Pontificia Universidad Catlica de ValparasoFacultad de Ciencias Instituto de Biologa

Participacin del Sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona (RAAS) en el Desarrollo Renal de embriones de Pollo: Efecto de un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina (ACE) sobre el mesonefros en desarrollo.

Trabajo de titulacin para optar al grado de Licenciado en Educacin y al Ttulo de Profesor de Biologa y Ciencias Naturales.

Natalia Alejandra Olivares RosProfesor Gua: Vctor Moya Silva. Profesor Co Gua: Alexis Gonzlez Parra.

Abril del 2015Indice

1. Agradecimientos....42. Abreviaturas.......53. Resumen.........74. Introduccin .......94.1 Bases moleculares del desarrollo metanfrico caracterizado en mamferos..104.1.1 Factor de crecimiento derivado de neuroglia ( GDNF ) / C-RET104.1.2Factor de crecimiento de Fibroblasto (FGF).124.1.3 Wnt...134.1.4 Protena Morfognica sea (Bmp)...134.2 Efectos del Sistema Renina Angiotensina (RAS) en el desarrollo renal.......145. Pregunta, hiptesis, objetivos ...196. Materiales Y Mtodo.206.1 Incubacin .... .206.2 Tratamientos ..206.3 Anlisis post-tratamiento....216.3.1 Estudio estructural macroscpico.216.3.2 Estudio estructural microscpico del mesonefro..216.3.2.1 Tcnicas histoqumicas ....226.3.2.2 Tecnicas inmunohistriqumicas ........236.3.2.2 Western blot.......246.4 Anlisis estadstico......267. Resultados ....277.1 Resultados genereles de la incubacin ...277.2 Resultados de los efectos del captopril sobre el desarrollo mesonfrico de los embriones de pollo, estudios macroscpicos297.3 Determinacin del receptor de Angiotensina II en mesonefros de embriones de pollo ..327.4 Estudio de homologa entre receptores de Ang II para pollo, humano, rata y ratn..357.5 Anlisis de la estructura microscpica de los mesonefros..........378. Discusiones...429. Proyecciones 4510. Conclusiones ......4611. Referencias bibliogrficas .47

1. Agradecimientos Sin duda soy una agradecida de Dios por permitime en estos momentos estar terminando una etapa tan importante en mi desarrollo personal. Pero no puedo dejar de agradecer a todas las persona que de una u otra forma han permitido que este trabajo haya terminado de buena manera, brindado su ayuda de manera incondicional en las diferentes etapas.Agradecer al profesor gua, el Sr. Victor Moya y al profesor co-gua el Sr. Alexis Gonzales por la orientacin, el apoyo, la forma de trabajo y la dotacin de materiales que fueron fundamentales en el desarrollo de esta tesis. Al profesor Christian Tapia por realizar los contactos para la obtencin del principio activo del captopril Al Sra Monica Reyes del laboratorio Sanitas por la donacin del principio activo de captopril, esencial para concretar este trabajo. A la Sra Veronica Rojas por facilitar las dependencias del laboratorio de tcnicas histolgicas. A la Sra. Edith Mndez por las asesorias en tcncas histolgicas desde el inicio de este trabajo. A la Sta. Valentina Ansaldi por el apoyo en el trabajo experimental.Al Sr Ricardo Pefaur por la asesora en los anlisis estadsticos de los resultados. A la Sra. Carmen Tobar por realizar el montaje de las imgenes que fueron esenciales para la obtencin de los resultados microscpicosSin duda agradecer a mi familia que ha sido un pilar fundamental durante esta etapa culmine de la carrera, me han dado el apoyo moral y junto a mi novio me han contenido emocionalmente en los momentos mas dificiles.

AbreviaturasRAAS: Sistema renina angiotensina aldosterona UB: Brote uretralM. METMesenquima metanfricoGDNFFactor de crecimiento derivado de neurogla FGF Factor de crecimiento fibroblasticoBMPProtena morfognica osea o del hueso ACEEncima convertidora de angiotensina EGFRReceptor de crecimiento epidrmico ANGAngiotensina Ao Angiotensingeno ANG IAngiotesina IANG IIAngiotensina IIRPRReceptor de pro-reninaAt1Receptor de angiotensina II tipo 1 presente en mamferosAt2Receptor de agiotensina II, tipo 2 presentes en mamferosAtcReceptor de angiotensina II presente en aves LifFactor inhibidor de la leucemia P.IPeso inicial P.FPeso final BSAAlbmina de suero fetal de bovinoTAmb Temperatura ambienteAc 2 Anticuerpo secundario Ac 1Anticuerpo secundarioDAB 3,3-diaminobencidina tetrahidroclorada.CDCorpusculo renal

2. Resumen Hoy en da se sabe que el sistema renina angiotensina Aldosterona (RAAS) cumple un rol fundamental en el desarrollo embrionario, especificamente a nivel renal, en donde se ha descrito que cualquier mutacin en los genes que alteren la expresin del RAAS ocacionan malformaciones en el desarrollo renal como: hipoplasia papilar renal, hidronefrosis, problemas en la concentracin de la orina, entre otras. En nuestro estudio se puso a prueba la hiptesis de que la inhibicin de la encima convertidora de angiotensina II (ACE) altera el normal desarrollo de las estructuras renales en embriones de pollo, se propusieron los siguentes objetivos: Determinar la presencia de receptores de angiotensina II en el mesonefros de embriones de pollo de 14 das de incubaciny el segundo objetivo, evaluar el efecto del tratamiento con captopril, un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina (ACE) sobre la estructura del mesonefros de embrin de pollo, desde una perspectiva anatmica y microscpica. Para lograr los objetivos los huevos fueron incubados durante 14 das a 37,5 C , se trataron cada 24 hrs. a contar de las 48 hrs. de incubacin hasta las 336 hrs. (14 das) con captopril en una dosis de 5 mg de captopril por cada kg de peso hmedo del embrin. Para el anlisis de las muestras post tratamientos, se realizaron mediciones macroscpicas las que nos arrojaron que los embriones tratados con captopril han experimentado un aumento del: 24% en el peso hmedo, 8,58% en la longitud con respeto al control, los riones de los embriones tratados presentaron un aumento de: 23,79 % de la longitud , un 25,43 % del ancho, un 6,00% del rea y un 43,33 % en el peso con respecto a los riones de los embriones control, considerando un p 0,05. Para las mediciones microscpicas se utilizaron cortes longitudinales de embriones de pollo los cuales fueron teidos con tecnicas histoqumicas (hematoxilina eosina o PAShiff). Y las mediciones arrojaron que hay un aumento de tbulos en el mesonefros. En la zona ceflica los embriones tratados presentaron un aumento del 200%; en la zona media los embriones tratados presentaron un aumento del 42,57%; en la zona caudal los embriones tratados presentaron un aumento del 58,64% en la cantidad de tbulos con respecto al control considerando un p 0,05. Para determinar la presencia de resceptor de ANG II en mesonefros de embrin de pollo se realizaron inmunohistoqumicas que revelaron la presencia de un receptor tipo 1 en mesonefros de embriones de pollo, para validar el uso de anticuerpos de mamiferos en pollos se realiz un western-blot, el que indico que el receptor presente en pollos posee un rango de PM similar al de los mamiferos (40 Kd) y un anlisis de secuencia de los receptores de ANG II en pollos y en mamiferos la que nos indica que hay sobre el 75% de homologa Los resultados nos indican que un tratamiento crnico con IECA puede alterar el desarrollo normal de los embriones y del metanefros de pollo mediado por la accin del receptor de ANG II tipo 1 en pollos (ATc).

Palabras claves: Angiotensina II; Desarrollo renal; Enzima convertidora de angiotensina; Receptor AT1

3. IntroduccinLa mayor parte de las estructuras del sistema urogenital de los vertebrados, incluido el rin derivan del mesodermo intermedio.(Cherawsky, Sequeira, and Gmez 2002; Fernndez et al. 1996) al describir el desarrollo renal en aves y mamferos presenta tres estados en el desarrollo conocidas como; Pronefro, mesonefros y Metanefros. (Cherawsky et al. 2002) El pronefro en pollos se forma habitualmente a las treinta y seis horas de incubacin, corresponde al primer rgano excretor y degenera rpidamente. Comienza con la formacin de un cmulo de clulas macizas, da lugar a los tbulos pronfricos, el extremo libre sufre una curvatura hacia la seccin caudal del embrin formando un conducto macizo de clulas que se convertir en el conducto pronfricos que llevar lquidos filtrados hacia la cloaca. (Patten, B.M. 1920) En cuanto a las anormalidades en el desarrollo del pronefro puede generar agenesia renal, agenesia ipsilateral del pulmn y glndula suprarrenal.(Cherawsky et al. 2002; Fernndez et al. 1996)El mesonefros en pollos se forma habitualmente en pollos de 29 a 30 somitos a las 55 horas de incubacin. Se ubica de forma caudal al pronefro, los tbulos mesonfricos aparecen primero como racimos de clulas formadas en el mesodermo intermedio, mientras tanto el conducto mesonfrico ha comenzado el proceso de ahuecamiento para establecer un lumen ya definitivo. Los tbulos se forman en la zona contigua al pronefro y luego continan su desarrollo hacia la zona caudal, a medida que avanza el desarrollo mesonfrico comienza el proceso de degeneracin del pronefro. (Cherawsky et al. 2002; Fernndez et al. 1996)Luego de un periodo breve de funcionamiento el mesonefros comienza su degeneracin en direccin cfalo-caudal, dejando de existir como un rgano excretor, (Cherawsky et al. 2002) pero hay algunas estructuras del mesonefros que permanecen en machos y hembras, en el caso de los machos el conducto mesonfrico da origen a porciones del epiddimo y a los conductos deferentes, mientras que los tbulos mesonfricos, dan origen a conductos eferentes en las gnadas. En el caso de las hembras, los conductos mesonfricos pueden ser encontrados como estructuras vestigiales que no poseen funcin conocida, esto puede ocasionar quistes y anormalidades en el desarrollo del tracto reproductor femenino. (Cherawsky et al. 2002; Fernndez et al. 1996).Las principales estructuras implicadas en el desarrollo metanfrico son; el mesnquima metanfrico (M. MET) y el brote uretral (UB), el UB es una bifurcacin del conducto mesonfrico (conducto de Wolff) y dar origen a los urteres calices mayores, menores y la ramificacin de los tbulos colectores. Por otro lado el M. MET dar origen a las estructuras de la nefrona, como tbulos contorneados y diferentes procesos del asa del henle.(Burrow 2000; Fernndez et al. 1996; Kuure, Vuolteenaho, and Vainio 2000; Lechner and Dressler 1997; Rosenblum 2008; Yu, McMahon, and Valerius 2004) . En el desarrollo del rin definitivo participan diversos genes y seales que han sido descritos en mamferos incluidos humanos y ratas (Burrow 2000; Fernndez et al. 1996; Kuure et al. 2000; Lechner and Dressler 1997; Rosenblum 2008; Yu et al. 2004).4.1 Bases moleculares del desarrollo metanfrico caracterizado en mamferos El rin maduro se forma a partir del Metanefros por una serie de complejas inducciones recprocas entre la UB y M. MET. (Burrow 2000; Fernndez et al. 1996; Kuure et al. 2000; Lechner and Dressler 1997; Rosenblum 2008; Yu et al. 2004) Wnt 11 es un factor transcripcional expresado en el UB, que acta como un marcador para la bifurcacin y crecimiento del UB desde el conducto mesonfrico o de Wolff (Burrow 2000; Fernndez et al. 1996; Kuure et al. 2000; Lechner and Dressler 1997; Rosenblum 2008; Yu et al. 2004) una vez que se he formado el UB se puede encontrar la expresin de Wnt11 restringido a la punta del UB. (Burrow 2000; Fernndez et al. 1996; Kuure et al. 2000; Lechner and Dressler 1997; Rosenblum 2008; Yu et al. 2004)4.1.1 Factor de crecimiento derivado de neuroglia ( GDNF ) / C-RETLa seal se compone de un gen codificante para GDNF (factor de crecimiento derivado de neuroglia), este es sintetizado en el M. MET y acta mediado por un receptor de tipo tirosn quinasa denominado c-Ret, este es sintetizado en el tejido epitelial del UB. El gen Wnt11 es sintetizado en la punta del UB y sintetiza una glicoprotena Wnt11, esta acta sobre el M. MET induciendo y manteniendo en el tiempo la expresin del gen GDNF. (Majumdar A et al. 2003) Esta seal es la principal responsable del crecimiento constante del UB. (Burrow 2000; Fernndez et al. 1996; Kuure et al. 2000; Lechner and Dressler 1997; Rosenblum 2008; Yu et al. 2004) La seal GDNF/C-Ret/Wnt11, es regulada por otras seales y genes. (Basson Ma et al 2005; Grieshammer U et al.2004; Li X et al. 2003; Majumdar A et al. 2003; Rosenblum, 2008; Sainio K et al.1997;Xu P-X et al. 1999; Yu et al. 2004)En el mesnquima metanfrico hay una serie de seales implicadas en la regulacin de expresin de GDNF. Uno de los primeros genes en iniciar la cascada regulatoria es Foxc1, el cul regula de forma negativa la expresin del gen Eya 1. (Li X et al. 2003), Eya 1 presenta actividad fosfatasa y activa la expresin de genes que controlan procesos tanto de crecimiento como de induccin primaria, crticos en la sealizacin implicadas en la formacin del rin. (Xu P X et al. 1999; Li X et al. 2003) Eya1 activa a Six1, lo que permite la co-activacin de otros genes, entre ellos el Pax2. (Rosenblum, 2008) Pax2 regula positivamente la expresin de GDNF en el M. MET (Rosenblum, 2008) y estimular la expresin endgena del gen Wt1, factor transcripcional esencial en el control de la apoptosis (Sainio K et al.1997 ; Xu P-X et al. 1999).Uno de los reguladores negativos de la seal GDNF/c-Ret es Sprouty 1 (Spry 1). Spry1 es secretado por las clulas del M. MET y se caracteriza por ser un inhibidor endgeno de la actividad tirosn quinasa del receptor c-Ret. (Basson Ma et al. 2005; Rosenblum, 2008)En el UB se sintetiza el receptor de tirosn quinasa c-Ret para el ligando de GDNF. (Majumdar A et al. 2003) Tambin se sintetizan dos seales que son de suma importancia, el Wnt11 que al ser expresado mantiene constante la expresin del gen GDNF postulndose como autoregulador positivo de la seal GDNF/c-Ret (Majumdar A et al. 2003) El UB secreta Slit2 el cual acta sobre el receptor ROBO2 localizado en el mesnquima metanfrico. Esta seal regula de forma negativa la expresin de GDNF, delimitando el dominio de la expresin, otorgando la orientacin y el nmero adecuado de UBs (Grieshammer U et al. 2004). En sntesis el complejo GDNF/c-RET/Wnt1, es responsable del crecimiento permanente del UB y al ser regulado de forma negativa restringe el crecimiento del mismo, evitando la produccin de anomalas en el desarrollo de los tbulos colectores, urteres y rin en general. (Rosenblum 2008; Yu et al. 2004)4.1.2 Factor de crecimiento de Fibroblasto (FGF)El UB secreta factor de crecimiento de fibroblasto 2 (FGF2) y protena morfognica del hueso 7 (BMP7), los cuales inducen la expresin de factores de transcripcin Hoxa-1/ c-11/ d-11 y Wt1 en el mesnquima metanfrico, estos factores marcan las clulas que entrarn en el proceso de diferenciacin celular, mantienen la induccin del UB e inhiben la apoptosis. (Burrow 2000; Kuure et al. 2000; Rosenblum 2008; Yu et al. 2004)El FGF2 acta como un marcador que permitir la accin posterior del factor inhibidor de la leucemia (Lif). (Rosenblum 2008; Yu et al. 2004). La expresin de Lif es necesaria para iniciar la condensacin del mesnquima y posterior tubulognesis, Lif induce la diferenciacin de clulas progenitoras mesenquimales, activando STAT3 mediante la ruta de sealizacin JAK / STAT que a su vez pueden activarse por un gran nmero de factores de crecimiento y citoquinas secretadas. (Honghe Wang et al 2010)El factor de crecimiento fibroblstico 7 (FGF 7), es secretado por el M. MET y es esencial en el desarrollo papilar del rin, acta sobre el UB para dar origen a los clices y papilas renales, mantiene el crecimiento epitelial uretral y asegura el nmero de nefronas apropiados en el rin. (Burrow 2000; Kuure et al. 2000; Rosenblum 2008; Yu et al. 2004)El factor de crecimiento fibroblstico 10 (FGF 10) es secretado por el UB y acta sobre la nefrona en desarrollo, potenciando el desarrollo del asa de Henle. (Burrow 2000; Kuure et al. 2000; Rosenblum 2008; Yu et al. 2004). Antes de la accin de FGF10, se requiere la expresin de Lim1 y Brn1, dos factores de transcripcin que actan como marcadores regionales en la nefrona, (Kobayashi A et al.2005; Nakai S, 2003). Lim 1 se expresa en el mesodermo intermedio, conducto nfrico, tbulos mesonfricos, BU, agregados pretubulares y sus derivados, especficamente en la seccin proximal de la nefrona (Kobayashi A et al.2005), Brn 1, tambin se expresa en los cuerpos en forma de S y marca las secciones distales de la nefrona. (Asa de Henle y tbulo contorneado distal). (Nakai S, 2003).4.1.3 WntLa familia de Wnt, se encuentran presentes en todas las etapas del desarrollo renal. El Wnt 1 acta en la diferenciacin de los segmentos del nefrn, as como tambin en el desarrollo glomerular, existe evidencia de que Wnt 1 influye tanto en estructura como en el nmero de glomrulos. (Burrow 2000; Kuure et al. 2000; Rosenblum 2008; Yu et al. 2004) El Wnt6 es secretado por el brote uretral y actan sobre el mesnquima metanfrico, (Rosenblum 2008; Yu et al. 2004) durante el proceso de induccin las clulas mesenquimales se condensan alrededor de la punta del UB que est en crecimiento, se dividen en dos agregados comenzando el proceso de ramificacin. (Rosenblum 2008; Yu et al. 2004). Las clulas epiteliales que se diferencian de forma ms tempranas forman un quiste esfrico llamado vescula renal. Recientes anlisis de la expresin gnica de Cadherina indica que la vescula renal ya est modelada de tal manera que las clulas adyacentes a la yema uretral expresan la molcula de adhesin E-Cadherina y clulas ms distales de la yema expresan K-Cadherina. Las vesculas renales se someten a una serie de invaginaciones y alargamientos para generar los cuerpos en S. La sntesis de laminina, colgeno tipo IV y receptores para laminina, son esenciales para la formacin de lmina basal y posterior formacin de epitelio en los cuerpos en forma de S (Burrow 2000; Rosenblum 2008; Yu et al. 2004). 4.1.4 Protena Morfognica sea (Bmp) La protena morfognica sea 7 (BMP 7), es secretada por el BU, tiene dos acciones claramente definidas, la primera es la participacin en la formacin de epitelios de los cuerpos en forma de S y la segunda es asegurar el nmero adecuado de nefronas para el correcto funcionamiento del rin definitivo. (Burrow 2000; Kuure et al. 2000; Rosenblum 2008; Yu et al. 2004) La protena morfognica sea 4 (BMP 4) es secretado por el M. MET y acta modulando la ramificacin del UB, acta como un antagonista de seales GDNF, restringiendo la ramificacin del conducto a los sitios apropiados. (Burrow 2000; Kuure et al. 2000; Rosenblum 2008; Yu et al. 2004)4.2 Efectos del Sistema Renina Angiotensina (RAS) en el desarrollo renal.El RAS, se compone de renina, angiotensingeno (Ao), angiotensina (ANG I), la cual es hidrolizada por la enzima convertidora de angiotensina (ACE) formando la angiotensina II (ANG II). Esta ltima es la principal hormona peptdica efectora actuando a travs de dos tipos de receptores acoplados a protena G (Kempf et al. 1996), el AT1 y el AT2. (Contreras et al. 2000; Yosypiv 2004, 2009) Hoy en da hay una gran gama de informacin sobre el efecto de sistema renina angiotensina (RAS) sobre el sistema cardiovascular, entre ellos se puede destacar la presencia de receptores para ANG II y si se administran antagonistas de ANG II se genera una desarrollo menor en las paredes ventriculares y disminuye la dilatacin del corazn, por otra parte, se detect anomalas en la curvatura del corazn, lo que nos indica que RAS tiene efectos considerables en el desarrollo cardiaco. (Price et al. 1997) Hay evidencia sobre la participacin del RAS en diversos aspectos del desarrollo embrionario, entre ellos se pueden mencionar: la induccin del desarrollo renal, controlando el crecimiento del UB (Iosipiv and Schroeder 2003; Yosypiv 2004, 2005, 2008; Song et al. 2010 Song, Preston, and Yosypiv 2011) y el sistema colector (Yosypiv 2008; Yosypiv Dahr SS. 2005); procesos hematopoyticos, alterando la angiognesis embrionaria (Hubert et al. 2006). La ANG II se caracteriza como un regulador fisiolgico de la eritropoyesis, mediado por AT1, actuando como factor de crecimiento para progenitores elitroides aumentando la masa de los glbulos rojos. Induce la secrecin de eritropoyetina independiente del incremento de los hematocritos. Si la ACE o el AT1 son inhibidos, disminuyes los hematocritos causando anemias en los organismos. (Vlahakos et al. 2010) Dentro de la evidencia existente, se hace alusin a la participacin del RAS en el desarrollo renal, controlando el crecimiento del UB (Iosipiv and Schroeder 2003; Yosypiv 2004, 2005, 2008; Song et al. 2010 Song, Preston, and Yosypiv 2011) y el sistema colector. (Yosypiv 2008; Yosypiv Dahr SS. 2005) Se ha demostrado que mutaciones o alteraciones en la expresin de genes asociados a componentes del RAS estn relacionados con malformaciones o alteraciones renales como: hipoplasia papilar renal, hidronefrosis, problemas en la concentracin de la orina. (Yosypiv 2004) En mamferos la ANG II acta en el desarrollo renal mediante la activacin de los receptores AT1 y AT2. (Butkus el at. 1997) AT1 y AT2 poseen patrn de distribucin espacial y temporal diferentes, (Gimonet et al. 1998) estudios realizados en especies ovinas nos demuestran que AT1 se puede encontrar en, clulas mesengiales, y en clulas intersticiales de la corteza y medula durante la nefrognesis (60 das de gestacin), este receptor tambin se expresa una vez terminada la nefrognesis y su disposicin est establecida en la franja interna de la medula externa. El receptor AT2 solo se expresa durante la nefrognesis (40 a 131 das de gestacin), en tejidos intersticiales perifricos del metanefros y en epitelios presentes en la mcula densa. (Butkus el at. 1997)En aves la ANG II acta mediante la activacin de un receptor denominado ATc (Kempf et al. 1999), el cual se expresa tanto en pollos adultos como en embriones. En pollos adultos ATc se expresa en tejidos como: glndula adrenal, corazn, rin y en clulas endoteliales. (Kempf et al. 1996) Mientras que, en embriones se ha descrito en: mesonefros, alantoides, corazn, arcos branquiales y extremidades (Kempf et al. 1999). Se postula que el receptor de ANG II en aves es una nueva clase de receptor, esto basado en que ATc posee un patrn de distribucin diferente al de los mamferos y adems se ha establecido que estos receptores poseen caractersticas farmacolgicas distintas a los mamferos. (Herv and Pierre 2001)Tambin se ha determinado la presencia de ANG, ya sea ANG II o angiotensingeno (Ao), en mamferos y en aves. En el caso de los mamferos se puede destacar la presencia de ANG II y Ao, en la especie ovina se ha establecido la expresin de todos los genes componentes de la RAS, angiotensina, Ao, ANG II, AT1, AT2, entre otros, tanto en mesonefros, como en metanefros (Wintour et al. 1998). Por otro lado, la expresin gentica de los componentes de la RAS se ha establecido en la metanefrognesis, principalmente en el UB y en el estroma circundante. (Iosipiv and Schroeder 2003; Song et al. 2011; Yosypiv 2004, 2008, 2014)En ovinos la ANG II estimula la morfognesis y la supervivencia celular mediante la accin de los receptores AT1 y AT2. (Gimonet et al. 1998) El mesonefros ya tiene la capacidad de sintetizar y secretar todos los componentes del RAS (renina, ANG, (Ao), ACE). (Wintour et al. 1998) En ratas se ha observado que la inactivacin o mutaciones de componentes del RAS, generan una disminucin en la ramificacin del UB provocando malformaciones en el rin, como hipoplasia papilar renal, hidronefrosis, problemas en la concentracin de la orina. (Yosypiv 2004). Por otro lado en cultivos celulares al ser sometidos a tratamientos con antagonistas de AT1, se genera una ramificacin escasa (Iosipiv and Schroeder 2003). En ratas la ANG II podra estimular la morfognesis y la ramificacin del brote uretral, as como tambin la migracin celular mediante la activacin del receptor de crecimiento epidermal (EGFR) por fosforilacin (Song et al. 2011; Yosypiv 2008). Se ha planteado tambin que algunas de las acciones de la ANG II mediadas por el receptor AT1 sobre el desarrollo renal podran estar con el receptor de pro-renina (RPR). Se ha pensado que la accin del RPR mediada por el receptor AT1 induce la regulacin a la baja de RPR, el RPR se expresa principalmente en estructuras como el brote uretral, urteres, conductos colectores.(Song et al. 2013)La ANG II tambin estimula la proliferacin y supervivencia de las clulas del UB, mediante la activacin del AT2. (Song et al. 2010) Se ha observado que el tratamiento con agonistas de AT2 puede aumentar el patrn de ramificacin del UB, mientras que, el tratamiento con antagonistas de AT2 inhiben la ramificacin y disminuyen la expresin de GDNF /c-ret/ wnt11 y spry 1. (Song et al, 2010). Hoy en da los inhibidores de la ACE, estan contraindicados durante el periodo de embarazo, porque puede ocasionar una serie de problemas en el desarrollo del feto, como por ejemplo: retraso en el crecimiento intrauterino, alteraciones respiratorias, circulatorias, malformaciones oseas, renales, entre otras. Las evidencias quedan a la vista despus de hacer pruebas en animales y documentar los efectos causados en el humano que sern presentadas a continuacin. En ovejas un suministro constante de captopril induce a una disminucin del flujo sanguineo feto-placentaria y hay un aumento en la resistencia vascular de la placenta, (Soares D M et al, 1995) mientras que el enalapril y/o captopril pueden generar otras anomalas fetales como muerte inesperada, anomalias esquelticas, expansin pulmonar producto de afixia durante el parto. (Rosenthal T, Oparil S, 2004) Cuando se suministra captopril a corderos y conejos al finalizar el embarazo se genera un aumento en la mortalidad y en el caso de los conejos se ha observado un aumento en el tiempo de gestacin. Se ha medido adems que hay una disminucin en las prostaglandinas, las cuales son escenciales para mantener el flujo sanguineo entre la placenta y el feto. (Rosenthal T, Oparil S, 2004)En el caso de los humanos se han estudiando casos en donde las madres han estado sometidas a tratamientos para la hipertensin, en embarazos de 33 semanas se ha evidenciado un progresivo retraso en el crecimiento fetal, anomalias como el oligohidramnios y la anuria neonatal, hidroplasia pulmonar y posible muerte fetal asociadas al efecto de estos medicamentos. Otros estudios han demostrado que mujeres que han estado expuestas a captoprio o lisinopril los fetos han presentado disgenesia tubular renal, disminucin en el crecimiento de la bobeda craneana, hipotensin / hipoxia. (Rosenthal T, Oparil S, 2004)En el caso de las aves el tratamiento agudo con captopril ha generado una serie de efectos en el desarrollo embrionario, a nivel sistmico se ha visto alterada la osmorregulacin de los iones de sodio y potasio, los riones metanfricos han visto aumentado su peso humedo en un 11% con respecto al control y adems los embriones de 19 das han presentado hipotensin. (Mueller, C.A., et. Al. 2014)Los antecedentes antes mencionados demuestran que hay una modulacin de RAS durante el desarrollo renal pudiendo generar dialogo cruzado con otros receptores que son determinantes en el proceso de organognesis. El conocimiento de la posible participacin del RAS en el desarrollo renal de aves resulta relevante ya que, el embrin de pollo es uno de los modelos de estudio del desarrollo en vertebrados, llegando a ser una alternativa til para el estudio del desarrollo tanto normal como anormal del desarrollo renal.

4. Pregunta, hiptesis, objetivosPregunta:Si la enzima convertidora de Angiotensina (ACE) se enacrga de la formacin de la Angiotensina II y esta ha sido implicada en la regulacin del desarrollo renal, podr el tratamiento crnico de embriones de pollo con la IACE afectar el desarrollo renal? Hiptesis: La inhibicin de la ACE altera el normal desarrollo de las estructuras renales en embriones de pollo. Objetivos:1.- Determinar la presencia de receptores de angiotensina II en el mesonefros de embriones de pollo de 14 das de incubacin.2.- Evaluar el efecto del tratamiento con captopril, un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina (ACE) sobre la estructura del mesonefros de embrin de pollo, desde una perspectiva anatmica y microscpica

5. Materiales Y Mtodo 6.1 Incubacin Se trabaj con huevos fecundados de la variedad Bovans, obtenidos en la avcola Arizona localizada en la comuna de Quilpu V regin. Se realizaron incubaciones a distintos tiempos para determinar los pesos de los embriones y los estados de desarrollo segn Hamburger and Hamilton (1951).Previo a la incubacin los huevos fecundados fueron limpiados cuidadosamente y luego incubados en posicin vertical por el tiempo deseado en una estufa Binder, modelo BD115 a 37C y una humedad relativa entre 70 y 80% y eran volteados 2 veces al da. Segn protocolo descrito (Dohle et al. 2009 y Mueller C et al.,2013).6.2 TratamientosPara evaluar el efecto del inhibidor del RAAS sobre el desarrollo del mesonefro, se realizaron inoculaciones en 2 grupos de huevos a travs de un orificio en la cmara de aire. Las inoculaciones se realizaron cada 24 hrs., y se iniciaron a las 48 hrs. de incubacin hasta el da 14.Experimentalmente se definieron 2 grupos: un grupo control y otro tratado. El grupo control (15 huevos), el cual fue inoculado con 200 ul de suero fisiolgico (SF) cada 24 hrs, mientras que el grupo tratado fue inoculado con 200 ul de captopril a una dosis de 5 mg por cada Kg de peso en SF (las concentraciones oscilaron entre 5*10-4 y 0,05 mg de captopril). EL captopril es un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina encargada de convertir la angiotensina en angiotensina II y la dosis se escogi en base al trabajo previo publicado por (Mueller C et al.,2013).

6.3 Anlisis post-tratamientoPara evaluar el efecto del tratamiento sobre el desarrollo del mesonefro se realizaron una serie de anlisis.6.3.1 Estudio estructural macroscpicoAl da 14 los huevos fecundados fueron sacrificados incubndolos a -4C por 20 min., luego de lo cual se extrajo a los embriones que fueron pesados, fotografiados y disectados.El peso hmedo de los embriones y los mesonefros se determin en una balanza que nos permita una presicin de 0,01 gr y estudiados mediante una lupa estereoscpica Modelo Cambrige Instruments, modelo Z45E y luego fotografiados con una cmara Olympus, modelo C-5060 wide zoom para determinar su estado de desarrollo segn Hamburger and Hamilton (1951).A partir de las fotografas se determin: el largo de los embriones, as como tambin el largo, ancho y rea de los mesonfros, Las mediciones se realizaron utilizando el programa de anlisis de imgenes JAVA conocido como ImageJ desarrollado en Natinal Institutes of health.6.3.2 Estudio estructural microscpico del mesonefroPara analizar los efectos de tratamiento con captopril sobre las estructuras del mesonefro se consideraron los siguientes parmetros: nmero y tamao de corpsculos renales, nmero y tamao de los tbulos proximales, tbulos distales y colectores. Para los recuentos, se consider el nmero total por rea de mesonefros y por zonas en el mismo (ceflica, media y caudal).Para analizar las caractersticas morfolgicas de los mesonefros en los embriones tratados y no tratados, se realizaron preparaciones histoqumicas e inmunohistoqumicas. Estas se analizaron mediante las fotografas obtenidas con un microscopio ptico, Marca Nikon modelo Eclipse Ci, a este se le acopla la cmara digital marca nikon, modelo Ds-fi2, asociado al sofwere NIS- elements versin 4.00.00.La preparacin de las muestras se realiz de acuerdo al protocolo descrito por Conn H,J. (1953), el cual se describe brevemente a continuacin. Los embriones fueron fijados en Bouin o en solucin AFA, y luego incluidos en parafina, (Hstosec) para ser cortados en el Micrtomo Rotatorio tipo Minot, marca Jung, modelo 21544. Cortes de 6 m de grosor fueron adheridos al portaobjeto con ovoalbmina en el caso de los que fueron procesados para histoqumica y con poli-L lisina en el caso de los que fueron procesados para inmunohistoqumica.Los cortes fueron desparafinados de acuerdo al mtodo propuesto por Conn H,J. (1953). Para esto los cortes fueron incubados tres veces con xiloles por 10 min cada uno y luego deshidratados mediante incubacin en una batera de alcoholes de concentracin decreciente (100, 96 y 70). Posteriormente se lavaron en agua corriente y finalmente en agua destilada en el caso de las pruebas histoqumicas (Hematoxilina-eosina o PAS) o buffer fosfato salino (PBS) en el caso de las pruebas inmunohistoqumicas.6.3.2.1Tcnicas histoqumicasEl tratamiento de las muestras se realiz de acuerdo a los mtodos de uso habitual descritos por Conn H,J. (1953). En algunos cortes se aplic el mtodo de tincin general de Hematoxilina - eosina y en otros el mtodo PAShiff. Una vez terminado el proceso de tincin, las muestras son deshidratadas en una batera de alcoholes creciente (70, 96 y 100), luego sometidas a aclaramiento en tres xiloles al 100% para finalmente ser cubiertas con los cubreobjetos.

6.3.2.2 Tcnicas inmunohistoqumicas Para determinar la presencia de receptores de angiotensina tipo AT1R y Acuaporina tipo 2 (AqpII) en mesonefros, se realizaron estudios inmunohistoqumicos de acuerdo a la modificacin del protocolo descrito por Clemente M (2010).Los cortes previamente lavados en PBS por 10 min., fueron incubados en cmara humeda por 30 min. a temperatura ambiente con H2O2 al 3 % en metanol absoluto y luego nuevamente lavados en PBS por 10 min. Posteriormente, las muestras se incubaron en cmara hmeda por 1 hr. con la solucin de bloqueo (PBS-Tween 1%-3% albmina de suero fetal de bovino-BSA) y luego fueron lavadas con PBS durante 10 min. en agitacin suave a TAmb. Las muestras fueron incubadas en cmara hmeda durante toda la noche con el anticuerpo primario (Ac 1) diluido en solucin de bloqueo PBS-Twenn 1% BSA al 3 %.Para determinar los receptores de angiotensina se utilizaron diluciones del anticuerpo anti AT1 (N - 10) Sc 1173 (Santa Cruz, CA, USA) obtenido en conejo (diluciones 1:50 y 1:100). Para detectar las estructuras positivas a Aqp2 en el mesonefro se utilizaron diluciones del anticuerpo anti-AQP-2 (H- 40) Sc- 28629 generado en conejo (Santa Cruz, CA, USA) (diluciones 1:50 y 1:100) .Terminada la incubacin con el Ac 1, las muestras fueron lavadas a TAmb con PBS por 10 min. con agitacin suave. Posteriormente los cortes se incubaron por 2 hrs. a T Amb. en cmara hmeda con el anticuerpo secundario (Ac 2) anti conejo Sc 2505 HRP conjugado (Santa Cruz, CA, USA) en una dilucin 1:1000.Para el revelado, los cortes se incubaron por 3 min. con 3,3- diaminobencidina tetrahidroclorada (DAB) diluida en actico-acetato y glucosa oxidasa, posteriormente se realiz un lavado con agua corriente, seguido de una incubacin de 2 min. en agua destilada. Los cortes fueron deshidratados con una batera de alcoholes creciente (70, 96 y 100) y finalmente fueron cubiertos con un portaobjetos.6.3.2.3 Protocolo western blotPara validar el uso del anticuerpo contra el receptor de angiotensina II de mamfero (AT1R) con los embriones de pollo se realizaron 2 procedimientos: 1) Se determin el PM de la protena de inters mediante un gel en condiciones denaturantes seguido de un western-blot y 2) se practic un anlisis de homologa de secuencia de aminocidos entre los receptores de angiotensina de mamfero (AT1R) y los receptores de pollo (ATc) utilizando herramientas bioinformticas del sitio del National Center for Biotechnology Information. Para buscar las secuencias aminacdicas de las protenas a comparar (At1R en mamferos y Atc en pollos), luego fueron comparadas en el sitio web del European Molecular Biology Laboratory - European Bioinformatics Institute. Determinacin de protenas en las muestras de rinLos riones fueron trozados y luego sonicados en un buffer de lisis (Tris HCl en presencia de Triton X-100, ms un cctel inhibidor de proteasas). Las muestras fueron centrifugadas a 800 g por 10 min. a 4 C y el sobrenadante fue colectado. Se midi la concentracin de protenas en el sobrenadante mediante el mtodo del cido Bisinconlico utilizando un kit comercial (Pierce, #23225, USA). La curva de calibrado se realiz en placas de 96 pozos (Trueline, #TR5003, USA), utilizando albmina de suero fetal de bovino (BSA) como estndar (Calbiochem, #12659, USA).Electroforesis de protenas en Gel de poliacrilamida en condiciones denaturantes (PAGE SDS)20 a 30 g de protena en buffer de carga reductor 4x fueron usados para la electroforesis utilizando geles al 12% de Acrilamida/Bis-acrilamida 30% p/v (Winkler, BM-0110, Chile) y una cmara de electroforesis Mini-PROTEAN Tetracell (Galenica, Biorad, USA) asociada a una fuente de poder (C.B.S*Scientific, EPS-300x,USA). La electroforesis inici a 60 V y una vez alcanzado el frente electrofortico se aumento el voltaje a 120 V.Para determinar los PM de las protenas de inters se emple un estndar de peso molecular comercial (BIORAD,#161-0377, USA).Westernblot del receptor de Angiotensina II (AT1R) y Aquaporina 2 (Aqp2)La transferencia desde el gel a la membrana de nitrocelulosa (Thermo, #88018, USA), se realiz durante 90 min. a 350 mA utilizando un Mini-Trans Blot (Galenica, BIORAD, USA). La eficacia de la transferencia se verific tiendo la membrana con una solucin de Rojo Ponceau (Winkler, BM-1492, Chile). Las membranas se lavaron en agua destilada y luego se incubaron con la solucin de bloqueo (TBS-Tween 1%-3% BSA en agitacin constante), durante 1hr. a temperatura ambiente (TAmb.). Se incub el anticuerpo primario (Ac 1) diluido en la solucin de bloqueo, durante toda la noche. En el caso de la -actina (Santa Cruz, CA, USA) se ocupo un anticuerpo obtenido en conejo a una dilucin 1:1000 y en caso del AT1R (Santa Cruz, CA, USA) se utiliz un anticuerpo obtenido en rata a una dilucin 1:500. El anticuerpo anti-AQP-2 generado en conejo (Santa Cruz, CA, USA) fue diluido 1:500. A la maana siguiente, las membranas se lavaron 5 veces en un buffer TBS-Tween 1% y luego se incubaron con el anticuerpo secundario (Ac 2) diluido en solucin de bloqueo durante 1 hr. a TAmb. En el caso del anticuerpo secundario anti-conejo se utiliz una dilucin 1:3000 y en el caso del anticuerpo secundario anti-ratn, una dilucin 1:5000. Pasada 1 hr. se descart el Ac 2 y se lav la membrana 5 veces en buffer TBS-Tween 1% y 2 veces en buffer TBS Para revelar las protenas de inters, las membranas fueron incubadas por 2 min. con el reactivo quimioluminiscente Western Lightning Plus-ECL (Perkin Elmer, #NEL104001EA, USA). La seal luminiscente fue detectada mediante la exposicin de las membranas con las pelculas de revelado -XPosure Film (Thermo, 34088, USA) dentro de los casettes de revelado KODAK (SOCAL BM, Biomax cassette). Los tiempos de exposicin fueron: 1 min. para el caso del la -actina, 5 min. para el caso de AT1R y finalmente 10 min. para el caso de Aqp2. Pasado el tiempo de exposicin, las pelculas fueron incubadas con la solucin reveladora (Kodak, CAT1543966, USA). Las pelculas fueron sometidas a un rpido enjuague con agua para detener el proceso de revelado y luego se incubarn con la solucin fijadora (S-F Jamarca,U-3, Chile). Una vez que las pelculas se secaron, se identificaron la(s) banda(s) de inters mediante la comparacin del estndar de peso molecular. Para utilizar la misma membrana con distintos anticuerpos, se realiz un proceso de vaciado suave (stripping) usando la solucin de Mild stripping (Glicina 0,2M, SDS, 10% p/v, pH 2,2 por cada 100ml) y siguiendo el protocolo estandarizado de la tcnica. Las pelculas obtenidas fueron digitalizadas en una impresora-copiadora multifuncional (HP Deskjet F4180 All in one) y las bandas fueron cuantificadas mediante el uso de un programa de procesamiento de imgenes JAVA de dominio pblico (ImageJ). Los resultados obtenidos fueron expresados como la razn entre la abundancia de la protena de inters y la protena estndar, -actina. 6.4 Anlisis estadstico Los anlisis estadsticos se realizaron utilizando el programa o software SPSS Statistics Professional, se realizaron los anlisis de estadstica descriptiva (media mediana, promedio, desviacin estandar), posterior a eso se realiz la prueba de normalidad con el test Shapiro-Wilk, si las muestras se distribuyen de manera normal se aplicaron pruebas paramtricas, en este caso T de Student con intervalo de confianza del 95%, si las muestras no se distribuyen de forma normal, se realizaron pruebas no paramtricas prueba U Mann-Whitney, con un intervalo de confianza del 95%.

7. Resultados 7.1 Resultados generales de la incubacin. En este trabajo, se utilizaron 30 huevos fecundados de los 15 huevos control, se obtuvo 11 embriones sanos (73,3 %), 2 embriones con malformaciones (13,3%) y 2 huevos sin desarrollo (13,3%), Por otro lado, de los 15 huevos tratados se obtuvo 9 embriones sanos (60%), 2 con malformaciones (13,3%) y 4 huevos sin desarrollo (26,6%). Ver tabla resumen inferiorTasa de supervivenciaTasa de mortalidad

Embriones sanosEmbriones con malformacionesNo hay desarrollo

Controles73,3 %13,3%13,3%

Tratados60%13,3%36,6%

A lo largo del tratamiento se observ una leve tendencia a la disminucin de los peso de los huevos control y tratado, sin embargo esta diferencia no result significativa, ver figura 1. Tampoco se observaron diferencias significativas al comparar las variaciones de peso (peso inicial y el final) entre los huevos control y tratados ver figura 2

Fig 1: Variacin de peso de los embriones de pollo tratados y no tratados durante el periodo de incubacin.Los huevos fueron incubados durante 14 das a 37,5 C y una humedad relativa entre el 70 y 80%. Se trataron cada 24 hrs. a contar de las 48 hrs. de incubacin hasta las 336 hrs. (14 das) con suero fisiolgico (grupo control) o con captopril en una dosis de 5 mg de captopril por cada kg de peso hmedo del embrin.. Se muestran los valores promedio DST. EL asterisco * indica diferencias significativas con un p 0.05

Fig 2: Efectos del captopril sobre el peso inicial y final de los huevos de pollo.Los huevos fueron incubados durante 14 das a 37,5 C y una humedad relativa entre el 70 y 80%. Se trataron cada 24 hrs. a contar de las 48 hrs. de incubacin hasta las 336 hrs. (14 das) con suero fisiolgico (grupo control) o con captopril en una dosis de 5 mg de captopril por cada kg de peso hmedo del embrin. Se muestran los valores promedio DST. EL asterisco * indica diferencias significativas con un p 0.057.2 Resultados de los efectos del captopril sobre el desarrollo mesonfrico de los embriones de pollo, estudios macroscpicos. Los embriones tratados con captopril presentaron un aumento significativo de un 24% en el peso hmedo con respecto al grupo control (P 0,05). Ver figura 3 Los embriones tratados con captopril mostraron un aumento leve pero significativo de un 8,5% en la longitud de cuerpo con respecto al grupo control (P 0,05). Ver figura 4

Fig 3: Efectos del captopril sobre el peso hmedo de los embriones.Los huevos fueron incubados durante 14 das a 37,5 C y una humedad relativa entre el 70 y 80%. Se trataron cada 24 hrs. a contar de las 48 hrs. de incubacin hasta las 336 hrs. (14 das) con suero fisiolgico (grupo control) o con captopril en una dosis de 5 mg de captopril por cada kg de peso hmedo del embrin. Se muestran los valores promedio DST. EL asterisco * indica diferencias significativas con un p 0.05.

Fig 4: Efectos del captopril sobre longitud de los embriones.Los huevos fueron incubados durante 14 das a 37,5 C y una humedad relativa entre el 70 y 80%. Se trataron cada 24 hrs. a contar de las 48 hrs. de incubacin hasta las 336 hrs. (14 das) con suero fisiolgico (grupo control) o con captopril en una dosis de 5 mg de captopril por cada kg de peso hmedo del embrin. Se muestran los valores promedio DST. EL asterisco * indica diferencias significativas con un p 0.05. Los embriones tratados con captopril mostraron un aumento significativo de un 23,79% en la longitud total del mesonefros con respecto al grupo control (P 0,05). Ver figura 5

Fig 5: Efectos del captopril sobre la longitud del mesonefros de embriones de pollo.Los huevos fueron incubados durante 14 das a 37,5 C y una humedad relativa entre el 70 y 80%. Se trataron cada 24 hrs. a contar de las 48 hrs. de incubacin hasta las 336 hrs. (14 das) con suero fisiolgico (grupo control) o con captopril en una dosis de 5 mg de captopril por cada kg de peso hmedo del embrin. Se muestran los valores promedio DST. EL asterisco * indica diferencias significativas con un p 0.05.

Los embriones tratados con captopril mostraron un aumento significativo de un 25,43 % en el ancho de los mesonefros con respecto al grupo control. . (P 0,05). Ver figura 6

Fig 6: Efectos del captopril sobre el ancho del mesonefros de embriones de pollo.Los huevos fueron incubados durante 14 das a 37,5 C y una humedad relativa entre el 70 y 80%. Se trataron cada 24 hrs. a contar de las 48 hrs. de incubacin hasta las 336 hrs. (14 das) con suero fisiolgico (grupo control) o con captopril en una dosis de 5 mg de captopril por cada kg de peso hmedo del embrin. Se muestran los valores promedio DST. EL asterisco * indica diferencias significativas con un p 0.05.

Los embriones tratados con captopril evidenciaron un aumento leve pero significativo de un 6% en el rea de los mesonefros con respecto al grupo control (P 0,05). Ver figura 7

Fig 7: Efectos del captopril sobre el rea del mesonefros de embriones de pollo.Los huevos fueron incubados durante 14 das a 37,5 C y una humedad relativa entre el 70 y 80%. Se trataron cada 24 hrs. a contar de las 48 hrs. de incubacin hasta las 336 hrs. (14 das) con suero fisiolgico (grupo control) o con captopril en una dosis de 5 mg de captopril por cada kg de peso hmedo del embrin. Se muestran los valores promedio DST. EL asterisco * indica diferencias significativas con un p 0.05. Los embriones tratados con captopril mostraron un aumento significativo del 43,3% en el peso de los mesonefros en comparacin con los grupos control (P 0,05). Ver figura 8.

Fig 8: Efectos del captopril sobre el peso del mesonefros de embriones de pollo.Los huevos fueron incubados durante 14 das a 37,5 C y una humedad relativa entre el 70 y 80%. Se trataron cada 24 hrs. a contar de las 48 hrs. de incubacin hasta las 336 hrs. (14 das) con suero fisiolgico (grupo control) o con captopril en una dosis de 5 mg de captopril por cada kg de peso hmedo del embrin. Se muestran los valores promedio DST. EL asterisco * indica diferencias significativas con un p 0.05

7.3 Determinacin del receptor de Angiotensina II en mesonefros de embriones de polloSe determin la presencia especfica de receptores de Angiotensina II tipo AT1R en mesonefros de embriones de pollo, los cuales fueron inmunolocalizados en estructuras como: tbulos proximales (P), tbulo distales (D), tbulos colectores (TC) tbulos. La especificidad de la marca fue corroborada utilizando un control en el cual los cortes no fueron incubados con el 1 anticuerpo. Ver imgenes 9, 10 y 11

Fig 9: Inmunolocalizcin del receptor tipo AT1 en un corte longitudinal de mesonefros de embrin de pollo no tratado E 39 HH, a aumento total de 100X.Control de la inmunihistoqumica para receptor tipo AT1R en mesonefros de pollo, incubadas con Ac 2 anti-conejo a dilucin de 1:1000, pero en ausencia del Ac 1. Fig 10: Inmunolocalizacin del receptor tipo AT1 en un corte transversal de mesonefros de embrin de pollo no tratado E 39 HH, a aumento total de 100X.Inmunohistoqumica de mesonefros de pollo, incubadas con Ac 1a dilucin 1:50 y con Ac 2 anti-conejo a dilucin de 1:1000.

Fig 11: Inmunolocalizacin del receptor tipo AT1 en un corte transversal de mesonefros de embrin de pollo no tratado E 39 HH, a aumento total de 400X Inmunihistoqumica de mesonefros de pollo, incubadas con Ac 1a dilucin 1:50 y con anticuerpo Ac 2 anti-conejo a dilucin de 1:1000.en ella se puede observar marcas especficas en estructuras como tbulos proximales (P), tbulo distales (D), tbulos colectores (TC)

A partir de los westernblot realizados a los mesonefros procedentes de los embriones control y tratados se observ la presencia de una banda especfica para un receptor tipo AT1R entre los 37 y 50 KD. Por otra parte, se observ una leve disminucin en los niveles del receptor en los mesonefros de los embriones tratados, sin embargo no result significativa (P 0,05). Ver figura 12

Fig 12: Efecto de tratamiento con captopril sobre la expresin de receptor tipo AT1R en mesonefros de embriones de pollo. El Ac1 en el caso de la -actina se ocup un anticuerpo obtenido en conejo a una dilucin 1:1000 y en caso del AT1R se utiliz un anticuerpo obtenido en rata a una dilucin 1:500. El Ac 2 anti-conejo se utiliz una dilucin 1:3000 y en el caso del anticuerpo secundario anti-ratn, una dilucin 1:5000. Se muestran los valores promedio DST. EL asterisco * indica diferencias significativas con un p 0.05

7.4 Estudio de homologa entre receptores de Ang II para pollo, humano, rata y ratnAl comparar las secuencias aminoacdicas de los receptores de AngII se obtuvo lo siguiente. Entre el receptor de AngII de pollo (Gallus gallus) y humano (Homo sapiens) existe una homologa de un75,77%, con ratn (Mus musculus) de un 75,21% y con rata (Rattus norvergicus) de 75,21%. Ver figuras 13, 14, 15

Fig 13. Comparacin de homologa entre las secuencias de aminocidos del receptor de Ang II de Gallus gallus (ATc) con el receptor de Ang II, tipo 1, de Homo sapiens (AT1). La simbologa: * aminocidos idnticos, : . aminocidos homlogos, ( ) aminocidos distintos.

Fig 14. Comparacin de homologa entre las secuencias de aminocidos del receptor de Ang II de Gallus gallus (ATc) con el receptor de Ang II, tipo 1 de Mus musculus (AT1). La simbologa: * aminocidos idnticos, : . aminocidos homlogos, ( ) aminocidos distintos.

Fig 15: Comparacin de homologa entre las secuencias de aminocidos del receptor de Ang II de Gallus gallus (ATc) con el receptor de Ang II, tipo 1 de Rattus norvegicus (AT1). La simbologa: * aminocidos idnticos, : . aminocidos homlogos, ( ) aminocidos distintos.7.5 Anlisis de la estructura microscpica de los mesonefrosEn los mesonefros de los embriones tratados con captopril, se observ un aumento significativo de un 89,69% en el nmero de tbulos totales con respecto al control ver figura 16. Dicho aumento se reflej en cada una de las 3 zonas analizadas, encontrando un 200% de aumento en la zona ceflica, un 42,57% en la zona media y un 58,4% en la zona caudal (p 0,05) ver figura 17

Fig 16: Efectos del captopril sobre el nmero de tbulos en el mesonefros de embriones de pollo.Los huevos fueron incubados durante 14 das a 37,5 C y una humedad relativa entre el 70 y 80%. Se trataron cada 24 hrs. a contar de las 48 hrs. de incubacin hasta las 336 hrs. (14 das) con suero fisiolgico (grupo control) o con captopril en una dosis de 5 mg de captopril por cada kg de peso hmedo del embrin. Se muestran los valores promedio DST. EL asterisco * indica diferencias significativas con un p 0.05

Fig 17: Efectos del captopril sobre el nmero de tbulos en la zona ceflica, media y caudal en el mesonefros de embriones de pollo.Los huevos fueron incubados durante 14 das a 37,5 C y una humedad relativa entre el 70 y 80%. Se trataron cada 24 hrs. a contar de las 48 hrs. de incubacin hasta las 336 hrs. (14 das) con suero fisiolgico (grupo control) o con captopril en una dosis de 5 mg de captopril por cada kg de peso hmedo del embrin. Se muestran los valores promedio DST. EL asterisco * indica diferencias significativas con un p 0.05

Al analizar los efectos del tratamiento con captopril sobre los corpsculos renales (CR) de los mesonefros de los embriones de pollo se observ lo siguiente. El nmero de los CR, el rea y dimetro de los CR, el rea y dimetro de los glomrulos y el espacio de Bowman, no mostraron diferencias significativas al comparar los grupo control y tratados Ver figuras 18 a la 23.

Fig 18: Efectos del captopril sobre el nmero de corpsculos renales en la zona ceflica, media y caudal en el mesonefros de embriones de pollo.Los huevos fueron incubados durante 14 das a 37,5 C y una humedad relativa entre el 70 y 80%. Se trataron cada 24 hrs. a contar de las 48 hrs. de incubacin hasta las 336 hrs. (14 das) con suero fisiolgico (grupo control) o con captopril en una dosis de 5 mg de captopril por cada kg de peso hmedo del embrin. Se muestran los valores promedio DST. EL asterisco * indica diferencias significativas con un p 0.05

Fig 19: Efectos del captopril sobre el dimetro del glomrulo renal en la zona ceflica, media y caudal en el mesonefros de embriones de pollo.Los huevos fueron incubados durante 14 das a 37,5 C y una humedad relativa entre el 70 y 80%. Se trataron cada 24 hrs. a contar de las 48 hrs. de incubacin hasta las 336 hrs. (14 das) con suero fisiolgico (grupo control) o con captopril en una dosis de 5 mg de captopril por cada kg de peso hmedo del embrin. Se muestran los valores promedio DST. EL asterisco * indica diferencias significativas con un p 0.05

Fig 20: Efectos del captopril sobre el dimetro de las capsulas renales en la zona ceflica, media y caudal en el mesonefros de embriones de pollo.Los huevos fueron incubados durante 14 das a 37,5 C y una humedad relativa entre el 70 y 80%. Se trataron cada 24 hrs. a contar de las 48 hrs. de incubacin hasta las 336 hrs. (14 das) con suero fisiolgico (grupo control) o con captopril en una dosis de 5 mg de captopril por cada kg de peso hmedo del embrin. Se muestran los valores promedio DST. EL asterisco * indica diferencias significativas con un p 0.05

Fig 21: Efectos del captopril sobre el rea de los ovillos renales en la zona ceflica, media y caudal en el mesonefros de embriones de pollo.Los huevos fueron incubados durante 14 das a 37,5 C y una humedad relativa entre el 70 y 80%. Se trataron cada 24 hrs. a contar de las 48 hrs. de incubacin hasta las 336 hrs. (14 das) con suero fisiolgico (grupo control) o con captopril en una dosis de 5 mg de captopril por cada kg de peso hmedo del embrin. Se muestran los valores promedio DST. EL asterisco * indica diferencias significativas con un p 0.05

Fig 232: Efectos del captopril sobre el rea del corpsculo renal en la zona ceflica, media y caudal en el mesonefros de embriones de pollo.Los huevos fueron incubados durante 14 das a 37,5 C y una humedad relativa entre el 70 y 80%. Se trataron cada 24 hrs. a contar de las 48 hrs. de incubacin hasta las 336 hrs. (14 das) con suero fisiolgico (grupo control) o con captopril en una dosis de 5 mg de captopril por cada kg de peso hmedo del embrin. Se muestran los valores promedio DST. EL asterisco * indica diferencias significativas con un p 0.05

Fig 23: Efectos del captopril sobre el rea del espacio de Bowman en la zona ceflica, media y caudal en el mesonefros de embriones de pollo.Los huevos fueron incubados durante 14 das a 37,5 C y una humedad relativa entre el 70 y 80%. Se trataron cada 24 hrs. a contar de las 48 hrs. de incubacin hasta las 336 hrs. (14 das) con suero fisiolgico (grupo control) o con captopril en una dosis de 5 mg de captopril por cada kg de peso hmedo del embrin. Se muestran los valores promedio DST. EL asterisco * indica diferencias significativas con un p 0.058. DiscusionesEn base al estudio llevado a cabo, se ha establecido que luego del periodo de incubacin y aplicacin de tratamiento crnico con Captopril durante 14 das, no se presentaron diferencias en la tasa de mortalidad, entre los controles y los tratados, as como tampoco hay diferencias en la variacin del peso de los huevos, ya que durante el periodo de incubacin y al paso de los das, los huevos pierden agua por efecto de la evaporacin (Hernando A., 1990), lo que explica la disminucin del peso de los huevos durante el periodo de incubacin. En lo que respecta a los estudios macroscpicos del efecto del captoril en el desarrollo, se puede establecer que en el caso de los mamferos, tanto en ovejas como en el caso con humanos, los fetos han presentado una disminucin de tamao, ya que hay una disminucin en la circulacin feto-placentaria (Barr M, 1994; Moura S & Lopes C, 1995; Rosenthal T, Oparil S, 2002), esta disminucin en la circulacin genera una disminucin en el desarrollo embrionario por una falta de oxgeno y nutrientes (Moura S & Lopes C, 1995).Durante el desarrollo de los embriones de pollo se ha documentado que por efecto de inhibicin de la ACE hay una disminucin en el peso de los embriones (Friberg et al., 1994;Tufro-McReddie et al., 1995yMezzano et al., 2001), por otra parte, en un estudio llevado a cabo recientemente se ha establecido que los embriones tratados con captopril no han pesentado diferencias en el peso humedo y tampoco en el peso seco con respecto al control. (Mueller.et.al, 2013) Sin embargo en nuestro estudio se ha encontrado que los embriones tratados con captopril han experimentado un aumento del 24% en el peso hmedo y un aumento del 8,58% en la longitud con respeto al control. Se ha documentado que por efecto del captipril se inhibe parcialmente la produccin de ANG II, y se presenta una aumento de la Angiotensina-(1-7) genera un aumento en el flujo sanguineo (Santos. et. al., 2000) lo que puede ocasionar un mayor desarrollo del organo en cuestin. Cabe destacar que el rion de las aves termina su maduracin en los das posnatales, lo que puede generar cambios posteriores a la eclosin del huevo (Widema, 1989). Siendo concordante con los cambios morfolgicos externos que se han podido observar , en donde los riones de los embriones tratados presentaron un aumento de 23,79 % de la longitud , un aumento de 25,43 % del ancho, aumento en el rea que corresponde a un 6,00% , un aumento en el peso, que corresponde al 43,33 % con respecto a los riones de los embriones control. Estos cambios no solo se han reflejados a nivel macroscpicos. A nivel microscpico el mesonefros ha experimentado cambios por efectos del tratamiento con captopril, entre ellos se destaca en aumento de tbulos presentes por zona y a nivel del mesonefros. En la zona ceflica los embriones tratados presentaron un aumento del 200%; en la zona media los embriones tratados presentaron un aumento del 42,57%; en la zona caudal los embriones tratados presentaron un aumento del 58,64% en la cantidad de tbulos con respecto al control, actualmente no se ha documentado que el captopril genere una aumento en el numero de tubulos por tanto, estos resultados abren una nueva posibilidad de estudio. Aunque estos resultados no son lo que se esperan, se puede establecer que la ANG II no es completamente eliminada del sistema al suministrar IACE, ya que se conoce una via independiente de ACE, esta puede convertir directamente la ANG I en ANG II, por efecto de la catepsina G y tonina, (Wolny et al, 1997) especificamente a nivel renal en perros, la cimasa es la principal enzima encargada en la conversin de ANG II, adems se ha establecido que en humanos el 40% de la ANG II circulante es producido por vias independientes de la ACE. (Hollemberg et al, 1998) Los efectos del tratamiento con IECA, no solo inhiben la conversin de ANG I a ANG II, sino que tambin se disminuye la degradacin de ANG-(1-7) otro componente activo del RAS y se ha documentado que al inhibir las ACE, hay un aumento del ANG-(1-7) de 25 veces su concentracin normal , porque al estar inhibida la ACE no se degrada la ANG-(1-7) y adicionalmente se genera un incremento en la actividad de la ACE - 2, ( Allred et al, 2000) esta se localiza principalmente en el endotelio de las arterias coronarias, en el endotelio de las arterias renales y en el epitelio tubular renal (Shi,2010). Lo que nos permite pensar en la posibilidad de una sealizacin local que afecte la formacin de tubulos. El aumento de la ANG-(1-7) en el plasma llega a ser similar a las concentraciones de ANG II en condiciones fisiolgicas normales (Yamada et al., 1980).

La ANG-(1-7) se puede considerar un antagonista de la ANG II (Santos et al., 2000), a nivel renal la ANG-(1-7) en ratas puede ocasionar un aumento en el flujo sanguineo (Sampaioet al, 2003), mientras que en conejos se produjo un relajo de la arteria aferente por medio de la liberacin de NO en el rion (Ren et al,. 2002). Como se ha documentado anteriormente receptor de ANG II tipo 1 en pollos, ATc se encuentra presente desde el estado 8 HH, y tiene un peso molecular de 40Kd app, este receptor se encuentra en orgnos como el corazn, rion y alantoides modulando la accin de la ANG II, ( Savary K. et. al, 2004 ) y presenta una homologa mayor al 75 % con mamferos (humanos, ratn y rata). Con estos datos a la vista y teniendo en cuenta los resultados del western-blot se puede establecer que las marcas de la inmunohistoqumica presentes en el mesonefros de embrin de pollo, corresponden a un receptor de ANG II, tipo 1 (ATc), este receptor es el principal modulador de las acciones de la ANG II en el desarrollo embrionario de pollos. Adems se ha establecido mediante el western-blot que la expresin del receptor de AngII tipo 1 en pollos no present diferencias con respecto al embrin control. Esto se puede explicar por dos razones, en primer lugar no tenemos la certeza de que la ANG II este inhibido en un 100%, lo que nos permite establecer que si hay presencia de ANG II, el receptor se encontrar presente en el tejido diana, como se ha demostrado en (Yang CH. et. al.,2014), si hay un aumento de la ANG II en el corazn, hay un aumento en la expresin del ARNm y en la expresin del receptor AT1R, lo que nos hace pensar que si hay una disminucin en la ANG II se ver afectada la expresin del receptor de ANG II. Si el RAS est completamente inhibido est la posibilidad de que el receptor AT1r en mamferos sea activado por ANG-(1-7), ya que al inhibir la ACE esta aumenta su concentracin, compitiendo con la ANG II por el sitio de unin del receptor AT1, tambin se ha demostrado que al exponer los tejidos previamente a ANG-(1-7) se produce una disminucin en el nmero de receptores de AT1 en el rion, (Clark. et. al., 2003). 9. ProyeccinesLas proyecciones de nuetro estudio radican en replicar este estudio en donde el tratamiento a utilizar sea un IACE en conjunto con un bloqueador del receptor de ANG II, de esta manera podramos establecer que la ANG II est completamente inhibida y se podran establecer como la ANG II modula el desarrollo del mesonefros. Otra proyeccin importante de nuestro estudio es determinar en que medida la ANG-(1-7) modula el desarrollo del mesonefros en embriones de pollo, para ello sera necesario inhibir la ACE y aumentar cronicamente la concentracin de ANG-(1-7), de esta manera se podran comparar los resultados obtenidos con este estudio y se podra establecer si los resultado obtenidos ahora son por efecto de la ANG-(1-7).

10. Conclusiones En este estudio se ha podido establecer que, los embriones que han sido tratados con una dosis crnica de captopril han presentado un aumento de tamao significativo. Tanto en peso, como en longitud, y estos resultados tambin se han visto reflejados a nivel del mesonefros, en donde tambin se observaron diferencas significativas en el peso, tamao y aumento en el nmero de tbulos. Esto muestra que los inhibidores de la ACE pueden alterar el normal desarrollo de las estructuras renales, en nuestro estudio mostr que hay un aumento en el crecimiento de los embriones y de los organos.

11. Referencias bibliogrficas.Allred A, Diz D, Ferrario C, Chappell M., 2000. Pathways for angiotensin-(1-7) metabolism in pulmonary and renal tissues. Am J Physiol Renal Physiol. 279: F841-F850.Basson MA, Akbulut S, Watson-Johnson J, 2005. Sprouty1 is a critical regulator of GDNF/RET-mediated kidney induction. Dev Cell;8(2):229e39.Burrow, C. R. 2000. Regulatory Molecules in Kidney Development. Pediatric nephrology (Berlin, Germany) 14(3):24053. Retrieved (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10752765).Butkus A, Albiston A, Alcorn D, Giles M, McCausland J, Moritz K, Zhuo J, Wintour EM. 1997. "Ontogeny of Angiotensin II Receptors, types 1 and 2, in ovine Mesonephros and Metanephros" Kidney Int.52 (3): 628.36. Cherawsky, Daniel, Mara Sequeira, and Ariel Gmez. 2002. Bases moleculares del desarrollo renal. Pediatric nephrology 2(1):1329.Contreras, F. Tern,L. Barreto,N. de la Parte1,M. Simonovis, M and Velascol, M. 2000. Aspectos Funcionales Del Sistema Renina Angiotensina Aldosterona Y Bloqueantes de Los Receptores Ati de Angiotensina II En Hipertensin Arterial. 19.Dakha-Dahmane, F., Levy-Beff, E., Jugie, M., Lenclen, R., 2006. Foetal kidney maldevelopment in maternal use of angiotensin II type I receptor antagonists. Pediatr. Nephrol. 21, 729732.Dohle, Daniel S. et al. 2009. Chick Ex Ovo Culture and Ex Ovo CAM Assay: How It Really Works. Journal of visualized experiments: JoVE (33):27. Retrieved June 1, 2014 (http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3157849&tool=pmcentrez&rendertype=abstract).Fernndez, C., E. Lecuona, E. Gallego, J. J. Garca Prez, and P. Martn. 1996. Desarrollo Renal: Factores de Crecimiento , Celularidad Y Transporte de Sodio Y Potasio. Nefrologa 16(1):2637.Friberg, P., Sundelin, B., Bohman, S.-O., Bobik, A., Nilsson, H., Wickman, A., Gustafsson, H., Petersen, J., Adams, M.A., 1994. Reninangiotensin system in neonatal rats: induction of a renal abnormality in response to ACE inhibition or angiotensin II antagonism. Kidney Int. 45, 485492.Gimonet, V. et al. 1998. Nephrogenesis and Angiotensin II Receptor Subtypes Gene Expression in the Fetal Lamb. The American journal of physiology 274(6 Pt 2):F10629. Retrieved (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9841497).Gomez R A, Norwood V F. 1995. "Developmental consequences of the Renin- Angiotensinsystem". Am J Kidney Dis. 26 (3): 409- 31Grieshammer U, Le M, Plump AS, Wang F, Tessier-Lavigne M, Martin GR 2004: SLIT2-Mediated ROBO2 Signaling Restricts Kidney Induction to a Single Site. Dev Cell. 6:709-717.Hamburger, Victor, and Howard Hamilton. 1951. A series of normal stanges in the development of the chick embryo. journal of morphology 88(1).Hill, M.A. (2014) EmbryologyBook - The Early Embryology of the Chick 13. Retrieved July 3, 2014, from //embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php?title=Book_-_The_Early_Embryology_of_the_Chick_13Hollenberg, NK, Fisher NDL, Price DA.,1998. Pathway for angiotensin II generation in intact human tissue. Evidence from comparative pharmacological interruption of the renin system. Hypertension. 32: 387-392.Honghe Wang, Yili Yang, Nirmala Sharma, Nadya I. Tarasova, Olga A. Timofeeva, Robin T. Winkler-Pickett, Shunsuke Tanigawa, and Alan O. Perantoni,2010. STAT1 activation regulates proliferation and differentiation of renal progenitors. Cell Signal. 22(11): 17171726. doi:10.1016/j.cellsig.2010.06.012.Iosipiv, Igor V, and Mercedes Schroeder. 2003. A Role for Angiotensin II AT1 Receptors in Ureteric Bud Cell Branching. American journal of physiology. Renal physiology 285(2):F199207. Retrieved (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12657564).Kempf, H.Corvol,p. 2001. "Angiotensin Receptor (s) in fowl". Comparative Biochemistry and Physioloy. 128 (1): 77-88.Kempf, H., P. Corvol, and J. M. Gasc. 1999. Expression of the Chicken Angiotensin II Receptor: Atypical Pattern Compared to Its Mammalian Homologues. Mechanisms of development 84(1-2):17780. Retrieved (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10473137).Kempf, H., J. M. le Moullec, P. Corvol, and J. M. Gasc. 1996. Molecular Cloning, Expression and Tissue Distribution of a Chicken Angiotensin II Receptor. FEBS letters 399(3):198202. Retrieved (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8985144).Kobayashi A, Kwan KM, Carroll TJ, 2005. Distinct and sequential tissue-specic activities of the LIM-class homeobox gene Lim1 for tubular morphogenesis during kidney development. Development;132(12):2809e23.Kuure, S., R. Vuolteenaho, and S. Vainio. 2000. Kidney Morphogenesis: Cellular and Molecular Regulation. Mechanisms of development 92(1):3145. Retrieved (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10704886).Lechner, M. S., and G. R. Dressler. 1997. The Molecular Basis of Embryonic Kidney Development. Mechanisms of development 62(2):10520. Retrieved (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9152004).Li X, Oghi KA, Zhang J, Krones A, Bush KT, Glass CK, Nigam SK, Aggarwal AK, Maas R, Rose DW, 2003: Eya protein phosphatase activity regulates Six1-Dach-Eya transcriptional effects in mammalian organogenesis. Nature, 426:247-254.Majumdar A, Vainio S, Kispert A, McMahon J, McMahon AP 2003:" Wnt11 and Ret/Gdnf pathways cooperate in regulating ureteric branching during metanephric kidney development." Development, 130:3175-3185. Mason Barr. 1994. "teratogen update: angiotensin- converting enzyme inhibitors". Teratologi 50: 399- 409. Mezzano, S.A., Ruiz-Ortega,M., Egido, J., 2001. Angiotensin II and renal fibrosis. Hypertension 38, 635638.Mueller, C.A., Burggren, W.W., Crossley II, D.A., 2013. Angiotensin II and baroreflex control of heart rate in embryonic chickens (Gallus gallus domesticus). Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 305, R855R863.Mueller, C.A., Burggren, W.W., Crossley II, D.A., 2014. The actions of the reninangiotensin system on cardiovascular and osmoregulatory function in embryonic chickens (Gallus gallus domesticus) Comparative Biochemistry and Physiology, Part A 178 (2014) 3745Nakai S, Sugitani Y, Sato H, 2003. Crucial roles of Brn1 in distal tubule formation and function in mouse kidney. Development;130(19):4751e9Price, R. L. Carver, W. Simpson, D G. Fu, L. Zhao, J. Borg, T K. Terracio, L 1997. The Effects of Angiotensin II and Specific Angiotensin Receptor Blockers on Embryonic Cardiac Development and Looping Patterns. Developmental biology 192(2):57284. Retrieved (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9441690).

Pryde, P.G., Sedman, A.B., Nugent, C.E., Barr, M., 1993. Angiotensin-converting enzyme inhibitor fetopathy. J. Am. Soc. Nephrol. 3, 15751582.

Ren Y, Garvin JL, Carretero OA.,2002. Vasodilator action of angiotensin-(1-7) on isolated rabbit afferent arterioles. Hypertension. 39:799-802Rosenblum, Norman D. 2008. Developmental Biology of the Human Kidney. Seminars in fetal & neonatal medicine 13(3):12532. Retrieved June 2, 2014 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18096451). Rosenthal T, Oparl S, 2002. "The effect of antihiperrensive drugs on the fetus." Jouranl of human hypertension 16, 293- 298. (http://www.nature.com/jhh)Sainio K, Suvanto P, Davies J, 1997. Glial-cell-line-derived neurotrophic factor is required for bud initiation from ureteric epithelium. Development;124:4077e87Santos RA, Campagnole-Santos MJ, Andrade SP., 2000. Angiotensin-(1-7): an update. Regul Pept. 91:45- 62.Sampaio WO, Nascimento AA, Santos RA., 2003. Systemic and regional hemodynamic effects of angiotensin-(17) in rats. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology 284: H1985H1994.savay K, Michaud A, Faviee J, Larger E, Corvol P, Gasc J, 2004. Role of the renin- angiotensin system in primitive erythropoiesis in the chick embryo. American Society of Hematologi 105: 103 - 110.Shi L, Mao C, Xu Z, Zhang L., 2010. Angiotensin converting enzymes and drug discovery in cardiovascular diseases. Drug Discovery Today. 15(9/10): 332-341.Soares M, cerqueire L, 1995.Effects of captopril on the human foetal placental circulation: an interaction with bradykinin and angiotensin I. Br J clin Pharmac; 39: 497-501.Song, Renfang, Graeme Preston, and Ihor V Yosypiv. 2013. Ontogeny of the (pro)renin Receptor. Pediatric research 74(1):510. Retrieved July 15, 2014 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23575876).Song, Renfang, Graeme Preston, and Ihor V. Yosypiv. 2011. Angiotensin II Stimulates in Vitro Branching Morphogenesis of the Isolated Ureteric Bud. 128(504):35967.Song, Renfang, Melissa Spera, Colleen Garrett, and Ihor V Yosypiv. 2010. Angiotensin II-Induced Activation of c-Ret Signaling Is Critical in Ureteric Bud Branching Morphogenesis. Peditric Nephrology 127(504):2127.Song, Renfang, Melissa Spera, Colleen Garrett, and Ihor V Yosypiv. 2010. Angiotensin II and receptor regulates uretric bud morphogenesis. Peditric Nephrology 298 (3):807-17Tufro-McReddie, A., Romano, L.M., Harris, J.M., Ferder, L., Gomez, R.A., 1995. Angiotensin II regulates nephrogenesis and renal vascular development. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 269, F110F115.Vlahakos D, Marathias K, Madias N. 2010. "The Role of the Renin -Angiotensin System in the Regulatio of Erythropoiesis". The American journal of Kidney Diseases. 56 (3): 558 -65 Wideman, R.F., 1989. Maturation of glomerular size distribution profiles in domestic fowl (Gallus gallus). J. Morphol. 201, 205213.Wintour E M , Alcorn D, Albiston A, Boon WC, Butkus A, Earnest L, Moritz K, Shandley L. 1998. " The Renin-Angiotensin System and the Development of de Kidney and Adrenal sheep". Clim Exp Pharmacol Suppl. 25: 97 - 100. Wolny A, Clozel JP, Rein J, Mory P, Vogt P, Turino M, Kiowski W, and Fischli W., 1997. Functional and biochemical analysis of angiotensin II-forming pathways in the human heart. Circ Res. 80: 219-227.Xu P-X, Adams J, Peters H, 1999. "Eya1-decient mice lack ears and kidneys and show abnormal apoptosis of organ primordia". Nat Genet;23:113e7.Yamada K, Iyer SN, Chappell MC, Ganten D, Ferrario CM., 1998. Converting enzyme determines plasma clearance of angiotensin-(1-7). Hypertension. 32:496- 502.Yang C , Liu Z , Liu K , Yang P., 2014. Mechanisms of Ghrelin Anti-Heart Failure: Inhibition of Ang II-Induced Cardiomyocyte Apoptosis by Down-Regulating AT1R Expression. PLoS One; 9(1): e85785.Yosypiv, Ihor V. 2004. Hypothesis: A New Role for the Renin-Angiotensin System in Ureteric Bud Branching. Organogenesis 1(1):2632. Retrieved (http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2633671&tool=pmcentrez&rendertype=abstract).Yosypiv, Ihor V. 2008. A New Role for the Renin-Angiotensin System in the Development of the Ureteric Bud and Renal Collecting Syst. Peditric Nephrology 57(4):18489.Yosypiv, Ihor V. 2009. Renin-Angiotensin System-Growth Factor Cross-Talk: A Novel Mechanism for Ureteric Bud Morphogenesis. Pediatric nephrology 24(6):111320.Yosipiv, Ihor V. 2014. "Renin-Angiotensin System in urtric Bud Branching Morphogenesis: implications for Kidney disease." Pediatric nephrology 29(4):609-20.Yu, Jing, Andrew P. McMahon, and M. Todd Valerius. 2004. Recent Genetic Studies of Mouse Kidney Development. Current opinion in genetics & development 14(5):55057. Retrieved June 11, 2014 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15380247).

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