Separación
Para separar se emplean básicamente tres alternativas:
Separaciones mecánicas
Procesos cinéticos y electrocinéticos
Equilibrios de distribución entre dos fases
Proceso Cromatográfico
La fase móvil fluye, arrastrando consigo los solutos
Los solutos se reparten entre ambas fases
MuestraFase móvil Fase estacionaria
Elución La muestra se aplica al principio de la
columna como una banda fina El eluyente tiene menor afinidad por la fase
estacionaria que los solutos Los solutos avanzan por el sistema a
velocidades diferentes, menores a la de la fase móvil
Los solutos se separan en bandas que eluyenal final de la columna
Requisitos de la muestra
Presión de vapor baja
Compuestos iónicos
Compuestos de peso molecular elevado
Termolábil
Instrumentación
Fase móvil Bomba de alta presión
Inyector
Columna
Detector
Muestra
Control de temperatura
Gradientede elución
Registrador
Fase móvil
0.73Metanol
0.50Acetonitrilo
0.32Cloruro de metileno
0.22Éter isopropílico
0.01Isoctano
0.00HexanooDisolvente
Fase móvil
Disolventes grado cromatográfico Agua de 18 m Baja viscosidad No volátil Miscibilidad Filtrada Sin oxígeno disuelto (degasificada) Solubilidad de los analitos Compatible con el detector
Cromatografía Fase Inversa
F E Sílica químicamente modificada con
grupos no-polares: hidrocarburos saturados: C2 dimetil, C4 tetrametil, C8 octil, C18 octadecil
F M Mezclas: acuosos / orgánicos
H2O + (CH3OH, CH3CH2OH, CH3CN)
Fase estacionaria (columna)
Empaque Sílica gel, C8, C18, Ciano, Amino,
Resinas, Polímeros Carga de Carbón 5-20 % w/w Intervalo de pH = f (FE) Límite de presión de trabajo Compatible con la fase móvil
Cromatografía Fase Inversa
Efecto solvofóbico fuerte:
Parte apolar de la molécula del soluto es mayor
% C en la FE es mayor Polaridad de la FM es alta (mayor % de
H2O)
Cromatografía Fase Inversa
Ventajas
Reproducibilidad en las separaciones
Estabilidad de la FE (pH 7)
Mezclas: acuosos/orgánicos H2O + (CH3OH, CH3CH2OH, CH3CN)
InstrumentaciónFase móvil Bomba de
alta presión
Inyector
Columna
Detector
Muestra
Control de temperatura
Gradientede elución
Registrador
Proceso Cromatográfico
El lecho cromatográfico puede ser abierto (placa) o cerrado (columna)
La fase móvil fluye a lo largo del lecho cromatográfico en contacto con la fase estacionaria
Ventajas
Análisis de compuestos iónicos, de alto peso molecular
Diversidad de columnas y detectores Formación de derivados pre-columna y
post-columna Separaciones con control de pH Separaciones preparativas
Limitantes
Muestras “relativamente” limpias Solubilidad de la muestra en la fase móvil Viscosidad de la fase móvil Dimensiones de la columna Presión de trabajo Intervalo de pH Utilizar un filtro (pre-columna)