el Óxido nítrico como neurotransmisor y neuromodulador

El Óxido Nítrico 39

El Óxido Nítrico como Neurotransmisory Neuromodulador

Adriana Fernández Alvarez, Verónica Abudara,Francisco R. Morales

Neurofisiología Celular, Departamento de Fisiología. Facultad de Medicina,Universidad de la República. Montevideo, Uruguay.

1. Introducción. Breve reseña histórica

La neurociencia ha ingresado en un período de revisión y renovación de teo-rías y conceptos acerca del funcionamiento del sistema nervioso. La definicióndel óxido nítrico (NO) como mensajero intercelular1, ilustra uno de estos proce-sos de renovación impactando sobre nuestra concepción clásica de la transmi-sión sináptica y de la comunicación interneuronal.

El NO es una molécula gaseosa liposoluble, membrana-permeante y muydifusible. Este compuesto es capaz de activar cadenas metabólicas intracelula-

1 El presente artículo se concentrará en la función del NO como mensajero neuronal y no analizaráotros de sus papeles, fisiológicos o patológicos, como intermediario en las funciones tumoricidas ybactericidas de los macrófagos (Hibbs et al. 1988), o en la muerte celular.La siguiente revisión deberá leerse considerando que éste es un campo del conocimiento de creci-miento explosivo, y que nuevas evidencias se agregan a la literatura día a día.

Actas de Fisiología, 5: 39-77, 1999

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res, principalmente mediante la promoción de la síntesis de GMPc. El NO, adiferencia de otras sustancias neurotransmisoras, posee la capacidad de afectarcélulas, procesos neurales o efectores aunque éstos no se encuentren en contac-to anatómico inmediato con el elemento celular que sintetiza este compuesto(Snyder, 1992; Bredt & Snyder, 1992).

La historia de cómo se llegó al conocimiento de la existencia del NO y de sufunción como mensajero ilustra de qué manera descubrimientos inconexos eincógnitas no resueltas convergieron para adquirir significado biológico. Los orí-genes de esta historia se pueden rastrear en el siglo XIX, cuando se reconoció elefecto beneficioso de la nitroglicerina en el tratamiento del angor pectoris (Brun-ton, 1867; Murrel, 1879). A esta sustancia se le atribuyó un efecto vasodilata-dor coronario y de otros vasos del organismo, aunque su mecanismo de accióníntimo no pudiera dilucidarse durante décadas. En efecto, transcurrió más de unsiglo antes que se lograran evidencias experimentales de que esta vasodilataciónera causada por la generación de NO, a partir del desdoblamiento de la molécu-la de nitroglicerina, y que a su vez, el NO era capaz de promover la síntesis deGMPc. Por medio de eventos intracelulares interrelacionados, este segundomensajero desencadena la relajación vascular.

Pasado ese tiempo, nuevos hitos contribuyeron a esta historia. Por ejemplo,Furchgott en 1984, obtuvo evidencia experimental de la existencia de un factorde naturaleza química desconocida de origen endotelial, que producía la relaja-ción del músculo liso vascular ante la administración de acetilcolina (ACh). Aesta enigmática sustancia se le denominó, provisoriamente, “factor endotelial dela relajación vascular” (Endothelium-Derived Relaxing Factor; EDRF). Del tra-bajo de Furchgott transcribimos: “Hace algunos años descubrimos en formaaccidental que la relajación observada por la administración de ACh en el pre-parado aislado de arteria (anillo, tiras cortadas en forma transversa o helicoidal),dependía totalmente de la presencia de células endoteliales en la preparación.Este descubrimiento contribuyó a resolver la paradoja de que la ACh, un poten-te vasodilatador arterial in vivo, no produjera relajación muscular en el prepara-do aislado de arteria. Aparentemente, en los preparados in vitro, no se obteníala relajación por el daño accidental de sus células endoteliales, durante la disec-ción del preparado biológico.” (Furchgott, 1984). La figura 1 ilustra uno de losexperimentos clásicos de este investigador, en el cual, la administración de ACha un preparado aislado de aorta, provocó la disminución de la tensión musculara condición de que el endotelio vascular se hallara indemne. La ACh entonces


no actuaría directamente sobre el músculo liso vascular sino que su efecto dilata-dor se cumpliría a través de la producción y liberación de un EDRF.

Se consideró prioritario entonces, identificar este factor y determinar su es-tructura química. Ya en 1979, se había demostrado que el barboteo con NO enel baño de un preparado de músculo liso provocaba una marcada relajación delmúsculo precontraído y que este efecto era mediado por la enzima guanilatoci-clasa (Gruetter et al. 1979). Otros estudios demostraron que la nitroglicerina yotros nitritos orgánicos ejercían su efecto vasodilatador mediante la activaciónde la guanilatociclasa y la producción de GMPc (Arnold et al. 1977; Ignarro etal. 1981). Fue así que, debido a la similitud de los efectos del EDRF y del NOsobre el músculo liso, Furchgott e Ignarro propusieron en una reunión científicarealizada en 1986, que el NO era en realidad el enigmático EDRF, lo que fueconfirmado años más tarde (Furchgott, 1988; Ignarro et al. 1988; Moncada etal. 1991; Palmer et al. 1987;1988). Por sus estudios, a estos investigadores seles otorgó, junto con F. Murad, el Premio Nobel de Medicina en 1998.

En la figura 2 se esquematiza cómo se produciría la relajación vascular ante laadministración de ACh o ante la administración de compuestos que liberen NO(dadores de NO, como la nitroglicerina). De acuerdo con este esquema, el NO

Figura 1. Experimentos que indican la existencia de un factor endotelialresponsable de la relajación vascular y que es liberado por acción de laacetilcolina.Los trazados corresponden a la tensión desarrollada por un trozo aisladode arteria aorta en presencia de norepinefrina (NE). En el trazado de laizquierda el endotelio del trozo de aorta se mantuvo indemne, a la derechadicho endotelio fue removido previamente. La acetilcolina (Ach) provocauna disminución de la tensión sólo en el segmento con el endotelio intacto.Esta acción es dosis dependiente.W: lavado. (Modificado de Furchgott, 1984).


Figura 2. Diagrama que resume el mecanismo por el cual la acetilcolina(Ach) ejerce su efecto vasodilatador en el músculo liso vascular.La Ach actúa a nivel de la célula endotelial promoviendo la síntesis de NOa través de un mecanismo Ca++/calmodulina dependiente. El NO difundehacia la célula muscular lisa donde se combinaría con la guanilato ciclasasoluble o podría ejercer efecto directo sobre canales de potasio calciodependientes. Un efecto similar, por acción directa en las células del músculoliso, se obtiene con la administración de dadores de NO.GC: guanilato ciclasa soluble; GMPc: monofosfato cíclico de guanina; GTP:trifosfato de guanina; L-arg: L-Arginina; L-cit: L-Citrulina; NOS: NO-sintetasa; PK-GMPc: proteínquinasa dependiente de GMPc. (Modificadode Butler et al. 1995).

es sintetizado en la célula endotelial al activarse una enzima que cataliza la con-versión de L-arginina a L-citrulina y NO. Esta enzima es conocida como óxidonítrico sintetasa (en inglés “nitric oxide sinthetase” o “NOS”). La combinaciónde la ACh con un receptor muscarínico de la membrana de la célula endotelialllevaría, por un mecanismo indirecto, a la activación de la NOS. Tanto el NOsintetizado en la célula endotelial como el generado a partir de un dador, actua-rían en la célula blanco activando la enzima guanilatociclasa soluble con el consi-guiente aumento de la concentración intracelular de GMPc. A su vez, este se-gundo mensajero intracelular, provocaría la apertura de canales de K+ hiperpo-larizando la fibra muscular lisa y estimularía una bomba de Ca++ en la membrana


disminuyendo el contenido intracelular de este ión. Tanto el NO producido en lacélula endotelial como el administrado a partir de un dador utilizan como meca-nismo de acción en la célula blanco la activación de la guanilatociclasa soluble. ElNO también podría ejercer efecto directo sobre canales de potasio calcio de-pendientes de la célula muscular.

Hasta lo que indica el esquema, el NO sería un mensajero intercelular entre lacélula endotelial y el músculo liso vascular. De dónde surge la noción de que esun neurotransmisor y no solamente un factor endotelial? Si el NO fuera un neu-rotransmisor, debería en primer lugar ser sintetizado en un elemento neural y ensegundo lugar, moléculas receptoras del NO como la enzima guanilato ciclasasoluble, deberían estar localizadas en neuronas o en efectores del sistema ner-vioso como las células musculares o glandulares. En este aspecto la historiatambién muestra como el acúmulo de evidencias condujo a una nueva síntesisconceptual por la cual, efectivamente, se estableció al NO como un neurotrans-misor o neuromodulador en el sistema nervioso central y en el periferico. En1977 el grupo de investigadores encabezado por Murad describió que el NOactivaba una guanilatociclasa cerebral, este hecho fue considerado inicialmentecomo un fenómeno bioquímico sin significado fisiológico evidente (Arnold et al.1977; Miki et al. 1977). Posteriormente se demostró que los aminoácidos exci-tatorios eran capaces de aumentar los niveles de GMPc en cultivos de neuronasde cerebelo a partir de un factor con propiedades similares al EDRF (Garthwai-te et al. 1988). Una coenzima de la NOS, la NADPH, fue localizada en nume-rosos grupos neuronales en el sistema nervioso central, posteriormente la exis-tencia de la propia NOS fue demostrada en el sistema nervioso.

Estos hechos sugirieron que la síntesis de NO podría ocurrir en el sistemanervioso, aunque su función fuera aún motivo de especulación. Fue en el sistemanervioso periférico donde se demostró por primera vez, el papel del NO en laneurotransmisión. En este sector, los preparados experimentales utilizados per-miten la estimulación de fibras nerviosas de la pared de diversos órganos y elregistro del grado de contracción del músculo liso de éstos. De esta manera sedeterminó que algunos componentes de la relajación de la fibra muscular lisaobtenidos por estimulación nerviosa no podían ser explicados ni por la noradre-nalina ni por la ACh. Estos componentes estarían mediados por otro tipo deneurotransmisión, a la que se denominó “no-adrenérgica no-colinérgica”(NANC). La confirmación de la hipótesis de que el NO era un neurotransmisorNANC , se obtuvo cuando, por medio de inhibidores de la síntesis del NO, se


logró bloquear la relajación del músculo anococcígeo inducida por la estimula-ción eléctrica del plexo mientérico -acción NANC por excelencia- (Gillespie etal. 1989; Li & Rand, 1989; Gibson et al. 1990).

A continuación desarrollaremos distintos aspectos sobre la acción del NOcomo neurotransmisor y neuromodulador. Consideraremos: a) de qué manerasus propiedades físico-químicas le otorgan peculiaridades en su función de trans-misor de información (ítem 2), b) cómo se sintetiza, difunde y reacciona este gascon distintas moléculas (ítems 3 al 6), c) cómo se localiza y distribuye en elsistema nervioso (ítem 7), y d) haremos hincapié en su papel como neurotrans-misor, en el marco de distintas funciones del sistema nervioso autónomo y delsistema nervioso central (SNC) en las que estaría involucrado (ítems 8 y 9).

2. El óxido nítrico como neurotransmisor

Existe acuerdo que para considerar a una sustancia como neurotransmisora,ésta debe cumplir con ciertos criterios. Algunos de estos criterios que se basanen nociones establecidas sobre los mecanismos de la neurotransmisión son: 1)La maquinaria biosintética para una sustancia neurotransmisora debería estarpresente en la presinapsis; 2) La sustancia debe encontrarse almacenada en laterminal presináptica; 3) La misma, debe liberarse ante la estimulación nerviosapresináptica; 4) La administración exógena de la sustancia debe provocar unarespuesta, que imitar a a la causada por la estimulación nerviosa presináptica; 5)Aquellas drogas que modificaran la respuesta causada por la sustancia, debenprovocar las mismas modificaciones en la respuesta causada por la estimulaciónnerviosa presináptica; 6) En la sinápsis o en su cercanía deben encontrarse me-canismos que determinen el cese de la acción de dicha sustancia neurotransmi-sora sobre la postsinápsis.

Algunos de estos criterios necesarios para considerar al NO como un neuro-transmisor en el sistema nervioso autónomo (SNA) han sido satisfechos (Vin-cent, 1995); pero como veremos a continuación, las propiedades físico-quími-cas del NO determinan características peculiares en la neurotransmisión nitrinér-gica (Snyder, 1992; Bredt & Snyder, 1992).

El NO es una molécula gaseosa liposoluble, reactiva y difusible (ver 4.). Alpermear libremente las membranas biológicas, es poco probable su almacena-miento en vesículas sinápticas. Por lo tanto a diferencia de otros neurotransmi-


sores, el NO no se almacena en el elemento presináptico, debe ser producidode novo ante su requerimiento funcional y no se libera por exocitosis. Por otraparte la liberación del NO no se desarrolla necesaria y exclusivamente en lasterminales sinápticas (Wiklund et al. 1997). Al existir NOS en el cuerpo neu-ronal y en las dendritas éste podría ser sintetizado en estos elementos y difundirlibremente, pudiendo este compuesto actuar en cualquiera de las células cerca-nas a la neurona nitrinérgica si ellas contaran con los receptores adecuados.

El NO es sintetizado por acción de la enzima NO-sintetasa (NOS) (ver 3.)y difunde desde su sitio de síntesis por gradiente de concentración hacia suscélulas blanco. Allí se combina con sus receptores biológicos, entre ellos (el másestudiado): la enzima guanilatociclasa soluble. En la figura 3 se esquematiza unasinapsis glutamatérgica en el SNC rodeada de otros elementos neurales. En esteesquema, el glutamato liberado por una terminal presináptica actúa en el elemen-to postsináptico produciendo la entrada de ion calcio. El aumento de la concen-tración de calcio intracelular activa la NOS por un mecanismo calmodulina de-pendiente, sintetizándose NO en el elemento postsináptico. Esta molécula pue-de difundir espacialmente abarcando una esfera (que se representa por la líneapunteada), donde podrían encontrarse otros elementos neuronales (terminalespresinápticos y otros elementos postsinápticos). El NO producido luego de laliberación de glutamato, podría actuar sobre dichos elementos si estos contuvie-ran la enzima guanilato ciclasa soluble. Por lo tanto, en principio, la difusibilidaddel NO determinaría que sus efectos no se hallen restringidos al sitio de síntesis.En efecto, esta sustancia sería capaz de actuar sobre todas las estructuras exis-tentes en la esfera hipotética que tenga como centro su sitio de síntesis, tal cuales esquematizado en la figura 3 (ver 4.).

Generalmente para el cese de las acciones de un neurotransmisor en unasinapsis química, éste debe ser activamente eliminado del espacio sináptico. Porejemplo, la acetilcolina es hidrolizada por la acetilcolinesterasa en el espaciosináptico o la serotonina es recaptada por terminales sinápticas serotoninérgi-cas. En el caso del NO sin embargo, no opera ni la metabolización ni la recapta-ción, sino que el neurotransmisor se agota a medida que difunde y se combinacon diferentes sustratos (Vincent, 1995).

Por lo tanto, es evidente que no todos los criterios para considerar a unamolécula como un neurotransmisor son cumplidos estrictamente por el NO, peroesto no invalida la noción de que esta sustancia es un neurotransmisor sino queimplica que la transmisión nitrinérgica constituye una nueva y particular forma de


NOS NONO

NO

GC?GC?

GC?

GC?GC?

GC?

Ca++

glutamato

PRESINAPSISPRESINAPSIS PRESINAPSIS

NEURONAVECINA

NEURONAVECINA

Figura 3. Síntesis, difusión y esfera de acción del NO.En el sector central del esquema, se representa una terminal glutamatérgicaque establece contacto sináptico con un elemento postsináptico que contieneNOS. La combinación del neurotransmisor glutamato con un subtipo dereceptor postsináptico (NMDA), genera la entrada de calcio al elementopostsináptico. El aumento del Ca++ intracelular promueve la síntesis deNO, por activación Ca++/calmodulina dependiente de la NOS. La líneapunteada representa la esfera de acción del NO en un momento determinado.El NO que difunde desde la postsinapsis podría actuar, teóricamente, encualquiera de los elementos celulares representados siempre y cuandocontengan blancos moleculares adecuados (por ejemplo la guanilato ciclasasoluble: GC?). Observe que inclusive el propio elemento productor de NOpuede ser blanco de su acción, si poseyera receptor para el mismo.GC, guanilato ciclasa soluble; NMDA, N-metil-D-aspartato; NOS, NO-sintetasa.


neurotransmisión. Es así que, para aceptar que en un determinado sistema latransmisión es nitrinérgica, debería tenerse en cuenta el acúmulo de las eviden-cias experimentales, en lugar de insistir en el cumplimiento riguroso de un con-junto de criterios determinados a priori y que excluirían a nuevos mecanismosy/o sustancias del proceso de neurotransmisión (Vincent, 1995; Rand & Li,1995a).

3. Síntesis de NO

La enzima NO-sintetasa (NOS) cataliza la conversión de L-arginina a L-citrulina y NO; esta reacción se esquematiza en la figura 4. La NOS requierecofactores como NADPH, FAD y FMN (NADPH: dinucleótido de nicotíamida- adenín- fosfato reducido; FAD: flavín-adenín-dinucleótido; FMN: flavín-mo-nonucleótido). Tres iso-enzimas de la NOS (neuronal, endotelial y macrofágica)han sido purificadas, clonadas y caracterizadas bioquímicamente. 1) En las neu-ronas existe una NOS constitutiva de activación rápida, Ca++/calmodulina de-pendiente (Bredt & Snyder, 1990), pero no se descarta la presencia de otrasiso-enzimas. 2) La NOS endotelial también es activada por un mecanismo Ca++/calmodulina dependiente. 3) Los macrófagos normalmente no contienen NOSen su citoplasma sino que la enzima es sintetizada de novo ante la aparición dedeterminados agentes agresores (NOS inducible). En un hallazgo con interesan-tes implicancias se ha podido demostrar que en algunos tipos neuronales la NOSneuronal puede ser inducida bajo condiciones especiales como durante el desa-rrollo y la injuria neuronal (Wu et al. 1993; Mayer, 1995; Yun et al. 1997; Lin etal. 1997).

La actividad de la NOS neuronal es regulada por la concentración de Ca++

intracelular (Bredt & Snyder, 1990). El gráfico que se observa en la figura 4,muestra la variación de la actividad de la NOS, en función de la concentraciónde calmodulina y en ausencia o presencia de Ca++. Existen mecanismos adicio-nales de regulación de la NOS. Por ejemplo, esta enzima es sensible a las varia-ciones de la disponibilidad del sustrato L-arginina y/o de cofactores como laNADPH. Probablemente, el NO producido contribuiría también a la inhibiciónde la actividad de la NOS por un mecanismo de retroalimentación negativa,uniéndose al grupo hemo de la NOS en forma reversible (Rogers & Ignarro,1992). Se ha identificado en varias especies, una Proteína Inhibidora de la NOS


Figura 4. Síntesis de NO por acción de la NO-sintetasa, a partir de L-arginina.La L-arginina se convierte a L-citrulina y NO. Esta reacción es catalizada por la enzimaNO-sintetasa (NOS) cuyas coenzimas y dominios catalíticos se representan a la izquierda.La NOS posee dos dominios catalíticos. 1) El dominio de actividad reductasa está ubicadoen la mitad C-terminal de la enzima y presenta los sitios de unión para los cofactoresNADPH, FAD y FMN. Las flavinas FAD y FMN están encargadas del traslado de electronesdesde el cofactor NADPH al grupo hemo. 2) El dominio de actividad oxidasa estácompuesto por un grupo hemo ubicado en la mitad N-terminal de la proteína, y determinala oxidación de la L-arginina. Ambos dominios se hallan separados por un sitio de uniónpara la calmodulina. De esta manera un terminal guanidino nitrogenado de la argininaincorpora 5 electrones oxidándose, reacción que es sustentada por la NADPH reducida ylas flavinas FMN y FAD. La tetrahidrobiopterina (BH4) y el tiol constituyen cofactoresadicionales de la NOS. El flujo de electrones se establece desde la NADPH hasta el hierrodel grupo hemo (como lo indica la flecha).La transferencia de electrones requiere la fijación de calmodulina a la NOS. El recuadromuestra un experimento en el cual se midió la actividad de la NOS, en función de laconcentración de calmodulina y en ausencia o presencia de calcio. El EDTA es un quelantedel calcio.BH4, Tetrahidrobiopterina; FAD, Flavín-adenín-dinucleótido; FMN, Flavín- mononucleótido;NADPH, dinucleótido de nicotín-adenín-fosfato reducido.(Modificado de Vincent, 1995 y Bredt & Snyder 1990).


neuronal (PIN) que al fijarse a la NOS impide su dimerización, inhibiendo suactividad (Jaffrey & Snyder, 1996); recientemente se ha determinado la distri-bución de la PIN en el cerebro de la rata (Greenwood et al. 1997).

Por lo tanto la actividad enzimática de la NOS puede regularse por diversosfactores, entre ellos: la concentración de Ca++ intracelular, la disponibilidad desustrato y los niveles del mismo neurotransmisor.

4. Difusión del NO y su esfera de acción

El NO difunde fácilmente a través de las membranas biológicas. En las mem-branas plasmáticas el coeficiente de difusión determinado a 20 ºC varía desde1,3 x 10-5 cm2. s-1 en liposomas hasta 0,4 x 10-5 cm2. s-1 en eritrocitos (Denico-la et al. 1996). En solución buffer a pH fisiológico y en condiciones de nor-moxia, la vida media del NO es de 30 segundos y su distancia de difusión radiales de 540 µm mientras que en sangre, estos valores disminuyen respectivamentea 1 segundo y 100 µm (Kelm & Schrader, 1988). Estas distancias son conside-rables si tenemos en cuenta las dimensiones de las neuronas y elementos nervio-sos del cerebro; de hecho, en un radio de 100 µm en un neuropilo se encontra-rían numerosas sinapsis y fibras (tamaño de la sinapsis 10-3 a 10-2 nm). Por lotanto, el NO es capaz de actuar, teóricamente, sobre todas las estructuras queposean su receptor, contenidas en una esfera hipotética (como la esquematizadaen la Fig. 3) que tiene como centro el sitio de producción del gas y cuyo volumendepende del coeficiente de difusión del NO en el ambiente en que se encuentre.El NO alcanzaría un número de blancos más o menos cercanos o lejanos depen-diendo de las reacciones químicas producidas a medida que difunde y de laexistencia de vasos sanguíneos cercanos, que contienen hemoglobina que “se-cuestraría” al NO.

Teniendo en cuenta la difusibilidad del NO, uno podría preguntarse cómo esposible que su acción sea específica y localizada. En respuesta a esta interro-gante es lógico proponer que la especificidad y la localización de los efectos delNO, estarían determinadas por la naturaleza y la distribución de sus moléculasreceptoras, situadas en los elementos neurales incluidos en su espacio de difu-sión. La difusión a distancia del NO y la distribución diferencial de sus moléculasreceptoras ofrece perspectivas novedosas de integración e interacción en losniveles 1) espacial y 2) temporal de los circuitos y redes neuronales centrales


(Snyder, 1992). 1) Estos aspectos vinculados a la integración espacial se ilustranen un ejemplo en la figura 13 y se considerarán más adelante. En esta figura seilustran los resultados de experimentos que sugieren que el NO afecta neuronasque aunque se encuentran cercanas carecen de contacto anatómico entre sí. 2)En cuanto a los aspectos temporales en la función del NO deben considerarse:el tiempo de contacto del NO con los elementos sinápticos y el tiempo deacción del NO en sus células blanco. Es posible que el NO se mantenga mástiempo en contacto con los elementos neurales que un neurotransmisor clásicoporque: a) no es removido activamente del espacio sináptico y b) la vida mediadel NO en los sistemas biológicos (6 a 8 segundos en solución buffer pH 7.4equilibrada con O2 95% y CO2 5%; Gryglewski et al. 1986), es relativamenteprolongada, sobre todo si se compara con la duración de la corriente sinápticamediada por receptores ionotrópicos que es del orden de las décimas de milise-gundos. El cese de las acciones del NO en sus células blanco estaría determina-do, entre otras cosas, por: a) la velocidad con la cual disminuye la concentraciónde NO en el espacio sináptico por difusión desde su sitio de síntesis y por com-binación con grupos químicos afines (por ejemplo la oxihemoglobina circulante),b) la velocidad de degradación del GMPc intracelular por las fosfodiesterasas, yc) la velocidad de desfosforilación de proteínas por fosfatasas (Sanders & Ward,1992).

5. Un receptor biológico esencial del NO: la guanilatociclasa soluble

El receptor biológico para el NO más estudiado es la guanilato ciclasa solu-ble citoplasmática. En el SNC, esta enzima presenta una distribución diferencial,siendo relativamente abundante en los núcleos estriado y accumbens, la sustan-cia negra (Hoffman et al. 1977), la neocorteza y el cerebelo (Ariano et al.1982), el bulbo olfatorio y algunas zonas del tronco encefálico (Furuyama et al.1993). En general, el elemento neural que produce NO se encuentra en lascercanías del elemento neural que posee la guanilatociclasa soluble. En este sen-tido, existe una complementariedad anatómica de estos elementos (Schmidt etal. 1992; Young et al. 1993). En algunos casos, como en las neuronas de nú-cleos colinérgicos del tronco, la maquinaria biosintética del NO se colocalizacon su receptor biológico, la guanilato ciclasa soluble, de tal forma de que existe


la posibilidad de que el NO ejerza una acción moduladora sobre la propia neu-rona que lo sintetiza.

La activación de la guanilatociclasa soluble por el NO, causa un aumento dela concentración intracelular de GMPc a partir de GTP (Schmidt et al., 1993).Se desencadena así una cascada de reacciones de activación o inactivación dedeterminadas enzimas por fosforilación. La figura 5 esquematiza dichas reaccio-nes. Se han descrito 3 ligandos específicos para el GMPc con importancia neu-robiológica: a) la proteinquinasa GMPc-dependiente, a la cual activa (Wang &Robinson, 1997); b) las fosfodiesterasas activadas o inhibidas por el GMPc y c)canales iónicos de la membrana plasmática regulados directamente por el GMPc(Vincent, 1994). El clásico ejemplo de lo que ocurre en la retina es muy ilustra-tivo de esta regulación directa de canales iónicos. En la membrana de los basto-nes retinianos existen canales de sodio activados por GMPc que participan en elproceso de fototransducción (Fesenko et al. 1985). La activación de la rodop-sina por la luz activa indirectamente la fosfodiesterasa que hidroliza al GMPc, loque determina una disminución de la concentración intracelular del nucleótido.Como consecuencia de esto se produce el cierre de los canales de sodio, oca-sionando la hiperpolarización del bastón retiniano. Opuestamente, durante laoscuridad se inactiva la fosfodiesterasa lo que resulta en un aumento del GMPcintracelular con la consiguiente apertura de los canales de sodio y la depolariza-ción del fotorreceptor (Stryer, 1986).

Con herramientas farmacológicas es posible actuar en diversos niveles delmecanismo de acción celular del NO. La administración de NO a preparadosbiológicos es dificultosa, por eso se utilizan dadores de NO: sustancias que aldiluirse en soluciones fisiológicas se descomponen liberando al NO del resto dela molécula. La acción de dadores de NO puede modificarse aplicando sustan-cias inhibidoras o activadoras de la cascada del GMPc. Así, se han sintetizadomoléculas que inhiben en forma específica la guanilatociclasa soluble bloquean-do la acción del NO, como por ejemplo el ODQ (1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-alquinoxalin-1-one), (Wu and Dun, 1996). Mientras tanto, análogos membrana-permeante del GMPc como el 8-Br-GMPc imitarán las acciones del gas (Pine-da et al. 1996). Más adelante veremos cómo estos conocimientos básicos sehan aplicado exitosamente en el área médica en casos de disfunción de la erec-ción peneana a través del uso del sildenafil, un bloqueante de la fosfodiesterasaV (ver 8.1.).


Figura 5. Acción celular del NO mediada por el GMPc.El esquema ilustra algunos de los mecanismos posibles, de acción celulardel NO. En este caso a través de la vía guanilato ciclasa / GMPc. De estamanera puede activar a la guanilato ciclasa soluble que cataliza la formaciónde GMPc a partir de GTP. El GMPc podría unirse a distintos ligandos(como lo indican las flechas del esquema): activar fosfodiesterasas, activarla proteínquinasa dependiente de GMPc o modular la apertura de canalesiónicos; lo que le permitiría actuar mediante diferentes mecanismoscelulares.GMPc, monofosfato cíclico de guanina; GTP, trifosfato de guanina; PK-GMPc dependiente, proteínquinasa dependiente de GMPc.

6. Blancos celulares de la acción del NO: reactividad del NO condistintos compuestos

Las acciones biológicas del NO están determinadas por su combinación conmoléculas blanco ubicadas dentro de las células, en sus membranas y/o en elmedio extracelular. Cabe preguntarse entonces con qué compuestos es capazde combinarse el NO, cuáles son sus blancos celulares, cuáles de estas reaccio-nes químicas tienen consecuencias fisiológicas y cuáles patológicas. En la figura


6 se muestra un listado de los posibles blancos moleculares del NO. Es relevan-te que muchos de los compuestos con los cuales se combina este mensajero,tengan acciones en la regulación de funciones celulares. La capacidad del NOde reaccionar con diversas moléculas, le confiere la posibilidad de participar enuna gran variedad de procesos biológicos. A continuación haremos referencia aalgunas de estas moléculas.

6.1. Hemoproteínas. En términos de su actividad biológica, una propiedadquímica destacable del NO es su capacidad de reaccionar rápidamente y enforma reversible, con el Fe++ de grupos prostéticos hemo de distintas metalo-proteínas (Radi, 1996a). Este es el mecanismo de activación de la guanilatoci-clasa citosólica (Arnold, 1977; Miki, 1977). El NO también reacciona con losgrupos hemo de la oxihemoglobina y mioglobina aunque de manera irreversible.(Kelm & Schrader, 1990; Butler et al. 1995). Estas sustancias se utilizan co-múnmente como “secuestradores” de NO (Gillespie & Sheng, 1989). Ya hemosmencionado la capacidad del NO de unirse al grupo hemo de la NOS inhibien-do su actividad en condiciones experimentales (ver 3.) (Rogers & Ignarro, 1992;Mayer et al. 1994).

6.2. Grupos ferrosulfuros. El NO tiene alta afinidad con grupos ferrosulfuros(Fe-S, formando Fe-S-NO en forma irreversible), entre ellos los pertenecientesa enzimas mitocondriales a las que inhibe (Radi et al. 1994; Cassina and Radi,1996); este es el mecanismo subyacente propuesto para el efecto citotóxico delNO sobre células tumorales. De manera similar, es un inhibidor de varias oxida-sas y oxigenasas y del citocromo C (Butler et al. 1995). Este mismo tipo deactividad química con ferrosulfuros regularía la proliferación celular, causandoefecto citostático en células tumorales al actuar sobre la síntesis de ADN a tra-vés de la inhibición de la ribonucleótido reductasa (Butler et al. 1995; Gross andWolin, 1995).

6.3. Nitrosilación de proteínas. El NO tiene la potencialidad de reaccionarcon grupos tioles de moléculas proteicas de diferentes funciones, tales comoreceptores para neurotransmisores y/o enzimas (Stamler et al. 1992; Montagueet al. 1994). Por ejemplo, la nitrosilación de grupos tioles de las moléculas queconforman el canal del receptor NMDA (N-metil-D-aspartato), desensibilizaneste receptor sináptico lo que provoca la pérdida de la respuesta a sus agonistas


(Lei et al. 1992). Más adelante se comentará la importancia funcional de estareacción (ver 9.4. y la figura 12).

La presencia de grupos tioles, en la estructura de factores de transcripción,explicaría la capacidad del NO de modular la expresión génica directamente,además de por la vía del GMPc (Gross & Wolin, 1995).

6.4. ADP - ribosilación. El NO es capaz de activar la ADP-ribosilación deproteínas solubles usando como cofactor al NADPH. Esta activación es inde-pendiente de la guanilatociclasa ya que ni el dibutiril ni el 8-Br-GMPc (análogosdel GMPc que permean las membranas biológicas) han sido efectivos para ac-tivar la ADP ribosilación (Brüne & Lapetina, 1989; Brüne et al. 1994). Lagliceraldehido-3P-deshidrogenasa sería el principal blanco de ADP-ribosilacióninducida por el dador de NO, nitroprusiato de sodio (Kots et al., 1992). A nivelneuronal esta reacción es neurotóxica en preparados in vitro, por mecanismosque involucrarían una reducción de los depósitos energéticos de la célula (Daw-son & Dawson, 1995a).

6.5. Anión superóxido. El NO reacciona con el anión superóxido formandoperoxinitrito. Se ha demostrado que el peroxinitrito puede descomponerse enradicales libres tóxicos y en dióxido de nitrógeno (Alvarez et al. 1995; Radi,1996b; Denicola et al. 1995; 1996). La enzima superóxido dismutasa (SOD) alconvertir el anión superóxido a peróxido de hidrógeno prolonga la vida mediadel NO en sistemas biológicos (Gryglewski et al. 1986, Mügge et al. 1991); loque es utilizado como recurso experimental (Bredt & Snyder, 1989).

7. Inmunohistoquímica y localización de neuronas nitrigénicas en elsistema nervioso

En la actualidad es posible detectar indirectamente la presencia de la NOSen neuronas, manteniendo la estructura del tejido relativamente preservada: 1)El desarrollo de anticuerpos específicos contra la NOS neuronal purificada (Bredtet al. 1990), ha permitido detectar NOS por métodos inmunohistoquímicos ylocalizar así centros y vías nitrinérgicas (Vincent, 1995). 2) Además de las técni-cas inmunohistoquímicas de reconocimiento de la NOS, existe otra, en principio


Figura 6. Potenciales blancos moleculares del NO.La capacidad del NO de reaccionar con diversos tipos de moléculas, leconfiere la posibilidad de participar en gran variedad de procesos biológicos.Teniendo en cuenta que el número de blancos celulares descritos para laacción del NO se encuentra en aumento contínuo, aquí resumimos algunosde los compuestos cuya combinación con el NO puede resultar en efectoscelulares fisiológicos y/o patológicos.GAPHD, Gliceraldehído–3 fosfato deshidrogenasa; ONOO-, Peroxinitrito.(Modificado de Dawson & Dawson, 1995b).

menos específica, que consiste en determinar por métodos histoquímicos la ac-tividad de la NADPH-diaforasa relacionada con la NOS.

La reacción histoquímica de la NADPH-diaforasa neuronal (Hope et al.1991) y la utilización de anticuerpos contra la NOS, permitieron la localizaciónde la enzima en varias regiones del SNC (Förstermann et al. 1990) y periférico(Bredt et al. 1990; 1991; Burnett et al. 1992). Existe una buena coincidenciaentre la distribución de las neuronas marcadas con anticuerpos contra la NOS y


la de las neuronas marcadas con NADPH-diaforasa (Bredt et al. 1991; Daw-son et al. 1991).

En el SNC se han encontrado poblaciones de neuronas nitrinérgicas en elcerebelo, el bulbo olfatorio accesorio y en el tegmento pedúnculo-pontino. Aun-que en menor cantidad, también se observan en el hipotálamo, núcleo estriado,hipocampo y bulbo raquídeo (Förstermann et al. 1990; Vincent, 1994). En éste,las neuronas nitrinérgicas se disponen en la formación reticular organizándose engrupos columnares discretos y bien definidos (grupos medial y lateral) que en-vían proyecciones a los núcleos motores del tronco cerebral (Fig. 7) y de lamédula espinal. Recientemente se ha descrito en el bulbo raquídeo un grupo deneuronas nitrinérgicas a lo largo del núcleo del tracto solitario, en el área postre-ma y en los núcleos motor dorsal del vago, ambiguo, giganto cellularis y para-gigantocelularis (Laurense, 1997). En la médula espinal, la sustancia gelatinosaasí como también neuronas que rodean el epéndimo se marcan con la técnica deNADPH diaforasa (Dawson & Dawson, 1996). En el tálamo y la corteza visualde roedores también se han detectado neuronas que contienen NOS (Williamset al. 1997).

En el sistema nervioso periférico, la NOS fue localizada en neuronas nitrinér-gicas del plexo mientérico del tracto gastrointestinal (Bredt et al. 1990) así comoen fibras nerviosas que rodean la capa adventicia de las arterias del cerebro ydel pene (Bredt et al. 1991; Burnett et al. 1992). También existen células gan-glionares y fibras NADPH diaforasa positivas en la médula adrenal (Dawson &Dawson, 1996).

La NOS puede colocalizarse con otros neurotransmisores. La NOS es co-expresada en neuronas inmunorreactivas para el péptido intestinal vasoactivo(VIP) en el plexo entérico (Costa et al. 1991) y en nervios perivasculares (Vin-cent, 1995). En el SNA existen evidencias de cotransmisión nitrinérgica - VI-Pérgica (Costa et al. 1991; Stark, 1991) y nitrinérgica - purinérgica (Boeckxs-taens et al. 1993). También hay evidencias de cotransmisión de VIP y NO ennervios de arterias del cerebro y en neuronas oculares (Bredt & Snyder, 1992)y de cotransmisión nitrinérgica-purinérgica inhibitoria para producir relajacióndel músculo liso de: la capa circular del colon humano (Boekxstaens et al. 1993),de la vena porta del conejo y del íleo terminal y unión íleo-colónica del perro(Rand & Li, 1995b).

En SNC la NOS se colocaliza con aminas, GABA y glutamato (Vincent,1995); en el estriado con somatostatina y neuropeptido Y (Bredt & Snyder,


1992) y las neuronas del tegmento dorsolateral y del núcleo parabraquial delpuente son neuronas nitrinérgicas-colinérgicas. Existen evidencias de cotransmi-sión de NO en el SNC con somastostatina y neuropéptido Y en el estriado(Bredt & Snyder, 1992), lo que coincide con los datos de colocalización yamencionados.

8. El NO en el Sistema Nervioso Autónomo

8.1. Transmisión neuroefectora mediada por NO

Es a nivel del sistema nervioso autónomo (SNA) donde se ha obtenido elmayor número de evidencias con respecto a la función del NO como neuro-transmisor. Los conceptos extraídos de estudios realizados en el sistema nervio-so periférico generalmente se extrapolan al SNC, aunque como se verá, en estaextrapolación se debe ser cuidadoso. Por ejemplo, en los efectores del sistemanervioso periférico, el NO cumple un papel principalmente inhibitorio, en cam-bio algunas neuronas del SNC son excitadas y otras inhibidas por este mensaje-ro.

Durante años, cuando la respuesta de un efector a la estimulación eléctrica defibras del SNA no se abolía con bloqueantes adrenérgicos o colinérgicos, dicharespuesta era atribuida a la acción de un neurotransmisor no-adrenérgico-no-colinérgico de identidad desconocida (neurotransmisión NANC). Se admiteactualmente que el NO es uno de los neurotransmisores NANC inhibitorio ycomo tal media la relajación del músculo liso del intestino (Bult et al. 1990), delestómago y de los esfínteres del tracto digestivo (Desai et al. 1991). El registroreproducido en la figura 8, muestra la acción del NO sobre la contractilidad delmúsculo liso en la unión íleo-colónica del perro. En este experimento la estimu-lación de fibras nerviosas del plexo mientérico genera una relajación muscular,debida muy probablemente, a la liberación de NO (ver leyenda de la figura 8).Estudios electrofisiológicos han mostrado que la relajación del músculo liso deltracto gastrointestinal inducida por la estimulación eléctrica de fibras NANC esprecedida de una hiperpolarización y que el NO y los dadores del NO producenuna hiperpolarización similar (Sanders & Ward, 1992; Vincent, 1995; Bult et al.1990; Boeckxstaens et al. 1991; Chakder & Rattan, 1993). El estudio de lasbases iónicas de dicha hiperpolarización, sugiere que ésta se debe a un aumento


A

B


transitorio de la conductancia al K+ (Tomita, 1972). En concordancia con ésto,registros de canales iónicos únicos realizados en parches de membrana de mio-citos colónicos bajo fijación de voltaje, mostraron aumento en la probabilidadde apertura de canales de K+ activados por el Ca++ (Thornbury et al. 1991).

El NO tiene un papel fisiológico fundamental en la erección peneana y loseventos hemodinámicos determinados por la relajación del músculo liso del teji-do eréctil (cuerpos cavernosos y cuerpo esponjoso). Por años se sostuvo que elsistema parasimpático-colinérgico era el único sistema fisiológico que participa-ba en la erección peneana. Sin embargo, existían hechos contradictorios no ex-plicados. Por ejemplo, la inyección intracavernosa de atropina, en humanos, nobloquea completamente la erección peneana (Brindley, 1986). Otros estudiosfarmacológicos, en tiras aisladas de cuerpos cavernosos de hombres con impo-tencia, demostraron que el bloqueo colinérgico con atropina disminuye pero noabole la relajación del músculo liso del tejido eréctil inducida por estimulacióneléctrica. Estas observaciones indicaron la participación de neurotransmisoresno colinérgicos en la fisiología de la erección (Saenz de Tejada et al. 1988).Además, en el mismo preparado, la aplicación de ACh determinó relajaciónmuscular sólo cuando el endotelio vascular del cuerpo cavernoso se mantuvoindemne, en forma similar a lo observado en otros tejidos (Fig. 1). Toda estaevidencia alentó la hipótesis de que el NO participaría también en la generaciónde los eventos hemodinámicos vinculados a la erección. Durante la erecciónpeneana, la deformación mecánica de las células endoteliales del tejido eréctil,subsecuente al aumento del flujo sanguíneo producido por la dilatación de lasarteriolas helicinas, determina liberación de NO desde estas células. Observa-ciones recientes indican que además existe una relajación de las células muscu-

Figura 7. Ejemplos de fibras nitrinérgicas del tronco encefálico.A) Inervación de motoneuronas. Microfotografía en la que la actividad para la NADPHdiaforasa se evidencia con la reacción del azul de tetrazolio. Las motoneuronas fueroncontrateñidas empleando la técnica de Nissl. En la vecindad del cuerpo de una neuronadel núcleo motor del trigémino se observan procesos, que posiblemente corresponden afibras nitrinérgicas que inervan estas motoneuronas. Obsérvese la íntima cercanía deestos procesos y esta célula (flecha).B) Inervación de neuronas sensoriales. En esta microfotografía las mismas técnicas detinción empleadas en A), permiten identificar claramente la presencia de un proceso, queposiblemente corresponda a una terminación dendrítica nitrinérgica inervando a unacélula del núcleo sensorial mesencefálico del V par.


lares lisas causada por el NO liberado desde neuronas no-colinérgicas-no-adre-nérgicas.

Independientemente de cual de las tres secuencias origine la liberación deNO, la liberación de ACh, la deformación mecánica del endotelio o su libera-ción directamente desde neuronas NANC, es claro que esta molécula, es unfactor importante en la modulación del tono del músculo liso del cuerpo caver-noso (Lerner et al. 1993). En las células musculares lisas del cuerpo cavernosoel NO actúa a través de la activación de la guanilatociclasa soluble provocandoel consiguiente aumento de la concentración de GMPc intracelular. Si uno impi-diera la catabolización del GMPc así formado, inhibiendo farmacológicamentepor ejemplo la fosfodiesterasa V las acciones del NO se prolongarían en eltiempo. Esto es efectivamente la base científica de la utilización del sildenafil, uninhibidor reversible de la fosfodiesterasa V, en el tratamiento por vía oral de ladisfunción eréctil (Boolell et al.1996; Ballard, 1998).

8.2. ¿Es el NO el único neurotransmisor nitrinérgico?

Aunque la transmisión nitrinérgica es inicialmente generada por la activaciónde la NOS, algunas evidencias experimentales originaron dudas respecto a si elNO es en todos los casos el neurotransmisor nitrinérgico. Por ejemplo, en de-terminados preparados biológicos donde el NO imita la respuesta a la estimula-ción de fibras nitrinérgicas, los efectos generados por la administración de NOfueron bloqueados por distintas drogas (hidroxicobalamina, LY-83583, hidro-quinona), que, sin embargo, no bloquearon la respuesta obtenida por la estimu-lación de fibras nitrinérgicas (Gillespie & Sheng, 1990; Hobbs et al. 1991; Li &Rand, 1993; Barbier & Lefebvre, 1992). Esto hace pensar que el mensajeroliberado por las fibras nerviosas es algún compuesto con acción similar al NO,pero no él mismo. Por otra parte, en el músculo anococcígeo de la rata, la rela-jación inducida por la estimulación de fibras NANC es inhibida por la adminis-tración de hemoglobina y no por la administración de una suspensión de eritro-citos con una cantidad de hemoglobina equivalente. Esto indicaría que el neuro-transmisor nitrinérgico liberado por las fibras NANC no permea la membranaeritrocítica y por tanto no podría ser el NO (Gillespie & Sheng, 1989).

Así, para algunos investigadores el término nitrinérgico describe un modo detransmisión que involucra al NO y por extensión los nervios desde los que seorigina, pero dicho término no indicaría la naturaleza química exacta del neuro-


Figura 8. La acetilcolina y laestimulación nerviosa provo-can relajación de la uniónileocolónica, actuando a travésde la liberación de NO.

En los trazados se muestra eldesarrollo de tensión provoca-do por la administración denoradrenalina (NOR), a un pre-parado aislado de uniónileocolónica de perro.A) Cada triángulo sobre el tra-zado indica el inicio de un de-terminado estímulo. Los cua-tro primeros corresponden aestimulación eléctrica (E) defibras nerviosas a intensida-des crecientes de izquierda aderecha. Note que a mayor in-tensidad de estimulación seobtiene mayor relajación mus-cular. El quinto triángulo co-rresponde a la administraciónde acetilcolina (Ach), el sextoa la de NO y el séptimo a la de un dador de NO, nitroglicerina (NTG). Todas estas sustanciasprovocaron relajación muscular, tal como lo hizo la estimulación de las fibras nerviosas.B) Se realizaron las mismas maniobras experimentales que en A), pero el preparado fueincubado previamente con un inhibidor competitivo de la NOS (L-NNA). En estas condi-ciones la estimulación nerviosa no produjo la relajación del músculo contraído. El efecto dela Ach también fue bloqueado mientras que las acciones directas del NO y la nitroglicerinase mantuvieron. Esto indica que tanto la estimulación nerviosa, como la Ach necesitan dela síntesis de NO para causar sus efectos. Nótese además, que la noradrenalina causó unaumento de la tensión mayor que en A), lo que sugiere la existencia de producción basal deNO. L – NNA: NG – Nitro – L – arginina. (Modificado de Sanders & Ward, 1992).

transmisor involucrado, a diferencia de los términos colinérgico o adrenérgicoplanteados por Dale. Rand & Li (1995a), utilizan el término nitromimético parareferirse a aquellas sustancias que imitan la respuesta a la estimulación de fibrasnitrinérgicas y consideran dichas sustancias como potenciales candidatos a trans-misor nitrinérgico siempre y cuando se sinteticen en el organismo. Los nitroso-


tioles (formados de la unión de grupos tioles con NO) y en particular la nitrocis-teína, seguirían al NO en la lista de candidatos a transmisor nitrinérgico, ya quealgunos de ellos se sintetizan en el organismo y reproducen los efectos de laestimulación nitrinérgica.

Por lo tanto, si bien la mayoría de las evidencias experimentales indican queel NO es el neurotransmisor nitrinérgico, algunos hallazgos cuestionan que esteconcepto sea de aplicación universal (Rand & Li, 1995b). Esta salvedad seincluye en este artículo pues debe entenderse que el trabajo experimental y teó-rico en este campo es muy intenso y siempre cabe la posibilidad de que nuevoshallazgos impacten radicalmente en las nociones actuales de la función de latransmisión nitrinérgica.

8.3. Resumen de los procesos que ocurren durantela transmisión nitrinérgica en el SNA

Sanders & Ward (1992), describen los procesos que ocurrirían durante latransmisión nitrinérgica en el SNA, de la siguiente forma: El influjo de Ca++ a laterminal presináptica que ocurre durante la llegada del potencial de acción, acti-va la NOS a través de la calmodulina. El NO sintetizado en la terminal sinápticadifunde hacia el espacio extracelular y las células efectoras. En ellas se activaríala guanilatociclasa soluble, determinando un incremento del GMPc citosólicoque media sus efectos biológicos, entre ellos la apertura de canales de K+, Ca++-dependientes (Vincent, 1995). En el músculo liso, el incremento del GMPc in-tracelular, activaría proteínquinasas determinando la fosforilación de proteínas,que influyen en la relajación a través de un aumento de la extrusión o secuestrode Ca++ -por ejemplo, fosforilando bombas para este ión- (Murphy, 1993).

9. El NO en el SNC

A partir del descubrimiento de neuronas capaces de sintetizar NO en el SNC,el estudio del NO como mensajero neuronal ha despertado gran interés. Dife-rentes sistemas neuronales específicos utilizarían al NO como neurotransmisor.El papel del NO en cada uno de ellos dependerá de la función del sistema encuestión. Las siguientes son algunas de las evidencias experimentales acerca dela función del NO en el SNC.


9.1. El NO en funciones motoras

En el sistema óculomotor, la inhibición unilateral de la NOS en el núcleoprepósito hipogloso, que interviene en el control de los movimientos oculares,resulta en un severo nistagmus contralateral (Moreno-López et al. 1996). Elaumento local de NO o GMPc produce nistagmus ipsilateral. Esto indica que unsistema nitrinérgico estaría involucrado en el control de los movimientos ocula-res.

Nosotros hemos encontrado evidencias morfológicas de la existencia de fi-bras nitrinérgicas que inervan los núcleos motores del tronco cerebral (Fig. 7).En el núcleo motor del trigémino, la presencia de estas fibras sugiere una trans-misión directa entre terminales presinápticas nitrinérgicas y motoneuronas post-sinápticas, en las cuales no se detecta la presencia de NOS. A partir de estaevidencia morfológica, surgió la interrogante de si el NO actuaría a ese nivelcomo neurotransmisor anterógrado y desarrollamos el estudio in vitro, de laspropiedades eléctricas de las motoneuronas trigeminales luego de la administra-ción de distintos dadores de NO. En estas células hemos encontrado que el NOdetermina un aumento de la excitabilidad de las mismas (figura 9) (Abudara etal. 1998). Estos datos son trascendentes, además, porque indican que el NOtiene un efecto excitador en la postsinápsis al contrario de lo que en generalsucede en el sistema nervioso periférico.

9.2. El NO en la regulación de las propiedades intrínsecas neuronales

Además de los datos relatados anteriormente, existen también evidencias deefectos nitrinérgicos postsinápticos excitatorios en neuronas del locus coeru-leus. Estas células presentan descargas automáticas rítmicas incluso in vitro. Laaplicación de dadores de NO produjo un aumento de su frecuencia de descarga(Fig. 10), asociada al desarrollo de una corriente de tipo Ih (Pineda et al. 1996).Estos resultados son importantes ya que indican el mecanismo subyacente a esarespuesta excitatoria.

En el ganglio nodoso aislado de la rata, mediante registro intracelular, se ob-servó que el dador de oxido nítrico, dietilentriamina-NO (DETA – NO), causódepolarización dosis dependiente de sus neuronas; dicha depolarización fue blo-queada con inhibidores de la guanilato ciclasa soluble (Laurence, 1997).


Los experimentos desarrollados en rodajas de médula espinal de rata me-diante registro extracelular por Schmid & Pehl (1996) se consideran de interés.Sus resultados muestran que el dador de NO, nitroprusiato de sodio, puedeocasionar un aumento o una disminución de la actividad eléctrica de las neuronasespinales según la ubicación de las mismas (lámina X y láminas I+II, respectiva-mente). Tanto los efectos excitatorios como inhibitorios, fueron dosis depen-diente, reversibles y reproducibles con la aplicación de otros dadores de NO ocon un análogo del GMPc (8Br-GMPc). Estos resultados muestran claramentecómo el NO en células diferentes, puede desencadenar mediante el uso de unamisma señal de transducción, efectos diferentes y hasta opuestos.

9.3. Los sistemas nitrinérgicos y el sueño paradójico

Las células colinérgicas del tegmento laterodorsal y del núcleo pedúnculopontino de la protuberancia, están involucradas en la generación y el manteni-miento del sueño paradójico. Estas células colocalizan NOS, con lo cual se haplanteado que produzcan y liberen NO durante esta etapa del sueño y que inter-vengan en la generación de este estado. En efecto, la inhibición de la síntesis deNO disminuye la duración del sueño paradójico (Leonard & Lydic, 1997) (figu-ra 11). Por otro lado la administración de sustancias dadoras de NO en la regiónprovoca un aumento del sueño lento y del sueño paradójico (Datta et al. 1996).

9.4. Acciones del NO en la función sináptica

El descubrimiento del NO como mensajero intercelular, generó nuevos con-ceptos respecto a cómo puede inducirse la plasticidad sináptica en el sistemanervioso (Hölscher, 1997).

Existen evidencias experimentales de que el NO puede modificar la sensibi-lidad de los receptores postsinápticos a un determinado neurotransmisor. Porejemplo en experimentos in vitro como el ilustrado en la figura 12, la adminis-tración de un dador de NO, provocó una disminución de la respuesta postsináp-tica al glutamato en neuronas mesopontinas (Leonard et al. 1995). Esto se de-bería a la nitrosilación de grupos tioles de las moléculas que conforman el canaldel receptor NMDA (Lei et al. 1992). En la misma sinapsis el NO determinauna disminución de la liberación de neurotransmisor que se evidencia por unadisminución en la probabilidad de ocurrencia de potenciales postsinápticos exci-


tatorios únicos grandes. La función del NO en este caso sería la inhibición deuna sinapsis excitatoria glutamatérgica (figura 12).

Actualmente se considera que el NO puede estar involucrado en procesosde plasticidad sináptica tales como la potenciación y la depresión duradera (LTPy LTD respectivamente) (Bohme et al. 1991; Schibuki & Okada, 1991). Lapotenciación duradera consiste en un aumento prolongado en la eficacia sinápti-ca que se produce luego de un estímulo de alta frecuencia (estimulación tetánica)en la vía presináptica. Esta potenciación puede durar horas in vitro, o inclusodías o semanas en el animal entero (Kandel et al. 1991). La LTP se ha estudia-

Figura 9. Efectos excitatorios del NO en motoneuronas trigeminales.Registros intracelulares de una motoneurona del núcleo motor del trigémino,en “rodajas” de tronco encefálico de cobayo. Se registra la respuesta de laneurona, a la aplicación de un pulso cuadrado de 3 nA de intensidad y 100ms de duración, en tres situaciones diferentes: control, al administrar undador de NO (SPER/NO) y al lavar dicho dador del preparado. Laadministración del dador de NO provoca depolarización de la neurona,descenso de la reobase y un aumento del número de espigas disparadasdurante el pulso de estimulación. El efecto excitatorio del dador reviertetotalmente con el lavado.SPER/NO, Spermine/NO complex. (Modificado de Abudara et al. 1998).


Figura 10. Efectos excitatorios del NO en neuronas del locus coeruleus.Se muestran las modificaciones de la frecuencia de la descarga en neuronasdel Locus coeruleus frente a la administración de distintas drogas. En cadatrazado el eje de las ordenadas representa el número de descargas registradasen 10 segundos.A) El dador de NO, DEA-NO, provocó el aumento de la frecuencia de ladescarga de neuronas.B) El análogo membrana-permeante del GMPc, 8-Br-GMPc, imitó el efecto delos dadores de NO y además ocluyó el efecto de otro dador, nitroprusiato deNa (SNP), lo que indica que la acción del NO se desarrolla, en este caso, porla vía del GMPc.C) El aumento de la frecuencia de la descarga causado por el SNP es revertidoante la aplicación de un “secuestrador” de NO, la hemoglobina (Hb).DEA-NO, Dietilamina/NO complex Na. (Modificado de Pineda et al. 1996).


Figura 11. Disminución del sueño paradójico luego de la administración deun inhibidor de la síntesis de NO.A) El esquema representa el diseño experimental con el cual se obtuvieronlos resultados graficados en B). Se utilizaron gatos implantados, noanestesiados y entrenados para dormir con la cabeza en posición fija. Serealizó el registro poligráfico de los distintos estadíos del ciclo sueño-vigilia.La administración de drogas se efectuó por microinyección, en la formaciónreticular mesopontina mientras el animal se encontraba en vigilia tranquila.B) La inyección de un bloqueante competitivo de la NOS (L-NNA) a nivel dela formación reticular mesopontina disminuyó en un 70 % el porcentaje desueño paradójico, con respecto al animal no tratado.L – NNA, NG – Nitro – L – arginina. (Modificado de Leonard & Lydic, 1997).


Figura 12. El NO modifica una sinapsisglutamatérgica actuando a nivel de laliberación presináptica y a nivel del re-ceptor postsináptico para el glutamato.A) Esquema del dispositivo experimen-tal para estudiar los efectos sinápticosdel NO en neuronas mesopontinas. Noteel electrodo de estimulación en la fibrapresináptica, el electrodo de registro enel elemento postsináptico y la micropi-peta para inyectar distintas sustancias.Los registros indican la depolarizaciónde la célula postsináptica producida porglutamato, en ausencia y presencia deNO.B) Acción del NO sobre la depolariza-ción postsináptica inducida por elNMDA. Note que en presencia de undador de NO (SNP), la magnitud de larespuesta postsináptica disminuye sig-nificativamente. Este efecto es postsi-náptico, dada la presencia de tetrodo-toxina (TTX) durante el experimento.C) Potenciales postsinápticos excitato-rios unitarios producidos por la estimu-lación de fibras presinápticas, en condi-ciones control y luego de administrar undador de NO (DEA – NO). El NO dismi-nuye la probabilidad de que existan po-tenciales únicos grandes, aunque semantiene el mismo rango de amplitud que

en el control; esto sugiere que el NO determinaría una disminución en la liberación deneurotransmisor por parte del elemento presináptico.NMDA, N-metil-D-aspartato; SNP, Nitroprusiato de Na; DEA-NO, Dietilamina/NO com-plex Na; CNQX, 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3 dione. (Modificado de Leonard et al. 1995).

Figura 13. Evidencias de que el NO actúa a distancia y que, como neurotransmisor retró-grado (de postsinápsis a presinápsis), participa en la potenciación duradera (LTP) en elhipocampo.A) Esquema del dispositivo experimental. Las fibras presinápticas excitadoras que llegan alas neuronas 1 y 2 son representadas como un conjunto de líneas paralelas. El electrodo Ese utiliza para estimular estas fibras eléctricamente. Las células postsinápticas (1 y 2), son


AE

célula 1 célula 2

células piramidales de lacapa CA1 del hipocampoy en ellas se registró la res-puesta postsináptica (po-tenciales postsinápticosexcitatorios) mediantesendos electrodos intrace-lulares. Las células regis-tradas pueden estar cerca-nas o alejadas entre sí. Ob-servese que sólo la célula1 recibe un estímulo eléc-trico depolarizante y no lacélula 2.B) LTP en células pirami-dales. Se grafica la res-puesta postsináptica delas células 1 y 2, como por-centaje de la respuestapostsináptica basal decada célula en función deltiempo. Inicialmente (pri-meros 5-7 minutos) se apli-ca un estímulo en la presi-napsis cada 15 segundosobteniéndose un períodode respuesta postsinápti-ca basal, que en el gráficocorresponde al 100%. Laflecha indica el inicio si-multáneo de una estimu-lación tetánica presinápti-ca (1 Hz) concomitante-mente a una depolariza-ción directa de la célula 1pasando corriente por elelectrodo. Esto es necesa-rio para la inducción deuna potenciación durade-ra (LTP) tanto en la célula1, como en la célula 2, queno ha sido depolarizada di-rectamente. El hecho de


que para la instalación de LTP en la célula 1 se necesite su depolarización, señala la necesa-ria existencia de un mensajero retrógrado entre la célula 1 y la presinapsis. Por otra parte, elhecho de que la célula 2 presente LTP sin ser depolarizada directamente, señala la necesariaexistencia de un mensajero entre las células 1 y 2. Las células 1 y 2 son cercanas (distanciaentre los somas menor de 100 µm), como lo muestra, junto al gráfico, las neuronas marcadascon biocitina.C) En este caso las neuronas 1 y 2 no son vecinas (distancia entre los somas: aproximada-mente 500 µm) y la LTP no se observa en la célula 2 que no fue depolarizada directamente.De la comparación de los experimentos B) y C) se concluye que el mensajero entre 1 y 2puede actuar hasta una determinada distancia y no más allá de ella.D) La LTP fue abolida por la presencia de un inhibidor de la NOS: NG-metil-L-arginina (L-MNA), tanto en la célula 1 como en la célula 2. La abolición de la LTP en la célula 1 señalaal NO como el mensajero retrógrado entre esta neurona y la presinapsis. Por otra parte, laabolición de la LTP en la célula 2 señala al NO como el mensajero a distancia entre lascélulas 1 y 2. El NO sería el mensajero retrógrado y a distancia, determinante para la insta-lación de la LTP en estas sinapsis. (Modificado de Schuman & Madison, 1994).

do intensamente en el hipocampo, en la sinapsis establecida entre las fibras exci-tatorias de la región dendrítica del stratum radiatum y las neuronas piramidalesde la capa CA1. Allí, para que se produzca la LTP, además de la estimulacióntetánica presináptica, es necesaria la presencia de una depolarización postsináp-tica (Fig. 13). Como el aumento de la eficacia sináptica es un fenómeno funda-mentalmente presináptico, ya que involucra un aumento de la liberación de neu-rotransmisor, pero que en este caso requiere la activación postsináptica, se hapostulado la existencia de un mensajero retrógrado indispensable para trasladarinformación desde la postsinapsis a la presinapsis. Algunas evidencias experi-mentales señalan al NO como un mensajero que es capaz, además, de actuar adistancia de su sitio de liberación (Garthwaite et al. 1988; Schuman & Madison,1994). Cuando se administran inhibidores de la NOS a rodajas de hipocampo,subsecuentes intentos para inducir la LTP resultan bloqueados en forma argini-na-reversible (Böhme et al. 1991). La administración extracelular de hemoglo-bina que secuestra al NO, atenúa la LTP (Schuman & Madison, 1994) sugirien-do que el NO se desplaza entre las células. En la figura 13 se ilustran resultadosde experimentos que sugieren que el NO es el mensajero interneuronal retrógra-do que actuando a distancia estaría involucrado en la LTP (Schuman & Madi-son, 1994).


10. Conclusiones

En los últimos años el NO ha sido implicado en un amplio rango de funcionesneurales. El estudio de la localización de neuronas productoras de NO en elSNC ha mostrado una extensa distribución de la NOS, lo que indica que el NOpodría estar involucrado en muchos de los aspectos de la función del SNC. Esprobable, como lo muestran evidencias ya mencionadas (Schmid & Pehl, 1996),que las acciones del NO no sean similares o estereotipadas en diferentes tiposcelulares. En este artículo, hemos focalizado nuestra atención en los mecanismoscelulares, moleculares y en el significado del NO como mensajero neuronal.

El descubrimiento de que el NO funciona como una molécula mensajera en elsistema nervioso abre una nueva dimensión en nuestro concepto de la comuni-cación neural. A la neurotransmisión química clásica donde la información viajaunidireccionalmente, desde la pre a la postsinapsis, y por un espacio discreto (lahendidura sináptica); se le agrega la existencia de una señal (el NO), que debidoa sus propiedades físico-químicas, difunde sin respetar los límites espaciales quelas membranas celulares, los transportadores y las enzimas inactivadoras le im-ponen habitualmente a la actividad de un neurotransmisor clásico. En principio,el NO podría influenciar desde su sitio de síntesis diferentes elementos tisulares:neurales, gliales, vasculares, que no están necesariamente en íntima yuxtaposi-ción anatómica y que contienen la/s molécula/s receptora/s del gas.

El NO es una molécula pequeña relativamente estable que difunde hacia susblancos moleculares con los que reacciona. El NO ejerce acciones biológicasligándose a variados receptores, a través de un amplio rango de reaccionesquímicas y siendo su receptor más estudiado la guanilatociclasa soluble. Lasreacciones precisas que ocurran en un determinado “ambiente biológico”, de-penderán entonces de la concentración de NO alcanzada, así como, de las fre-cuentemente sutiles variaciones en la composición del medio intra y extracelular.

La capacidad del NO de transportar información en un determinado volu-men, podría brindarle al SNC la posibilidad de coordinar espacial y temporal-mente grupos neuronales involucrados en una misma función. Para que una señalque difunde espacialmente como el NO, tenga en su acción un significado bioló-gico, deben existir diferentes reglas o pautas que gobiernen la especificidad desu acción. Una de ellas sería la distribución y distancia de sus blancos molecula-res en torno al sitio de síntesis y liberación del NO.


El estado actual del conocimiento en este tema genera variadas interrogantesy desafíos. Algunos de ellos son: a) demostrar y determinar con mayor precisiónla función del NO, en las diferentes regiones del sistema nervioso donde actúa;b) profundizar en los mecanismos de transducción que utiliza esta señal biológicay c) investigar las implicancias fisiológicas que, para el sistema nervioso, puedetener la existencia de tan particular forma de neurotransmisión. Por otra partecabe destacar, la importancia creciente que en el área de la salud tiene, y conseguridad tendrá, la aplicación de estos conocimientos básicos que se encuen-tran en explosivo crecimiento y desarrollo.

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el Óxido nítrico como neurotransmisor y neuromodulador

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