EFECTO DE LOS HIDROLIZADOS DE COLÁGENO SOBRE CULTIVOS DE CONDROCITOS HUMANOS Investigador Principal: P. Benito

Co-investigadores: J. Monfort, M. Nacher Servicio Reumatología -Hospital del Mar Unitat de Recerca en Fisiopatologia Òssia i Articular-IMIM Septiembre 2002

El Dr. Pedro BENITO-RUIZ, Doctor en Medicina y médico especialista en

Reumatología y Medicina Interna, Jefe del Servicio de Reumatología del

Hospital del Mar, -Universidad Autónoma de Barcelona- y Coordinador de la

Unidad de Biología Celular de la URFOA, (Unitat de Recerca en Fisiología Ossia

i Articular) del IMIM (Institut Municipal d’Investigació Mèdica) –Universitat

Pompeu Fabra de Barcelona-, certifica que el informe final que se acompaña: “Efecto de los hidrolizados de colágeno sobre cultivos de condrocitos humanos”, ha sido realizado bajo su dirección en el laboratorio de Biología

Celular de Artrosis, en el Institut Municipal d’Investigació Mèdica de Barcelona.

A su vez declara no tener ningún otro tipo de relación que la meramente

científica con PROTEIN SA, patrocinador del estudio.

Y para que así conste lo certifica en Barcelona en Septiembre de 2002.

Dr.P. Benito-Ruiz

EFECTO DE LOS HIDROLIZADOS DE COLÁGENO SOBRE CULTIVOS DE CONDROCITOS HUMANOS 1. INTRODUCCION

Algunos estudios1,2,3 han sugerido la eficacia del colágeno hidrolizado en el tratamiento de la artrosis. El uso de este agente se basó en la hipótesis de que el colágeno hidrolizado contiene abundantes aminoácidos que jugarían un papel en la síntesis de colágeno, uno de los principales componentes de la matriz extracelular. La segunda hipótesis contemplaba la posibilidad que estos agentes, al estimular la síntesis de colágeno de la matriz por los condrocitos, proporcionarían una mejoría sintomática en el tratamiento de la artrosis. Los hidrolizados de colágeno han sido utilizados como suplementos alimentarios y su perfil de seguridad los hace interesantes como agentes terapéuticos. De hecho se ha publicado que la ingestión de 10 g de colágeno hidrolizado durante 60 días reduce el dolor en pacientes afectos de artrosis de rodilla y/o cadera1,2 Sin embargo, no se conoce el mecanismo íntimo de actuación de los hidrolizados de colágeno. Así pues es razonable la hipótesis sobre su mecanismo de actuación y sobre su efecto terapéutico, sin embargo la ausencia de ensayos clínicos de calidad y la inexistencia de trabajos en cultivos celulares humanos hacen que dichas hipótesis no hayan sido por el momento demostradas. El propósito de nuestro trabajo es averiguar en cultivo celular el comportamiento de los hidrolizados de colágeno sobre condrocitos humanos sanos respecto a la proliferación celular, la síntesis de colágeno tipo II y agrecano. 2. HIPÓTESIS El digerido del hidrolizado de colágeno Colnatur (Protein, s.a.) estimula la proliferación celular, la síntesis de colágeno tipo II y proteoglicanos en cultivos de condrocitos humanos procedentes de cartílago sano. 3. OBJETIVOS Cuantificar en los cultivos de condrocitos incubados en presencia de hidrolizados de colágeno los siguientes parámetros:

a) proliferación celular b) síntesis de colágeno tipo II c) síntesis de proteoglicanos

4. MATERIAL Y MÉTODOS 4.1. Diseño del estudio Se ha estudiado el efecto de cuatro concentraciones de la suspensión obtenida como consecuencia del paso del hidrolizado de colágeno a través de un modelo dinámico del aparato gastrointestinal (TIM-1). Esta suspensión se ha testado sobre tres poblaciones diferentes de condrocitos. Se ha valorado la proliferación celular, la síntesis de colágeno tipo II y la síntesis de proteoglicanos. Se ha diseñado el presente estudio como un diseño experimental de bloques randomizados (individuos) en los que se realizarán dos, tres ó cuatro réplicas (según el parámetro a analizar) de cada determinación. 4.2. Obtención de las muestras de cartílago 4.2.1. Pacientes a partir de los que se han obtenido las muestras Criterios de inclusión: Pacientes sometidos a intervención de rodillas en las que se practicó una reconstrucción del ligamento cruzado anterior Criterios de exclusión : - Pacientes afectos de artrosis primaria o secundaria de rodilla - Pacientes afectos de cualquier conectivopatia - Pacientes afectos de hiperuricemia y/o condrocalcinosis - Pacientes que no hayan autorizado el consentimiento informado para el

estudio 4.2.2. Recogida de las muestras de cartílago Las células objeto del estudio se obtuvieron, previo consentimiento del paciente, a partir de fragmentos ostecondrales extraídos de rodillas a las que se practicó una reconstrucción del ligamento cruzado anterior. Durante esta intervención un paso rutinario consiste en agrandar la escotadura intercondílea, con objeto de permitir el reposicionamiento adecuado del neoligamento y evitar su fricción con las paredes y techo de la escotadura. Este agrandamiento, o notchplasty en la literatura anglosajona, se realiza extrayendo con un escoplo unos 3 a 5 mm de la pared medial del cóndilo femoral lateral, proporcionado de esta manera 2 o 3 fragmentos osteocondrales que en condiciones normales son despreciados. Los fragmentos así obtenidos se procesaron como sigue para obtener las células. Las muestras se obtuvieron en condiciones de asepsia y se depositaron en medio de cultivo HAM'S F-12/Dulbecco's modified Eagles Medium (HAM’S F-12/DMEM) (Gibco BRL) manteniéndose a 4ºC. Las muestras fueron

trasladadas al Instituto Municipal de Investigación Médica y se procesaron durante las 24 horas posteriores a su extracción. Las muestras de estos pacientes procedieron del Hospital del Mar. El estudio experimental se realizó en la Unidad de Investigación en Fisiopatología Osea y Articular del Instituto Municipal de Investigación Médica (IMIM). 4.2.3. Obtención de los cultivos de condrocitos El cartílago se cortó en finas láminas que se digirieron con tripsina al 0,25% durante 30 minutos a 37ºC y, posteriormente, con colagenasa al 0,05% a 37ºC durante 16-18 horas. La suspensión celular se pasó a través de un filtro de 100 µm y las células se recogieron mediante centrifugación. Los condrocitos se depositaron en frascos de cultivo con HAM’S F-12/DMEM suplementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 UI/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina y 50 µg/ml de ácido ascórbico. Al llegar a la confluencia, las células se subcultivaron en proporción 1:4. Para los experimentos se utilizaron condrocitos obtenidos entre el primer y el segundo subcultivo. Las células se caracterizaron mediante inmunocitoquímica para la detección de colágeno tipo II. 4.3. Obtención del hidrolizado de colágeno (Colnatur) Se obtiene a partir de huesos de cerdo procedentes de animales sanos de edad comprendida entre 5 y 6 meses. El proceso de obtención consiste en una ebullición de los huesos triturados con el fin de obtener un caldo de colágeno y grasa. Una vez separada la grasa, el caldo se purifica y se somete a una hidrólisis enzimática con endoproteasas hasta la obtención de fragmentos de un rango comprendido entre 3000 y 5000 Daltons. A continuación, el caldo de colágeno hidrolizado se concentra al vacio y se somete a una atomización con aire caliente para su desecación. 4.4. Obtención del digerido de hidrolizado de colágeno a través del modelo dinámico de aparato gastrointestinal TIM-1. El digerido del hidrolizado de colágeno Colnatur fue realizado en un sistema multicompartimental que simula el estómago e intestino delgado (TIM-1) (TNO Nutrition and Food Research, Netherlands)4 Este modelo simula de forma muy parecida las sucesivas condiciones dinámicas del tracto gastrointestinal (temperatura corporal, curvas de pH, concentración de electrolitos, actividad enzimática en el estómago e intestino delgado, concentración de sales biliares en las diferentes partes del intestino, cinética del paso del quimo a través del estómago e intestino delgado así como absorción de moléculas de bajo peso molecular y agua). Finalmente, a partir de 45 gramos del hidrolizado de colágeno, se obtuvo una suspensión en alícuotas de 50 ml que se utilizaron para la realización de los diferentes experimentos.

4.5. Cuantificación de la proliferación celular. 4.5.1. Curvas de crecimiento Las células se distribuyeron en placas de 24 pocillos a una densidad de 20000 células/pocillo y se incubaron con HAM’S F-12/DMEM suplementado con un 10% de FBS, antibióticos y ácido ascórbico y las diferentes concentraciones del hidrolizado de colágeno (dia 0). Se realizó un recuento celular en los días 2, 4, 6, 8, 11 y 14 y, posteriormente, se calculó el tiempo de duplicación celular, la densidad celular en el día 14 de incubación, así como el área obtenida bajo la curva (AUC). 4.5.2. Incorporación de bromodeoxiuridina Para la cuantificación de la incorporación de bromodeoxiuridina (BrdU) al DNA, los condrocitos se distribuyeron en placas de 96 pocillos a una densidad de 10000 células/pocillo y se incubaron con HAM’S F-12/DMEM suplementado con un 10% de FBS, antibióticos y ácido ascórbico. Una vez adheridos a la superficie de cultivo, se cambió el medio de cultivo y se añadió HAM’S F-12/DMEM suplementado con un 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA) durante 48 horas. Transcurrido dicho periodo de tiempo, se volvió a cambiar el medio de cultivo y se añadió HAM’S F-12/DMEM suplementado con un 10% de FBS y las diferentes concentraciones del hidrolizado de colágeno. Se incubaron durante 24, 48, 72 y 96 horas y se realizó un marcaje con BrdU durante las últimas 24 horas de incubación. Posteriormente, la incorporación de BrdU al DNA celular se cuantificó mediante ELISA (Biotrak, Amersham). 4.6. Cuantificación de la síntesis de colágeno tipo II y agrecano Las células se distribuyeron en placas de 24 pocillos y se incubaron con HAM’S F-12/DMEM suplementado con un 10% de FBS, antibióticos y ácido ascórbico. Una vez adheridas a la superficie de cultivo, se cambió el medio de cultivo y se añadió HAM’S F-12/DMEM suplementado con un 0,1% de BSA durante 48 horas. Transcurrido dicho periodo de tiempo, se volvió a cambiar el medio de cultivo y se añadió HAM’S F-12/DMEM suplementado con un 0,1% de BSA, ácido ascórbico y las diferentes concentraciones del hidrolizado de colágeno, todo ello en presencia ó ausencia de 100 ng/ml de Insulin-like Growth Factor-I (IGF-I). Se incubó durante 48 y 96 horas, transcurridas las cuales, por un lado y como medida de la síntesis de proteoglicanos, se cuantificaron los niveles de agrecano en el sobrenadante de los cultivos celulares mediante ELISA (BioSource) y, por otro lado, se cuantificaron los niveles de colágeno tipo II nativo en lisados de la monocapa celular también mediante ELISA (Morwell Diagnostics).

4.7. Estudio estadístico Se realizó un modelo lineal general en el que se incluyeron: a) los valores de proliferación, colágeno tipo II y agrecano como variables dependientes, b) las poblaciones celulares como factor aleatorio y c) el tiempo de incubación, la presencia de IGF-I y la concentración del digerido del hidrolizado de colágeno como factores fijos. Las comparaciones post Hoc se realizaron aplicando la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples. Los resultados se expresan como media aritmética con la respectiva desviación estándar de los experimentos realizados sobre tres poblaciones de condrocitos. 5. RESULTADOS 5.1. Cuantificación de la proliferación celular 5.1.1. Curvas de crecimiento Aunque se observó una clara tendencia a la disminución en la proliferación celular en los condrocitos incubados con 1000 µg/ml del digerido del TNO, no se obtuvieron diferencias significativas en cuanto al tiempo de duplicación celular, expresado en horas ni en cuanto a la densidad celular alcanzada en el día 14 de incubación con las diferentes condiciones experimentales (tabla 1) (figura 2A y 2B). El cálculo de la AUC si que fue significativamente menor en condrocitos incubados a la concentración más elevada del digerido del hidrolizado de colágeno (p< 0,0001) (figura 2C). Los condrocitos incubados en presencia de 1000 µg/ml del digerido mostraron una morfología mucho más redondeada respecto a los condrocitos incubados en condiciones basales ó bien en presencia de concentraciones menores (figura 1). 5.1.2. Incorporación de bromodeoxiuridina (BrdU) Tampoco se pudieron observar diferencias significativas en la incorporación de esta molécula al DNA cuando las células eran estimuladas con las diferentes condiciones experimentales (tabla 2) excepto en las células incubadas con la concentración de 100 µg/ml a la que la incorporación de BrdU fue significativamente mayor pero solamente respecto a la concentración de 1 µg/ml y no respecto a la concentración basal (ausencia del digerido). De todos modos, se observa una tendencia a la inhibición de la incorporación de BrdU en las células incubadas con la concentración de 1000 µg/ml, resultado que concuerda con los obtenidos en las curvas de crecimiento (figuras 3C y 3D). En los gráficos, los resultados se han expresado tanto en valores absolutos de

absorbancia como en porcentaje de incorporación de bromodeoxiuridina en cada condición experimental respecto a su control basal (sin incubar con el digerido TNO del Colnatur). 5.2. Cuantificación de la síntesis de colágeno tipo II y agrecano En las condiciones y límites de detección aplicados, no se pudieron cuantificar niveles detectables de colágeno tipo II en la monocapa celular de los cultivos tratados con las diferentes condiciones experimentales. El límite de detección del kit lo hemos fijado en la menor concentración utilizada en la curva estándar del ELISA (0,03125 µg/ml). En lo que se refiere a la cuantificación de los niveles de agrecano en los sobrenadantes de los cultivos celulares, no se observaron diferencias en los cultivos tratados durante las primeras 48 horas de incubación (que podría explicarse por un periodo de adaptación de las células). Por el contrario, se observaron diferencias globales entre los cultivos tratados con y sin IGF-I (p= 0,027) y, por otro lado, también se pudo constatar un aumento muy significativo (p<0,0001) en los condrocitos tratados durante 96 horas con 1000 µg/ml de digerido TNO del Colnatur, tanto en ausencia como en presencia de IGF-I y respecto al resto de concentraciones utilizadas (tabla 3 y figura 4). 5.3. Correlación entre los niveles de agrecano y los parámetros de proliferación celular. Los niveles de agrecano obtenidos en condrocitos incubados durante 96 horas con IGF-I y las diferentes concentraciones del digerido correlacionaron negativamente con la densidad celular (p<0,0001, r= -0,898) y con el AUC (p= 0,001, r= -0,875). Por otro lado, los niveles de agrecano en condrocitos incubados sin IGF-I durante 96 horas correlacionaron negativamente con la densidad celular (p= 0,013, r= -0,950), con la incorporación basal de BrdU a las 96 horas de incubación (p= 0,010, r= -0,960) y con la incorporación estimulada con FBS a las 96 horas de incubación (p= 0,010, r= -0,958). 6. CONCLUSIONES - Se observó un significativo aumento de la síntesis de agrecano utilizando

concentraciones de 1000µg/ml. - Los condrocitos incubados en presencia de 1000 µg/ml de digerido de

hidrolizado de colágeno Colnatur, mostraron una morfología mucho más redondeada respecto a los condrocitos incubados en condiciones basales, o en presencia de concentraciones menores, lo que parecería indicar una mayor actividad de los mismos.

- No se ha obtenido efecto sobre la proliferación celular, excepto para dosis de 1000 µg/ml a las que se observa una inhibición de dicha proliferación.

- En apariencia, el aumento en la síntesis de agrecano a dosis de 1000µg/ml

junto a la inhibición de la proliferación celular a estas mismas dosis podría interpretarse como una contradicción. Sin embargo, en realidad, este hecho no supone ninguna contradicción sino que, por el contrario, cuando las células secretan una mayor cantidad de proteína dejan de proliferar.

- En las condiciones y límites de detección estudiados, no se pudieron

detectar niveles de colágeno tipo II mediante ELISA 7. BIBLIOGRAFÍA 1. Adam M. Osteoarthritis therapy / gelatin preparations: Results of a clinical

study. Therapiewoche 1991; 41: 2456.

2. Moskowitz RW. Role of collagen hydrolysate in bone and joint disease.

Semin Arthritis Rheum 2000; 30 (2): 87-99. 3. Deal CL, Moskowitz RW. Nutraceuticals as therapeutic agents in

osteoarthritis. The role of glucosamine, chondriotin sulphate and collagen hydrolysates. Rheum Dis Clin North Am 1999 May; 25 (2) : 379-95.

4. Venema K, VanNuenen M, Smeets-Peeters M, Minekus M, Havenaar R.

TNO’s in vitro large intestinal model: an excellent screening tool for functional food and pharmaceutical research. Ernährung/Nutrition 2000;24(12):558-564.

5. Vignon E y cols Evaluation in vitro d’un chondroprotecteur. Rev Rhum Mal

Osteoartic 1990;57:9:15S-18S.

FIGURA 1. A B

(A) Condrocitos incubados en ausencia de digerido de hidrolizado de colágeno. (B) Condrocitos incubados en presencia de 1000 µg/ml del digerido. Aumentos: 100x.

TABLA 1. CUANTIFICACIÓN DE LA PROLIFERACIÓN CELULAR EN CONDROCITOS INCUBADOS EN PRESENCIA DE DIFERENTES CONCENTRACIONES DE DIGERIDO TNO DEL COLNATUR.

Concentración (µg/ml)

CDT (horas) Densidad (células/pocillo)

AUC

0+FBS 38±10 69861±20217 823±87 1+FBS 41±7 66389±8128 841±75 10+FBS 35±2 71875±9778 793±13

100+FBS 38±4 71181±10026 794±46 1000+FBS 79±45 54167±2603 575±86*

Los resultados se expresan como media aritmética ± desviación estándar de tres poblaciones condrocitarias. Las células se incubaron en presencia de las diferentes concentraciones del digerido y con un 10% de suero bovino fetal (FBS). CDT: tiempo de duplicación celular AUC: área bajo la curva *p<0,0001 TABLA 2. INCORPORACIÓN DE BROMODEOXIURIDINA AL DNA DE LOS CONDROCITOS INCUBADOS EN PRESENCIA DE DIFERENTES CONCENTRACIONES DE DIGERIDO TNO DEL COLNATUR EN PRESENCIA Y AUSENCIA DE SUERO DE BOVINO FETAL. Concentración

(µg/ml) 24 horas 48 horas 72 horas 96 horas

0 0,188±0,028 0,239±0,06 0,272±0,048 0,201±0,0111 0,184±0,018 0,204±0,013 0,200±0,02 0,196±0,015

10 0,187±0,025 0,228±0,022 0,238±0,06 0,197±0,016100 0,195±0,023 0,326±0,054* 0,295±0,141 0,206±0,017

1000 0,229±0,071 0,220±0,054 0,227±0,098 0,166±0,019

0+FBS 0,535±0,098 1,783±0,324 0,720±0,191 0,446±0,1961+FBS 0,486±0,078 1,481±0,154 0,631±0,157 0,359±0,112

10+FBS 0,486±0,085 1,600±0,289 0,707±0,195 0,362±0,067100+FBS 0,430±0,065 1,599±0,200 0,678±0,186 0,379±0,043

1000+FBS 0,337±0,056 1,241±0,500 0,635±0,208 0,292±0,016 La incorporación de Bromodeoxiuridina (BrdU) se cuantificó incubando los condrocitos en presencia de las diferentes concentraciones del digerido del Colnatur obtenido por el TNO a lo largo de distintos tiempos de incubación (24, 48, 72 y 96 horas). Dicha incorporación se evaluó en presencia ó ausencia de un 10% de suero bovino fetal (FBS), como estimulador de la síntesis de DNA. La incorporación de BrdU está expresada como media ± desviación estándar en unidades de absorbancia de los resultados obtenidos en tres poblaciones condrocitarias. *100 µg/ml vs 1 µg/ml (p<0,01)

FIGURA 2. A B C

TIEMPO DUPLICACION CELULAR (CDT)

0

20

40

60

80

100

120

140

0+FBS 1+FBS 10+FBS 100+FBS 1000+FBSConcentración digerido TNO (mcrg/ml)

Hor

as

CDT

DENSIDAD CELULAR EN EL DIA 14 DE INCUBACION

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

0+FBS 1+FBS 10+FBS 100+FBS 1000+FBSConcentración digerido TNO (mcrg/ml)

nº c

ondr

ocito

s

Densidad

AREA BAJO LA CURVA (AUC)

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

0+FBS 1+FBS 10+FBS 100+FBS 1000+FBS

Concentración digerido TNO (mcrg/ml)

AU

C

AUC

* p<0.0001

FIGURA 3. A

INCORPORACIÓN BASAL BrdU

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 1 10 100 1000

Concentración digerido TNO (mcrg/ml)

Abs

orba

ncia

24h48h72h96h

* 100 vs 1, p=0.05

PORCENTAJE INCORPORACIÓN BASAL BrdU

40

60

80

100

120

140

160

0 1 10 100 1000

Concentración digerido TNO (mcrg/ml)

% in

corp

orac

ión

Brd

U

24h48h72h96h

* 100 vs 1, p=0.05

C D

INCORPORACIÓN ESTIMULADA BrdU

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

0+FBS 1+FBS 10+FBS 100+FBS 1000+FBS

Concentración digerido TNO (mcrg/ml)

Abs

orba

ncia

24h48h72h96h

PORCENTAJE INCORPORACIÓN ESTIMULADA BrdU

40

50

60

70

80

90

100

110

0+FBS 1+FBS 10+FBS 100+FBS 1000+FBS

Concentración digerido TNO (mcrg/ml)

% in

corp

orac

ión

Brd

U

24h48h72h96h

TABLA 3. NIVELES DE AGRECANO EN LOS SOBRENADANTES DE CONDROCITOS INCUBADOS EN PRESENCIA DE DIFERENTES CONCENTRACIONES DE DIGERIDO TNO DEL COLNATUR EN PRESENCIA Y AUSENCIA DE IGF-I.

Concentración (µg/ml) 48 horas (ng/ml) 96 horas (ng/ml)

0 2,31±3,06 4,31±5,02 1 1,81±1,94 2,79±3,01 10 1,71±2,04 3,66±4,5

100 1,68±2,11 3,67±3,95 1000 2,99±2,62 18,29±13,76

0+IGF-I 4,98±3,88 7,71±4,82 1+IGF-I 5,92±5,3 8,08±5,26

10+IGF-I 4,71±3,72 6,31±4,97 100+IGF-I 4,09±3,89 5,66±5,12 1000+IGF-I 4,37±3,8* 18,51±9,49*

Los niveles de agrecano se cuantificaron incubando los condrocitos en presencia de las diferentes concentraciones del digerido de Colnatur obtenido por el TNO a lo largo de dos tiempos de incubación (48 y 96 horas) y en presencia ó ausencia de IGF-I (100 ng/ml). Los niveles de agrecano están expresados como media ± desviación estándar de los resultados obtenidos en tres poblaciones condrocitarias. *1000 µg/ml vs el resto (p<0,0001) FIGURA 4.

SINTESIS DE AGRECANO EN CONDROCITOS INCUBADOS CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DEL DIGERIDO DE TNO CON Y

SIN IGF-I

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

0 1 10 100

1000

0+IG

F-I

1+IG

F-I

10+IG

F-I

100+

IGF-I

1000

+IGF-I

Concentración digerido TNO (mcrg/ml)

Agre

cano

(ng/

mL)

48h96h

**

p<0.0001 p<0.0001