Download - Diagnostico Molecular
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE PATOLOGÍAS VIRALES Y
BACTERIANAS
PROF. DR. MARCELO BUSTAMANTE, Ph. D.FACULTAD DE MEDICINA, UCSC.
Desarrollo de la Ingeniería Genética- 1953 James Watson y Francis Crick, doble hélice DNA
- 1982 Insulina humana recombinante
- 1985 Kary Mullis, creador de la técnica de PCR
1993 Nobel de Química
- 1985 Alec Jeffreys (U. de Leicester, UK) huella génica
- 1990 Inicio proyecto Genoma Humano
Proyecto genoma patógenos humanos, animales y plantas
- 1997 Secuencia completa bacteria E. coli
Ian Wilmut-oveja Dolly
- 2000 Primer borrador Genoma Humano (85%)
Bancos de Datos-Internet-Acceso libre
-2003 Mapa completado en un 99% con 99% de precisión-Costo: US$ 2700 Mi-Intituciones participantes (18): USA, UK, Francia, Alemania, Japón y China.
ReverseTranscription
Código Genético
PROYECTO
GENOMA
Diagnóstico Molecular
• Diagnóstico basado en información molecular
• Información genética de los individuos (virus, procariontes y eucariontes)
• ADN
• ARN
Detección de Virus
• Indicado para:– Detección de virus ADN– Detección de virus ARN (retrovirus)– Epidemiología: Identificación de cepas– Taxonomía: Identificación de especies
• Ejemplos:– Herpes (Subtipos) Papiloma (Subtipos)– Citomegalovirus VIH (Carga Viral)– SARS Hepatitis A, B, C– Enterovirus Influenza aviar– Virus Sincicial Rotavirus
Detección de Bacterias• Indicado para:
– Detección de bacterias de difícil cultivo: Chlamidia, Mycoplasma
– Detección de bacterias de crecimiento lento: MTB– Detección de resistencias: -lactamasas, Rifampicina– Epidemiología: Identificación de cepas – Taxonomía: Identificación de especies
• Ejemplos:– M. tuberculosis complex M. Avium (Subesp. ParaTBC)– Treponema palidum Chlamidia – Mycoplasma pneumoniae Legionella pneumophila– Helicobacter pylori Leptospira sp– Bordetella pertussis
Detección de Parásitos• Indicado para:
– Detección de parásitos de difícil cultivo– Detección de parásitos de crecimiento lento– Detección de resistencias a antiparasitarios– Epidemiología: Identificación de cepas – Taxonomía: Identificación de especies
• Ejemplos:– Protozoos: Entamoeba sp– Helmintos: Nematelmintos (Enterobius, Trichinella)
»Platelmintos: Céstodes: Hymenoleptis, Tenias»Tremátodes: Distoma
Parásitos sánguíneos: Tripanosoma
Mutación del Gen de la protrombinaMutación del Factor V de Leyden
Optimización del PCR• Oligonucleótidos iniciadores
– Secuencia: Tm, especificidad– Tamaño: Tm– Gen que se detecta: nº de copias iniciales
• Temperatura de hibridación– Mayor temperatura = mayor especificidad = menor rendimiento
• Condiciones de reacción– Concentración de Mg++
– Concentración de Taq polimerasa• Extracción del DNA• Elección del método de detección y análisis
Proceso de análisis
Toma de MuestraToma de Muestra Extracción ADNExtracción ADN
Amplificación ADNAmplificación ADN Detección amplificadoDetección amplificado
SYBR GREEN I
Micrografía de Célula infectada por virus Herpes
Micrografía de fase final de infección por virus Herpes
Virus Herpes Simplex
Subtipos de Virus Herpes
Mapa genético de Virus Herpes 1
•Técnica: LightCycler® - HSV 1/2 Detection Kit
•Flexible: Permite la detección de 2 subtipos de virus Herpes simultáneamente
•Sensibilidad: 10 copias/muestra
•Rapidez: 3 horas para entrega de resultados
•Seguridad: Control interno para minimizar la posibilidad de falsos negativos y Control positivo para verificar efectividad del PCR
Método de Detección de Virus Herpes 1 y 2
Herpes 1 (53,9°C)
Herpes 2 (67,1°C)
Peaks de Melting para la diferenciación de Virus Herpes 1 y 2
Mycoplasma pneumoniae
•Técnica: LightMix® for the Detection of Mycoplasma pneumoniae
•Flexible: Permite la detección de Mycoplasma pneumoniae específicamente (fragmento de PCR de 342 bp)
•Sensibilidad: 10 copias/muestra (Detección linear entre 10 y 107 copias)
•Rapidez: 3 horas para entrega de resultados
•Seguridad: Control interno para minimizar la posibilidad de falsos negativos y Control positivo para verificar efectividad del PCR
Método de Detección de Mycoplasma pneumoniae
Resultados del PCR Light Cycler para Mycoplasma pneumoniae
Bordetella pertussis
Mecanismo de patogenicidad de B. pertussis
•Técnica: LightMix® for the Detection of Bordetella pertussis
•Flexible: Permite la detección de Bordetella pertussis específicamente (fragmento de PCR de 181 bp correspondiente a IS 481)
•Sensibilidad: 1-10 copias/muestra (Detección linear entre 10 y 107 copias)
•Rapidez: 3 horas para entrega de resultados
•Seguridad: Control interno para minimizar la posibilidad de falsos negativos y Control positivo para verificar efectividad del PCR
Método de Detección de Bordetella pertussis
Gram (-) Gram (+)Escherichia coli Staphylococcus aureusKlebsiella (pneumoniae/oxytoca) SCoN1Serratia marcescens Streptococcus pneumoniaeEnterobacter (cloacae/aerogenes) Streptococcus spp.Proteus mirabilis Enterococcus faeciumPseudomonas aeruginosa Enterococcus faecalisAcinetobacter baumannii 3Stenotrophomonas maltophilia
HongosCandida albicans
Candida tropicalisCandida parapsilosis
Candida glabrataCandida krusei
Aspergillus fumigatus
Tabla 1: Lista maestra de SeptiFast (SML)
Ilustración 1: RC G-, CH 610
Gráfico 1 Gráfico 2
Gráfico 3 Gráfico 4
Termociclador Labnet (PCR convencional)
PCR de tiempo real (Light CyclerTM)
Laboratorio de Diagnóstico MolecularUniversidad Católica de la Santísima ConcepciónLista de Prestaciones-Mayo 2007
Identificación genómica de patógenos Método
Mycobacterium spp. Real-Time PCR (LC)
Mycobacterium tuberculosis complex Real-Time PCR (LC)
Helicobacter pylori Real-Time PCR (LC)
Virus Hepatitis C (HCV) Real-Time PCR (LC-Roche)
Virus Hepatitis B (HBV) Real-Time PCR (LC-Roche)
Virus hepatitis A (HAV) Real-Time PCR (LC-Roche)
Papilloma Virus Humano (PVH) Real-Time PCR (LC-Roche)
Genotipificación PVH oncogénicos Real-Time PCR (LC-Roche)
Virus Herpes Simplex tipo 1 y 2 (HSV-1 y HSV-2) Real-Time PCR (LC-Roche)
Mycoplasma pneumoniae Real-Time PCR (LC-Roche)
Virus Varizella-Zoster (VZV) Real-Time PCR (LC-Roche)
Citomegalovirus Humano (HCMV) Real-Time PCR (LC-Roche)
Virus Epstein-Barr (EBV) Real-Time PCR (LC-Roche)
Herpes virus Humano tipo 6 (HHV6) NESTED - PCR
Bordetella pertussis Real-Time PCR (LC-Roche)
Septifast Real-Time PCR (LC-Roche)
Enterovirus Real-Time PCR (LC-Roche)
Determinación de Carga Viral
Virus de la Hepatitis B (HBV) PCR-ELISA (Amplicor-Roche)
Virus de la Hepatitis C (HCV) PCR-ELISA (Amplicor-Roche)
Virus Inmunodeficiencia Humana ( VIH) NASBA BIOMERIEUX
Detección de Mutaciones Genéticas Humanas
Gen Factor V de Leiden (G A) posición 1691 Real-Time PCR (LC-Roche)
Gen Protrombina (G A) posición 20210 Real-Time PCR (LC-Roche)
Prestaciones varias área Biología Molecular
Inmunotipificación subpoblaciones leucocitarias CD3/CD4/CD8
Citometría de Flujo-FACS Scan
Inmunotipificación subpoblaciones linfocitariasCD3/CD4/CD8/CD14
Citometría de Flujo-FACS Scan
Inmunotipificación subpoblaciones linfocitariasCD3/CD4/CD8/CD14/CD56/CD19
Citometría de Flujo-FACS Scan
MUCHAS GRACIAS