dr. j.v. sinisterra universidad complutense de madridinhibidores suicidas fagos dañinos hidrólisis...
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Dr. J.V. Sinisterra
Universidad Complutense de MadridFacultad de Farmacia
Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica
LA FACTORIA CELULAR II
Screening
Nuevos microorganismosaislados
Ingeniería Genética
Producción del biocatalizador (células o enzimas)
FermentaciónEscalado
Biotransformaciónmicrobiana
UTILIZACION DIRECTA
Industria cerveceraProcesado de alimentosProductos farmacéuticosTratamiento de aguas residualesProducción de aditivos alimentariosIndustria de Química Fina
APLICACIONES INDUSTRALESProcesado de alimentos, Productos Farmacéuticos, pesticidas, aminoacidosAromatizantes
APLICACIONES ANALITICASAnálisis de alimentos. Análisis clínicos, análisis del medio ambiente, control deCalidad
Producción de biogas
Introducción
• Fuentes de Nuevos Biocatalizadores
1. Screening a partir de bibliotecas de enzimas comercialesAmano, Sigma-Aldrich, Fluka, Toyobo, Diversa, ThermoGen, Altus Biologicsy Roche
2. Screening a partir de una colección de microorganismosATCC: American Type Culture Collection. U.S.
CBS: Fungal Biodiversity Center. Utrecht. Holanda.
CECT: Colección Española de Cultivos Tipo. U.Valencia.
DSMZ: Colección Microorganismos y cultivos celulares.
IMI: International Mycological Institute. Reino Unido.
MINC: Microbial Information Network of China
MSDN: Microbial Strain Data Network
NCYC: National Collection of Yeast Cultures. Reino Unido.
WDCM: World Data Center for Microorganisms. Japan
3. Screening a partir de bancos de genesCGSC E.coli Genetic Stock Center. U.S.
Introducción
• Screening: Diseño Experimental
i) Selección de sustratos y condiciones de reacción
ii) Criterios de selección de positivos
iii) Métodos de screening
a) Screenings consecutivos (modo jerárquico)
b) Screening automatizado a gran escala
a) Screening ecológicob) Screening taxonómicoc) Screening por selecciónd) Screening por detección
Procariotas : bacterias Gram (+)y Gram (-) actinomicetos (bacteria Gram (+)con crecimiento micelial durante parte de su ciclo biológico)
SCREENING - MICROORGANISMOS
pro-actinomicetos (bacteria Gram (+)con crecimiento micelial bajo determinadas condiciones)
Eucariotas : levaduras: organismos unicelulares
Hongos filamentosos: Hifas, puntas (crecimiento apical), crecimiento micelialCélulas en trofofase alimentación y crecimientoCélulas en idiofase : fase de diferenciaciónpared: quitina
Hifas no tabicadas: Ficomicetos
Hifas tabicadas: Ascomicetos : esporas en interior de las ascas Basidiomicetos: esporas en el exterior de los basidiosDeuteromicetos
Criterios de selección de microorganismos
No ser patógenos
No producir substancias tóxicas
No tener actividad antibiótica
Condiciones de cultivo: sencillas, reproducible y escalables
Productividad enzimáticaFácil caracterización enzimáticaGran rendimientoAusencia de actividades colateralesFácil purificación de la enzima
Escalado facil de nivel de fermentación
Screening
Screening específico
Screening secundario
Screening primario
• Screening jerárquico
Colección de potenciales biocatalizadores
Ensayos - Sustratos
Ensayos - Sustratos
Colección de Microorganismos
II COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
1. Selección de los Microorganismos
1. Asentamiento de la Colección
2. Protocolo de eliminación de residuos
2. Selección de los medios y condiciones de cultivo
para cada grupo taxonómico
Colección de Microorganismos
• Selección de los microorganismos
416 microorganismos tipo I en la escala de bioseguridad seleccionados buscando la máxima biodiversidad. (Actinomicetos, bacterias, basidiomicetos, hongos filamentosos, hongos marinos y levaduras)
Los microorganismos fueron seleccionados de parte pública de la biblioteca microbiana de SmithKline-Beecham.
i) ATCC: American Type Culture Collection.
ii) CECT: Colección Española de Cultivos Tipo.
iii) DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen.
iv) IMI: International Mycological Institute.
v) CBS: Centraalbureau voor Schimmelcultures. Holanda.
vi) NCYC: National Collection of Yeast Cultures. Reino Unido.
Plan de Trabajo
Asentamiento de la Colección
Medio Sólido
Almacenamiento
CriogenizaciónCultivo en medio líquido
Medios de cultivo
Condiciones
Diseño de experimentos
Selección Sustratos
Protocolo Extracción
Duración de la biotransformación
Concentración
Condiciones de Análisis
Criterios de selección de los microorganismos positivos que pasan a la
siguiente fase
Cromatografía de gases
Identificación compuestos y
criterios de cálculo
Eliminación de residuos biológicosProtocolo de
reasentamiento
Reasentamiento de los
microorganismos positivos
Eliminación de residuos
orgánicos y biológicos
Selección de la ColecciónMicroorganismos y Cultivos
Screening: Primera Fase
Reasentamiento de positivos
Diseño de experimentos
Selección Sustratos
Protocolo Extracción
Tiempo de contacto
Concentración
Condiciones de Análisis
Criterios de Selección de los microorganismos positivos que pasan a
Inmovilización y al screening final
Cromatografía de gases
Identificación compuestos. Criterios de
cálculo
Eliminación de residuos
orgánicos y biológicos
Screening: Segunda Fase
Optimización de los Biocatalizadores
Inmovilización
Diseño de experimentos
Liofilización directa
Técnicas de Inmovilización
Elección del soporte
Diseño de ensayos
estadísticos
Selección de los mejores soportes de inmovilización para
cada microorganismo
Optimización del Biocatalizador
Screening Final
Introducción
Diseño de experimentos
Selección Sustratos
Protocolo Extracción
Tiempo de contacto
Concentración
Condiciones de Análisis
Cromatografía de gases
Identificación compuestos
y criterios de cálculo
Quiral Aquiral
HPLC
QuiralResultados Finales
NUEVOS BIOCATALIZADORES DE CÉLULAS ENTERAS
CONCLUSIONES
Modelización molecular
Screening Final
QSAR-3D /CoMFA
Colección de Microorganismos
Actinomicetos11%
Levaduras14%
Hongos Marinos8%Bacterias
17%
Basidiomicetos14%
Ascomicetos36%
71 Bacterias148 Ascomicetos
60 Basidiomicetos59 Levaduras
45 Actinomicetos33 Hongos Marinos
Total 416
Colección Microorganismos
• Protocolo de eliminación de residuos
Residuos
Sólidos Líquidos
Urbanos oNo Biológicos
Biológicos NoContaminantes
Contaminantes
Punzantes
No Punzantes
Punzantes
No punzantes
Biológicos
Disolventes Orgánicos
Halogenados
No Halogenados
Colección de Microorganismos
• Selección de Medios de Cultivo y Condiciones de Reacción
Phylum Medio de Cultivo
Tiempo de cultivo (h) Agitación Temperatura
Actinomicetos ABME 72 h
120 h
48 h
144 h
144 h
48 h
28 ºC
Ascomicetos HAGGS
250 rpm.
250 rpm.
250 rpm.
100 rpm
250 rpm.
28 ºC
Bacterias LB 28 ºC
Basidiomicetos PDA 28 ºC
Hongos Marinos HM 28 ºC
Levaduras YM 250 rpm. 28 ºC
Screening
III Screening: Primera Fase
1. Selección de Sustratos
2. Selección de las Condiciones de Reacción
3. Resultados obtenidos en cada una de las reacciones
4. Criterios de selección de los microorganismos positivos
Introducción
• Reducción asimétrica de compuestos carbonílicos:
ADH-Prelog y Anti-Prelog
O
GP
[H-] Alcohol deshidrogenasaPrelog
NAD(P)HNAD(P)+
OH
GP
S-Alcohol
P: Sustituyente pequeñoG: Sustituyente grande
ADH Prelog: - S. cerevisiae, G.candidum, Alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo, Alcohol deshidrogenasa de levadura, ADH de Thermoanaerobium brockii (NADPH dependiente), Alcohol deshidrogenasa de hidroxiesteroides; 2-fenil-etanol-NAD+-oxidoreductasa de Corynebacterium, ADH de cianobacterias
ADH anti-Prelog: Existen menos alcohol deshidrogenasas anti-Prelog (capaces de generar el R-alcohol) en el mercado, destacando por encima de todas la de Lactobacillus kefir, enzima NADPH dependiente. Hay otras ADH anti-Prelog aisladas aún no disponibles comercialmente como la de Mucor javanicus y Pseudomonas sp.Como células completas se utilizan para conseguir el R-alcohol la Pichia farinosa y la Yarrowia lipolytica (Fantin y cols, 1996).
Introducción
• Mecanismo de reacción de las alcohol deshidrogenasas
Enz + NAD + Enz. NAD +
ROH
ROH
Enz.NAD +.ROH
Paso limitante de lavelocidad de reacción
Enz.NADH..R=O
R=O R=O
Enz.NADH
Enz + NADH
Introducción
• Mecanismo de reacción de las alcohol deshidrogenasas
Figura 1.12. Mecanismo de reacción de las alcohol
deshidrogenasas. Cesión al medio de un hidrógeno
mediante formación de una molécula de agua.
N
O
H2N
O
HO
HO
N
RNAD+
+
O
N
H
H
His 47
Tyr-48
H
OH HS
CyS-46
NN
His67
SH
Cys-178
HH
O
H
R1
R2
Protón cedido al medio
Zn+2
O OH
Screening – Primera Fase• Selección de Reacciones
A. Búsqueda de biocatalizadores para reducir compuestos carbonílicos
B. Búsqueda de biocatalizadores para oxidar alcoholes
C. Búsqueda de biocatalizadores para monooxigenar cetonas
OH O
O
OO
Screening Primera Fase• Condiciones de Reacción: Protocolo de Trabajo
Adición de sustrato a una concentración final de 10 mM. Tiempo de contacto según
el tipo de microorganismo (48 o 72h). Adición de 5 mL de
Acetato de etilo con 1 mg/mL de hexadecano
como patrón internoTUBO FALCON DE 50 mL
VORTEX 15 s
CENTRIFUGAMOS A 4000 rpmdurante 15 minutos
Extraemos el disolvente con una pipeta de 1 mL y lo pasamos a un vial
Hewlett-Packard de 2 mL.
Análisis por Cromatografía de gases
Crecimiento de los microorganismos siguiendo las condiciones de cultivo óptimas para su grupo
taxonómico (indicadas en el capítulo dedicado a microorganismos y cultivos)
Diseño deExperimentos
Screening• Resultados de la reacción de reducción de ciclohexanona
ActinomicetosHongos
filamentosos Bacterias Basidio.Hongos marinos Levaduras
Reducción 51% (23-45)
41 % (60-148)
4 %(3-69)
13 %(8-60)
33 % (12-33)
47 %(28-59)
Microorganismos que superan el 10 % de conversión en la reacción de reducción de ciclohexanona. (microorganismos positivos-microorganismos totales del grupo).
H.filamentosos60%
Levaduras28%
H.marinos6%
Actinomicetos3% Basidiomicetos
3%Distribución de los microorganismos seleccionados
(que alcanzan conversiones superiores al 50 % en la
reducción de ciclohexanona)
ScreeningComparativa de las conversiones obtenidas con los distintos hongos filamentosos y la levadura seleccionada en
la reacción de reducción frente a concentraciones crecientes de ciclohexanona (72h)
[ciclohexanona] mM
0 50 100 150 200 250
% C
onve
rsió
n
0
20
40
60
80
100Pyrenochaeta oryzae IMI 195679Neosartorya hiratsukae CBS 294.93Diplogelasinospora grovesii IMI 171018Monascus kaoliang CBS 302.78Gongronella butleri CBS 157.25Absidia glauca CBS 100.48Echinosporangium transversale CBS 357.67Schizosaccharomyces octosporus NCYC 427
o
Ho
OEt
o
Cl
o
H
o
o
CH3
o
N
O
CH3
o
O
Cl
o
O
Cl
NHCOCH3
N
O
O
Cl
o
NH3C
O
o
H
o
o
CH3
79
8
10
12
11
1314
15 16
Reduction of some acyclic compoundsby D. grovesii.
COMPOUND Yield (%) ee (%) Stereopreference
7 94 _ _
8 88 12 R > S
9 98 _ _
10 _a _ _
11 14 >99 S
12 99 >98 S > R
13 68 >99 R > S
14 99 87 S > R
15 _a _ _
16 52 85 S > R
PropranololprecursorSynthesis of S-alcohol
from propranololhaloketone precursor
Attack by Re face
attack by front
NADH
O
O
Cl
(-)
OH back
OH back
XZ
S-alcohol
Adrenergic β Blocker precursor in the active site of
D. grovesii reductase
Model of active compounds in D. grovesii
NADH
SER 138
Drosophila lebanoniensis alcohol
dehydrogenasecomplex (Protein Data Bank) and
docking of molecules and NADH. Global
CoMFA.
pro S – H in NADH
Y
X
Screening de biocatalizadores por selección genética
El screening se basa en la diversidad – generada artificialmente- y en el Desarrollo de nuevos métodos de detección mas eficaces y rápidos
-Métodos de mezcla de genes que encodan proteínas ya conocidas-Métodos que buscan genes existentes en la naturaleza- screening de
Librerías o metagenómica.
Screening por selecciónselección de los microorganismos o GMO que crecen en presencia
de un sustrato determinado
Screening por detecciónselección de micrroganismos de una librería por la reacción que dan,
estando presentes otros microrganismos de la librería. Actividad selectiva
Screening por selección genética
Método Presión selectiva Tipos de reacción Campo de aplicación
Substrato como fuente de carbono
Capacidad de degradación del sustrato
Ejemp. Hidroxilaciónde hidrocarburos
Screening de microorganismos
Complemetación Ejemp: Capacidad para crecer en ausencia de triptófano
Ejemp. Isomerización de fosforibosilantranilato
Enzimas modificadas
Inmunización frente a TSA
Débil unión a TSA Todas Anticuerpos catalíticas
Infección debida a la actividad
Infección por fagos Acilación en un paso Anticuerpos catalíticos
Reactividad debida a la unión a una superficie
Fagos dañinos Ruptura de glicósidos Anticuerpos catalíticos
Inhibidores suicidas Fagos dañinos Hidrólisis de amidas/esteres
Anticuerpos catalíticos Enzimas modificadas.
TSA.- transition state analog
Wahler & Reymond Cur. Opinion Che. Biol. 2001, 5, 152-158
Ensayos para el screening de bioocatalizadores
Tipo de ensayo Metodología final
Cromogénico o fluorogénico .- TLCBiosíntesis de productos
coloreados
Reactivos sofisticados.- QUEST .- querying for enzymes using three-hybrid systemcat- ELISA.- enzyme-linked immunosorbent assayCompetitive ELISA
Instrumentos sofisticados.- HPLCMS HPLC-MS (TOF & TOF-TOF)- time of free fly
CE.- capillary array elelctrophoresis
Wahler & Reymond Cur. Opinion Che. Biol. 2001, 5, 152-158
Principios del ensayo “competitive cat-ELISA”
Wahler & Reymond Cur. Opinion Che. Biol. 2001, 5, 152-158
Implica: Unos sustratos y unos productos de bajo Pm que se unen de manera competitiva conel producto o con el conjugado proteína-producto que ocupan un sitio de unión de el productoa sitio específico de un anticuerpo.
El producto se detecta cuando compite con el conjugado proteina-producto.
El aumento de la cantidad de conjugado proteína (AChE) - producto cuanto mas productose forma, se determina después de lavar para eliminar el exceso de reactivos porla detección de un sustrato cromogénico de la acetil colinesterasa. Cuanto mas producto se formó mas enzima enzima –producto se libero y mas actividad AChE se detectara.
Wahler & Reymond Cur. Opinion Che. Biol. 2001, 5, 152-158
Principio de los ensayos cromogénicos y fluorímétricos
En la Figura se muestra el ensayo fluorogénico de la ADH.
La cetona formada por oxidación de uno de los enatiómeros se descompone en presenciade seroalbúmina bovina (BSA) para dar la umbeliferona que es una molécula fluorescentea λ= 460nm.