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Making quality control easy
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Materiales de referencia microbiológicos
26 de octubre 2011
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1. ¿Qué es un material de referencia?
2. ¿Qué es un material de referencia certificado?
4. ¿Qué son los productos BACuali, BACuanti, BAControl, BACuanti PCR y BACuantiDNA desarrollados por Labaqua?
3. ¿Qué características principales tienen los materiales de referencia microbiológicosdesarrollados por Labaqua?
Preguntas más frecuentes
6. ¿Qué proporciona el uso de los materiales de referencia y materiales de referenciacertificados?
DNA desarrollados por Labaqua?
5. ¿Qué diferencia existe entre los diferentes materiales presentados por Labaqua?
7. ¿Qué vantajas presentan estos materiales frente a las cepas habituales procedentesde Colecciones de Cultivo?
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Preguntas más frecuentes
10. ¿Es obligatoria la realización de todas estas actividades?
11. ¿Qué es validar un método de ensayo?
9. ¿En que actividades del laboratorio puedo emplear estos materiales?
8. ¿ Son los productos BACuali, BACuanti, BACuanti PCR, BAControl y BACuantitrazables con cepas de Colecciones de Cultivo?
12. ¿Cuales son los controles de calidad que debe efectuar un laboratorio?
13. ¿Cuales son los controles de calidad internos que debe realizar un laboratorio?
15. ¿Con que periodicidad debe un laboratorio realizar las actividades internas decontrol de calidad?
14. ¿Qué son los controles externos de calidad?
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Material de Referencia (ISO 17025)
Material o substancia una o más de cuyas propiedades tienen valores suficientemente homogéneos y claramente establecidos como para poder ser utilizados en la calibración de un aparato, la evaluación de un método de medida, o la asignación de valores materiales.
Materiales de Referencia
Material de Referencia Certificado (ISO 17025)
Material de referencia, acompañado de un certificado, en el cual uno o más valores de sus propiedades han sido certificados mediante un procedimiento que establece su trazabilidad a una realización exacta de la unidad en la que se expresan los valores de dichas propiedades. Cada valor certificado se acompaña de una incertidumbre y el nivel de confianza correspondiente.
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Cepa de Referencia (ISO 11133)
Microorganismo definido por lo menos al nivel de género y especie, catalogado y descrito según sus características y preferiblemente de origen conocido.
Cepa de Reserva (ISO 11133)
Cepas idénticas logradas mediante un único subcultivo de una cepa de
Materiales de Referencia
Cepas idénticas logradas mediante un único subcultivo de una cepa de referencia, o lo que es lo mismo, una serie de alícuotas de cultivos idénticos elaboradas en el laboratorio por subcultivo de la cepa de referencia.
Cepa de Trabajo (ISO 11133)
Subcultivos primarios obtenidos de una cepa de reserva, a fín de ser empleados en los ensayos pertinentes.
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G-ENAC-04: Utilización de cepas de referencia
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Un material de referencia debe ser:
• Representativo• Representativo
• Valor de la propiedad (Identidad)
• Homogéneo
• Estable
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1. Ampolla conteniendo material liofilizado
2. Rotura de la ampolla con diamante
3. Rehidratación en medio líquido apropiado
4. Extensión en medio sólido apropiado
Material liofilizado clásico
5. Crecimiento y preparación de cepas de reserva
TIEMPO: 24-48 h
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Material liofilizado clásico
1. Preparación suspensión bacteriana
2. Preparación de diluciones seriadas
3. Incubación y recuento del título
TIEMPO: 24-48 h
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Inconvenientes de los materiales de referencia microbiológicos
NECESIDAD DE NUEVOS MATERIALES DE REFERENCIA
- Estabilidad (microorganismos)
- Homogeneidad (bajas concentraciones)
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Nuevos Materiales de Referencia
BACuanti BACualiBAControl
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Objetivo
Desarrollo de un material de referencia microbiológicoGUÍA-ISO 34 “General requirements for the competence ofreference materials producers ”
-Fácil de preparar
-Homogéneo
-Estable
-Fácil de usar
-Aplicable a diferentes microorganismos
Guia ISO 35 e ISO 13528
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Material de Referencia: Preparación I
� Comprobación de la identidad de la cepa mediante secuenciacióndel gen rDNA 16S
� Hidratación de la cepa de una Colección de Cultivos Tipo
del gen rDNA 16S
� Realización de la titulación del microorganismo
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Material de Referencia: Preparación II
� Realización de los cálculos a partir del título obtenido
Pastillas de rango bajo (<2 log)
Pastillas de rango alto (>2 log)
� Preparación y dispensación de una mezcla homogénea :“Caldo de mantenimiento” + suspensión bacteriana
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Material de Referencia: Preparación III
� Proceso de estabilización (liofilización)
� Desemblistado y conservación a -18ºC
� Resultado: PASTILLA
� Desemblistado y conservación a -18ºC
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Material de Referencia: Controles de calidad I
1. Reconstitución del Material de Referencia
2. Controles de esterilidad
� De cada cepa empleada
� De cada mezcla preparada
� De cada lote fabricado
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Material de Referencia: Controles de calidad II
10 pastillas, 2 réplicas de cada pastilla
� ISO 13528: Statistical methods for use in proficiency testingby interlaboratory comparisons
T2/(I-1) ≤ 2� T: Test estadístico de Cochran (Heisterkamp et. al.,1993)
3. Homogeneidad
(Heisterkamp et. al.,1993)
� ANOVA
ss ≤ 0.3 σ
p-valor>0.05
(σ: desviación estándar diana)
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Ejemplo 1:
Test T
Lote PCP11088
C. perfringens
Cápsula Réplica 1 Réplica 21 42 362 30 48 Media 39,53 40 46 Nº cápsulas 104 39 445 37 34 Limites6 44 37 T-1 (97.5%) T-1(2.5%)
Microorganismo: Clostridium perfringens (UFC/1 mL)Dilución: 1/10
ESTUDIO DE MATERIAL DE REFERENCIA
HOMOGENEIDAD PASTILLAS (11/02/08) Lote PCP11028
Material de Referencia: Controles de calidad II
Homogeneidad
7 41 43 T-1: 6,22 3,25 20,488 37 37 T-1/I(J-1): 0,579 41 39 T-2 (5%)10 38 36 T-2: 2,67 16,92
T-2/(I-1): 0,30
Media geométrica 39,2St. dev. (log) 0,027
RESULTADO: T-1T-2
HOMOGENEOHOMOGENEO
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Análisis de varianza de un factor
RESUMENGrupos Cuenta Suma Promedio Varianza
Fila 1 2 3,179551791 1,589775896 0,00224094Fila 2 2 3,158362492 1,579181246 0,02083248Fila 3 2 3,264817823 1,632408912 0,00184211Fila 4 2 3,234517284 1,617258642 0,00137225Fila 5 2 3,099680641 1,549840321 0,00067428Fila 6 2 3,211654401 1,6058272 0,00283135Fila 7 2 3,246252312 1,623126156 0,00021393Fila 8 2 3,136403448 1,568201724 0Fila 9 2 3,203848464 1,601924232 0,00023586Fila 10 2 3,136086097 1,568043049 0,00027568
Ejemplo 1: ANOVA, Homogeneidad Lote PCP11028 C. perfringens
Material de Referencia: Controles de calidad II
ANÁLISIS DE VARIANZAOrigen de las variaciones
Suma de cuadrados
Grados de libertad
Promedio de los cuadrados
F ProbabilidadValor crítico
para FEntre grupos 0,013184202 9 0,001464911 0,48000145 0,857775864 3,020382947Dentro de los grupos 0,030518894 10 0,003051889
Total 0,043703096 19
Ss= 0,028168937
Ss/sigma= 0,06 < 0.3
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Cápsula Réplica 1 Réplica 21 10 132 9 13 Media 12,13 15 13 Nº cápsulas 104 17 155 12 14 Limites6 17 13 T-1 (97.5%) T-1(2.5%)7 6 10 T-1: 8,74 3,25 20,48
Microorganismo: Escherichia coli (UFC/1 mL)Dilución:
ESTUDIO DE MATERIAL DE REFERENCIA
ESTUDIO HOMOGENEIDAD PASTILLAS (08/02/07) Lote PEC08027Ejemplo 2:
Test T
Lote PEC08027
E. coli
Material de Referencia: Controles de calidad II
Homogeneidad
7 6 10 T-1: 8,74 3,25 20,488 9 15 T-1/I(J-1): 0,799 8 8 T-2 (5%)10 17 7 T-2: 10,49 16,92
T-2/(I-1): 1,17
Media geométrica 11,5St. dev. (log) 0,104
RESULTADO: T-1T-2
HOMOGENEOHOMOGENEO
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Ejemplo 2: ANOVA, Homogeneidad Lote PEC08027 E. coliAnálisis de varianza de un factor
RESUMENGrupos Cuenta Suma Promedio Varianza
Fila 1 2 2,11394335 1,05697168 0,00649154Fila 2 2 2,06818586 1,03409293 0,01275218Fila 3 2 2,29003461 1,14501731 0,00193118Fila 4 2 2,40654018 1,20327009 0,00147738Fila 5 2 2,22530928 1,11265464 0,00224094Fila 6 2 2,34439227 1,17219614 0,00678677Fila 7 2 1,77815125 0,88907563 0,02460843Fila 8 2 2,13033377 1,06516688 0,02460843Fila 9 2 1,80617997 0,90308999 0Fila 10 2 2,07554696 1,03777348 0,07424765
Material de Referencia: Controles de calidad II
ANÁLISIS DE VARIANZA
Origen de las variaciones
Suma de cuadrados
Grados de libertad
Promedio de los
cuadradosF Probabilidad
Valor crítico para F
Entre grupos 0,19622884 9 0,0218032 1,40534808 0,300849328 3,02038295Dentro de los grupos 0,15514451 10 0,01551445
Total 0,35137335 19
Ss= 0,05607474
Ss/sigma= 0,21 < 0.3
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Pastilla Replica 1 Replica 21 39,07 37,842 36,1 37,23 Media 37,23 36,67 36,58 Nº Pastillas 104 35,74 37,715 39,92 36,51 Limites6 36,06 38 T-1 (97.5%) T-1(2.5%)7 36,48 38,02 T-1: 0,39 3,25 20,488 37,42 37,76 T-1/I(J-1): 0,04
Estudios de Homogeneidad (04/08/02) Lote PLPQ28036Microorganismo: Legionella pneumophila (ct/7.1 uL)
Ejemplo 3:
Test T
Lote PLPQ28036
L. pneumophila Q-PCR
Material de Referencia: Controles de calidad II
Homogeneidad
8 37,42 37,76 T-1/I(J-1): 0,049 36,73 38,84 T-2 (5%)10 36,28 35,94 T-2: 0,28 16,92
T-2/(I-1): 0,03
Media geométrica 37,2St. dev. (log) 0,009
Resultados: T-1T-2
HOMOGENEOHOMOGENEO
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� Estudios previos:
� Temperatura de conservación: ambiente, 4ºC y –18ºC.
� Estabilidad medio plazo: Período de tiempo de 15-20 días
� Estabilidad largo plazo: 9 meses
Material de Referencia: Controles de calidad III
4. Estabilidad
Dos pastillas por triplicado durante X días
� Estudiado tanto por cultivo como por Q-PCR (L. pneumophila)
� Estudios estadísticos (ISO 13528):
� /X-Y/ < 0.4 σ (X:media homogeneidad; Y:media cada día
estudiado; σ:desviación estándar diana)
� L.pneumophila: Análisis de varianza (p-valor>0.05)
� Gráficas de evolución temporal
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Escherichia coli
Temperatura de conservación
ESTABILIDAD LOTE PEC160
3.5
4
4.5
Conservar a –18ºC
Material de Referencia: Controles de calidad III
4. Estabilidad
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 112 119 126 133 140 147 154 161 168 175
DIAS
E.coli Tªamb.
E.coli Nevera
E. coliCongelador
Conservar a –18ºC
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ESTABILIDAD LOTE PCF25115
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
0 5 10 15
DIAS
Citrobacter f.
Lineal(Citrobacter f.)
Citrobacter freundii
Estabilidad a corto plazo
Material de Referencia: Controles de calidad III
4. Estabilidad
y = 0,0045x + 5,16860 5 10 15
DIAS
ESTABILIDAD DIANA PCF25115
0,0000
0,0200
0,0400
0,0600
0,0800
0,1000
0,1200
0,1400
0,1600
0 4 7 11 15
/X-Y/0,4xSs
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Estabilidad a largo plazo
ESTABILIDAD LOTE 160 PEF28084
2,5
3,0
3,5
4,0
E.faecium
Enterococcus faecium
Material de Referencia: Controles de calidad III
4. Estabilidad
y = -0,0002x + 2,9436
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 112 119 126 133140 147 154 161168 175
DIAS
E.faecium
Lineal(E.faecium)
Caducidad 6 meses
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Estabilidad a largo plazo
Legionella pneumophila Lote PLP18065 Means and 95,0 Percent LSD Intervals
1,5
1,6
1,7
1,8
RE
SU
LTA
DO
S
Material de Referencia: Controles de calidad III
4. Estabilidad
07
1421283842495763707784
Box-and-Whisker Plot
1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8
RESULTADOS
DIA
Sp-valor=0,5898
0 7 14 21 28 38 42 49 57 63 70 77 84
DIAS
1,4
RE
SU
LTA
DO
S
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Estudios de certificación I
Condiciones:
- 7 laboratorios acreditados por ENAC
- 2 pastillas por triplicado
- mismas condiciones de ensayo
Microorganismo Medio cultivo Tiempo/ Temperatura incubaciónMicroorganismo Medio cultivo Tiempo/ Temperatura incubación
Escherichia coli Tergitol-7 agar 24 h a 37ºCCitrobacter freundii Tergitol-7 agar 24 h a 37ºCEnterococcus faecium Slanetz-Bartley agar 48 h a 37ºCClostridium perfringens TSC agar 24 h a 44ºC (Anaerobiosis)Legionella pneumophila BCYE-α 4 días a 37ºCStaphylococcus aureus Chapman manitol 48 h a 37ºCPseudomonas aeruginosa Agar Cetrimida 48 h a 37ºC
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Resultados:
- fecha envío resultados
- boletín de resultados
- tratamiento estadístico (Guía ISO 35:
Certification of reference materials. General and
statistical principles)
LABORATORIO:
MICROORGANISMO:
LOTE:
12
BOLETÍN DE RESULTADOS (*)
RESULTADOS MEDIO ESPECÍFICO
RESULTADOS MEDIO GENERAL (en su caso)
PASTILLA UNIDADESRÉPLICA
R1 R2 R3
PASTILLA UNIDADESRÉPLICA
R1 R2 R3
Estudios de certificación II
� ¿Diferencias entre pastillas?
� ¿Diferencias entre réplicas?
� ¿Diferencias entre laboratorios?
12
NOTA: En caso de que los resultados correspondan a una dilución, indicar a cual corresponde.
OBSERVACIONES:
(*)Realizar tantas copias de este boletín como lotes s e hayan analizado
R1 R2 R3
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Estudios de certificación III
PEF01028 (19/02/2008)
R1 R2 R3 R1 R2 R3Lab 1 1400 1600 2800 2000 3000 2600Lab 2 1980 1800 1740 1760 1940 1800Lab 3 1220 1740 1580 2140 1560 1800Lab 4 2200 2000 1600 2600 1400 1400Lab 5 2000 1800 1600 2000 1600 2000Lab 6 1600 1200 2000 2800 2600 2000Lab 7 1620 1880 1760 2080 2200 1960
Slanetz Bartley (ufc/pastilla)Pastilla 1 Pastilla 2
AMC Robust Statistics V1.0
ROBUST STATISTICS SUMMARYEstimate Estimate value ParametersMedian 3,263512308A15 mean 3,268905864 c=1.5: Convcrit=0.001H15 mean 3,271059179 c=1.5: Convcrit=0.001MAD 0,016808962MADe 0,024920982sMAD 0,024920982H15 Std Dev 0,029790253 c=1.5: Convcrit=0.001
¡¡¡Calcular la estadística robusta para obtener H15 mean y H15 Std Dev!!!
¡¡¡Asignar valor de n (Nº de laboratorios)!!!
Enterococcus faecium
X S3,3318 0,13643,2635 0,02313,2174 0,08113,2591 0,11093,2611 0,04763,2912 0,13593,2803 0,0483
TOTAL media robusta 3,271desviación estandard 0,030
Incertidumbre=s/raiz n 0,011 Intervalo confianza(I)=t*s/raiz n 0,02755238% 0,344 3,244
3,299
Valor medio/pastilla 1,87E+03Incertidumbre (%) 0,34
1,75E+031,99E+03
VALORES CERTIFICADO
Intervalo confianza
¡¡¡Asignar valor de t en la tabla, para (n-1)!!!
Intervalo (media-I; media+I)
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Certificados de análisis: Cuantitativos
Guía ISO 31: Contenido de Certificados de Materiales de ReferenciaDescripciónCódigo: L060046Microorganismo: Citrobacter freundii V318 precedente de NCTC 6272, con menos de dos pases desde la cepa liofilizada empleadaLote: PCF05028Fecha de preparación: 05/02/08
Valor medio por pastilla, en las condiciones de análisis indicadas
Caducidad 6 meses
BACuanti
Fecha de preparación: 05/02/08Fecha de caducidad: 05/08/08
ResultadosPorcentaje del lote analizado: 10%Valor medio por pastilla: 2.06x103 ufcIncertidumbre: + 1.82%Intervalo de confianza 95%: 1.46x103 – 2.89x103 ufc
Conservar a –18ºC
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Certificados de análisis: Cuantitativos
Guía ISO 31: Contenido de Certificados de Materiales de ReferenciaDescripciónCódigo: L060046Microorganismo: Citrobacter freundii V318 precedente de NCTC 6272, con menos de dos pases desde la cepa liofilizada empleada
Valor por pastilla, en las condiciones de ensayo del fabricante
Caducidad 6 meses
BAControl
pases desde la cepa liofilizada empleadaLote: PCF07028Fecha de preparación: 07/02/08Fecha de caducidad: 07/11/08
Resultados
Valor por pastillaobtenido por el fabricante: 8.87x103 ufc
Conservar a –18ºC
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DescripciónCódigo: L060031Microorganismo: Citrobacter freundii V318 precedente de NCTC 6272, con menos de dos pases desde la cepa liofilizada empleadaLote: PCF25117Fecha de preparación: 25/11/07
Caducidad 9 meses
Certificados de análisis: Cualitativos
BACuali
Certificación de la identidad de la cepa suministradaFecha de preparación: 25/11/07Fecha de caducidad: 25/08/08
Control de calidadContaminación: CorrectoHomogeneidad: HomogéneoEstabilidad: Estable
Conservar a –18ºC
la cepa suministrada
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DescripciónCódigo: L060047Microorganismo: Legionella pneumophilaL2949 precedente de ATCC 33152, con menos de dos pases desde la cepa liofilizada empleadaLote: PLPQ21018Fecha de preparación: 21/01/08Fecha de caducidad: 21/01/09
Valor medio por pastilla, en las condiciones de análisis indicadas
Caducidad 12 meses
Certificados de análisis: Cuantitativos para PCR
BACuanti- PCR
ResultadosPorcentaje del lote analizado: 10%Valor medio por pastilla: 3.15x108 célulasIncertidumbre: + 0.98%Intervalo de confianza 95%: 1.84x108 – 5.37x108 células
Fecha de caducidad: 21/01/09condiciones de análisis indicadas
Conservar a temperatura ambiente
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DescripciónCódigo: L060024Microorganismo: Legionella pneumophilaL2949 precedente de ATCC 33152, con menos de dos pases desde la cepa liofilizada empleadaLote: LN31018Fecha de preparación: 17/01/08Fecha de caducidad: 17/07/08
Caducidad 6 meses
Valor medio por vial, en las
Certificados de análisis: Cuantitativos para PCR
BACuanti- DNA
Fecha de caducidad: 17/07/08
ResultadosPorcentaje del lote analizado: 10%Valor medio por pastilla: 12 µg (2.8x109 unidades genómicas)Incertidumbre: + 2.6%Intervalo de confianza 95%: 11.32 - 12.70 µg/vial
Valor medio por vial, en las condiciones de análisis indicadas
Conservar a temperatura ambiente
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Recepción del material Conservar a -18ºC Rasgar la bolsa de aluminio Extraer el dispositivo
Material de Referencia: Guía rápida de utilización (BACuanti/BACuali)
Extraer el dispositivo Romper precinto seguridad Girar siguiendo flecha Liberar la pastilla en 20 mL
Incubar 10 min. Suspensión bacteriana Tratar como una muestra Comparar con el valor certificado
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Material de Referencia: Guía rápida de utilización (BAControl)
Recepción del material Conservar a -18ºCExtraer el vial
Romper precinto seguridadAdicionar 20 mL
Incubar 10 min. Tratar como una muestra
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Materiales de referencia disponibles
BACuanti • Escherichia coli
• Citrobacter freundii
• Entrococcus faecium
• Clostridium perfringens
• Pseudomonas aeruginosa
• Staphylococcus aureus
• Legionella pneumophila
Material cuantitativo Material cuantitativo
BAControl
� Material cuantitativo
� Cada pastilla contiene un número determinado de células viables y cultivables
� Útil para la validación de métodos y controles de calidad cuantitativos
� Disponibilidad de rango bajo (<2log) y rango alto (>2log)
� Material cuantitativo
� Cada pastilla contiene un número determinado de células viables y cultivables
� Útil para el control de calidad rutinario (controles de proceso, gráficos de control, control de calidad de medios de cultivo, etc.)
�Disponibilidad de rango bajo (<2log) y rango alto (>2log)
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Materiales de referencia disponibles
BACuali• Escherichia coli
• Citrobacter freundii
• Entrococcus faecium
• Clostridium perfringens
• Pseudomonas aeruginosa
• Staphylococcus aureus
• Legionella pneumophila• Legionella pneumophila
• Salmonella enterica subsp. enterica
� Material cualitativo
� Se certifica la identidad de la cepa suministrada
� Útil para la validación de métodos y controles de calidad cualitativos
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BACuanti- PCR � Legionella pneumophila
� Material cuantitativo
� Cada pastilla contiene un número determinado de células inactivadas
� Útil para la validación de métodos moleculares y control de calidad del proceso analítico completo
Materiales de referencia disponibles
analítico completo
� DNA liofilizado de Legionella pneumophila
� Material cuantitativo
� Cada vial contiene un número determinado de unidades genómicas
� Útil para la validación de métodos moleculares y control de calidad de la fase de amplificación por PCR
BACuanti- DNA
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Materiales de Referencia: Ventajas
SENCILLEZ: la preparación del material es extremadamente simple, gracias al formato en pastilla que se suministra en un vial o en un dispositivo plástico estéril de muy fácil uso, que evita manipulaciones engorrosas
RAPIDEZ: el tiempo de reconstitución se reduce a 10 minutos
SEGURIDAD: al reducirse las manipulaciones al mínimo, se reduce el riesgo de contaminación
TRAZABILIDAD: las cepas empleadas son trazables a diferentes Colecciones de Cultivos tipoCultivos tipo
CALIDAD: el material va acompañado de una Guía Rápida de Uso y el correspondiente Certificado de Análisis
FLEXIBILIDAD: el material está disponible en dos rangos de concentraciones, baja (<2 log.) y alta (>2 log.)
SERVICIO: además de las especies disponibles en stock, se ofrece la posibilidad de preparar material de referencia a una concentración predefinida por el cliente
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1. Ampolla conteniendo material liofilizado
2. Rotura de la ampolla con diamante
3. Rehidratación en medio líquido apropiado
4. Extensión en medio sólido apropiado
5. Crecimiento y preparación de cepas de reserva
Material liofilizado clásico
TIEMPO: 24-48 h1. Preparación suspensión bacteriana
2. Preparación de diluciones seriadas
3. Incubación y recuento del título
TIEMPO: 24-48 h
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1. Sacar del congelador
2. Abrir el sobre de aluminio/Extraer el vial de la caja
3. Abrir el dispositivo de dispensación/Desprecintar el vial
4. Servir una pastilla/Adicionar el agua
Material de referencia:BACuanti – BACuali - BAControl
4. Servir una pastilla/Adicionar el agua
5. Incubar a Tª ambiente 10 min.
6. Material preparado
TIEMPO: 15 min
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TIEMPO: 48-96 h TIEMPO: 15 min
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Uso de los materiales de referencia junto con los kits de
qPCR
www.ielab.es
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KITS PARA CADA UNA DE LAS FASES DEL PROCESO
CONCENTRACIÓN DE MUESTRAS DE AGUA
EXTRACCIÓN & -Kit aguas limpias-Kit aguas sucias
Kits de diagnóstico molecular
PURIFICACION DE DNA
ANALISIS POR PCR
-Kit aguas sucias
- Confirmación bacteriológica por PCR- Detección cualitativa de Legionella- Detección cuantitativa de Legionella
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KITS PARA CADA FASE DEL PROCESO
1. KIT DE CONCENTRACIÓN DE MUESTRAS DE AGUA
2. KIT EXTRACCIÓN & PURIFICACIÓN DE DNA
Kits de diagnóstico molecular
- Membranas de filtración
- Tubos de recogida
- Tubos de concentración
AGUA LIMPIA AGUA SUCIA
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KITS PARA CADA FASE DEL PROCESO
3. ANALISIS POR PCR
3.1. Confirmación bacteriológica por PCR
3.3. Kit de detección cuantitativa de Legionella spp . y
Kits de diagnóstico molecular
bacteriológica por PCR (confirmación simultánea de
hasta 10 especies)
3.2. Kit de detección cualitativa de Legionella spp . y L. pneumophila
L. pneumophila
� CONTROLES POSITIVO & NEGATIVO
� CONTROL INTERNO POSITIVO
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KITS DE DETECCIÓN CUALITATIVA DE
Legionella spp. y L. pneumophila
DescriptionCode: I060002Specificity: Legionella pneumophilaBatch: CLN11068Manufacturing date: 11/June/2008
Analysis conditionsMethod: amplification by PCR and electroforesis in agarose gel analysisThermocycler: GeneAmp PCR System9700, Applied Biosystems
Kits de diagnóstico molecular
Manufacturing date: 11/June/2008Expiry date: 11/Dec/2008Number of tests : 70
Applied BiosystemsAmplification program: Denaturation at 95ºC 4 min, 35 cycles of 95ºC 30 s., 58ºC 30 s., 72ºC 1 min. and final extesion at 72ºC 10 min.
Quality controlsPositive control amplification: rightNegative control amplification: rightInternal positive control amplification: right
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KITS DE DETECCIÓN CUANTITATIVA DE Legionella spp. y L. pneumophila
Quality controls
Used fungible materialTaqMan Environmental Master Mix, Internal positive control (plamidic DNA), primers, probe and Legionella spp. ATCC 33152 DNA as
DescriptionCode: ED000864Specificity: Legionella spp.Batch: QLS030909
Analysis conditionsMethod: amplification by “real time” PCR Thermocycler: 7500 Real-Time PCR System, Applied Biosystems
Kits de diagnóstico molecular
Quality controlsPositive control amplification: rightNegative control amplification: rightInternal positive control amplification: right
and Legionella spp. ATCC 33152 DNA as positive controlBatch: QLS030909
Manufacturing date: 08/June/2009Expiry date: 08/March/2010Number of tests : 70
Applied BiosystemsAmplification program: 50ºC 2 min, 95ºC 10 min. and 42 cycles of 95ºC 15 s. and 60ºC 1 min.
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Dispensar la pastilla en un tubo con 4 mL de
agua estéril
Ejemplo de aplicación: Legionella pneumophila
Incubar durante 10 min a Tª ambiente
Analizar como una muestra de rutina
RMPreparación de la
muestra de trabajo cuantitativa
Control de proceso en qPCR
ConcentraciónEluciónExtracción/Purificación
de DNA
Analisis por qPCR
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� El Control de Calidad Interno permite establecer laTasa de Recuparación del proceso completo dePCR (concentración de muestra, extracción/purificación de DNA, etc.)� El uso de RM ayuda en la Validación de métodosPCR methods, porque facilita la preparación demuestras cuantitativas y la determinación de laExactitud y Precisión del método.
Ejemplo de aplicación: Legionella pneumophila
Control de proceso en qPCR
Proceso completo
(6.72x104 células/pastilla)
Análisis directo
(1.49x105 células/pastilla)
Exactitud y Precisión del método.
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Ct=-3,028 log[DNA]]]] +39,6148
R²= 0,94743 r= -0,9733
Rectas de calibrado
CURVA ESTANDAR
40
50
STANDARD CURVE
Curva de calibrado
Ejemplo de aplicación: Legionella pneumophila
Certificación Multisector0
10
20
30
40
0 2 4 6 8 10
Log Nº copies
Ct
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ConcentratciónPreparación de la
muestra de trabajo
cuantitativa
Incubar durante 10 min a Tª ambiente
Routine qPCR control
Dispensar la pastilla en un tubo con 4 mL de
agua estéril
BACuanti-PCR
Analizar como una muestra de
rutina
RM
Ejemplo de aplicación: Legionella pneumophila
EluciónExtración/purificación de DNAAnalysis por qPCR
BACuanti-DNA
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PTs, Materiales de Referencia y Kits qPCR:
1. Facilitan la aplicación de métodos normalizados y validados.
2. Ahorra tiempo de implementación.
3. Ofrecen un sistema rápido y fácil de implementar sistemas intenos
Conclusiones
y externos de control de la calidad.