APLICACIÓN DEL ANTICUERPO ANTI-BCG PARA LA DETECCIÓN DE DIFERENTES MICROORGANISMOS EN TEJIDOS INCLUIDOS EN PARAFINA
ANABELLA FAJARDO BELTRÁN FANNY ANGÉLICA REY LINARES
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
Para optar por el título de
BACTERIÓLOGA
Trabajo presentado a: PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA
Trabajo realizado en: INSTITUTO NACIONAL DE SALUD LABORATORIO DE PATOLOGÍA
Director Asesor Dr. GERZAIN RODRÍGUEZ T Dra. MARCELA NEIRA Médico – Patólogo Bacterióloga Coordinador Laboratorio de Patología Laboratorio de Patología INSTITUTO NACIONAL DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
Asesor Dr. FREDY GAMBOA PhD. Microbiología
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA BOGOTÁ D.C.
2001
APLICACIÓN DEL ANTICUERPO ANTI-BCG PARA LA DETECCIÓN DE DIFERENTES MICROORGANISMOS EN TEJIDOS INCLUIDOS EN PARAFINA
ANABELLA FAJARDO BELTRÁN
FANNY ANGÉLICA REY LINARES
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BACTERIOLOGÍA
BOGOTÁ D.C.
2001
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de julio de 1946:
La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
tesis de grado.
APLICACIÓN DE ANTICUERPO ANTI-BCG PARA LA DETECCIÓN DE DIFERENTES
MICROORGANISMOS EN TEJIDOS INCLUIDOS EN PARAFINA
ANABELLA FAJARDO BELTRÁN
FANNY ANGÉLICA REY LINARES
Director Gerzain Rodriguez
Codirector
Asesor
Decano Facultad de Ciencias
Dr. Carlos Corredor
Directora Carrera de Bacteriología
Dra. Aura Rosa Manascero
Jurado
Jurado
A nuestras familias
por su confianza y apoyo
AGRADECIMIENTOS
CONTENIDO
Pág
CONTENIDO vii
LISTA DE TABLAS xi
LISTA DE FIGURAS xii
RESUMENINTRODUCCIÓN 1
1. JUSTIFICACIÓN 2
2. OBJETIVOS 3
2.1 OBJETIVO GENERAL 3
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 3
3. MARCO TEÓRICO: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 4
3.1 TÉCNICAS INMUNOHISTOQUÍMICAS 4
3.1.1 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS 4
3.1.2 FUNDAMENTO TÉCNICAS INMUNOHISTOQUÍMICAS 6
3.1.2.1 TÉCNICAS DE INMUNOPEROXIDASA 7
3.1.2.2 MÉTODO AVIDINA-BIOTINA 8
4.1.2.3 ENZIMAS 9
3.2 Mycobacterium bovis (BCG) 10
3.2.1 MECANISMO DE ACCIÓN 11
3.2.2 APLICACIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-BCG 12
3.3 GÉNERO Mycobacterium 13
3.4 TUBERCULOSIS 15
3.4.1 Mycobacterium tuberculosis 15
3.4.2 TAXONOMÍA 17
3.4.3 EPIDEMIOLOGÍA Y TRANSMISIÓN 17
3.4.4 MANIFESTACIONES CLÍNICAS 19
3.4.4.1 TUBERCULOSIS PRIMARIA 19
3.4.4.2 TUBERCULOSIS SECUNDARIA 20
3.4.4.3 TUBERCULOSIS MILIAR 21
3.4.5 DIAGNÓSTICO 21
3.5 LEPRA 23
3.5.1 Mycobacterium leprae 23
3.5.2 TAXONOMÍA 23
3.5.3 EPIDEMIOLOGÍA Y TRANSMISIÓN 24
3.5.4 MANIFESTACIONES CLÍNICAS 24
3.5.4.1 CLASIFICACIÓN 25
3.5.4.2 LEPRA INDETERMINADA 26
3.5.4.3 LEPRA TUBERCULOIDE 27
3.5.4.4 LEPRA DIMORFA 27
3.5.4.5 LEPRA LEPROMATOSA 28
3.5.5 HISTOPATOLOGÍA 29
3.5.6 DIAGNÓSTICO 31
3.6 MICOBACTERIAS ATÍPICAS 32
3.6.1 TAXONOMÍA 32
3.6.2 EPIDEMIOLOGÍA Y TRANSMISIÓN 35
3.6.3 MANIFESTACIONES CLÍNICAS 37
3.6.3.1 ENFERMEDAD CUTÁNEA 37
3.6.3.2 ENFERMEDADES POSTOPERATORIAS 38
3.6.3.3 ENFERMEDAD PULMONAR 38
3.6.3.4 ENFERMEDAD DISEMINADA 38
3.6.3.5 INFECCIONES MISCELÁNEAS 38
3.6.4 HISTOPATOLOGÍA 39
3.6.5 DIAGNÓSTICO 40
3.7 ESPOROTRICOSIS 42
3.7.1 Sporothrix schenckii 42
3.7.2 TAXONOMÍA 42
3.7.3 EPIDEMIOLOGÍA Y TRANSMISIÓN 43
3.7.4 MANIFESTACIONES CLÍNICAS 43
3.7.4.1 ESPOROTRICOSIS CUTÁNEA Y LINFOCUTÁNEA 44
3.7.4.2 ESPOROTRICOSIS PULMONAR 44
3.7.4.3 ESPOROTRICOSIS OSTEOARTICULAR 45
3.7.4.4 ESPOROTRICOSIS DISEMINADA VICERAL 46
3.7.5 HISTOPATOLOGÍA 46
3.7.6 DIAGNÓSTICO 47
3.8 HISTOPLASMOSIS 48
3.8.1 Histoplasma capsulatum 49
3.8.2 TAXONOMÍA 49
3.8.3 EPIDEMIOLOGÍA Y TRANSMISIÓN 50
3.8.4 MANIFESTACIONES CLÍNICAS 51
3.8.4.1 HISTOPLASMOSIS PULMONAR AGUDA 51
3.8.4.2 HISTOPLASMOSIS PULMONAR CRÓNICA 52
3.8.4.3 HISTOPLASMOSIS DISEMINADA 52
3.8.4.4 HISTOPLASMOSIS CUTÁNEA PRIMARIA 53
3.8.5 HISTOPATOLOGÍA 53
3.8.6 DIAGNÓSTICO 54
3.9 LEISHMANIOSIS 55
3.9.1 Leishmania 55
3.9.2 TAXONOMÍA 56
3.9.3 EPIDEMIOLOGÍA Y TRANSMISIÓN 57
3.9.4 MANIFESTACIONES CLÍNICAS 60
3.9.5 HISTOPATOLOGÍA 60
3.9.6 DIAGNÓSTICO 61
4. MATERIALES Y MÉTODOS 65
4.1 TIPO DE ESTUDIO 65
4.2 MUESTRAS 65
4.2.1 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS 65
4.3 CONTROLES 66
4.4 ESTANDARIZACIÓN 66
4.5 TÉCNICA INMUNOHISTOQUÍMICA CON ANTI-BCG 67
4.5.1 DESPARAFINIZACIÓN Y DESHIDRATACIÓN 67
4.5.2 DIGESTIÓN ENZIMÁTICA 68
4.5.3 BLOQUEO ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ENDÓGENA 68
4.5.4 DESENMASCARAMIENTO DE ANTÍGENO 68
4.5.5 BLOQUEO DE REACCIÓN CRUZADA 69
4.5.6 ANTICUERPO ANTI-BCG 69
4.5.7 ANTICUERPO ANTI-CONEJO BIOTINILADO 69
4.5.8 COMPLEJO AVIDINA-BIOTINA (ABC) 69
4.5.9 REVELADO 70
4.5.10 COLORACIÓN DE CONTRASTE 70
4.5.11 REHIDATACIÓN 70
5. RESULTADOS 71
5.1 ESTANDARIZACIÓN 71
5.2 TÉCNICA INMUNOHISTOQUÍMICA CON ANTI-BCG 71
6. DISCUSIÓN 83
7. CONCLUSIONES 86
8. RECOMENDACIONES 87
9. BIBLIOGRAFÍA 88
LISTA DE TABLAS
Pág
Tabla 1. Clasificación de lepra 26
Tabla 2. Clasificación de las micobacterias atípicas por Runyon 33
Tabla 3. Clasificación actual de las micobacterias atípicas 34
Tabla 4. Síndromes clínicos causados por Leishmania y su distribución
geográfica 59
Tabla 5. Resultados de técnica inmunohistoquímica con anti-BCG 73
LISTA DE FIGURAS
Pág
Figura 1. Mecanismos de virulencia de M. tuberculosis 16
Figura 2. Piel leproma. Coloración ZN. 800x. 74
Figura 3. Piel leproma. Técnica IHQ anti-BCG. 40x. 74
Figura 4. Tuberculosis miliar pulmón. Coloración ZN. 400x. 75
Figura 5. Tuberculosis miliar pulmón. Técnica IHQ anti-BCG. 800x. 75
Figura 6. Granuloma por micobacteria atípica. Coloración ZN. 800x. 76
Figura 7. Granuloma por micobacteria atípica. Técnica IHQ anti-BCG. 800x 76
Figura 8. Lepra post-tratamiento. Coloración H&E. 800x 77
Figura 9. Lepra post-tratamiento. Técnica IHQ anti-BCG. 800x 77
Figura 10. Esporotricosis. Técnica IHQ anti-S. schenckii. 400x 78
Figura 11. Esporotricosis. Técnica IHQ anti-BCG. 1000x 78
Figura 12. Esporotricosis. Técnica IHQ anti-BCG. 2000x 79
Figura 13. Histoplasmosis. Técnica IHQ anti-BCG. 400x,800x. 80
Figura 14. Leishmaniosis experimental. Técnica IHQ anti-BCG. 800x. 81
Figura 15. Leishmaniosis cutánea humana. Técnica IHQ anti-BCG. 800x. 81
Figura 16. Escrofuloderma. Técnica IHQ anti-BCG. 400x, 800x. 82
RESUMEN
El anticuerpo policlonal anti-BCG tiene gran capacidad para reaccionar frente a diferentes
determinantes antigénicos tanto del género Mycobacterium como de otros
microorganismos.
En este trabajo se evaluó la funcionalidad de la técnica inmunohistoquímica (IHQ) con un
anticuerpo policlonal anti-BCG para la detección de antígenos de microorganismos en
tejidos incluidos en parafina. Para tal fin se estandarizó la técnica y se ensayó en
diferentes patologías infecciosas.
Para la estandarización se realizaron variaciones a la metodología convencional y se
utilizaron casos de TBC miliar y lepra lepromatosa con los que se obtuvo como dilución
óptima del anticuerpo 1:300.
Con la técnica IHQ con el anticuerpo anti-BCG se obtuvieron los siguientes resultados: en
12 casos de lesiones por micobacterias atípicas que presentaban tinción de Ziehl-Neelsen
negativa, se observó antígeno intensamente marcado dentro de los macrófagos. En 4
biopsias de pacientes con lepra tratada y curada, se observó marcación persistente de
antígeno dentro de los macrófagos. En 9 casos de esporotricosis se observó tinción de la
levadura, mejor aún que con el anticuerpo anti-Sporothrix shcenckii. En histoplasmosis se
observó marcación con el anticuerpo en los 6 casos. Y en leishmaniosis el resultado fue
positivo para el total de los casos trabajados.
Con los resultados obtenidos se confirma la alta sensibilidad que posee el anticuerpo anti-
BCG, lo que le permite demostrar la presencia de varios antígenos de diferentes
micobacterias y del Sporothrix schenkii entre otros. Aunque la técnica posee una baja
especificidad es muy útil en un laboratorio de patología.
1. INTRODUCCIÓN
En el incremento de patologías infecciosas mundialmente están involucrados factores
como la pobreza, drogadicción, multirresistencia a la terapia, indigencia y la pandemia del
VIH entre otras (1), acentuándose en países como Colombia debido a las condiciones de
vida. Para la realización de un diagnóstico acertado de este tipo de patologías, se debe
realizar un análisis interdisciplinario en el cual el área de la histopatología juega un papel
importante.
El diagnóstico de patologías que involucran daño tisular por parte de microorganismos,
presenta algunos inconvenientes como son, el que este se encuentre en poca cantidad o
que haya sido procesado por células fagocíticas que dañan la estructura del mismo (2). Es
por esta razón, que los métodos convencionales no siempre son óptimos puesto que están
diseñados para demostrar el agente causal basándose en sus propiedades físico-químicas
(3), mientras que las técnicas inmunológicas que involucran anticuerpos policlonales,
pueden asegurar una alta sensibilidad al detectar no solo el microorganismo si no también
su antígeno degradado (4,5).
En el laboratorio de Patología del Instituto Nacional de Salud (INS), se trabajó la técnica
inmunohistoquímica (IHQ) con el anticuerpo policlonal anti-BCG, el cual demostró tener
una alta sensibilidad al unirse a determinantes antigénicos de diferentes microorganismos
como Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium leprae, otras micobacterias y algunos
hongos como Histoplasma capsulatum y Sporothrix schenckii, siendo en este último, de
gran utilidad en el diagnóstico, ya que se logra observar la levadura como agente causal.
2. JUSTIFICACIÓN
En la rutina histopatológica se hace necesaria la identificación de los agentes infecciosos
causales de enfermedad mediante diversos métodos como son, la tinción, la
inmunolocalización del antígeno o algunas tan complejas como las basadas en biología
molecular.
Las técnicas utilizadas en el laboratorio de patología, ayudan a la localización de la zona
lesionada y a identificar el posible agente infeccioso causal de la misma, sin embargo, se
pueden presentar fallas en la detección del microorganismo, debidas a que en algunos
casos este ya no se encuentra en forma completa sino que esta fraccionado o ha sido
digerido por macrófagos.
Es por esta razón que se hace necesaria la utilización de una técnica que permita la
localización del antígeno, que sea lo suficientemente sensible para la detección de un
amplio espectro de determinantes antigénicos comunes entre diferentes especies y que a
su vez sea de fácil manejo para poder ser empleada tanto en diagnóstico como en
propósitos de investigación.
Para tal fin, se utilizó un anticuerpo policlonal anti-Mycobacterium bovis BCG (Bacilo de
Calmette - Guérin) que es capaz de reaccionar con aproximadamente 100 antígenos
diferentes de BCG, siendo muchos de estos compartidos con otras micobacterias y en
algunos casos comunes con varias especies bacterianas y fúngicas (4,5).
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GENERAL
Evaluar la funcionalidad de la técnica inmunohistoquímica con el anticuerpo policlonal anti–BCG en la demostración de antígenos de diferentes microorganismos en tejidos incluidos en parafina del laboratorio de Patología del Instituto Nacional de Salud.
3.2 OBETIVOS ESPECÍFICOS
Estandarizar la técnica inmunohistoquímica con el anticuerpo policlonal anti–BCG
para la detección de antígenos en tejidos fijados en formol e incluidos en parafina.
Determinar la utilidad de la técnica en diferentes entidades infecciosas de origen
bacteriano, protozoario y fúngico, de interés para el laboratorio de Patología del
Instituto Nacional de Salud.
4. MARCO TEÓRICO: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
4.1 TÉCNICAS INMUNOHISTOQUÍMICAS
4.1.1 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
FIJACIÓN: los tejidos deben ser fijados, para preservarlos evitando autolísis de sus
células. El formol es un fijador que actúa por reticularización ya que desnaturaliza las
proteínas, rompiendo los puentes de hidrógeno, formándose una malla reticular
polipeptídica por asociación química entre los grupos activos desenmascarados por el
líquido fijado. Se debe tener en cuenta que este fijador altera más a los antígenos
ricos en proteínas que los ricos en carbohidratos (6).
INCLUSIÓN: para este proceso se utiliza la parafina caliente que puede llegar a
producir perdida de la antigenicidad, por lo que el tiempo de infiltración deberá
disminuirse al mínimo y se deben emplear parafinas de bajo punto de fusión. La
parafina a su vez puede aumentar la tinción de fondo, por lo que es necesario realizar
una desparafinización completa de las preparaciones histológicas antes de la
inmunotinción (6).
CORTES Y ADHESIVOS: los cortes en parafina se realizan en un micrótomo (3 a 5 µm)
y se colocan en láminas previamente tratadas con un adhesivo que puede ser poly-L-
lisina, albúmina de huevo o cromo gel, que ayudan a que el tejido soporte todo el
proceso dejándolas toda la noche en horno a 60ºC. A continuación se desparafinan
cuidadosamente en xilol, llevándose hasta alcohol absoluto e hidratándose (6).
DIGESTIÓN ENZIMÁTICA: la pérdida de antigenicidad ocasionada por los fijadores que
contienen aldehídos como el formol, puede restablecerse por medio de la digestión
enzimática con enzimas como proteasa, tripsina y pronasa entre otras, ya que estas
ayudan a descubrir los diferentes antígenos presentes en el tejido (6).
BLOQUEO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ENDÓGENA: si en la técnica
inmunoenzimática se utiliza como marcador una enzima normalmente presente en el
tejido, se debe inhibir su actividad endógena antes de la inmunotinción, de lo
contrario, la enzima endógena reaccionará con el sustrato empleado para localizar la
enzima marcadora, dando lugar a falsos positivos. Para el bloqueo de la peroxidasa
endógena se emplea peroxido de hidrógeno disuelto en metanol (6).
INCUBACIÓN: para prevenir la evaporación del antisuero, las incubaciones se llevan a
cabo en una atmósfera húmeda, preferiblemente en cámara de incubación, puesto que
la temperatura influye en la velocidad de reacción antígeno-anticuerpo. Si se realizan
incubaciones cortas el procedimiento se hará a temperatura ambiente; pero si por el
contrario, se aplican incubaciones largas se deberá mantener la cámara húmeda a 4ºC
(6).
REVELADO: es el proceso mediante el cual, se pone de manifiesto el lugar de la
reacción antígeno-anticuerpo por la adición del sustrato, la enzima y de un cromógeno
(6).
CONTROLES: en el control negativo, se omite el anticuerpo primario y se sustituye por
suero no inmune o buffer; si el resultado es positivo se deberá a una reacción
inespecífica. Para control positivo, se utiliza una sección de tejido de la que se tenga
certeza absoluta de que tiene el antígeno por determinar. Así, si con un control
positivo la técnica es negativa será debido a un defecto de fijación o a cualquier fallo
en el procedimiento técnico (6).
4.1.2 FUNDAMENTO TÉCNICAS INMUNOHISTOQUÍMICAS
Las técnicas inmunohistoquímicas son técnicas de inmunolocalización que utilizan una
enzima como trazador del marcaje. Al llevarse a cabo la reacción antígeno-anticuerpo
esta se visualiza añadiendo el sustrato de la enzima más un cromógeno, el producto
originado al actuar la enzima sobre el sustrato, interacciona a su vez sobre el cromógeno,
dando lugar a un precipitado insoluble y coloreado (6). En estas pueden utilizarse tanto
anticuerpos monoclonales como policlonales.
ANTICUERPOS POLICLONALES: son anticuerpos que van dirigidos contra los diferentes
epítopes o determinantes antigénicos de un inmunógeno. Estos anticuerpos, son
elaborados inmunizando un animal hospedero con una molécula específica, en la que
se encuentran diferentes determinantes antigénicos, frente a los cuales se pretende
obtener anticuerpos. El animal produce numerosas clonas de células plasmáticas;
cada una de las cuales es capaz de sintetizar un anticuerpo con especificidad diferente
para cada uno de los epítopes presentes en el inmunógeno (6).
ANTICUERPOS MONOCLONALES: van dirigidos específicamente contra un epítope de
un inmunógeno. Se elaboran fusionando la célula productora de anticuerpos (Linfocito
B) específicos para el epítope deseado, con una célula que tenga ilimitada capacidad
de división (célula de mieloma), de este modo la célula fusionada o hibridoma será
capaz de vivir en un medio de cultivo selectivo, dividirse y producir anticuerpos
específicos (6).
4.1.2.1. TÉCNICAS DE INMUNOPEROXIDASA
Método directo: es el procedimiento más sencillo pero el menos sensible para la
detección de antígenos. En este, el anticuerpo que va dirigido contra el antígeno
(anticuerpo primario) se une de forma covalente a la peroxidasa (7).
Método indirecto: en este procedimiento el anticuerpo primario o específico sin
conjugar se une al antígeno presente en el tejido, posteriormente se añade un
anticuerpo marcado con el trazador enzimático (anticuerpo secundario), obtenido de
un animal diferente al primario y específico para el animal y la clase de
inmunoglobulina que constituye el anticuerpo primario (7).
Método de la peroxidasa-antiperoxidasa (PAP): este procedimiento desarrollado
por Sternberger y colaboradores en 1970 se utiliza como trazador de inmunocomplejos
formados por la enzima peroxidasa y anticuerpos específicos dirigidos contra ella. La
peroxidasa se obtiene del rábano picante mediante un proceso de purificación y se
inocula a un animal para obtener los anticuerpos dirigidos contra la enzima. De este
modo, al poner en contacto los anticuerpos con la peroxidasa, se forman complejos
antígeno-anticuerpo (complejos peroxidasa-antiperoxidasa o PAP) a través de una
reacción de precipitación. Estos complejos están formados por tres moléculas de
peroxidasa y dos de anticuerpo antiperoxidasa (7).
4.1.2.2. MÉTODO AVIDINA-BIOTINA
Son procedimientos muy sensibles que utilizan anticuerpos marcados y se basan en la
gran afinidad que poseen entre sí las moléculas de biotina y avidina, de forma que se
genera un fuerte enlace no inmune (6).
La avidina es una glicoproteína de alto peso molecular que esta presente en la clara de
huevo y en la bacteria Streptomyces avidinii. Esta molécula esta formada por cuatro
subunidades que configuran una estructura terciaria con cuatro regiones hidrofóbicas de
unión con la biotina (6).
La biotina es una vitamina de bajo peso molecular perteneciente al
complejo B (vitamina H) que se encuentra en la yema del huevo. Se
conjuga fácilmente con anticuerpos y enzimas trazadoras, ligándose de
forma covalente a cadenas laterales amino o carbonilo de residuos
aminoácidos o de azúcares de proteínas y glicoproteínas. Se considera que
pueden unirse hasta 150 moléculas de biotina a una sola molécula de
anticuerpo (6).
En todos los métodos inmunoenzimáticos que utilizan el procedimiento
avidina-biotina, se realiza el marcaje del anticuerpo primario con biotina
(técnica directa) o del anticuerpo secundario (técnica indirecta).
Método puente avidina-biotina: en este se realiza una unión del
anticuerpo biotilinado con avidina sin marcar para ligar a continuación
este complejo con una enzima también biotilinada (7).
Método de complejo avidina-biotina o ABC: se aplica un complejo de
avidina y trazador enzimático biotilinado que contenga lugares de unión
libres en la avidina para que se produzca la fijación sobre el anticuerpo
primario o secundario biotilinado (7).
4.1.2.3. ENZIMAS
PEROXIDASAS: son enzimas que catalizan la oxidación de diversas
sustancias a través de su reacción con el peroxido de hidrógeno (H2O2).
Son muy abundantes tanto en vegetales (rábano picante) como en
tejidos animales (mieloperoxidasa de leucocitos); tienen actividad
pseudoperoxidásica la hemoglobina y ciertas enzimas oxidorreductoras
(catalasas). Como método que más se utiliza para la detección de
peroxidasas, el es el de la bencidina. Esta es una sustancia difenólica
particular que se oxida en presencia de oxígeno naciente. Sin embargo,
el método emplea un derivado de la bencidina, la 3´3-diaminobencidina
la cual proporciona colores estables. El sustrato descompuesto por la
enzima para la obtención de oxígeno, es el peróxido de hidrógeno (6).
FOSFATASA ALCALINA: es una enzima capaz de hidrolizar los ésteres
de fosfato en un medio alcalino, la demostración de la actividad de esta
enzima se realiza empleando naftol-AS-fosfato como sustrato y sales de
diazonio tipo fast red TR o fast blue BB como agente de copulación, el
resultado de la reacción es un colorante azoico rojo o azul. El principal
inconveniente de los métodos que utilizan la fosfatasa alcalina como
trazador, es la necesidad de utilizar un medio de montaje acuoso para
la confección definitiva de las preparaciones. Sin embargo, con los
nuevos procedimientos de revelado mediante neofucsina se obtiene un
compuesto también de color rojo e insoluble tanto en agua como en
disolventes orgánicos (6).
GLUCOSA OXIDASA: es una enzima aislada del Aspergillus niger y de la
que no existe actividad endógena en mamíferos. Histoquímicamente se
demuestra por la oxidación de la glucosa con reducción simultánea de
una sal de tetrazolio incolora que se transforma en un azul formazan
estable y no difusible (6).
4.2 Mycobacterium bovis (BCG)
Mycobacterium bovis es productor de enfermedad fundamentalmente en animales aunque
también puede ser adquirido por el hombre, constituyéndose en la mayoría de los casos
en una enfermedad de tipo profesional. La enfermedad que produce en el hombre es
indistinguible de la causada por el M. tuberculosis (8).
La cepa atenuada del Mycobacterium bovis contenida en la vacuna del bacilo Calmette–
Guérin (BCG), fue inicialmente aislada de la ubre de una vaca con tuberculosis, por Nocard
en el año de 1902 (9).
En el mismo año Calmette y Guérin iniciaron una serie de trabajos con cultivos de este
microorganismo utilizando un medio con glicerol, papa y bilis. Años más tarde y después
de 230 pases lograron obtener una cepa lo suficientemente atenuada, apropiada para ser
utilizada como vacuna y de la cual se dispuso solo hasta el año de 1921 (9).
Sin embargo, en 1930 para Calmette y Guérin fue necesario hacer diferentes
demostraciones de la inocuidad de la vacuna luego de lo ocurrido en Lubeck (Alemania),
cuando por error 251 recién nacidos fueron “vacunados” con una cepa virulenta del bacilo,
de los cuales fallecieron 71 niños (10).
La vacunación tiene por objeto proteger a los no infectados especialmente a las
poblaciones donde existe un gran número de tuberculosos bacilíferos, lo que lleva a que el
riesgo de transmisión sea elevado (10). Su función es reemplazar una infección natural
virulenta por otra, con una cepa de BCG no virulenta pero que es capaz de estimular una
respuesta inmune y que en el huésped creará una protección frente a nuevas infecciones
causadas por M. tuberculosis o por otras micobacterias como M. leprae frente al que ha
mostrado conferir mayor protección en algunos ensayos clínicos poblacionales (11).
4.2.1 MECANISMO DE ACCIÓN
El mecanismo de protección ofrecido por la vacuna BCG, involucra una reacción en la
diseminación hematógena del bacilo desde el sitio de la infección primaria. La vacuna
protege contra las manifestaciones agudas de la enfermedad y reduce el riesgo de
reactivación endógena a lo largo de la vida y de diseminación a partir de un foco adquirido
por una primoinfección. No hay evidencia de que la BCG reduzca el riesgo de infección o
reinfección (12). Sin embargo, hay un consenso acerca del efecto protector de esta
vacuna contra meningitis y las formas diseminadas de la tuberculosis en la infancia (13).
Una vez introducida en el organismo, la vacuna activa la multiplicación y sensibilización de
los Linfocitos T (14).
Ventajas de la vacuna: entre estas tenemos su inocuidad, bajo costo, solo se
requiere de una dosis la cual se puede suministrar a cualquier edad y su alta
inmunogenicidad (12).
Desventajas: la vacuna está compuesta por microorganismos vivos que han sido
sometidos a varios cambios desde la cepa original que pueden haber modificado sus
características inmunogénicas y su virulencia. No previene la infección tuberculosa
pero sí sus manifestaciones más agudas. Presenta mejor eficacia en zonas tropicales
donde existe prevalencia alta de otras micobacterias no tuberculosas. Interfiere con la
utilización diagnóstica de la reacción tuberculínica. Es lábil a la luz y al calor y a pesar
de su inocuidad, presenta complicaciones que van desde la ulceración local y cicatrices
queloideas hasta la osteitis y diseminación (12).
4.2.2 APLICACIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-BCG
Los anticuerpos anti-BCG, son anticuerpos policlonales capaces de reaccionar contra
diferentes determinantes antigénicos solubles e insolubles de M. bovis (5).
Estos anticuerpos han sido utilizados en técnicas inmunológicas como la
contrainmunoelectroforesis, donde se pudo observar la reacción cruzada que presentan
estos con diferentes determinantes antigénicos de las micobacterias y con algunas
especies de bacterias de diferente familia a la Mycobacteriaceae, entre estas se
encuentran Nocardia asteroides, Corynebacterium pyogenes y Listeria monocytogenes (5).
También se ha comprobado su utilidad en técnicas inmunohistoquímicas (IHQ). En el año
de 1990, un estudio realizado en la Universidad de Texas confirmó la efectividad de la
reactividad cruzada que presentan estos anticuerpos policlonales (anti-BCG) en un trabajo
realizado en biopsias con hiperplasia pseudoepiteliomatosa. La positividad se observó
mediante la reacción de color dada por la presencia del antígeno ubicado en los focos
supurativos descubriéndose así casos de Nocardiosis cutánea primaria los cuales fueron
confirmados por cultivo (15). Estos estudios de reactividad cruzada, han llevado a la
experimentación con otras patologías como micosis en las cuales se ha observado una
reacción positiva con el anticuerpo (16).
Su utilización para la detección de una amplia gama de microorganismos en tejidos fijados
en formol e incluidos en parafina es posible gracias a su alta sensibilidad a la que se le
suma el hecho de que son capaces de reaccionar con cerca de 100 antígenos diferentes
de BCG los cuales son comunes para otras micobacterias e incluso algunos son
compartidos con diferentes especies (4).
Recientemente, Julie Byrd y col. utilizaron una técnica con anticuerpo anti-BCG en biopsias
de pacientes con micosis causadas por Sporothrix shenckii, en las cuales fue posible
detectar tanto antígeno digerido por macrófagos como las levaduras que conservaron su
integridad estructural durante todo el proceso (17).
4.3 GÉNERO Mycobacterium
Las enfermedades ocasionadas por micobacterias constituyen un capítulo importante en la
patología infecciosa humana, con enfermedades tan antiguas como la tuberculosis y la
lepra (18).
El género Mycobacterium incluye más de 100 especies que pueden clasificarse en seis
grupos desde el punto de vista bacteriológico pero con fines didácticos se dividen en tres
apartados:
COMPLEJO TUBERCULOSIS. Incluye las especies M. tuberculosis, Mycobacterium bovis
(incluida la cepa BCG) y Mycobacterium africanum, productoras todas ellas de
tuberculosis. Se incluye también Mycobacterium microti, productor de tuberculosis en la
rata (19).
COMPLEJO LEPRA. En el que se incluyen las especies M. leprae productor de la lepra
humana y Mycobacterium lepraemurium que produce lepra en roedores (19).
OTRAS MICOBACTERIAS. Son micobacterias no comprendidas en los dos grupos
anteriores. Sólo algunas de ellas suelen ser patógenas oportunistas y otras suelen ser
saprófitas. Producen las denominadas infecciones por micobacterias atípicas (19).
Los principales antígenos de las micobacterias se dividen en dos grandes grupos:
Solubles o citoplasmáticos.
Insolubles ligados a la pared celular (18).
En relación con la naturaleza de los antígenos solubles se sabe que hay:
De naturaleza polisacárida comunes a todas las micobacterias y constituidos por
arabinosa, arabinogalactanos y glucanos (18).
Proteínas, entre ellas la denominada tuberculina vieja (OT) o el Derivado Proteico
Purificado (PPD). También el antígeno 5 o el de 65 Kda (18).
Lipídica, los monóxidos de fosfatidil inositol (PIM) constituyen una familia de lípidos
polares que se encuentran presentes en la membrana plasmática de las micobacterias.
Entre ellos se pueden citar los glicolípidos fenólicos, bastante específicos para M.
leprae (PGL-1), para M. kansasii (PGL-Kl) y para M. tuberculosis (PGL-Tbl) (18).
El denominado antígeno 60 (Ag 60) es un complejo proteico-lipopolisacárido
procedente del citoplasma y de la membrana celular del M. bovis BCG y es común a M.
tuberculosis, M. bovis y otras micobacterias (18).
Estudiando los antígenos mediante doble difusión en gel, se han establecido cuatro
grandes grupos con mayor o menor especificidad:
Grupo I: compuesto por antígenos comunes compartidos por todas las micobacterias
e incluso con algún otro género bacteriano como Nocardia o Corynebacterium (18).
Grupo II: estaría formado por antígenos propios de las micobacterias de crecimiento
lento (18).
Grupo III: en este estarían incluidos los antígenos de las micobacterias de
crecimiento rápido y nocardias (18).
Grupo IV: constituido por antígenos propios de cada especie (18).
Los antígenos insolubles ligados a pared se han usado con fines taxonómicos mediante
aglutinación por especies no rugosas como el M. avium, estableciéndose serotipos con
excepción del M. tuberculosis en el cual estos procedimientos no resultan útiles puesto
que este produce autoaglutinación (18).
4.4 TUBERCULOSIS
Desde el siglo pasado cuando el Doctor Robert Koch, descubrió el bacilo de la tuberculosis
los investigadores han buscado numerosas estrategias con el fin de controlar la epidemia
que ha durado milenios y que cada año le cuesta la vida a millones de personas en el
mundo entero (8).
A partir de la década de los cuarenta, cuando se desarrollaron las primeras terapias
realmente efectivas contra la enfermedad la comunidad científica pensó ingenuamente
que era posible erradicarla por completo. Así, en naciones industrializadas era evidente el
descenso progresivo en el número de victimas hasta el punto que a comienzos de los 80´s
ya no era considerado un problema de salud pública en abierto contraste con los datos
obtenidos en países en vía de desarrollo, donde la epidemia continuaba campante (8).
4.4.1 Mycobacterium tuberculosis
El bacilo de la tuberculosis suele tener una morfología característica, se presenta de forma
recta o ligeramente curvo en frotis teñidos y su tamaño es de 1 a 4 µm de largo por 0.3 a
0.5 µm de ancho. Ocasionalmente forman ramificaciones verdaderas y se observan en
cultivos enriquecidos o en frotis de ganglios linfáticos caseosos. No son formadores de
esporas y no poseen flagelo o cápsula. Las micobacterias son aerobios estrictos (20).
Son bacilos ácido-alcohol-resistentes, por lo que la tinción de Ziehl Neelsen es útil para la
coloración de estos microorganismos obtenidos ya sea de muestras clínicas o de cultivo.
Los bacilos tuberculosos son difíciles de teñir con tinción de Gram pero aunque de forma
irregular se alcanzan a teñir como gram positivos (2). Estructuralmente consta de una
gruesa pared separada de la membrana celular por el espacio periplásmico. Posee cuatro
capas perfectamente definidas compuestas así: la más interna es el glicopeptido o
peptidoglicano con moléculas de N-acetilglucosamina y ácido N-glucorilmurámico (en lugar
del habitual N-acetilmurámico) con cortas cadenas de alanina. Externamente hay otras
tres capas compuestas, una por polímeros de arabinosa y galactosa y otra formada por
ácidos micólicos (que son ácidos grasos derivados, de gran importancia taxonómica en
micobacterias y otros géneros relacionados como Nocardia) y otra superficial formada por
lípidos como los sulfolípidos, el cord factor, llamado así por su aparente asociación con la
forma acordonada con que se agrupan las micobacterias virulentas y los micósidos que
son al igual que el anterior glicolípidos. Los bacilos tuberculosos tienen un crecimiento
muy lento, incluso en condic iones óptimas se requiere de 10 a 20 días de incubación a
37ºC (22).
Figura 1. Mecanismos de virulencia de M. tuberculosis . (Tomado de ILADIBA).
(23).
Los tres principales factores de virulencia de M. tuberculosis son:
A) Actividad catalasa-peroxidasa.
B) El factor colonizador de macrófagos, que se encuentra codificado por el gen mce.
C) Moléculas relacionadas con el gen sigA (tales como esterasa, fosfolipasas y lipasas)
(23).
4.4.2 TAXONOMÍA
- Reino: Procaryotae
- Clase: Schyzomycetes
- Familia: Mycobacteriaceae
- Género: Mycobacterium
- Especie: tuberculosis
(24).
4.4.3 EPIDEMIOLOGÍA Y TRANSMISIÓN
La tuberculosis constituye una de las enfermedades infecciosas de mayor prevalencia y es
la principal causa de muerte por enfermedad prevenible a nivel mundial. Así, hoy la
tuberculosis supone un importante problema de salud pública con una incidencia que se
ha elevado en muchos países en los últimos años (25).
La epidemia de la infección por el Virus de Inmunodeficiencia Humana, el aumento de la
indigencia en los grandes centros urbanos y la inmigración de habitantes de áreas
geográficas con alta prevalencia de tuberculosis, se han señalado como las causas más
importantes que han contribuido a revertir la curva decreciente de nuevos casos de
tuberculosis que se venia observando en los países occidentales (25).
El riesgo de padecer tuberculosis es variable dependiendo de la presencia de
determinados factores. La adquisición de la infección tiene lugar por vía aérea, con un
riesgo que es similar para todos los individuos, variando exclusivamente con la capacidad
infectiva de la persona enferma y la proximidad del contacto. Tras la infección primaria, la
progresión a enfermedad es variable de una persona a otra. En los niños menores de 5
años y en personas inmunodeprimidas existe un riesgo elevado de una rápida progresión
(en semanas o meses) a enfermedad activa, con frecuencia diseminada. En los adultos no
inmunocomprometidos existe mayor posibilidad de que la infección entre en estado de
latencia con un riesgo de reactivación en los años siguientes (26).
Las personas con infección latente pueden ser identificadas mediante la prueba de la
tuberculina (PPD), que permite detectar a las personas infectadas para que se puedan
beneficiar de recibir quimioprofilaxis evitándose así el desarrollo de la enfermedad (27).
Ocasionalmente, en las personas inmunocompetentes, la tuberculosis puede presentarse
con afectación extrapulmonar o diseminada. Aunque estas son las formas clínicas más
frecuentes en pacientes con SIDA o inmunocomprometidas. Entre los órganos que con
mayor frecuencia se afectan se incluyen los ganglios linfáticos, hígado, bazo, riñón,
sistema nervioso central y el pericardio. No es raro el aislamiento de M. tuberculosis a
partir de sangre de pacientes inmunocomprometidos (27).
En 1993 la Organización Mundial de la Salud declaró la tuberculosis como emergencia
global, pues su incidencia ha venido experimentando un preocupante incremento en todo
el mundo, gracias a la epidemia de infección por el Virus de Inmunodeficiencia Humana, al
deterioro de las condiciones de vida en varias naciones y al descuido de las políticas de
salud destinadas a su control. Se calcula que un tercio de la población mundial (dos mil
millones de personas), está infectada por Mycobacterium tuberculosis (28).
4.4.4 MANIFESTACIONES CLÍNICAS
Clínicamente la tuberculosis puede presentarse como: tuberculosis primaria; tuberculosis
secundaria y tuberculosis miliar (20).
4.4.4.1. TUBERCULOSIS PRIMARIA
Esta infección se presenta en personas que no han tenido contacto previo con el
microorganismo. Aunque los bacilos suelen ingresar por el sistema respiratorio, en
ocasiones también lo pueden hacer por el tracto digestivo, por inoculación cutánea o
subcutánea. Los bacilos inhalados suelen depositarse en los alvéolos ubicados justo
debajo de la pleura, por lo general en la parte inferior de los lóbulos superiores o en la
parte superior de los lóbulos inferiores, esto se debe a que en estas áreas se recibe el
mayor volumen de aire inspirado. La infección inicial solo causa alteraciones leves
acompañados en algunas oportunidades de malestar general y fiebre. Como no hay
linfocitos T sensibilizados los bacilos se pueden multiplicar libremente, pasando al torrente
sanguíneo o linfático y la inmunidad celular tarda en desarrollarse un período de más o
menos tres a seis semanas (20).
La infección primaria produce de manera característica un complejo llamado (Complejo de
Ghon), que se presenta como una sola lesión en el parénquima pulmonar, por lo general
subpleural, la cual se ve acompañada de una lesión en los ganglios linfáticos hiliares que
drenan esa parte del pulmón. Esta lesión es típicamente un nódulo gris y circunscrito de
1cm. que se torna granulomatoso a los pocos días. Por la segunda semana adquiere un
centro blando de necrosis caseosa. Los bacilos drenan por las vías linfáticas, infectando
los ganglios linfáticos, formando así la segunda parte del Complejo de Ghon (20).
En la mayoría de los adultos normales, la infección sigue su curso limitado curando las
lesiones del complejo mediante retracción, fibrosis cicatricial y calcificación. La mayoría de
los microorganismos mueren pero algunos pueden continuar viables durante años. Si los
mecanismos inmunes se debilitan o fallan los bacilos inactivos pueden emerger y causar
una grave infección tuberculosa (20).
La tuberculosis primaria progresiva se da cuando la respuesta inmune no logra controlar la
multiplicación de los bacilos, por ello esta es más común en niños menores de 5 años y en
inmunocomprometidos, en estos, el foco de Ghon se agranda en el pulmón y rápidamente
erosiona el árbol bronquial y se propaga ocasionando lesiones satelitales. Paralelamente
se produce una neumonía tuberculosa (20).
4.4.4.2. TUBERCULOSIS SECUNDARIA
Esta suele ocurrir por reactivación de los microorganismos endógenos inactivos en un
paciente sensibilizado y en algunos casos la enfermedad se debe a reinfección por bacilos
exógenos. La tuberculosis secundaria puede ocurrir en cualquier momento después de
una tuberculosis primaria. La reactivación se inicia típicamente en los segmentos apicales
o posteriores de uno o ambos lóbulos superiores, en donde los microorganismos fueron
sembrados durante la infección primaria, en este caso las lesiones son periféricas y
cavitarias. Una cápsula fibrosa rodea a un centro acelular caseoso que contiene
numerosos bacilos de Koch (20).
Los síntomas de esta tuberculosis comienzan con tos, posteriormente aparece febrícula
acompañada de malestar general, cansancio, anorexia, adelgazamiento y a menudo
sudoración nocturna. A medida que la enfermedad progresa aparece expectoración
sanguinolenta. La rotura de una rama de la arteria pulmonar en la pared de la cavidad
produce hemoptisis masiva con asfixia (20).
Estas lesiones pueden presentar diferentes efectos secundarios: 1) Fibrosis y calcificación;
2) propagación a otras áreas; 3) fibrosis pleural con adherencias, dolor pleurítico en
puñalada y disnea; 4) rotura de una lesión caseosa que libera bacilos dentro de la cavidad
pleural y 6) implantación de bacilos en la laringe ocasionando laringitis (20).
4.4.4.3. TUBERCULOSIS MILIAR
Es la forma diseminada, se produce por la siembra de bacilos en vasos linfáticos o
sanguíneos con producción de minúsculas lesiones blanco-amarillentas. Los sitios más
comunes de las lesiones miliares son: el pulmón, ganglios linfáticos, riñones,
suprarrenales, medula ósea, bazo, hígado, meninges, encéfalo, ojos y genitales (20).
4.4.5 DIAGNÓSTICO
El diagnóstico actual de la tuberculosis se basa esencialmente en las mismas técnicas
bacteriológicas que enseñó Robert Koch hace más de 100 años. Sin embargo, si bien la
baciloscopia tiene una alta especificidad, es poco sensible en las formas menos avanzadas
de la enfermedad. Además es un procedimiento que requiere de personal entrenado y de
laboratorios especiales. El cultivo aumenta la sensibilidad diagnóstica, a expensas de un
mayor costo y de una demora de 4 a 8 semanas (29).
Durante el último decenio se ha tomado conciencia que para lograr la erradicación de la
tuberculosis, es más importante mejorar los métodos diagnósticos que intentar seguir
perfeccionando el tratamiento de la enfermedad. Es así como en los últimos años se han
estado introduciendo nuevas técnicas que prometen revolucionar en un futuro próximo el
manejo de la tuberculosis y otras enfermedades infecciosas y aún el de muchas
enfermedades crónicas como el cáncer (29). Entre las técnicas de diagnóstico de la
tuberculosis tenemos:
Técnicas químicas: el método más recientemente desarrollado es el “high
performance liquid cromatography” (HPLC), el cual es capaz de detectar cantidades
mínimas de determinadas sustancias químicas producidas por la micobacteria en los
líquidos orgánicos, amplificando señales hasta en un millón de veces. Sin embargo,
aunque muy prometedor este procedimiento resulta ser muy costoso ya que requiere
de métodos radioactivos y otros de cromatografía de gases y espectrómetro de masas
(30).
Técnicas radiométricas: para este se emplean unos frascos que contienen un medio
de cultivo de Middlebrook enriquecido, rico en ácido palmítico y otros ácidos grasos
marcados con carbono 14 (C14). Este isótopo emite radiaciones â que son de baja
longitud y por lo tanto son inofensivas para el personal de laboratorio. Con este
procedimiento se establece un “índice de crecimiento”, resultando ser un método de
alta sensibilidad y especificidad con el que se permite hacer el diagnóstico en menos
de una semana en el 95% de los casos (31).
Detección de anticuerpos: con esta técnica se busca, identificar y cuantificar en el
suero del enfermo, los anticuerpos dirigidos contra los antígenos más específicos de la
micobacteria (32).
Detección de antígenos: en tuberculosis cada día aparecen nuevas técnicas de
detección de antígenos. Así con la técnica de ELISA y empleando anticuerpos anti-
BCG, se ha podido cuantificar los antígenos solubles del bacilo de Koch en líquido
céfalorraquídeo y hacer así el diagnóstico de meningitis tuberculosa con una alta
sensibilidad y especificidad (32).
4.5 LEPRA
La lepra o enfermedad de Hansen es una infección crónica causada por Mycobacterium
leprae que afecta las partes más frías del cuerpo en particular mucosa nasal, vías
respiratorias superiores, nervios periféricos, testículos, piel de las orejas y segmento
anterior de los ojos (20).
4.5.1 Mycobacterium leprae
Mycobacterium leprae es un bacilo pleomórfico gram positivo (33) y ácido-alcohol
resistente al ser coloreado por el método de Zielh-Neelsen. Mide entre 1 y 8 µm de
longitud por 0.2 a 0.5 µm de ancho, se puede observar como bacilo individual o agruparse
en globias. Esta micobacteria no crece en medios de cultivo artificiales (34).
4.5.2 TAXONOMÍA
- Reino: Procaryotae
- Clase: Schyzomycetes
- Orden: Actinomycetales
- Familia: Mycobacteriaceae
- Género: Mycobacterium
- Especie: leprae
(35)
4.5.3 EPIDEMIOLOGÍA Y TRANSMISIÓN
El reservorio más importante de la lepra es el enfermo humano multibacilar no tratado, el
cual por medio de las mucosas nasal y oral descarga enormes cantidades de bacilos (36)
los cuales utilizan como puerta de entrada la nariz y la mucosa respiratoria (37). Aunque
no se puede descartar la vía cutánea especialmente en pacientes bacilíferos con lesiones
abiertas (38).
En diferentes trabajos se ha mostrado que la infección en convivientes de enfermos es
cercana al 50% y entre los convivientes expuestos a pacientes multibacilares se presentan
porcentajes de infección más elevados que en otros individuos menos expuestos (36).
Siendo un factor de riesgo convivir con una persona infectada.
En Colombia, es notorio el agrupamiento de casos de lepra en los departamentos de Norte
de Santander, Santander y Boyacá, dentro de los que existe agrupamiento municipal (36).
En general la lepra presenta tasa de incidencia y proporciones de prevalencia mayores para
la zona rural que para la urbana.
En adultos la lepra es más común en hombres que en mujeres (33), la razón en Colombia es
2:1 con variaciones dentro de las diferentes regiones, siendo en algunas 1:1. Y con
respecto a la edad, la mayoría de estudios han mostrado un pico alrededor de los 20 años
con estabilización a los 50 años (36).
4.5.4 MANIFESTACIONES CLÍNICAS
La lepra presenta una gran variedad de manifestaciones clínicas las lesiones varían desde
pequeñas máculas de la lepra indeterminada hasta las lesiones difusas, desfigurantes y a
veces fatales de la lepra lepromatosa. Esta variación se relaciona con las diferencias en la
reactividad inmune (39).
Dentro del 5 % de los pacientes susceptibles a la enfermedad, existe un amplio espectro
que va desde pacientes anérgicos (que tienen poco o nada de resistencia) que adquieren
lepra lepromatosa, mientras que aquellos hiperérgicos (que tienen gran resistencia) que
adquieren lepra tuberculoide y en el medio se encuentra la lepra dimorfa (20).
4.5.4.1. CLASIFICACIÓN
La clasificación de las diferentes formas de la lepra ha sido bastante controversial, sin
embargo, en el Sexto Congreso Internacional de Lepra en Madrid en 1.953 se recomendó
establecer dos tipos polares, lepromatosa y tuberculoide y dos grupos, indeterminada y
dimorfa (40).
En 1.966 Ridley y Jopling dividieron el espectro en 5 grupos basados en criterios clínicos,
inmunológicos y patológicos (Tabla ) así: Tuberculoide-Tuberculoide (TT), Dimorfo-
Tuberculoide (BT), Dimorfo-Dimorfo (BB), Dimorfo-Lepromatoso (BL), Lepromatoso-
Lepromatoso (LL). Las formas indeterminada (I) y neural pura están fuera de esta
clasificación (41).
Y en 1981 la OMS con el fin de instaurar los regímenes de terapia multidroga, introdujo
una nueva terminología basada en los hallazgos bacteriológicos: pacientes multibacilares
(MB) y paucibacilares (PB) (40).
Tabla 1. Clasificación de la lepra. Ridley y Jopling (1966), Congreso de Madrid (1953) y
OMS (1982).
CLASIFICACION ESPECTRO DE LA LEPRA
R Y J TT BT BB BL LL
MADRID Tuberculoide Dimorfa Lepromatosa
O M S Paucibacilar Multibacilar
(40)
4.5.4.2. LEPRA INDETERMINADA
Se debe tener en cuenta que antes de presentarse las lesiones cutáneas se producen
parestesias o endurecimientos localizados muy difíciles de diagnosticar como lepra hasta
pasado cierto tiempo. Luego se observarán las alteraciones cutáneas que pueden ser
sutiles y pasar inadvertidas (42). Pero las lesiones características son máculas únicas o
múltiples, asimétricas, hipocrómicas o eritemato-hipocrómicas de límites difusos o mal
definidos. Se localizan en cualquier lugar del cuerpo pero tienen preferencias por las
zonas más frías como la cara, las extremidades y la región glútea. Son lesiones planas
que no hacen relieve sobre la superficie normal de la piel. La sensibilidad cutánea en las
lesiones esta discretamente disminuida, la sudoración y el crecimiento del vello no suelen
estar afectados (40).
La lepra indeterminada puede permanecer como tal, curar espontáneamente o virar a
lepra lepromatosa o tuberculoide, por esto es importante diagnosticarla a tiempo ya que
esto permitirá que los enfermos se curen sin secuelas (42).
4.5.4.3. LEPRA TUBERCULOIDE (LT)
Las lesiones en lepra tuberculoide pueden ser maculosas, placas infiltradas con o sin
microtubérculos en la periferia, eritematosas, hipocrómicas o eritematovioláceas; de pocos
centímetros a lesiones anulares grandes. Es infrecuente pero característico que dentro de
la placa o mácula o en su periferia se palpe un filete nervioso engrosado. Los bordes son
bien definidos (42).
El compromiso neural es precoz e intenso, apareciendo prontamente hipo o anestesia,
disminución de la sensibilidad térmica y táctil, anhidrosis y alopecia. El número de
lesiones es escaso y asimétrico (menos de 5 lesiones) (42).
Las lesiones de la LT pueden curarse espontáneamente, pero el principal riesgo lo
constituye la afección de los troncos nerviosos, que deja secuelas graves e irreversibles
(40).
4.5.4.4. LEPRA DIMORFA
Este grupo es una mezcla de varios grados de componentes lepromatosos y tuberculoides.
Los subgrupos de lepra dimorfa son: (33,40).
Lepra dimorfa-tuberculoide (BT): de 6 a 25 lesiones
Lepra dimorfa-dimorfa (BB): más de 25 lesiones
Lepra dimorfa-lepromatosa (BL): numerosa y variada cantidad de lesiones
Las lesiones suelen ser maculosas o placas eritematosas, violáceas o castañas, infiltradas
en su totalidad, muy características con una zona recortada central neta y una de avance
o externa que gradualmente se confunde con la piel vecina. Varían en número de acuerdo
al sitio del espectro en que se hallen, numerosos en BL, menor número en BT. El
compromiso neural es precoz, intenso y están afectados numerosos nervios. Esta es la
forma clínica con mayor daño neural (42).
4.5.4.5. LEPRA LEPROMATOSA
En la lepra lepromatosa la resistencia al microorganismo es prácticamente nula, lo que le
permite multiplicarse sin obstáculos en todos los órganos del paciente. Las lesiones se
tornan eritematosas, ferruginosas e infiltradas, de límites precisos y se diseminan
ampliamente. Con los años surgirán pápulas, placas y tubérculos o lepromas. Las orejas
se afectan inicialmente por infiltración y posteriormente con lepromas. Hay caída de la
cola de las cejas y de las pestañas (40).
Las infiltraciones de cara acompañada de los lepromas originan la facies leonina típica, con
caída nasal o ensanchamiento de la nariz y de los lóbulos auriculares péndulos. En frente
y mentón abollona la piel y se acentúan los pliegues. A su vez sobre las infiltraciones o en
forma aislada pueden hallarse los tubérculo-nódulos o lepromas , con alteraciones de la
sensibilidad, alopecia, anhidrosis (42).
Los pacientes con LL tienen compromiso de la mucosa nasal, que sin un manejo adecuado
puede llegar a la perforación del tabique y la deformidad de la nariz en silla de montar
(40).
4.5.5 HISTOPATOLOGÍA
LEPRA INDETERMINADA: en la lepra indeterminada se observa escaso o ningún
infiltrado linfohistiocitario perivascular superficial. Infiltrados linfohistiocitarios
perineurales en la dermis profunda. Engrosamiento neural de filetes de límite
dermohipodérmico o subcutáneo, con penetración de linfocitos, plasmocitos y
macrófagos al nervio. Engrosamiento del perinervio con perdida de la delimitación
neta del mismo con el tejido conjuntivo vecino. Infiltrados perivasculares y
perisudoríparos en grado variable, usualmente discreto (39).
Ocasionalmente, se ven bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR) en células
subepidérmicas; en el endotelio de vasos del límite dermohipodérmico y en los
músculos erectores del pelo (39).
LEPRA TUBERCULOIDE: en la lepra tuberculoide se ven granulomas subepidérmicos
que tocan y erosionan el epitelio, constituidos por células epitelioides y de Langhans
con abundantes linfocitos. Granulomas semejantes en la dermis profunda que tienden
a confluir y a englobar los anexos cutáneos y los nervios. Grado severo de destrucción
neural por penetración de las células epitelioides, gigantes y linfocitos al nervio, lo cual
los hace irreconocibles en la mayoría de las biopsias (39).
LEPRA DIMORFA: presenta histopatología variable según tienda hacia el polo
tuberculoide o hacia el lepromatoso. En el primer caso, los granulomas son ricos en
células epitelioides y linfocitos, sin mayor número de células de Langhans ni
plasmocitos. Los infiltrados no tocan la epidermis. Los nervios se afectan un poco
menos que en los casos tuberculoides y con las coloraciones para BAAR se observan
escasos o no se observan (39).
En la lepra dimorfa central (BB) se presentan granulomas edematosos de macrófagos
vacuolados con pocas células epitelioides y linfocitos. No hay células de Langhans.
Los nervios están engrosados con alguna tendencia a la laminación y a la invasión por
los infiltrados, se observan numerosos BAAR (39).
En las lepras dimorfas lepromatosas los infiltrados son difusos y están constituidos por
macrófagos vacuolados y escasas células epitelioides dispersas, que no forman
granulomas definidos. Los linfocitos pueden ser abundantes. Los nervios muestran
laminación característica del perinervio. El número de BAAR es muy abundante (39).
LEPRA LEPROMATOSA: la biopsia muestra epidermis atrófica o normal, no hiperplásica,
excepto cuando hay ulceración. Banda estrecha subepidérmica de colágeno horizontal,
no permeada por los infiltrados inflamatorios. Infiltrado dérmico difuso de macrófagos
vacuolados o espumosos que alteran con variable número de plasmocitos a veces muy
importante. El infiltrado puede extenderse al interior de lo lobulillos adiposos
hipodérmicos y a la pared de los vasos de mediano calibre (39).
Se observa enorme número de BAAR en los nervios, los macrófagos, los endotelios y
las estructuras tales como pelos, los músculos erectores del pelo y las glándulas
sudoríparas (39).
4.5.6 DIAGNÓSTICO
El diagnóstico de la lepra se hace por medio del examen clínico, apoyado por la presencia
de Micobacterium leprae en la baciloscopia, pues dependiendo de la carga bacilar se
determinará el esquema y la duración de la terapia (34).
En Colombia, se han estandarizado las baciloscopias así:
Se tomarán mínimo 5 muestras por paciente y las muestras serán de: moco nasal, linfa de
los lóbulos auriculares, linfa de las lesiones y si no las hay, se pueden tomar muestras de
los codos y las rodillas. En todas estas muestras se persigue extraer el líquido intersticial
rico en macrófagos que contienen los bacilos (34).
Estas muestras serán coloreadas por medio de la técnica de Ziehl-Neelsen y se leerán con
las mismas escalas utilizadas en tuberculosis. En el informe se deberá incluir el número
de cruces en cada una de las muestras y el resultado del índice bacilar calculado (34).
La biopsia permitirá confirmar definitivamente la sospecha clínica, clasificar la enfermedad,
contribuir a evaluar los resultados del tratamiento y establecer los diagnósticos
diferenciales. El material de estudio es fijado en formol taponado al 10% e incluido en
parafina y se sacan varias láminas que se colorearan con Hematoxilina-Eosina (HE), Fite-
Faraco (FF) o Ziehl-Neelsen (ZN) (39).
De igual forma se emplean en el laboratorio técnicas como la Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR), métodos que dependen de la detección de ADN el cual es más
susceptible a la degradación en células muertas que otros componentes celulares, por lo
que es un indicador más exacto de viabilidad, determinando así el porcentaje de bacilos
vivos, lo que permite la evaluación eficaz de la quimioterapia y la viabilidad de la
micobacteria (43).
4.6 MICOBACTERIAS ATÍPICAS
Entre el género Mycobacterium existen especies saprófitas denominadas micobacterias
oportunistas que normalmente habitan en el medio ambiente, pudiendo causar
ocasionalmente enfermedad tanto en hombres como en animales.
Inicialmente, cualquier micobacteria distinta al M. tuberculosis o M. leprae era considerada
como saprofito ambiental e inofensivo razón por la cual se agruparon dentro del epíteto de
no tuberculosas o anónimas. Actualmente reconocidas como micobacterias atípicas, cuyo
verdadero potencial patógeno solo fue reconocido a mediados de este siglo (44)
Las micobacterias son microorganismos pleomórficos cuando provienen de muestras
clínicas (45) pero en medios de cultivo se observan como bastoncillos delgados, a veces
ligeramente curvos de 0.2 a 0.6 µm por 1 a 4 µm Algunos presentan ramificaciones
filamentosas, no son formadores de esporas y cada célula tiene una estructura granular
marcada, por lo que con frecuencia aparecen abundantes gránulos citoplasmáticos ácido
alcohol resistentes bipolares. Entre las estructuras granulares se encuentran los gránulos
metacromáticos, constituidos por polifosfatos y gránulos lipídicos. Estos lípidos celulares
constituyen hasta un 40% en peso seco de la bacteria (2).
4.6.1 TAXONOMÍA
- Reino: Procaryotae
- Clase: Schyzomycetes
- Familia: Mycobacteriaceae
- Género: Mycobacterium
- Especie: avium;. intracellulare;
kansasii;.haemophilum
scrofulaceum; simiae;
szulgai;. gordonae;
ulcerans; xenopi;
marinum; chelonae;
fortuitum; africanum
y gordonae
entre otras
(24).
En 1957 Runyon propuso para la unificación de criterios en la clasificación de las
micobacterias atípicas, separarlas en cuatro grupos según el tiempo requerido por estas
para formar colonias en medios artificiales de cultivo y su respectiva producción de
pigmento (46). Ver tabla 2 .
Tabla 2. Clasificación de las micobacterias atípicas por Runyon.
(47).
Grupo I o Fotocromógenas: desarrollan un pigmento que va desde el amarillo hasta
el rojo ladrillo cuando se exponen a la luz.
Grupo II o Escotocromógenas: producen este pigmento aun en ausencia de luz.
Grupo III o no Cromógenas: no producen pigmento alguno.
Grupo IV o Crecedoras rápidas: forman colonias en cultivos a temperatura
ambiente en menos de siete días. Dentro de este grupo es posible encontrar cepas
foto, escoto y no cromógenas (48).
Sin embargo, actualmente se acepta que deben individualizarse y denominarse cada una
según su nombre binomial aprobado científicamente. Esta se realiza con base en sus
difentes características bacteriológicas, organizándolas en seis grupos en los que se tiene
en cuenta: velocidad de crecimiento (rápido o lento, según sea inferior o superior a una
semana en medio sólido) y producción de pigmento en presencia o ausencia de luz
(fotocromógeno o escotocromógeno) (49). Ver tabla 3.
Tabla 3. Clasificación actual de micobacterias atípicas
CLASIFICACIÓN DE LAS MICOBACTERIAS ATÍPICAS POR RUNYON
DE CRECIMIENTO LENTO
GRUPO I FOTOCROMÓGENAS M. marinum; M. kansasii; M. simiae
GRUPO II ESCOTOCROMÓGENAS M. scrofulaceum; M. flavescens; M. szulgai
GRUPO III NO CROMÓGENAS M. avium-intracellulare; M. gastrii; M. terrae
M. triviale; M. xenopi; M. haemophilum; M. novum; M. nonchromogenicum.
GRUPO IV CRECEDORAS RÁPIDAS M. chelonae; m. Abscessus; M. fortuitum M. peregrinum; M. phlei; M. vaccae M. smegmatis; M. diernhoferi.
Grupo I Fotocromógenas
Grupo II Escotocromógenas
Grupo III No cromógenas
M. kansasii a)Pigmento rosa-rojo M. avium M. asiaticum M. lactis M. intracellulare M. intermedium . gastri
b)Pigmento amarillo naranja M. térrea
M. gordonae M. triviale M. scrofulaceum M. nonchromogenicum M. flavescens M .malmoense M. szulgai M. haemophilum c)Pigmento irregular M. shimoidei M. xenopi M. celatum M. simiae M. interjectum M. ulcerans M. branderi
GR
UP
OS
DE C
REC
IMIEN
TO LEN
TO
M. genavense (49).
Grupo IV Fotocromógenas
Grupo V Escotocromógenas
Grupo VI No cromógenas
a)Pigmento rosa-rojoM. fallax M. marinum M. engbaecki M. chelonae M. abscessus
b)Pigmento amarillo naranja M. agri
M. acapulcense M. mucogenicum M. aurum M. chitae M. duvalii M. gadium M. neoaurum M. gilvum M. abuense M. rhodesiae M. aichiense M. chubuense M. tokaiense c)Pigmento irregular
GR
UP
OS
DE C
REC
IMIEN
TO R
ÁP
IDO
M. phlei
M. vaccae M. thermoresistibile M. smegmatis
M. austroafricanum
(49).
4.6.2 EPIDEMIOLOGÍA Y TRANSMISIÓN
En Colombia como en el resto del mundo no se conoce la verdadera prevalencia de las
enfermedades por micobacterias atípicas y tan solo con la aparición de la pandemia del
Síndrome de Inmunodeficiencia Humana SIDA, se ha despertado especial interés (50).
Tal grado de desconocimiento se debe a que no son reportadas en muchos países, por la
falta de claridad en su significancia clínica o porque no existen las facilidades para hacer
su diagnóstico e identificación, o simplemente debido a que no existe interés en el campo
de la salud pública puesto que la enfermedad se presenta como no contagiosa porque no
es trasmisible de persona a persona (50,51).
Es bien sabido que la respuesta inmune mediada por células es necesaria para controlar la
infección por micobacterias, con la aparición del SIDA, la enfermedad inmunosupresora
más importante de los últimos tiempos, la cual ataca directamente la inmunidad celular, se
ha aumentado considerablemente la frecuencia y severidad de estas infecciones. Es esta
la razón por la cual se ha incrementado la aparición de brotes por diferentes especies
como los ocasionados por el complejo M. avium; M. kansasii; M. xenopi; M. scrofulaceum;
M. Fortuitum y M. gordonae. De igual forma, se han ido descubriendo nuevas especies
como lo son M. genavence y M. celatum, los cuales se han involucrado en casos de
enfermedad diseminada en pacientes VIH positivos (52).
Aunque las micobacterias atípicas siempre se han asociado a condiciones de
inmunosupresión, se han reportado casos de agresión a pacientes inmunocompetentes.
En 1966 el Dr. Álvarez, reportó el caso de una lesión cutánea producida por una
micobacteria de rápido crecimiento y en 1981 se describieron 3 casos de lesiones en tejido
blando, todos con antecedentes traumáticos y una posterior contaminación con tierra o
astillas de madera, de los cuales se logró aislar M. fortuitum (53).
En Colombia se han reportado tres microepidemias post inyección, con soluciones
contaminadas causando absceso en el sitio de la inoculación. La primera de ellas ocurrió
entre 1981 y 1982, en un grupo de individuos vacunados contra la Fiebre Amarilla entre
los cuales se pudo aislar M. chelonae subsp. abscessus (54).
Paralelamente a este brote entre 1980 y 1982 en el Laboratorio de Micobacterias del
Instituto Nacional de Salud, se diagnosticó micobacteriosis pulmonar en un paciente
imnunologicamente normal ocasionada por M. simiae (55).
La segunda microepidemia ocurrió en Medellín entre 1988 y 1989 posterior a la aplicación
de unos alergenos, pero en este caso fue imposible determinar la especie micobacteriana
causal (54).
El último de estos brotes sucedió en 1993 en 667 pacientes que recibieron múltiples
inyecciones subcutáneas de xilocaína como terapia para diferentes procesos patológicos,
de estos 297 pacientes presentaron lesiones cutáneas de cuyas secreciones se aisló M.
abscessus y se determinó que la fuente de contaminación era la xilocaína (56).
Cada vez son más frecuentes los casos reportados de abscesos en los sitios de aplicación
de inyecciones atribuidos al uso de jeringas o soluciones contaminadas con la micobacteria
(56,57). El primer informe de absceso post inyección data de 1904 en el cual se involucró
como agente causal el complejo M. fortuitum-chelonae (58).
4.6.3 MANIFESTACIONES CLÍNICAS
Ampliamente distribuidas, las micobacterias se han encontrado colonizando de forma
transitoria como flora normal en nasofaringe, mucosa bronquial e intestinal, sin embargo
en algunos casos pueden llegar a causar enfermedad (50).
Los pocos casos mortales informados, se presentaron como enfermedad diseminada
asociada con patología pulmonar, sepsis por infección de heridas quirúrgicas, endocarditis
de válvulas porcinas e inmunosupresión (59,60).
4.6.3.1. ENFERMEDAD CUTÁNEA
Es la manifestación clínica más frecuente, su presentación principal es la de abscesos
localizados en los que la lesión ocurre por acción traumática en cualquier sitio de la piel
(51).
4.6.3.2. ENFERMEDADES POSTOPERATORIAS
Se han descrito casos posteriores a esternotomía medial, mamoplastia de aumento, y
varicectomías entre otras. Los signos y síntomas que presentan estos pacientes son:
dolor, inflamación, eritema, calor y drenaje espontáneo de material purulento o
serosanguinolento y generalmente cursan sin fiebre (51).
4.6.3.3. ENFERMEDAD PULMONAR
Ocurre en pacientes inmunosuprimidos o con enfermedad pulmonar subyacente aunque
también se han informado en pacientes previamente sanos. El 85% de los casos es
producido por M. abscessus y el restante de los casos por M. chelonae (61).
4.6.3.4. ENFERMEDAD DISEMINADA
Se caracteriza por un síndrome en el que hay episodios recurrentes de abscesos de piel y
de tejidos blandos, se presenta en enfermos con alguna condición de inmunosupresión
como transplante renal, terapia con corticoides, artritis reumatoide, linfoma o leucemia
(62).
4.6.3.5. INFECCIONES MISCELÁNEAS
Aquí se incluyen patologías infecciosas como endocarditis de válvulas protésicas,
queratitis, linfadenitis cervical (51) y osteomielitis. En los casos de linfadenitis, con el
tiempo los ganglios se reblandecen y presentan drenaje espontáneo constituyendo
ESCROFULODERMAS. M. chelonae, es responsable solo de una pequeña proporción de
estas infecciones, siendo M. scrofulaceum el principal agente etiológico (63).
4.6.4 HISTOPATOLOGÍA
Entre las diferentes especies micobacterianas se ha descrito una amplia gama de patrones
histológicos que incluyen abscesos, granulomas tuberculoides y sarcoideos, granulomas
que semejan granulomas reumatoideos e inflamación crónica no específica que en
ocasiones no sugiere lesión por micobacterias (64).
En el caso de las lesiones por M. chelonae y M. abscessus, se observa respuesta
inflamatoria severa, granulomatosa nodular o difusa con granulomas mixtos compuestos
de abscesos centrales rodeados por células gigantes y epiteloides. A veces predominan
los abscesos con poca inflamación granulomatosa. La necrosis es otra característica
constante. Hay presencia de espacios claros redondeados vacuolares rodeados por
polimorfonucleares o células epiteloides que se encuentran ubicadas en el centro de los
abscesos o dentro del área granulomatosa (65).
Estas vacuolas son lipídicas provenientes de la hipodermis. La importancia de estas reside
en que en ellas es más fácil la observación de los microorganismos debido al contraste
creado por la tinción rojo intensa de los bacilos ácido-alcohol resistentes que proporciona
el colorante de Ziehl Neelsen (48).
El examen histopatológico de la enfermedad pulmonar por M. fortuitum, M. abscessus y
M. chelonae se caracteriza por la presencia de polimorfonucleares y microabscesos,
ausencia de necrosis de caseificación y a diferencia de la tuberculosis la respuesta
inflamatoria aguda persiste en asociación con los granulomas epiteloides y células
gigantes sin importar la edad de la lesión. El M. kansasii y el complejo M. avium-
intracellulare, son las dos especies que con mayor frecuencia causan enfermedad
pulmonar produciendo una enfermedad similar a la tuberculosis. Durante la fase
preclínica de la enfermedad aparece un infiltrado neutrofílico, en la segunda semana se
presenta un predominio de monocitos y macrófagos, a la sexta semana es cuando las
lesiones originan síntomas apareciendo células epiteloides y gigantes formando típicos
tuberculos con granulomas y necrosis (66).
La clave para diferenciar la enfermedad pulmonar causada por micobacterias atípicas de la
causada por el M. tuberculosis , radica básicamente en la localización de los bacilos.
Mientras en el primer grupo los bacilos se encuentran entre los microabscesos o en las
vacuolas ya mencionadas, en la tuberculosis se ubican en la zona de necrosis de
caseificación y en su periferia (66).
En las fases avanzadas de la enfermedad en pacientes inmunosuprimidos como en el caso
de los pacientes VIH positivos el M. avium-intracellulare llena en grandes conglomerados
el citoplasma de macrófagos en múltiples órganos como son: pulmón, hígado, bazo,
intestino y ganglios linfáticos (67).
4.6.5 DIAGNÓSTICO
No es fácil hacer el diagnóstico de las enfermedades causadas por micobacterias
ambiéntales, puesto que estas en su gran mayoría carecen de manifestaciones clínicas por
lo que no se les considera como posibles agentes etiológicos, a todo esto se le suma la
falta de conocimiento a cerca de su verdadero potencial patógeno, así como de sus
características bacteriológicas las que a su vez dificultan su identificación (24).
Se ha comprobado que la sensibilidad antimicrobiana presenta importantes variaciones
aún entre especies del mismo grupo (68), por lo que no basta con saber el grupo al que
pertenece la micobacteria, sino que es necesario en algunos casos una identificación
mediante métodos más complejos como lo son la hibridación del DNA entre otras (69).
Las técnicas disponibles pueden resumirse en:
Métodos bacteriológicos: se trata de métodos que permiten en la mayoría de
casos , asignar las micobacterias a un subgrupo. Entre estos se tienen en cuenta
parámetros como: la ácido-alcohol resistencia, velocidad de crecimiento, temperatura
de crecimiento, morfología de las colonias, pigmentación y fotoreactividad (70,71,72).
Métodos bioquímicos: son los métodos que tradicionalmente se han venido
empleando, entre ellos están: prueba de la niacina, prueba de la reducción de los
nitratos, prueba de la hidrólisis del Tween 80, prueba de la arilsulfatasa, prueba de la
catalasa, prueba de la resistencia a la TCH (Hidracida del ácido 2-1 Iofenocarboxílico),
crecimiento en agar MacConkey sin cristal violeta y prueba de la reducción del telurito
potásico (70,71,72).
Métodos genéticos de microbiología molecular: la principal ventaja que aportan
estos métodos es la rapidez en la identificación, ya que son técnicas para las que no se
requieren subcultivos, la mayoría de las veces pueden llevarse a cabo directamente en
el cultivo primario. Como ventaja adicional, los métodos genéticos pueden aplicase
también directamente a los cultivos en medios líquidos (BACTEC radiométrico y nuevos
medios). Las técnicas mas utilizadas son: las sondas de ácidos nucleicos;
secuenciación de ácidos nucleicos, Polimorfismo de Fragmentos de Restricción (FRP) y
técnicas de detección e identificación (70,71,72).
Cromatografía: se trata de una técnica con la que se estudia la composición de
lípidos de la pared celular de las micobacterias. Existen tres tipos de cromatografía
empleados en la identificación de las micobacterias, estas son: la cromatografía de
capa fina, la cromatografía de gases y la cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC). De ellas, la cromatografía de gases y la HPLC son las que mejores resultados
han dado (70,71,72).
4.7 ESPOROTRICOSIS
La esporotricosis es una infección crónica que se caracteriza por lesiones nodulares de los
tejidos cutáneo y subcutáneo y ganglios linfáticos adyacentes (73), aunque en pacientes
inmunocomprometidos se puede dar compromiso osteoarticular y visceral (74). Es
causada por un hongo llamado Sporothrix schenckii, el cual tiene como hábitat el material
vegetal en descomposición (20).
4.7.1 Sporothrix schenckii
Sporothrix schenckii es un hongo dimórfico térmico (75), el cual en el medio ambiente o
en el laboratorio a temperaturas entre 25 a 30ºC crece como moho e in- vivo a 37ºC se
encuentra en forma de levadura. Las levaduras miden de 4 a 6øm de diámetro y se
pueden encontrar en forma de cigarro (74).
4.7.2 TAXONOMÍA
- Reino: Fungi
- División: Deuteromycota
- Clase: Hyphomycetes
- Orden: Moniliales
- Familia: Cematiaceae
- Género: Sporothrix
- Especie: schenckii
(73,76)
4.7.3 EPIDEMIOLOGÍA Y TRANSMISIÓN
La esporotricosis se encuentra distribuida alrededor del mundo pero la mayoría de casos
son reportados en Norte y Sur América y Japón (74), encontrándose principalmente en
zonas con alta temperatura y áreas tropicales (76).
La infección por Sporothrix schenckii se encuentra ligada a ocupaciones como la jardinería,
agricultura, albañilería, personas que recolectan rosas (77), en general personas que
trabajan con materiales vegetales y suelo ya que el agente etiológico vive en tales
elementos.
En algunos casos se ha aislado el hongo de animales como moscas, hormigas y cerdas de
caballo (73), aunque los animales más comúnmente reportados causantes de transmisión
zoonótica de Sporothrix schenckii son los armadillos y los gatos (78). En los casos de
esporotricosis pulmonar el modo de transmisión es presumiblemente por inhalación de
conidios por aerosoles del suelo y la vegetación (74).
4.7.4 MANIFESTACIONES CLÍNICAS
La esporotricosis se manifiesta principalmente como una infección cutánea y subcutánea
crónica, aunque el desarrollo de la enfermedad depende del sitio de inoculación del
microorganismo y de la respuesta del huésped (73). En pacientes que presentan factores
de riesgo como alcoholismo, diabetes mellitus, enfermedad pulmonar obstructiva crónica e
infección por VIH es más vista la esporotricosis diseminada visceral, osteoarticular,
meníngea y pulmonar (74).
4.7.4.1. ESPOROTRICOSIS CUTÁNEA Y LINFOCUTANEA
La esporotricosis cutánea y linfocutánea son las manifestaciones más comunes de la
infección con S. schenckii y se dan después de la inoculación de la conidia dentro de la
piel o del tejido subcutáneo (74).
En la esporotricosis cutánea las lesiones persisten en el sitio de la inoculación y los lugares
más comunes son cara, cuello y tronco, las lesiones se presentan como úlceras, placas
verrucosas, acneiformes, infiltradas, eritematosas o a manera de parches escamosos;
eritema macular o papular, sin afección linfática local aunque son comunes las pequeñas
lesiones satelitales (79). Las lesiones pueden ser transitorias y sanar de manera
espontánea, pero generalmente retornan permaneciendo activas por años (73).
En la esporotricosis linfocutánea se da como lesión inicial un nódulo que progresa dando
paso a la aparición de lesiones nodulares a lo largo de la distribución linfática proximal a la
lesión inicial (80). No es raro que la lesión primaria se inicie en forma de pequeña ulcera
en vez de un nódulo en el sitio de la lesión. Es posible que algunas lesiones persistan
activas durante años (73).
4.7.4.2. ESPOROTRICOSIS PULMONAR
En este tipo de esporotricosis muy rara vez se ha visto que la infección primaria se
encuentre en otro sitio del cuerpo (73). Se cree que en la mayor parte de las personas se
da la infección primaria en el pulmón por la inhalación de conidios (82). Se considera que
el alcoholismo es un gran factor de riesgo para este tipo de infección (83).
La esporotricosis pulmonar se puede manifestar de dos formas, la más frecuente es la
enfermedad cavitária crónica (83) la cual inicia como neumonía o bronquitis aguda, donde
las partes apicales del pulmón parecen ser los sitios más afectados por la infección. La
enfermedad se convierte en neumonía crónica con masas nodulares y se desarrollan
cavidades de paredes delgadas con fibrosis y derrames pleurales. En ocasiones la
cavitación se vuelve masiva con necrosis caseosa (81).
La otra forma de infección pulmonar afecta en forma primaria los ganglios linfáticos
traqueobronquiales, la enfermedad de los ganglios puede persistir estacionaria durante
periodos prolongados y es frecuente la resolución espontánea (84).
4.7.4.3. ESPOROTRICOSIS OSTEOARTICULAR
La infección osteoarticular es precedida por inoculación cutánea o subcutánea o por una
diseminación por vía hematógena desde los pulmones (74).
La enfermedad ha sido descrita como una artritis destructiva (85) con lesiones osteolíticas,
tenosinovitis y periosteitis, donde se presentan muy pocos casos de lesiones de los huesos
en ausencia de enfermedad articular. Los sitios que más se ven afectados son: carpo,
metatarso, cúbito, radio, fémur y costillas (73). Casi siempre los casos de artritis
comprometen puntos periféricos como: rodillas, codo, tobillo y muñeca (76).
Comúnmente en la esporotricosis articular se presentan síntomas de dolor, hinchazón y
limitación del movimiento progresivo crónico (85).
4.7.4.4. ESPOROTRICOSIS DISEMINADA VISCERAL
La infección diseminada aunque poco común, se da a raíz de la diseminación de una lesión
linfocutánea (74). Se presenta alto riesgo de presentar una infección diseminada en
pacientes con diabetes, sarcoidosis, antecedentes de tratamiento prolongado con
cortisona (86,87), neoplasias y pacientes con SIDA donde comúnmente se presenta
diseminación a meninges y lesiones en la piel con ulceraciones atípicas con mínima
respuesta inflamatoria (74).
Puede haber afección de diferentes lugares como tejido cutáneo, muscular u óseo, hígado,
intestino, bazo, páncreas, cerebro, tiroides y miocardio. A menudo la diseminación se
acompaña de fiebre de 39ºC, anorexia, perdida de peso y rigidez de articulaciones (73).
4.7.5 HISTOPATOLOGÍA
En el material de biopsia se dificulta la observación del microorganismo ya que este se
encuentra en poca cantidad, excepto si las lesiones se han tratado con esteroides, se
pueden encontrar numerosas células de levadura (88).
Los cuadros histológicos de la esporotricosis son un conjunto de reacciones
granulomatosas, las cuales Lurie en 1963 (89) clasificó así: esporotricosicos, tuberculoides
y de cuerpo extraño. La reacción observada depende, en parte, del sitio de la lesión.
La reacción esporotricósica esta compuesta de masas de histiocitos epitelioides, los cuales
tienden a formar zonas concéntricas. El área central de la lesión consta de neutrófilos o
de material necrótico rodeado de un infiltrado de neutrófilos y algunas células plasmáticas
y linfocitos (89).
En la reacción tuberculoide a veces esta área se fusiona dentro de la zona de las células
epitelioides mezcladas con fibroblastos, linfocitos y células gigantes de langhans. En
algunos casos se puede observar cuadro histológico de un granuloma de cuerpo extraño
sin ninguna demostración de componente piógeno. Y en enfermedad diseminada, en
ocasiones se puede encontrar microabscesos sin componente histiocítico epitelioide (89).
En la esporotricosis diseminada rara vez se presenta ulceración de los nódulos cutáneos y
la dermis y epidermis que los cubre presentan poco cambio patológico. El nódulo mismo
no es diferente al granuloma de las lesiones primarias y consta de una capa externa de
células redondas y células plasmáticas, una capa interna de histiocitos y células gigantes
con un área de necrosis e infiltrado neutrófilo. La presencia de cuerpos asteroides es más
común en estas lesiones secundarias que en las primarias (89).
La biopsia de esporotricosis que puede presentar cuerpos asteroides, muestran en general
gruesas escamocostras, hiperplasia pseudoepiteliomatosa notoria, microabscesos
intraepidérmicos e intradérmicos, granulomas epitelioides centrado por microabscesos e
infiltrados dérmicos de polinucleares, plasmocitos, células gigantes aisladas o en grupos y
siderófagos. El aspecto general de la biopsia es el de una micosis en la que no se ven
levaduras ni hifas (90), el cuerpo asteroide se observa como estructura de 12 a 16 µm,
constituida por una levadura central de 3 a 6 µm de diámetro, de la cual irradian espículas
eosinofílicas en forma de estrella (90).
4.7.6 DIAGNÓSTICO
Se debe considerar la posibilidad de esporotricosis en cualquier caso en el que se
presenten erupciones polimorfas múltiples o úlceras sobre todo si no se resuelven con
tratamiento tópico usual (74).
El diagnóstico de esporotricosis se da por el hallazgo de blastoconidias del Sporothrix
schenckii en muestras como exudados, material purulento, biopsias, esputos, líquido
sinovial y LCR, por medio de coloraciones como la inmunofluorescencia directa, la técnica
de la inmunoperoxidasa o coloraciones histológicas como HE, PAS y plata-metenamina
(92).
Aunque la visualización del hongo y la reacción tisular establecen o sugieren la
esporotricosis, los cultivos son esenciales para el diagnóstico (92). Generalmente se utiliza
para cultivo primario agar Sabouraud dextrosa (74).
Las pruebas serológicas pueden ser de ayuda para el diagnóstico, aunque el definitivo se
debe realizar aislando el microorganismo del lugar de la infección (73).
4.8 HISTOPLASMOSIS
La histoplasmosis clásica es una enfermedad granulomatosa causada por Histoplasma
capsulatum var. capsulatum. La infección inicia después de la inhalación de conidios,
desarrollandose una gran variedad de manifestaciones clínicas, con un gran porcentaje de
casos asintomáticos y el resto de pacientes pueden presentar enfermedad pulmonar
progresiva crónica, enfermedad cutánea generalizada o crónica (73) y en pacientes
inmunosuprimidos se dará diseminación por vía hematógena con complicaciones letales
(76).
4.8.1 Histoplasma capsulatum
Histoplasma capsulatum es un hongo térmicamente dimórfico que con temperaturas
menores a 35 °C crece como un moho, pero a 37°C crece como una levadura. Este
microorganismo es característicamente de crecimiento lento y posee un ciclo reproductivo
sexual (93). Elabora macroconidias características, erizadas, ovales o piriformes que
miden de 8 a 11 µm de diámetro y microconidios que miden de 2 a 4 µm (94,95). Los
microconidios son inhalados de una fuente exógena y penetran a los alvéolos, donde se
convierten en pequeñas células levaduriformes, que son rápidamente fagocitadas por los
macrófagos alveolares (93).
4.8.2 TAXONOMÍA
- Reino: Fungi
- División: Ascomycota
- Clase: Ascomycetes
- Orden: Onygenales
- Familia: Onygenaceae
- Género: Histoplasma
- Especie: capsulatum
- variedad: capsulatum
(76)
4.8.3 EPIDEMIOLOGÍA Y TRANSMISIÓN
El Histoplasma capsulatum agente etiológico de la histoplasmosis se encuentra distribuido
a nivel mundial. Su desarrollo está íntimamente relacionado con la existencia de guano de
pájaros y murciélagos que provee alto contenido de nitrógeno al suelo (96,97).
Los conidios del hongo cuando están secos son fácilmente transportados por el aire,
siendo quizás este el principal agente de diseminación, aunque el hongo también puede
ser transmitido de un lugar a otro en los apéndices dérmicos de pájaros y murciélagos
(93,73).
En Colombia fueron estudiados, datos de 12 brotes de histoplasmosis, por la Corporación
para Investigaciones Biológicas y el Instituto Nacional de Salud entre 1977 y 1994. 3 de
estos brotes ocurrieron en Tolíma (Cunday y Falan), 3 en Caldas (Manizales y Belalcázar),
1 en Cundinamarca (Pedro Palo), 3 en Antioquia (Concordia, Venecia y Medellín), 1 en
Boyacá (Sogamoso) y 1 en Risaralda (99).
Todas las edades y los sexos están sometidos a la infección pulmonar primaria, pero la
distribución de acuerdo con el sexo y la forma de la enfermedad cambian conforme
aumenta la edad del paciente. En algunas personas que padecen enfermedades del grupo
del linfoma de Hodgkin, Síndrome de Inmunodeficiencia Humana (SIDA) o quienes siguen
tratamiento con esteroides y otros agentes inmunosupresores, se presenta infección
oportunista rápidamente progresiva (73).
4.8.4 MANIFESTACIONES CLÍNICAS
Las manifestaciones clínicas de la histoplasmosis están relacionadas con el tamaño del
inóculo y con factores del hospedero, tales como una adecuada respuesta inmune,
exposición previa y presencia de enfermedad pulmonar crónica. Aproximadamente el
90% de los individuos expuestos desarrollan una infección pulmonar asintomática
autolimitada (92). En el otro porcentaje el episodio pulmonar inicial puede ser agudo o
crónico, o puede haber diseminación por vía hematógena o linfática desde los pulmones
hacia otros órganos (93).
4.8.4.1. HISTOPLASMOSIS PULMONAR AGUDA
Los pacientes con histoplasmosis pulmonar aguda presentan síntomas que varían desde
una enfermedad leve que cura espontáneamente, hasta un tipo moderado o severo de
enfermedad. En huéspedes sanos, el grado de compromiso y sintomatología es
aproximadamente proporcional al tamaño del inóculo inhalado. En el individuo
previamente sensibilizado, la exposición a reinfección da como resultado una infección
más corta y leve (93).
Los síntomas que usualmente se presentan son: fiebre, malestar, debilidad, dolor
subesternal o pleurítico, dolor de cabeza, tos, mialgia, escalofrío, nauseas, anorexia y
perdida de peso (99,100).
La curación de la histoplasmosis pulmonar aguda puede ser completa o con fibrosis, pero
típicamente se produce calcif icación. Estas calcificaciones son regulares, con halos y
pueden encontrarse en el hígado, bazo y pulmones (93).
4.8.4.2. HISTOPLASMOSIS PULMONAR CRÓNICA
Esta forma se considera una complicación oportunista de una enfermedad pulmonar
obstructiva crónica subyacente con enfisema y espacios pulmonares anormales. Puede
desarrollarse inmediatamente después de la inhalación primaria o luego de años de
aquiescencia aparente (93).
La enfermedad temprana es manifestada como una neumonitis intersticial, disparada
posiblemente por la reacción inmunológica (101) y la infección tardía se caracteriza por
infección persistente en espacios de aire, con progreso o recaída sin terapia (94).
Dentro de los factores predisponentes se incluye una enfermedad pulmonar obstructiva
crónica subyacente, ser de raza blanca y de sexo masculino y en el caso de que no se
presente la enfermedad obstructiva crónica, la inmunosupresión también predispone a
histoplasmosis cavitaria (102).
Los síntomas clínicos son muy parecidos a los de la tuberculosis. Comúnmente incluyen
tos, perdida de peso, fiebre, disnea, dolor de pecho, hemoptisis, dolor de rodillas, fatiga y
sudoración (103).
4.8.4.3. HISTOPLASMOSIS DISEMINADA
Las células levaduriformes del microorganismo, probablemente se diseminan por el cuerpo
mientras están dentro de macrófagos. Los sitios más comunes de compromiso después
de los pulmones, son los tejidos reticuloendoteliales de bazo, hígado, ganglios linfáticos y
médula ósea. Sin embargo, se han documentado lesiones en casi todos los órganos (93).
La histoplasmosis diseminada puede ser aguda o progresiva. En estos casos los síntomas
pulmonares son insignificantes, y los pacientes pueden presentar hepatoesplenomegalia,
perdida de peso, anemia y leucopenia. Pueden observarse lesiones granulomatosas y
macrófagos cargados con células levaduriformes en hígado, bazo, médula y con bastante
frecuencia en glándulas adrenales (93).
Esta forma de histoplasmosis es una enfermedad oportunista asociada con compromiso de
la inmunidad mediada por células como en pacientes con SIDA que reciben drogas
inmunosupresoras y aquellos con neoplasia linfomatosa subyacente (93).
4.8.4.4. HISTOPLASMOSIS CUTÁNEA PRIMARIA
Se desarrolla después de la inoculación primaria en la piel o tejido mucocutáneo. En estos
casos no hay compromiso pulmonar porque los microorganismos típicamente se
introducen luego de contaminación de una herida traumática. Tales infecciones pueden
estar anatómicamente localizadas, como en algunos casos oculares o pueden progresar
crónicamente con compromiso a lo largo de los linfáticos de drenaje (93).
4.8.5 HISTOPATOLOGÍA
El cuadro histológico de las lesiones depende de lo reciente de la infección y de la
gravedad y forma de la enfermedad. En la forma aguda, solo se observan numerosas
células de levadura dentro de los histiocitos. Los neutrófilos, las células plasmáticas y los
linfocitos, no son tan abundantes y no contienen células de levadura (73).
Las levaduras que están en los histiocitos son de tamaño uniforme y son visibles con el
método de Gram, Giemsa, Wright o Hematoxilina-Eosina (73).
En las formas menos fulminantes de la enfermedad se forman granulomas epitelioides que
contienen células plasmáticas, linfocitos, macrófagos, neutrófilos y células gigantes. Los
microorganismos se observan en cualquiera de las células fagocíticas, pero en menor
número que en la forma fulminante (73).
4.8.6 DIAGNÓSTICO
La histoplasmosis puede diagnosticarse por hallazgo de células levaduriformes en material
clínico. Las muestras que se pueden utilizar son: esputos, lavado broncoalveolar, médula
ósea, sangre, biopsias, exudados de lesiones mucosas y cutáneas, material de ganglios
linfáticos, LCR y líquidos corporales (92).
Para la visualización de las levaduras se utilizan coloraciones como: Giemsa, Wright o Diff-
Quick para extendidos y HE, PAS y plata metenamina para cortes histológicos. En este
examen microscópico de los extendidos, se observan blastoconidias ovaladas de 2-3µm,
intracelulares, generalmente con una sola gema; por efectos de la coloración ocurre una
retracción de citoplasma (92).
En los cortes histológicos la pared del hongo se tiñe débilmente con la HE pero se destaca
con el PAS, Gram y plata-metenamina. Con HE se puede apreciar la respuesta
inflamatoria del hospedero, en el individuo inmunocomprometido tal respuesta es mínima
y el hongo se reproduce en forma abundante en el interior de los macrófagos. En los
individuos inmunocompetentes, el hongo evoca una reacción granulomatosa, con
predominio de células epitelioides y gigantes, en cuyo interior se encuentra el hongo (92).
Para realizar el cultivo de las muestras, las no estériles deben cultivarse en un medio
enriquecido con sangre y en agar Sabouraud con antibióticos e incubarse durante por lo
menos 4 semanas a 25°C (93).
Se pueden detectar anticuerpos específicos para antígenos de histoplasma por medio de
pruebas serológicas. Actualmente se han aceptado ampliamente dos pruebas serológicas:
la medición de los anticuerpos fijadores de complemento y la prueba de inmunodifusión
(93).
4.9 LEISHMANIOSIS
La leishmaniosis es una zoonosis que puede afectar piel, mucosa o vísceras y cuyo agente
causal es un protozoo flagelado del género Leishmania . La infección ocurre luego de ser
introducido este al huésped mediante la picadura de un insecto flebotomíneo (104).
Las diferentes especies de Leishmania presentan un rango de características clínicas y
epidemiológicas que solo por razones de conveniencia se combinan bajo 3 agrupamientos
clínicos: 1) leishmaniosis visceral 2) leishmaniosis cutánea y 3) leishmaniosis mucocutánea
o nasobucal. Sin embargo, algunas especies pueden inducir varios síndromes patológicos
(por ejemplo leishmaniosis visceral por uno de los agentes de la leishmaniosis cutánea o
leishmaniosis cutánea por el agente de leishmaniosis visceral) (2).
4.9.1 Leishmania
Las características morfológicas de los protozoos del género Leishmania corresponden a
dos formas parasitarias que adoptan según su ciclo de vida: amastigotes y promastigotes.
Los amastigotes son parásitos ovalados o redondeados que miden de 2 a 5 µm de
longitud, no poseen flagelo y se localizan dentro de los macrófagos de los huéspedes
vertebrados. Al ser sometidos a procesos de coloración se observa un citoplasma azul
claro y un núcleo de color rojo con cariosoma central. A un lado se encuentra una
estructura en forma de barra que se denomina cinetoplasto, la cual se tiñe intensamente
de violeta oscuro (105).
Los promastigotes se encuentran en el huésped invertebrado y son la forma que se
inocula al vertebrado. Son parásitos alargados que miden entre 10 y 15 µm de longitud.
Mediante la coloración se observa que tienen un núcleo en la parte media del cuerpo.
Cerca del extremo anterior del parásito está el cinetoplasto, que puede ser terminal o
subterminal, y de donde sale un flagelo que le confiere movimiento. Este flagelo tiene
casi el mismo tamaño del cuerpo. Todos los protozoos del género Leishmania poseen un
ciclo de vida similar, que incluye insectos de la familia Phlebotominae. Los vectores
principales pertenecen a los géneros Phlebotomus y Lutzomyia (105).
4.9.2 TAXONOMÍA
- Reino: Protista
- Subreino: Protozoo
- Phylum: Sarcomastigophora
- Subphylum: Mastigophora
- Clase: Zoomastigophora
- Orden: Kinetoplastida
- Familia: Trypanosomatidae
- Género: Leishmania
Subgénero:.Leishmania
Complejo: L. donovani - Especie: L. chagasi
L. tropica
L. major
L. aethiopica
L. mexicana - Especies: L. venezuelensis
L. mexicana
L. amazonensis
Subgénero: Viannia
Complejo: L. braziliensis - Especies: L. braziliensis
L.peruviana
L. guyanensis - Especies: L. guyanensis
L. panamensis
L.colombiensis
(Tomado del Comité de expertos de la OMS. Lucha contra la leishmaniosis. Ginebra:
OMS;1990. Serie de informes técnicos Nº 793).
4.9.3 EPIDEMIOLOGÍA Y TRANSMISIÓN
La incidencia y prevalencia de la leishmaniosis no es realmente conocida porque se
presentan muchos casos que no son bien diagnosticados o que no son reportados
sobretodo en áreas donde la infección es endémica. En 1993 La Organización Mundial de
la Salud, estimó que aproximadamente 350 millones de personas en el mundo están en
riesgo de infección (106).
Esta zoonosis de amplia distribución mundial representa un problema de salud pública en
muchos países del tercer mundo. En Colombia la enfermedad es endémica y se encuentra
en el 91% de todo el territorio ubicado bajo los 1.750 metros sobre el nivel del mar.
Durante 1995, se registraron casos de la enfermedad en el 45% de los municipios del
país. La leishmaniosis es una dolencia crónica, lo que hace difícil distinguir los casos
nuevos, por lo tanto, los datos aportados por el Ministerio de Salud se presentan en
proporciones de prevalencia, con la población rural de los municipios endémicos como
denominador. Durante el periodo de 1985 a 1996, se informó de 55.888 casos de
leishmaniosis, entre los que predominó la forma cutánea (95%). Se registraron
prevalencias que oscilaron entre 18.03 y 57.36, con una media de 61.1 por 100.000
habitantes (107).
Tabla 4. Síndromes clínicos causados por leishmania y su distribución geográfica (108).
SINDROMES CLINICOS ESPECIES DE LEISHMANIA LOCALIZACIÓN
- Leishmaniosis visceral Kala-azar :compromizo generalizado del Sistema retículoendotelial (médula ósea, bazo e hígado).
L. (L.) donovani L. (L.) infantum
India, norte y este de la China, Pakistán y Nepal. Mediterraneo Medio Oriente, centro y sur de Asia, norte y noreste de China y norte de África.
L. (L.) donovani (archibaldi) Sudan, Kenya y Etiopía
L. (L.) species Kenya, Etiopía y Somalia
L. (L.) chagasi América Latina
L. (L.) amazonensis Brasil (Estado de Bahía)
L. (L.) tropica Israel, India y enfermedad con viscerotropismo en Arabia Saudita (grupo U.S.)
- Leishmaniosis dérmica Post- Kala-azar. L. (L.) donovani L. (L.) species
India Kenya, Etiopía y Somalia
- Leishmaniosis cutánea del Viejo Mundo con un limitado número de lesiones en piel. L. (L.) major
Oriente Medio, noroeste de China, noreste de la India, Pakistán y África
L. (L.) tropica Litoral Mediterráneo, Oriente Medio, área occidental de Asia y la India.
L. (L.) etiópica Terrenos montañosos de Etiopía, Kenya y Yemen
L. (L.) infantum Cuenca Mediterránea.
L. (L.) donovani (archibaldi) Sudan y este de África
L. (L.) species Kenya, Etiopía y Somalia
- Leishmaniosis cutánea difusa - Leishmaniosis cutánea del Nuevo Mundo con limitado número de lesiones en piel.
L. (L.) etiópica L. (L.) mexicana (ulcera del chiclero)
Terrenos montañosos de Etiopía, Kenya y Yemen América central, México y Texas
L. (L.) amazonensis Cuenca Amazónica, áreas vecinas, Bahía y otros estados en Brasil. Zona amazónica
L. (V.) braziliensis Múltiples áreas de centro y sur América.
L. (V.) guyanensis (bosques) Guyana, Surinam y Norte de la cuenca Amazónica
L. (V.) peruviana (uta) Perú (este de los Andes), Montañas de Argentina
L. (V.) pifanoi Venezuela
L. (V.) garnhami Venezuela
L. (V.) venezuelensis Venezuela
- Leishmaniosis visceral del Nuevo Mundo L. (L.) chagasi Centro y sur América
- Leishmaniosis cutánea difusa L. (L.) amazonensis Cuenca Amazónica, áreas vecinas, Bahía y otros estados en Brasil.
L. (V.) pifanoi Venezuela
L. (L.) mexicana México y América central
L. (L.) species República Dominicana
- Leishmaniosis mucocutánea L. (V.) braziliensis (espundia)Múltiples áreas de América Latina.
L. (L.) species República Dominicana
L. (V) panamensis Múltiples áreas de América Latina
4.9.4 MANIFESTACIONES CLÍNICAS
La leishmaniosis tegumentaria americana se presenta a cualquier edad, con notorio
pleomorfismo. La úlcera franca, única o múltiple, de borde elevado, firme, infiltrado y
fondo granulomatoso y limpio, es la variante más frecuente, la más conocida y la de
diagnóstico clínico más preciso. Existen formas ulcerocostrosas, nodulares, en placa,
verrucosas, papulosas (109), y linfangíticas (110). Se localizan en cualquier área cutánea,
menos en el cuero cabelludo. La lesión mutilante, costrosa y ulcerada del pabellón
auricular o “úlcera de los chicleros”, es clásica por su cronicidad, por su resistencia al
tratamiento y por su falta de curación espontánea, lo que comparte con otras formas de
leishmaniosis como la difusa (109), la mucocutánea y la visceral (111).
La leishmaniosis mucocutánea afecta la nariz y la orofaringe principalmente. En más del
90% de los casos se presenta una lesión cutánea luego de meses o años de curar
espontáneamente o por tratamiento inadecuado, pero excepcionalmente las dos pueden
ser concomitantes. También puede presentarse la lesión mucosa por extensión de una
lesión cutánea contigua. Comienza con sensación de prurito y obstrucción nasal, con
secreción mucosanguinolenta o epistaxis, seguida de ulceración y perforación de tabique
que progresa paulatinamente sin curación espontánea, extendiéndose a la rinofaringe, el
paladar, el labio superior, y aún en la traquea y los bronquios, en los casos terminales y
anérgicos. Puede originar complicaciones como bronconeumonías, disfagia, disfonía,
meningitis y caquexia, que llevan al paciente a la muerte (112).
4.9.5 HISTOPATOLOGÍA
En la leishmaniosis tegumentaria americana, la lesión correspondiente a la entrada del
parásito se inicia con una reacción inflamatoria en el tejido conectivo que forma una
pápula y al desarrollarse la inmunidad se produce necrosis en la dermis y ulceración. El
infiltrado existente esta compuesto por plasmocitos, linfocitos y células gigantes, en las
lesiones antiguas. Ciertos pacientes forman un granuloma con infiltrado tuberculoide hay
fibrosis y existen pocos parásitos o no se encuentran, por lo cual suele informarse como
granuloma inespecífico. La mayoría de las lesiones se encuentran en la piel y ocupan el
corion incluyendo las papilas, existe atrofia cutánea y desaparición de la epidermis (113).
La invasión mucocutánea además de las lesiones ulcerativas, puede presentar cordones
epiteliales que entran profundamente en la dermis, la mucosa muestra reacción infiltrativa
y ulcerativa. En las formas anérgicas o difusas no hay necrosis ni granulomas y los
parásitos se multiplican en gran cantidad dentro de los histiocitos o macrófagos (113).
En la Leishmaniosis cutánea del Viejo Mundo, al comienzo de la infección se observan los
amastigotes dentro de los histiocitos de la epidermis. La lesión se ulcera progresivamente
y se forma una reacción inflamatoria o granulomatosa, similar a la descrita en la
leishmaniosis tegumentaria americana. Hay hipertrofia de la capa córnea con hiperplasia
de las papilas. La infiltración esta formada por macrófagos, células plasmáticas y linfoides
(105).
4.9.6 DIAGNÓSTICO
El diagnóstico clínico se comprueba mediante el hallazgo de los parásitos en los
extendidos de linfa del borde activo de las úlceras y su posterior aislamiento en medio de
cultivo, por la inoculación de la muestra en el hocico y almohadillas plantares de un
hámster o mediante la demostración de los amastigotes en la biopsia de tejido. En el
Laboratorio de Patología del Instituto Nacional de Salud, se logran revelar los parásitos
hasta en un 55% de los casos (104).
Clínicamente la leishmaniosis se puede presentar en varias formas y es necesario
establecer diagnóstico diferencial con otras enfermedades, aunque existen úlceras
características que desde la primera inspección se sospecha con certeza el diagnóstico,
especialmente cuando el paciente procede de un foco activo, pero cuando aún no se ha
formado la úlcera se puede confundir con una pápula por picadura de insectos, nódulos de
una enfermedad de Hansen, granuloma por cuerpo extraño, sarcoidosis, y psoriasis entre
otras (105).
Si la úlcera ya esta formada, es necesario diferenciarla de otro tipo de úlceras como las
piógenas, especialmente las de evolución crónica, úlceras traumáticas, pioderma
gangrenoso, úlcera vascular, esporotricosis tanto en su forma fija como en la linfagítica,
pian, lepra, tuberculosis cutánea principalmente por micobacterias atípicas, cromomicosis,
histoplasmosis, lobomicosis, tumores de piel como carcinoma espinocelular, etc (105).
Cuando existe compromiso de mucosa o lesiones mucocutáneas, es importante el
diagnóstico diferencial con paracoccidiomicosis, histoplasmosis, rinoescleroderma, úlceras
traumáticas, granuloma letal de la línea media, granulomatosis de Wegener, úlcera de la
anemia falciforme, tuberculosis, lepra, sífilis, esporotricosis, perforación del tabique nasal
por alguna de las anteriores entidades o secundaria al uso de vasoconstrictores, trauma,
aspiración de cocaína, etc (105).
Para confirmar la leishmaniosis es indispensable identificar el parásito por cualquiera de
los siguientes métodos:
Examen directo: con este es posible obtener una buena muestra de aspecto granular
con células de tejido y muy poca sangre y en donde la coloración muestra los
amastigotes intra o extracelulares. Esta prueba tiene una especificidad del 100%, pero
la sensibilidad es variable de acuerdo al tipo de muestra (105).
Biopsia: es el procedimiento más útil cuando se atienden pacientes en áreas rurales,
suburbanas o selváticas, porque es fácil de realizar, no es costoso y porque aclara el
diagnóstico diferencial. Se logra demostrar los amastigotes en 70 – 80% de las
biopsias de leishmaniosis, dentro de macrófagos univacuolados a los que han
denominado “macrófagos leishmaniásicos”. La vacuola es un fagolisosoma, a cuya
membrana se adhiere el amastigote de una manera característica, que se puede
demostrar perfectamente por microscopia electrónica. Además las biopsias, exhiben
grados diversos de hiperplasia seudoepiteliomatosa con epidermis muy clara y un
infiltrado dérmico e hipodérmico, masivo, difuso, con granulomas constituidos por
macrófagos vacuolados o por células epitelioides y gigantes, que en general es poco
organizado y que varía con el germen productor, el tiempo de evolución de las lesiones
y la respuesta inmune del huésped (104).
Cultivo: el medio más utilizado es el Novy – MacNeal – Nicolle, conocido como medio
NNN. La incubación se hace entre 20ºC y 30ºC, transcurridos ocho días se revisan los
cultivos buscando la presencia de amastigotes en la fase líquida, que con frecuencia
están aglomerados y entrelazados por los flagelos, formando unas rosetas
características (105). Sin embargo, se debe tener en cuenta que hay cepas que
proliferan con mayor dificultad como es el caso de L. braziliensis (114).
Intradermorreacción de Montenegro: esta corresponde a una reacción de
hipersensibilidad tardía, mediante la aplicación de un antígeno compuesto por una
suspensión de promastigotes procedentes de cultivo. La lectura se realiza entre 48 y
72 horas posteriores a la aplicación y se reporta como positiva si se palpa un nódulo
inflamatorio de 5mm o más (105).
Métodos serológicos: para esta se han utilizado técnicas como ELISA, IFI, DAT y
RIA entre otras (105).
Métodos de Biología Molecular: entre los que más se han empleado esta la prueba
de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (105).
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 TIPO DE ESTUDIO
El estudio realizado fue de tipo descriptivo puesto que involucró la estandarización y
evaluación de la funcionalidad de una técnica que no había sido empleada anteriormente
en el Laboratorio de Patología del Instituto Nacional de Salud (INS).
5.2 MUESTRAS
Para el estudio se utilizaron 48 biopsias de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina.
Los casos se seleccionaron según el diagnóstico emitido por el Laboratorio de Patología
del INS, teniendo en cuenta únicamente las siguientes patologías: tuberculosis (7 casos),
lepra (8 casos), lesiones por micobacterias atípicas (12 casos), esporotricosis (9 casos),
histoplasmosis (6 casos) y leishmaniosis (6 casos).
5.2.1. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
Las biopsias de tejido que llegan al Laboratorio de Patología del INS, se encuentran fijadas
en formol tamponado al 10%, lo que asegura su preservación evitando la autolísis celular
(6), posteriormente son tratadas en el procesador automático de tejidos Histokinette
LEICA (TP-1010), en el cual pasan por: etanol al 100% (7 pases), xilol al 100% (2 pases)
y parafina (2 pases).
La inclusión en bloques de parafina ultra pura (MERCK Ref. 107164) se lleva a cabo en el
Histoembedder LEICA (D-6907 Nussloch), de los cuales se obtienen cortes de 3 a 5 µm en
un micrótomo de rotación LEICA, los cortes se extienden en láminas previamente tratadas
con Poly-L-lisina que proporciona una mayor adhesión del tejido (6).
5.3 CONTROLES
Como controles de la técnica se utilizaron casos en los que la tinción con Ziehl-Neelsen
demostrara presencia de abundantes bacilos ácido-alcohol resistentes y en la tinción con
Hematoxilina-Eosina se observara una evidente lesión del tejido, por esta razón, se
emplearon muestras con diagnóstico de tuberculosis miliar y lepra lepromatosa. Estos se
trabajaron tanto como controles positivos como negativos en cada montaje de la técnica.
De igual forma, se utilizó como control para cada caso una muestra del mismo sin adición
del anticuerpo primario (control negativo).
5.4 ESTANDARIZACIÓN
Para la estandarización de la técnica inmunohistoquímica con anticuerpo anti-BCG
elaborado en conejo (DAKO cod.B 0124), se utilizaron biopsias de tejido con diagnóstico
de tuberculosis miliar y lepra lepromatosa, ya que en estas por medio de la tinción de
Ziehl-Neelsen se observan abundantes bacilos ácido-alcohol resistentes.
En el laboratorio de Patología del INS, las técnicas inmunohistoquímicas se encuentran con
tiempos y concentraciones estandarizadas, las cuales fue necesario modificar para obtener
un resultado óptimo al emplear el anticuerpo anti-BCG.
Las modificaciones que se realizaron fueron:
Los pases consecutivos en buffer citrato (de 1 a 3) a 99 ºC en horno microondas,
dejando las láminas 20 minutos en buffer caliente y 20 minutos en buffer a
temperatura ambiente.
El tiempo de incubación del suero normal se duplicó, quedando este en una hora en
cámara húmeda.
El tiempo de incubación del anticuerpo anti-conejo biotilinado se triplicó, quedando en
tres horas en cámara húmeda.
El tiempo de incubación del complejo ABC se duplicó, quedando en dos horas en
cámara húmeda
Para buscar la concentración óptima del anticuerpo policlonal anti-BCG fue necesario
ensayar diluciones seriadas y variaciones de tiempo a diferentes temperaturas.
5.5 TÉCNICA INMUNOHISTOQUÍMICA CON ANTI-BCG
5.5.1 DESPARAFINIZACIÓN Y DESHIDRATACIÓN
Una vez secos los cortes de tejido, se sometieron a desparafinización dejándolos
aproximadamente 12 horas en un horno a 60 ºC, una vez transcurrido este tiempo se
deshidrataron pasándolos por 3 xiloles al 100% y 5 alcoholes (2 al 100%, 2 al 95% y 1 al
70%), para luego ser lavados con agua a chorro.
5.5.2 DIGESTIÓN ENZIMÁTICA
El tratamiento con enzimas como la tripsina (ICN cod. 19626) o proteasa (SIGMA P5380),
ayuda al desenmascaramiento del antígeno. Para esto, se diluyó la enzima en PBS
precalentado a 37 ºC, en esta solución se dejaron las láminas por un periódo de 30 min en
horno a 37 ºC, luego se lavaron tres veces con PBS.
5.5.3 BLOQUEO ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ENDÓGENA
El utilizar peroxido de hidrógeno (MERCK 7210) disuelto en metanol (EM MX 0485-7),
permite inhibir la actividad de la peroxidasa endógena presente en algunas células del
tejido evitando así los falsos positivos. Se utilizaron 3 ml de H2O2 en 100 ml de metanol y
se sumergieron las láminas durante 40 minutos a temperatura ambiente, posteriormente
se lavaron 3 veces con PBS.
5.5.4 DESENMASCARAMIENTO DE ANTÍGENO
Se utilizó buffer citrato con varios cambios de temperatura así: se sumergieron las láminas
en el buffer y se pusieron en el microondas hasta alcanzar una temperatura aproximada
de 99 ºC, se repitió el procedimiento de 1 a 3 veces dependiendo de la resistencia que
presentó cada tejido, se dejaron en el buffer caliente por 20 min y luego se cambió por
buffer a temperatura ambiente en el que se dejaron las láminas por otros 20 minutos.
5.5.5 BLOQUEO DE REACCION CRUZADA
El empleo de un suero normal elaborado en caballo, bloquea y evita las posibles
reacciones cruzadas que se puedan presentar. Con este suero se hizo una dilución 1:20
en buffer citrato y se cubrieron los tejidos dejándolos en incubación por 1 hora en cámara
húmeda.
5.5.6 ANTICUERPO ANTI-BCG
El anticuerpo anti-BCG elaborado en conejo, se empleó en dilución 1:300 en buffer citrato,
una vez cubiertos los tejidos con este se dejaron en incubación por 12 horas en cámara
húmeda a 4 ºC.
5.5.7 ANTICUERPO ANTI-CONEJO BIOTINILADO
El anticuerpo (VECTOR BA-1000) va dirigido contra la región Fc del anti-BCG y va marcado
con biotina la cual va a permitir la unión de la enzima. Este anticuerpo se utilizó en una
dilución 1:200 en buffer citrato, el cual se dejó incubando en cámara húmeda por 3 horas.
5.5.8 COMPLEJO AVIDINA–BIOTINA (ABC)
El ABC (VECTOR LAB), se diluyó con PBS y se adicionó a los tejidos, dejandolo en
incubación por un periodo de 3 horas en cámara húmeda.
5.5.9 REVELADO
Para el revelado se utilizó una solución cromógena de diaminobenzidina (SIGMA 3´3 –
Diaminobenzidine Tablets), esta se disolvió en 10 ml de PBS adicionándole 12 µl de
peróxido de hidrógeno. Una vez disuelta la tableta, se agregó a los tejidos por un periodo
de 1 a 2 minutos, cuando se obtuvo el tono café deseado se lavaron las láminas con agua
a chorro.
5.5.10COLORACIÓN DE CONTRASTE
En este caso se utilizó como colorante de contraste la hematoxilina, la cual permite
observar núcleos y citoplasmas celulares. Se sumergieron las láminas por 5 minutos y
luego se lavaron con agua a chorro, posteriormente se introdujeron en una solución de
agua amoniacal por unos segundos y se lavaron nuevamente.
5.5.11REHIDRATACIÓN
Los tejidos se rehidratan para poder observar su estructura original, se pasaron las
láminas por 5 alcoholes de diferentes concentraciones (1 al 70%; 2 al 95% y 2 al 100%) y
por 3 xiloles al 100%, finalmente se cubrió el tejido con una laminilla adherida con
citorrecina. Los tejidos se observaron al microscopio óptico de luz en diferentes aumentos.
6. RESULTADOS
6.1 ESTANDARIZACIÓN
Para la estandarización de la técnica se utilizaron casos de tuberculosis miliar y lepra
lepromatosa, puesto que en estas dos entidades se encuentran grandes acumulos de
bacilos ácido-alcohol resistentes. Para la titulación del anticuerpo primario (anti-BCG) se
utilizaron diluciones seriadas hasta observar que en la dilución 1:300, la tinción de fondo
era aceptable o mínima y el antígeno se teñía intensamente, con un período de incubación
de 12 horas a 4 ºC en cámara húmeda. De igual manera se utilizó buffer citrato a alta
temperatura (99ºC), para lograr una mejor exposición de los diferentes determinantes
antigénicos, asegurando que la integridad del tejido fuera alterada lo menos posible
(Figura 2,3,4,5).
6.2 TÉCNICA INMUNOHISTOQUÍMICA CON ANTI-BCG
Un total de 52 muestras de tejidos, fijados en formol e incluidos en parafina fueron
procesados con la técnica inmunohistoquímica (IHQ) con el anticuerpo policlonal anti-BCG.
Se utilizaron casos con diagnóstico de tuberculosis, lepra, lesión por micobacterias
atípicas, esporotricosis, histoplasmosis y leishmaniosis, emitido por el Laboratorio de
Patología del INS y confirmado mediante métodos de tinción convencional como
Hematoxilina-Eosina (HE) y Ziehl Neelsen (ZN) y algunas técnicas especiales como IHQ
con anticuerpo anti-Sporothrix schenckii. (Los resultados se encuentran resumidos en la
tabla 5).
En los casos positivos de tuberculosis, lepra, lesión por micobacterias atípicas,
esporotricosis, histoplasmosis y leishmaniosis se observó marcación persistente del
antígeno en los macrófagos, a su vez, estos se analizaron paralelamente con su propio
control negativo, al cual no se le agregó anticuerpo primario (anti-BGC).
Con la tinción de Ziehl-Neelsen no se evidenció la presencia de bacilos ácido-alcohol
resistentes en las biopsias de lesiones por micobacteria atípicas, sin embargo, se pudo
establecer la presencia de antígeno localizado en los macrófagos mediante la técnica con
anti-BCG (Figura 6,7).
En las lepras post tratamiento se observó antígeno positivo, sin embargo en los nervios no
se vio tinción alguna (Figura 8,9)
En los casos de esporotricosis e histoplasmosis, no sólo se presentó marcación del
antígeno digerido por células, si no que también se vió con claridad la levadura del hongo
causante de la enfermedad (Figura 10,11,12,13).
Las biopsias de leishmaniosis cutánea humana y las leishmaniosis experimentales
procedentes de almohadilla plantar de hámster, mostraron marcación positiva del antígeno
en células fagocíticas. En ninguno de estos casos se presentó marcación de los
amastigotes (Figura 14,15).
Tabla 5. Resultados de técnica inmunohistoquímica con anti-BCG.
DIAGNÓSTICO
CASOS
CASOS POSITIVOS
CON ANTI-BCG
CASOS NEGATIVOS
CON ANTI-BCG
Micobacterias atípicas 12 12
Tuberculosis
TBC miliar 1 1
TBC ganglionar 2 2
Granuloma tuberculoide 3 2 1
Esclofuroderma 1 1
Lepra
Lepra lepromatosa 4 4
Lepra post-tratamiento 4 4
Esporotricosis 9 9
Histoplasmosis 6 6
Leishmaniosis 6 6
TOTAL DE CASOS POSITIVOS 47
TOTAL DE CASOS NEGATIVOS 1
TOTAL DE CASOS 48
Figura 2. Piel leproma. Coloración de Ziehl Neelsen. Se observan bacilos y globias fagocitados dentro de los macrófagos. 800x.
Figura 3. Piel leproma (Control). En el mismo espécimen de Figura 2, la técnica inmunohistoquímica con anti-BCG demuestra la tinción difusa del antígeno micobacteriano contenido dentro de los macrófagos, sin delimitación de los bacilos. Técnica IHQ método ABC. 400x.
Figura 4. Tuberculosis miliar pulmón. Coloración de ZN. Se ven bacilos ácido-alcohol resistentes fagocitados dentro de los macrófagos. 400x.
Figura 5. Tuberculosis miliar pulmón (Control). El mismo espécimen de Figura 4 teñido con IHQ contra BCG. Se demuestra una mayor cantidad de antígeno micobacteriano dentro de los macrófagos de la lesión. Técnica IHQ método ABC. 800x.
Figura 6. Granuloma cutáneo por una micobacteria atípica (M. abscessus) aislado en cultivo de la lesión. Coloración de ZN. Se observan macrófagos vacuolados, neutrófilos y plasmocitos pero no se demuestra el agente causal. 800x.
Figura 7. IHQ con anti-BCG en corte de la misma lesión de la Figura 6. Muestra amplio contenido de antígeno micobacteriano dentro de los macrófagos del granuloma cutáneo. Técnica IHQ método ABC. 800x.
Figura 8. Lepra lepromatosa curada y tratada. La coloración de Hematoxilina Eosina (H&E) demuestra macrófagos espumosos como signos residuales en un leproma cutáneo.800x.
Figura 9. Lepra lepromatosa tratada y curada. La IHQ para BCG demuestra persistencia de antígeno micobacteriano dentro de estos macrófagos. Estos antígenos pueden explicar la aparición de reacciones lepróticas post-tratamiento. Técnica IHQ método ABC. 800x.
Figura 10. Lesión cutánea de esporotricosis. Tinción con IHQ con anticuerpo policlonal anti- Sporothrix schenckii. Numerosos macrófagos dan reacción positiva para este antígeno. Técnica IHQ método ABC. 400x.
Figura 11. IHQ con anti-BCG en el mismo caso de la Figura 10. Menor número de macrófagos tiene reacción antigénica positiva pero se ve con más claridad la presencia de levaduras de S. schenckii. Técnica IHQ método ABC. 1000x.
Figura 12. IHQ con anti-BCG. Caso de esporotricosis donde se observa levadura gemante del hongo. Téncnica IHQ método ABC. 2000x.
Figura 13. Histoplasmosis cutánea en paciente con SIDA. La levadura del hongo se tiñe bien con la IHQ con anti-BCG. Técnica IHQ método ABC. 400x, 800x.
Figura 14. Leishmaniosis experimental en almohadilla plantar de hámster por L. panamensis. La IHQ con BCG muestra que algunos macrófagos dan reacción positiva difusa en su citoplasma y los amastigotes no dan reacción alguna. Esto podría indicar que la reacción se da solo en amastigotes desintegrados en el citoplasma de macrófagos. 800x.
Figura 15. Leishmania cutánea en hombre. Numerosos macrófagos dan reacción positiva difusa en su citoplasma. Técnica IHQ método ABC. 800x.
Figura 16. Lesión cutánea de cuello en niña. Escrofuloderma. La tinción con IHQ con anti-BCG muestra numerosos macrófagos y célula gigante con tinción granular difusa. Técnica IHQ método ABC. 400x, 800x.
7. DISCUSIÓN
Las técnicas inmunohistoquímicas (IHQ) son cada vez más empleadas en el diagnóstico e
investigación de enfermedades de origen infeccioso. Es por esta razón, que se quiso
ensayar la técnica con el anticuerpo anti-BCG (anticuerpo primario), que ya ha sido útil en
otros estudios (4,17).
El anticuerpo anti-BCG es un anticuerpo policlonal elaborado en conejo (DAKO cod.B
0124), el cual va dir igido contra antígenos solubles e insolubles de Mycobacterium bovis-
BCG. Al ser utilizado en inmunoelectroforesis cruzada reacciona con aproximadamente
100 antígenos diferentes de BCG, siendo muchos de estos comunes entre micobacterias y
algunos pocos con otras especies de microorganismos causantes de enfermedades como:
eritrasma, vasculitis séptica, nocardiosis, aspergilosis, blastomicosis, histoplasmosis,
esporotricosis, dermatofitosis, tuberculosis, lepra e infecciones por micobacterias atípicas
entre otras (3,4,5,15,16,115).
Aunque las técnicas IHQ se encuentran estandarizadas en el Laboratorio de Patología del
INS, para la utilización del anticuerpo anti-BCG fue necesario hacer variaciones como: el
empleo de buffer citrato a altas temperaturas, que si bien ayuda al desenmascaramiento
del antígeno, puede llagar a afectar la estructura del tejido. Así mismo, los tiempos de
incubación se tuvieron que prolongar para asegurar una mejor unión de los anticuerpos.
En los trabajos realizados por Kutzner (4), Byrd (17) y en el inserto del reactivo, se
recomienda la utilización del anticuerpo anti-BCG (anticuerpo primario) en dilución 1:1000.
Sin embargo, en este trabajo se estableció como concentración óptima 1:300, debido a
que no se contó con la olla a presión Vaporella (116), que proporciona un mejor
desenmascaramiento del antígeno, la cual fue sustituida durante la estandarización por
buffer citrato a 99°C en horno microondas, razón por la cual fue indispensable aumentar
la concentración del anticuerpo primario.
La reactividad cruzada que presenta el anticuerpo anti-BCG frente a diversos
determinantes antigénicos de bacterias, hongos y protozoos fue demostrada en este
estudio mediante la positividad observada en los diferentes casos trabajados. Es
importante mencionar que el anticuerpo no presenta reacción cruzada con el tejido.
En las biopsias con esporotricosis e histoplasmosis, la técnica IHQ reveló no solo la
presencia de antígeno en macrófagos sino que también permitió observar las levaduras del
hongo, las cuales no siempre son teñidas con el anticuerpo anti-Sporothrix schenkii
(elaborado en conejo por el Laboratorio de Microbiología del INS), por esta razón se
considera que el anticuerpo anti-BCG puede ser empleado con fines diagnósticos en estas
patologías.
La alta sensibilidad que tiene el anticuerpo, hace que éste pueda ser empleado como
ayuda diagnóstica en casos en los que las técnicas convencionales como la tinción con
Ziehl-Neelsen (ZN), no revelen la presencia de microorganismos. Tal es el caso de las
lesiones ocasionadas por micobacterias atípicas, en las que a pesar de tener un ZN
negativo, la IHQ con BCG mostró positividad en las células fagocíticas.
En la lepra post-tratamiento la técnica IHQ con BCG reveló positividad en células
espumosas, en las cuales también se observa algunos fragmentos del clofazimine,
medicamento utilizado para el tratamiento de estos pacientes. Sin embargo es importante
resaltar que no se observó ningún tipo de marcación en nervios. Estos antígenos pueden
explicar la aparición de la típica reacción leprótica post-tratamiento.
Aunque en el trabajo en que se ha empleado la técnica IHQ con anti-BCG para lesiones de
leishmaniosis, reporta resultados negativos (4), en el estudio realizado en el Laboratorio
de Patología del INS, se observó que en las biopsias de almohadilla plantar de hámster
con la enfermedad, así como las de leishmaniosis cutánea en humano ocasionadas por L.
panamensis, se evidenció la presencia de reacción positiva en macrófagos, sin que en
ninguno de los casos se tiñeran los amastigotes. La positividad en las células fagocíticas,
puede deberse a que la degradación del antígeno en el interior de estas células, permita la
exposición de diferentes determinantes antigénicos que puedan ser reconocidos por el
anticuerpo policlonal anti-BCG.
8. CONCLUSIONES
Para obtener un mejor marcación con anticuerpo policlonal anti-BCG, este debe
emplearse en dilución 1:300 con un período de incubación de 12 horas en cámara
húmeda a 4°C y debe utilizarse buffer citrato a 99°C.
Con los resultados se hace evidente la reacción cruzada que presenta el anticuerpo
anti-BCG frente a diferentes determinantes antigénicos de diversos
microorganismos, lo cual asegura su alta sensibilidad y baja especificidad.
Al utilizar el anticuerpo anti-BCG en inmunohistoquímica este proporciona gran
ayuda diagnostica en los casos en que las técnicas histoquímicas no permitan
observar el microorganismo, cuando este se encuentra en poca cantidad o ya haya
sido procesado por el sistema inmunológico del paciente.
La inmunohistoquímica con anticuerpo anti-BCG, en los casos en que la
histopatología es similar como en esporotricosis, lesiones por micobacterias atípicas
e incluso en algunas tuberculosis, es de gran utilidad diagnóstica ya que con gran
sensibilidad permite observar la levadura del Sporothrix schenkii.
En los casos de leishmaniosis la reacción cruzada con el antígeno de los
amastigotes presente en las células fagocíticas, confirma que Mycobacterium bovis
y Leishmania comparten antígenos.
En lepra post tratamiento, histoplasmosis y leishmaniosis, la técnica mostró una
alta sensibilidad marcando antígeno en células fagocíticas, en la totalidad de los
casos.
9. RECOMENDACIONES
Continuar el estudio con un número de muestra significativo, determinando la
sensibilidad, la especificidad y los valores predictivos positivo y negativo de la
técnica.
Determinar la utilidad de la técnica en diferentes patologías de interés.
Utilizar otros métodos de desenmascaramiento del antígeno que no alteren la
estructura del tejido como los que utilizan vapor y calor.
Trabajar con otro tipo de enzimas reveladoras como la fosfatasa alcalina, ya que
con esta se logra un mejor color de contraste, visualizándose el antígeno de color
rojo en un fondo azul.
Emplear microscopia electrónica para observar ultraestructuralmente la marcación
intracitoplasmática de los macrófagos en las diferentes patologías.
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