GRUPO DE PATÓLOGOS DEL NOROESTEREUNIÓN ACADÉMICA 2013
BIOLOGÍA MOLECULAR BÁSICA PARA EL PATÓLOGO
Luis Muñoz FernándezCentenario Hospital Miguel Hidalgo
Biopath MéxicoAguascalientes, Ags.
López-Corella E. Patología 1991; 29: 65-66.
EL CONOCIMIENTO DEL CÁNCER A LOS LARGO DEL TIEMPO
DeVita VT et al. Primer of the Molecular Biology of Cancer 2011: 4-5.
EL CONOCIMIENTO DEL CÁNCER A LOS LARGO DEL TIEMPO
De Vita VT el al. Primer of the Molecular Biology of Cancer 2011: 4-5.
LiVolsi V, Upton MP. Am J Clin Pathol 2012;137: 341-342.
DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Blakey GL, Farkas DH. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 62.
BIOMARCADORES• Es una característica que se mide objetivamente
como un indicador de:• Un proceso biológico normal.• Una enfermedad.• Las respuestas farmacológicas a una intervención
terapéutica.• Tipos:• Biomarcador pronóstico: evolución.• Biomarcador predictivo: sensibilidad a cierto
tratamiento.• Biomarcador de monitorización: respuesta a un
tratamiento.
Jaffe CC. Arch Pathol Lab Med 2009; 133: 547-549.
BIOMARCADORES• Biomarcadores pronósticos:• La mayoría de los que detectamos en patología.• Un buen ejemplo son los índices mitósicos o de
proliferación (PCNA, Ki 67).• Biomarcadores predictivos:• Her2-neu en cáncer de mama.• Mutación de KRAS en cáncer de colon.
• Biomarcadores de monitorización:• Fluorodesoxiglucosa en tomografía por emisión
de positrones (PET scan).Jaffe CC. Arch Pathol Lab Med 2009; 133: 547-549.
BIOMARCADORES PRONÓSTICOS EN NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS
Bahler D. Molecular Pathology of Hematolymphoid Diseases 2010: 66.
FIJADORES USADOS EN PATOLOGÍA
Hunt JL. Arch Pathol Lab Med 2008; 132: 251.
TÉCNICAS MOLECULARES EN TEJIDOS FIJADOS EN FORMOL Y EMBEBIDOS EN PARAFINA
• Hibridación in situ fluorescente o cromógenica (FISH, CISH).
• Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).• Secuenciación del ADN.• Pruebas en ARN, como la PCR con
transcripción reversa (RT-PCR).• Microarreglos para determinar la expresión
génica.
Dry, S et al. Am J Clin Pathol 2012; 137: 346-355.
DEGRADACIÓN DEL ADN EN TEJIDOS FIJADOS EN FORMOL Y EMBEBIDOS EN PARAFINA
• Para los estudios moleculares, el tiempo de fijación en formol debe ser entre 6 y 24 horas.
• El formol establece enlaces cruzados con el ADN, las histonas y otras proteínas, fraccionando las moléculas:
• Este proceso prosigue en los bloques tisulares a lo largo de los años:• Después de 10 a 20 años, la degradación puede
impedir la amplificación con PCR.
Dry, S et al. Am J Clin Pathol 2012; 137: 346-355.
Hunt JL. Arch Pathol Lab Med 2008; 132: 250.
PROTOCOLOS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Blakey GL, Farkas DH. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 62.
EXTRACCIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
Hunt JL , Sanja D. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 70.
FLUJO UNIDIRECCIONAL EN EL LABORATORIO DE PATOLOGÍA MOLECULAR
Hunt JL. Arch Pathol Lab Med 2008, 132: 256.Blakey GL, Farkas DH. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 67.
REACTIVOS DE LA PCR
• Polimerasa termoestable: Taq polimerasa u otra:• Pfu, Pwo, Tgo, Tli, Tth.
• Cebadores (primers).• Desoxinucleótidos.• Solución amortiguadora (buffer).• Magnesio.
Dwight O. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 77-78.
PCR
Hunt JL. Arch Pathol Lab Med 2008 132: 254.
PCR: CICLOS TÉRMICOS
Dwight O. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 75.
Dwight O. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 74.
Dwight O. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 75.
DETECCIÓN Y ANÁLISIS DE LOS PRODUCTOS DE LA PCR (“AMPLICONES”)
Blakey GL, Farkas DH. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 62.
VARIEDADES DE PCR
• Hot start: mayor especificidad.• Nested: mayor producción y especificidad.• Específica para metilación.• Multiplex: se amplifican varias regiones
simultáneamente.• PCR con transcripción reversa (RT-PCR):
amplificación de secuencias de ARN.
Dwight O. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 78-79.
PCR EN TIEMPO REAL
Dwight O. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 80.
PCR EN TIEMPO REAL
Dwight O. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 80.
MATRICES DE ADN (MICROARRAYS)
Quackenbush J. N Engl J Med 2006, 354: 2463-2472.
MATRICES DE ADN (MICROARRAYS)
http://www.columbia.edu/~bo8/undergraduate_research/projects/sahil_mehta_project/work.htm
APLICACIONES DE LAS MATRICES DE ADN
Blakey GL, Farkas DH. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 66.
Perou ChM et al. Nature 2000, 406: 747-752.
PERFILES DE EXPRESIÓN GENÉTICA EN CANCER DE MAMA
Lester SC. Pathologic Basis of Disease 2010.
ONCOTYPE PARA CÁNCER DE MAMA
http://www.oncotypedx.com/en-US/Breast.aspx
CÁNCER COLORRECTAL: UNA ENFERMEDAD HETEROGÉNEA
• Diferentes vías moleculares de la carcinogénesis:• Vía supresora convencional (60%):
• APC/β-catenina/Wnt.• Vía de inestabilidad hereditaria de microsatélites (Lynch,
2 al 7%) :• MSH2, MLH1, MSH6, PSM2.
• Vía de la mucosa aserrada (35%):• Silenciamiento epigenético (metilación de islas CpG). TGFβ y
BAX.
Shi Ch, Washington K. Am J Clin Pathol 2012, 137: 847-859.
Shi Ch, Washington K. Am J Clin Pathol 2012, 137: 847-859.
TRATAMIENTO DEL CARCINOMA DE PULMÓN QUE NO ES DE CÉLULAS PEQUEÑAS (NSCLC)
• La neoplasia maligna que se diagnostica con mayor frecuencia en el mundo.
• Más del 50% de los pacientes están en etapa IV cuando se les hace el diagnóstico.
• En el 10 al 15% de los casos de carcinoma que no es de células pequeñas (NSCLC) existen mutaciones del EGFR: gefitinib, erlotinib.
• Rearreglos del gen ALK (gen de fusión EML4-ALK) en el 5% de los NSCLC: crizotinib.
Aisner DL, Marshall CB. Am J Clin Pathol 2012, 138: 332-346.
Aisner DL, Marshall CB. Am J Clin Pathol 2012, 138: 332-346.
TRATAMIENTO DEL CARCINOMA DE PULMÓN QUE NO ES DE CÉLULAS PEQUEÑAS (NSCLC)
• La mutación de KRAS es un predictor negativo de las mutaciones de EGFR y de los rearreglos de ALK.
• La amplificación de MET se asocia a la resistencia al tratamiento con inhibidores de EGFR.
Aisner DL, Marshall CB. Am J Clin Pathol 2012, 138: 332-346.