Resultados

EL DIALOGO ENTRE O-GLCNACILACION, FOSFORILACION, UBIQUITINACION, ACETILACION Y

SUMOYLACION CONTROLA LA ACTIVIDAD TRANSCRIPCIONAL Y LA ESTABILIDAD DE LA DELTA-

LACTOFERRINA

Escobar-Ramirez Adelma, Huvent Isabelle, Hoedt Esthelle, Dehnnaut Vanessa y Pierce Annick Unit de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle, UMR 8576 CNRS-Universit des Sciences et Technologies de Lille,

IFR 147, 59655 Villeneuve d Ascq, France

Introduccion La Delta-lactoferrina (Lf) es un factor de transcripcin,su expresin se encuentra bajamente regulada en el caso de cancer (Fig.1). La Lf es un marcador de tejido sano y la alta expresin de este transcrito fue correlacionado con un buen pronstico en cancer de seno (Benassa et al., 2005). La Lf es el resultado del uso alternativo del promotor del gen de la lactoferrina el cual permite la produccin de dos isoformas la alternativa N-Terminal: lactoferrina (LF) la cual es secretada y la Lf la contraparte nucleocitoplasmtica (Siebert and Huang, 1999). La Lf posee efectos antiproliferativos e induce el arresto del ciclo celular, esta es un eficiente factor de transcripcin e interacta in vivo via un elemento de respuesta a la Lf encontrado en los promotores de los genes Skp1, Bax, Dcps y SelH (Mariller et al., 2007, 2009; Hoedt et al., 2012; Hardivill et al., 2013). Dado que la Lf posee diferentes genes blanco, modificaciones en su actividad o concentracin podra tener crucial incidencia en la homeostasia celular.

Plegamiento de la Lf. La estructura de la Lf ha sido creada usando

los datos cristalograficos de la Lf,trazada usando UCSF Chimera 1.5.3.

La superficie molecular muestra una exclusin del solvente con un radio de contacto de 1.4 (Mariller et al., 2012)

Diagrama esquemtico de dominios y sitios functionales de la Lf El sitio de O-GlcNAcilacin es indicado en el cuadro azul,los sitios de ubiquitinacin en rojo, los sitios de acetilacin en verde y los sitios de sumoylacin en amarillo, DBD, DNA binding domain; TAD. TransActivating Domain; PEST, rapid degradation domain; NLS nuclear localization signal

(despues de Mariller et al.,2012).Las modificaciones posttraduccionales

modulan eficientemente la actividad y la estabilidad de la DLf.

Nuestros recientes resultados mostraron que la O-GlcNAcilacin regula negativamente la actividad transcripcional de la Lf mientras esta inhibe su

ubiquitinacin e incrementa su tiempo de vida media . Por otra parte la fosforilacin activa la actividad transcripcional y su degradacin (Hardiville et al., 2010). La sumoylacin y acetilacin parecen tambin modular la actividad transcripcional y la estabilidad.

Modificaciones post-traduccionales en la Delta-lactoferrina La ruta de la sumoylacin

La SUMOylacin es una modificacin post-traduccional caracterizada por la unin covalente y reversible de protenas ,small ubiquitin-like modifier (SUMO) una protena blanco (Garreau et Lima, 2010). En mamferos existen 4 isoformas llamadas ,SUMO -1 ,-2, -3 y -4 ( 11 kDa) . Las protenas SUMO estan fuertemente involucradas en la modulacin de la organizacin nuclear y viabilidad celular, su expresin est incrementada significativamente en procesos asociados con carcinognesis tal como el crecimiento celular,diferenciacin,senescencia,estrs oxidativo y apoptosis. La ruta de la SUMOylacin comprende las etapas de SUMO maduracin, conjugacin y deconjugacin. A diferencia de la ubiquitinacin,la SUMOylacin de protenas blanco solo necesita una enzyma E2 (UbC9) y un reducido nmero de enzymas E3 ligasas

Estructura de la Delta-lactoferrina

LVLK361GEA Type I: -K-X-E

NLRK308SEE Type II

SCIK13RDS Type II

ENYK391SQQ Type II

YTAGK379CGL ?

sitios putativos SUMO en la Lf

1 Sitio SUMO consenso ptimo y 3 sitios no consenso ptimos fueron localizados utilizando el programa SUMOsp 2.0

(htpp://bioinformatics.lcd-ustc.org/sumosp). El sitio principal de

ubiquitinacin podra ser tambin un sitio de SUMOylacin

NLS

PEST DBD?

Hinge

region

Lf polySUMOylada

PolySUMOylacin de la DLf en clulas HEK 293 . Cotransfeccin con pCMV10-3Xflag-Lf y pSG5-His-SUMO1. Immunoprecipitacin usando anticuerpo anti-Histidina dirigido contra el 6xHis-tag e

Inmunorevelacin de las formas SUMOyladas de la DLf utilizando el anticuerpo anti-3xflag (M2).

SUMO1 and SUMO2/3 estan dispuestas sobre la DLf

SUMO-1 no forma cadenas SUMO porque sta carece de sitio de SUMOylacin. SUMO-2 y SUMO-3 tienen 97% de identidad y forman

eficientemente cadenas. Sin embargo SUMO-1

puede estar conjugada a cadenas SUMO-2/3

como un terminador de la cadena y por lo tanto

estar presente sobre cadenas de

polySUMOylacin. 3xFLAG-DLf : 75 kDa; cadena SUMO : 11 kDa; mono-

SUMO-3xFLAG-DLF : 86 kDa; polySUMO--3xFLAG-DLf >

97 kDa

Mutantes de SUMOylacion

Representacin esquemtica de la construccin de las mutantes de SUMOylacin. 1 nico sitio SUMO es preservado. La M5S es una mutante

SUMO nula.

A B

Identificacin de los sitios SUMO I (A) y SUMO2/3 (B). Co-transfeccin utilizando el vector pCMV10-3xflag-Lf/mutantes y pSG5-His-SUMO1, pCDNA3.1-His-SUMO2/3. Inmunoprecipitacin con el anticuerpo anti-3xflag (M2) e immunoblot con un anticuerpo anti-His. La GAPDH fu utilizada como control de carga.

Actividad Transcripcional de la

DLf y sus mutantes de

SUMOylacin

La actividad transcripcional de la DLf y la

mutante K308 estn moduladas por el nivel de SUMOylacin

La sobreexpresin de la proteasa SENP2 conduce a un incremento en la actividad

transcripcional mientras la sobreexpresin de las protenas SUMO la regula negativamente.

Sitios de acetilacin en la DLf

2 sitios de acetilacin: K13 y K379 K13 es el principal sitio blanco de

acetiltransferases

Represin de la actividad transcripcional de la DLf en K308. Desrepresin de la actividad transcripcional cuando los sitios

SUMO son silenciados, mutante (M5S).

Benassa, M., Peyrat, J.-P., Hornez, L., Mariller, C., Mazurier, J., Pierce, A. 2005. Int J Cancer 114, 299306 Gareau, J.R., Lima, C.D. 2010. Nat Rev Mol Cell Biol 11, 861871. Hardivill, S., Hoedt, E., Mariller, C., Benassa, M., Pierce, A. 2010. J Biol Chem 285, 1920519218. Hardivill S., Pina-Canseco S., Escobar-Ramirez A., Elass E., Pierce, A. 2013. Eur. J. Chem. Biol. Hoedt, E., Hardiville, S., Mariller, C., Elass, E., Perraudin, J.P., Pierce, A., 2010. Biometals 23, 441-452. Mariller, C., Benaissa, M., Hardiville, S., Breton, M., Pradelle, G., Mazurier, J., Pierce, A., 2007. FEBS J 274, 2038-2053.

La Delta-lactoferrina esta sumoylada en K13,K308,K361,K379 y K391. Algunos

de estos sitios de SUMOylacin se encuentran localizados en reas donde tambien se encuentran presentes otras modificaciones post-traduccionales.

El sitio K13 SUMO/acetilacin se encuentra localizado cerca del sitio de O-GlcNAcilacin y/o fosforilacin. El dilogo entre estos sitios puede constituir el cdigo Lf responsable para el control de la actividad transcripcional de la DLf. Se sabe que la acetilacin y la fosforilacin dirigen la activacin transcripcional mientras la O-GlcNAcilacin y SUMOylacin la reprimen. Esta regin podra ser parte del dominio de transactivacin.

K308 y K361 son tambien sitios reguladores. Estos se localizan en la vecindad

del DBD (Dominio de union al DNA).

K379 est involucrado principalmente en la regulacin de la estabilidad de la DLf porque esta a la vez SUMOylado o acetilado sugiriendo que tambien podra regular la actividad de la DLf.

K391 participa en el control de la estabilidad de la DLf . Este sitio est en el centro de la secuencia PEST. Por lo tanto en la extremidad C-terminal un

crosstalk entre fosforilacin/SUMOylacin/ubiquitinacin podra constituir el cdigo Lf responsable para el control de la estabilidad de la Deltalactoferrina.

Conclusiones

DLf

K308 -sumoylation

K361 sumoylation-

K379 sumoylation-

K13 actylation-

DBD ?

K 379 actylation-

Mariller, C., Hardiville, S., Hoedt, E., Benaissa, M., Mazurier, J., Pierce, A., 2009. Biochimie 91, 109-122. Mariller, C., Hardivill, S., Hoedt, E., Huvent, I., Pina-Canseco, S., Pierce, A. 2012. Biochem. Cell Biol. 90: 113 (2012) Pourcet ,B., Staels,B.,Glineur, C. 2013. Methods Mol Biol 952, 145-161 Siebert, P.D., Huang, B.C. 1997. Proc Natl Acad Sci USA 94, 21982203

Bibliografia

PolySUMOylacion