 0,337b 0.2728 0.592.1 0,5877 0.7596 O.OflOO

-

-

-

0 2900 0.3818 ti 5026 0.5240 0.5-077

-

0.6930 0.5586 0.5942 0.5884

0.47BO 0.2780 0.6324 6.5509 0.5445 0.7292 (lii'.ll 0.9041 CSFlPO

0.5408

0.5060 0.3.186 0.5140 0.4853 0.6952 0.1131 0.8868 11 \ .iX

X2*r!l OTcsl MEC FICFU

0,78 5 ' 0 7426

0.52 5fl ti 711,(1 0.1021, 0.8971

MtrPm Alklc

0-9814 Q.B778 PFNTA F D35I3 58

0.0275 | 0.0340

FCA

D2I51 1 PENTA

0,8949

0.9199 D i JS31 D5S818 7

0.761 i 0.7070 0.0783 0,1106 0.92 1 6 0.8893

D I 65539

THOl

Fn el ttidtlfo 4, el potlcr dr rlisi timitiiidom acumulativa (PDi uc tic 0,9999 y probabilidad de exclusin acumula! iva (MfTi fue tic O.O'iO'.

?.

Cuadru 5, Oistrihuc i in allica do 1 > STRs aulusmicos y amekim'nina e n amerindios kichwas (n = 115) - anlisis automatizad 1 Alele 2,2 3,2 P E N T A 03S13SB FCA

s!i

0,0560

-

-

185.51 D21S11 PENTA D 0.0890

VWA

D8S1179 D7S820 D13S317 DSS818 D16SS39

-

0,0050 0.0330

-

-

-

6,3 7 B 9 10 11 12 13 14 15 16 17 B 1H..2 l'l 1 9,2 20 21 22 23 24.2 25 26 24 13,2

0,0410 1!. 1 IfiO 0,0370 0,0280 0,0700 0.1070 0,0B9O 0,0700 0,1200 0,0610 0,0330 0,0420

-

-

-

m

-

-

-

iMJij'id-

-

THOl

-

CSFlPO

TROX

-

0,2570 0,0050 0,1450 0.0840

-

-

0,0470 0,0420

0,0370 0,0050 0.4210 0.1 540 0.0700 0.2140 0.0790

-

0.0470

0,1170 0.1160 0,2010 0,1450 0,0750 0,1030 0,0170 0,0140

O,D050 O,021 0,0280 0,1030 0,3320 0,3040 0,1820 0,0190

-

0.1450 0,0890

0,0370 0.1450

0,0140 0.0190 0,0610 0,0510 0,3130 0,2940 0,2290 0,0140-

0,0050 0,0090 0,2010 0,1260 0,3270 0.1680 0,1310 0,0210

0,3830 ' 0,0370

-

-

*0,0050 0,0470

-

m

0,0050 0,0090

0,3040 0,0510 0,2380 _ 0,2710 0,1920 0,2900 0,0330 ' 0,1590 0,0010 0,0470

0,1170 " 0.0090 0,2660 _ 0,2570

-

0,0050 0,0050 0,0610 0.3640 0,1360 0,16B0 -

0.0190 0.0130 0,1730 0.2710 0,2760 0,1120 0,0840-

-

0,0560 0,0090 0,1360

0,2990 0,0420

-

0.OO50

0.1640 0.1540 0.1780

-

0,0510 0,0050 0,1120 0,0190 [J.IKW-

-

-

-

-

0,0050-

-

-

0.0050

-

0,0140 0,0190 0,0140 0,0050

-

0,0700 0,0700 0,0050 0,0890 0.O370 0,0960 0,0140 0,1590 0,1400 0,0140 0,1070 0,0050 0,1170 0,1070'

-

-

-

_

0,0190

-

-

-

-

-

0.0050

-

-

-

V"

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

1

-

-

-

-

-

-

-

-

...ContlWltdri Allelt PENTA E D3S-1 i.; FGA D18S51 D21511 PENTA D 27 0,0510 0,0370 0,0190 0,1590 ; za 0,0050 28,2 li ( i i i ' u i 0,1590 29 510,2 31 n,2 '2 32,2 33 3.3,2 34 34,2 15 30

VWA

DBS1179 D7SB20 DI3S317 DSS81B D16S539

THOl

CSFlPO

TPC1X

8

_

-

:

:-

_ -

-

-

-

-

:

0,2570 0,0370

-

-

1 > 3B,

a

-

-

-

-

-

-

0,0980 0,1070 0,0140 0,0650 0,0140 0,0230

-

-

"*

-

-

-

-

*-

-

-

-

Tlexacto \1 tc-l G-T1 MEC MEP

1,0000 0,9976 0,9998 0,8280 0,8151 0,9088

[ 0,0090 0,0050 0,0090 0,4798 0,7260 0,6590 0,4532

-

-

-

-

~

0,6914 0,1706 0,6904 0.5297 0,5195

_

-

0,5976 0,6930 0.5588 0,5942 0.5884 0,7611 0,2900

0,5060 0,5408 0,3106 0,5140II ll.i

0,2166 0,1282 0,2416 0,7518 0,7584 0,8655 0,0174 H'ii,' ,

-

0.982

0,7994 0,7551 0,9142 0,5779 0,5779 0,7513 0.0820 0.9179

0,2482 ' 0,4308 0,3376 0,2728 0,5921 0,5877 0,7596 0,08O0 0,9199 0.21.20M . i i

0,4780

1

\ \

PICPmPD

Alld

0.1221 0,0275 " 0,0?JO 0.0453 0,8778 0,9724" ,9b5y 0,9546 PENTA E D3S135B FGA D1B551 DI 1 Sil 0,0186 0,9814 poder at

0,6246 0,1506 0,5794 0,3662 0,6638 0.7710 0,8184 0,4754 0,4794 0,7815 0,7426 0,7128 0,4640 0,7885 0,7526 0,7108 ' 0.6716 0,8825 0,8620 0.8.180

0,7125 0,1050 0,8949

0,5333 0,5258 0,7160 0,1026 0,8973

0.0781 ,92T6

0,3818 0,2760 0,5026 0,6324 0,5240 0,5509 0,5077 ' 0,5445 0,7070 0,7292

1 i%3

0,1 106 0.8893

0,0958 0,9041

0,6952

0,1151 0,8868

-

En el cuadro 5, e

PENTA U VWA 08S1179 D75820 D I 15317 DS5B1 8 D165539 THOl CSriPO TPOX umuLivo de dscri mi nacin (HLH fue de 0,9999 y probabilidadttaimwLitiv.ii le exclusin (MEC) fue d e 0,9999954.

n

a

-

C u a d r o 6. Distribucin allica de 1 5 STRs autonmicas y amclgenna en hari^nis ln=37) - anlisis automatizado THlll CSFlPO 0 0 1) 0.013S 0 0 H,l4!fi 0,1622 n.i.r.i 0,0135 WW70 0 0 0 0 0 TPOSC n II D 0,0115 II f II 0.2701 0,7162 (1 II 0 a

VWA II 0,0135 ll n 0 oB

D13S317 I I S I ;-n 0 0 0 0 0 0 fl.OHIl 11.01 i .1

D7S82G 0 0,2973 0 II il! 1 ,0

D21S11 0 0 0 l > 0 0 0 0 D 0 0 l > 0 0 0 0 0 l 0 0 0 0 0 0.1351 0.2412 0.10H! 0.2027 0.2162 0.0946

EJ185J1 0 0 n 0 o 0 II 0,1241 0,1622 O.lll < 0,14(14! 0,m !5 11,1216 0,2162 0 0 0

PENTA E D I 65539 0 0 0 0 11.112" 0 0 0 0.04D5 0,1757 0 0.4865 0 0 0 0,1216 0,1486 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

(i0.44 5'l 0,49165 0 o

PENTA D 0.03" 0 0 0II .1

DB51179 0 0 0 0 0 0 0,0135 II oc n i .w 0,12 t 0,4865 0,0946 0,2027 II 0 n 1 1 II0

FCJA 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.6481. 0,33 7H 0,0|,15 0 0 0 II II II II II II ll ll II II ll ll

II

?

9n 0 HU i , 0

a0 un I II. l?84 0 I I 1 J.'.l II.I.II..:6 0,027 11,0115 11,0676 0 0 0 0

,mo 0

0 |ff9 0,0541 0 0,0676 0 0 0 0

n Ll a II 0,1351 0^6486 o.,i II o.nni nm

0,2973 0,2297 0,1622 0 0 0 0 u 0

03 - 9 , 91 D,S541 0.11405 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 41 0 0 1 1 II 0

o

0 0 0 0 0 0 0 0 0 11,1 151 0,0135 0,0115 0,1151 IM514 0,1757 0,1757 0 0 0 0 0/" ni 0,77137 0,75670 D.59B99 .4739 0,24871 0,10021 0,69979 0,51350 0,51756 0,05767 D7SB20 0,50075 0,69752 0,88383 0.75680

0,09106 0,10785 0,10379 0,10786 0,19117 ! 0.57406 0,58OBI 0,62797 0,43898 | 0,11615 0,10007 0,09863:

PENTA D 0651179 O.UOOl 0,9377 0.08749 0.26158 0,27533 D.72467 0,45940 0,55992 0,19061 THOl 0,46180 0,08749 0,123.15 0,50597

FCA 0,85807 0,1754* 0,08391 0,33863 0,40972 0,59028 0,35130 0,41381 0,16251 TPOX

0,36882 i 0,74640 0,75277 0.78751 0,56102 ' 6,814585 0,09993 0,90137 0,56750 0,91890 0,fi64 fifi 0,91900

0,35735 0,21400

0.47777 0,65476

l'l, 14095

0,1 1617 0,17601 0,82399 0.67550

0,27091 0,72907 0,45930 0.54716 0,17192 CSFlPO

CUMH

U.7B600 0,70997 U.BS'JOS 0,5 L 360 0,45940 0,75670 0,52490 I"l,ri917l 0,13662 -0,07913 VWA

l.\|J H 0,65326 0,46502 ' 0,77790 0,78454 0,81413 0.62704 FIS 0.1 15418 -0,20386-0,16526 41.0B719 -0,11354 019199 n i 8Mt D21S11 PENTA D Aldo PENTA f D3S1358 F C A

DSS1179t

0,65192 0,74397 0.65961 0,14502 0,00149 0,01025 D13S3I7 D58I8 Di 65539

En el cuadro 6, el poder acumulstiw de discriminacin I P D ) fuc di,- [), >999 y probabilidad acumulativa de exclusin ( M E O fue de CX999625

F n u r m m e d i c u * wbtv

ytcnrtiL

L J l y n t ' l k j mcikN ul.ir

I J r w d m YS DVS H DYS DVS DVS DYS 19 385 a 385 b 3891 389 II 390 hi 1 0,166667 14 19 12 30 25 , h2 1 0,166667 14 14 16 30 23 13 ha 1 0.166667 1 16 11 30 23 4 14 1 0,166667 13 15 15 28 23 u n 14 16 12 30 23 1 0,166667 t4 1 0,166667 14 14 16 30 23 M 13

Ma

0,01% 0,0196 0,0196 0 0196 0 196 0,0196 0,0294 0,0196 0,0196 0,01 96 0,0294r r

t

13 13 16 15 15 16 16 " 15 J S . 15 15 17 14 11 17 , 16 15 15 14 11 15 16 17 ! 17 1 4 11

14 15 17 1 17 IR

13 12 13 13 13 13

13

18 18 16 14 17 18 14

13 1413 13

10 28 30 30 31 31 29 30 31 29 31

24 23 21 21 21 21 23 21 21 25 21

10 n 10 J E L , 10 n 10 1.3 10 11 10 11 11 13 11 11 13

10 10

9

11 12 11

13 15 15 14 13 15 13 15 13 13 13 14 13 DYS 393 14 13 13 13 12 13

10 11 11ll

10

1112

12

1112 11 12

11

11 11

11

10 11 12 12 12 12 11 13 11 12 12 11 12 DVS 438

14 14 13 14

14 15 14 14 15 14 14 1 5 DVS 439 12 13 11 Hi 12 12

\A

DVS 391 10 10 10 10 10 10

DYS 392 15 15 15

:4

14 15

DVS 417 15 14 14 14 14 14

1112 12

1112 12

Tabla 5, Informacin haplotpica de 12 STRs de criimomiirui " Y " en varios grupos tnicosTimarlo de la muestra Nmero de haplotipos nicos Diversidad haplotpica ftrfjabiIidad tti match rarirtnrnica Mestizos 102 99 0.999418 0,000582 KioiMjK 102 91 0,997670 0.0O2110c

Negros 102 69 0.> >74761

Hu.iur.ini-. 6 6 _ 0.99919 ' 0.0001

0.002524

Lecturas recomendadas y fuentes de informacin Sobre recomendaciones internacionales * Bar W . , Brinkmann B_, Budowle R-, etl (1997), DNA fCtJmnwndaions, Further repon o the DNA Commission ofthe tSFH regarding the use ot'short tndem repeat systems, Forensic: Sci Int, 1997 Jun 23, 87 (3): 181-4, * Gil P, Brenner C , Brinkmann B., Budowle B., Carracedo A., lobling M A el l DNA Comission ofthe ISFG recommendations on forensic anaiysis using Y-chromosome STRs. (2001), Int J Legal M e d , 114: 305-9.r

Sobre poblaciones nativas latinoamericanas * Budowle B,, Adamowicz M , , Aranda X,, Barna C Chakrarjorty R., Eisenberc, Al, et i. Twelve short tndem repeal loci V chromosome haplotypes: genetic anatysis on populations residing in North America, Forens. Sci, Int. (in nress). * Gene M-, Fuentes M., Huguet E., el t. Quechua Amerinidian popuiation characterized by HLA-DQ, YNZ22, 3APO B, HUMTHOh and HUM VWA A 31A Plymorphsm, J- Forensic Sel, (1998), 43 (2): 403-5, " Sns M., Admixture studies in Latn America: from the 20th cenlury to the 21 tb century, Human Biol, (2000), 72 (1): 155-77. * Zimmeimann R, Phadkc P., Lee A-, et l, Migration ota novel DQA T * alele from Antean origin to North and South America, Human Inmunologv, (1995), 42:233-240.r

r nx.it it iriL'clicji-. MIIIF- j.ni'.|iL.i

l a genetic j molecular e n b meefs:in.i ,'i LI.IM :n.;n.i

Sabr poblaciones ecuatorianas Blagitko N., 'huiHin 0- S02 643 4BO- 565 52 & 580 4B - 565 596 534 53b 685: 11

Sfifl

526

sao-

65 D

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6157

Quantum rwt fRed 670 Bromuro de Elidi KOX Red 611 Rojo de TPJ.T Huiiodmero re elidi Yoduro de propidit IRD 700 Cy? IRD fHKl(tiPfW: w r r p f p w n i i j i

670 605..)-

613 6)5 616 617 767 705 B49

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E m a i c n mffdixiv vibre

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l.i HTC'I < ,1 - m l m i l j - i'n .l I H H I U I . I m i , " ' JIVl:

Agentes intercalantes Son luorocromos que aumentan notablemente lo emisin d e fluorescencia cuando se unen a A D N de doble hlice. El incremento del A D N en cada ciclo se refleja en un aumento proporcional d e la fluorescencia emitida. Es un sistema barato y de fcil mplemcntacin. Tienen el inconveniente d e su baja especificidad, debido a que se unen d e manera inespecffica a dfmeros sueltos en la reaccin. Adems, se recomienda utilizarlos c o n P C R hol-start, ya que sta disminuye las amplificaciones inespecficas. Para ello, se pueden usar polimerasas recombinantes modificadas o anticuerpos d e bloqueo q u e activan la polimerasa cuando se ha alcanzado la temperatura adecuarla. Los equipos de PCR a tiempo al pueden determinar la temperatura d e fusin ( i m ) d e los fragmentos amplificados. La temperatura de fusin es la temperatura a la cual el 50 % del A D N d e la molcula est desnaturalizada, Cada amplicn tiene una Tm caracterstica que defiende d e la longitud y la composicin de sus bases. M t o d o s d e d e t e c c i n d e la f l u o r e s c e n c i a . Existen tres m t o d o s generales: 1. Sondas d e hidrlisis ("aqMan, molecular Beacons y sondas Escorpin* 2. Sondas d e hihrdizacin (Lighl Cycler) 3. Agentes intercalantes en ef A D N (SYBR Green I) l . Sondas de hidrlisis. Las ms utilizadas son sondas T a q M a n , las molecular Beacons y las sondas Escorpin. 1.1 Sondas T a q M a n . Son oligonucletidos marcados con un luorocromo

donador en el extremo 5' que emite iluorescencia al ser excitado y un receptor en e! extremo 3' que absorve la fluorescencia liberada por el d o nador. stos tienen d e 2-J pares d e bases con dos fluorocromos u n i -

dos a sus extremos, I lamados reprter (donador) en el extremo 5' (6-FAM, V I O y quencher (receptor) en el extremo 3' (normalmente T A M R A ) . S e disean para hibridar entre los cebadores sentido (forwardt y antisentido (reverse* d e la secuencia que se quiere amplificar, siendo su temperatura d e fusin varios grados nas alta, d e modo que se asegura una unin completa al A D N durante la P C R . U n factor que hace posible la cuantiicacin con sondas TaqMan es la actividad 5' exonuefeasa d e la Taq p o limerasa. 1.2 M o l e c u l a r FJeacons probes (esferas moleculares). Son tambinOIRO-

nudetidos con una molcula donadora y otra receptora en cada extremo,, pero se dilerencian de las sondas TaqMan e n que no necesitan actividad exonueleasa para generar fluorescencia. C u a n d o estn libres en Ea

Enwivu* m i k l i n K Mihr? ^rn^liL.i

1.1 umtffica: molecular H I la n n t d i a n j ecujIpnaEa

.trfido Cin/ri'x ^ndr.id

mezcla d e reaccin adoptan una estructura de horquilla gracias a qu> poseen dos brazos c o n secuencias complementarias. D e este modo si favorece la proximidad entre los fluorocromos, permitiendo q u e el dona dor apague la fluorescencia del receptor. Sin embargo, al hibridarsc am bos estn n una distancia lo suficientemente grande c o m o para q u e el re portero emita la seal fluorescente y sea captada por el lector, Estos oli gonucletidos permanecen intactos durante la reaccin y en cada c:icl< pueden volverse a unir a la secuencia diana y producir seal.Molecular B c a c o i K " Prtttwf1

Grfico 7. Perlas mo leudares

1.3

Sondas Escorpin ( S c o r p i o n s " Uni-p rabel. La secuencia especfica de1

primer y la deleccin del producto de la P C R se alcanza utilizando ui solo nuclelido. La sonda mantiene la configuracin de un asa cuandt no est hibridizada, semejando la cola d e un escorpin. El fluorforo s < une al extremo el mismo que est treme al receptor inlerno (quen cher) unido al exlremo 1 ' . Esta secuencia se liga .ll extremo 5 ' d e un ce bador especfico, que es un monmero no arnpliicable. Despus de I extensin, la secuencia especfica es capaz d e un irse a su compcmcnti dentro del amplicn extendido d e este modo, se abre el asa inicial.

Grafito 9r Sonriiy fycurpin

F^hrrifi C,anr\fj

Anrlradi

1

EnwviK m n i c i H

siAre p'nljti. Ll

ii,rfi(i:j!ffluleiflilfen la medvinn cuamna

Sondas de hibridacin especficas. Son sondas marcadas c o n dos tipos d e fluorocromos, un donante y un receptor. Fl proceso se basa en la transferencia d e energa fluorescente mediante resonancia (FRET) entre dos molculas. S e las c o n o c e como Sondas

FRET, La tecnologa FRET (Fluorescent

Resonant

Energy Transfer se basa e n el principio d e q u e , cuando un colorante de altaenerga est muy prximo a otro de baja energa, tiene lugar una transferencia de mayor a menor. U n a vez que Ja sonda ha hibridizado, y mientras los dos fluorocromos permanezcan juntos en ella, el quencher (apagador) apaga la fluorescencia del reprter (reportero), esto se c o n o c e c o m o efecto FRET. D u rante la fase de extensin, la Taq polimerasa degrada a la sonda y gracias a su actividad 5'3' exonucleasa, libera al reponer que al separarase del quencher (apagador) emite fluorescencia. Esta seal fluorescente q u e se detecta en cada ciclo es proporcional a la cantidad de producto generado en el mismo. D u r a n te la PCR, se llega a un punto en el que la seal fluorescente alcanza un nivel por encima del mnimo nivel de deteccin; el ciclo en el q u e esto tiene lugar se c o n o c e c o m o Ct (eyele threshold-ciclo umbral). S e lo observa en la fase exponencial d e la P C R y es inversamente proporcional a la concentracin d e templado inicial. La cantidad de A D N d e la muestra puede d e este modo ser determinada por extrapolacin de su Ct e n una curva estndar.

Do or

Acceplor

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Excitation

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Grfico 9, Tecnologa FRET

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3 . A g e n t e s i n t e r c a l a n t e s , S Y B R G r e e n * Es un colorante que se intercala e n el surco menor d e la molcula de A D N y que solo emite fluorescencia cuando est unido a A D N de doble cadena. Es un mtodo muy econmico que presenta el inconveniente de no discriminar entre A D N molde real yotros posibles artefactos,i

Lnt.itfK nilbci^s NJJIM- ^ ' i i r l L . i

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IITMII Gimillv

Xudrjjili

L e w i n [?., Genes, 7ma. tel., Editorial M a r b n , Espaa, 2 0 0 1 , Mallel, JT (2002). Elgenoma Mefdrum D., Aittomation

humano. Ed. Complutense, for genomics,

"T, Ed. Madrid, Espaa

part two: sequencvrs,

microarrays

and future trends, CnameJTcAc, ,i hyperespectral 46. Orlando O

Research, (2000}, 10: 12flf!-1 2.3..

O'Brien K M , W r e n J , D a v e V K , Bai D, Anderson RO, Kayner S el al (1998), A S

imaging DNA sequencer. Revista Sci Instru, 69: 2141 in quantitative PCR

Pinza ni P, Pazzagli M (1999), Devehpments

Clin C h c m Lab M e d , 36 (5) : 255-269. Ruiz Ponte C, Loidi L. Vega A , Cariacedo A, Barros F. Rapad real time flores

cent PCR gene dfisage test for the diagnosisiions. din * ( hvm :Hm,, 4f, 11 O: I -.74-J

of DNA duplications Books

and dele Publication

Schena M . , Microarray Biochip Technology, BioTechniques

Eaton Publishing, sis ofpoinl13:1-10.

Nalick, M A . 2000 primer

Syvanen AC-, From >els to chips: minisequencing

extensin for anatyH u m Mutat, 1 999 S c i e n c e , VoJ

mutalion

and single nucleolide

polymorphisms,

Venler JC y cois (2001 , The sequcnce 291 ; 1 304-1351 .

of the Human

Cenme,

Existen numerosos portales d