efectos del entrenamiento de fuerza sobre la sensibilidad del músculo esquelético humano a la...

EFECTOS DEL ENTRENAMIENTO DE FUERZA SOBRE LA SENSIBILIDAD

DEL MÚSCULO ESQUELÉTICO HUMANO A LA LEPTINA

Hugo Olmedillas Fernández

INDICE q  Introducción q  Hipótesis q  Objetivos

q  Metodología

-Modificación del procedimiento elecroforético para la separación MHC

q  Resultados

q  Conclusiones q  Perspectivas de futuro

INTRODUCCIÓN

ü  ACSM 19981: Aconseja la necesidad de añadir sesiones de fuerza a los programas de entrenamiento teniendo como objetivo que los principales grupos musculares del cuerpo se ejerciten. ü  ACSM 20012: El mantenimiento de la masa muscular es un componente importante para lograr el éxito dentro de programas de entrenamiento que tengan como objetivo la pérdida de masa grasa. ü  NCSA 2001: Existen evidencias científicas que sugieren que la participación en programas de fuerza generan beneficios para la salud:

- Disminución de la presión sanguínea. - Leves mejoras en el perfil lipídico.

- Aumento de la tolerancia a la glucosa y mayor sensibilidad a la insulina.

MSSE 30(6):975-991, 1998; MSSE 33(12):2145-2156, 2001; MSSE 34(2):364-380, 2002; National Strength & Conditioning Association: 23(6), 9-23,2001

INTRODUCCIÓN

LEPTINA

ü  Dickie et al (1950), comunican la aparición en una de sus colonias de ratas, un mutante asociado con obesidad mórbida (ob/ob).

ü Coleman et al (1978), describen otra alteración genética en ratones, que consistía en la aparición de obesidad y diabetes y que fue denominado db/db.

ü  Zhang et al (1994), consiguen clonar el gen ob, que codifica para la leptina, una proteína de 167aa que se expresaba únicamente en el tejido adiposo.

ü Tartaglia et al (1995), logran clonar y secuenciar el gen db, que codifica para las distintas isoformas del receptor de leptina (OB-R).

Dickie MD, J Hered 1950; 41: 317-318; Coleman DL. Diabetologia 1978; 14: 141-148; Zhang et al, Nature 1994; 372: 425-432; Tartaglia et al Cell 83, 1263-1271.

Funciones de la leptina

v  Central

- Disminución del apetito

- Aumento gasto energético

v  Periférico

- Aumento oxidación A.G.

- Aumento captación de glucosa

- Aumento metabolismo basal

INTRODUCCIÓN

Argiles et al, Med Res Rev. 2005 Jan;25(1):49-65. Review. Zhang et al, Nature. 1994 Dec 1;372(6505):425-32. Erratum in: Nature 1995 Mar 30;374(6521):479.;

Isoformas del receptor de leptina

Lee et al., 1996; White y Tartaglia 1996 Tartaglia 1997; Chua et al., 1997.

INTRODUCCIÓN

ü  Isoformas cortas (OB-Ra,c,d,f)

ü  Isoformas secretada o soluble (OB-Re)

ü  Isoforma larga (OB-Rb)


q  Metodología


q  Resultados


1.  El entrenamiento de fuerza orientado a producir hipertrofia muscular se

asocia a un descenso de la masa grasa.

2. El entrenamiento de fuerza aumenta los niveles de expresión proteica de

receptores de leptina (OB-R) en el músculo esquelético humano.

3.  El entrenamiento de fuerza aumenta la sensibilidad a la leptina.

HIPÓTESIS

HIPÓTESIS

MÚSCULO ESQUELÉTICO

MÚSCULO ESQUELÉTICO

1.  El entrenamiento de fuerza orientado a producir hipertrofia muscular se

asocia a un descenso de la masa grasa.

3.  El entrenamiento de fuerza aumenta la cantidad de expresión proteica de

receptores de leptina (OB-R) en el músculo esquelético humano.

5.  El entrenamiento de fuerza aumenta la sensibilidad a la leptina.

6.  La sensibilidad muscular a la leptina está aumentada en los sujetos con

mayor porcentaje de fibras musculares de tipo I.

HIPÓTESIS


q  Metodología


q  Resultados


1.  Determinar la expresión proteica de OB-R en músculo esquelético

humano.

2. Investigar si el entrenamiento de fuerza altera los niveles de expresión de

los receptores musculares de leptina.

3. Estudiar si el entrenamiento de fuerza aumenta la sensibilidad a la leptina

en el músculo esquelético humano.

OBJETIVOS


q  Metodología


q  Resultados

q  Conclusiones q  Perspectiva de futuro

Variable

Edad (años) 34 ± 4.4 Altura (cm) 176 ± 2.8 Peso (Kg) 85 ± 12 BF (%) 23.8 ± 7.5

Sujetos:

8 Adultos (activos):

MATERIAL Y MÉTODOS

•  Test de fuerza: 1 Repetición máxima (1RM)

• Absorciometría fotónica dual de rayos-X (DXA) (Hologic QDR-1500)

•  Biopsia muscular (Técnica de Bergstrom)

•  D. fibras musculares

•  Kit ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay )

• Western Blot

Electroforesis

Histoquímica

MATERIAL Y MÉTODOS

Prensa Leg Extension Remo Sentado Press Banca ½ Sentadilla Tríceps Polea Alta Femoral

MATERIAL Y MÉTODOS 1RM

MATERIAL Y MÉTODOS DXA

ü  Masa grasa corporal (MGC)

ü Masa muscular corporal (MMC)

ü Masa muscular brazos (MMB)

ü Masa muscular piernas (MMP)

MATERIAL Y MÉTODOS Biopsia

MATERIAL Y MÉTODOS

Programa de entrenamiento

Determinación de fibras musculares

•  Histologica - ATPase

•  Electrophoresis - SDS-PAGE (Sodium Dodecil Sulfate Polyacrilamide Gel Electrophoresis)

4.3 4.6 10.3

1 1 5 Tipo I 1 3 1 Tipo IIc 5 5 1 Tipo IIa 5 3 1 Tipo 2ax 5 1 1 Tipo 2x

ATPase Technique

4.6

4.3

10.3

I

IIx

IIa

SDS-PAGE

Enhanced protein electrophoresis technique for separating human skeletal muscle myosin heavy chain isoforms. Bamman J Physiol. Sci. Vol. 56, No. 5; Oct.2006

Isoformas cadena pesada de miosina (MHC)


q  Metodología


q  Resultados

q  Conclusiones q  Perspectiva de futuro

Problemas

I La expresión de mRNA de OB-R en músculo esquelético humano ya había sido descrita (Ceddia, et al 2001). Aunque se desconocía sí existía expresión proteica de las isoformas de OB-R en este tejido (Guerra et al, 2007).

II Dificultad de establecer la distribución de las fibras en el músculo esquelético humano. Mediante la técnica electroforética somos capaces de determinar las isoformas de la cadena pesada de miosina (MHC).

I OPTIMIZACIÓN DEL WESTERN BLOT PARA OB-R

•  Tampón de extracción de proteínas: UREA 6M-SDS 1%

• Electroforesis: No > 90 min.

• Incubación con anticuerpo primario: la incubación con rabbit-anti-OB-R O/N a 4ºC 1:2000 en tampón de bloqueo (leche desnatada al 5% diluida en TBS-Tween 0.1%).

•  Lavados: TBS-Tween 20 (0.2%) para disminuir el ruido de fondo.

•  Incubación con anticuerpo secundario: la incubación con el anti-rabbit-HRP 1 hora R.T. a 1:20.000 en tampón de bloqueo.

Guerra et al, 2007

II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC

1. VARIABLES EN LA MUESTRA

2. VARIABLES EN EL GEL

ü  Degradación extracto proteico


VARIABLES EN LA MUESTRA


ü  Selección de la muestra



ü Degradación extracto proteico


ü  Buffer de extracción





ü  Buffer de extracción

ü  Cuantificación de proteínas



1. VARIABLES EN LA MUESTRA

2. VARIABLES EN EL GEL


ü Protean II; Mini-protean III


VARIABLES EN EL GEL


ü  Grosor del gel


VARIABLES EN EL GEL



ü Separating gel


VARIABLES EN EL GEL



ü Separating gel

ü 2-Metamercaptoethanol o Dithiothereitol (DTT)


VARIABLES EN EL GEL



ü Separating gel

ü 2-Metamercaptoethanol o Dithiothereitol (DTT)

ü 30% Glicerol


VARIABLES EN EL GEL




ü Separating gel

ü 2-Metamercaptoethanol o Dithiothreitol (DTT)

ü 30% Glycerol

ü  Running Buffer

VARIABLES EN EL GEL

Running Buffer

•  Lower Running Buffer (LRB)

50mM Tris, 75 mM glycine, 0.05%SDS

• Top Running Buffer (TRB) 2x TRB

6x TRB

Electrophoretic Separation of Human Skeletal Muscle Myosin Heavy Chain Isoforms: The Imporatance of Reducing Agents. T.A. Kohn, K. H. Myburgh. J. Physiol Sci Vo.56, No. 5; 2006; pp.355-360

6X (Kohn et al, 2006) 2X Comercial


6X Comercial




ü Separating gel

ü  30% Glycerol



ü Temed

VARIABLES EN EL GEL

TEMED 0.03%

TEMED 0.1%


TEMED 0.25%

TEMED 0.05%




ü Separating gel

ü  30% Glycerol



ü Temed

ü Tinción del gel

VARIABLES EN EL GEL

SILVER

COOMASSIE

Western Blot

Type IIa

Type IIx

Type I


Tinción del gel

MHC



q  Metodología


q  Resultados


1RM MIEMBROS SUPERIORES

RESULTADOS

1RM

(kg)

A B AB A B

P. BANCA REMO EXT.TRICEPS

*

** 36%

1RM MIEMBROS INFERIORES

RESULTADOS

A B AB A B

1RM

(kg)

PRENSA ½ SQUAT L.E.

*

*

*

14%

GRASA CORPORAL RESULTADOS

A B

Gra

sa C

orpo

ral (

%) *

LEPTINA RESULTADOS

*

Lept

in C

once

ntra

tion

(ng/

mL)

A B

P=0.002

OB-R RESULTADOS

170KDa 128KDa 98KDa

A AB A BB

OB

-R/a

lpha

-Tub

ulin

ban

d de

nsity

(a

rbitr

ary

units

)

P= 0.33

P= 0.64

P= 0.43

RESULTADOS

MMC

A B

MM

C (k

g)

P= 0.46


q  Metodología


q  Resultados


CONCLUSIONES

ü Hemos identificado OB-R en músculo esquelético humano.

ü Hemos mejorado la técnica electroforética permitiendo la identificación de las tres isoformas de MHC en músculo esquelético humano de forma reproducible.

ü Tras un programa de 12 semanas de entrenamiento de fuerza se produce una reducción de la masa grasa y una disminución significativa de la concentración de leptina en suero, pero la expresión proteica de OB-R no cambia.

CONCLUSIONES

ü  Los resultados son compatibles con un aumento de la sensibilidad a la leptina en músculo esquelético humano en respuesta al entrenamiento de fuerza.


q  Metodología


q  Resultados


1. Analizar eletroforéticamente todas las fibras musculares

de las muestras que tenemos en el laboratorio (± 300).

2. Conocer las vías de señalización activadas por el OB-Rb

en respuesta al ejercicio.

3. Localizar histoquímicamente el OB-R en la fibra

muscular.

PERSPECTIVAS DE FUTURO

200X_ Goat anti Rabbit 200X_ Rabbit antiOBR

400X_ Rabbit antiOBR

25µm 25µm

25 µm

Localizar histoquímicamente el OB-R en la fibra muscular

ATENCIÓN

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