Cintica y Enzimas

Introduccin

Las enzimas son las molculas encargadas de acelerar las reacciones qumicas que constituyen el metabolismo de los seres vivos. La Bioqumica moderna, se inici con el estudio de las caractersticas de las enzimas. El impulso inicial tuvo lugar en 1897 cuando Buchner demostr que la fermentacin alcohlica se poda efectuar en extractos de levadura, libres de clulas. A partir de este momento, se hizo posible estudiar las enzimas individuales en forma sistemtica, y definir su importancia para las reacciones qumicas de los seres vivos.

Reacciones Qumicas

Las reacciones qumicas del metabolismo, lo mismo que cualquier otra reaccin qumica, son procesos en los cuales una o ms substancias llamadas reactivos, se transforman en otras llamadas productos, con estructura y propiedades diferentes. En general las reacciones qumicas se representan como: Reactivos Productos

Los cambios de estructura durante las reacciones qumicas slo son posibles si se rompen y/o forman enlaces qumicos. El rompimiento y formacin de enlaces qumicos implica que los tomos comparten sus electrones en forma diferente en los reactivos y en los productos. Podemos entonces concluir que una reaccin qumica es un: Proceso durante el cual se producen reacomodos de los electrones de enlace de los tomos.

Para que se lleven a cabo dichos reacomodos, es necesario que tenga lugar un intercambio de energa. Los intercambios de energa durante las reacciones qumicas los estudia la Termodinmica Qumica.

Termodinmica Qumica

La Termodinmica se encarga del estudio de los intercambios de energa que acompaan a todos los procesos. A partir de un modelo bsico del mundo real y un conjunto de leyes que rigen su comportamiento, la Termodinmica deduce relaciones que describen los cambios de energa y la direccin de los procesos fsicos y qumicos a escala macroscpica. Como no hace ninguna consideracin respecto de las propiedades microscpicas de la materia, no puede decir nada sobre el universo atmico. Es bsicamente esttica pues se ocupa slo del inicio y el final de los cambios y jams de su velocidad, aunque si puede predecir su direccin y punto de equilibrio.

Energa. La energa es el objeto de estudio de la Termodinmica. La energa se define como la capacidad de producir trabajo, modificando o desplazando objetos. La energa puede ser Potencial o Cintica (determinada por el movimiento). La Termodinmica estudia los intercambios y transformaciones de Energa, empleando un Modelo, y aplicando las Leyes de la Termodinmica.

Leyes de la Termodinmica

El estudio de las transformaciones de energa que se producen durante cualquier cambio en el Universo, est basado en las Tres leyes de la termodinmica.

Primera Ley o Ley de la Conservacin de la Energa. La primera ley, describe el balance de la energa intercambiada en un proceso. Su forma ms conocida es la Ley de la Conservacin de la Energa, que dice que: La energa no se crea ni se destruye, pero puede cambiar de una forma a otra. En Termodinmica tambin se enuncia como: La energa total del universo es constante o En un sistema aislado la energa interna es constante. Cuando un sistema intercambia energa con sus alrededores, se producen cambios en la energa interna del sistema.

Simplificando, los cambios de Energa Interna (E) en cualquier sistema, resultan del ntercambio de energa como calor (q) y trabajo (w), y deben cumplir la ecuacin de la primera ley:

E = q w

Segunda Ley. La segunda ley pone un lmite a la eficiencia de una sistema. En su forma ms simple, establece que: Para realizar trabajo, la energa debe fluir de un lugar caliente a uno fro. En otras palabras: En el Universo, los procesos siempre proceden en una direccin, desdeestados de mayor energa hacia estados de menor energa.

La prdida de energa durante el cambio de estado, va acompaada de una prdida de organizacin, o aumento de la libertad de variacin del sistema, que se mide como un cambio de Entropa (S, con unidades de Energa/Temperatura).

Tercera Ley o Ley Cero. Esta ley, marca un punto de referencia absoluto para la medicin de la entropa y, al menos en teora, para todas las propiedades de estado. Todas las substancias tienen entropa positiva, pero a cero grados de temperatura absoluta, la Entropa tiende al mnimo y se vuelve cero para un cristal perfecto.

Catalizadores

Los catalizadores son substancias que aceleran las reacciones qumica, participando en ellas pero sin consumirse. Los catalizadores tienen algunas propiedades generales:

1. Actan a concentraciones bajas.

2. Participan, pero no se modifican ni consumen durante la reaccin.

3. No cambian el equilibrio de las reacciones.

4. No modifican las propiedades termodinmicas de las reacciones, solamente la velocidad con que se alcanza el equilibrio.

5. Cambian el mecanismo de las reacciones, estabilizando los estados intermedios de alta energa.

6. Disminuye la energa de activacin.

Clasificacin

Existen dos tipos de catalizadores, los inorgnicos, sintetizados en laboratorios, y los orgnicos

o enzimas que sintetizan los seres vivos. Aunque ambos tipos tienen las mismas propiedades generales, existen diferencias importantes entre enzimas y catalizadores inorgnicos.

1. Tamao. Las enzimas son protenas o cidos nuclicos, ms grandes que los substratos, grupos funcionales y catalizadores inorgnicos. Las enzimas tienen pesos moleculares mayores (desde 12,000 a 1 milln de Daltons) que los catalizadores inorgnicos.

2. Especificidad. La mayora de las enzimas son especficas de los substratos que usan y/o las reacciones que catalizan, mientras que la especificidad de los catalizadores inorgnicos an es menor.

3. Capacidad Cataltica. Las enzimas aceleran las reacciones mucho ms que los catalizadores inorgnicos, en el orden de 106 a 1017 veces, comparadas con los 102 a 104 de los catalizadores inorgnicos (Tabla 2).

4. Condiciones de Trabajo. Las enzimas son activas en condiciones de pH y Temperatura en las que la mayora de los catalizadores inorgnicos no funcionan.

Tabla 2. Capacidad cataltica de las enzimas

Funciones de las Enzimas. Adems de la catlisis, las enzimas tambin cumplen otras funciones.

1. Catlisis. La mayora de las reacciones qumicas del metabolismo son lentas, las enzimas aceleran las reacciones permitiendo que el metabolismo se efecte a la velocidad que las clulas requieren.

2. Direccin. Las enzimas no permiten la formacin de productos secundarios, de esta manera evitan que se pierdan precursores y energa que la clula necesita; esta caracterstica tambin se conoce como catlisis negativa.

3. Control. La actividad de las enzimas se puede regular para ajustarla a las necesidades del metabolismo. La velocidad del metabolismo es determinada por las enzimas.

4. Acoplamiento. Las enzimas son los agentes encargados de acoplar reacciones no permitidas con reacciones espontneas, permitiendo que se realicen.

Composicin y Estructura

En 1905 Arthur Harden descubri que la actividad de las enzimas requera de dos fracciones, una no ultrafiltrable y sensible a la temperatura, a la que llam zimasa, y otra filtrable y resistente al calentamiento, la cozimasa. La zimasa de Harden, est formada por las protenas, mientras que la cozimasa contena las sustratos y cofactores necesarios para que la actividad de las enzimas.

La mayora de las enzimas son protenas, como lo descubri James B. Sumner en 1926, al cristalizar la enzima Ureasa (EC 3.5.1.5) de la soya. Como tales, tiene todas las propiedades de las protenas. El descubrimiento de las propiedades catalticas de molculas de RNA bautizadas como Ribozimas, realizado en 1981 por Thomas Cech, no modifica en forma importante los temas a revisar ya que en esencia la actividad enzimtica de los RNA tiene las mismas caractersticas cinticas que la de las protenas.

La actividad enzimtica depende de la integridad de la estructura. Todos los niveles estructurales son importantes, 1, 2, 3 y 4 de protenas, y 1, 2 y 3 de cidos ribonucleicos. Los agentes que desnaturalizan protenas, destruyen la actividad enzimtica y lo mismo sucede con las ribozimas.

Su estructura puede estar constituida slo por aminocidos (como la Ribonucleasa pancretica (EC 3.1.27.5) y la Pepsina de la digestin), o pueden ser protenas conjugadas con otros grupos qumicos para realizar cciones que los aminocidos no pueden. Las ribozimas conocidas slo necesitan nucletidos para ser activas, aunque algunas se asocian con iones y protenas.

Los grupos qumicos no protenicos de las enzimas conjugadas se dividen en tres categoras.

1. Cofactores. De naturaleza inorgnica, frecuentemente iones metlicos, entre los ms comunes estn Fe2+, Cu1+, Mg2+, Mo2+, Mn2+ y Zn2+.

2. Coenzimas. Compuestos orgnicos, muchos de ellos derivados de vitaminas, tambin conocidos como Cosubstratos. Algunos ejemplos son cido lipico, pirofosfato de tiamina, biotina y vitamina B12. Tradicionalmente, se llaman coenzimas a los cosubstratos libres, que se separan de la enzima por dilisis.

3. Grupos prostticos. Se denomina as a los Cofactores o Coenzimas que se unen con fuerza a su enzima, a veces mediante enlaces covalentes, y no se separan por dilisis.

Las enzimas conjugadas pueden requerir tanto cofactores como coenzimas.

1. Holoenzimas. Son las enzimas conjugadas que tiene actividad cataltica alta porque estn unidas a su coenzima o cofactor.

2. Apoenzima. Es la parte protenica de una enzima conjugada, cuando no se encuentra presente el cofactor o coenzima necesarios. En estas condiciones la protena pierde parte o toda su actividad cataltica.

Basndose en lo anterior, se dice que la protena es la parte responsable de la especificidad de la enzima mientras que la coenzima o cofactor son responsables de la catlisis. Esta es una simplificacin y debe interpretarse con cautela.

Muchas enzimas son protenas oligomricas y algunas de sus subunidades tiene funciones de regulacin.

Varias enzimas tienen ms de una forma molecular capaz de catalizar la misma reaccin dentro de un organismo, un tejido, e incluso una sola clula. A estas molculas se les llama Isoenzimas.

Las isoenzimas catalizan la misma reaccin pero tiene propiedades cinticas diferentes, composicin de aminocidos distinta y se pueden separar por mtodos de purificacin. Un ejemplo conocido es la Lactato Deshidrogenasa (LDH EC 1.1.1.27) que tiene cinco formas isoenzimticas, todas con caractersticas cinticas diferentes. La distribucin de las isoenzimas en un organismo es el reflejo de las diferencias que hay entre los distintos sitios en que se localiza, por ejemplo:

1. Patrones metablicos diferentes. Las diferencias entre las isoenzimas de LDH de msculo cardiaco y estriado reflejan las diferencia metablicas entre ambos tejidos, el primero es esencialmente aerbico mientras que el segundo es facultativo.

2. Localizacin y funcin diferente dentro de una misma clula. La enzima Malato Deshidrogenasa

(EC 1.1.1.37) se encuentra en formas diferentes, en la mitocondria y en el citoplasma de las clulas, catalizando la misma reaccin pero en vas metablicas distintas.

3. Diferencias en desarrollo de los tejidos. La LDH del hgado muestra un patrn isoenzimtico en el feto distinto al del adulto

4. Ajustes en la velocidad del metabolismo. Varias enzimas reguladoras existen en distintas formas isoenzimticas que difieren en su respuesta a los moduladores, como la Glucocinasa (EC 2.7.1.2) y la Hexocinasa (2.7.1.1).

El primer paso en la catlisis enzimtica es la unin del substrato a la enzima para formar el llamado complejo Enzima-Substrato (ES). El substrato se une a la enzima en un lugar especfico de esta llamado Sitio Activo. En la Figura 9 se muestra el sitio activo de enzima Fosfofructocinasa (EC 2.7.1.11) ocupado por sus substratos, ATP y Fructosa 6 - fosfato.

El complejo ES, se ha estudiado en varias enzimas usando tcnicas como la microscopia electrnica, ifraccin de rayos X, Resonancia Magntica Nuclear y varios mtodos espectroscpicos, determinndose que las propiedades ms importantes del sitio activo son:

1. Constituye slo una pequea parte de toda la estructura de la enzima.

2. Es el sitio de reconocimiento y unin del substrato.

3. Contiene los restos de aminocidos que participan en las reacciones qumicas.

4. Tiene una forma tridimensional caracterstica, determinada por el arreglo de restos de aminocidos provenientes de diferentes secciones de la cadena de aminocidos, que se aproximan entre s, debido a las estructuras 2, 3 y 4.

Los substratos se unen al sito activo mediante interacciones no covalentes como:

1. Enlaces electrostticos.

2. Puentes de hidrgeno.

3. Fuerzas de van der Waals.

4. Interacciones hidrfobas.

Ocasionalmente tambin se pueden formar enlaces covalentes de corta duracin.

Mecanismos de la Catlisis Enzimtica

La complementariedad de forma tridimensional entre la enzima y el substrato permite disminuir la energa de activacin de la reaccin, mediante factores como:

1. La orientacin de los substratos en el sitio activo es la ms apropiada para la reaccin.

2. La participacin de las cadenas laterales de los aminocidos en el complejo ES, permite estabilizar los estados de transicin.

3. La unin del substrato al sitio activo, aumenta la concentracin efectiva de los grupos reactivos y facilita la reaccin.

4. Los cambios de conformacin de la enzima, provocados por la unin del substrato al sitio activo, inducen tensin en la molcula y facilitan el rompimiento de enlaces.

Existen dos modelos para explicar la unin de la enzima y el substrato y la catlisis enzimtica:

1. Modelo de la llave y la cerradura. Fue propuesto por Emil Fischer a finales del siglo XIX.

Considera que la enzima es una estructura rgida a la cual se debe ajustar el substrato.

2. Modelo de ajuste inducido. Desarrollado por Daniel Koshland en la dcada de 1960. Supone que la enzima es flexible, capaz de cambiar de forma cuando es inducida por la unin del substrato apropiado, moviendo los grupos R hacia posiciones que facilitan la reaccin.

Especificidad

La especificidad de las enzimas por sus substratos es variable, y se pueden describir tres tipos generales:

Especificidad absoluta. Una enzima une slo un substrato, cataliza una sola transformacin y forma un solo producto.

1. Aspartasa (EC 4.3.1.1). Esta enzima de plantas y bacterias cataliza la adicin del amoniaco al cido fumrico para formar el aminocido l-Aspartato. La enzima es absolutamente especfica para la geometra trans del cido fumrico y la isomera ptica del l-Aspartato.

Esquema 1. Reaccin de la Aspartasa

2. Aconitasa (EC 4.2.1.3). Enzima del ciclo de Krebs que interconvierte en forma reversible el Citrato y el Isocitrato. La especificidad es absoluta para los dos cidos y de los cuatro ismeros posibles del Isocitrato slo forma y utiliza el ismero 2R, 3S.

Esquema 2. Reaccin de la Aconitasa

Especificidad de grupo. Una enzima puede catalizar la misma reaccin en un grupo de substratos con estructura semejantes.

1. Las enzimas digestivas Tripsina y Quimotripsina (EC 3.4.21.1) miembros de la familia de las proteasas con serina, catalizan el rompimiento de cualquier enlace peptdico e incluso ster, siempre que el grupo carboxilo provenga de aminocidos especficos, aromticos en el caso de la Quimotripsina y catinicos en el de Tripsina.

Esquema 3. Especificidad de Tripsina y Quimotripsina

2. Enzimas de la Oxidacin de cidos Grasos. Este grupo de enzimas mitocondriales, es capaz de oxidar cidos grasos, sin importar la longitud de la cadena de carbonos

Esquema 4. Beta-oxidacin de cidos grasos

Especificidad de reaccin. Estas enzimas catalizan una reaccin en substratos que pueden tener estructuras muy diferentes.

1. Las enzimas de destoxificacin de frmacos son especficas para reacciones de oxidorreduccin, hidrlisis, conjugacin, etc., pero los substratos tienen estructuras muy variadas.

2. La Mono Amino Oxidasa (MAO EC 1.4.3.4), cataliza la desaminacin oxidativa de varios neurotransmisores con estructura diferente.

Esquema 5. Ejemplo de reaccin catalizada por la MAO

Algunos autores interpretan la especificidad enzimtica de otra forma, diciendo que:

Todas las enzimas son especficas porque la ausencia de una no puede ser substituida por ninguna otra.

Medicin de la Actividad Enzimtica

La unidad de actividad enzimtica se define como la cantidad de enzima que causa la transformacin de 1 micromol (1 mol = 10-6mol) de substrato por minuto, a 25 C, en condiciones ptimas de actividad.

Actividad especfica. Es el nmero de las unidades de actividad de enzima por miligramo de protena. La actividad especfica es una medida de pureza de la enzima, aumenta durante la purificacin y alcanza el valor mximo y constante cuando la enzima est pura.

Clasificacin y Nomenclatura

En 1878. Friedrich Wilhelm Khne us por primera vez el trmino Enzima, que significa en la levadura, para referirse al agente causante de la fermentacin del azcar, y distingui dicho agente del organismo que lo produce.

En 1883. Pierre mile Duclaux introdujo la convencin de nombrar las enzimas aadiendo el sufijo asa, al nombre del sustrato para el que se reporta por primera vez su accin.

1. Ureasa, cataliza la hidrlisis de Urea.

Esquema 6. Reaccin de la Ureasa

2. Arginasa (EC 3.5.3.1) hidroliza el aminocido Arginina.

Esquema 7. Reaccin de la Arginasa

Este esquema se modific empleando el nombre del substrato o producto, seguido del tipo de reaccin con terminacin asa.

1. Glutamina Sintetasa (EC 6.3.1.2), cataliza la sntesis del aminocido Glutamina a partir del cido Glutmico y amoniaco.

Esquema 8. Reaccin de la Glutamina Sintetasa

2. La ya mencionada Lactato Deshidrogenasa, es la enzima que cataliza la oxido-reduccin reversible del cido lctico en cido pirvico.

Esquema 9. Reaccin de la LDH

Otros nombres no se relacionaron con el substrato o reaccin, sino con la fuente de donde se obtena la enzima.

1. Pepsina, es una enzima digestiva que hidroliza protenas y se obtiene del jugo pptico.

2. Papana, es otra proteasa que se obtiene de la cscara de papaya.

Estas prcticas dieron como resultado posibles confusiones porque:

1. Una misma enzima puede tener varios nombres; por ejemplo, Citrato Sintetasa, Enzima Condensante y Citrogenasa, son nombres que se han aplicado a la enzima que cataliza la formacin de cido Ctrico a partir de cido Oxalactico y Acetil-CoA en el ciclo de Krebs, que hoy se conoce como Citrato Sintasa (EC 4.1.3.21).

2. Un mismo nombre se puede dar a enzimas diferentes; por ejemplo, las proteasas son enzimas que catalizan hidrlisis de protenas pero existen varios tipos extra e intracelulares.

Clasificacin y Nomenclatura Digital

En 1972. La Comisin de Nomenclatura Enzimtica, rgano creado por la Unin Internacional de Bioqumica, hoy Unin Internacional de Bioqumica y Biologa Molecular, propuso un esquema de nomenclatura y clasificacin de las enzimas, basado en los mecanismos de reaccin que se ilustran en la Tabla 3, acompaados de ejemplos de nombres recomendados para algunas enzimas representativas de cada categora.En la Clasificacin Digital, porque cada enzima se identifica con un conjunto de cuatro nmeros, separados con puntos. Antes de los nmeros se escriben las iniciales EC, correspondientes a Comisin de Enzimas, que es el organismo encargado de elaborar y mantener dicha clasificacin. La clasificacin se hace con base en el mecanismo de la reaccin que cataliza cada enzima, en especial el del primer paso de la reaccin que es determinante de cualquier reaccin posterior. Se reconocen seis tipos de mecanismos de reaccin, que se designan con nmeros, los cuales se escribe como el primer nmero de la clasificacin de las enzimas; los tipos de mecanismos son:

1. Oxidorreductasas. Catalizan reacciones de transferencia de electrones en las que un substrato se oxida (pierde electrones) y otro se reduce (gana electrones) con frecuencia, uno de los substratos es una coenzima.

2. Transferasas. Mueven radicales qumicos entre dos molculas distintas al agua.

Tabla 3. Mecanismos de Reaccin de la Clasificacin Digital

3. Hidrolasas. Catalizan la transferencia de radicales qumicos al agua, lo cual equivale al rompimiento de enlaces con adicin de los elementos de una molcula de agua.

4. Liasas. Catalizan reacciones de eliminacin, formando dobles enlaces, o reacciones de adicin a dobles enlaces.

5. Isomerasas. Forman ismeros, moviendo radicales qumicos dentro de una misma molcula, provocando cambios estructurales o geomtricos.

6. Sntetasas o Ligasas. Forman enlaces C-C, C-S, C-O, C-N, acoplando la formacin, al rompimiento de molculas de Adenosn Trifosfato (ATP), u otro nucletido de alta energa de hidrlisis (XTP).

En cada clase principal existen subclases y sub-subclases, que se representan con el segundo y tercer nmeros, y proporcionan informacin sobre los substratos, productos, coenzimas, tipos de enlace que se modifican, y datos caractersticos de cada tipo de reaccin, como se muestra en la Tabla 4.

Tabla 4. Informacin en las subclases de la clasificacin digital

Por ltimo, se agrega un cuarto nmero secuencial que indica el orden en que se incluyen las enzimas en la clasificacin.

Junto con la clasificacin digital, la comisin de nomenclatura asigna a cada enzima un nombre sistemtico, que describe la reaccin, separando con dos puntos los nombres de los participantes y el tipo de reaccin (ver Tabla 5). Estos nombres resultan engorrosos por ello, tambin se asigna un nombre comn permitido, frecuentemente el ms usado antes de la clasificacin.

Como ejemplo de la nomenclatura digital, en el Esquema 10 se presenta la reaccin de transferencia de un grupo fosfato entre el ATP y la D-Glucosa.

Esquema 10. Reaccin de fosforilacin de Glucosa

A una de las enzimas que cataliza esta reaccin, le corresponde el nmero de clasificacin EC 2.7.1.1, que significa:

2 = Clase principal = Transferasa

7 = Subclase = Grupo transferido = Fosfato proveniente de ATP

1 = Sub-subclase = Aceptor = el aceptor es un radical hidroxilo

1 = Numero secuencial de la enzima particular dentro de esta categora.

El nombre oficial asignado a la enzima es ATP : Glucosa : Fosfato Transferasa, y su nombre comn recomendado es Hexocinasa.

Tabla 5. Estructura de los Nombres Sistemticos y Recomendados

Cintica Enzimtica

La cintica enzimtica estudia el mecanismo, velocidad y los factores que modifican las reacciones catalizadas por enzimas. Los factores que estudiaremos son la concentracin de substrato, temperatura, pH, concentracin de enzima, e inhibidores enzimticos.

Concentracin de Substrato

La concentracin del substrato tiene un efecto importante en la velocidad de las reacciones enzimticas.

El anlisis del efecto del cambio de concentracin de substrato, proporciona informacin respecto del mecanismo de reaccin, especificidad y propiedades cinticas de las enzimas.

En 1902, al estudiar la cintica de la hidrlisis de Sacarosa, Adrian Brown descubre la saturacin de la enzima Invertasa (EC 3.2.1.26) y propone que la reaccin se efecta en dos etapas, primero la enzima (E) y el sustrato (S), se unen para formar un complejo (ES):

E + S ES

Que se disocia liberando el producto (P):

ES E + P

Despus, en 1903, Vctor Henri estudia el equilibrio de la formacin del complejo enzimasubstrato y propone una expresin cuantitativa entre la concentracin de sustrato y actividad enzimtica. En 1913, Leonor Michaelis y Maude L. Menten corrigieron el trabajo de Brown y Henri.Aplican condiciones estrictas para la medicin de la actividad enzimtica, y suponen que la formacin del complejo ES, es rpida y reversible, mientras que la liberacin del producto es lenta.

Con base en este supuesto, proponen el modelo del Equilibrio Instantneo para determinar la relacin entre la concentracin de substrato y la velocidad de las reacciones enzimticas. y obtienen una relacin matemtica que describe dicho efecto, la cual se conoce como la ecuacin de Michaelis y Menten:

donde:

v = velocidad de la reaccin

[S] = Concentracin de substrato

VMAX = Mxima actividad enzimtica

KM = Constante de Michaelis

Como se muestra en la Figura 14, la ecuacin de Michaelis y Menten es una hiprbola; para valores pequeos

de [S] la cantidad del substrato limita la velocidad; mientras que con valores grandes el lmite es la cantidad

de enzima.

Las condiciones de equilibrio instantneo, propuestas por Michaelis y Menten consisten en suponer que E y S

reaccionan muy rpidamente para formar ES mientras que la disociacin del complejo hacia producto es relativamente lenta porque k2 es muy pequea. Por lo tanto, el complejo ES se encuentra en equilibrio con E y S. En estas condiciones, KM es igual a la constante de equilibrio de la disociacin del complejo ES:

Figura 14. Cintica de Michaelis

Ya que k2 es pequea, a menudo es el factor que limita la velocidad y por ello se conoce como la constante cataltica (kcat) de la enzima.

Aos despus, en 1925 George E. Briggs y John B. S. Haldane corrigieron el trabajo de Michaleis al establecer que la suposicin de que k1 y k-1 son mucho mayores que k2 no siempre se cumple, por lo tanto no se alcanza el equilibrio de la disociacin de ES. En su lugar proponen que la concentracin de ES se encuentra en un Estado Estacionario (Figura 14) en el que la velocidad de formacin de ES, es igual a la de descomposicin por disociacin y por formacin de producto.

Con esta suposicin la ecuacin no cambia de forma pero KM ya no es igual a la constante de disociacin de ES, ahora es:

Figura 15. Variacin de la concentracin de E, S y ES, durante una reaccin enzimtica

Significado de VMAX

Es la mxima actividad que puede alcanzar una enzima, tericamente se logra en condiciones de [S] grande, porque entonces la enzima se satura y trabaja tan rpido como es posible. En la prctica es imposible que la enzima alcance el valor de VMAX, debido a limitaciones de difusin de productos y sustratos, desde y hacia el sitio activo.

Significado y Propiedades de KM

Si la suposicin de Michaelis y Menten es valida, KM es la constante de disociacin de ES a E + S, igual a k-1/k1. Por lo tanto, es una medida de la afinidad de la enzima por su substrato. Si KM es grande significa que k-1 es grande o que k1 es pequea por lo que la reaccin inversa es mas favorecida que la reaccin directa y con ello la afinidad de la enzima por su substrato es baja. Por el contrario, si KM es pequea, la afinidad de la enzima por el substrato es grande.

Por otro lado, segn Briggs y Haldane, KM representa el cociente (k-1 +k2)/k1, este cociente sigue siendo la constante de disociacin de ES, pero ahora tanto hacia S como hacia P, porque se supone que k2 contribuye en forma significativa a la desaparicin de ES. De cualquier manera, valores de KM grandes representan baja afinidad por el substrato y valores pequeos afinidad alta. El valor de KM tambin corresponde a la concentracin de S en la cual v = VMAX/2, que se interpreta como la concentracin a la cual la enzima est saturada slo a la mitad.

Cuando ms de una enzima catalizan una reaccin, o si no estamos seguros de cual es el substrato verdadero de una enzima, los valores de KM indican la relacin ms apropiada.

1. Tpicamente, si la enzima trabaja con varios substratos podra suponerse que el substrato con el KM ms bajo es el substrato verdadero.

2. Para decidir qu enzima es la importante necesitamos saber la concentracin del substrato y el valor de KM.

Segn las condiciones de [S], el orden de la reaccin es diferente.

Temperatura

Igual que ocurre en las reacciones qumicas, al aumentar la temperatura aumenta la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Esto se debe a que un mayor nmero de molculas alcanzan la energa cintica necesaria para superar la energa de activacin de la reaccin. Sin embargo, el aumento de temperatura tambin disminuye la estabilidad de la estructura de las protenas y las enzimas comienzan a desnaturalizarse, de modo que a medida que aumente la temperatura la actividad enzimtica tiende a bajar. Como consecuencia de estos efectos opuestos del aumento de temperatura, existe una Temperatura ptima en la cual la actividad enzimtica tiene un mximo.

Es de suponer que a la temperatura normal de los organismos las enzimas sean estables, y por lo tanto estn por debajo de su temperatura ptima.

Figura 18. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica

La mayora de enzimas se desnaturalizan rpidamente a 100 C y pierden mucha de su actividad al ser expuestas a temperaturas superiores a 60 C, an por perodos de tiempo cortos. La particularidad de algunas enzimas, por ejemplo, la Adenilato Cinasa (EC 2.7.4.3) y la Ribonucleasa de resistir la ebullicin, facilita enormemente su purificacin ya que el resto de enzimas pueden ser destruidas por un tratamiento preliminar con calor.

Una resistencia excepcional al calor se observa en las enzimas de bacterias que viven en aguas termales, a temperaturas de 60 a 80 C, como Thermophilus aquaticus, bacteria de la cual se extrajo la enzima Polimerasa de DNA (EC 2.7.7.7) que se us para desarrollar la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) de gran importancia en la biologa molecular actual. Quiz ms sorprendente sea el caso de algunas enzimas que pueden ser desnaturalizadas in vitro por una cada de la temperatura. Esto se explica suponiendo que a la energa libre de formacin de los enlaces que determinan la conformacin de estas enzimas, proviene al menos en parte, de la entropa del medio, la cual disminuye al disminuir la temperatura.

La importancia para los animales homeotermos de mantener su temperatura corporal constante alrededor de 310 K (37 C) radica en que s la temperatura del organismo varia con la del ambiente y esta disminuye a 10 C (283 K) la velocidad del metabolismo disminuye en un factor de 6, respecto de la de 37 C y esto es una desventaja para la supervivencia.

Para fines prcticos, una expresin conveniente de la relacin entre la velocidad de reaccin y la temperatura es el llamado Q10, que corresponde al valor del cociente entre la velocidad de la reaccin a dos temperaturas separada por 10 C

Los Q10 de las reacciones catalizadas por enzimas estn comprendidos dentro de un margen estrecho, entre 1.5 y 2.5, mientras que los de las reacciones no enzimticas estn entre 2.0 y 4.0. El valor de Q10 de una reaccin enzimtica es importante cuando la actividad de la enzima se mide a temperaturas diferentes de la fisiolgica.

pH

El pH del medio afecta la actividad de las enzimas, porque muchos de los aminocidos tiene restos ionizables. Los cambios de pH modifican el grado de ionizacin de todos o alguno de estos grupos, lo que repercute en la ionizacin total de la molcula de enzima modificando la actividad de la enzima al menos por tres mecanismos.

1. Los pH extremos, por debajo de 4.0, o por arriba de 10.0, cambian el grado de ionizacin de casi todos los restos de aminocidos de la enzima, de forma que puede alterarse su estructura tridimensional. Si este cambio es suficientemente grande, se desnaturaliza la enzima y se pierde su actividad de forma irreversible. Incluso, la disminucin del pH, que se presenta en las muestras de fluidos corporales o de tejidos por dao o muerte celular, puede ocasionar la desnaturalizacin de las enzimas.

2. Las variaciones de pH ms pequeas, entre 4 y 10, afectan a un nmero menor de grupos ionizables, pero si stos estn presentes en el sitio activo, la actividad enzimtica cambia en forma importante. Sin embargo, este cambio normalmente es reversible.

3. La variacin del pH tambin puede alterar la ionizacin del substrato, y modificar la unin enzima substrato.

Para muchas enzimas, el efecto del pH tiene forma de campana con un valor de pH ptimo bien definido, pero para otras, la forma de la curva es muy diferente; por ejemplo, cuando en la interaccin enzima substrato participan muchos grupos ionizables. Los puntos de inflexin de la curva pH/actividad corresponderan a los pK de los grupos responsables de la dependencia frente al pH. Este tipo de informacin se ha utilizado para identificar de los aminocidos del sitio activo.

Figura 19. Efecto del pH sobre la actividad enzimtica

Algunas enzimas estn adaptadas para funcionar al pH propio de su ambiente. Por ejemplo, la Pepsina tiene un pH ptimo de 2.0, que corresponde aproximadamente al pH del jugo gstrico. Por otro lado, el pH ptimo de ciertas enzimas intracelulares est muy alejado del pH intracelular; por ejemplo, la Glicerato cinasa (EC 2.7.1.31) tiene un pH ptimo de 9.8, y la Fosfoglicerato mutasa (EC 5.4.2.1) de 5.9. Esto puede deberse a que las enzimas manifiestan propiedades diferentes in vitro e in vivo, donde la interaccin con los componentes celulares pueda modificar su dependencia del pH.

Concentracin de Enzima

Como se explico antes, la velocidad de la actividad enzimtica, depende de la constante cataltica y la concentracin del complejo enzima substrato.

S la enzima se encuentra en condiciones de [S] constante, o de saturacin, su actividad depende solamente de la concentracin de enzima con una cintica de orden 1 esto es, al aumentar la concentracin de enzima la actividad enzimtica aumenta en la misma proporcin. Este efecto tiene relevancia biolgica en los procesos de induccin enzimtica, cuando la actividad de una enzima que no exista o estaba a un nivel muy bajo, aumenta por la sntesis de la misma, provocada por la acumulacin de su sustrato

Inhibicin Enzimtica

Los inhibidores enzimticos son molculas que se unen a las enzimas y disminuyen su actividad.

Las clulas emplean como inhibidores molculas de intermediarios metablicos o iones, para controlar la actividad enzimtica como parte de la regulacin del metabolismo. En investigacin se usan inhibidores para estudiar las propiedades de las enzimas. Muchos inhibidores enzimticos son usados como medicamentos, venenos, pesticidas, etc. Existen dos tipos generales de inhibidores enzimticos: Reversibles e Irreversibles.

Los inhibidores irreversibles se combinan o destruyen un grupo funcional de la enzima, necesario para la actividad cataltica. Los inhibidores irreversibles se disocian muy lentamente de la enzima porque se unen con fuerza, ya sea en forma covalente, la mayora, o no covalente, por tal motivo se dice que no se pueden eliminar mediante dilisis. Ejemplos de inhibidores irreversibles son:

1. Diisopropilfluorofosfato (DIFP). Inhibidor de la enzima Acetilcolina esterasa (EC 3.1.1.7) que cataliza la hidrlisis del neurotransmisor acetilcolina. Esta reaccin es necesaria para la correcta transmisin nerviosa. Se usa en pesticidas como el Malatin. El DIFP se une especficamente a un residuo de Serina en el sitio activo de la enzima.

Esquema 11. Reaccin del DIFP

2. La yodo-acetamida es un inhibidor irreversible que reacciona especficamente con los grupos sulfhidrilo de la Cisteina.

Esquema 12. Yodacetamida

3. El Cianuro(1-) interfiere con el transporte de electrones en el grupo Hemo de los citocromos.

4. Los iones Mercurio(II) y Plomo(II) inhiben las enzimas que tienen grupos tiol (-SH), en su sitio activo, unindose a ellos.

Por su parte, los inhibidores reversibles se unen a las enzimas con menos fuerza, casi siempre en forma no covalente, de modo que se disocian rpidamente y se pueden eliminar por dilisis. No modifican la estructura de los grupos funcionales de las enzimas y cuando se disocian, la enzima recupera su actividad. Los inhibidores reversibles se clasifican segn su efecto cintico en tres clases: Competitivos, No Competitivos e Incompetitivos.

1. Inhibidores Competitivos

a. Por lo general son anlogos del substrato. Su estructura tridimensional es semejante a la del substrato natural.

b. Compiten con el substrato por el sitio activo. La enzima puede unir al substrato o al inhibidor pero no ambos simultneamente, la unin de uno inhibe la unin del otro.

Figura 20. Unin de Inhibidores competitivos

c. El inhibidor unido a la enzima no es transformado, slo ocupa el sitio activo y evita la formacin del complejo ES, disminuyendo la proporcin de molculas de enzima que pueden formar producto.

Esquema 13. Mecanismo de accin de los Inhibidores competitivos

d. La velocidad mxima de la enzima no cambia porque el efecto del inhibidor se puede revertir, aumentando la concentracin de substrato; por eso se dice que la inhibicin competitiva es remontable.

Figura 21. Grficas de Michaelis-Mente (A) y Lineweaver-Burk (B) del efecto cintico de los Inhibidores competitivos

e. La KM aumenta por un factor igual a (1+[I]/Ki) siendo [I] la concentracin del inhibidor y Ki la constante de afinidad del inhibidor por la enzima.

2. Inhibidores No Competitivos

a. Su estructura tridimensional no necesita estar relacionada con la del substrato.

b. No compiten con el substrato, se une a la enzima en un sitio distinto del sitio activo. La enzima puede unir al substrato y al inhibidor simultneamente. Pueden formar complejos tanto con la enzima libre como el complejo ES.

Figura 22. Unin de Inhibidores No competitivos

c. Al unirse a la enzima cambian la conformacin de esta, evitando que transforme el substrato en producto.

d. Disminuyen el nmero de recambio de la enzima y la inhibicin no puede ser remontada con concentraciones altas de substrato por lo que la VMAX disminuye en un factor igual a (1+[I]/Ki).

Esquema 14. Mecanismo de accin los Inhibidores No Competitivos

e. La enzima que no est unida al inhibidor no cambia y por ello KM permanece constante.

Figura 23. Grficas de Michaelis-Menten (A) y Lineweaver-Burk (B) del efecto cintico de los inhibidores No competitivos

3. Inhibidores Incompetitivos o Acompetitivos

a. No tienen relacin estructural con el substrato.

b. Son incapaces de unirse a la enzima libre, primero se debe formar el complejo ES para que la enzima adquiera una conformacin a la cual se une el inhibidor.

Figura 24. Unin de Inhibidores incompetitivos

c. La unin del inhibidor impide que la enzima adquiera la conformacin necesaria para transformar el substrato en producto.

d. No se puede remontar la inhibicin porque la presencia de mayor cantidad de substrato favorece la unin del inhibidor, y por ello VMAX disminuye en un factor igual a (1+[I]/Ki).

Esquema 15. Mecanismo de accin de los Inhibidores Incompetitivos

e. La interaccin del inhibidor con el complejo ES desplaza el equilibrio hacia la formacin del complejo ES, por lo que KM tambin diminuye en un factor igual a (1+[I]/Ki).

Figura 25. Grficas de Michaelis-Menten (A) y Lineweaver-Burk (B) del efecto cintico de los Inhibidores incompetitivos

Las caractersticas de los inhibidores enzimticos reversibles se resumen en la Tabla 7.

Tabla 7. Propiedades de los Inhibidores Reversibles

Regulacin de la Actividad Enzimtica

Existen varios niveles de control de la actividad de las enzimas, los tres ms importantes para nosotros son:

1. Regulando la concentracin de enzima. La actividad de cualquier enzima es proporcional a la cantidad que existe de ella.

2. Modificando la estructura covalente de la enzima. Diferentes formas de regulacin de la actividad enzimtica implican la formacin y el rompimiento de enlaces covalentes.

3. Alterando la forma de las enzimas. Como cualquier otra macromolcula, la funcin de las enzimas depende de su forma tridimensional, modificaciones de esta alteran la actividad.

Regulacin de la Concentracin de Enzimas. La actividad de algunas enzimas se encuentra presente durante toda la vida de la clula, an en momentos en los que no se usan. Este tipo de enzimas se llama constitutivas. En contraste, existe otro grupo de enzimas que slo se sintetiza cuando se van a usar, son las llamadas enzimas inducibles. Ejemplos de enzimas constitutivas son las de Gliclisis, sntesis de protenas, metabolismo de cidos grasos, etc. Todas estas enzimas son de gran importancia en el metabolismo energtico y de sntesis en las clulas. Entre las enzimas inducibles se encuentran las que se encargan de la destoxificacin de frmacos, las enzimas de sntesis de colesterol y algunas encargadas de otras vas especiales y especficas de algunos tipos celulares.

La regulacin de la concentracin de enzimas se lleva a cabo a travs del control de la sntesis de protena, mediante el mecanismo conocido como Opern. El opern es la unidad de regulacin de la expresin de la informacin gentica, y su funcionamiento detallado se discutir al estudiar las funciones de los cidos nucleicos. En este momento, basta decir que cuando hace falta el producto de una va metablica o se acumula el substrato de una enzima, se induce la sntesis de las enzimas de la va respectiva. Por otro lado, cuando se acumula el producto de una va metablica, o se adquiere del exterior, se reprime la sntesis de una o ms de las enzimas de la va. Esta forma de regular la actividad de las enzimas tiene la caracterstica principal de ser econmica pues las enzimas slo se sintetizan cuando se necesita su actividad. Por otro lado, tiene la desventaja de ser lenta en respuesta porque es necesario que se sintetice la enzima, y adems irreversible, una vez sintetizada la enzima su actividad no se detiene hasta que se degrada.

Modificaciones covalentes. Esta forma de regulacin se lleva a cabo mediante el rompimiento y/o formacin de enlaces covalentes. Existen dos tipos bsicos.

1. Activacin de zimgenos o proenzimas. Los zimgenos o proenzimas son molculas de protena sin actividad cataltica que se sintetizan, se guardan y se convierten en enzimas activas por hidrlisis de una parte de su estructura, cuando se necesita su actividad.

Por ejemplo, la Tripsina una proteasa de la digestin, se sintetiza en el Pncreas en forma de Tripsingeno el cual se libera al intestino delgado donde es convertido en Tripsina por accin de la enzima Enteropeptidasa (EC 3.4.21.9), que elimina seis aminocidos del extremo carboxilo de la cadena peptdica. Todas las enzimas digestivas del Pncreas (Tripsina, Quimotripsina, Elastasa (EC 3.4.21.36), Carboxipeptidasa (EC 3.4.16.5)), se regulan de esta forma.

Este mecanismo de regulacin tiene la ventaja de que la respuesta es ms rpida que en la regulacin de la sntesis, pero es menos econmica porque se debe sintetizar la enzima, aunque no se use, adems, sigue siendo irreversible.

2. Regulacin por Fosforilacin - Desfosforilacin. La adicin de fosfatos a la estructura de algunas enzimas puede aumentar o disminuir su actividad. S la enzima desfosforilada es activa, la fosforilacin la inhibe. Por el contrario, s la enzima sin fosfato no tiene actividad, la fosforilacin la activa. La eliminacin del fosfato devuelve la enzima a su estado de actividad inicial.

La fosforilacin de las protenas est a cargo de las enzimas llamadas Proten Cinasas (EC 2.7.1.n) y la desfosforilacin depende de las Proten Fosfatasas (EC 3.1.3.16). Ambos tipos de enzimas tambin se pueden regular. Las proten cinasas se agrupan en familias, segn el resto de aminocido al que unen el fosfato, como proten cinasas de Tirosina, Treonina o Serina.

Un buen ejemplo de este tipo de regulacin se encuentra en las enzimas del metabolismo del Glucgeno.

La sntesis de Glucgeno depende de la enzima Glucgeno Sintasa (EC 2.4.1.11), que sin fosfato es activa y cuando es fosforilada disminuye su actividad. Por su parte, la Glucgeno Fosforilasa (EC 2.4.1.1) que degrada el Glucgeno, es inactiva cuando no tiene fosfato y se activa por fosforilacin, de esta forma las dos vas no pueden funcionar simultneamente; los estmulos que favorecen la fosforilacin de las enzimas, estimulan la degradacin y detienen la sntesis, mientras que la desfosforilacin activa la sntesis y detiene la degradacin.

Con frecuencia los estmulos externos, como neurotransmisores y hormonas, provocan cambios dentro de la clula activando las proten cinasas.

La regulacin por Fosforilacin - Desforforilacin, es costosa en cuanto a energa porque los fosfatos que se usan para fosforilar las protenas provienen de ATP y la energa se pierde al desfosforilarlas, pero es de respuesta muy rpida, por la intervencin de enzimas, adems, es reversible.

Por ltimo, la misma intervencin de enzimas en este tipo de regulacin, le da la capacidad de amplificar seales, pues una sola proten cinasa activa es capaz de transformar muchas protenas.

Modificacin de la Conformacin. La actividad de las enzimas depende de su forma tridimensional, por lo tanto, la modificacin de dicha forma provocar cambios en la actividad de la enzima; esta es la base de la regulacin alostrica. Todas las protenas se encuentran en constante cambio de forma tridimensional. En una enzima, una de esas conformaciones, llamada forma tensa, puede tener poca afinidad por el substrato y por lo tanto poca actividad mientras que otra conformacin, la llamada forma relajada, tiene gran afinidad por el substrato y gran actividad.

Alguna molcula, puede unirse a la enzima y estabilizar la forma relajada, activando la enzima;

en cambio, otra molcula puede unirse y estabilizar la forma tensa, inhibiendo la enzima. Las molculas que se unen a la enzima y modifican su actividad se llaman moduladores alostricos.

Los activadores se denominan moduladores positivo y los inhibidores, moduladores negativos.

Con frecuencia los moduladores negativos son los productos finales de una va sinttica, mientras que los positivos son intermediarios o el propio substrato de la enzima. Tambin es frecuente que intermediarios metablicos importantes sirvan como moduladores alostricos, como el ATP que activa las vas que usan energa e inhibe las que la producen.

Figura 26 Regulacin por fosforilacin y desfosforilacin

Figura 27 Regulacin por cambio de conformacin

Los moduladores se unen a la enzima en sitios reguladores, diferentes del sitio activo, de ah el nombre de alostricos, y su unin por lo general no es covalente. Las enzimas alostricas son oligomricas, tienen estructura cuaternaria.

Las enzimas alostricas tienen cintica sigmoidal, diferente a la cintica hiperblica clsica (Figura 27.). La unin de activadores alostricos, desplaza la curva hacia una forma ms hiperblica, mientras que los inhibidores la hacen ms sigmoidal (Figura 27.B). En las enzimas alostricas la afinidad por el substrato se mide como la K0.5, que es la concentracin a la cual se satura el 50% de la enzima. Al igual que KM, la K0.5, es inversamente proporcional a la afinidad de la enzima por su substrato. Los activadores aumentan la afinidad y disminuyen la K0.5, los inhibidores disminuyen la afinidad y aumentan la constante.

Figura 28. (A) Cintica sigmoidal de enzimas alostricas. (B) Efecto de moduladores alostricos }

La actividad de algunas enzimas alostricas tambin es controlada por protenas reguladoras como la Calmodulina. Esta familia protenas cambian su conformacin en respuesta a la variacin del nivel intracelular de Calcio y se unen a muchas protenas, entre ellas varias enzimas, modificando su actividad a travs de interacciones alostricas. Muchas enzimas pueden ser reguladas mediante ms de un mecanismo, por ejemplo, algunas enzimas alostricas al ser fosforiladas pierden la capacidad de responder a los moduladores de actividad, inhibidores, activadores o ambos.

Aspectos de Inters Mdico

El estudio de las propiedades de las enzimas es de importancia en Medicina por mltiples razones.

Primero, son la clave para entender los estados de salud y enfermedad porque determinan el balance y control metablico. Muchas enfermedades son provocadas por defectos en la actividad de las enzimas, ya sea por su ausencia o por deficiencias en su actividad o regulacin. Algunos ejemplos de estos desordenes incluyen los que se muestran en la Tabla 8.

Para remediar estas enfermedades se han intentado varias estrategias para reemplazar la enzima defectuosa. Una de las ms exitosas es el uso de enzimas encapsuladas. La terapia gnica es una promesa para el tratamiento de este tipo de desordenes pero an se encuentra en etapa experimental y no es posible aplicarla en forma rutinaria.

Un aspecto interesante de la terapia gnica relacionado con las enzimas, es el uso de ribozimas con el fin de corregir las molculas de RNA mensajero defectuosas. En experimentos realizados recientemente, se emple una ribozima para corregir el RNA mensajero de la Hemoglobina S, y permitir la sntesis de Hemoglobina A, normal. Esta estrategia podra convertirse en una nueva arma en la terapia enzimtica de los desordenes genticos.Tabla 8. Enfermedades provocadas por defectos en la actividad de enzimas

Otro uso importante de las enzimas en Medicina es el apoyo en el diagnstico y seguimiento de enfermedades. Varias enzimas se utilizan con fines de diagnsticos y seguimiento de desordenes.

Algunos ejemplos representativos se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9. Algunas enzimas de empleadas en diagnstico