Electroforesis

La electroforesis es una técnica que se basa en la separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico.

De frente móvil (en solución)

Tipos:

De zona (sobre un medio soporte)

Agarosa Poliacrilamida

(DNA) (DNA y proteínas)

Geles (a través de una matríz porosa)En papel Sílice

ÁnodoCátodo

- +

Fel

Fresist

v

Fel = Q . E = Q . V/dQ = cargaE = potencial eléctricoV = voltajed = distancia entre electrodosf = coeficiente de fricciónv = velocidad

A v constante v partícula = Q . E

f

Fresist = Fel

Movilidad de la partícula = v = Q

E f

Tamaño y forma de la partícula

La movilidad del DNA depende de:

Factores extrínsecos a la partícula

[agarosa] o [poliacrilamida]

Voltaje

Buffer

Tiempo

Temperatura

pH

Factores intrínsecos a la partícula

Relación carga/masa

Conformación

Tamaño

Factores extrínsecos

Log(

PM

o K

bs)

0,5%

0,7%

1%

1,2%

% de agarosa

a b

b > a

[ ] Agarosa

A > % de agarosa la movilidad de la partícula disminuye

A > % de agarosa la resolución de partículas de PM similar aumenta

% agarosa Rango separación

poliacrilamida 1-5 pb a 500 pb

0,5 700 pb a 25 Kpb

0,8 500 pb a 15 Kpb

1 250 pb a 12 kpb

1,2 150 pb a 6 kpb

1,5 80 pb a 4 kpb

* Fragmentos grandes de DNA se corren en geles de agarosa de campo pulsante

Poliacrilamida

Alta resolución

NO para fragmentos grandes

Difícil de armar

Agarosa

Baja resolución (poros grandes)

SI fragmentos grandes

Fácil de armar

Si el % es muy bajo el gel es frágil

=

Voltaje aplicado

V típico = 10 V / cm de gel y geles de 10 – 15 cm 100 V – 130 V

Mejor resolución Voltajes menores (70 V)

(máxima resolución fragm. > 2kb, se corre a 5 V / cm de gel)

OJO, V difusión

Buffer de corrida

Da la fuerza iónica al medio de corrida

Al la [ ] de iones, la resolución

Composición

TAE

TBE

TPE

Más usado. No puede reciclarse mucho.

Mayor capacidad buffer

Tiempo

Depende del tamaño de los fragmentos a separar

A tiempo resolución OJO! (Que no se caiga la muestra del gel)

Temperatura

pH

A V Temperatura y la OJO! (Se puede fundir el gel)

Hay que controlar el pHEvitar modificaciones en la carga y conformación del DNA y las proteínas

Factores intrínsecos

Relación Q/m

Imp. para proteínas: Q/m

Ac. Nucleicos: Q/m constante!

Tamaño

tamaño

Conformación del DNA

DNA circulares: 3 conformaciones posibles

CCC

Lineal

CA

Circular covalentemente cerrado

(superenrrollado)

Circular abierto

+

-

0,6 a 1% agarosa

Si el % de agarosa es de 1 a 1,4 % corren: 1ro. el Lineal, 2do. el CCC y 3ro. el CA

Loading Buffer

Glicerol o ficol o sacarosa Densidad a la muestra

Colorantes de corrida(ubicar frente de corrida)

Azul de bromofenol(corre como DNA 300 pb)

Xylene Cyanol(corre como DNA 4000 pb)

Orange G (corre como DNA 50 pb)

Revelado

Autorradiografía DNA marcado radioactivamente

(Ej. PCR radioactiva)

Agentes intercalantes

BrEt

- Se intercala cada 2,5 pb- Fluoresce naranja a la luz UV- Detecta hasta 10ng de DNA ds- En la agarosa o post-corrida

Genera SC(+). Afecta movilidad CCC.Retrasa 15% lineal

Visualización durante corrida

(tumorigénico)

SyBR Gold

- Fluoresce amarillo- Poca afinidad gel (bajo background)- Detecta hasta 20 pg DNA ds- Seguro (no tumorigénico)- Caro

Marcadores de peso molecular

cualitativos

cuantitativos

sintéticos

DNA fagos o plásmidos digeridos por ER

Sintéticos comerciales

Mar

ker

Lam

bda

Eco

R1/

Hin

dIII

MuestraTamaño DNA fago = 48,5 kb

Intensidad similar

48,5 kb 100%3,53 kb 7,28%

Si sembré 500 ng marker DNA:

100% 500 ng7,28% 36,4 ng

% por el vol de DNA muestra sembrado para obtener la [ ]

Cuantificación DNA

Tipos de geles de agarosa

Comunes

Analíticos

Preparativos

Alcalino (c/NaOH) Para cDNA

Para RNA Con formaldehído (desnaturaliza RNA)

PGFE (en campo pulsante) Separación de fragm. > a 50 kb

Recuperación del DNA del gel

- Agregar al gel membrana de DEAE-celulosa

- Colocar trozo de gel en bolsa de diálisis

- Kits de sílica gel

- Usar low melting point agarosa (funde entre 25-35 grados). Extracción con fenol.

- Corte en gel durante la corrida, seguir con UV y levantar cuando DNA cae en el pocillo