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Clonación y secuenciación del DNA 1

Dr. Antonio Barbadilla

Tema 10: Clonación y secuenciación del DNA



Objetivos tema 10:Clonación y secuenciación del DNA

Deberán quedar bien claros los siguientes puntos:

•¿Cómo se manipula el DNA?•Las endonucleasas (enzimas) de restricción• Clonación del DNA: DNA foráneo, vector de clonación, organismo huésped, selección de vectores•Vectores eucarióticos•Organismos transgénicos•Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto •Mapas de restricción•Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción•La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)•La secuenciación del DNA



Manipulación del DNA

Estudio de una secuencia específica de DNA que suele encontrarse en un conjunto heterogéneo de secuencias.

Aislamiento, amplificación, secuenciación y expresión de un fragmento de DNA específico

Esta tecnología se denomina:Tecnología del DNA recombinante, clonación

génica o ingeniería genética

Ningún campo de la biología ha permanecido igual tras esta revolución tecnológica

Propiedad básica del DNA que permite su manipulación:

El acoplamiento de cadenas por complementariedad. La extraordinaria especificidad del reconocimiento entre secuencias de bases complementarias constituye un poderoso instrumento para la identificación, aislamiento, clonación,... De fragmentos de DNA complementarios a uno dado



Herramienta básica

Endonucleasas (enzimas) de restricción -> Enzimas de bacterias que reconocen secuencias de DNA específicas y lo cortan por el esqueleto azúcar-fosfato.

•Tipo I y III: cortan el DNA en puntos distintos al de reconocimiento (al azar)

•Tipo II: cortan justo en los puntos que reconocen, que son repeticiones invertidas o palíndromes

5´-GGATCC- 3´

3´-CCTAGG- 5´



EcoRI: E. ColiBamHI: Bacillus amyloliquefaciens

Dos tipos de cortes:

•Corte plano: extremos romos

•Corte escalonado:extremos pegajosos o cohesivos



Herramienta básica

Las enzimas de restricción tipo II:

Proporcionan una forma de cortar el DNA de cualquier origen en secuencias específicas, produciendo por tanto una población heterogénea de fragmentos de extremos idénticos



Clonación del DNA

•DNA foráneo (secuencia que se desea clonar)

•Vector de clonación (vehículo)

•Organismo huésped (E. Coli)

•Selección de vectores

Vector híbrido



Vectores híbridos (quimera)Fragmentos de distintas procedencias que se unen in vitro tras cortarse con la misma enzima de restricción. Ligasa sella zona híbridaVectores

de clonación

•Plásmido (1 sitio de corte) 2-15 kb•Fago (Lambda)•Cósmido

Clonación del DNA



Vectores de clonación

•Fago (2 sitios de corte) < 24 kb

•Cromosomas artificiales P1 (derivados del bacteriófago P1, pueden aceptar insertos de 80 y 100 kb

Clonación del DNA

Fago



Vectores de clonación•Cósmido: extremos cos + DNA plásmido (origen replicación) + DNA foráneo + cápisde. ~50 kb

•BAC (cromosoma artificial bacteriano): derivado del plásmido F, insertos de 150-300 kb. Usados en la secuencia de genomas

Clonación del DNA

Cósmido



Huésped: E. coli

Inserción del vector híbrido en el huésped:

•Plásmido: transformación (solución diluida cloruro de calcio) y replicación autónoma

•Fago (transducción, inserción en DNA huésped)

•Cósmido (transducción como fago y replicación como plásmido)

Clonación del DNA



Selección de vectores híbridos

•Plásmido: resistencia a antibióticos

•Fago : Inserción en E. coli (sólo se puede empaquetar el DNA de si contiene el inserto foráneo)

Clonación del DNA



Clonación del DNA

Obtención de la secuencia que se clona

•Un gen •Aislamiento a partir del mRNA (ya no tiene intrones): uso de la transcriptasa inversa que hace cDNA (por ejemplo, 1982 primera insulina humana recombinante en bacterias)

•Síntesis automatizada de DNA in vitro: a partir de la secuencia aminoacídica se puede hacer DNA con la ayuda del código (no región promotora ni controladora de la expresión) ~100bp

•Fragmentos del genoma por digestión con enzimas de restricción (aleotoria o perdigonada, Shotgun)

•Se obtiene genoteca, juego completo fragmentos clonados del genoma del organismo



Permite obtener las máximas ventajas de genes eucariotas

•Vectores de levaduras: cromosomas artificiales de levaduras (YACs):

Plásmidos + Secuencia replicadora + centrómero de levadura + (telómero levadura)Puede incorporar más de 500 kb de DNA

Vectores eucarióticos

Origen de replicación del DNA de levadura

(ARS)

Región centromérica (CEN)

Resistencia a antibiótico (p.e., ampr)

Origen de replicación bacteriano (ori)

CEN ARSampr ori TelómeroTelómero

Linealización (con endonucleasas) y

adición de extremos teloméricos



Transfección: Introducción de DNA foráneo en eucariotasOrganismo transgénico: un eucariota con DNA

foráneo

•Células eucariotas toman DNA foráneo del ambiente con fosfato cálcico (poco eficiente)

•Inyección en el oocito: DNA incorporado en el cromosoma (ratones transgénicos 15% eficiencia)

Métodos transfección



•Retrovirus: parte de su genoma se reemplaza con DNA foráneo (ejemplo: leucocitos humanos carecen enzima adenosina desaminasa (ADA) se repararon por infección viral)




•Electroporación: se usa corriente eléctrica para introducir DNA

•Liposomas: DNA se encapsula en liposomas (vesículas de membrana artificial)

•Biolística (mitocondrias y cloroplastos): disparo de proyectiles de tungsteno recubiertos por DNA

•Plásmidos (Ti de Agrobacterium tumefaciens en plantas) y elementos móviles (Elemento P en Drosophila)




Población de fragmentos

Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto heterogéneos de fragmentos



Separación fragmentos

Reptación de los

fragmentos a través del gel de agarosa



DNA teñido con

bromuro de etidio emite fluorescencia con luz UV



Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto heterogéneos de fragmentos

Se precisa de una sonda marcada (radioactividad, colorantes fluorescentes,...), cDNA suele usarse como sonda

•Transferencia en Southern (Southern blotting)•Transferencia Northern (Northern blotting): se hibrida con RNA



Transferencia en Southern

(esquema resumen)



Mapas de restricciónmediante

enzimas de restricción



Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP)



La reacción

en cadena de la

polimerasa (PCR)



•Secuenciación

•DNA fósil (evolución,

arqueología, historia) DNA

traza

Fósiles

Mamut lanudo (40000

años)

Abraham Lincoln

(síndrome de Marfan,

afecta tejido conectivo,

fribrilina)

Hombre Neandertal ->

Hablaba como

nosotros? Color

cabello?

•Huellas dactilares del DNA (DNA

forense)

Usos de la PCR



Secuenciación de DNA

La secuencia nucleotídica exacta de un fragmento de DNA permite un conocimiento más completo de la estructura y función de un gen.

Métodos:Secuenciación manual (inicial)

Químico (Maxam y Gilbert 1977)Didesoxi (Sanger 1977)

Secuenciación automatizada (1986,…) Didesoxi

Disoxi

•La base molecular de mutaciones específicas en un gen pueden investigarse•Las secuencias del DNA han revelado regiones reguladoras comunes a todos los genes•La comparación de secuencias de diferentes especies provee estimas de las tasas de evolución molecular•Secuenciación de genomas: estructura del genoma



Secuenciación del DNA



Secuenciación automatizada del DNA



http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.html

Animaciones de técnicas de la genética

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