El biofilm bacteriano y su tratamiento con extractos de Allium sativum

Lamana, Jesús M.

La publicación de un artículo científico conjunto de una Universidad americana y otra china en el J. Antimicrob. Chemoter, en Mayo de 2012 (1), sobre el efecto antimi-crobiano de un derivado del Allium sativum (ajo) sobre el biofilm de Campylobacter jejuni, me ha hecho darle vueltas a lo poco que se ha trabajado sobre las biopelículas bacterianas y resaltar las amplias posibili-dades de tratamiento antimicrobiano que tienen las moléculas azufradas del ajo.

En el citado trabajo se demuestra que los vegetales, especialmente el ajo spp., contienen moléculas, como el dialilsul-furo, que poseen un alto poder como agentes bactericidas y que son efectivas contra la mayor parte de los patógenos que causan toxiinfecciones alimentarias. En concreto el artículo se centra en el biofilm de Campylobacter jejuni, la mayor

toxiinfección alimentaria que afecta hoy a la población de la UE, por encima de la salmonelosis y transmitida fundamental-mente por la carne de pollo.

El dialilsulfuro es mucho más efectivo en la inactivación de las biopelículas bacte-rianas que la eritromicina y la ciprofloxaci-na por su capacidad de penetrar libremente en las capas de fosfolípidos de las paredes de las células bacterianas. El objetivo del estudio fue comparar sistemáticamente la efectividad de los componentes far-macológicos del ajo con los antibióticos normalmente usados para tratar la campi-lobacteriosis. Los resultados indicaron que el dialilsulfuro es 100 veces más efectivo para combatir el biofilm bacteriano que los antibióticos comerciales, alguno de ellos de última generación como la ciprofloxacina, utilizados para tal fin.

❱❱ Características de la Biopelícula bacteriana

Las bacterias en un medio natural pueden encontrarse también en dos estados:

• En forma libre o también denominada planctónica.

• En forma de biofilm.

La mayor parte de las bacterias están normalmente en forma de biofilm o biope-lículas, alrededor del 98%. Es sorprendente el poco estudio que se ha hecho sobre este tipo de presentación de las bacterias, tanto en medicina veterinaria como en humana. Casi todos los trabajos de microbiología y terapéutica se han enfocado hacia las bacterias de vida libre, posiblemente aquí se pueda encontrar el motivo de una gran

Jesús M. Lamana. Veterinario. jesusmlamana@gmail.com

El biofilm bacteriano y su tratamiento con extractos de Allium sativum

54

nº 43El biofilm bacteriano y su tratamiento con extractos de Allium sativum

parte de los fallos en los tratamientos anti-bióticos habituales.

Seguramente esta forma de organización de las bacterias sea parte de una estrategia evolutiva con objeto de burlar las defensas inmunológicas del huésped y a los antimicro-bianos. Hay que decir que desde luego han tenido éxito, ya que las bacterias y los microor-ganismos microscópicos que comparten con nosotros la tierra tienen aproximadamente unos 2000 millones de años más que los vertebrados. Las primeras formas de vida fueron este tipo de microorganismos por lo que tienen mucho que decir en la evolución de los seres vivos. Posiblemente parte de nuestro organismo, los componentes de nuestras células fueron microorganismos de vida libre hace millones de años, los cuales a lo largo de la evolución y por simbiosis, es decir con un beneficio para ellas y nosotros, se fundieron con nuestro organismo. Un ejemplo de este proce-so pueden haber sido las mitocondrias celulares. Esta teoría fue sostenida por la bióloga evolutiva Lynn Margulis (3) y hoy está bastante aceptada por la comunidad científica.

La forma de presentación en biofilm no es única para un microorganismo especí-fico, -además siempre hay en éstos varios géneros bacterianos-, va a depender de unas determinadas condiciones ambietales, por lo que una bacteria puede crecer en forma libre o en biofilm. El entorno ideal para que se forme la biopelícula es el ambiente líquido, las bacterias necesitan agua para crecer y para fijarse a una deter-minada superficie, esta unión al substrato es irreversible. El sustrato puede ser una materia inerte como una tubería de fon-tanería o la mucosa intestinal de un pollo.

❱❱ Definición de biofilm

Podemos definir el biofilm bacteriano como una:

• Comunidad bacteriana (no solo compuesta de un género).

• Adherida irreversiblemente a un substrato inerte o vivo.

• Encerrado en una matriz de políme-ros extracelulares y producidos por las mismas bacterias.

Los componentes de éste son: agua, como he citado antes, en un 98%, las propias bacterias, los materiales de su metabolismo y los sedimentos cálcicos o componentes sanguíneos en biofilms orgánicos. Los exopolisacáridos le per-

miten por su carga eléctrica interactuar con diferentes sustancias antibióticas y antimicrobianas para que no afecten a la vida y reproducción de las bacterias.

La forma de estos biofilms no es sólida, son acúmulos tridimensionales de colo-nias con bacterias aeróbicas y anaeróbicas. Dentro de esta arquitectura que al principio pareció compacta hay espacios huecos, canales de agua que permiten un flujo para la supervivencia interna de nutrien-tes y oxígeno así como la eliminación de residuos del metabolismo. Tanto la forma como la estructura de la biopelícula depen-den del sustrato al que se fijan.

❱❱ Etapas en la formación del biofilm

Hay tres etapas en la formación de la bio-película bacteriana:

• Adhesión al substrato.

• Crecimiento bacteriano y de la matriz exopolisacárida.

• Desprendimiento.

La adhesión bacteriana al sustrato puede ser de tipo reversible o irreversi-ble, en la fijación irreversible intervienen factores como el abundante suministro de nutrientes en superficies rugosas y con unas determinadas propiedades fisico-químicas de la superficie.

La formación de la matriz o crecimiento comienza con la división de las células hijas dando lugar a microcolonias, producción de exopolisacáridos y de esta manera ya tenemos formada la matriz del film bac-teriano.

El desprendimiento o separación del biofilm en el que se separan un conglo-merado de bacterias por erosión, abrasión o separación y posterior colonización de otras superficies, cerrando así el proceso de formación y desarrollo del biofilm.

Un ejemplo de biofilm inorgánico es el que se forma en los depósitos de agua en las granjas donde no se lavan y desinfectan regularmente, así como en la superficie interna de las cañerías de conducción de agua de bebida con base iones calcio y hierro.

Van Leeuwenhoek, descubridor del microscopio en el siglo XVII, ya com-probó la presencia de microorganismos microscópicos adheridos a la placa den-tal humana, un claro ejemplo de biofilm.

En los años 70 del siglo pasado Donlan, RM. (4) estudió estos biofilms en sistemas de aguas industriales logrando demostrar la resistencia a diferentes desinfectantes entre ellos el cloro. Costerton y cols. (5) describieron la presencia de bacterias de diversos géneros intrincados en una matriz glucoproteica unidos a superficies y en contacto con agua, demostrando que los biofilms podrían explicar los mecanismos por los que las bacterias se adhieren a todo tipo de superficies.

Cuando se ha podido estudiar realmen-te y con detalle este tipo de estructuras es con la utilización del microsocopio eléc-tronico, especialmente con el de barrido. Utilizando tinciones especiales se logró demostrar que la matriz que engloba a las bacterias estaba formada por exopolisacá-ridos. En esta última década se han hecho varios avances técnicos importantes en el estudio del biofilm bacteriano, uno debido a la genómica, con el estudio de los genes implicados en la formación y adhesión, y otro a través de una innovación instrumen-tal, por medio del microscopio laser confo-cal que permite el estudio ultraestructural de la biopelícula.

❱❱ Autoinducción

La autoinducción denominada también “quorum sensing” es el proceso que rige la unión de las bacterias a una determinada superficie para la posterior formación del biofilm. Las bacterias tienen su propio lenguaje, es decir, un sistema de comuni-

Foto enterobacteria.

Esquema.

55

Lamana, Jesús M.

cación por medio de señales químicas que son moléculas mensajeras que les permiten comunicarse unas con otras.

La autoinducción supone para las bac-terias una indicación de que hay otras dis-puestas a realizar la unión a las superficies, para determinar la densidad de población en un momento dado y así responder a condiciones variables del medio. Se han descubierto varias moléculas señal para las bacterias, químicamente unas son proteí-nas, otras como las de las Gram positivas son oligopéptidos modificados y para las Gram negativas son lactonas.

Hay muchos procesos patológicos tanto respiratorios como entéricos en veterinaria que son procesos de tipo crónico e inflamatorio y a veces no responden adecuadamente a los antibió-ticos tanto a los convencionales como a los de nueva generación, en muchos casos no hay vacunas para este tipo de antígenos. Este tipo de biofilms dan lugar a la aparición de resistencias bacterianas y también los microorganismos se hacen resistentes a los mecanismos de defensa del huésped debido a su complejidad y tamaño. La resistencia a los antibióticos es debida a que son capaces de sobre-vivir a concentraciones miles de veces mayores con respecto a las bacterias de vida libre. La penetración en el biofilm es lenta e incompleta, suelen formar espo-ras y normalmente se producen cambios genéticos proporcionando vías metabóli-cas nuevas.

Hay que encontrar nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento y pre-vención de las biopelículas bacterianas, principalmente las terapias que rompan la estructura de la biopelícula. Entre ellos podemos citar los agentes quelan-tes que secuestran determinados iones metálicos, los análogos de proteínas que

interfieran en el proceso de “quorum sen-sing”, como la furanona y más que ella sus derivados ya que la furanona es una molécula muy tóxica, también están las sustancias que disuelven los polímeros de la matriz. A pesar de que su estudio ha aumentado en los últimos años toda-vía es necesario definir con precisión su papel en las patologías crónicas que afectan a la producción animal.

❱❱ Los biofilms en la industria alimentaria

Los biofilms se forman en lugares donde hay una higiene deficitaria, donde se lim-pia poco, allí es donde tienen tiempo las bacterias para crecer y no ser eliminadas. Como he comentado el biofilm es como una pasta firme y no fácil de desprender, las bacterias están más protegidas que en la forma libre contra los agentes anti-microbianos, son menos vulnerables y se multiplican más lentamente. Al liberarse las bacterias de la matriz del biofilm se adhie-ren a otras superficies líquidas, pudiendo también formar aerosoles, éstos pueden entrar en contacto con los alimentos y ser contaminados.

La acción de los desinfectantes con-vencionales puede destruir algunas células pero la matriz puede quedar intacta y faci-litar la fijación de nuevas bacterias y por lo tanto desarrollar nuevos biofilms. Hay que poner en marcha una serie de procedi-mientos de limpieza, manejo y desinfección específicos contra las biopelículas que se producen en el material que se utiliza en la industria alimentaria. Las construcciones, materiales y utillaje deben de ser de muy fácil limpieza.

La industria alimentaria, así como la producción animal, demanda productos

desinfectantes que sean capaces de alterar la fisiología microbiana pero por medio de moléculas biodegradables, no contaminan-tes del medio ambiente y naturales. En esta línea se está trabajando con los derivados vegetales y ácidos orgánicos para este fin.

❱❱ Tratamiento

Los derivados vegetales, en concreto del ajo (Allium sativum), han demostrado que tie-nen un efecto antimicrobiano muy potente contra los biofilms bacterianos comparado con los antibióticos convencionales. Los datos publicados en el trabajo del J. Antim. Chemoter en Mayo del 2012 (1) demues-tran que el modo de acción de la molécula derivada del ajo “dialilsulfuro” es diferen-te al de los antibióticos convencionales, posiblemente sea una de las cualidades que hace que posean una mayor acción antibacteriana y sean capaces de burlar las defensas bacterianas.

En España la empresa PREBIA FEED EXTRACTS, S.L. (2) comercializa y posee un importante I+D alrededor de los derivados azufrados del ajo, en concreto de dos molé-culas farmacológicas estables como son el PTS (propiltiosulfinato) y la PTSO (propil-

Estructura del biofilm bacteriano. Microscopía electrónica

Planktonic Cell

Attached Cell

Microcolony

Biofilm

56

tiosulfonato). Estas moléculas vegetales han sido probabas tanto “in vitro” como “in vivo” en la producción animal intensiva de monogástricos así como en rumiantes con unos resultados muy positivos como anti-microbianos y promotores de crecimiento no antibióticos, comercializándose tanto en el mercado nacional como en el internacio-nal desde hace 5 años.

En el IPVS 2010 de Canadá se presentó un trabajo (6) sobre la actividad del PTS y PTSO en aislados de campo de Brachyspira hyodi-senteriae productor de la Disentería Porcina en cerdos de cebo por A. Hidalgo y cols. de la Facultad de Veterinaria de León. Actualmente esta patología entérica es una enfermedad prevalente en cerdos de cebo, ocasionando graves pérdidas al productor. El estudio tiene como objeto evaluar el uso potencial de los dos compuestos farmacológicos de origen vegetal obtenidos a partir de plantas del G. Allium para el control y tratamiento de la disentería porcina. El PTS y PTSO fue capaz de prevenir el crecimiento de todos los aislados en un amplio rango de concentraciones.

Los ensayos clínicos en el campo con el producto comercial que contiene las molé-culas farmacológicas (GARLICON LIQUID) (7) han corroborado el potente efecto antidisen-térico del producto con un adecuado proto-colo en tiempo de administración y a dosis media de 200 ml por litro de agua de bebida.

Estas dos moléculas organosulfura-das PTS y PTSO tienen una alta actividad

“in vitro” contra Salmonella entérica y Escherichia Coli lo que las hace sustitu-tivas de los antibióticos convencionales, como el sulfato de colistina, neomicina o gentamicina, en los piensos de prees-tárter y estárter en lechones (8). En la producción de pollos broiler es efectiva contra la Salmonella y Campylobacter (1).

Este tipo de productos naturales son absolutamente competitivos desde el punto de vista económico con los antibióticos que se usan de forma pro-filáctica en los piensos, con la ventaja de que no necesitan ni período de reti-rada “antemortem” ni receta veterinaria para su administración sea en agua de bebida o vía premix en el pienso. Estos derivados vegetales son ya una alter-nativa a los problemas de resistencias bacterianas (9) que se ocasionan con la utilización sistemática de toneladas de antibióticos en la producción inten-siva en los animales de granja, con los problemas que de ello pueden derivarse para la alimentación humana por el consumo de carne. Se han estudiado los efectos del PTS y PTSO sobre los aislados MRSA (Staphylococcus Aureus Meticilin Resistentes) por E. Arandilla y cols. (10) demostrando que las moléculas vegeta-les derivadas del ajo pueden ser consi-deradas como una opción terapéutica en las infecciones por MRSA tanto en reservorios animales como en humanos.

❱❱ Bibliografía

1. LU. X. Y COLS. 2012. ANTIMICRObIAL EFFECT OF

DIALLYL SULPHIDE ON CAMPYLObACTER jEjUNI

bIOFILMS. j.ANTIMICROb. CHEMOTER.

2. PREbIA FEED EXTRACTS, S.L. TALAVERA DE LA

REINA (TOLEDO). www.PREbIA.ES

3. LYNN MARGULIS Y COL. 2003. CAPTANDO GENO-

MAS. UNA TEORíA SObRE EL ORIGEN DE LAS ESPE-

CIES. EDITORIAL KAIRóS.

4. DONLAN RM. 2002. bIOFILMS: MICRObIAL LIFE ON

SURFACES. EMERG. INFECT. DIS. 8 (9): 881-900.

5. COSTERTON Y COLS. 1999. bACTERIAL bIOFILMS:

A COMMON CAUSE OF PERSISTENT INFECTIONS.

SCIENCE. 284: 1318-1322.

6. HIDALGO, A. Y COLS. ACTIVIDAD DE DOS COM-

PUESTOS ORGANOSULFURADOS DE AjO

(ALLIUM SPP) CONTRA CEPAS DE CAMPO AISLA-

DAS DE bRACHYSPIRA HYODISENTERIAE (IPVS

2010; VANCOUVER, jULY 2012). FACULTAD DE

VETERINARIA DE LEóN. ESPAñA.

7. PRODUCTOS REGISTRADOS DE LA EMPRESA PREbIA:

GARLICON LIQUID (PARA EL AGUA DE bEbIDA),

ALLIbIA PREMIX (PIENSO), GARLICON NEbULO

(AEROSOL) Y ALLIbIA SHOT (DIRECTAMENTE POR

bOCA PARA PEQUEñOS ANIMALES). 2012.

8. E. ARANDILLA Y COLS. 2011. VALORACIóN IN

VITRO DE LA ACTIVIDAD DE DOS MOLéCULAS

ORGANOSULFURADAS PROCEDENTES DEL AjO

(A. SATIVUM). PTS Y PTSO Y SU COMbINACIóN

FRENTE A SALMONELLA ENTéRICA Y ESCHERICHIA

COLI. PREbIA FEED EXTRACTS Y FACULTAD DE

VETERINARIA DE LEóN. SIMPOSIUM 2011 AULA DEI

DE ZARAGOZA.

9. LAMANA, jESúS M. 2011. EL MRSA

(STAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTENTE A LA

METICILINA), UNA AMENAZA PARA LA SALUD

PúbLICA Y LA PRODUCCIóN PORCINA. CRíA Y

SALUD. 37: 42-49.

10. E. ARANDILLA Y COLS. 2010. IN VITRO EVALU-

ATION OF A COMMERCIAL EXTRACTS OF ALLIUM

SATIVUM AGAINST METHCILLIN-RESISTANT

AND METHICILLIN-SENSITIVE STAPHYLOCOCCUS

AUREUS ISOLATES. FACULTAD DE VETERINARIA DE

LEóN. DPTO. DE SANIDAD ANIMAL. UNIVERSIDAD

DE LEóN. SPAIN. CONGRESO ICAR 2010.

Lamana, Jesús M.

58