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Crecimiento bacteriano
MICROBIOLOGA GENERAL
2015TRABAJO PRACTICO N 3CRECIMIENTO BACTERIANO Y EFECTO DE LOS ANTIBITICOS
CRECIMIENTO BACTERIANO Y EFECTO DE LOS ANTIBITICOS
Se define al crecimiento de cualquier sistema biolgico como el incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la multiplicacin celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicacin se traduce en un aumento del tamao del individuo, mientras que en unicelulares lo que ocurre es un aumento de la poblacin.
El estudio del crecimiento a nivel de poblaciones incluye los siguientes tpicos:
cintica del crecimiento;
factores que afectan al tiempo de generacin (g);
factores ambientales que estimulan o limitan el crecimiento.
En este trabajo prctico estudiaremos las caractersticas cinticas de un cultivo bacteriano y los efectos que tienen sobre el mismo el agregado de antibiticos y los cambios en las condiciones de cultivo.
Cintica del crecimientoEl crecimiento de una poblacin o cultivo bacteriano se puede expresar en funcin de:
aumento de masa del cultivo
aumento del nmero de clulas
La medida de la masa bacteriana puede realizarse por mtodos directos, como la determinacin del peso hmedo o peso seco o por mtodos indirectos, como la turbidimetra.
Mtodos directos:
a. Determinacin del peso hmedo:
1. se tara un tubo de centrfuga;
2. se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante;
3. se determina el peso del sedimento.
Inconvenientes: grandes errores, debido al lquido intercelular retenido, cuya cuanta depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento, etc.
b. Determinacin del peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser pesado (105 C, toda la noche), hasta peso constante. Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso hmedo.
Inconvenientes: mtodo tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastante error en la determinacin: es difcil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1 mg de peso seco equivale aprximadamente a unas 5x109 bacterias.
Mtodos indirectos
a. Mtodos turbidimtricos (pticos): La base comn de estos mtodos consiste en la medicin de la cantidad de luz dispersada o transmitida a travs de un cultivo bacteriano.
Recordemos aqu que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partcula pequea suspendida en agua. La dispersin de la luz es, dentro de ciertos lmites, proporcional a la masa del cultivo.
Espectrofotmetro: Este equipo es de uso habitual en cualquier laboratorio de Microbiologa o Bioqumica. El mismo hace incidir un haz de luz de una determinada longitud de onda () sobre una muestra lquida y mide la cantidad de esta luz que es absorbida y/o dispersada por la muestra. La fraccin de luz que es capaz de atravesar la muestra se denomina transmitancia (T). La absorbancia (A) o densidad ptica (DO) se define como
DO = A = - log T
Es decir que la DO es una medida de la luz absorbida y/o dispersada por la muestra
Para medir turbidez utilizamos un haz de luz de =600 nm, ya que es sabido que los cultivos bacterianos no presentan una absorcin significativa a esta longitud de onda. En estas condiciones el valor de DO obtenido se deber completamente a la luz dispersada por la muestra, y se podr correlacionar entonces la DO con la turbidez y por ende, con la concentracin de clulas en cultivo
Si uno quisiera determinar la masa bacteriana o el nmero de clulas a partir de mediciones pticas, se debera realizar una curva de calibracin previa y determinar el grado de correlacin entre ambas variables. Crecimiento balanceado
Una poblacin de bacterias que se encuentre en un medio adecuado en el que se mantienen constantes todos sus parmetros nutricionales y ambientales, crece de forma tal que el incremento por unidad de tiempo de masa celular, no de clulas, ADN, ARN, protenas, etc., es un valor constante y similar en cada caso:
M/M = N/N = [ADN]/[ADN] = [protenas]/[protenas] = ... = K
As pues, durante este crecimiento, de tipo exponencial o logartmico, el cultivo se comporta como una reaccin autocataltica de primer orden:
velocidad de aumento del componente = K{cantidad del componente}
Tambin se puede decir que el no de clulas, la masa celular u otros componentes se duplican en un mismo lapso de tiempo determinado.
Este tipo de crecimiento se denomina balanceado. Se caracteriza, pues, por ser el crecimiento en el que todos los constituyentes celulares se duplican en un mismo tiempo, o dicho de otra manera: aquel en el que estos constituyentes aumentan proporcionalmente por un mismo factor en la unidad de tiempo. Este factor es el coeficiente exponencial de crecimiento (), que es caracterstico para cada cepa bacteriana en cada medio determinado.
Expresin matemtica del crecimiento balanceado:
Para deducirla vamos a aprovechar la definicin emprica anterior, atendiendo por un lado al aumento de la masa celular, y por otro al incremento del nmero de individuos. En funcin del aumento de masa celular:
Podemos decir que en condiciones de crecimiento exponencial:(dM/M)/dt = ( dM = M dtSi integramos esta ltima expresin, entonces resulta:M/M0 = e (t-t0)Aplicando logaritmos neperianos, tenemos que:
ln[M/M0] = (t-t0)
De esta frmula se puede deducir que en condiciones de crecimiento exponencial existe una relacin lineal entre el logaritmo de M y el tiempo.
De aqu se puede deducir que el coeficiente es
= ln (M/M0) /(t-t0)Supongamos que partimos de una clula, tras una divisin (generacin celular), tendremos 2, tras dos divisiones tendremos 4, luego 8, etc:
serie geomtrica. 1, 2, 22, 23, 24, ... 2n (donde n es es nmero de generaciones transcurridas).
Si en vez de partir de una clula partimos de N0 clulas iniciales, la expresin se convierte en:N = N02n (N/N0 = 2n Por otro lado, el nmero de generaciones se puede calcular fcilmente teniendo en cuenta el tiempo transcurrido y conociendo el tiempo medio de generacin (g)n = (t-t0)/gSustituyendo esta expresin en la frmula anterior tenemos:
N/N0 = 2 (t-t0) / g
Aplicando logaritmos neperianos obtenemos queln (N/N0)= [(t-t0)/g ] ln2Ahora bien, como estamos ante un crecimiento balanceado, las dos expresiones matemticas que hemos deducido, basadas en la masa o en nmero de individuos son equivalentes, por lo tanto,ln (M/M0) = ln (N/N0) = ln (M/M0) / (t-t0) = [(t-t0)/g ln 2] / (t-t0)Simplificando el trmino (t-t0) en la expresin anterior:= ln 2 / g = 0.693/g (expresado en h-1 o min-1)Esta es la expresin matemtica del coeficiente del crecimiento balanceado, en funcin del tiempo medio de generacin (g) en condiciones de crecimiento exponencial.
En un medio ideal, sin limitacin de nutrientes, este coeficiente es = mx, o sea, el mximo valor posible del coeficiente para esa cepa en ese medio. Es decir, es un crecimiento balanceado no restringido.
En un medio donde exista algn nutriente limitante (o sea, cuya concentracin est por debajo del lmite de eficiencia de las permeasas), el crecimiento balanceado es de tipo restringido, de modo que el coeficiente real de crecimiento es inferior al mximo, segn la frmula emprica siguiente:
= mx [S]/(KS + [S])
donde [S] es la concentracin del nutriente limitante; KS es la constante de saturacin, equivalente a la concentracin de nutriente para la que el coeficiente es semimximo.
Como se puede ver, la tasa de crecimiento (medida por ) es una funcin hiperblica de la concentracin del sustrato (nutriente) limitante. Este sustrato puede ser una fuente de C y/o de energa, fuente de N, de P, un factor de crecimiento, etc.
En la naturaleza, y en los sistemas de cultivo cerrados que habitualmente se emplean en laboratorio, tarde o temprano el crecimiento balanceado suele terminar, debido a que se agotan los nutrientes o se acumulan sustancias de desecho, entonces se establece un sistema cerrado cuyas caractersticas se describen a continuacin:
Curva de crecimiento en un sistema cerrado en medio lquido
El crecimiento en un sistema cerrado consta de varias fases.
Fase de retardo (fase "lag"): Es el perodo de tiempo durante el que el inculo bacteriano se adapta a las condiciones del medio fresco sobre el que se ha sembrado. Se trata de un perodo de ajuste metablico. Su duracin depende de varios factores:
tamao del inculo estado metablico previo del inculo: si el inculo procede de clulas en fase estacionaria de un cultivo anterior, la fase lag es larga. Ello se debe a que los contenidos en coenzimas y otros constituyentes de las clulas son bajos, y las clulas deben reponerlos en el medio fresco. Si las clulas estn daadas por algn agente, el lag tambin es largo, ya que necesitan un tiempo para la reparacin de los daos. Si las clulas del inculo se tomaron de un cultivo previo en fase logartmica, el lag es ms corto.
medio del que procede el inculo: si el medio es similar al medio fresco, el lag es ms corto. Si el medio del inculo era un medio rico y el medio fresco es ms pobre, la fase de retardo se hace ms larga porque las bacterias necesitan un tiempo adicional para activar la sntesis de las enzimas biosintticas que estaban reprimidas en el medio rico. Pero an cuando la inoculacin se hace desde un cultivo previo en fase logartmica, cuyo medio sea idntico al medio fresco, se observa siempre una fase lag. Por qu?:
necesidad de neutralizar sustancias txicas en el medio fresco; diferencia en la temperatura de los medios
porque puede producirse dilucin de metabolitos intracelulares
Fase de crecimiento exponencial (fase logartmica). En el comienzo de este perodo, cada clula entra en crecimiento exponencial con un cierto desfasaje respecto de sus compaeras. Ello demuestra que las clulas del inculo no estn todas en las mismas condiciones fisiolgicas.
Durante la fase logartmica se da un crecimiento balanceado no restringido durante unas pocas generaciones (normalmente menos de 10). El tiempo de generacin (g) es caracterstico para cada especie o cepa, en cada medio concreto:
El valor del tiempo de generacin (g) depende de:
composicin del medio
temperatura
pH
osmolaridad (tonicidad), etc.
Los microorganismos hetertrofos suelen crecer ms rpidamente en los medios complejos, ricos, que en los medios sintticos, y dentro de estos ltimos, mejor con glucosa que con otras fuentes de carbono.
Fase estacionaria: Esta fase se caracteriza porque el coeficiente neto de crecimiento se hace nulo ( = 0), pero an existe crecimiento. Lo que ocurre es que el crecimiento neto se equilibra con las muertes celulares.
En este perodo se agotan determinados nutrientes y se acumulan sustancias de desecho. Incluso el pH del medio empieza a hacerse inadecuado para el crecimiento celular.Si la bacteria crece en un medio complejo, la transicin entre las fases exponencial y estacionaria (de aceleracin negativa) puede ser relativamente larga, debido a que va recurriendo a fuentes alternativas (por ejemplo, puede recurrir a metabolizar aminocidos como fuente de carbono una vez agotados los azcares).
En la fase estacionaria an existen reacciones metablicas, pero el metabolismo general de la bacteria es sustancialmente diferente al de la fase logartmica:
las clulas son ms pequeas, debido a que existe divisin celular despus de que se haya detenido el incremento de masa;
el citoplasma se condensa;
en las bacterias Gram-negativas aumenta el volumen relativo del periplasma;
el nucleoide se condensa, por sustitucin de ciertas protenas que se unen a ADN;
la membrana citoplsmica se hace menos fluida;
suelen ser ms resistentes a agentes fsicos (temperatura, estrs osmtico) y qumicos;
existe un cambio en el patrn de expresin gentica: disminuye la expresin de cientos de genes que haban estado expresndose durante la fase exponencial, mientras que se activan unos 50-100 genes que antes estaban reprimidos (genes de fase estacionaria); estos genes se transcriben mediante la holoenzima de la ARN-polimerasa dotada del factor sigma S caracterstico de esta fase de crecimiento.
existe reciclado de ciertos materiales intracelulares;
baja el contenido en ARN.
Fase de muerte: Se da muerte y lisis masiva del cultivo. Se debe al agotamiento de reservas de energa y la imposibilidad de llevar a cabo las reacciones bsicas para el mantenimiento de la clula. Algunas veces las clulas aparecen grandes, hinchadas, distorsionadas (formas "fantasmas", "ghost"). Dependiendo de la especie y el cultivo utilizado, la fase de muerte puede presentar una cintica exponencial, caracterizada por un de muerte, que en este caso ser negativo. La pendiente de esta curva tambin vara segn la especie (por ejemplo, en bacterias entricas es suave, mientras que en Bacillus es ms acentuada).
EFECTO DE LOS ANTIBITICOS
Los antibiticos son sustancias normalmente de bajo peso molecular producidas por seres vivos (antibiticos naturales) o modificadas artificialmente a partir de ellas (antibiticos semisintticos), que a pequeas concentraciones tienen efectos antimicrobianos (microbicidas o microbiostticos), tras ser administrados por va adecuada a un organismo receptor.
La mayor parte de los antibiticos proceden del metabolismo secundario de microorganismos procariotas (Streptomyces, Myxococcus, Bacillus, entre otras) o eucariotas (hongos de los gneros Penicillium, Cephalosporium, etc).
La mayor parte de los antibiticos comerciales se emplean para tratar enfermedades de etiologa bacteriana, aunque algunos se usan contra hongos y levaduras, y unos pocos presentan actividad antitumoral.
La mayora de los antibiticos son molculas complejas, con regiones hidrofbicas que facilitan el transporte al interior celular. Muchos poseen varios anillos, algunos de los cuales mejoran la interaccin de la molcula con su diana macromolecular.
Para estudiarlos es ms til agrupar a los antibiticos no por clases segn su naturaleza qumica, sino en funcin de los blancos sobre los que actan y con las que interfieren:
A) antibiticos que interfieren con la biosntesis de la pared celular
B) antibiticos que actan sobre la membrana celular
C) antibiticos que inhiben la sntesis de protenas
D) antibiticos que actan sobre la sntesis de cidos nucleicos.
Los antibiticos ms abundantes, y los mejor estudiados, son los que interfieren con enzimas de la biosntesis del peptidoglicano de las eubacterias, y los que interfieren con la funcin del ribosoma.
Inhibidores de la biosintesis de la pared celular bacteriana
Fosfomicina (fosfonomicina)
Este antibitico de estructura muy simple est producido por Streptomyces fradiae. Su accin inhibitoria es ejercida a nivel de la primera reaccin de la sntesis del PG, a saber, impidiendo la condensacin reductora del UDP-NAG con el PEP para dar UDP-NAM. Ello lo logra unindose con la enzima transferasa correspondiente, inactivndola.
Aunque tiene baja toxicidad para organismos superiores, apenas ha encontrado aplicacin en la clnica (se emple en Espaa, pero no est admitido en los EE UU).
Cicloserina
Producido por Streptomyces orchidaceus, este antibitico muestra cierto parecido estructural con la D-alanina, lo que explica el hecho de que acta como inhibidor competitivo de las dos reacciones secuenciales de la sntesis del PG donde aparece la D-ala:
inhibe la racemasa que cataliza la conversin de L-ala en D-ala;
inhibe la D-alanil-D-alanina sintetasa (que condensa dos D-ala para dar el dipptido D-ala-D-ala).
La cicloserina tiene mayor afinidad que el sustrato natural (D-ala) hacia las dos enzimas.
Es un antibitico de amplio espectro, pero apenas se emplea clnicamente, debido a su neurotoxicidad. Se recurre a l slo para tratar ciertos casos de tuberculosis, en combinacin con otros antibiticos.
Vancomicina
Es un glucopptido complejo producido por Streptomyces orientalis. Se une rpida e irreversiblemente con el extremo D-alanil-D-alanina del pentapptido del precursor del PG que se halla unido al undecaprenil-P (a nivel de membrana citoplsmica), de modo que inhibe la reaccin de transglucosidacin.
Es un antibitico de espectro estrecho, bactericida frente a muchas bacterias Gram-positivas. Recientemente se est usando frente a infecciones severas de Staphylococcus aureus y de Streptococcus pneumoniae que sean resistentes a otros antibiticos. Es la droga de eleccin ante colitis asociadas a antibiticos ocasionadas por Clostridium difficile.
Ristocetina
Es un antibitico parecido al anterior, producido por Nocardia lurida, y que, al igual que la vancomicina inhibe la transglucosidacin, siendo activo frente a Gram-positivas.
BacitracinaProducida por Bacillus subtilis variedad "tracy" (de ah su nombre), es un antibitico polipeptdico provisto de un anillo tiazol, bactericida frente a muchos Gram-positivos as como frente al Gram-negativo Neisseria. Es demasiado txico (sobre todo nefrotxico) como para ser administrado sistmicamente, pero tiene uso tpico (p. ej., en ciruga del colon).
Su mecanismo de accin estriba en que se une al pirofosfato del undecaprenil-P-P, e impide su regeneracin hasta undecaprenil-P por la fosfatasa especfica; por lo tanto, evita la reentrada del undecaprenil-P en el ciclo biosinttico del PG.
Antibioticos -lactmicos
Todos los antibiticos de este grupo contienen un anillo caracterstico: el anillo -lactmico. La importancia de las penicilinas radica en que fueron los primeros compuestos antibiticos naturales en descubrirse. Con el paso del tiempo se fueron descubriendo otros compuestos que presentan el mismo anillo -lactmico, pero que presentan variantes estructurales y por lo tanto se agrupan en familias diferentes a la penicilina:
El poder de estos antibiticos reside fundamentalmente en su anillo -lactmico, por lo que el mecanismo de accin de todos ellos es el mismo:Inhiben el sistema enzimtico implicado en la reaccin de transpeptidacin del peptidoglucano naciente, impidiendo los entrecruzamientos entre cadenas de PG.
Esta inhibicin de la reaccin de transpeptidacin causa:
acumulacin de precursores del PG, sin ensamblar;
activacin de una serie de autolisinas (amidasas, glucosidasas), que hidrilozan el PG maduro de la bacteria. En Gram-positivas, adems, se produce desorganizacin de los cidos teicoicos y lipoteicoicos. (En este tipo de bacterias son estos cidos los que regularan la activacin de las autolisinas).
Por ello todas las penicilinas son bactericidas lticos sobre bacterias en crecimiento activo y en medios hipotnicos respecto al interior celular.
En caso de que la bacteria se encuentre creciendo en un medio de cultivo isotnico, se generar una clula sin pared denominada protoplasto, pero ste no se lisar. Si la bacteria no se encuentra en crecimiento, no habr sntesis de pared celular ni renovacin ("turnover") de la misma. En estas condiciones la penicilina no tendr una "diana" sobre la que actuar y por lo tanto, la bacteria sobrevivir. Esta es la causa general de las "recadas" de muchas infecciones, una vez que se ha dado por terminado el tratamiento de un paciente con un antibitico -lactmico.
Antibiticos que interfieren en la biosntesis de protenas
Los antibiticos que interfieren en la sntesis de protenas son muy variados y abundantes, y la mayora de ellos funcionan interfiriendo con el ribosoma, sobre todo los que se unen a protenas ribosmicas y/o a alguno de los ARN ribosmicos. Nosotros vamos a detenernos principalmente en aquellos antibiticos que afectan a la elongacin de la cadena naciente del polipptido. Obviamente, los ms tiles son aquellos que tienen efectos selectivos frente a los ribosomas 70S procariticos, pero no sobre los 80S eucariticos. Dentro de ellos, y siguiendo el orden natural del funcionamiento de la elongacin de la cadena polipeptdica, podemos agruparlos segn la fase concreta de la elongacin sobre la que actan:
inhibicin del reconocimiento de un aminoacil-ARNt (aa-ARNt) hacia el sitio A del ribosoma;
introduccin de errores en la lectura de los ARNm;
inhibicin de la reaccin de formacin del enlace peptdico;
inhibicin de la traslocacin del peptidil-ARNt (pp-ARNt) desde el sitio A al sitio P.
bloqueo de los factores de elongacin.
Inhibidores de la fase inicial de la elongacion (del reconocimiento y entrada del aa-ARNt al sitio "A" del ribosoma)
Tetraciclinas Son antibiticos de muy amplio espectro (frente a Gram-positivas, Gram-negativas, Rickettsias y Clamidias, e incluso Micoplasmas), producidos por distintas especies de Streptomyces. Actan como bacteriostticos, siempre y cuando las bacterias estn en crecimiento activo. Como se puede ver por su espectro, son tiles incluso contra bacterias que viven como parsitos intracelulares (como las Rickettsias), debido a que su carcter hidrofbico facilita su difusin a travs de membranas.
Mecanismo de accin: Provocan que la unin del aa-ARNt al sitio A del ribosoma sea inestable y est distorsionada, con lo cual se evita la elongacin de la cadena. In vitro actan tanto frente a ribosomas 70S como frente a los 80S. Entonces, por qu in vivo slo inhiben a las bacterias? La explicacin est en el hecho de que las bacterias transportan complejos tetraciclina-Mg de forma "suicida", cosa que no ocurre en eucariotas. Al llegar la tetraciclina a la subunidad 30S, se une a las protenas S4 y S18 del ribosoma 70S intacto, ejerciendo el efecto que hemos descrito en el prrafo anterior.
Efectos secundarios:
Las tetraciclinas naturales se absorben mal por el intestino, y pueden destruir la flora autctona, favoreciendo infecciones secundarias. Las semisintticas evitan este problema.
Se depositan en tejidos calcificados, ocasionando daos a huesos y dientes, y tiendo los dientes de amarillo en los nios.
Antibiticos inhibidores de la formacin del enlace peptdicoSe trata de un grupo variado y heterogneo de agentes antibacterianos que interfieren con el centro peptidil-transferasa de la subunidad grande del ribosoma.
Cloranfenicol (antes llamado cloromicetina) Antiguamente la industria lo obtena a partir de Streptomyces venezuelae, pero actualmente es ms barato fabricarlo por sntesis qumica. Es un bacteriosttico de amplio espectro. Se absorbe bien va oral y penetra bien en todos los tejidos, incluyendo cerebro y lquido cerebroespinal, por lo que se puede usar frente a meningitis ocasionadas por Haemophilus influenzae, as como tratamiento de fiebres tifoideas y anaerobios Gram-negativos.
Sin embargo, hay que controlar bien las dosis, ya que puede provocar supresin de mdula sea (aplasia medular); de hecho, casi no se emplea en pases de Occidente, aunque se receta demasiado en el Tercer Mundo.
Mecanismo de accin: Se une a varios sitios de la subunidad 50S, entre los cuales el ms importante es la protena L16, que forma parte del centro peptidil-transferasa, cerca del sitio del ribosoma donde encaja el extremo aminoacil del ARNt, en el sitio A.
El cloranfenicol ha sido muy til en el estudio de los ribosomas, ya que estabiliza los polisomas rpidamente.
TRABAJO PRCTICO N 3
CRECIMIENTO BACTERIANO Y EFECTO DE LOS ANTIBITICOS1. Medicin de la actividad antimicrobiana
a. Mtodo de dilucin en tubo
La actividad antimicrobiana se mide determinando la cantidad ms pequea del agente que se necesita para inhibir el crecimiento de un organismo control, valor que se conoce como concentracin inhibitoria mnima (CIM). A partir de este dato puede determinarse si es posible tratar una infeccin causada por ese microorganismo con ese antimicrobiano. Si la CIM es menor que la concentracin de antimicrobiano que se alcanza en los tejidos de cuerpo humano, el tratamiento puede tener xito, y el microorganismo se considera sensible; en caso contrario fracasar, y el microorganismo se considera resistente.a) Preparar un tubo de hemlisis con 1 mL de LB lquido, con una concentracin de cloranfenicol de 200 g/mL. A partir del mismo preparar 5 diluciones seriadas al medio. En el ltimo tubo, los 0.5 mL sobrante debe descartarse de manera de que todos los tubos tengan el mismo volumen.Inocular todos los tubos de la serie con la cepa de Bacillus subtilis MC530.b) Repetir la preparacin de las diluciones partiendo de una concentracin inicial de cloranfenicol de 25g/ml. Inocular todos los tubos de la serie con la cepa de Bacillus subtilis JH642.En ambos se agregarn 2 tubos de hemlisis con 0.5 mL de LB cada uno: Uno se inocular con la cepa de B. subtilis correspondiente (Control positivo) y uno se dejar sin inocular (Control negativo).Despus de la incubacin a 37C con agitacin durante una noche, observar en qu tubos no ha habido crecimiento (indicado por turbidez visible) e informar la CIM de cada una de las cepas.b. Mtodo de la difusin en agar (Antibiograma)Un antibiograma es un estudio de la sensibilidad de un microorganismo ante distintos compuestos antimicrobianos. Las distintas especies y variantes microbianas presentan distintos grados de sensibilidad a los diversos agentes, de ah que sea necesario hacer una evaluacin para poder seleccionar el compuesto ms apropiado para el tratamiento de una infeccin bacteriana.
a) Preparar el inculo: suspensin del microorganismo al cual se le determinar la sensibilidad al antibitico (MC530 o JH642).
b) Sembrar 100 l del inculo de la cepa bacteriana a ensayar con esptula de Drigalsky en una placa de LB.
c) Aplicar un set de discos de antibiticos sobre la placa (agregar a cada disco 5 l de distintas concentraciones de Cm: 40 mg/ml, 5 mg/ml y 2.5 mg/ml, y 10 l de Kn 10 mg/ml, antes de aplicar sobre la placa)d) Incubar 16 horas a 37C y observar el desarrollo de crecimiento.
Durante la incubacin el agente difunde desde el papel de filtro al agar: cuanto ms se aleja del papel menor es la concentracin del agente. A una cierta distancia del disco se alcanza la CIM. Pasado ese punto hay crecimiento, pero ms cerca del disco no lo hay. Se crea por lo tanto una zona de inhibicin, y el dimetro de esta zona es proporcional a la cantidad de agente antimicrobiano aadida al disco y a la efectividad del agente. Este mtodo se utiliza rutinariamente para ensayos de sensibilidad a los antibiticos de los microorganismos patgenos.
2. Recuento de clulas viables
a) Realizar diluciones seriadas hasta un orden de 10-6 a partir de un cultivo de Bacillus subtilis de DO 0.3-1b) Sembrar las diluciones 10-4, 10-5 y 10-6 en placas de LB utilizando esptula de Drigalsky.
c) Incubar una noche a 37C y hacer el recuento de colonias en la placa que corresponda.
3. Cintica de crecimiento
a) Inocular un erlenmeyer con 80 ml de medio LB lquido con un cultivo saturado de E. coli, de manera de lograr una DO inicial de 0.1. Incubar a 37 C con agitacin.
b) Cuando el cultivo haya alcanzado una DO aproximada de 0.3 dividir en 4 alcuotas de 15 ml cada una:
cultivo control: Sin agregados
Cultivo Ap200: se le agregar el antibitico ampicilina en cantidad suficiente para alcanzar una concentracin final de 200 g/ml.
Cultivo Cm40: se le agregar el antibitico cloranfenicol en cantidad suficiente para alcanzar una concentracin final de 40 g/ml.
Cultivo Tc100: se le agregar el antibitico tetraciclina en cantidad suficiente para alcanzar una concentracin final de 100 g/ml.
c) Continuar la incubacin y tomar alcuotas de 1 ml cada 30 minutos. Sobre estas alcuotas se medir la DO.
d) Graficar DO en funcin del tiempo para cada uno de los cultivos.e) Graficar ln DO en funcin del tiempo para cada uno de los cultivos.
Cuestionario Gua
1. Qu tcnicas pueden utilizarse para medir el crecimiento bacteriano? Cules son las ventajas y desventajas de cada una de ellas?2. Puede usarse la produccin de un metabolito secundario para evaluar el crecimiento de un cultivo?3. Que fenmenos ocurren durante la fase lag de crecimiento? Qu factores afectan la duracin del perodo lag?
4. Qu factores influyen sobre la velocidad de crecimiento?
5. Cmo se calcula la velocidad mxima de crecimiento en un cultivo cerrado? y el tiempo de generacin?
6. Cmo se puede mantener un microorganismo en fase exponencial de crecimiento por un perodo continuado de tiempo? 7. Cmo se calcula el rendimiento celular?
8. Si luego de 2 das de cultivo no se obtiene desarrollo de un dado microorganismo ni a 10C ni a 45C, puede concluir que ese microorganismo no crece a esas temperaturas?
9. Por qu deben realizarse diluciones para realizar el recuento de clulas viables?
10. Cuando se realiza un recuento de clulas viables, qu es lo que se cuenta y qu es lo que se asume?
11. Cmo diferencia un agente bactericida de un bacteriosttico?
12. Cul es el blanco de los antibiticos betalactmicos? Cul es su mecanismo de accin? 13. Para qu realizara un antibiograma en un diagnstico clnico?14. Cmo se podra determinar si los microorganismos contenidos dentro una zona de inhibicin del crecimiento estn muertos o solo inhibidos?
15. Explique la importancia de incluir controles positivos y negativos en un ensayo de CIM
Problemas1. Se desean estudiar las caractersticas de crecimiento de dos especies bacterianas Q.O.T. aisladas a partir de una muestra de suelo. Las especies en cuestin, denominadas cepa A y cepa B, fueron caracterizadas nutricionalmente hallndose que la cepa A posee una auxotrofa para el aminocido (L)-leucina y mientras que la cepa B es prottrofa para este aminocido y es productora de al menos una sustancia con actividad antibitica, sintetizada desde el comienzo de la fase exponencial tarda de crecimiento. Luego de cultivarse por separado las cepas A y B en medio sinttico mnimo, se obtuvieron los resultados dados a continuacin.
Tiempo (h)ln D.O.
Cepa ACepa B
00.0950.182
10.1390.182
20.5300.405
30.9100.693
41.6091.029
52.3001.386
62.9901.568
73.4001.609
83.6901.705
93.8001.705
103.8501.723
113.8501.740
123.8501.723
a) Calcule la mxima de crecimiento y el tiempo de generacin (g) para cada cepa bacteriana.
b) Confeccione un medio de cultivo sinttico mnimo apto para el crecimiento de cada cepa bacteriana por separado.
A continuacin los microorganismos A y B son crecidos juntos en el mismo medio de cultivo sinttico mnimo obtenindose los datos siguientes:
Tiempo (h)ln (N cl. viables / ml)
Cepa ACepa B
011.5111.61
111.6111.61
212.0711.95
312.3012.30
412.9012.64
513.5913.00
614.2813.33
714.4014.15
814.0015.42
913.5916.70
1013.2217.97
1112.2119.24
129.2120.51
c) Confeccione un medio de cultivo sinttico mnimo para el crecimiento conjunto de las cepas A y B.
d) Calcule mxima de crecimiento de las cepas A y B as como mxima de muerte (cuando corresponda). Cmo explica Ud. los resultados obtenidos al comparar estos datos con los de la respuesta a la pregunta 1, anterior situacin en la cual los microorganismos A y B fueron crecidos separadamente?
2. Se desea conocer el nmero de unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml), de un cultivo de Escherichia coli LE392. A partir de dicho cultivo se realizaron tres diluciones 1:100, y una dilucin 1:10. Se sembraron con esptula de Drigalski 0,1 ml de la tercera y cuarta dilucin. En la tercera se contaron 50 colonias y en la cuarta 3 colonias.
a- Qu significado tiene el trmino UFC/ml?
b- Cul de las dos diluciones se usa para calcular el nmero de UFC/ml? Justifique.
c- Calcule en nmero de UFC/ml del cultivo original.
d- Este mtodo de cuantificacin de microorganismos determina:
I. nmero total de microorganismos.
II. nmero de microorganismos viables.
III. nmero de microorganismos muertos.
3. Para estudiar el efecto y mecanismo de accin de un antibitico se llevaron a cabo los siguientes experimentos:
a. Recuento del nmero de clulas viables.
El ensayo del antibitico (ATB) se realiz sobre una cepa de Bacillus subtilis sensible (S) y una resistente (R); el antibitico fue agregado en una concentracin de 100 g/ml, 150 minutos despus de iniciado el cultivo.
Los valores informados son unidades formadoras de colonias por mililitro de cultivo.TIEMPO (minutos)S y R con antibitico.
S sin antibiticoS sin antibiticoS con antibitico
01.0 x 1031.1 x 1031.1 x 103
301.0 x 1031.2 x 1031.2 x 103
601.5 x 1031.3 x 1031.2 x 103
904.0 x 1044.2 x 1044.1 x 104
1204.0 x 1054.1 x 1054.0 x 105
1504.0 x 1063.9 x 1063.8 x 106
1804.2 x 1074.1 x 1074.0 x 106
2103.7 x 1083.6 x 1089.0 x 105
2404.3 x 1084.2 x 1082.0 x 105
2705.0 x 1084.9 x 1088.0 x 104
3005.1 x 1085.0 x 1084.0 x 104
3305.2 x 1085.1 x 1082.1 x 104
3605.2 x 1085.2 x 1081.0 x 104
3905.2 x 1085.2 x 1085.0 x 103
Osmolaridad del medioISOSMOTICOHIPOSMOTICOHIPOSMTICO
b. Se ensay tambin el efecto de distintas concentraciones del antibitico sobre el crecimiento de una cepa sensible en condiciones hiposmticas, para lo cual se adicion el mismo a distintas alcuotas de un cultivo de Abs=0,6 y se midi la Abs final alcanzada luego de 1 hora de adicionado el antibitico.CONCENTRACIN (g/ml)Abs final alcanzada
101.2
500.9
1000.2
2000.2
c. Para analizar cul era el metabolismo afectado se ensay el antibitico en cuestin y otros de actividad conocida sobre una cepa sensible en presencia de precursores marcados radiactivamente, y se midi su incorporacin a distintas biomolculas. Los valores informados (en cuentas por minuto totales) fueron:
ANTIBIOTICO[35S] metionina[3H] timidina[3H] uracilo[14C] UDP NAcGluc
ATB14900140001490017000
Cloranfenicol31001630016100111000
Actinomicina14000250015500120000
Rifampicina1390016000170115000
Vancomicina14800165001600020000
Sin antibitico150001700016500120000
d. Con el fin de localizar el sitio de accin del antibitico se realiz un experimento en el cual se utilizaron precursores radioactivos de la sntesis de murena, midindose la incorporacin de los mismos a la pared celular en un medio isosmtico, luego de 2 horas de cultivo, en presencia de 200 g/ml del antibitico.
PRECURSORS sin antibiticoS con antibiticoR con antibitico
N-AcGlucosamina20000150018000
D-Alanina23000130017900
UDP NAc Mur pentapptido19000160019000
e. Para estudiar el mecanismo de resistencia de la cepa R se realiz el siguiente experimento:
Se cultiv la cepa R en presencia del antibitico hasta una Abs de 0,5, se separaron las clulas por centrifugacin, y se adicion el sobrenadante a un cultivo de la cepa sensible S, partiendo de una Abs inicial de 0,15.
Los resultados se informan como Abs final alcanzada luego de 3 horas de cultivo.
MEDIO FRESCO / SOBRENADANTEAbs FINAL ALCANZADA
Sin agregado del medio de cultivo de R0.80
400.81
200.72
100.74
40.71
i. Grafique ln(Nv) versus tiempo para las cepas en estudio.
ii. Represente los resultados esperados en el caso de medir Abs. en lugar de Nv.
iii. Calcule la mx. para la cepa control sin antibitico en medio isosmtico.iv. Indique el posible sitio de accin del antibitico y mecanismo de resistencia para la cepa R.4. Para analizar el efecto de diferentes concentraciones de un antibitico sobre el crecimiento de una cepa de Streptococcus se determin tanto la D.O. del cultivo, como el recuento de clulas viables a diferentes tiempos. Los datos indicados en la columna 1 (cultivo I) fueron obtenidos en ausencia del antibitico. Los cultivos 2 y 3 muestran crecimiento de cultivos a los cuales se les adicion a los 150 minutos el antibitico en estudio a una concentracin final de 1 y 100 (g/ml respectivamente.
Cultivo 1: ausencia de antibitico
Cultivo 2: a los 150 minutos se agreg el antibitico a una concentracin final de 1 (g/ml y se continu midiendo la D.O. del cultivo.
Cultivo 3: se realiz el mismo procedimiento que para el cultivo 2 excepto que el antibitico se agreg a una concentracin final de 100 (g/ml.
Tabla 1. Medida de D.O.
Tiempo (min)Cultivo 1Cultivo 2Cultivo 3
D.O.ln D.OD.O.ln D.OD.O.ln D.O
0148514851485
60149514951495
901815.21815.21815.2
1203305.83305.83305.8
1506006.46006.46006.4
180109776006.46006.4
21020007.66006.46006.4
24036408.26006.46006.4
30054008.66006.46006.4
36054308.66006.46006.4
Tabla 2. Recuento de clulas viables x 108 (Nv).
Tiempo (min)Cultivo 2Cultivo 3
Nvln NvNvln Nv
02.719.42.7
602.719.42.7
903.319.63.3
1206.020.26.0
1501120.86.0
1801120.85.8
2101120.83.2
2401120.82.5
3001120.82.0
3601120.81.8
a. Calcule mx y g e indique durante que lapso el cultivo se encontraba en la fase exponencial.
b. Fundamente cual es el efecto del antibitico para cada concentracin (bacteriosttico, bactericida o bacterioltico).
c. Calcule, si corresponde, la velocidad especfica de muerte, sabiendo que la muerte celular sigue una cintica exponencial similar a la de crecimiento celular.
5. Con el fin de analizar el efecto de los antibiticos X e Y sobre el crecimiento de E. coli se determin el nmero de clulas viables por mililitro (Nv/ml) a diferentes tiempos, en ausencia (Tabla 1) y en presencia de dichos antibiticos (Tabla 2: antibitico X; Tabla 3: antibitico Y). Se indican las diluciones realizadas a cada tiempo para el contaje de clulas viables, el volumen sembrado para cada dilucin y el nmero de unidades formadoras de colonias (UFC) contadas en cada dilucin.Tabla 1. Valores obtenidos en ausencia de antibiticos.
Tiempo (hs)DilucinVol. de siembra (ml)UFC
010-20.130
10-30.11
110-20.261
10-30.23
210-20.160
10-30.18
410-30.1410
10-40.138
610-60.249
10-70.24
710-50.1922
10-60.1145
810-60.1290
10-70.125
910-70.258
10-80.21
Tabla 2. El antibitico X fue agregado a T = 4 hs.
Tiempo (hs)DilucinVol. de siembra (ml)UFC
510-40.154
10-50.15
710-30.1630
10-40.155
910-30.21200
10-40.2108
Tabla 3. El antibitico Y fue agregado a T=4 hs.
Tiempo (hs)DilucinVol. de siembra (ml)UFC
510-40.2108
10-50.29
710-30.1120
10-40.124
910-30.254
10-40.22
a. Calcule UFC/ml del cultivo para cada tiempo, en ausencia y presencia de los antibiticos X e Y.
b. Grafique ln Nv/ml vs tiempo en ausencia y presencia de los antibiticos.
c. Calcule mx y g.
d. Puede, en base a los datos de Nv, indicar el efecto de los antibiticos X e y sobre E. coli? (bacteriosttico, bactericida propiamente dicho o bacterioltico). En caso negativo, indique qu otros datos necesitara para determinarlo.
6. Se quiere determinar el sitio de accin de un antibitico, para lo cual se utiliza la bacteria Gram (+) Bacillus subtilis. Alcuotas de esta bacteria son incubadas con el agregado de precursores radioactivos en presencia o en ausencia del antibitico. Luego se van tomando muestras a distintos tiempos y se determina la incorporacin de radioactividad en cada caso, obtenindose los siguientes grficos:
a) Incubacin realizada en presencia de UDP (14C) Glc-Nac
b) Incubacin realizada en presencia de (14C) D-alanina.
c) Incubacin realizada en presencia de (14C) D-alanina.
Indique los posibles sitios de accin de este antibitico. Grafique D.O. en funcin del tiempo para un cultivo al que se le agrega este antibitico. Justifique sus respuestas.
7. Se estudi el mecanismo y lugar de accin de un antibitico activo contra bacterias Gram (+), para ello se realizaron los siguientes ensayos:
Ensayos de biosntesis de macromolculas: se cultiv la bacteria Staphylococcus aureus en presencia de distintos precursores de macromolculas marcadas radioactivamente, en presencia de distintos antibiticos conocidos y del nuevo antibitico X. Luego se prepararon los extractos celulares segn la macromolcula que se quera estudiar y se determin la cantidad de radioactividad de cada una segn la siguiente tabla:% de inhibicin sobre la biosntesis
ProtenaDNARNAMurena
X21192
Cloranfenicol85022
Actinomicina191150
Rifampicina01921
Vancomicina10084
Incorporacin de radiactividad proveniente de precursores unidos a UDP en presencia de distintos antibiticos. Posteriormente se separa el pptidoglicano cido insoluble y se determina su radiactividad para cada condicin de cultivo segn se ve en la siguiente tabla:Precursor radioactivoAntibitico (/ml)Radiactividad (incorporada en murena)% Inhibicin
UDP-GlcNac Sin agregado
X
D-cicloserina
Ristocetina20000
200
250
400-
99
98.5
98
UDP-MurNac-pentapptido Sin agregado
X
D-cicloserina
Ristocetina5000
4500
4250
500-
5
7.5
90
En base a los datos suministrados:
a. Interpretar cada uno de los resultados presentados.
b. Indicar los posibles lugares de accin del antibitico.
8. Las tetraciclinas representan una familia de antibiticos introducidos a fines de la dcada del 40, a partir de su aislamiento de diferentes cepas de Streptomyces.Cuando una de estas cepas es cultivada en un medio de cultivo adecuado se obtienen los resultados observados en la siguiente tabla:
TIEMPO (hs)PESO SECO (g/l)Ln PESO SECO
14.51.50
35.01.61
66.31.84
1012.52.53
1425.03.22
18403.70
Por encima de las 20 hs. no se observa aumento apreciable del peso seco.
Paralelamente se determina la concentracin de tetraciclina (Tc) producida por esta especie bacteriana en el sobrenadante del medio de cultivo. (Figura 1)
Figura 1.
a. Calcular la velocidad de crecimiento especfica mxima y el tiempo de generacin.
b. Se podran utilizar los datos numricos de produccin de Tc (en caso de contar con ellos) para calcular la velocidad pedida? Justificar.9. Se realizaron investigaciones acerca del mecanismo de resistencia a Tetraciclina, desarrollado por una cepa mutante de Staphyloccus faecalis. Se emplearon para este fin tres cepas de este microorganismo: una sensible al antibitico (A), una cepa resistente ya conocida (B), y la mutante en estudio (C). Para detectar el origen de la resistencia adquirida por esta cepa, se realizaron los siguientes ensayos:a) Efecto de la tetraciclina sobre el crecimiento de las cepas (A), (B) y (C). (Figura 1). La flecha indica el momento de agregado del antibitico (100 g/ml).
Figura 1.
b) Actividad biolgica de la Tetraciclina recuperada del sobrenadante (esterilizado por filtracin) donde se desarrollaron las cepas (B) y (C) (Fig. 2).
El sobrenadante de un cultivo de S. faecalis (B) y (C), al que se cultiv ON en presencia de Tetraciclina (100 g/ml), fue recuperado y utilizado para ensayar su capacidad inhibitoria remanente a distintas concentraciones, sobre una suspensin de bacterias (A). El crecimiento fue observado y medido a las 15 hs de la adicin del sobrenadante. El control se realiz incorporando en un tubo cantidades variables de Tetraciclina fresca.
Figura 2.b) Efecto de la Tetraciclina en la sntesis in vitro de protena, medida como porcentaje de Actividad (incorporacin de 14C aminocidos)
Los extractos de las cepas (A), (B) y (C) fueron preparados y se enfrentaron con distintas concentraciones de Tetraciclina (Figura 3).
Figura 3.
c) Incorporacin de 3H-Tetraciclina por las cepas (A), (B) y (C).
Se analiza la capacidad de acumularla intracelularmente en presencia o ausencia de glucosa (fuente de energa).Figura 4
Establezca qu tipo de mecanismo sera el que impide que estos mutantes sean afectados por la Tetraciclina.
10. Indique cmo se comportar un cultivo de la bacteria Gram (-) E. coli K12, ante el agregado de los siguientes antibiticos, por separado, en los momentos indicados por las flechas, ya sea en un medio hipotnico (caldo peptonado) o isotnico (caldo peptonado + sacarosa).1- Penicilina G
2- Estreptomicina
3- Polimixina
4- cido Nalidxico
11. Hasta el presente se han descripto distintos mecanismos de resistencia bacteriana a tetraciclinas. Para estudiar uno de estos mecanismos de resistencia mediado por la protena Tet (0) en una cepa de E. coli denominada JM107 productora de esta protena, se realizaron los siguientes ensayos:a. Captacin de 3H-tetraciclina: se cultivaron las cepas JM107 y HB101 (cepa de E. coli resistente a tetraciclina mediante un proceso de expulsin activo de la droga) hasta la fase exponencial de crecimiento, se lavaron y resuspendieron en medio de cultivo fresco con el agregado de 3H-tetraciclina. A distintos tiempos se tomaron alcuotas y se determin la radioactividad presente en las bacterias.
b. Efecto de Tet(0) sobre la actividad de la tetraciclina: se utiliz un sistema de traduccin in vitro a partir de ARNm sinttico (poliU) cuya traduccin da polifenilalanina. Dicho sistema de traduccin utiliza fracciones ribosomales provenientes de E. coli HB101 o JM107 TcR en presencia de 14C-fenilalanina y distintas concentraciones de tetraciclina en un medio por lo dems completo. A los 60 minutos se precipita la polifenilalanina con cido tricloroactico al 10% y se mide la radioactividad incorporada en el precipitado. En la figura 2 se grafica el porcentaje de inhibicin alcanzado.
c. Por ltimo se midi la unin de 3H-tetraciclina a una fraccin de ribosomas provenientes de la cepa HB101 o de la cepa JM107. Para ello se incub una alcuota conteniendo ribosomas en un buffer adecuado en presencia de distintas concentraciones de 3H-tetraciclina durante 15 minutos a 37C. Posteriormente se colectaron los ribosomas, se lavaron, y se determin la radioactividad unida en cada caso. Se obtuvieron los siguientes resultados:
En base a los datos mostrados, indique el posible mecanismo de resistencia de la cepa JM107. Justifique su respuesta analizando en cada caso los datos mostrados.12. En el curso de la bsqueda de nuevos antibiticos producidos por microorganismos se detect que una cepa de Bacillus subtilis produce un novedoso antibitico macrocclico llamado Dificidina. A los efectos de caracterizar este compuesto se realizaron los siguientes experimentos:
a. Una cepa de E. coli fue cultivada en medio sinttico hasta D.O. 0,1. En ese momento se fraccion el cultivo en 4 partes, y a los 60 minutos a cada fraccin se le adicion un compuesto diferente (Fig. 1).
b. Clulas de E. coli fueron cultivadas en medio M9 hasta fase logartmica y en ese momento se adicion Dificidina. Se tomaron alcuotas del cultivo desde el agregado del antibitico, con el objeto de detectar la viabilidad celular (Fig. 2).
FIGURA 1
FIGURA 2
En base a estos dos experimentos, qu conclusiones extrae sobre el efecto de Dificidina sobre el crecimiento de E. coli? Fundamente su respuesta.
A continuacin es realizada una serie de experimentos para determinar el proceso metablico primario inhibido por Dificidina (ejemplo: sntesis de murena, de protenas, de ARN, de ADN). En todos los casos E. coli se cultiv en medio M9 en presencia de algn precursor radioactivo como se indica en cada caso, y se determin la radioactividad (cpm) incorporada por las clulas (Figuras 3-6).
Figura 3
Figura 4
Figura 5
Figura 61) sin agregado
5) Estreptomicina
2) Dificidina
6) Rifampicina
3) Ac. Nalidxico
7) Cloranfenicol
4) Cicloserina
Qu conclusin extrae de estos ltimos experimentos acerca del o de los posibles blancos de accin de la Dificidina? Explique su respuesta.13. Se quiere caracterizar un nuevo antibiotico llamado BQ14. Para ello se realizan los siguientes experimentos utilizando una cepa sensible al mismo:
Se cultiva la cepa sensible en medio de cultivo LB hasta DO= 0.3. En este momento el cultivo se divide en 2: A la mitad se le adiciona BQ14 100 g/mL y a la otra se la deja sin tratamiento (Control). Se obtienen el siguiente resultado:
En los tiempos T1 y T2 se realiza el recuento de viables en el cultivo al cual se le agreg BQ14, obtenindose los siguientes resultados:MuestraDilucinVolumen sembradoColonias
T110-40.11000
10-50.2230
10-60.218
T210-30.2150
10-40.16
10-50.10
Se evala la incorporacin de distintos sustratos marcados radiactivamente por parte de la cepa sensible, en presencia y ausencia del antibitico BQ14
[35S] metionina[3H] timidina[3H] uracilo[14C] DAP
+ BQ1414900110015900110000
Sin antibitico150001700016500120000
Teniendo en cuenta los resultados anteriores:
a) Sabiendo que el max= 0.5 h-1 para el cultivo sin antibitico: Calcule el tiempo de generacin.
b) Describa brevemente los pasos a seguir para hacer un recuento de clulas viables.
c) Calcule UFC/mL en los tiempos T1 y T2 para el cultivo tratado con BQ14.
d) Clasifique a BQ14 segn su actividad sobre la cepa estudiada. Justifique
e) Qu procesos metablicos se ven afectados en presencia de BQ14? Justifique
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