ELECTROFORESIS DE PROTENAS EN CONDICIONES DENATURANTES

El trmino electroforesis describi originalmente la migracin de partculas cargadas a

travs de un medio lquido o semislido bajo la influencia de un potencial elctrico. En

la actualidad la palabra se refiere a cualquier tcnica por la cual las macromolculas se

separen unas de otras en gradientes de potencial elctrico basndose en diferencias en

sus cargas netas, sin importar el medio de conduccin.

El mtodo es empleado frecuentemente en la separacin de distintas protenas, debido

a que las cadenas laterales de varios aminocidos existen en forma disociada y

contribuyen con cargas positivas y negativas a las macromolculas. Sin embargo, otras

molculas tambin se pueden separar por electroforesis, despus de formar complejos

con iones inorgnicos u otros grupos cargados.

Los principios de la electroforesis son simples: Si dos electrodos se sumergen en una

solucin que contiene un electrolito y una suspensin de macromolculas de variadas

cargas netas, las macromolculas acelerarn hacia el electrodo de signo opuesto con

una fuerza proporcional a la magnitud de la carga en la macromolcula y a la

diferencia del potencial elctrico aplicado. Debido a que cada una de las partculas que

migran van a enfrentar una resistencia a su movimiento por friccin, cada una

alcanzar rpidamente una velocidad mxima de migracin. Por lo tanto, si una mezcla

de estas macromolculas se expone a un campo elctrico constante, se alcanzaran

distintas velocidades mximas para partculas de distintas cargas netas.

Adems de la carga neta y el campo elctrico hay muchos otros factores que

influencian la rapidez de la migracin electrofortica de protenas, incluyendo tamao,

pH y la naturaleza del medio a travs del cual ocurre la migracin.

La velocidad a la cual una protena migra hacia uno u otro electrodo durante la

electroforesis se llama movilidad electrofortica (usualmente expresada en cm2/seg-

1 Volt-1) y es dependiente del nmero relativo de cadenas laterales de aminocidos

cargados positiva y negativamente.

El hecho, que una cadena lateral de un aminocido lleva o no una carga, es a su vez

determinado en parte por el pH de la solucin de protenas. A medida que el pH baja

(la concentracin de H+ aumenta), grupo cargados negativamente como

COO - secundarios del cido asprtico o glutmico y el O- de la tirosina se protona, y

por lo tanto las cargas negativas se neutralizan. Al mismo tiempo algunos grupos

amino secundarios de la lisina y arginina pueden aceptar protones

adicionales, aumentando as el nmero de cargas positivas asociadas a la protena.

Por el contrario, si el pH aumenta (OH- aumenta), los protones se disocian de las

cadenas laterales y la protena se hace ms negativa.

Por lo tanto el nmero y tipo de cargas asociados a cadenas laterales de aminocidos

de una protena estn determinados por el pH. A bajo pH, las protenas tienden a llevar

ms cadenas laterales positivas que negativas, por lo tanto la carga neta ser positiva

y la migracin en una electroforesis ser al ctodo (electrodo negativo). A pH alto, las

cadenas laterales negativas predominan y la protena migra hacia el nodo. De lo

anterior se deduce que para cada protena habr un pH en el cual el nmero de cargas

positivas y negativas ser igual. Si la electroforesis se lleva a cabo a este pH, no habr

migracin, debido a que la protena no tiene carga neta. Sobre este pH la carga neta

de la protena se hace ms negativa y su movilidad electrofortica hacia el nodo

aumenta. Bajo este pH, la movilidad electrofortica aumenta hacia el ctodo. El pH al

cual la protena no posee movilidad electrofortica se llama punto isoelctrico y es

caracterstico para cada protena. Debido a que el pH influencia marcadamente la

movilidad electrofortica, es importante mantener el pH constante durante la

electroforesis. Esto se lleva a cabo incluyendo tampones en las soluciones

electrolticas.

Electroforesis en geles de poliacrilamida es quizs el sistema electrofortico ms til y

verstil en el anlisis y separacin de protenas, molculas pequeas de RNA y

fragmentos de DNA.

Poliacrilamida ha reemplazado otros medios de soporte, debido a que el tamao del

poro del gel se puede controlar variando la concentracin de poliacrilamida y adems

la adsorcin de protenas es despreciable.

El gel de poliacrilamida se prepara entrecruzando acrilamida con N,

N-metilenbisacrilamida y el resultado es una matriz inerte, o sea un gel continuo a

travs del cual migran las macromolculas de inters. Hay, bsicamente, 2 formas de

realizar experimentalmente una electroforesis en geles de poliacrilamida: en tubo y en

placas. Geles en placas han reemplazado casi totalmente a geles en tubo, debido al

gran nmero de muestras que se pueden correr en forma simultnea.

Para una resolucin mxima se ha introducido la electroforesis discontina,

desarrollada alrededor de 1960 por L.Ornstein y Davis. El trmino discontinuo se

refiere al hecho a que el sistema usa pH discontinuo. El sistema de gel se prepara en

tubo o en placa y consiste en dos regiones: Gel espaciador y el gel separador. El gel

espaciador tiene una concentracin de poliacrilamida menor, por lo tanto el tamao del

poro es mayor y adems est preparado en un tampn de fuerza inica menor y

distinto pH que el gel separador. El tamao de poro ms grande significa que las

molculas se movern ms rpido en el gel espaciador. Similarmente la fuerza inica

menor significa una mayor resistencia elctrica, de manera que el campo elctrico

(V/cm) es mayor en este gel y eso permite a las molculas desplazarse con mayor

velocidad. Este movimiento rpido en el gel espaciador resulta en la acumulacin de

materia entre el gel espaciador y el separador. Sin embargo, por razones que estn

ms all del objetivo de este curso, los componentes individuales, aunque muy juntos,

se ordenan en "pilas" por orden de movilidad. A medida que las molculas migran a

travs del gel separador, las distintas protenas se separan en bandas discretas de

acuerdo a su movilidad. Al trmino de la corrida electrofortica las bandas se pueden

identificar de varias formas:1. El gel se puede teir por inmersin en colorante

seguido de lavado exhaustivo para remover colorante no unido. Si es necesario

informacin cuantitativa, se puede medir la cantidad de colorante unido a cada una de

las bandas en un densitmetro. 2. Cuando la protena en estudio es una enzima, se

puede practicar tincin de actividad enzimtica. 3. Si la mezcla de protenas est

radioactiva las bandas se pueden detectar por autorradiografa o fluorografa.

Los principales usos de la electroforesis discontinua son para determinar pureza de una

protena presumiblemente pura y para analizar los componentes de una mezcla con

muy buena resolucin (ej. si la cantidad de los componentes es muy grande). Pureza,

es por supuesto, un trmino relativo, ya que se puede obtener una sola banda en el

gel, debido a que las impurezas estn a concentraciones muy bajas para ser

detectadas. Adems, para un buen criterio de pureza deben considerarse distintos

pH, y/o distintos tampones.

Geles de poliacrilamida en condiciones denaturantes

En 1967, A. Shapiro, E. Vi|uela y J. Maizel mostraron que los pesos moleculares para

la mayor parte de las protenas se podan determinar midiendo la movilidad

electrofortica en geles de poliacrilamida que contienen un poderoso detergente de

carga negativa, dodecil sulfato de sodio (SDS). Esta tcnica fue perfeccionada dos aos

despus por K. Weber y M.Osborn.

A pH cercano al neutro, en 1% SDS y 0.1M beta- mercaptoetanol, la mayora de las

protenas, con varias cadenas que unen SDS se disocian; los puentes S-S se rompen

por el BMSH, la estructura secundaria se pierde; y los complejos que consisten de

subunidades proteicas ms SDS asumen una configuracin espiral al azar. Protenas

tratadas de esta forma se comportan como si tuviesen forma uniforme y una razn

idntica carga/masa. Esto es debido a que la cantidad de SDS unido por unidad de

peso de protena es constante: 1.4 g de SDS/g de protena.

La carga es entonces determinada por SDS unido y no por la carga intrnseca de los

aminocidos

Debido a que los espirales al azar de la protena, recubiertos con SDS tienen igual

razn carga a masa, uno puede esperar que la movilidad de cada molcula proteica

sea proporcional al nmero de enlaces peptdicos por molcula, esto es, la movilidad

sera proporcional al peso molecular. Sin embargo, el gel es un "cedazo molecular" a

travs del cual deben pasar las molculas. Cuanto ms pequea sea la molcula,

migrar ms rpidamente a travs del gel; por lo tanto la movilidad aumenta con

pesos moleculares decrecientes.

Weber y Osborn mostraron que si una serie de protenas de peso molecular conocido

se someten a electroforesis en un gel, ellas se separaran en bandas (ver Fig.1A,

pg.40), y que el grfico: distancia de migracin v/s logaritmo del peso molecular daba

una lnea recta (Fig. 1B, pg.40). Por lo tanto, si se somete a electroforesis una

protena de peso molecular desconocido con varias protenas de PM conocido o

estndares, el PM desconocido se puede calcular con una exactitud que varia entre el

5 - 10%.

El procedimiento de electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS es una

herramienta poderosa para el anlisis de protenas debido a que se usa para separar

cualquier protena sin importar su solubilidad en solucin acuosa. Protenas de

membrana, componentes proteicos del citoesqueleto y protenas que forman parte de

agregados macromoleculares grandes pueden resolverse como especies separadas.

Finalmente, como se mencion anteriormente, debido a que el mtodo separa

polipptidos estrictamente de acuerdo al tamao, provee tambin informacin acerca

del peso molecular y la composicin de subunidades de cualquier complejo proteico.

BIBLIOGRAFIA

1. Chrambach,A. & Robbard.D. (1971) Science, 172, 440

2. Laemmli, U.K (1970) Nature (London) 277, 680-685

3. Freifelder,D. (1982) Physical. Biochemistry 276-319, 2a. Editores Freeman &

Company

4. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Vol I. T.S. Work +

E. Work Editors. A.H. Gordon en Pg. 1-145 (Parte I).

ELECTROFORESIS DISCONTINUA DE PROTEINAS SERICAS EN GELES DE

POLIACRILAMIDA EN CONDICIONES DENATURANTES

PARTE EXPERIMENTAL:

I. SOLUCIONES:

A. Acrilamida-bisacrilamida 45% - 1,2% (46,2%T - 2.6% C).

Precaucin: Acrilamida es neurotxico. Evite ingestin o contacto directo con la

piel. Agregar a la solucin una punta de esptula de carbn activado agitar

durante 2 horas, filtrar por papel Whatman. Guardar a 4oC.

B. Tampn gel separador

1,5 M Tris-HCl pH 8,8 0,4% SDS (guardar a 4oC)

C. Tampn gel espaciador.

0,5 M Tris-HCl pH 6,8, 0,4% SDS (guardar a 4oC)

D. Persulfato de amonio 1%

Prepararla solamente (guardar a 4oC)

E. Temed (N, N, N', N' - tetrametiletilendiamina)

F. Tampn de corrida 4x

0,1 M Tris

0,768 M glicina

0,4% SDS

Diluir 1:4 con agua antes de usar, no es necesario ajustar pH. (Guardar a 4oC)

G. SDS 20% P/V (Guardar a temperatura ambiente)

H. Azul de Bromofenol 0,2% azul de bromofenol en 0,1 M Tris HCl pH 6.8

I. Tampn de muestra (5x)

0.125 MTris HCl pH 6.8

5% SDS

25% Glicerol

0.05% azul de bromofenol (guardar a -20oC)

J. Fijador

25% Isopropanol - 10% cido actico

K. Solucin de teido

0,3% azul de Coomasie R en 50% metanol - 10% cido actico.

Se disuelve el azul de Coomasie en metanol (agitar 8 horas) se

filtra, se agrega cido actico y el agua.

L. Solucin de desteido

7% cido actico - 30% metanol

II. PREPARACION DE GELES

A. Gel separador 15%

Acril-Bis 45 - 1,2% 1.94 ml

Tris-HCl 1.5 M pH 8.8, 1,2% SDS 1,5 ml

Persulfato 1% 0,159 ml

H20 2,4 ml

TEMED 12 ml

Total 6 ml

IMPORTANTE: todas las operaciones se realizan en hielo para evitar polimerizacin

B. Gel espaciador 3,4%

Acril-Bis 45 - 1,2% 0,29 ml

Tris-HCl 0,5 M pH 6,8, 0.8% SDS 1,0 ml

Persulfato 1% 0,4 ml

H20 2,3 ml

TEMED 5 ml

Total 4 ml

III. PROCEDIMIENTO

A. Limpiar las placas de vidrio con metanol.

B. Armar la placa con los espaciadores fijando con pinzas.

C. Agregar el volumen necesario de la mezcla del gel separador hasta una altura de

3/4 del alto de la placa.

D. Borrar el menisco, agregando suavemente por las paredes tampn 1,5M Tris-HCl

pH 8,8, 1,2% SDS diluido 1:4, o agua destilada.

E. Dejar gelificar por 20 minutos.

F. Eliminar tampn diluido y lavar la superficie con H20 destilada.

G. Preparar el gel espaciador.

H. Agregar volumen necesario sobre el gel separador. Colocar peineta de 8 10

surcos, evitando que queden burbujas de aire. Dejar gelificar por 20 minutos.

I. Una vez gelificado el gel espaciador, retirar la peineta y el espaciador basal y

colocar las placas en la cmara electrofortica.

J. Agregar el tampn de corrida al depsito inferior evitando atrapar aire en el

borde del gel.

IV. PREPARACION Y APLICACION DE LA MUESTRA

A. La cantidad de protenas sricas a aplicar es de 30 a 60 microgramos por surco.

B. Diluir las muestras con buffer muestra 1:5. Agregar b-mercaptoetanol 5% final y

hervir por 2 minutos.

C. Los volmenes recomendables a aplicar por surco son de 40-70 microlitros.

D. Aplicar las muestras con micropipeta adecuada y agregar nuevamente tampn de

corrida sobre las muestras y el depsito superior.

V. CORRIDA ELECTROFORETICA

A. Conectar los electrodos (polo + abajo).

B. Aplicar 10-15 mA hasta que el indicador del frente inico llegue a 1 cm del borde

del gel (ms o menos 2 horas).

VI. FIJACION Y TINCION

A. Transcurrido el tiempo de corrida, retirar los espaciadores y placas de vidrio y

sumergir el gel en solucin fijadora por 1 hora, luego trasladar a la solucin colorante

por 1 hora.

B. Cambiar a solucin decolorante hasta que las bandas se observen sobre el fondo

claro.

VII. DETERMINACIN DEL PESO MOLECULAR DE LA ALBUMINA

A. En forma paralela a las protenas sricas, someter a electroforesis albmina pura

ms otras protenas de peso molecular conocido. Mida las distintas distancias de

migracin y grafique log. peso molecular versus distancia. Por interpolacin determine

el peso molecular de la albmina srica.

A B

Fig. 1 A. Electroforesis de varias protenas en gel de poliacrilamida en

condiciones denaturantes. Las protenas son: 1. Miosina, 2. b-galactosidasa, 3.

Fosforilasa, 4. Sero-Albmina, y 5. Ovoalbmina,.

B. Grafico semilogartmico de peso molecular versus distancia migrada, para

determinar peso molecular por electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones

denaturantes. Comparar datos del gel al 5 % con figura A.