dr. josÉ antonio fernÁndez lÓpez upctminaeees/fundamentos_analisis_cromatografico.pdf · 1...

1

INTRODUCCIINTRODUCCIÓÓN A LA HPLCN A LA HPLC

Dr. JOSÉ ANTONIO FERNÁNDEZ LÓPEZDepto. Ingeniería Química

Grupo de Investigación QUIMYTECUPCT

FUNDAMENTOS DEL ANALISIS CROMATOGRAFICO.

Cromatografía Líquida de Alta Resolución

22


Cromatografía = escribir en coloresElementos que participan en una cromatografía

1. Fase estacionaria2. Fase móvil3. Muestra

¿Cómo interaccionan?En general, una cromatografía se realiza permitiendo que la mezcla de moléculas que se desea separar (muestra) interaccione con un medio o matriz de soporte que se denomina fase estacionaria. Un segundo medio (la fase móvil)que es inmiscible con la fase estacionaria se hace fluir a través de ésta para "lavar" (eluir) a las moléculas en la muestra.

33


Inicialmente se refería a:High Pressure Liquid Chromatography

En la actualidad hace referencia a:High Performance Liquid Chromatography

La alta presión permite usar relleno de tamaño de partícula reducido para lograr la separación de componentes a flujos razonables.

2

44


fase móvil(Líquido)

bombas que permiten presiones de hasta 6000 psi (414 atm) hacen pasar la fase móvil por el interior de columnas de acero (2-5 mm x 3-25 cm) que contienen la fase estacionaria con flujos de 0,1 – 10 ml/min.

HPLC = high performance liquid chromatography

cromatografía líquida de alta resolución

Otras acepciones equivalentes:

high pressure liquid chromatography

high patient liquid chromatography

high priced liquid chromatography

55


Las muestras no necesitan ser vaporizadas para su análisis. Cualquier sustancia puede ser potencialmente analizada por esta técnica.

El desarrollo instrumental es posterior al de la CG debido a dificultades para lograr un flujo estable en el eluyente.

66


Una muestra en estado líquido es arrastrada por una corriente líquida llamada eluyente.

Como fase estacionaria actúa un sólido finamente dividido (diámetro de partícula 3, 5, 10 μm), o una película líquida a él adherida.

Dependiendo de la retención de los componentes de la muestra por la fase estacionaria y de su solubilidad en el eluyente se provocará su migración diferencial.

3

77


Características:SelectividadReproducibilidadSensibilidadRapidez

Parámetros:Naturaleza de la fase estacionariaTamaño de partículaEluyente (composición y flujo)Detector

Fase Directa:fase estacionaria polarfase móvil de baja polaridad

Fase Reversa:fase estacionaria de polaridad bajafase móvil de polaridad alta

88


Principales mecanismos de interacción en cromatografía líquida:

– Adsorción superficial

– Partición

– Intercambio iónico

– Exclusión molecular

99


La fase estacionaria es sólida. La separación se logra por las diferencias en solubilidad (en fase móvil) y de retención por adsorción (en fase estacionaria) de la mezcla de solutos.

CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN

4

1010


Sílica (90%) y alúmina (10%) son las fases estacionarias más comunes.

Tanto las moléculas de solutos como de disolvente son atraídas hacia los lugares activos polares de la fase estacionaria.

Unos solutos serán más atraídos que otros por la fase estacionaria y así se logrará su migración diferencial.

Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poder de elución y la selectividad adecuadas. Normalmente un disolvente apolar (n-hexano) unido a otro más activo (acetona, cloruro de metilo, etc.).

CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN

1111


La separación se basa en el reparto o distribución de los solutos entre una fase móvil líquida y otra estacionaria inmiscible, soportada sobre un sólido inerte. La discriminación se produce por diferencias de solubilidad.

CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN

1212


El mecanismo de actuación es similar al de un modelo de extracción en contracorriente.

Las especies más retenidas serán las que presenten mayor afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que por la fase móvil (eluyente).

La separación de los solutos se basa en las diferencias en esta solubilidad relativa.


5

1313


Existen dos modos básicos de operación:

Fase normal. Cuando se trabaja con fase estacionaria polar y fase móvil no polar.

Fase reversa. Cuando se emplea una fase estacionaria no polar y fase móvil polar.

Inicialmente tuvo más auge la fase normal pero en la actualidad son más comunes los métodos cromato-gráficos en fase reversa dada la naturaleza hidrofílica de las muestras de mayor interés (clínico, contaminación, alimentos).


1414

INTRODUCCIINTRODUCCIÓÓN A LA HPLCN A LA HPLCCROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN

Según empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elución de bandas y el tiempo de análisis.

1515

INTRODUCCIINTRODUCCIÓÓN A LA HPLCN A LA HPLCCROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN

905Spherisorb A5W

Alúmina6005, 10, 20SpherosilSílice4005, 10, 20μPartisilSílice

2510Lichrospher 100

Sílice2005-7HypersilSílice

Area específica (m2/g)

Tamaño partícula (μm)

Nombre comercial

Tipo

Materiales comerciales empleados como soportes en cromatografía de adsorción y partición.

6

1616

INTRODUCCIINTRODUCCIÓÓN A LA HPLCN A LA HPLCCROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN Y ADSORCIÓN

μBondpak-Phenyl-C6H5Fase Reversa

Nucleosil-C8, Lichrosorb RP8,…-C8H17Fase Reversa

Nucleosil-C18, Lichrosorb RP18, Spherisorb ODS2,…

-C18H37Fase Reversa

Nucleosil-NH2, Lichrosorb-NH2, μBondpak-NH2,…

-(CH2)n-NH2Fase Directa

Nucleosil-CN, Micropak-CN,…-(CH2)3-CNFase Directa

Nucleosil, Kromasil,Inertsil, Partisil,…

SílicaFase DirectaNombre comercial- RMecanismo

Principales fases estacionarias en HPLC

1717


Tanto fase estacionaria como fase móvil son de naturaleza iónica. La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente.

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

R–— A+ + B+ R–— B+ + A+

R+— A– + B– R+— B– + A–

1818

INTRODUCCIINTRODUCCIÓÓN A LA HPLCN A LA HPLCCROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

7

1919


Se emplea para el análisis de todo tipo de iones (inorgánicos y orgánicos).

Las moléculas intercambiadoras se ligan a soportes específicos.

El material intercambiador de la fase estacionaria es de diámetro de partícula pequeño (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 – 10-3 meq/g).


2020


Separación de aniones inorgánicos por cromatografía de intercambio iónico.


2121


La separación se basa en el tamaño molecular. Como fase estacionaria se emplean sustancias de tamaño de poro determinado. También se denomina cromatografía de permeabilidad por gel (GPC).

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

8

2222


Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminación entre los solutos según su tamaño.

Los analitos de mayor tamaño no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos, viajando con la fase móvil en el frente de la misma.

Se muestra especialmente útil para determinar el rango molecular de polímeros, proteínas, etc.


2323


Separación de polímeros de poliestireno por GPC.


2424

INTRODUCCIINTRODUCCIÓÓN A LA HPLCN A LA HPLCEL EXPERIMENTO CROMATOGRÁFICO

Ilustración de un experimento por HPLC.

9

2525

INTRODUCCIINTRODUCCIÓÓN A LA HPLCN A LA HPLCEL EXPERIMENTO CROMATOGRÁFICO

Parámetros de un cromatograma.

2626

INTRODUCCIINTRODUCCIÓÓN A LA HPLCN A LA HPLCMAGNITUDES CROMATOGRÁFICAS

MAGNITUD SÍMBOLO

Tiempo de retención de una sustancia no retenida

seg. tM

Tiempo de retención seg. tR

Tiempo de retención reducido

seg. tR´= tR – tM

Retención relativa -- α = tR2´/ tR1´

Amplitud de bandas a media altura

seg. W

Relación de capacidad -- k´= tR´/tM

Resolución -- RS = 2 [(tR2´- tR1´) / (w2 + w1)]

2727


Equipo básico para HPLC.

EQUIPO

10

2828


Alta pureza (calidad HPLC).

Inactividad frente a la fase estacionaria.

Baja viscosidad.

Compatibles con la muestra.

Facilitar la recuperación de la muestra.

Compatibilidad con el sistema de detección.

Según su composición varíe o no con el tiempo:

Elución isocrática

Elución en gradiente

FASE MÓVIL

2929


Los disolventes deben desgasificarse antes de uso empleo en HPLC.

La desgasificación reduce el riesgo de formación de burbujas en la columna o en el detector.

Posibilidades:Desplazamiento con un gas menos soluble (He)

Aplicación de vacío

Sonicación

Calentamiento

FASE MÓVIL

3030


Presión estable hasta 5000 psi (400 atm) 1 atm = 14,696 psi

Flujo libre de pulsaciones

Amplio rango de flujos (0,1 a 10 mL/min)

Control, exactitud y repro-ducibilidad del flujo

Componentes químicamente inertes y resistentes a la corrosión

BOMBAS

11

3131


Se emplean válvulas inyectoras de volumen (loop) constante

Pueden ser manuales o automáticas

Para variar el volumen de inyección se debe cambiar el “loop” correspondiente

Se debe evitar la entrada de burbujas en el sistema de inyección

SISTEMAS DE INYECCIÓN

3232


Se trata de una pequeña columna (0,5 – 3 cm) colocada entre el inyector y la columna

Ayuda a prevenir la entrada de suciedad, procedente de la muestra o del eluyente, en la columna analítica

Va a permitir alargar la duración de las columnas

Debe ser del mismo relleno que el de la columna analítica

PRECOLUMNAS

3333


Gran avance en la última década por el progreso en la tecnología de rellenos y columnas

Rellenos más uniformes y de menor tamaño

Fases químicamente liga-das a los soportes aumentando su eficacia y resolución

Mejora en los métodos de empaquetado

COLUMNAS

12

3434


Al disminuir el tamaño del relleno aumenta la eficiencia pero también la presión de trabajo

Las columnas constan de:Cuerpo – normalmente de acero inoxidable

Relleno – material con i.d. definido

Algunas casas comerciales permiten la renovación del relleno sin tener que comprar la columna completa

Existen columnas de compresión radial, cuyo cuerpo puede ser presurizado para aumentar su eficiencia

COLUMNAS

3535


Fase Normal

Sílica

Alúmina

Amino (-NH2)

Ciano (-CN)

Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)

Fase Reversa

C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)

C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)

C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)

COLUMNAS

3636

INTRODUCCIINTRODUCCIÓÓN A LA HPLCN A LA HPLCCOLUMNAS

13

3737

INTRODUCCIINTRODUCCIÓÓN A LA HPLCN A LA HPLCCOLUMNAS

Influencia de la longitud de la columna y del tamaño de partícula en la duración del cromatograma

3838


Ventajas de la “High Speed HPLC” con columnas cortas

Tiempo de análisis reducido

Menor consumo de disolventes

Menor dispersión de los solutos a analizar

Ahorro de costes

Mayor sensibilidad

COLUMNAS

3939


Cualquier propiedad física o química que se pueda medir en la disolución podría usarse como método de detección

Los detectores en HPLC no son destructivos

Se pueden clasificar en:

Detectores que miden una propiedad de la fase móvil

Detectores que miden una propiedad de los solutos

DETECTORES

Rapidez

Reproducibilidad

Sensibilidad

Linealidad

Estabilidad

14

4040

INTRODUCCIÓN A LA HPLC

Principales detectores empleados en HPLC:

UV/Vis

Fotodiodos

Índice de refracción

Fluorescencia

Conductividad

Dispersión de luz

Espectrometría de masas

DETECTOR

4141

0,1 – 1 ng0,5 – 1

0,001 – 0,01 ng0,1 – 1 ng

100 – 1000 ng0,1 – 1 ng

Límite detección

SíEspectrometría de masasNoConductividadSíFluoresecenciaSíDispersión de luzNoÍndice de refracciónSíUV/VIS

Permite Gradiente

Detector

INTRODUCCIÓN A LA HPLCDETECTOR

Comparación de detectores usados en HPLC

4242

INTRODUCCIÓN A LA HPLCDETECTOR UV/VIS

Para sustancias que absorben radiación UV/VIS

El más usado

Con lámparas de deuterio, xenon o wolframio

Desde 190 a 900 nm

Camino óptico de la microcelda de un detector UV/VIS. Las celdas ordinarias tienen 0,5 cm de camino óptico y contienen 8 μL de líquido

15

4343284 nmTolueno

212 nmTetrahidrofurano205 nmMetanol195 nmn-Hexano215 nmÉter Dietílico245 nmCloroformo190 nmAgua190 nmAcetonitrilo330 nmAcetona

Longitud de ondaDisolvente

INTRODUCCIÓN A LA HPLCDETECTOR UV/VIS

Longitudes de onda de corte en el UV de disolventes usados en HPLC

4444

INTRODUCCIÓN A LA HPLCDETECTOR FOTODIODOS

Permite registrar la absorbancia simultánea en todo el rango UV/VIS.

La muestra es atravesada por luz blanca (todas las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos. En cada diodo incide una λ diferente, que manda la información al sistema de análisis de datos.

4545


Posibilidades de un detector de fotodiodos.

-0,05

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

AU

0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00 5,50 6,00 6,50 7,00Minutes

250,00

30 0,00

350,00

DETECTOR FOTODIODOS

nm

220,00

240,00

260,00

280,00

300,00

Minutes1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00

AU

0,00

0,20

0,40

0,60

Minutes1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00

Caf

eína

- 5,

357

16

4646


Van a medir variaciones en el índice de refracción del eluato con respecto al del disolvente puro.

Sólo se pueden usar si la elución es isocrática.

Responden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad.

Son muy sensibles a las variaciones de temperatura. Deben estar termostatizados.

DETECTOR DE ÍNDICE DE REFRACCIÓN

4747


Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes.

Se seleccionará la λexc y la λem.

Son de alta sensibilidad.

No se ven interferidos por los disolventes al no tener éstos naturaleza fluorescente.

DETECTOR DE FLUORESCENCIA

4848


Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta.

Empleados fundamentalmente en cromatografía de intercambio iónico.

Inconvenientes:

Baja sensibilidad

Sensibles a impurezas de la fase móvil.

DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD

17

4949


Válido para aquellos solutos que sean claramente menos volátiles que la fase móvil.

El eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partículas sólidas que entran en la zona de detección.

Las partículas se detectan por la luz que procede de un diodo láser y llega al fotodetector por dispersión.

Sólo tampones volátiles en la fase móvil.

DETECTOR DE DISPERSIÓN DE LUZ

5050

INTRODUCCIINTRODUCCIÓÓN A LA HPLCN A LA HPLCAPLICACIONES

5151


18

5252


dr. josÉ antonio fernÁndez lÓpez upctminaeees/fundamentos_analisis_cromatografico.pdf · 1...

Documents