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B. Lomonte92Captulo 13Electroforesis en Gel de PoliacrilamidaIntroduccinLos geles de poliacrilamida constituyen un excelente medio de soporte paraseparaciones electroforticas, dado que renen una serie de propiedades idneas:transparencia, elasticidad, porosidad controlable y compatibilidad con una gran variedad decompuestos qumicos. La poliacrilamida se forma por copolimerizacin de doscompuestos, la acrilamida y la bis-acrilamida (N,N'-metiln-bis-acrilamida), en unareaccin iniciada por la tetrametiletilndiamina (TEMED) y el persulfato de amonio. Elradical persulfato activa al TEMED, el cual a su vez activa al monmero de acrilamida paraque polimerice. Las cadenas de poliacrilamida son entrecruzadas al azar por la bis-acrilamida, formndose as una red de porosidad bastante uniforme, que puede ser reguladavariando las condiciones de la reaccin y las concentraciones de los monmeros.Entre las diversas tcnicas de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE, por sussiglas en ingls "polyacrylamide gel electrophoresis"), probablemente la ms utilizada es lamodalidad que se lleva a cabo en presencia del detergente duodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), tanto para analizar mezclas de protenas, como para ser combinada con tcnicas deinmunoelectrotransferencia (Captulo 14). En la tnica de SDS-PAGE, se mezclan lasprotenas con el detergente aninico SDS para formar complejos desnaturalizados,cargados negativamente. La cantidad de SDS unido a las protenas es proporcional a sutamao: el SDS se une en una proporcin aproximada de 1,4 g SDS/g protena. Loscomplejos protena/SDS poseen una estructura elipsoide o de bastn, donde la cadenaproteica es distendida y solubilizada por el detergente. Dado que la relacin finalcarga/masa queda constante para las distintas protenas (se anula su carga intrnseca), estasvan a ser separadas en el gel poroso fundamentalmente con base en sus diferencias de pesomolecular (PM): a menor tamao, mayor movilidad de la protena, y viceversa.Estimacin del peso molecular por SDS-PAGESe deduce de lo anterior que esta tcnica permite estimar el peso molecular (PM) deuna protena, comparando su movilidad electrofortica con la de protenas de PM conocido(Fig.13.1). Estas determinaciones poseen un margen de error de10%. Algunos tipos deprotenas pueden mostrar una migracin atpica en esta tcnica, por ej. protenas con puntosisoelctricos muy extremos (donde la carga intrnseca puede ser lo suficientemente fuertepara influir en la movilidad), o protenas altamente glicosiladas.

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Inmunologa General: Manual de Laboratorio93La determinacin del PM de protenas mediante SDS-PAGE es vlida cuando seanalizan cadenas proteicas individuales (subunidades), en donde se han reducido todos losenlaces disulfuro y por ende, se ha distendido toda la cadena proteica para su interaccincon el SDS. Bajo estas condiciones, la migracin de las molculas obedecefundamentalmente a su PM. No obstante, en ocasiones es til analizar muestras noreducidas de una protena, por ejemplo, para evaluar su composicin de subunidades. Ental caso, la movilidad electrofortica en SDS-PAGE, aunque guarda una cierta relacin conel PM, no necesariamente corresponde con su PM exacto, dependiendo de la forma y lospliegues causados por los enlaces disulfuro, que seguiran intactos an despus de lainteraccin SDS-protena, en condiciones no-reductoras.Si la muestra ha sido reducida con 2-mercaptoetanol (u otro reductor como elditiotreitol), los enlaces disulfuro intra- e inter-catenarios son disociados, la estructuracuaternaria se pierde y las subunidades se separan como cadenas peptdicas individuales.La movilidad electrofortica relativa (Rf) es inversamente proporcional al logaritmo delPM. Trazando un grfico con estndares de PM conocido, se obtiene una lnea dereferencia en la cual se puede interpolar muestras de PM desconocido. El Rf se calculadividiendo la distancia (mm) recorrida por la banda en cuestin, entre la distancia recorridapor el colorante azul de bromofenol (u otro punto de referencia arbitrario). Ejemplo:Cuadro 13.1:Determinacin del peso molecular de una protena "incgnita",mediante SDS-PAGE.Las muestras fueron reducidas con 2-mercaptoetanol, ycorridas en un gel al 12% de concentracin.______________________________________________________________________MarcadorPMDistancia (mm)Rf (vs.70 mm)______________________________________________________________________Albmina bovina66.0006,50,092Ovalbmina45.00013,00,186Gliceraldeh-3-P-DH36.00018,00,257Anhidrasa carbnica29.00025,00,357Tripsingeno24.00028,50,407Inhibidor de tripsina20.10038,00,543-Lactalbmina14.20050,00,714Banda incgnita?44,00,623_____________________________________________________________________Al graficar estos datos en papel semilogartmico (x=Rf, y=Log PM) se observa larelacin mencionada (Fig.13.1). El PM estimado para la protena incgnita es de 16.200daltons, interpolando mediante una regresin lineal en los puntos adecuados.

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B. Lomonte94Figura 13.1:Ejemplo de una curva de referencia para la estimacin del peso molecular deprotenas mediante SDS-PAGE.Los datos corresponden al ejemplo del Cuadro 13.1. Ntese que lalnea de regresin con los estndares de PM conocido muestra una ligera curvatura, tpica de los gelesde concentracin homognea. Para la interpolacin de bandas incgnita, en la prctica es ms sencilloaplicar una regresin lineal simple a los puntos colineales ms cercanos a la muestra. La extrapolacinde la curva hacia el eje Y, donde Rf=0, indica que, tericamente, las protenas mayores de 100 Kd nopenetran en el gel.Para ilustrar la utilidad del anlisis de una protena bajo condiciones de reduccin ono-reduccin, se puede usar como ejemplo la molcula de IgG (Fig.13.2). Al correr unapreparacin pura de IgG no reducida, se obtendr una sola banda, en la regin de PM150-160 Kd. Si se trata la muestra con un reductor como el 2-mercaptoetanol, se observar dosbandas: una de50 Kd (la cadena) y otra de25 Kd (las cadenas livianas kappa ylambda).Figura 13.2:Anlisis de la composicin de subunidades de unaprotena en SDS-PAGE.Una muestra de IgG purificada (carrilcentral) que no fue tratada con agente reductor, migrar con un PMaparente de 150-160 Kd. La misma se separar en dos bandas, alser reducida (IgG (R), con PM de 50 y 25 Kd, respectivamente. A laizquierda se representan los marcadores de PM conocido (M).6894433020141505025MIgG IgG (R)+

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Inmunologa General: Manual de Laboratorio95La tcnica de SDS-PAGE posee un alto poder de resolucin. Lo anterior se deriva deluso de un sistema electroforticodiscontinuo, formado de dos geles de distinta porosidady pH, que primero compactan las muestras (en el gel superior ocompactador) y luego lasseparan (en el gel inferior oseparador; Fig.13.3).gel compactador (superior)gel separador (inferior)Figura 13.3:Partes de un gel de SDS-PAGE.Est compuesto de dos gelesde distinta porosidad y pH, que cumplen funciones diferentes, para aumentarel poder de resolucin.En el gel separador, la movilidad es restrigida por el tamao del poro, el cual dependede la concentracin de monmeros del gel. As, si se requiere resolver componentes demuy alto PM, se utilizan geles al 5% o al 7,5%, mientras que los geles de poro menor, ej.15-20% son tiles en la separacin de pptidos y protenas pequeas. Los geles de porointermedio (10-12%) proveen una separacin adecuada para protenas de ~10.000-90.000daltons.Geles en gradienteCiertos tipos de muestras poseen componentes con PMs muy variados, que incluyendesde macromolculas hasta pequeos pptidos. En tales casos, el uso de un gel separadorde concentracinhomognealimita a resolver adecuadamente solo una fraccindeterminada de los componentes. La alternativa para estos casos es la utilizacin de gelesde concentracin heterognea, en los cuales se prepara ungradienteque va desde unaconcentracin baja, al inicio del gel (ej. 5%), aumentando hacia el final (ej. 30%) Estosgeles proporcionan la mejor resolucin obtenible por SDS-PAGE para mezclasheterogneas, y su preparacin requiere de un aditamento simple para generar gradientes,que puede ser obtenido comercialmente o preparado en el laboratorio (Fig.13.4).

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B. Lomonte96Figura 13.4:Esquema de la preparacin de un gel de poliacrilamida en gradiente.1:llave; 2:agitador magntico; 3:bomba peristltica; 4:molde de vidrio para el gel;A:solucin diluda (concentracin mnima); B:solucin concentrada (concentracinmxima).Preparacin de geles para SDS-PAGE (Laemmli, 1970).Las cantidades que se describen a continuacin1sirven para el sistema de mini-geles de Bio-Rad (Mini-Protean II). Las mismas pueden adaptarse para otras cmaras dediversa capacidad, conservando las proporciones.1.Para la preparacin del gel separador o inferior (5 ml, grosor = 0,75 mm), mezclar lossiguientes reactivos, segn el porcentaje de gel deseado, en un frasco Kitasato de 50 ml:------------------------------------------------------------------------------------------ComponenteConcentracin final20% 15% 12% 10% 7,5% 5%-------------------------------------------------------------------------------------------agua desionizada3671167 1683 2000 2367 2783 lamortiguador separador1250 1250 1250 1250 1250 1250 lSDS505050505050lacrilamida/bisacrilamida3333 2500 2000 1667 1250 833l-------------------------------------------------------------------------------------------1Nota:la acrilamida esneurotxica. Al pesar el reactivo slido debe usarse guantes y mascarilla. Limpiecualquier residuo de acrilamida en la balanza y sus alrededores, pues la inhalacin es tan nociva como elcontacto con la piel. Al preparar geles es necesario usar guantes e igualmente, limpiar cualquier derrame.Los sobrantes de solucin de monmeros no deben ser vertidos en el desage, es mejor polimerizarlos ydescartarlos en forma de gel (ya que el polmero pierde la toxicidad.

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Inmunologa General: Manual de Laboratorio972.Preparar el molde para el gel. Hacer una marca a1-1,5 cm debajo del nivel del "peine"de muestras. Retirar el peine.3.Con la mezcla de reactivos a temperatura ambiente, desgasear aplicando vaco2por 15min.4.Iniciar la polimerizacin agregando 3l de TEMED y 15l de persulfato de amonio3a lamezcla. Inmediatamente mezclar y verter la solucin en los vidrios (molde), hasta la marcahecha en el paso #2, sin atrapar burbujas. De seguido, eliminar la curvatura (menisco) en lasuperficie, con una delgada capa (1-2 mm) de agua destilada o de isobutanol, depositadamuy suavemente sobre la mezcla. Dejar que polimerice el gel (ptimamente en 15-20 min).5.Una vez que la interfase entre el polmero y el agua se torna visible, esperar 10-15 minadicionales para que se complete la reaccin. Luego, decantar el exceso de lquido de lasuperficie, y colocar el peine para muestras, en posicin ligeramente inclinada (para noatrapar burbujas).6.Mezclar los componentes del gel superior (compactador):ComponenteCantidad------------------------------------------------agua desionizada1,5 mlamortiguador superior630 lSDS33 lacrilamida/bisacrilamida330 lTEMED2 lPersulfato de amonio10 l------------------------------------------------7.Una vez agregados los catalizadores, mezclar y verter de inmediato en el molde,nivelando ahora el peine a su posicin horizontal, sin atrapar burbujas. Dejar polimerizar.8.Quitar el peine deslizndolo suavemente, y lavar los hoyos llenndolos con agua yaspirando luego con una jeringa. Esto elimina residuos de componentes no polimerizados.9.Preparar las muestras. Estas se pueden analizar en estadoreducidoono reducido,mezclndolas con el respectivo amortiguador de muestras. Si las muestras son slidas, sepueden disolver directamente en el amortiguador "1x". Si son lquidas, se mezclan partesiguales de muestra y amortiguador "2x". La cantidad de protena a aplicar depende de lasensibilidad del sistema de deteccin (ej.g para tincin de Coomassie, ng para tincin de2asegurarse de que el sistema de vaco cuente con una trampa de seguridad.3las cantidades de persulfato y TEMED pueden variar segn cada lote y estado de los reactivos.

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B. Lomonte98plata, etc.) y de la heterogeneidad de la muestra. Para reducir los enlaces disulfuro de lasmuestras (en el amortiguador reductor), colocarlas en bao de agua a ebullicin durante 4-5min. Para correr muestras no reducidas, se mezclan con amortiguador (sin reductor) y seaplican al gel directamente, sin calentamiento. La concentracin de las muestras a usardepende de su heterogeneidad. Las mezclas complejas de protenas se pueden preparar a5-10 mg/ml.10.Cargar las muestras en los hoyos (5-15l, correspondiendo por ej. a 10-30g en el casode mezclas complejas, o 3-10 g en el caso de protenas purificadas). Para esto, se puedellenar previamente todos los hoyos con amortiguador de cmara, y luego aplicar lasmuestras "bajo el amortiguador" (dado que son ms densas por la glicerina), con una pipetaHamilton o con una pipeta de puntas descartables para geles (puntas capilares). Esfundamental realizar estos pasos sin que haya contaminaciones cruzadas entre los distintoshoyos. Igualmente, si se utiliza una pipeta Hamilton, hay que lavarla exhaustivamente entrelas distintas muestras. Incluir marcadores de PM en uno de los carriles, como referencia.11.Llenar la cmara con el amortiguador de cmara (180 ml en el tanque inferior y 120 mlen el superior). Colocar el gel en la cmara y correr las muestras a 200 v (voltaje constante)hasta que el azul de bromofenol llegue casi al borde inferior del gel (45-60 min).12.Sacar el gel y sumergirlo en fijador durante 15 min, en un recipiente tapado (para evitarlos vapores txicos del metanol), con agitacin suave. Adems de fijar, esta solucin lavauna buena parte del SDS del gel, el cual interfiere con la tincin.13.Teir el gel durante 1 hr con azul Coomassie R-250. Eliminar luego el exceso decolorante con varios cambios del decolorador. La decoloracin es ms rpida si se agrega alrecipiente unos trocitos de esponja (tipo espuma de poliuretano) limpios, que actanadsorbiendo el colorante.14.Registrar los resultados por fotografa, por ejemplo con un sistema de reveladoinstantneo (Polaroid). Si se desea guardar el gel, se puede dejar en cido actico al 7% encajas o en bolsas de plstico selladas. El gel puede secarse sobre un papel de filtro grueso,o entre trozos de celofn especial. Para esto se sumerge el gel durante la noche en 5%metanol con 3% glicerol, se monta sobre el papel filtro o celofn, con otra hoja de celofnencima, y se coloca en un secador de vaco durante 1-3 hr a 60C. El secado de geles noest exento de riesgos, ya que pueden ocurrir rupturas que lo arruinen. A mayorconcentracin del gel, mayor es la dificultad para el secado, y viceversa. Si no se disponede un secador, se puede emplear un vidrio con peso sobre el celofn para secar atemperatura ambiente, ms lentamente. An estando secos, los geles pueden deteriorarse alganar o perder humedad con el tiempo. De ah la importancia de contar con un sistema deregistro fotogrfico.

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Inmunologa General: Manual de Laboratorio99Figura 13.5:Preparacin de un gel de poliacrilamida: partes.(1) vidrios separados por reglitas de tefln,que determinan el grosor del gel; (2) peine para formar los hoyos para muestras; (3) bloque de plstico paraensamblar los vidrios; (4) base para realizar el chorreo del gel; (5) ncleo de la cmara de electroforesis, conlos electrodos.Figura 13.6:Polimerizacin del gel.Una vez ensambladas las piezas del molde, los componentes del gelse mezclan con los catalizadores e inmediatamente se vierten en el espacio entre los vidrios.

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B. Lomonte100Figura 13.7:Anlisis de la pureza y composicin de subunidades de unaprotena mediante SDS-PAGE.Los carriles rotulados NR y R corresponden amuestras de una lectina aislada del veneno deCerrophidion(Bothrops)godmani,en condiciones no-reducidas y reducidas, respectivamente. El carril central (m)posee marcadores de peso molecular, cuya masa (kDa) se indica a la derecha. Sededuce que esta protena es un dmero formado por subunidades deaproximadamente 14 kDa (Lomonteet al., 1990).ReactivosSolucin de monmeros de acrilamida:29,2 g acrilamida; 0,8 g bis-acrilamida; disolver en agua desionizada y aforar a 100 ml.Filtrar y guardar en botella mbar de vidrio, en refrigeracin (