electroforesis, nb, sb y wb

Amanda Sánchez López

23/04/2014

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TÉCNICAS INTRUMENTALES BÁSICAS

Usuar022-PC

Resaltado

ESQUEMA

1- TECNICAS ELECTROFORÉTICAS • Fundamento físico-químico • Ventajas • Factores que afectan a la electroforesis • Tipos de electroforesis

2- WESTERN BLOT

3- SHOUTHERN BLOT

4- NORTHEN BLOT

ELECTROFORESIS

FUNDAMENTO FISICO-QUIMICO

DEFINICIÓN: Técnica utilizada para la SEPARACIÓN, PURIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN de partículas. Basada en la migración de las misma por la acción de un campo eléctrico.

CÁTODO ÁNODO


q

E

L

FE Ff

CÁTODO ÁNODO

μ

r f Ff


Las biomoléculas se separan en función de: - Carga electrica - Tamaño y forma

• A mayor carga, mayor movilidad • A mayor tamaño, menor movilidad • A mayor viscosidad del medio, menor movilidad

U Movilidad electroforérica. Velocidad de la particular por unidad de campo

VENTAJAS DE LA TÉCNICA

• Sensibilidad

• Elevado poder de resolución

• Versatilidad

• Posibilidad de separar mezclas complejas

• Aporta potente criterio de pureza

• Posibilidad de determinar otros parámetros: Pm, pI, nºde

cadenas polipeptídicas

FACTORES QUE AFECTAN A LA ELECTROFORESIS

CAMPO ELECTRICO / FUENTE DE ALIMENTACIÓN

•Diferencia de potencial entre los electrodos (Voltios)

•Intensidad de corriente (Amperios) [Ley de Ohm(V = i x R)]

•Resistencia (Ohmios)

•Temperatura (efecto Joule)

MUESTRA

• Carga, forma y tamaño de la molécula

TAMPÓN

• Fuerza iónica, pH

FACTORES QUE AFECTAN A LA ELECTROFORESIS

SOPORTE

• NO RESTRICTIVO

Permite el paso de la muestra. No supone un impedimento para la misma.

Proteinas.

La muestra se separa en función de la densidad de carga (relación masa y carga)

• RESTRICTIVO

Por su composición ofrecen un impedimento al paso de las muestras.

En condiciones generals, la separación dependerá de la forma, tamaño y carga

TIPOS DE ELECTROFORESIS

1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS 2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS 2.A. NO DESNATURALIZANTE 2.B. DESNATURALIZANTE

B.1. ISOELECTROENFOQUE B.2. BIDIMENSIONAL


1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS

Separar, identificar y purificar moléculas o fragmentos de DNA o RNA

MIGRACIÓN • ÁNODO (+) • Relación carga-masa igual • Tamaño y forma Soportes restrictivos Agarosa disuelta en un buffer

Agarosa Tamaño poros

Mejor separación fragmentos grandes



Separar, identificar y purificar moléculas o fragmentos de DNA o RNA

MIGRACIÓN • ÁNODO (+) • Relación carga-masa igual • Tamaño y forma

Soportes restrictivos DETECCIÓN Bromuro de etidio. Agente intercalante fluorescente



EtBr

Tª



EtBr

Tª

Glucosa/glicerol y colorante



MARCADOR DE PESO MOLECULAR (PM) ESTIMACIÓN DE PM


2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA

• La acrilamida polimeriza por la acción del TEMED y el PSA (persulfatoamónico) • La metilen-bis-acrilamida forma enlaces cruzados entre los polímeros de acrilamida • En conjunto se forma una especie de malla cuyo diámetro de poro viene determinado por la concentración de acrila-mida/bis-acrilamida (%)



Uniformidad del gel

Conformación de la proteína

Gel uniforme

Gel discontinuo

NO Desnaturalizante

Desnaturalizante



Uniformidad del gel

Conformación de la proteína

Gel uniforme Gel discontinuo

NO Desnaturalizante

Desnaturalizante NO

Desnaturalizante Desnaturalizante



GEL DISCONTINUO

GEL “STACKING”(EMPAQUETADOR) •Menor concentración de acrilamida •Tamaño de poro

Función: Acumular las proteínas a la entrada del gel separador para que salgan al mismo tiempo

GEL “RUNNING”(SEPARADOR) •Mayor concentración de acrilamida •Tamaño de poro menor

Función: separar las proteínas

STACKING

RUNNING



Las proteinas se pueden separar por: Tamaño, forma y carga eléctrica

La mayoría de las proteínas estarán cargadas negativamente



Puentes disulfuro


1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS 2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS 2.2.A. NO DESNATURALIZANTE 2.2.B. DESNATURALIZANTE




CONDICIONES NO DESNATURALIZANTES




A igual tamaño migra más la de

mayor carga

A igual carga migra más la de menor tamaño




80KDa 40KDa

80KDa

40KDa




80KDa 40KDa




VENTAJAS • Separa proteínas en estado nativo • Las proteínas siguen siendo funcionales • Permite separar complejos proteicos o proteínas multiméricas como una unidad • Excelente herramienta para detectar cualquier proceso que altere la carga o la conformación de una proteína INCONVENIENTES • Muchas proteínas no migran por no tener carga neta o por poseer carga neta positiva • El proceso de separación es muy lento debido a la debilidad de la carga neta de las proteínas • El proceso de separación no sólo estáafectado por el tamaño sino también por la forma de la proteína


1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS 2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS

2.A. NO DESNATURALIZANTE 2.B. DESNATURALIZANTE




CONDICIONES DESNATURALIZANTES: SDS-PAGE

Las proteínas pierden su conformación nativa 1. Se emplean AGENTES DESNATURALIZANTES (urea, detergentes), el SDS

(sodiumdodecylsulfate) es el de mayor uso

2. Se emplea un AGENTE REDUCTOR de puentes –s–s– generalmente β-mercaptoetanol o DTT (ditiotreitol)

¿QUE CONSEGUIMOS CON ESTO?

La cantidad de SDS unido a la proteína es proporcional a su tamaño, de tal forma que la relación carga/tamaño entre todas las proteínas va a ser aprox. la misma


¿QUE CONSEGUIMOS CON ESTO?


El β-mercaptoetanol va a “romper” los enlaces –S–S– tanto inter-como intramoleculares mediante una reacción redox. (El β-mercaptoetanol reduce los puentes disulfuro)

DTT




80KDa 40KDa




60KDa

40KDa

20KDa

80KDa 40KDa



NO DESNATURALIZANTE

DESNATURALIZANTE SDS-PAGE



VENTAJAS •Separación rápida de las proteínas •La separación no depende de la forma de la proteína nativa

•Se puede estimar el peso molecular de las proteínas •Aunque desnaturalizadas, las proteínas pueden usarse para la fabricación de anticuerpos (en la mayoría de los casos) INCONVENIENTES •Las proteínas separadas están desnaturalizadas por tanto no son funcionales


PARA LA DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR: 1. Necesitamos un marker 2. Necesitamos normalizar

ELECTROFORESIS GEL POLIACRILAMIDA

Azul de coomassie

DETECCION DE PROTEINAS - Azul de Coomassie - Todas las proteinas


2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. ISOLELECTROENFOQUE

Las proteínas se separan por: PUNTO ISOELÉCTRICO Las proteínas se moverán de acorde con su carga neta hacia el ánodo o el cátodo hasta que alcancen un valor de pH = pI donde su carga neta es neutra (y ya no se mueven)


1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS 2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS

2.A. NO DESNATURALIZANTE 2.B. DESNATURALIZANTE



2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. BIDIMENSIONAL

• Técnica de alta resolución cuyo objetivo es la separación de mezclas de proteínas altamente complejas •La base de su elevado poder de resolución está precisamente en la bidimensionalidad, es decir, en que las proteínas son separadas secuencialmente por dos criterios físicos •Debido a su elevada resolución, ha sido una técnica ampliamente utilizada en la confección de mapas de referencia, es decir, en la disección de la composición proteica de un determinado orgánulo o tipo celular (metabolómica)



En realidad son dos proteinas con identico peso molecular o punto isoeléctrico!

SOLUCION:

Electroforesis Bidimensional



Peso molecular

Punto isoeléctrico

WESTERN BLOT

WESTERN BLOT

Gel de proteínas Membrana tras WB

WESTERN BLOT

● ELECTROTRANSFERENCIA

● Mejor y más tiempo

● TECNICAS DE INMUNODETECCIÓN

WESTERN BLOT

La MEMBRANA de NITROCELULOSA se puede teñir a su vez con un colorante (ROJO PONCEAU) que pone de manifiesto el total de proteínas que se han transferido desde el gel

WESTERN BLOT

DETECCIÓN

•Autorradiografía •Precipitación de un cromógeno insoluble por la acción de una actividad enzimática •Fluorescencia •Quimioluminiscencia

WESTERN BLOT

DETECCIÓN

NORTHERN/SOUTHERN BLOT

MUCHAS GRACIAS



GEL UNIFORME

Concentración de poliacrilamida uniforme Función: separar las proteínas: Tamaño y densidad de carga

Ventajas: • Rápido • Sencillo • Puede estudiarse la funcionalidad de las proteínas separadas

Desventajas: •Menor resolución

electroforesis, nb, sb y wb

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