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Entrenamiento de la Practica:Prueba de modificación genética de
alimentos mediante PCR
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Principio de preparación de una PCR
10`, 72 °CCompleting
60``, 94 ° Denaturation
40 cycles
120``, 94°C Denaturation
60``, 55°CAnnealing
120``, 72 °CElongation
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I. Extracción de ADN
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1. Preparación
1.1 Etiqueta la parte superior de 2 tubos con tapa de rosca con:
- No-GMO (- GMO)- muestra de comida (T)y el número de tu grupo.
1.2 Pipetea 500 µl de homo-geneizado InstaGene-Matrix dentro de cada tubo
Alli debe haber la misma cantidad de gotas en los dos tubos
sobrenadante
gotas
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2. Extracción de ADN de alimento no modificado
genéticamente (no-GMO)
2.1 Pesa 1 g de alimento no-OGM y ponlo dentro del mortero
2.2 Añade 5 ml de H2O destilada!
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2.3 Homogeniza la mezcla durante unos cinco minutos
2.4 Añade 5 ml de H2Odest. y
machaca hasta que esté lo suficientemente fluido como para pipetear la mezcla
2. 2. Extracción de ADN de alimento no modificado
genéticamente (non-GMO)
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2.5 Pipetea 25 µl del alimento mezclado dentro del líquido del tubo con tapón enroscado etiquetado como “-GMO”!
2.6 Cierra el el tubo y agítalo bien golpeandolo ligeramente con los dedos!
Para evitar la contaminación con material„+GMO DNA“ „-GMO material“ debería ser extraido primero
El mortero y su mano deberían ser limpiados con un detergente y enjuagados con H2O destilada!
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3. Extracción de ADN de una muestra de alimento
3.1 Pesa 1 g de muestra de comida para ser testada (T) y ponla en el mortero !
3.2 Añade 5 ml de H2Odest.!
Por favor, usa guantes!!!
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3.3 Homogeniza la mezcla durante unos cinco minutos!
3.4 Añade de nuevo 5 ml de H2Odest. y
machaca hasta que esté lo suficientemente fluido como para pipetear la mezcla
3. Extracción de ADN de una muestra de alimeto
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3.5 Pipetea 25 µl de la mezcla de alimento dentro del líquidodel tubo con tapón de rosca etiquetado como “T”!
3.6 Cierra el tubo y agítalo bien mediante suaves golpes con los dedos en el tubo!
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4. Desnaturalización de enzimas a 95°C
4.1 Coloca los dos tubos con tapón de rosca en un baño con agua a 95oC durante 5 minutos!
4.2 Centrifuga los tubos durante 5 minutos a 13000 rpm!
4.3 Pon 50 µl de sobrenadante dentro de nuevos tubos que han sido etiquetados antes!
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Atención: Coge solo el sobrenadante sin las gotas de InstaGene, retirándolo del ADN de alimento control y del test de ADN del alimento.
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II. Preparación: PCR y electroforesis en grupo de trabajo
Según la tarea asignada a cada grupo, este prepara una parte de la PCR y de la electroforesis para los demás grupos .
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III. Preparación y desarrollo de la PCR
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1. Preparación de los tubos de PCR
1.1 Numera tus tubos de PCR del 1-6! 1.2 Pipetea las preparaciones de PCR
según la siguiente tabla!
1.3 Mezcla tus preparaciones de PCR pipeteando hacia arriba y abajo!
1.4 Enfría tus preparaciones de PCR en hielo hasta empezar la PCR!
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Nr Mezcla maestra
ADN
1 10 µl PMM 10 µl -GMO food control DNA
2 10 µl GMM 10 µl -GMO food control DNA
3 10 µl PMM 10 µl Test food DNA (T)
4 10 µl GMM 10 µl Test food DNA (T)
5 10 µl PMM 10 µl +GMO control DNA
6 10 µl GMM 10 µl +GMO control DNA
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Desarrolla la PCR según el programa de temperatura del termociclador!
Presta atención a la posición de tus muestras en el termociclador para evitar confusiones! Asegurate de que tus tubos están adecuadamente cerrados!
2. Desarrollo de PCR
Cycler-Program
Overview of the tubes in the cycler
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IV. Evidencia de productos PCR por electroforesis (Agarosa/PAGE)
Según tu tarea asignada haz evidentes los productos PCR, por medio del desarrollo de electrophoresis en gel de Agarosa o en gel de Poliacrilamida
1. Según tu tarea tiñe tus geles y analízalos!
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