Download - ppt. ENZIMAS INMOVILIZADAS
Las enzimas son catalizadores de origen biológico (proteico), producidas por organismos vivos, que parecen cumplir muchos de los requisitos necesarios para impulsar esta nueva industria química.
¿Qué es una Enzima
Ventajas
Presentan una gran actividad catalítica;
Muestran una gran especificidad de sustrato
Son muy activos a temperatura ambiente y presión atmosférica
Los procesos catalizados por enzimas en la industria son cada día más numerosos, ya que presentan una serie de ventajas frente a los catalizadores convencionales no biológicos.
Inconvenientes
La mayoría de las enzimas no son estables en las condiciones de trabajo.
Al ser solubles en agua, su separación de los sustratos y productos es difícil.
No se pueden reutilizar.
SOLUCIÓN
INMOVILIZACIÓN DE
ENZIMAS
¿Qué es la inmovilización?
Es un confinamiento de un biocatalizador (enzima o célula) en una determinada región
del espacio, de manera que su actividad catalítica se retenga y pueda ser reutilizada
MétodosRetención FísicaUnión química
Retención física
Atrapamiento Consiste en la retención física de la
enzima en las cavidades interiores de una matriz sólida porosa.
El atrapamiento, de gran sencillez desde el punto de vista experimental, requiere poca cantidad de enzima para obtener derivados activos.
La enzima no sufre ninguna alteración en su estructura.
Requiere control riguroso de condiciones de polimerización y comprobación de que la naturaleza química del proceso no altere los grupos reactivos de la proteína
Inclusión en membranas
MicroencapsulaciónLas enzimas están rodeadas de membranas semipermeables que permiten el paso de moléculas de sustrato y producto, pero no de enzima
Reactores de membranaEmplean membranas permeables al producto final, permeables o no al sustrato inicial y obviamente impermeables a la enzima. Mediante una bomba se establece un flujo líquido de sustrato que atraviesa el reactor
Unión Química
Unión a soporte
OrgánicosTipos de soportes
Inorgánicos
Reticulado Reticulado propiamente dicho El método del reticulado consiste en uso de
reactivos bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las moléculas de enzima. (dialdehídos, diiminoésteres, diisocianatos, sales de bisdiazonio)
Coreticulado Permite eliminar las pérdidas de actividad
enzimática debidas a efectos difusionales, mediante el entrecruzamiento de las enzimas con una proteína sin actividad enzimática y rica en residuos de lisina.
Elección del método de Inmovilización
●● No hay un método universalNo hay un método universal
● ● ElecciónElección::
◦◦ Condiciones de la reacción Condiciones de la reacción biocatalizadabiocatalizada
◦◦ Tipo de reactorTipo de reactor◦◦ Tipo de sustrato procesadoTipo de sustrato procesado
MÉTODO Inclusión
en membranas
Atrapamiento
Reticulado
Adsorción química
Unióncovalente
Preparación Intermedia Difícil Intermedia Sencilla Difícil
Fuerza de unión Débil Media Débil-media Media Fuerte
Actividad enzimática Media-Alta Baja Baja Media Alta
Regeneración soporte Posible Imposible Imposible Posible Difícil
Costo proceso Medio-Alto Medio Medio Bajo Alto
Estabilidad Media Alta Alta Baja Alta
Validez General General Limitada General Limitada
Resistencia microbiana Sí Sí Sí No No
●● métodos de preparación métodos de preparación difícil y costososdifícil y costosos biocatalizadores más estables y biocatalizadores más estables y duraderosduraderos
●● métodos más sencillosmétodos más sencillos derivados inmovilizados con derivados inmovilizados con pérdidas de actividad y deben pérdidas de actividad y deben ser repuestos continuamenteser repuestos continuamente
Efectos de la inmovilización
●● Incremento en la estabilidadIncremento en la estabilidad
●● Actividad enzimática afectada por Actividad enzimática afectada por efectos:efectos: EstéricosEstéricos DifusionalesDifusionales Del microentornoDel microentorno
Incremento de la estabilidad
●● Estabilización conformacional (uniones multipuntuales Estabilización conformacional (uniones multipuntuales enzima-soporte)enzima-soporte)
●● Protección frente a las proteasas en el medio.Protección frente a las proteasas en el medio.●● Se evita la agregación intermolecularSe evita la agregación intermolecular●● Alteración del microentorno de la enzimaAlteración del microentorno de la enzima
Efectos en la actividad enzimática
Si se pierde la actividad puede ser debido aSi se pierde la actividad puede ser debido a::
Unión del soporte. Paso del sustrato Unión del soporte. Paso del sustrato impedido.impedido.
Reacción del soporte con parte del centro Reacción del soporte con parte del centro activo.activo.
Cambio conformacional Cambio conformacional Condiciones experimentales. Condiciones experimentales.
Desnaturalización o desactivación de la Desnaturalización o desactivación de la enzima.enzima.
Aplicaciones de las enzimas inmovilizadas
AnalíticasAnalíticas MédicasMédicas En la IndustriaEn la Industria
Biosensores: sensores de glucosa.Biosensores: sensores de glucosa.
cátodo de Ptaislante
buffer KCl
solución a analizar
membranaánodo de
Ag
Glucosa + O2 glucosa oxidasa ácido glucónico + H2O2
Aplicaciones analíticas
Aplicaciones médicas
Antitumoral
Cicatrizante
Farmacéutica: síntesis de antibióticos
Alimenticia: hidrólisis de proteínas e hidratos de carbono
Química: producción industrial de acrilamida
Tratamientos de aguas residuales: degradación del benceno
Aplicaciones en la Industria
Producción de EtanolProducción de Etanol Síntesis química: Mediante la Síntesis química: Mediante la
modificación del etileno por modificación del etileno por hidratación. hidratación.
Bioetanol: Procesamiento de materia Bioetanol: Procesamiento de materia biológica (biomasa). A partir de un biológica (biomasa). A partir de un gran número de plantas; como caña de gran número de plantas; como caña de azúcar, remolacha, melazas, etc.azúcar, remolacha, melazas, etc.
PROCESO BIOETANOLPROCESO BIOETANOL
Fermentación anaeróbica de Fermentación anaeróbica de azúcares llevada a cabo por azúcares llevada a cabo por bacterias o levaduras en solución bacterias o levaduras en solución acuosa y una posterior destilación.acuosa y una posterior destilación.
Investigación producción de ETANOL con células
inmovilizadasCepas de Zymomonas mobilis: var. mobilis (Zmm1 y Zmm2) pomaceae (Zmp1 y Zmp2)
Aisladas de muestras de melazas de caña con el propósito de realizar un estudio comparativo con resultados reportados anteriormente a partir de:
células libres,Zymomonas mobilis mobilis (CETC) 560, considerada alta productora de etanol.
Resultados de la Resultados de la investigacióninvestigación
Los resultados revelaron a una concentración de inmovilización del 2% p/v, un rendimiento de 92.1%, por parte de las cepas nativas Zmm1 y Zmm2 y de 97.85%, con Zmm 560, comparado con los rendimientos de etanol obtenidos a partir de células libres, de 72.9% por parte de Zmm1 y 76.74% con Zmm 560.
Ventajas del uso de células inmovilizadas
Teniendo en cuenta que la utilización de células inmovilizadas ha sido considerado un método eficaz en el aumento de producción de metabolitos por parte de las células ya que permite: la utilización de células por largos
periodos de tiempo, aumenta la estabilidad de las células permite ventajas en la configuración de
reactores entre las que se incluyen: un rápido control de pH y temperatura, mantener altas concentraciones de células no requiere sistemas de agitación.
Inmovilización de células Se utiliza un polímero en este caso alginato de calcio. Se deja gotear una solución de alginato de Na+ en
una solución de CaCl2 obteniéndose en tiempos cortos, bolillas esféricas de tamaño controlado y homogéneo. Es un método que presenta gran flexibilidad, pues alginatos de distinto peso molecular y distinta composición química rinden geles de muy buenas características químicas y físicas.
El rango de temperaturas de operación va desde 0 hasta 80 ºC.
Las bolillas que se obtienen presentan diámetros entre 0,1 y 5 mm. y pueden presentar una alta carga celular por entrampamiento directo (hasta 30 g de células húmedas por ml de catalizador).
Este sistema puede someterse a un secado parcial, con lo que el tamaño disminuye y aumenta la estabilidad mecánica sin variación en la porosidad.
Puntos destacables del método
Reversibilidad de la gelificación: obliga a tomar precauciones en cuanto a la composición del medio a utilizar, principalmente pH y presencia de agentes que puedan secuestrar a los contraiones por precipitación o por formación de complejos.
Buena estabilidad mecánica respecto al empaquetado en columna y a la agitación.
Formación de bolillas regulares, y con tamaño controlado.
Formación de redes macroporosas, que se conservan aún después del secado parcial.
Alta capacidad de carga sin pérdida de estabilidad mecánica, pero con pérdida de eficiencia debido a resistencias difusionales.
Rendimientos de actividad catalítica de entre 80 y 100% en condiciones de reacción controladas.
Método suave, que permite que las células mantengan viabilidad y estabilidad.
Flexibilidad y simplicidad
FERMENTACIÓN
Bioreactores para células inmovilizadas
Consideraciones para elegir el bioreactor
estudio de la variación de la velocidad inicial de reacción frente a la variación de las concentraciones de enzima y de sustrato.
efecto del tipo de buffer y del ph. limitaciones difusionales en el
sistema (efecto del tamaño de partícula y la carga enzimática)
grado de conversión frente a tiempo de residencia.
estabilidad del biocatalizador en el almacenamiento (velocidad inicial residual tras el almacenamiento a diferentes tiempos en diferentes condiciones).
estabilidad operacional (velocidad inicial residual después de diferentes ciclos catalíticos).
Agradecimientos:Agradecimientos: DR. Miguel ArroyoDR. Miguel Arroyo
Adriana Matiz, Claudia Torres y Raúl Pontou
Laboratorio de Biotecnología Aplicada Dpto. de Microbiología_ Facultad de Ciencias_ Pontificia Universidad Javeriana de Bogotá Colombia
Dr. CivitDr. Da SilvaIng. PuglisiIng. Fuentes Berazategui
Dpto. de Bioquímica y Biología Molecular_Facultad de Cs. Biológicas Universidad Complutense de Madrid.