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ESTUDIO DEL EFECTO SOBRE LA CINETICA DE CRECIMIENTO DE
Aspergillus flavus y A.parasiticus POR SOBRENADANTES KEFIR Y DE BACTERIAS AISLADAS DEL
KEFIR. León, A.1,2,3; Gamba, R.1,2,4; Giannuzzi, L.2,5; De Antoni,
G.1,2,6. 1Cátedra Microbiología- UNLP. 2CIDCA – UNLP. 3Facultad de Química
Farmacéutica - Universidad de Antioquia-
Colombia. 4Facultad de Ciencias Exactas, Físico-Químicas y Naturales-UNRC. 5CONICET. 6CIC-
PBA.
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INTRODUCCIÓN• A.flavus y A.parasiticus causan pérdidas en
alimentos: cereales y sus derivados.
• Aflatoxinas: B1, B2, G1 y G2: hepatotóxicas, mutagénicas y posibles carcinógenos y un problema de salud pública (Legan, 1993).
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• Kefir: leche fermentada artesanal originaria del Cáucaso euroasiático.
• Microbiota compleja • Descripto Código
Alimentario Argentino: Art 576 - (Res. MSyAS N° 295 del 14.04.99).
• Actividad antimicrobiana (Garrote y col, 2000; Golowczyc y col, 2008)
KEFIR COM0 BIOPRESERVANT
E
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ANTECEDENTES DE ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA POR BACTERIAS DEL
ÁCIDO LÁCTICO
- Actividad antifúngica de BAL (Magnusson, Ström, Roos, Sjögren, & Schnürer, 2003; Sjögren, Magnusson, Broberg, Schnürer, & Kenne, 2003, Hassan, & Bullerman, 2008).
- Actividad antifúngica compuestos sobrenadantes de cultivo (Corsetti, Gobbetti, Rossi, & Damiani 1998; Lavermicocca, Valerio, Evidente, Lazzaroni, Corsetti, & Gobbetti, 2000; Gerez, Torino, Rollán, & de Valdez, 2008).
- Inhibición tasa crecimiento KD (mm/h) e incremento fase Lag (h) con ácidos puros y SLC de kefir. (León y col, 2006, 2007, 2008).
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– Resistencia al pH ácidoResistencia al pH ácido– Resistencia a la bilisResistencia a la bilis– Producción de ácidos Producción de ácidos
orgánicosorgánicos– Inhibición Inhibición
• Escherichia coliEscherichia coli,,• Salmonella typhimuriumSalmonella typhimurium,,• S.entericaS.enterica,,• S.gallinarumS.gallinarum • Shigella sonneiShigella sonnei
Características de las Características de las BAL seleccionadas de BAL seleccionadas de kefirkefir
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• Determinar la capacidad Determinar la capacidad inhibitoria de los inhibitoria de los microorganismos microorganismos aislados del kefir sobre el aislados del kefir sobre el hongo toxigénico hongo toxigénico Aspergillus parasiticus Aspergillus parasiticus NRRL2999. NRRL2999.
• Determinar la capacidad Determinar la capacidad inhibitoria de los inhibitoria de los microorganismos aislados microorganismos aislados del kefir y comparar estos del kefir y comparar estos resultados con los resultados con los obtenidos de obtenidos de sobrenadantes libres de sobrenadantes libres de células (SLC) de kefir, células (SLC) de kefir, sobre el hongo toxigénico sobre el hongo toxigénico Aspergillus flavusAspergillus flavus AFUBA5. AFUBA5.
OBJETIVOS
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A.flavus AFUBA5
A. parasiticus NRRL2999
L.plantarum 8312
MATERIALES
Cepas fúngicas:Cepas fúngicas:
• A. flavusA. flavus AFUBA5 AFUBA5 (UBA) (UBA)
• A. parasiticusA. parasiticus NRRL2999 (UNQ)NRRL2999 (UNQ)
Cepas de BAL:Cepas de BAL:
•L. plantarum CIDCA 8316
•L. plantarum CIDCA 8313
•L. plantarum CIDCA 8324
•L. plantarum CIDCA 8327
•L. plantarum CIDCA 83210
•L. plantarum CIDCA 8334
•L. plantarum Qf5
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CULTIVO MICROORGANISMOS
• Preparación de BAL:
Cultivo en leche estéril, 30 °C por 48 hs.
Centrifugación por 15min a 13200 rpm.
Obtención del SLC por filtración.
• Preparación cepas fúngicas:
Cultivo siete días agar inclinado PDA, 30 °C.
Diluciones: 104 conidias/ml.
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METODOLOGíA
BAL aisladas de gránulos de kefir x x x
Incubación en leche
Gránulos Gránulos CIDCA CIDCA
AGK1-AGK2AGK1-AGK2
Centrifugación Centrifugación y Filtracióny Filtración
SLC + Agar Malta
Plaqueo
SIEMBRA DE 10 µl EN EL CENTRO DE LA
PLACA
Cepa fúngica
CUATRO MEDICIONES CUATRO MEDICIONES DIARIAS DEL DIAMETRODIARIAS DEL DIAMETRO
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TASA CRECIMIENTO KTASA CRECIMIENTO KDD (mm/h) (mm/h)
INDICE DE INHIBICION INDICE DE INHIBICION DE LA TASA DE LA TASA
CRECIMIENTO:CRECIMIENTO:
{(K{(KDCDC – K – KDSDS)/ K)/ KDCDC}X100}X100
FASE LAG (hs)FASE LAG (hs)
INDICE DE INCREMENTO INDICE DE INCREMENTO DE LA FASE LAG:DE LA FASE LAG:
{(Lag{(LagSN SN - - LagLagCC)/Lag)/LagCC}X100}X100
PARAMETROS CINÉTICOS ESTUDIADOS
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RESULTADORESULTADOSS
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SLC DE GRÁNULOS DE KEFIR Y CEPAS
AISLADAS
IILag IIKd
AGK2 - pH3,5 - 50 % - 20°C 37,26 20,15
AGK2 - pH3,0 - 50 % - 20°C 282,55 34,66
AGK1 - pH3,5 - 50 % - 20°C 43,67 19,66
AGK1 - pH3,0 - 50 % - 20°C 102,2 26,11
AGK2- pH3,5 - 10 % - 20°C 5,86 7,45
AGK2 - pH3,0 - 10 % - 20°C 5,64 16,74
AGK1 - pH3,5 - 10 % - 20°C 32,6 3,33
AGK1 - pH3,0 - 10 % - 20°C 27,57 8,33
8316 - 50 % 8,15 2,70
8313 - 50 % 4,43 2,80
83210 - 50 % 10,47 2,97
8324 - 50 % 14,24 0,07
8327 - 50 % 9,13 2,34
8334 - 50 % 1,50 5,46
8316 - 10 % -7,96 27,96
8313 - 10 % -0,85 26,76
83210 - 10 % -7,15 28,86
8324 - 10 % -2,86 26,37
Efecto de SLC de GRÁNULOS CIDCA AGK1-AGK2 y CEPAS AISLADAS DE KEFIR sobre la Fase LagLag y KdKd de A. flavus
AFUBA5
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Efecto de SLC de GRÁNULOS CIDCA AGK1-AGK2 sobre la Fase LagLag y KdKd de A. flavus AFUBA5
IILag e IIKd de A. flavus AFUBA5 Vs SLC de KEFIR
SLC
%
0
50
100
150
200
250
300
350
IILag (%) AF5 IIKd (%) AF5 IILag e IIKd de A. flavus AFUBA5 Vs SLC de KEFIR
SLC
%
0
20
40
60
80
100
IILagIIKd
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IILag e IIKd de A. flavus Vs
CEPAS AISLADAS DE KEFIR
SLC
0
20
40
60
80
100
IILag IIKd
IILag e IIKd de A. flavus Vs
CEPAS AISLADAS DE KEFIR
SLC
%
-20
0
20
40
60
80
100
IILag IIKd
Efecto de SLC de CEPAS AISLADAS DE KEFIR sobre la Fase LagLag y KdKd de A. flavus AFUBA5
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SLC de L. plantarum CIDCA IILag IIKd
8316 - 50 % 38,5000 -17,2300
8316 - 10 % 14,4700 21,9600
8313 - 50 % 45,5700 -17,9900
8313 - 10 % 7,4100 23,6500
83210 - 50 % 44,4900 -12,3400
83210 - 10 % 13,5700 23,0900
8337 - 50 % 42,7300 -19,7700
8337 - 10 % 0,0000 24,8800
Qf5 - 50 % 12,2800 -14,7400
Qf5 - 10 % 2,4000 9,2600
Efecto de SLC de CEPAS AISLADAS DE KEFIR sobre la Fase LagLag y KdKd de A. parasiticus NRRL2999
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IILag e IIKd de A. parasiticus Vs
SLC DE CEPAS AISLADAS DE KEFIR
SLC
8316 - 0,5%
8316 - 0,1%
8313 - 0,5 %
8313 - 0,1%
83210 - 0,5 %
83210 - 0,1 %
8337 - 0,5 %
8337 - 0,1 %
Qf5 - 0,5%
Qf5 - 0,1%
%
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50IILag IIKd
Efecto de SLC de CEPAS AISLADAS DE KEFIR sobre la Fase LagLag y KdKd de A. parasiticus NRRL2999
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CONCLUSIONES• Se determinó que los SLC de kefir obtenidos a 20°C de
incubación inhiben al hongo toxicogénico A. flavus AFUBA5.
• Los SLC cepas de L.plantarum aislados del Kefir, inhiben el crecimiento de hongos toxigénicos A.flavus AFUBA5 y A.parasiticus NRRL2999, pero en una proporción menor que los SLC de kefir.
• El parámetro cinético mas afectado por los SLC, tanto de kefir como de cepas aisladas, es la Fase Lag.
• El efecto inhibidor de los SLC es mayor a medida que desciende el pH. Ya que aumenta la concentración de acido láctico en el medio.
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CONCLUSIONES• La capacidad inhibitoria contra los hongos es cepa-dependiente; está relacionada con la capacidad acidificante de la cepa y la producción de ácido láctico.
• Análisis de otros metabolitos diferentes a los ácidos orgánicos capaces de actuar a pH alrededor de 4,0.
• Continuar con la selección cepas potenciales o, mejor aun, consorcios no tan complejos como el kefir, para aplicar en fermentaciones y preservación de alimentos.
• Resaltar la importancia que tiene la comunidad microbiana del kefir y su complejidad; y lo relevante de estudiarlo desde el punto de vista sinecológico.
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BIBLIOGRAFIA
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• Garrote, G.L. (1999) Bacterias Lácticas y Levaduras para la Industria Alimentaria: Kefir. Tesis Doctoral. Universidad Nacional de La Plata, Facultad de Ciencias Exactas, Departamento de Química- Departamento de Ciencias Biológicas.
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MUCHAS GRACIAS!!!
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INHIBICIÓN A.flavus AFUBA5 MEDIANTE SLC : GRANULOS KEFIR
CIDCA AGK1 y AGK2 CULTIVADOS EN LECHE
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
%
20º,3.5 20º,3.3 20º,3.0 30º,3.5 30º,3.3 30º,3.0 37º,3.5 37º,3.3 37º,3.0
IIKD- K1
IILag -K1
IILag –K2
IIKD- K2
¿Papel de las Bacterias ácido lácticas y metabolitos de la fermentación ácido láctica del Kefir en la inhibición
fúngica?