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INFORME FINAL DEL PROYECTO “Estandarización de un método para la caracterización molecular por medio de marcadores ISTR de la diversidad del
Complejo Agave durangensis “, CLAVE SIP 20070192, RESPONSABLE NORMA ALMARAZ ABARCA
RESUMEN
Dada la importancia que ha tomado recientemente Agave durangensis para la
elaboración de mezcal en el Estado de Durango y la problemática existente en torno a
la pérdida de variabilidad genética de sus poblaciones naturales causada por la
recolección indiscriminada de plantas, la problemática taxonómica con respecto a su
delimitación taxonómica, y a la necesidad de contar con técnicas que permitan
autentificar el origen botánico de la planta de agave utilizada en la elaboración de
mezcal como una medida del control de calidad y como un parámetro para sustentar la
denominación de origen de esa bebida, en este trabajo se estandarizó un método
molecular basado en marcadores ISTR, que puede ser utilizado para detectar la
variabilidad genética, para discriminar entre especies de Agave, y para determinar el
origen botánico de las piñas para la elaboración de mezcal.
ESTADO DEL ARTE
En el Estado de Durango, México, la elaboración de mezcal se realiza principalmente
con plantas de agave que son recolectadas de sus poblaciones naturales.
Recientemente se ha incrementado la demanda de agave para la elaboración de esa
bebida. Esto ha provocado una sobreexplotación indiscriminada del recurso, ya que no
se conoce con exactitud la especie de agave que se colecta, ni el número de especies
de este recurso que pueden ser utilizadas para la elaboración de mezcal, de tal
manera que se habla de un complejo, el complejo Agave durangensis (Valenzuela-
Ruíz y cols., 2003). Esa sobreexplotación está provocando la pérdida de la variabilidad
intra e interpoblacional de este recurso en el Estado.
La caracterización genética de las poblaciones contribuye a la conservación de los
recursos naturales proporcionando herramientas que describen la diversidad genética
y un marco teórico para entender los cambios evolutivos y la variación de los patrones
genéticos de las poblaciones naturales (Sosa, 2001).
Las técnicas moleculares actuales permiten visualizar variaciones en el ADN que
pueden ser útiles para la caracterización genética de las poblaciones, para la
delimitación e identificación de especies y para establecer filogenias (Nyffeler, 2002;
Good-Avila y cols., 2006).
Recientemente la caracterización molecular de los recursos vegetales se ha convertido
en un elemento importante para la certificación o denominación de origen de los
propios recursos (especie o variedad de planta) y del o los productos que se generan
de su procesamiento para cumplir con los estándares nacionales e internacionales de
control de calidad (Deguilloux y cols., 2004).
La visualización de caracteres moleculares actualmente representa un elemento
esencial en todos los aspectos involucrados en el mejoramiento genético de recursos
vegetales, facilitando la identificación de los genes responsables de los caracteres
deseados y el manejo de los programas de mejoramiento (Dreher y cols., 2003; Celis y
cols., 2004).
En la actualidad existe una gama muy amplia de técnicas moleculares que pueden
utilizarse en el estudio de la diversidad vegetal. Esas técnicas difieren en la
sensibilidad para resolver diferencias genéticas, en el tipo de datos que generan y en
los niveles taxonómicos en que pueden ser aplicadas (Karp y cols., 1996).
La técnica de detección de polimorfismo asociado a la inserción de retrotransposones
en el genoma, basada en marcadores ISTR (Inverse Sequence Tagged Repeat) ha
sido utilizada con éxito en estudios sobre la diversidad en Agave fourcroydes (Infante y
cols., 2003) y Agave tequilana (Torres-Morán y cols., 2005).
Sin embargo, para poder realizar estudios moleculares es necesario contar con
métodos de aislamiento de ADN que permitan obtenerlo en cantidad y calidad
adecuadas. A pesar del gran número de métodos que es posible encontrar en la
bibliografía se sigue considerando que el problema de la extracción del ADN es aún un
aspecto importante en el campo de la biología molecular vegetal (Csail y cols., 1998) y
se continúa trabajando en el desarrollo de métodos de aislamiento específicos y
novedosos como el desarrollado por Manen y cols. (2005) en el que utilizan una
mezcla de enzimas degradadoras de carbohidratos obtenida de Trichoderma
longibrachiatum Rifai mantenida en cultivo.
Previo a cualquier estudio sobre marcadores moleculares, es un requisito
indispensable contar con métodos de aislamiento de material genético que permitan
obtener ADN en cantidad y calidad adecuadas. Los análsis moleculares de especies
vegetales actualmente se pueden considerar como un requisito en estudios con fines
taxonómicos, filogenéticos y evolutivos. Para poder realizar esos análisis es
indispensable contar con métodos que permitan obtener ADN en cantidad y calidad
adecuadas para que éste pueda ser sometido a fraccionamiento por medio de enzimas
de restricción o a amplificación por medio de PCR. Algunos autores han sugerido que
un solo método de extracción de ADN puede ser adecuado para una gama amplia y
diversa de especies vegetales (Doyle y Doyle, 1987; Palmer, 1988; Guillemaut y
Marechal-Drouard, 1992). Lo mismo ha sido afirmado por diferentes empresas que
ofertan kits para el aislamiento, en general, de ADN vegetal (por ejemplo los kits que
vende Promega). Sin embargo, existen autores que afirman que algunas especies
vegetales requieren condiciones muy específicas en alguno o algunos de los pasos del
proceso de aislamiento de ADN (Almaraz-Abarca, 1994; De la Cruz y cols., 1997; Csail
y cols., 1998).
A pesar de la existencia de paquetes comerciales con los que, de acuerdo al
fabricante, se garantiza la obtención de ADN a partir de especies de muy diversos
grupos, en muchos laboratorios de investigación se prefiere estandarizar sus propios
métodos según las especies a trabajar, porque la calidad y la cantidad del ADN
obtenido con los paquetes comerciales no siempre son las adecuadas. Existen
diferentes métodos para la extracción de ADN a partir de plantas, cada uno con
diferentes eficiencias. Algunos de ellos son muy complicados y prolongados y
requieren utilizar dos solventes orgánicos muy tóxicos como el fenol y el cloroformo
(Palmer, 1988) para la purificación del ADN; otros como el desarrollado por Herrmann
(1982) además del uso de esos solventes orgánicos requiere de un paso largo de
diálisis para el mismo fin. Otros métodos, extremadamente largos y complicados como
el de Rogers y Bendich (1992) utilizan ultracentrifugación en gradientes de cloruro de
cesio (ScCl) durante periodos largos, de 12 a 16 horas; la utilización de bromuro de
etidio (EtBr) para localizar las fracciones de ADN al iluminar los tubos del gradiente
con luz ultravioleta; y pasos igualmente largos de diálisis para eliminar de las muestras
de ADN residuos de ScCl y de EtBr.
En 1984, Saghai-Maroof y col. desarrollaron un método de aislamiento de ADN mucho
más accesible en términos de tiempo, de trabajo y de recursos, y que partía de
cantidades pequeñas de tejido vegetal. Ese método usaba el detergente catiónico
bromuro de hexadeciltrimetiamonio (CTAB) a concentraciones altas, para el paso de
lísis de las células vegetales, en sustitución del detergente más comúnmente usado
dodecil sulfato de sodio (SDS). A partir de la aparición de este método, prácticamente
todos los métodos desarrollados posteriormente utilizan el CTAB como detergente
para la lisis de las células vegetales, debido a que éste precipita los ácidos nucleicos
como sales insolubles de CTAB en soluciones de cloruro de sodio diluidas sin
precipitar proteínas contaminantes, lo que a su vez disminuye el riesgo de degradación
del material genómico.
En algunas especies o estadíos fisiológicos es difícil el aislamiento del ADN tal como
está recomendado en los protocolos. Tal es el caso de plantas maduras porque
contienen grandes cantidades de polisacaridos y de compuestos fenólicos que son
difíciles de separar del ADN (Cheng y col., 1997; Tibbits y cols., 2006; Cota-Sánchez y
cols., 2006). Obtener ADN puro en cantidades adecuadas es el cuello de botella de
muchos estudios moleculares.
Los agaves son una fuente importante de carbohidratos y compuestos secundarios
tales como saponinas y compuestos fenólicos (Williams, 1975), los cuales hacen de la
extracción del ADN puro un proceso particularmente difícil. Algunas especies de
Agave para las que se han desarrollado métodos de aislamiento de ADN para la
caracterización molecular con fines taxonómicos y de determinación de la variabilidad
genética son Agave fourcroydes (Infante y cols., 2003) y Agave tequilana (Torres-
Morán y cols., 2005).
Todos los métodos de aislamiento de ADN comprenden en general, tres etapas. La
primera comprende la homogeneización de los tejidos a partir de los cuales se aislará
el material genético. La segunda, comprende la lísis de las células de los tejidos
homogeneizados; el objetivo de esta etapa es liberar las moléculas de ADN contenidas
dentro de los organelos (núcleo, mitocondria y cloroplasto, en el caso de las plantas).
La tercera contempla la purificación de las moléculas de ADN para separarlo de
compuestos contaminantes que puedan interferir con los análisis moleculares para los
cuales se aísla el ADN.
En la etapa de homogeneización se debe considerar a) la selección del material
vegetal (tipo de tejido), del cual se va a obtener el ADN, b) la edad de la planta, si
plantas adultas con hojas completamente desarrolladas o bien, plántulas, de pocos
días de edad, las cuales contienen menos compuestos del metabolismo secundario
(Bookjans y cols., 1984; Jones, 1988; Mourad y Polacco, 1989), y c) pretratamientos,
de duración variable, de etiolación, durante los cuales se consume la mayor parte del
almidón almacenado en los tejidos vegetales e interrumpe la síntesis de compuestos
secundarios (Taiz y Zeiger, 1991), todos los cuales son sustancias contaminantes en
el proceso de aislamiento de ADN.
El objetivo de la homogeneización es la disgregación de las células que forman los
tejidos. Durante esta etapa también puede ocurrir la ruptura celular, por lo que la
composición química del medio o regulador es muy importante, ya que éste debe
contener sustancias que inhiban la actividad de nucleasas liberadas durante la ruptura
celular que pudieran degradar el material genético (Herrmann, 1982). Las sustancias
inhibidoras de nucleasas más comúnmente usadas son la sal disódica del
etilendinitrilotetracetato (EDTA-Na), el cual quela cationes divalentes como el Mg++,
con lo que se inactivan las ADNasas liberadas durante la ruptura celular al secuestrar
a su cofactor (Herrmann, 1982); y el ß-mercaptoetanol, el cual es un agente
antioxidante y que desnaturaliza las proteínas al romper los puentes disulfuro que se
forman entre los aminoácidos que contienen azufre de una enzima y altera la
conformación estructural y por lo tanto su actividad (Gordon, 1975).
Otro elemento que puede ser agregado al medio de homogeneización es una
sustancia, como la polivinilpirrolidona (PVP) y el polietilenglicol (PEG 4000), que
forman complejos con polifenoles a través de enlaces de hidrógeno, y los remueve de
manera efectiva del homogeneizado (John, 1992).
Para algunos autores la etapa de lisis es la más crítica en el proceso de aislamiento
del ADN. Este paso está influenciado, entre otros factores, por la fuerza iónica del
medio o regulador, la temperatura y la calidad y cantidad del detergente usado para
lisar las membranas celulares (Herrmann, 1982; Milligan, 1989). Los detergentes más
ampliamente utilizados son el dodecilsulfato de sodio (SDS), dodecilsarcosilato de
sodio (sarcosilo), el tritón 100 (Herrmann, 1982), y el bromuro de
hexadeciltrimetilamonio o cetiltrimetilamonio o CTAB (Bellamy y Ralph, 1968; Milligan
1989; Doyle y cols., 1990).
El CTAB, el detergente usado en los dos métodos evaluados en este estudio, es un
detergente catiónico que precipita los ácidos nucléicos como sales insolubles de CTAB
en soluciones de NaCl diluidas sin precipitar impurezas de alto peso molecular como
las nucleasas y los polisacáridos (Bellamy y Ralph, 1968). Sin embargo, en algunas
ocaciones, los polisacaridos pueden coprecipitar con el ADN es especies vegetales
muy recalcitrantes y entonces es recomendable buscar fuentes de tejido diferentes al
foliar, tales como cotiledones o embriones (Rogers y Bendich, 1992). Algunas
preparaciones proteolíticas tales como la Pronasa, preparada a partir del hongo
Streptomyces griseus, y la Proteinasa K, también pueden ser utilizadas como agentes
de lisis; sin embargo, su acción se considera incompleta (Milligan, 1989).
La purificación de las preparaciones de ácidos nucleicos tiene por objetivo eliminar
contaminantes de proteínas y polisacáridos, principalmente, que hayan coprecipitado
con el ADN en la etapa de lisis. Los primeros métodos utilizaron la ultracentifugación
en gradientes de CsCl (Sambrook y col., 1989), sin embargo, aunque este es un
método muy efectivo es también muy largo y caro. Los solventes orgánicos, tales
como el fenol y/o el cloroformo han representado una alternativa adecuada y más
accesible en términos de tiempo, trabajo y costo. Estos solventes favorecen la
disociación entre proteínas y ácidos nucleicos que se encuentran en solución acuosa,
por lo que su acción es desproteinizante (Wallace, 1987)
En este estudio se estandarizó un método, basado en la detección de la variabilidad
generada por elementos retrotransposables (marcadores ISTR), que permitirá realizar
la caracterización molecular del Complejo Agave durangensis en el Estado de
Durango. La caracterización molecular de este Complejo podrá contribuir a determinar
a) los niveles de variabilidad genética, las estructuras genéticas intrapoblacionales, la
distribución de la diversidad genética interpoblacional; b) delimitar el número de
especies que forman el complejo; c) caracterizar molecularmente líneas productoras
deseables, considerando caracteres químicos como concentración de azúcares y de
fenoles con función antioxidante (determinados por HPLC) y caracteres fisiológicos
como resistencia a enfermedades y plagas; y d) proporcionar marcadores útiles para
fundamentar la certificación de origen. Con esto se pretende contribuir al
establecimiento de las acciones necesarias para la conservación y aprovechamiento
sostenible de este recurso natural.
OBJETIVO
Estandarizar un método, basado en la variabilidad generada por elementos
retrotransposables (marcadores ISTR), que permita realizar la caracterización
molecular del Complejo Agave durangensis en el Estado de Durango para estimar la
diversidad de taxa que forman este Complejo.
MATERIALES Y MÉTODOS Material vegetal
Se utilizaron con fines comparativos, hojas y raíces de plántulas obtenidas de semillas
germinadas de Agave durangensis. Las semillas se colectaron en el municipio de
Nombre de Dios, Dgo. en Septiembre de 2004. La identificación botánica de las
plantas de Agave se realizó con base en sus características morfológicas. Las
plántulas se mantienen vivas en el laboratorio de Biotecnología del CIIDIR-IPN-Dgo.
Aislamiento de ADN total
Se probaron dos métodos para la extracción de ADN de Agave durangensis, el de
Doyle y Doyle (1987), el cual de acuerdo a los propios autores permite obtener ADN
en cantidad y calidad adecuadas para el análisis molecular de una gama muy amplia
de especies vegetales; y el Infante y col. (2006), el cual funciona adecuadamente para
Agave cocui. Estos métodos se siguieron inicialmente, lo más fielmente posible según
los recursos disponibles y después se evaluaron pretratamientos o se hicieron
modificaciones en alguno de los pasos. A continuación se describen los dos métodos,
los pretratamientos y modificaciones, en los casos que corresponda, que se
implementaron para evaluar las condiciones que permitieran obtener ADN de Agave
durangensis, posible de amplificar por PCR.
Se evaluó la cantidad y la calidad del ADN total de plántulas de Agave durangensis
obtenido por el protocolo propuesto por Doyle y Doyle (1987), evaluando los siguientes
parámetros: el tipo de tejido (hojas o raíces), tiempo de etiolación (de 5 a 36 días), y la
condición de homogeneización de los tejidos vegetales (en nitrógeno líquido y en
regulador de aislamiento a 65 °C). Los resultados obtenidos se compararon con los
generados utilizando el protocolo de aislamiento de ADN propuesto por Infante y cols.
(2006), evaluando la adición al protocolo original, de un paso de lavado de ADN con
cloroformo. Ambos protocolos utilizan el detergente CTAB para solubilizar y lisar las
membranas celulares de las células vegetales, sin embargo se distinguen por una
serie de factores que se pueden apreciar después de la descripción de cada uno de
ellos. El protocolo de Doyle y Doyle (1987) se describe a continuación.
1. Precalentar de 5-7.5 ml de regulador de aislamiento de CTAB (CTAB al 3%.
NaCl 1.4M, 2-mercaptoetanol al 0.2%, EDTA 20 mM, Tris-HCl 1000mM) en
tubo de centrifuga de vidrio de 30 ml, a 60ºC en un baño de agua.
2. Macerar tejido fresco, 0.5-1.0 g, en regulador de aislamiento de CTAB a 60ºC
en un mortero precalentado.
3. Incubar la muestra a 60ºC durante 60 min. Con agitación suave ocasional.
4. Extractar una vez en cloroformo-isoamilalcohol (24:1) mezclando suave pero a
través de toda la muestra.
5. Centrifugar en rotor de libre cupo, a temperatura ambiente para concentrar la
fase, a 5000 rpm, durante 15 min.
6. Remover la fase acuosa con una pipeta de boca ancha, transferirla a un tubo
de centrifuga de vidrio limpio adicionar 2/3 de volumen de isopropanol frío,
agitar suavemente para precipitar los ácidos nucleicos. Dejar en congelación
24 hrs.
7. Centrifugar a 2500 rpm durante 2 min. Suavemente verter tanto sobrenadante
como sea posible sin perder la pastilla que es floja y difusa. Adicionar buffer de
lavado directamente a la pastilla y agitar suavemente para resuspender los
ácidos nucleicos. Dejar lavando un mínimo de 20 min.
8. Desechar sobrenadante cuidadosamente y permita secar la pastilla
brevemente a temperatura ambiente.
9. Resuspender los ácidos nucleicos en 200 µl de TE.
El protocolo de Infante y cols. (2006) se describe a continuación:
1. Pesar 0.2 g de tejido fresco.
2. Macerar con nitrógeno líquido.
3. Agregar 200 uL de Buffer A (CTAB, 2% (p/v); Tris HCl, 100 mM; EDTA, 20 mM;
NaCl, 1.4 M; PVP 40, 4% (p/v); Ácido ascórbico 0.1% (p/v) y B-
Mercaptoetanol, 10 mM.), 600 uL de Buffer B (Tris HCl, 100 mM; EDTA, 50
mM; NaCl, 100 mM y B-Mercaptoetanol, 10 mM.) y 67 uL de Dodecil Sulfato de
Sodio (SDS) al 20%.
4. Agitar en vortex e incubar a 65° C durante 30 min, Dejar enfriar.
5. Agregar 300 uL de Acetato de potasio 5M frio.
6. Centrifugar a 12300 RPM 15 min.
7. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y agregar 0.5V de isopropanol frio e
incubar por 20 min en hielo.
8. Centrifugar a 12300 RPM 10 min.
9. Descartar el sobrenadante y lavar la pastilla con 500 uL de Etanol 70%. Dejar
secar.
10. Resuspender en 600 uL de regulador TE (Tris Base, 10 mM; EDTA, 1 mM) y
posteriormente agregar 60 uL de acetato de sodio 3 M (pH 5.2) con Ácido acetico
glacial y 660 uL de isopropanol frío. Incubar en hielo 20 min.
11. Centrifugar a 12300 RPM 10 min.
12. Repetir dos veces los pasos 9, 10 y 11.
13. Resuspender en 50 uL de TE.
La modificación evaluada a este segundo protocolo fue la adición de un paso de
lavado con un volumen equivalente de cloroformo entre el paso 6 y 7, y en seguida
uno de centrifugación a 12300 rpm, durante 10 minutos a temperatura ambiente y
eliminar el paso 12 del protocolo de Infante y cols. (2006).
Evaluación espectrométrica de la cantidad del ADN obtenido
La cantidad de ADN obtenido en cada análisis se cuantificó de acuerdo a lo descrito
por Sambrook y cols. (1989) y considerando, de acuerdo a esos mismos autores, que:
1A = 50 ng/µl de ADN de doble hebra (Fórmula 1)
Donde A = absorbancia
1. Tomar 4 uL del ADN obtenido y diluirlo en 496 uL de agua destilada (dilución 1/125).
2. Calibrar el espectrofotómetro a 260 usando como blanco agua destilada.
3. Registrar el valor de A260 de cada muestra y calcular de acuerdo a la fórmula 1 y el
factor de dilución, la concentración de ADN correspondiente.
4. Calibrar el espectrofotómetro a 280 usando como blanco agua destilada.
5. Cuantificar cada una de las muestras.
3.4 Evaluación espectrométrica de la pureza del ADN obtenido
Para cada muestra de ADN obtenida y resuspendida en TE se determinó, de acuerdo
a Towner (1991) y Sambrook y col. (1989), su valor de absorbancia a 240 nm y 280
nm para estimar la pureza con respecto a la presencia de carbohidratos y proteínas,
respectivamente; considerando que las soluciones de ADN cuya proporción A260/A240
tiene valores entre 1.7 y 2.0 y cuya proporción A260/A280 tiene valores mayor de 1.8,
tienen niveles suficientemente bajos de carbohidratos y proteínas, respectivamente,
para ser utilizado en la técnica de PCR.
Estimación del tamaño molecular y de la integridad del ADN obtenido
Las estimaciones del tamaño molecular de la integridad de las muestras de ADN se
realizaron por electroforesis en geles de agarosa, de acuerdo a lo descrito por
Andrews (1994). El ADN de alto peso molecular tiene una migración electroforética
muy baja en un gel de agarosa al 0.8% y una muestra de ADN lo suficientemente
íntegro, presentará un fondo muy tenue de color (backgrown) a lo largo de su carril
después de un análisis electroforético. Tanto tamaño molecular como integridad de las
muestras de ADN se determinaron en un gel de agarosa al 0.8 %. La preparación de
los geles se realizó de acuerdo a lo descrito en Sambrook y cols. (1989):
1. La agarosa en polvo se adiciona al regulador de electroforesis (TAE: Tris-base
40 mM, pH 8; ácido acético 20 mM; EDTA-Na 2 mM) en la cantidad adecuada
para preparar un gel al 0.8 % y se disuelve en baño María. Es importante
asegurarse que la solución esté completamente disuelta, su apariencia debe
ser homogénea.
2. La solución de agarosa homogénea se deja enfriar, a 55ºC para soluciones
menores al 1% y a 50ºC para concentraciones mayores de 1%.
3. Verter la solución de agarosa en el molde. Coloca el peine en su lugar antes de
verter el gel. No se deben forman burbujas.
4. Una vez solidificado el gel se remueve cuidadosamente el peine. En este paso,
los pozos se pueden llenar con regulador de electroforesis y si es necesario el
gel se envuelve en una bolsa de plástico y se puede mantener en refrigeración
durante uno o dos días.
Tres microlitros de cada muestra de ADN se mezclaron con tres microlitros de
regulador de muestra (Glicerol al 25%, azul de bromofenol al 0.25%, disueltos en
regulador TAE 10X). Los seis microlitros se depositaron dentro de los posillos del gel,
previamente sumergido en TAE 1X dentro de la cámara.
El voltaje utilizado en las electroforesis fue de 70 V. La corriente se detuvo cuando el
regulador de muestra llegó al extremo opuesto del gel.
Los geles fueron teñidos en una solución de bromuro de EtBr (bromuro de etidio), en
una proporción de 1 µl/ml, a partir de una solución stock de EtBr (5 mg/ml, en agua
destilada) o con CyberGreen, adicionado junto con las muestras de ADN, en una
proporción uno a uno. El marcador de peso molecular fue tratado de la misma manera
y sometido a electroforesis en el mismo gel que las muestras de ADN.
Amplificación por PCR de las muestras de ADN obtenidas
Para seleccionar qué protocolo de aislamiento de ADN de Agave durangensis permitió
obtener este material genético en cantidad y calidad adecuadas para utilizarse en
análisis moleculares, cada una de las muestras se sometieron a amplificación por
PCR. Las condiciones de amplificación utilizadas fueron las descritas por Infante y
cols. (2006).
Las mezclas de reacción estuvieron formadas por: iniciador F (5’---3’) 0.3 µM, iniciador
B (3’---5’) 0.3 µM, regulador PCR 1X, MgCl 3 mM, ADN 25 ng/µl, Taq polimerasa 1U,
dNTPs 0.25 mM, H2O la necesaria para ajustar a un volumen final de reacción de 20
µl.
Los iniciadores F y B utilizados amplifican, de acuerdo a Infante y cols. (2006)
secuencias de ADN asociadas a elementos transposables del género Agave.
El programa del termociclador empleado también fue el descrito por Infante y cols.
(2006). Este programa comprendió un primer paso de 3 minutos a 95°C; un segundo
paso de 40 ciclos, cada uno comprendiendo 0.3 minutos a 95°C, 1 minuto a 45°C, y 2
minutos a 72°C; y un tercer paso de 10 minutos a 72°C.
Separación de los fragmentos de amplificación
Los fragmentos de amplificación se separaron en geles de poliacrilamida como indican
Infante y cols. (2006). Se prepararon geles de poliacrilamida al 6%, de acuerdo a
Sambrook y col. (1989). Los componentes del gel, para 70 ml, fueron 10.5 ml de una
solución de acrilamida al 40%, 7 ml de regulador TBE (trisma base, ácido bórico,
EDTA) 10X, 32.2 g de urea, 240 µl de APS (persulfato de amonio), y 32 µl de temed.
Como regulador de la cámara se utilizó TBE 1X, se depositaron 8 µl de muestra de
ADN en los posillos. Se aplicaron 65 W durante todo el tiempo de análisis.
Visualización de los fragmentos de amplificación
Dado el tamaño de los fragmentos esperados y la mayor sensibilidad de la tinción con
sales de plata con respecto a otros tipos de tinción, se utilizó la primera vara visualizar
los fragmentos de amplificación de las muestras de ADN de Agave durangensis. Una
vez terminada la electroforesis, los geles se sumergieron en una solución fijadora (100
ml de ácido acético glacial y 900 ml de agua bidestilada) durante 20 minutos, se
lavaron dos veces en agua bidestilada durante 2 minutos, se sumergieron en una
solución de nitrato de plata (1 g de AgNO3, 1.5 ml de una solución de formaldehído al
37% y 1 l de agua bidestilada) durante 30 minutos, se lavaron en agua bidestilada
durante 1 minuto, se sumergieron en una solución reveladora (30 g de carbonato de
calcio, 1.5 ml de una solución de formaldehído al 37%, 200 µl de una solución de
tiosulfato de sodio a una concentración de 10 mg/ml, y 1 l de agua bidestilada) durante
5 minutos, y se lavaron con agua bidestilada durante 2 minutos.
RESULTADOS Cantidad y pureza del ADN obtenido
La determinación de la cantidad de ADN obtenido se realizo por medio de lecturas de
absorbancia a 260 nm, de cada una de las muestras. En la tabla 1 se presentan los
valores de absorbancia a esa longitud de onda y la estimación de la cantidad de ADN
obtenido en las diferentes condiciones evaluadas con el protocolo de Doyle y Doyle
(1987).
Tabla 1. Valores de absorbancia a 260 nm, 280 nm, 240 nm; valores de las relaciones A260/A280 y A260/A240; y estimación de la concentración de ADN obtenido con el protocolo de Doyle y Doyle (1987), bajo diferentes condiciones de extracción
Tejido Etiolación
(días)
N2
líquido
*A260 *A240 *A280 **A260/A280 **A260/A240 **ADN mg/ml
Raíz 13 días No 0.037 0.025 0.030 0.018 0.019 0.008 2.536 1.315 193.75
Hoja 13 días No 0.007 0.127 0.002 0.091 0.001 0.062 4.524 2.445 391.75
Raíz 20 días No 0.056 0.076 0.043 0.055 0.029 0.038 1.965 1.341 412.50
Hoja 20 días No 0.046 0.054 0.029 0.034 0.019 0.022 2.437 1.587 312.50
Raíz 28 días No 0.111 0.099 0.072 0.062 0.055 0.054 1.925 1.418 656.25
Hoja 28 días No 0.022 ---- 0.010 --- 0.009 --- 2.440 2.200 137.5
Raíz 29 días Sí 0.157 0.053 0.089 0.018 0.071 0.025 2.165 2.354 656.25
Hoja 29 días Sí 0.052 0.057 0.033 0.033 0.026 0.029 1.982 1.651 340.25
Raíz 36 días No 0.097 0.523 0.066 0.319 0.047 0.254 2.061 1.554 1937.5
Hoja 36 días No 0.125 0.166 0.077 0.092 0.060 0.083 2.041 1.713 909.37
* Valores correspondientes a dos repeticiones, ** Valores promedio
Lo correspondiente para el ADN obtenido con las diferentes condiciones evaluadas
utilizando el protocolo de Infante y cols. (2006) se muestra en la tabla 2.
Tabla 2. Valores de absorbancia a 260 nm, 280 nm, 240 nm; valores de las relaciones A260/A280 y A260/A240; y estimación de la concentración de ADN obtenido con el protocolo de Infante y cols. (2006) y las modificaciones señaladas en el texto. Modificación A260 A280 A240 *A260/A280 *A260/A240 *ADN
(mg/ml)
R1 R2 R1 R2 R1 R2
Con lavado
adicional con
cloroformo 0.231 0.205 0.118 0.120 0.1360.135 1.832 1.608
1362.5
Sin lavado
adicional con
cloroformo
0.114 0.122
0.099 0.080
0.068 1.00
1.600
0.899
735.50 R1 y R2: repeticiones
* Valores promedio
La forma general de los espectros de absorción entre 200 y 300 nm
y los valores de las relaciones A260/A280 y A280/A240 permiten estimar la pureza del
ADN obtenido.
En las figuras 1 a 21 se presentan los espectros de absorción de cada una de las
muestras de ADN obtenido con el protocolo de aislamiento de Doyle y Doyle (1987) y
bajo las diferentes condiciones evaluadas. En la tabla 1.0 se presentan los valores
correspondientes de absorbancia de las relaciones A260/A280 y A280/A240.
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
230 240 250 260 270 280 290 300
Longitud de Onda (nm)
Figura 1. Espectro de absorción UV del ADN de Agave durangensisobtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de raíz con 5
días de etiolación.
Abso
rban
cia
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
230 240 250 260 270 280 290 300
Longitud de Onda (nm)
Figura 2. Espectro de absorción UV del ADN de Agave durangensisobtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de hoja con 5
días de etiolación.
Abso
rban
cia
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
0,03
0,035
0,04
220 230 240 250 260 270 280 290 300
Longitud de Onda (nm)
Figura 3. Espectro de absorción UV del ADN de Agave durangensisobtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de raíz con 13
días de etiolación.
Abs
orba
ncia
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
220 230 240 250 260 270 280 290 300
Longitud de Onda (nm)
Figura 4. Espectro de absorción UV del ADN de Agave durangensisobtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de raíz con 13
días de etiolación.
Abs
orba
ncia
0
0,001
0,002
0,003
0,004
0,005
0,006
0,007
0,008
238 248 258 268 278 288 298
Longitud de Onda (nm)
Figura 5. Espectro de absorción UV del DNA de Agave durangensis obtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de hoja con 13
días de etiolación.
Abso
rban
cia
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
220 230 240 250 260 270 280 290 300
Longitud de Onda (nm)
Figura 6. Espectro de absorción UV del ADN de Agave durangensisobtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de hoja con 13
días de etiolación.
Abs
orba
ncia
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
220 230 240 250 260 270 280 290 300
Longitud de Onda (nm)
Figura 7. Espectro de absorción UV de Agave durangensisobtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de raíz con 20
días de etiolación.
Abs
orba
ncia
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
220 230 240 250 260 270 280 290 300
Longitud de Onda (nm)
Figura 8. Espectro de absorción UV de Agave durangensisobtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de raíz con 20
días de etiolación.
Abs
orba
ncia
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
0,03
0,035
0,04
0,045
0,05
220 230 240 250 260 270 280 290 300
Longitud de Onda (nm)
Figura 9. Espectro de absorción UV de Agave durangensisobtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de hoja con 20
días de etiolación.
Abs
orba
ncia
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
230 240 250 260 270 280 290 300
Longitud de Onda (nm)
Figura 10. Espectro de absorción UV de Agave durangensisobtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de hoja con 20
días de etiolación.
Abs
orba
ncia
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
220 230 240 250 260 270 280 290 300
Longitud de Onda (nm)
Figura 11. Espectro de absorción UV del DNA de Agave durangensisobtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de raíz con 28
días de etiolación.
Abs
orba
ncia
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
220 230 240 250 260 270 280 290 300
Longitud de Onda (nm)
Figura 12. Espectro de absorción UV del DNA de Agave durangensisobtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de raíz con 28
días de etiolación.
Abs
orba
ncia
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
230 240 250 260 270 280 290 300
Longitud de Onda (nm)
Figura 13. Espectro de absorción UV del DNA de Agave durangensisobtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de hoja con 28
días de etiolación.
Abs
orba
ncia
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
0,18
220 230 240 250 260 270 280 290 300
Longitud de Onda (nm)
Figura 14. Espectro de absorción UV de Agave durangensisobtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de raíz con 29
días de etiolación y el tejido macerado con Nitrógeno líquido.
Abs
orba
ncia
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
220 230 240 250 260 270 280 290 300
Longitud de Onda (nm)
Figura 15. Espectro de absorción UV de Agave durangensisobtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de raíz con 29
días de etiolación y el tejido macerado con Nitrógeno líquido.
Abs
orba
ncia
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
220 230 240 250 260 270 280 290 300
Longitud de Onda (nm)
Figura 16. Espectro de absorción UV de Agave durangensisobtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de hoja con 29
días de etiolación y el tejido macerado con Nitrógeno líquido.A
bsor
banc
ia
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
220 230 240 250 260 270 280 290 300
Longitud de Onda (nm)
Figura 17. Espectro de absorción UV del DNA de Agave durangensisobtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de hoja con 29
días de etiolación y el tejido macerado con Nitrógeno líquido.
Abs
orba
ncia
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
220 230 240 250 260 270 280 290 300
Longitud de Onda (nm)
Figura 18. Espectro de absorción UV del DNA de Agave durangensisobtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de raíz con 36
días de etiolación.
Abs
orba
ncia
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
230 240 250 260 270 280 290 300
Longitud de Onda (nm)
Figura 19. Espectro de absorción UV del DNA de Agave durangensisobtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de raíz con 36
días de etiolación.
Abs
orba
ncia
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
220 230 240 250 260 270 280 290 300
Longitud de Onda (nm)
Figura 20. Espectro de absorción UV del DNA de Agave durangensisobtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de hoja con 36
días de etiolación.A
bsor
banc
ia
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
0,18
220 230 240 250 260 270 280 290 300
Longitud de Onda (nm)
Figura 21. Espectro de absorción UV del DNA de Agave durangensisobtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de hoja con 36
días de etiolación.
Abs
orba
ncia
En la figura 22 se presenta el espectro de absorción de una de las muestras de ADN
obtenido con el protocolo de aislamiento de Infante y cols. (2006) y con las
modificaciones evaluadas. En la tabla 2.0 se presentan los valores correspondientes
de absorbancia de las relaciones A260/A280 y A260/A240.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
220 230 240 250 260 270 280 290 300
Longitud de Onda (nm)
Figura 22. Espectro de absorción UV del DNA de Agave durangensis obtenido con el método de Infante y cols. (2006) a partir de hoja de plantas adultas y macerado el
tejido con Nitrógeno líquido.
Abs
orba
ncia
Tamaño molecular e integridad del ADN obtenido.
Las apreciaciones del tamaño molecular y de la integridad del ADN se realizaron con
base en los resultados de la electroforesis en geles de agarosa.
Las figuras 23 a 26 muestran los geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio para
las muestras de ADN obtenidas con el protocolo de Doyle y Doyle (1987) y la figura 27
muestra las obtenidas con el protocolo de Infante y cols. (2006).
Figura 23. ADN de Agave durangensis, obtenido con el protocolo de Doyle y Doyle (1987), con 36 días de etiolación. De izquierda a derecha: carril 1: ADN obtenido a partir de hoja, carril 2 y 3: ADN obtenido a partir de raíz.
Figura 24. ADN de Agave durangensis, obtenido con el protocolo de Doyle y Doyle (1987). De izquierda a derecha, parte superior: carril 1: ADN obtenido a partir de hoja, con 36 días de etiolación; carril 2 y 3: ADN obtenido a partir de raíz, con 13 días de etiolación, carril 4 y 5: ADN obtenido a partir de hoja, con 13 días de etiolación. De izquierda a derecha, parte inferior: carril 1: ADN obtenido a partir de hoja, con 13 días de etiolación, carril 2 y 3: ADN obtenido a partir de raíz, con 20 días de etiolación, carril 4 y 5: ADN obtenido a partir de hoja, con 20 días de etiolación.
Figura 25. ADN de Agave durangenisis obtenido con el método de Doyle y Doyle (1987). De izquierda a derecha, parte superior: carril 1 y 2: ADN obtenido a partir de raíz, con 5 días de etiolación, carril 3 y 4: ADN obtenido a partir de hoja, con 5 días de etiolación, carril 5 y 6: ADN obtenido a partir de raíz, con 13 días de etiolación, carril 7: ADN obtenido a partir de hoja, con 13 días de etiolación. De izquierda a derecha, parte inferior: carril 1 y 2: ADN obtenido a partir de hoja, con 13 días de etiolación, carril 3 y 4: ADN obtenido a partir de raíz, con 20 días de etiolación y carril 5 y 6: ADN obtenido a partir de hoja, con 20 días de etiolación.
Figura 26. ADN de Agave durangensis obtenido con el método de Doyle y Doyle (1987). De izquierda a derecha, parte superior: carril 1 y 2: ADN obtenido a partir de raíz, con 28 días de etiolación, carril 3 y 4: ADN obtenido a partir de hoja, con 28 días de etiolación, carril 5 y 6: ADN obtenido a partir de raíz, con 29 días de etiolación y macerado el tejido con Nitrógeno líquido, carril 7 y 8: ADN obtenido a partir de hoja, con 29 días de etiolación y macerado el tejido con Nitrógeno líquido. La parte inferior del gel es repetición de la parte superior.
Figura 27. ADN de Agave durangensis obtenido con el método de Infante y col. (2006). De izquierda a derecha, carriles 1 a 5: ADN obtenido de acuerdo al método sin modificar, carriles 6 a 10: ADN obtenido con el paso adicional de lavado con cloroformo.
Amplificación del ADN obtenido
Los fragmentos de amplificación, visualizados en geles de acrilamida teñidos con sales
de plata, de las muestras de ADN sometidas a análisis de PCR se muestran en la
figura 30.
Figura 31. Fragmentos de amplificación obtenidos a partir del ADN de A. durangensis. ANÁLISIS DE RESULTADOS
Cantidad y pureza del ADN obtenido
En general, el protocolo de Infante y col. (2006) permite obtener una menor cantidad
de ADN (1362.5 mg/ml) que el de Doyle y Doyle (1987) (1937.5 mg/ml, máximo). Esos
valores corresponden a 6.812 mg/g de tejido y 9.687 mg/g de tejido fresco,
respectivamente; valores que son en ambos casos, superiores a los reportados por
otros autores (Keb-Llanes y cols., 2002) para otras especies de Agavaceae (0.070 a
0.120 mg/g tde tejido fresco).
El periodo de etiolación más largo (36 días), aplicado al protocolo de Doyle y Doyle
(1987), fue la condición de pretratamiento que permitió obtener la mayor cantidad de
ADN (1423.43 mg/ml, en promedio) de Agave durangensis.
Con respecto a los diferentes tipos de tejido utilizados en el protocolo de Doyle y Doyle
(1987), los tejidos de la raíz permiten obtener mayor cantidad de ADN (771.25 mg/ml,
valor promedio de todas las cantidades de ADN obtenidas a partir de este tejido,
independientemente de cualquier otra condición de pretratamiento) que los tejidos de
las hojas (418.27 mg/ml, valor promedio de todas las cantidades de ADN obtenidas a
partir de este tejido, independientemente de cualquier otra condición de
pretratamiento).
Diversos autores (Schuler y Zielinski, 1989, Sambrook y cols., 1989) indican que los
valores de las relaciones A260/A240 y A260/A280 deben caer en el intervalo de 1.7 a 2.0 y
ser mayores a 1.8, respectivamente, para considerar a una muestra de ADN con la
pureza suficiente para ser utilizado en análisis moleculares. De acuerdo a las tablas 1
y 2 de la sección de resultados, todas las muestras de ADN de A. durangensis
obtenidas con el protocolo de Doyle y Doyle (1987) cumplieron con el segundo
requisito (valores de A260/A280 mayores de 1.8), mientras que con el protocolo de
Infante y col. (2006), únicamente la muestras obtenidas con la modificación señalada
enteriormente cumplieron con este requisito, lo que indica que contienen un nivel de
contaminación con proteínas permisible para poder analizarlas con técnicas
moleculares. Sin embargo, el primer requisito, que señala el nivel de contaminación
con carbohidratos, sólo lo cumplen las muestras de ADN obtenidas con el protocolo de
Doyle y Doyle (1987), a partir de tejido foliar, con 36 días de etiolación, y sin utilizar
nitógeno líquido para la homogeneización del tejido.
A pesar de que la mayoría de las muestras de ADN no satisfacieron el requerimiento
de los niveles mínimos de carbohidratos y se presentó cierto grado de degradación,
pudo obtenerse a partir de ellas fragmentos amplificados de secuencias ISTR, como
puede verse en la figura 31. Esto sugiere que los niveles de carbohidratos son menos
críticos que los de proteinas contaminantes de muestras de ADN, para considerar a
estas últimas como suficientemente puras para producir fragmentos de amplificación
ISTR.
CONCLUSIONES
1. El tipo de tejido es un factor importante a considerar para el aislamiento de ADN de
los elementos del complejo Agave durangensis. Los tejidos radiculares representan
una opción recomendable para obtener ADN cualitativa y cuantitativamente adecuado.
2. El pretratamiento de etiolación es un factor importante en la obtención de ADN de A.
durangensis. La cantidad y la calidad del ADN se mejora con la prolongación de este
pretratamiento hasta alcanzar una duración de 36 días.
3. La homogeneización en presencia de nitrógeno líquido no es un factor que
determine la cantidad y calidad del ADN obtenido de A. durangensis.
4.- La modificación al protocolo de Infante y col. (2006), como se describió en este
trabajo, proporciona mejor ADN en términos de cantidad, pureza e integridad, para A.
durangensis.
5. La variabilidad genética de Agave durangensis puedes ser estudiada empleando el
protocolo de aislamiento de ADN de Infante y cols. (2006) modificado en este trabajo,
y los iniciadores de la amplificación in vitro de secuencias ISTR.
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