diseÑo e implementaciÒn de una metodologia para la

DISEÑO E IMPLEMENTACIÒN DE UNA METODOLOGIA PARA LA POLIMERIZACION Y CARACTERIZACION FISICOQUIMICA DE

HEMOGLOBINA LIBRE DE ESTROMA COMO UN TRANSPORTADOR DE OXIGENO INTRAVASCULAR

JULIAN GUILLERMO CRUMP LOMBANA

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERIA

DEPARTAMENTO DE QUIMICA BOGOTA D.C

2004

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15

INTRODUCCION

La hemoglobina es la mayor proteína encontrada en la sangre, que es

responsable por el transporte de oxígeno. Pero, existen dos grandes razones por

las cuales la hemoglobina que es extraída de los glóbulos rojos no puede ser

utilizada como transportador de oxígeno intravascular; primero, la hemoglobina se

parte en dímeros después de su infusión, por lo tanto es toxica para el organismo

y causa vasoconstricción por su tamaño; y la segunda, es que la hemoglobina

afuera del glóbulo rojo, no tiene acceso al cofactor 2,3-DPG, que facilita la unión

con el oxígeno en los pulmones y su adecuada liberación en los tejidos. Diferentes

soluciones de carácter biotecnológico son propuestas en este trabajo. La primera

es la reacción con piridoxal 5’ fosfato que es un análogo al cofactor 2,3-DPG y

facilita la unión y liberación de oxígeno. La segunda solución es la polimerización

de hemoglobina con glutaraldehido para formar polihemoglobina soluble la cual

no se parte en dímeros, y como se incrementa el tamaño de la partícula diluida,

tanto la presión oncótica ejercida por la hemoglobina es disminuida a niveles

normales, como la vasoconstricción es controlada, debido a que la molécula de

polihemoglobina ya no es capaz de atravesar la paredes vasculares.

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16

Otra grandiosa característica de este transportador de oxígeno intravascular, es la

posibilidad de ser esterilizado, por micro filtración y/o in activación viral, procesos

con los cuales se puede remover a los microorganismos responsables del VIH,

hepatitis etc. También, como este no posee antígenos de membrana que

determinan el grupo sanguíneo, no hay necesidad de tipificación. Esto ahorra

tiempo y dinero y facilita transfusiones in-situ. Además, el transportador de

oxígeno intravascular puede ser liofilizado y almacenado por largos periodos de

tiempo como un polvo seco y estable que puede ser reconstituido con solución

salina justo antes de su utilización.

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17

1. OBJETIVOS

Este trabajo de grado fue llevado acabo teniendo como referencia los siguientes

objetivos.

1.1. Objetivo global

Diseñar y implementar una metodología para el entrecruzamiento intermolecular e

intramolecular de hemoglobina libre de estroma y su caracterización físico-

química, para que pueda ser utilizada como un transportador de oxígeno

intravascular.

1.2. Objetivos específicos

• Diseñar e implementar una metodología para el entrecruzamiento

intermolecular de hemoglobina libre de estroma.

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18

• Diseñar e implementar una metodología para el entrecruzamiento

intramolecular de hemoglobina libre de estroma.

• Diseñar e implementar pruebas físico-químicas a la hemoglobina libre de

estroma entrecruzada (polihemoglobina)

• Caracterizar la hemoglobina libre de estroma entrecruzada (polihemoglobina).

• Apropiar tecnología de carácter extranjero a las condiciones tecnológicas

accesibles en Colombia.

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19

2. MARCO TEORICO

2.1. Transportadores de oxígeno intravascular (Hemosustitutos)

Las ventajas de un hemosustituto que pueda ser almacenado fácilmente y a

seguramente en cualquier momento y lugar indiferentemente de la cantidad y el

tipo de sangre, son mas que evidentes para cualquier persona. Debido a las

diferentes y complejas funciones se la sangre, el pensar en el desarrollo de un

sustituto que supla adecuadamente todas las funciones de la sangre, esta lejos de

la tecnología de hoy, pero características diferentes pueden ser suministradas por

diferentes sustitutos, que al ser combinados pueden hacer las funciones de un

hemosustituto. Las funciones de cada componente sanguíneo y su sustituto

correspondiente se describen en la tabla 11.

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20

Tabla 1. Funciones de los componentes sanguíneos y sus sustitutos

Componente sanguíneo Función Sustituto

Proteínas

plasmáticas

Albúmina Mantenimiento del volumen sanguíneo Expansor plasmático

Fibrinogeno Factor de coagulación (dextrano, hidroxietil almidón)

Globulina Anticuerpo Antibióticos

Plasma Electrolitos (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl-, HCO3-, HPO4

2-)

55% Osmoregulador, transporte de CO2 Reaprovisionado electrolítico

Lípidos (ácidos grasos, colesterol, grasa neutra, lecitina)

Nutrición Microesferas lipídicas

Carbohidratos Nutrición Inyección de glucosa

Glóbulo rojo

Hemoglobina Transporte de O2 y CO2 Glóbulo rojo artificial

Células

Anhidrasa

carbónica Acrecentar la eliminación de CO2

45%

Glóbulo blanco Fagocitosis, producción de anticuerpos Antibióticos, agentes

Quimioterapéuticos

Plaquetas coagulación (hemostasis) Coagulantes sanguíneos

Entonces, si un transportador de oxígeno intravascular o un glóbulo rojo artificial

son desarrollados, las demandas de los sustitutos sanguíneos serian

completamente establecidas.

1 Referencia 1 pg 117-118

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21

2.1.1. Areas potenciales de aplicación

“Debido a que los transportadores de oxígeno intravascular persisten en

circulación por 30 horas, sus aplicaciones clínicas potenciales, actualmente se ven

restringidas a cinco áreas, las cuales son descritas a continuación.” 2

2.1.1.1. Cirugía

“Es especialmente importante en cirugía de bypass cardiopulmonar, trauma,

cáncer, ortopedia y otras cirugías de carácter electivo. Por ejemplo, en cirugía

traumática el reemplazo de sangre llega hasta 100 unidades en algunos casos,

donde un transportador de oxígeno intravascular puede ser utilizado y al final de la

cirugía, sangre autóloga puede ser administrada.”2

2.1.1.2. Resucitacion de emergencia por hemorragia traumática

“Ejemplos incluyen accidentes de transito, desastres naturales como terremotos,

accidentes aéreos, casualidades civiles y no civiles en conflictos de carácter

mayor y menor. En estos casos, un transportador de oxígeno intravascular puede

ser utilizado para reemplazar perdida de sangre en shock hemorrágico. Es

importante en situaciones donde no hay tiempo y no existen facilidades para la

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22

tipificación sanguínea y la oferta de sangre donada no es la suficiente para suplir

las necesidades del momento.” 2

2.1.1.3. Soporte de glóbulos rojos a corto termino para otras condiciones

“Un ejemplo es anemia hemolítica severa. Otro ejemplo es soporte hasta que el

transplante de medula ósea o eritropoyetina humana recombinante comienzan sus

efectos esperados, además que puede estimular eritropoyesis en la medula ósea.

Otro ejemplo es el soporte para tipos sanguíneos atípicos y por lo tanto poco

accesibles en los bancos de sangre.” 2

2.1.1.4. Aplicaciones medicas donde los transportadores de oxígeno

intravascular pueden ser mas efectivos que los glóbulos rojos

“Transportadores de oxígeno intravascular en solución serian superiores a los

glóbulos rojos en perfusión a través de vasos obstruidos. Ejemplos incluyen infarto

del miocardio. Los usos potenciales de transportadores de oxígeno intravascular

en la preservación de órganos y en esas situaciones donde la hipotermia es usada

son otros ejemplos, esto es porque los glóbulos rojos no liberan oxígeno de una

manera adecuada a bajas temperaturas, en comparación con los transportadores

2 Referencia 2 pg 3-5

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23

de oxígeno intravascular, los cuales pueden ser preparados con un P50 aceptable

a bajas temperaturas.” 2

2.1.2. Disminuyendo los riesgos de infección

Actualmente, el sustituto de la hemoglobina es sangre donada, la transfusión

sanguínea a partir de sangre donada puede causar diferentes problemas como

hemólisis, coagulación e infección, aunque esto es bien manejado actualmente

pero a altos costos. La sangre donada no puede ser esterilizada actualmente, la

transmisión de infecciones son posibles todavía con las siguientes

probabilidades3:

Tabla 2. Probabilidades de transmisión de diferentes infecciones en unidades de sangre donada4

infección Probabilidad de transmisión

VIH 1/225,000 unidades

Hepatitis B 1/200,000 unidades

Hepatitis (otras) 1/3,300 unidades

HTLV I/II 1/50,000 unidades

Actualmente, una unidad de sangre donada después de todas la pruebas de

laboratorio y todos los requerimientos regulatorios son realizados, tiene un costo

3 Referencia 2 pg 6

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24

en el Mercado de aproximadamente US$250, sin incluir las demandas de las

personas que recibieron sangre infectada4.

2.1.3. Disminuyendo la carga en el sistema de sangre

“El nivel mínimo de glóbulos rojos en los pacientes antes de realizarles una

transfusión ha ido decayendo, debido a la probabilidad y el riesgo de infección.

Esto causa una mala oxigenación de los tejidos en pacientes con problemas

cardiovasculares o pulmonares, es aquí donde los transportadores de oxígeno

intravascular pueden proveer un margen de seguridad mucho mayor para estos y

cualquier otro paciente.” 5

“Para administrar sangre antóloga después de una cirugía, se requiere recoger

entre 4 y 6 unidades del paciente varias semanas antes de la cirugía, pero, en

cirugías mayores de carácter traumático, cardiovascular u ortopédico, el tiempo

para la recolección de sangre antóloga no es el adecuado, y por lo tanto el

proceso de recolección no puede ser llevado acabo.” 6

En la actualidad, el incremento paulatino de las necesidades para una población

en constante aumento y con un mayor tiempo de vida, ha hecho que aumenten las

necesidades de tratamientos médicos, donde se incluye la quimioterapia, el

4 Referencia 21

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25

transplante de órganos y la terapia de VIH. Esto ha hecho que los márgenes entre

la demanda y la oferta de sangre se haya estrechado a niveles no deseados, sin

incluir demandas inesperadas en el sistema de sangre causados por accidentes

de transito o aéreos, desastres como terremotos o conflictos armados6, este

ultimo, el cual se sufre actualmente en nuestro país Colombia. La posibilidad de

escalar a producción en planta industrial un producto como lo es el transportador

de oxígeno intravascular, es la solución, no solo disminuiría el margen entre la

demanda y oferta de sangre, pero también haría que los costos por unidad de

sangre sean menores, no solo por el tipo de producción a gran escala sino

también por la eliminación de las pruebas de laboratorio utilizadas para la

detección de infecciones. La única pieza faltante es la fuente de hemoglobina

necesaria para producción a gran escala, en primera instancia seria de sangre

donada vencida, pero otros grupos están trabajando con hemoglobina

recombinante, hemoglobina bovina y hemoglobina humana transgénica.

2.1.4. Atributos de un transportador de oxígeno intravascular

“En la tabla 3 se muestran algunos atributos de un transportador de oxígeno

intravascular que pueden ser relacionados por su uso cuando se consideren o

referencien las posibles aplicaciones en cirugía. El reemplazo es visto como una

función primaria y la mejor manera de aparear un “hemosustituto” con su función

5 Referencia 2 pg 7

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26

resultara cuando la necesidad y las propiedades especificas del caso sean

determinadas. El nivel de detalle y refinamiento no es obvio actualmente. Mas aún,

con la variedad de “hemosustitutos” que están siendo evaluados actualmente no

es confiable una comparación debido a que los elementos únicos pueden o no ser

conocidos. La función es clara: volumen y entrega de oxígeno. Otros efectos

farmacológicos pueden ser evaluadas una vez se tengan documentados y

establecidos. Por lo tanto el potencial para posterior refinamiento es real y

promisorio.”6

Tabla 3. Algunas propiedades físicas de un transportador de oxígeno intravascular9 Concentración de hemoglobina Capacidad de transporte de O2 Afinidad de la oxihemoglobina P50, función alostérica, cooperatividad Concentración de metahemoglobina presión osmótica coloidal Viscosidad pH Composición Electrolitos, Ca, Mg Tiempo de retención en plasma T1/2 Mecanismo de metabolización Mecanismo de excreción Aditivos

6 Referencia 17

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27

2.2. Matriz bidimensional de usos de los transportadores de oxígeno

intravascular

En la tabla 4 se muestra un modelo de matriz bidimensional de las opciones de un

transportador de oxígeno intravascular para usos actuales de donación sanguínea,

la “√’ indica las áreas de posible aplicación y la “X” refleja las áreas donde su uso

es menos viable.7

Tabla 4. Matriz bidimensional del uso de transportadores de oxígeno intravascular10

CASOS OPCIONES Preoperativo Intraoperativo Postoperativo

Electiva Urgente Emergencia Electiva Urgente Emergencia Electiva Urgente EmergenciaAutóloga Predeposito + EPO √ √ X √ √ X √ √ √ Hemodilución: Norvolémica aguda X X X √ √ √ X X X hipovolémica aguda X X X √ √ √ X X X Salvamento intraoperativo X X X √ √ √ X X X Salvamento postoperativo X X X X X X √ √ √ Diluyente para predeposito √ √ X X X X X X X Alogénica Tipo y cross match √ √ √ √ √ √ √ √ √ Tipo especifico √ √ √ √ √ √ √ √ √ Donante universal √ √ √ √ √ √ √ √ √ Glóbulos rojos procesados √ √ √ √ √ √ √ √ √ Sangre total X X √ X X √ X X √

Como se puede ver, en un poco mas del 60% de los casos clínicos tratados

actualmente, un transportador de oxígeno intravascular es viable, lo que justifica

su desarrollo además de las características mencionadas anteriormente.

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28

2.3. Transportadores de oxígeno

Diferentes investigaciones en posibles transportadores de oxígeno, han cerrado el

desarrollo a dos sustitutos que son utilizados actualmente y algunos están ya en

pruebas clínicas y listos para ser accesibles en el mercado: hemoglobina

modificada y perfluorocarbonos, que a diferencia de los glóbulos rojos, estos

pueden ser pasteurizados, filtrados o limpiados químicamente como la inactivación

viral, par volverlos estériles. Además, como estos no tienen antígenos de grupo

sanguíneo, su caracterización no es necesaria. Esto ahorra tiempo y dinero y

permite transfusiones in-situ en emergencias reduciendo el tiempo de respuesta,

que puede ser clave salvando la vida de una persona herida. Aun mas, estos

pueden ser almacenados por mas de un año, comparado con aproximadamente

un mes para sangre donada por métodos estándares8, que puede ser aumentado

por métodos muy laboriosos y costosos en donde la sangre es congelada para

almacenamiento a largo plazo9, este procedimiento es realizado para tipos de

sangre raros como B- y AB.

7 Referencia 17 8 Referencia 22 9 Referencia 2 pg 8

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29

2.4. Hemoglobina

“La ecuación de equilibrio para la unión de oxígeno con un material (M), puede ser

representada simplemente por:

Como k es la constante de unión al oxígeno, el oxígeno se une con M en una pO2

alta y se disocia de M a pO2 bajas. La presión parcial de oxígeno P50 a la cual la

mitad de las moléculas de M unen oxígeno es usualmente usada para expresar la

afinidad del oxígeno con el material M. En el caso de los glóbulos rojos, el material

con alta afinidad por el oxígeno es la proteína hemoglobina”.10

Las diferentes investigaciones llevadas a cabo con el fin de encontrar el mayor

transportador de oxígeno ha mostrado que ningún material conocido por la

humanidad actualmente, transporta oxígeno tan eficientemente como lo hace la

hemoglobina, la cual puede ser extraída de los glóbulos rojos. Perutz11 ha llevado

a cabo extensos trabajos sobre la función y estructura de la hemoglobina. En una

descripción corta, la hemoglobina esta encapsulada dentro del glóbulo rojo con el

fin de trabajar durante la circulación sin presentar problemas, el glóbulo rojo tiene

10 Referencia 1pg 9 11 PERUTZ M.F., Proc. R. Soc. Land. B, 1980, 208, 135

bO

aba

tcons

baK

PMOM

K

OMbOaM

)(][])()[(

)()(

2

2)tan(

22

=

⎯→←+

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30

en su membrana proteínas, lípidos y colesterol, la suma de estos tres

componentes se le conoce como estroma12. La hemoglobina es un tetrámero que

consta de cuatro subunidades: dos unidades α y dos unidades β que se

encuentran unidas por enlaces no covalentes, que son el resultado de puentes de

hidrógeno y fuerzas de Van der Waals13. Una representación esquemática de la

molécula de hemoglobina se muestra en la figura 1.

Figura 1. Representación esquemática de la molécula de hemoglobina14

Cada unidad de globina a consiste de 141 aminoácidos y tiene un peso molecular

de 15,126 Daltons, cada subunidad de globina b tiene 146 aminoácidos y tienen

12 Referencia 1 13 Referencia 3 col 3- 20 14 Referencia 2 pg 10

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31

un peso molecular de 15,867 Daltons15. Una molécula de hemoglobina pesa

61,986 Daltons.

Cada subunidad contiene un grupo hemo (hierro-protoporfirina IX), que es el sitio

de unión del oxígeno, tiene un hierro central con un bajo estado de oxidación

(bivalente) que permite la unión reversible del oxígeno.

“Debido a la atmósfera hidrofóbica que se encuentra en el bolsillo de la

hemoglobina, el hierro no se oxida a su estado trivalente, y por lo tanto, no pierde

su capacidad de unir oxígeno reversiblemente, cuando esto une el oxígeno tan

fuertemente que bloquea la transferencia de oxígeno. A este tipo de hemoglobina

en su estado trivalente se le conoce con el nombre de metahemoglobina.”16

“La hemoglobina constituye alrededor del 90% de toda la proteína que se

encuentra en un glóbulo rojo”17. “Un glóbulo rojo puede transportar 23 ml de

oxígeno por cada 100 ml de sangre, esto es alrededor de 80 veces mas alto que la

solubilidad física del oxígeno en el plasma”18. “La hemoglobina esta “oxi”, relajada

o en su estado R cuando transporta oxígeno (oxihemoglobina). Para liberar el

oxígeno, la hemoglobina conlleva un cambio conformacional con una rotación de

15°, así la molécula esta “deoxi”, tensa o en su estado T (deoxihemoglobina).”17

15 www.msstate.edu/org/MAS/julyjournal/hamil.htm 16 Referencia 1pg 6-8 17 Referencia 3 col. 3 : 33-34

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32

“El cofactor 2,3-difosfoglicerato (2,3-DPG) es el causante de este cambio

conformacional, debido a sus capacidades alostéricas . Por lo tanto, en presencia

de el cofactor 2,3-DPG, la hemoglobina puede liberar oxígeno mas fácil y

activamente a mayores tensiones de oxígeno tisular.”19

2.4.1. La hemoglobina dentro del glóbulo rojo

Dentro del glóbulo rojo, la hemoglobina forma un tetrámero, y la membrana celular

retiene el cofactor 2,3 DPG para que pueda interaccionar con la hemoglobina. La

concentración de hemoglobina dentro del glóbulo rojo es de 35 g/L (14 g/L en la

sangre total) que es posible porque la hemoglobina no ejerce presión osmótica en

el plasma fuera del glóbulo, únicamente el glóbulo rojo completo ejerce presión

osmótica. Los glóbulos rojos tienen un tiempo medio de vida de alrededor de 100

días20.

“El diámetro de un glóbulo rojo es de 8.5 µm, y la forma geométrica es de una

vesícula en forma de disco, bicóncavo, con un grosor mínimo de 1 µm y máximo

de 2.4 µm” 21 como se muestra en la figura 3.

18 Referencia 1pg 8 19 Referencia 2 pg 10 20 Referencia 2 pg 11 21 Referencia 1 pg 6

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33

Figura 2. Representación esquemática de la estructura y función de un glóbulo rojo.22

El volumen total de sangre en una persona es alrededor de 4 litros, lo que implica

una cantidad de hemoglobina de aproximadamente 650 g, claramente con

diferencias individuales19.

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34

“Un glóbulo rojo encapsula diferentes iónes , reguladores y enzimas, al igual que

hemoglobina. Aparte del cofactor 2,3-DPG, el glóbulo rojo transporta anhidrasa

carbónica para acrecentar el transporte de dióxido de carbono, superóxido

dimutasa y catalasa disminuir la formación de radicales de oxígeno, y sistemas

enzimáticos para reducir la formación de metahemoglobina y metabolitos

glicolíticos”.19

2.4.2. La hemoglobina como un hemosustituto

Obviamente, la primera reacción en busca del desarrollo de un transportador de

oxígeno intravascular es administrar directamente hemoglobina como

transportador de oxígeno. Pero la hemoglobina fuera del glóbulo rojo presenta

diferentes problemas que se describirán a continuación.

Cuando lo eritrocitos hemolizados son administrados, se ha encontrado que los

componentes de estroma son extremadamente tóxicos, resultando en

coagulopatía y una falla renal asociada23. “Esto fue solucionado por Rabiner en

1967 cuando preparo una solución de hemoglobina libre de estroma (SF-Hb) por

procedimientos de ultrafiltración y centrifugación.”23,24 Inclusive otros problemas

aparecen cuando se administra SF-Hb como transportador de oxígeno. Cuando se

22 Referencia 1 pg 8 23 Referencia 3 pg 4-5 24 Referencia 4

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35

extrae la hemoglobina de su microatmósfera celular, liga oxígeno tan fuertemente

que este no es liberado en los tejidos a los niveles requeridos25, esto pasa debido

a la ausencia del cofactor 2,3-DPG en el plasma sanguíneo, el cual regula la

liberación y unión del oxígeno.

“Además, el tetrámero se dimeriza, donde cada dímero contiene una unidad alfa y

una beta, y estos son filtrados rápidamente por los riñones y eliminados del

sistema circulatorio. Estos dímeros son tóxicos para los riñones, causan falla renal

y tienen un tiempo medio en la circulación de tan solo 2 horas. “26

El oxido nítrico posee un papel importante en el control del tono vascular, su

disminución resulta en la vasoconstricción, y su aumento resulta en la

vasodilatación. Las uniones intercelulares del endotelio celular permiten que la

hemoglobina tetramérica cruce desde la circulación debido a su tamaño. “La

hemoglobina tiene también una alta afinidad por el oxido nítrico y actúa como un

sifón removiendo oxido nítrico y dando como resultado la vasoconstricción.”27

“La concentración del numero de partículas solubles decide la cantidad de presión

osmótica. La hemoglobina dentro del glóbulo rojo esta separada del plasma y no

disuelto en el. Por lo tanto no ejerce presión osmótica. Por el contrario,

25 Referencia 3 col. 4 : 15-18 26 Referencia 2 pg 12 27 Referencia 23

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36

hemoglobina libre cuando es administrada como solución, se comporta como una

proteína disuelta en el plasma y cada hemoglobina se comporta como una

partícula soluble por lo que incrementa la presión osmótica.”28

“Para mantener el punto isoosmótico del plasma, una solución de hemoglobina a

una concentración de 7 g/dl debe ser administrada, reduciendo la capacidad de

transporte de oxígeno a la mitad, ya que la concentración normal de hemoglobina

es de 14 g/dl.”27

Como se comento anteriormente, la hemoglobina dentro del glóbulo rojo

interacciona con superóxido dimutasa y catalasa y con sistemas enzimáticos para

reducir la oxidación del hierro central, y entonces, evitar la formación de

metahemoglobina. Cuando se administra hemoglobina libre en el plasma, no tiene

ningún tipo de interacción con estos compuestos y tiende a formar

metahemoglobina.

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37

2.5. Que se puede hacer para solucionar estos problemas

2.5.1. Piridoxilación de hemoglobina libre de estroma

“La afinidad de la hemoglobina es regulada por un fosfato orgánico como el 2,3-

DPG. Benesch y Benesch demostraron en 1967, que en la presencia del cofactor

2,3-DPG, la hemoglobina tiene un P50 mas alto. Este fosfato orgánico altamente

aniónico esta presente en los glóbulos rojos en la misma concentración molar que

la hemoglobina. La hemoglobina puede entonces puede liberar mas fácil y

efectivamente el oxígeno en los capilares que suplen los tejidos.”29

“El sitio de unión del cofactor 2,3-DPG es importante ya que en el se encuentra la

base para diferentes modificaciones para formar transportadores de oxígeno

intravascular basados en hemoglobina modificada. El bolsillo del cofactor 2,3-DPG

es la cavidad central de la deoxihemoglobina, y consiste de tres residuos cargados

positivamente en la cadena β: el grupo α-amino, lisina EF6 y la histidina H21.

Estos grupos cargados positivamente en al cavidad central de la hemoglobina

interactúan con la fuerte y negativamente cargada molécula de 2,3-DPG. De esta

manera, el 2,3-DPG estabiliza la estructura cuaternaria de la deoxihemoglobina

28 Referencia 2 pg. 35 29 Referencia 2 pg 23

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38

entrecruzando las monómeros β de la hemoglobina. Esto lleva al equilibrio hacia la

forma tensa o T de la hemoglobina”30.

“La perdida del cofactor 2,3-DPG y otros ligandos orgánicos de tipo fosfato,

conlleva en soluciones de hemoglobina con una afinidad por el oxígeno mucho

mayor que la de la sangre total. La alta afinidad puede ser disminuida por la

modificación química de la hemoglobina con piridoxal 5’ fosfato” 31. “Benesch en el

año 1975 hizo este importante descubrimiento, y mostró que el piridoxal 5’ fosfato

es análogo al cofactor 2,3-DPG, por lo que mejora el P50 de la hemoglobina libre

de estroma.” 32

“Benesch descubrió que una variedad de derivados del piridoxal que contienen un

grupo aniónico en la posición 5’ reaccionan con la grupo amino terminal NH2 de la

hemoglobina humana. Sus estudios muestran que el piridoxal 5’ fosfato reacciona

con el tetrámero de la deoxihemoglobina para formar una base de Schiff

específicamente con el grupo amino terminal NH2 de una cadena β. En la figura 3

se muestra la reacción de la base de Schiff entre el glutaraldehido y la

hemoglobina para formar la polihemoglobina.

30 Referencia 2 pg 24 31 Referencia 5 32 Referencia 2 pg 21

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39

Figura 3. Reacción de la base de Schiff entre el glutaraldehido y la hemoglobina para formar polihemoglobina

Esta imina puede ser convertida a la correspondiente y estable amina secundaria

por la reducción con borohidruro de sodio dando como resultado un tetrámero

monosustituido” 33. En la figura 4 se puede ver una representación esquemática de

la hemoglobina libre de estroma piridoxilada (PLP-SFHb).

Figura 4. Representación de la hemoglobina piridoxilada

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40

2.5.2. Polimerización de la hemoglobina libre de estroma piridoxilada

Como se explico anteriormente, cuando la hemoglobina es administrada

directamente, esta se dimeriza causando falla renal. La principal razón por la cual

se polimeriza la hemoglobina es formar una macromolécula, que no se dimeriza,

evitando así la falla renal y además, se aumenta su vida media en circulación de 2

a 30 horas. Claramente aumenta su tamaño molecular, previniendo que la nueva

macromolécula de hemoglobina cruce las uniones intercelulares del endotelio y

retire el oxido nítrico, el cual es el responsable de regular la vasoconstricción. En

la figura 5 se muestra una representación esquemática de la hemoglobina

polimerizada con un agente bifuncional: cloruro de sebacilo.

Figura 5. Hemoglobina polimerizada con un agente bifuncional (Cloruro de sebacilo).34

33 Referencia 6 34 Reeference 2 pg 16

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41

2.5.2.1. Agentes de polimerización, regulación y terminación del proceso

de polimerización

"Los agentes bi- o polifuncionales convenientes para la polimerización deben ser

solubles en agua, y reactivos con los sitios de entrecruzamiento de la

hemoglobina, para producir un producto polimerizado soluble en agua. Los

agentes de polimerización no deben afectar la hemoglobina de una manera

adversa como desnaturalizándola, afectando su solubilidad o su función de unir

reversiblemente el oxígeno para suplirlo a los tejidos y órganos. Los agentes bi- o

polifuncionales tienen al menos dos grupos funcionales , que pueden ser iguales o

diferentes. Estos grupos son capaces de reaccionar y entrecruzarse con los

grupos amino y otros sitios de entrecruzamiento de la molécula de hemoglobina.

Por grupo amino se quiere decir el grupo alfa N-terminal de las cadenas de la

hemoglobina, y aquellos de los residuos básicos de aminoácidos como la lisina y

la arginina.

Los grupos funcionales del agente de polimerización pueden estar unidos

covaléntemente entre ellos o pueden estar separados por un anillo alifático o

aromático. Ejemplos de grupos funcionales aromáticos estabilizados son azo y

halo activados con un grupo nitro. Estos incluyen compuestos con un anillo

heterocíclico con grupos reactivos unidos al anillo. Por ejemplo, triazinas con la

formula:

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42

Figura 6. Formula de la triazina.35

Donde R1 es un halógeno como fluor, cloro y bromo, y R2 es un sustituto

nucleofílico como un grupo alifático o aromático, un halógeno, o un alquilo menor

de 1 a 8 carbonos, y aminas. Agentes de polimerización que caen dentro de este

grupo son 2-amino-4,6-dicloro-s-triazina y cloro-s-triazina. Los agentes de

polimerización incluyen agentes estabilizados aromáticos preparados por la

diazotación de una diamina aromática, por ejemplo, bencidina y sus derivados

con ácido nitroso para producir bis-diazobenzidinas de la formula:

Figura 7. Formula de la bis-diazobencidina.31

35 Referencia 7

IQ-2003-02-08

43

Donde R3 es un miembro del grupo que consiste de un enlace covalente, alquileno

de 1 a 5 carbonos, fenileno, éter, sulfona y secamina, R4 es un halógeno o nitro,

R5 es un hidrógeno, nitro, alquilo menor de 1 a 8 carbonos, sulfonato (SO3H) y

carboxilato, y R6 es un halógeno, diazo (-N:N-), isocianato (NCO), e isotiocianato

(NCS). Agentes de polimerización representativos de esta formula incluyen

bisdiazobenidina 2,2-ácido sulfónico , 4,4’-difluoro-3,3’-dinitrofenilsulfona y difenil-

4,4’-diisocianato.

Agentes de polimerización incluyen compuestos de la formula:

Figura 8. 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno.36

Donde R7 es un halógeno y R8 un nitro, o un hidrogeno con al menos un nitro en

R8, como el agente comercial halogenado activado 1,5-difluoro-2,4-

dinitrobenceno.

36 Referencia 7

IQ-2003-02-08

44

Agentes de polimerización también incluyen compuestos de la formula (R9)2C=O

donde R9 es un hidrogeno o un halógeno, y los compuestos de la formula

R10−(CH2)n−R10 donde R10 es el mismo o diferente y n esta entre 1 y 8. los

agentes de polimerización también incluyen compuestos que contienen un grupo

funcional unido a cicloalquilos representados por la formula:

Figura 9. Formula del cicloalquilo.37

Donde R10 es igual o diferente, p varia entre 0 y 4, y q varia entre 1 y 4. Los

agentes de entrecruzamiento incluyen compuestos que tienen grupos funcionales

unidos a una cadena alifática interrumpida con un grupo no funcional o que tienen

grupos no funcionales unidos a la cadena como se representa en los compuestos

con formula R10−(CH2)x−R11−(CH2)x−R10 donde R10 es igual o diferente, R11 es

seleccionado del grupo que consiste en un puente de éter, una amina divalente y

una sulfona, y x es un alquileno de 1 a 5 átomos de carbono, con cada x igual o

diferente. Compuestos representativos del grupo funcional que abarca R10 incluye

isocianato, vinilo, imina, isotiocianato, isocianuro, aldehído, epóxido, cloroformato,

tiocloroformato, imido esteres de alquilo menores y tiolactonas de la formula:

37 Referencia 7

IQ-2003-02-08

45

Figura 10. Formula de la tiolactona.30

Donde a varia entre 1 y 3. R10 también puede ser un grupo activado formado al

reaccionar ácido carboxílico con haluro de tionilo o haluro de fósforo, o un grupo

activado formado al reaccionar una amida o un ester de alquilo del ácido

carboxílico con hidracina y después con ácido nitroso para generar el

correspondiente grupo activado COR12 donde R12 es un halógeno o una azida. El

grupo activado puede ser formado también reaccionando el ácido carboxílico con

N,N'-carbonil diimidazola de la formula R13−N=C=N−R13 donde R13 es igual o

diferente y son un alquilo menor, un cicloalquilo menor, amino alquileno menor, y

heterocíclico alquilo menor . R12 puede ser también

Figura 11. Formula de alquilo menor.38

Un alquilo menor, y

IQ-2003-02-08

46

Figura 12. Otra posibilidad para R12.34

Donde n varia entre 1 y 2.

Reactivos para entrecruzamiento disponibles comercialmente abarcados por la

formula anterior incluyen divinil sulfona, epiclorohidrina, butadieno diepóxico, etilen

glicol diglicil éter, glicerol diglicil éter, dimetil suberimidato dihidrocoloruro, dimetil

malonimidato dihicrocloruro, y dimetil adipimidato dihidrocloruro.

Ejemplos de los compuestos que incluyen un grupo funcional isocianato o

isotiocianato son los compuestos listados abajo. Adicionalmente, los isocianatos o

tioisocianatos pueden ser sintetizados reaccionando un alquilo o aril amina con

fosfogén o tiofosfogén. Los isocianatos usados para entrecruzamiento son

diisocianatos y reaccionan con el grupo amino libre de la hemoglobina

produciendo sitios de unión tipo urea o tiourea. Compuestos típicos incluyen ácido

difenil-4,4'-diisotiocianato-2,2'-disulfónico, tolueno diisocianato, tolueno-2-

38 Referencia 7

IQ-2003-02-08

47

isocianato-4-isotiocianato, 3-metoxidifenilmetano-4,4'-diisocianato, propileno

diisocianato, butileno diisocianato y hexametileno diisocianato.

Ejemplos de agentes de entrecruzamiento que contienen el grupo funcional

aldehído o dialdehído incluyen formaldehído, paraformaldehído, ureas activadas

de formaldehído como 1,3-bis(hidroximetil)urea, N,N'-di(hidroximetil)

imidazolidinona preparadas de la condensación del formaldehído con urea según

la formula:

CH2O+R16HN−CO−NHR16 → HOCH2NR16−CO−NR16−CH2OH

Donde R16 es un hidrogeno, alquilo, arilo o un anillo heterocíclico. Otros agentes

de entrecruzamiento tipo dialdehído incluyen aquellos de la formula

OCH−R17−HCO donde R17 es un miembro seleccionado del grupo que consiste de

un enlace covalente y una cadena de alquileno lineal o ramificada de 1 a 8

carbonos. Dialdehídos encontrados dentro de este grupo incluyen gloxal,

dialdehído malónico, dialdehído succínico, glutaraldehido, adipaldehído, 3-

metilglutaraldehido, propiladipaldehido, dialdehído ftálico, tereftaldehido y aldehído

malónico.

Otros agentes de entrecruzamiento incluyen derivados de ácidos carboxílicos y

sus residuos de hemoglobina activados in situ para dar un reactivo derivativo de

hemoglobina que se entrecruzara con las aminas de otras hemoglobinas. típicos

IQ-2003-02-08

48

ácidos carboxílicos utilizados para este propósito tienen la formula

CO2H(CH2)nCO2H, y [(CH2)nCOOH]3CH donde n varia entre 1 y 8. Los ácidos

carboxílicos incluyen cítrico, malónico, adípico y succínico. Iniciadores del ácido

carboxílico incluyen cloruro de tionilo, carbodiimidas, N-etil-5-fenil-isoxazolium-3'-

sulfonato (reactivo K de Woodward), N,N'-carbonildiimidazola, N-t-butil-5-

metilisoxazolium perclorato (reactivo L de Woodward), 1-etil-3-dimetil

aminopropilcarbodiimda, 1-ciclohexil-3-(2-morfolinoetil) carbodiimida meto-p-

tolueno sulfonato. La reacción de entrecruzamiento cuando se usa un ácido

carboxílico se puede representar por la ecuación:

Otros grupos de entrecruzamiento que pueden ser usados son preparados de

esteres y tioésteres activados por tiolactonas, hidroxisuccimida ester, esteres de

ácidos carboxílicos halogenados e imidatos.

El reactivo de entrecruzamiento puede ser un dialdehído precursor que forma un

dialdehído bifuncional en el medio de reacción. Estos precursores incluyen dímero

de acroleina o 3,4-dihidro-1,2-piran-2-carboxaldehido que conlleva a un clivaje de

anillo en un ambiente acuoso para dar alfa-hidroxi-adipaldehido. Otros

precursores, que en hidrólisis producen un agente de polimerización, incluyen 2-

etoxi-3,4-dihidro-1,2-piran que produce glutaraldehido, 2-etoxi-4-metil-3,4-dihidro-

1,2-piran que produce 3-metil glutaraldehido, 2,5-dietoxi tetrahidrofurán que

HbHRCONRCOXHRCO NHHbactivator −−⎯⎯⎯ →⎯⎯⎯⎯ →⎯ − 22

IQ-2003-02-08

49

produce dialdehído succínico y 1,1,3,3-tetraetoxipropano que produce dialdehído

malónico y formaldehído de trioxano. Similarmente, los agentes de polimerización

pueden ser preparados por procedimientos de síntesis conocidos como

malonaldehído de tetraetil acetal, succinaldehido de dietoxitetrahidrofurán y

adipaldehído de la oxidación de ciclohexanodiol.

En la formula anterior, la expresión “un alquileno que varia entre 1 a 8 carbonos”

se incluyen cadenas lineales y ramificadas como el metileno, etileno, propileno,

isopropileno y hexileno. La expresión “alquilo menor de 1 a 8 carbonos” incluye

cadenas lineales y ramificadas como metil, etil, propil, isopropil y hexil.

Las aminas de bajo peso molecular adicionadas al proceso de polimerización para

regular el entrecruzamiento o terminarlo, es un agente mono-, di- o multifuncional,

preferiblemente una amina primaria de la fórmula R-NH2. La amina debe ser

soluble en solución acuosa para asistir en el mantenimiento de las características

de solubilidad de la hemoglobina polimerizada. Aminas de bajo peso molecular

típicas utilizadas para desactivar el exceso de agente de entrecruzamiento son

glicina, lisina, serina, treonina, alanina, etanolamina, ácido 2-aminoadípico y

glutationa. Otros compuestos capaces de desactivar los agentes polimerizantes

son terminadores tales como bisulfitos y dioles capaces de desactivar aldehídos,

IQ-2003-02-08

50

alcoholes de bajo peso molecular para desactivar ácidos carboxílicos activos,

haluros e isocianatos activos, y sulfhidrilos para desactivar epóxidos y vinilos.” 39

2.5.2.2. Que agentes para entrecruzamiento, regulación y terminación

serán utilizados

La selección de los agentes de polimerización o entrecruzamiento, regulación y

terminación, dependió de su facilidad de adquisición, y que algún tipo de

comparación pudiera ser realizada con otros grupos que ya han polimerizado

hemoglobina libre de estroma, los grupos de N.P. Kuznetsova40, L.R. Sehgal41,

Alza Corporation42 y T.M.S. Chang43,44 usan como agente de polimerización el

glutaraldehido y como agente de regulación y terminación la lisina

monohicrocloruro, por lo tanto estos agentes serán utilizados en el presente

trabajo para que haya manera de comparar con estos otros trabajos. El resultado

final es hemoglobina libre de estroma polimerizada y piridoxilada (Poly-PLP-

SFHb), un diagrama esquemático puede ser visto en la figura 12.

39 Referencia 7 40 Referencia 8 41 Referencia 9 42 Referencia 7 43 Referencia 2 pg 30-31 44 Referencia 10

IQ-2003-02-08

51

Figure 13. Resultado final, hemoglobina libre de estroma polimerizada y piridoxilada.45

2.5.3. Cinética de la reacción de polimerización

2.5.3.1. Definición de la velocidad de reacción

“La velocidad con que se efectúa una reacción química se puede expresar de

varias maneras. Se puede expresar como la velocidad de desaparición de los

reactivos o como la velocidad de formación de los productos. La polihemoglobina

se produce a partir de hemoglobina libre de estroma y glutaraldehido.

HBNHCOCHCONHHBNHHBHCOCHCOH −−−−−−⎯→⎯−+−−−− 32232 )()(

45 Referencia 2 pg 21

IQ-2003-02-08

52

Si el símbolo A representa al glutaraldehido, el valor numérico de la velocidad de

reacción –rA, se define como el numero de moles de glutaraldehido que

reaccionan (desaparecen) por unidad de tiempo por unidad de volumen

(mol/dm3s).” 46

2.5.3.2. La ecuación general de balance de moles

“Para realizar el balance de moles en un sistema, hay que especificar sus

fronteras. El volumen del sistema esta delimitado por estas fronteras. Se realiza un

balance de moles de la especie j, que representa la especie química a analizar.

Un balance de moles de la especie j en cualquier instante de tiempo t da la

siguiente ecuación:

velocidad de velocidad de velocidad de velocidad de flujo de j hacia generación de j flujo de j desde acumulación el sistema + por reacción - el sistema = de j dentro (moles/tiempo) química dentro (moles/tiempo) del sistema del sistema (moles/tiempo) (moles/tiempo) entrada + generación - salida = acumulación Fj0 + Gj - Fj = dNj/dt

46 Referencia 16 pgs. 2-4

IQ-2003-02-08

53

Donde Nj representa el numero de moles de la especie j en el sistema en el

tiempo. Si todas las variables del sistema (p.e. temperatura, actividad catalítica,

concentración de la especie química) son espacialmente uniformes dentro de todo

el volumen del sistema, la velocidad de generación de la especie j, Gj, es el

producto del volumen de reacción, V, por la velocidad de formación de la especie j,

rj.

volumenvolumentiempo

molestiempomoles

VrG jj

⋅⋅

=

⋅=

Si se supone que la velocidad de formación de la especie j para la reacción varia

con la posición en el volumen del sistema , la velocidad de generación ∆Gj1, en

términos de rj1 y el subvolumen ∆V1 es:

111 VrG jj ∆=∆

Se pueden escribir expresiones similares para los demás subvolumenes del

sistema ∆Vi. La velocidad total de generación dentro del volumen del sistema es la

suma de todas las velocidades de generación de cada uno de los subvolumenes.

Si el volumen total del sistema se divide en M subvolumenes, la velocidad total de

generación es:

IQ-2003-02-08

54

∑∑==

∆=∆=M

iiji

M

ijij VrGG

11

Si se toman los limites apropiados (es decir M → ∞ y ∆V → 0) y usando la

definición de integral, se puede rescribir la expresión anterior de la forma:

∫=V

jj dVrG

Esta ecuación dice que rj es una función indirecta de la posición, puesto que las

propiedades de los materiales que reaccionan (p.e. temperatura, concentración)

pueden tener diferentes valores en diferentes puntos del reactor. Ahora si se

sustituye esta expresión en la ecuación de balance de moles, tenemos:” 47

dtdN

dVrFF jV

jjj =+− ∫0

2.5.3.3. Reactor por lotes

“Un reactor por lotes no tiene flujo de entrada ni flujo de salida de productos

mientras la reacción se esta efectuando: Fj0 = Fj = 0. El balance general de moles

de la especie j es entonces:


IQ-2003-02-08

55

∫=V

jj dVr

dtdN

Si la mezcla de reacción es perfectamente homogénea, y por lo tanto no hay

variación en la rapidez de reacción en todo el volumen del reactor, en la ecuación

de balance de moles rj es constante y la integral de dV es V:” 48

Vrdt

dNj

j =

2.5.3.4. Cinética de reacciones no elementales de polimerización por pasos

o también conocida como reacción de condensación

“Un polímero es una molécula formada por unidades estructurales que se repiten

llamadas monómeros (p.e. la hemoglobina libre de estroma es el monómero de la

polihemoglobina).

La polimerización es el proceso por el cual los monómeros se enlazan por

reacción química para formar cadenas largas. Estas cadenas largas diferencian a

los polímeros de otras especies químicas y les confiere propiedades y

características determinadas que los diferencian entre si. Las reacciones de


IQ-2003-02-08

56

polimerización se dividen en reacciones por pasos o reacciones de condensación

y reacciones en cadena o reacciones de adición. La polihemoglobina es formada

por reacción por pasos o condensación. Las reacciones por pasos requieren

monómeros bi- o polifuncionales. Los grupos funcionales que reaccionan se

encuentran en monómeros diferentes, el grupo amina (NH2) en la hemoglobina y

el grupo aldehído (COH) en el glutaraldehido., que al unirse forman la unidad

estructural repetitiva de la polihemoglobina o monómero de polihemoglobina. Para

el caso de la polimerización de hemoglobina libre, si hacemos:

COCHCORHB

NHHBNHRHA

−−==

−−==

322

1

)(

Monómero A-R1-B + B-R2-B → A-R1-R2-B

Dímero A-R1-R2-B + A-R1-R2-B → A-(R1-R2)2-B

Trímero A-R1-R2-B + A-(R1-R2)2-B → A-(R1-R2)3-B

Tetrámero A-R1-R2-B + A-(R1-R2)3-B → A-(R1-R2)4-B

A-(R1-R2)2-B + A-(R1-R2)2-B → A-(R1-R2)4-B

Pentámero A-(R1-R2)2-B + A-(R1-R2)3-B → A-(R1-R2)5-B

A-R1-R2-B + A-(R1-R2)4-B → A-(R1-R2)5-B

Hexámero A-(R1-R2)3-B + A-(R1-R2)3-B → A-(R1-R2)6-B

A-(R1-R2)2-B + A-(R1-R2)4-B → A-(R1-R2)6-B

A-(R1-R2)1-B + A-(R1-R2)5-B → A-(R1-R2)6-B

IQ-2003-02-08

57

Al hablar del avance de una polimerización por pasos no tiene sentido usar la

conversión de monómero como medida, porque la reacción continua aunque se

haya consumido todo el monómero., ya que todavía hay grupos funcionales A y B

que pueden reaccionar. El avance de la polimerización se mide con el parámetro p

que es la fracción de grupos funcionales, A, B, que han reaccionado.

0

0

MMM

p−

=

Que es la fracción de grupos funcionales A o B que han reaccionado y M es la

concentración de grupos funcionales A o B (mol/dm3).

Si suponemos que la velocidad de desaparición es de primer orden con respecto a

A y B, el balance de A es:

]][[][ BAkdtAd

=−

Si la alimentación molar es igual tenemos

∫∫ −=

−=

==

t

t

M

M

kadtMdM

akMdt

dMAM

BaA

00

2

2

][][][

IQ-2003-02-08

58

Si t0=0 entonces al integrar a ambos lados resulta

takMM

M

MaktM

M

Makt

M

aktMM

0

0

0

0

0

0

1

11

11

11

+=

+=

+=

==−

En términos de la conversión fraccionaria de grupos funcionales, p,

11

10 +=

−takM

p

El grado de polimerización es el promedio numérico es el numero promedio de

unidades estructurales por cadena.

pX n −

=1

1

IQ-2003-02-08

59

El peso molecular promedio numérico es el peso molecular promedio de una

unidad estructural Ms, multiplicado por el promedio de unidades estructurales de

cadena Xn, mas el peso molecular de los grupos del extremo Mge.” 49

gesnn MMXM +=

2.5.3.5. Determinación de las concentraciones de polímeros en

polimerización por pasos

“Para determinar la concentración y fracción molar de los polímeros con cadena

de longitud j en términos de la concentración inicial de ARB, M0, la concentración

de grupos funcionales que no ha reaccionado (M), la constante de propagación (k)

y el tiempo t, entonces sea P1=A-R-B, P2=A-R2-B,...,Pj=A-Rj-B, tenemos:

reacción Leyes de velocidad

(1) 2P1 → P2 -r1P1 = 2kP12, r1P2 = -0.5r1P1 = kP1

2

(2) P1 + P2 → P3 -r2P1 = -r2P2 = r2P3 = 2kP1P2

(3) P1 + P3 → P4 -r3P1 = -r3P3 = r3P4 = 2kP1P3

(4) P2 + P2 → P4 -r4P2 = 2kP22, r4P4 = -0.5r4P2 = kP2

2


IQ-2003-02-08

60

El factor 2 en el termino de desaparición se debe a que hay dos formas en que A y

B pueden reaccionar

A - Rn - B

A - Rm – B

Las velocidades de reacción netas de P1, P2 y P3 para las reacciones de (1) a (4)

son:

3231213

2221

212

31212

11

222

22

222

3

2

1

PkPPkPPkPrr

kPPkPkPrr

PkPPkPkPrr

P

P

p

−−=≡

−=−=≡

−−−=≡

Si se continúan de esta manera se comprobará que la velocidad de formación neta

de P1 es

∑∞

=

−=1

121

jjP PkPr

Sin embargo la sumatoria de Pj no es mas que la concentración total de grupos

funcionales de A o B, que es M.

MkPrP 121

−=

De forma similar, podemos generalizar las reacciones (1) a (4) para obtener la

velocidad de formación neta del j-mero, para j ≥ 2.

IQ-2003-02-08

61

MkPPPkr j

j

ijij 2

1

11 −= ∑

−

=−

En un reactor por lotes, el balance de moles de P1 para eliminar M da:

2

001

0

011

1

11

122

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+

=

+−=−=

ktMMP

despejandotkM

MkPMkP

dtdP

Al despejar P1, se puede usar rj para despejar sucesivamente Pj

20

0

4

0

202

212

2

112

112 P

ktMkM

ktMkMMkPkPr

dtdP

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+

−⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+

=−==

con P2 = 0 en t = 0, entonces

1

0

02

002 11

1−

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+

=j

ktMktM

ktMMP

Continuando de esta manera se puede generalizar que

1

0

02

00 11

1−

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+

=j

j ktMktM

ktMMP

IQ-2003-02-08

62

Si recordamos que

120

0

0

)1( −−=

−=

jj ppMP

entoncesM

MMp

La fracción molar del polímero con longitud de cadena j es simplemente

MP

y jj =

Recordando que M = M0(1-p), se obtiene

1)1( −−= jj ppy

Esta es la distribución de Flory-Schulz.” 50

2.5.3.6. Distribución de pesos moleculares

“Lo que le confiere a un polímero sus propiedades únicas son la concentración de

polímero, el peso molecular promedio y la distribución de longitudes de cadena.


IQ-2003-02-08

63

En la figura 14 se muestra unas distribución típica de las longitudes de cadena

para todos los Pj (j = 1 a j = n).

Figura 14. Distribución típica de pesos moleculares de un polímero

Si dividimos el eje y entre la concentración total de polímero, ∑Pj, ese eje se

convierte en la fracción molar del polímero con j unidades repetidas incorporadas

en el, es decir yj.

Los parámetros que se obtienen de la distribución de pesos moleculares de los

polímeros y que podemos utilizar para cuantificar la distribución que se muestra en

la figura 13 son:

• Los momentos de la distribución

∑∞

=

=1n

jn

n Pjλ

IQ-2003-02-08

64

• El momento cero es la concentración total de polímero

∑∞

=

==1

0j

j PPλ

• El primer momento esta relacionado con el numero total de unidades de

monómero

∑∞

=

=1

1n

jjPλ

• El primer momento dividido entre el numero cero de la longitud de cadena

media numérica (NACL), µn

∑∑===

j

jn P

jPNACL

0

1

λλ

µ

Que también se le conoce como el grado de polimerización. Es el numero

promedio de unidades estructurales por cadena y también se puede calcular a

partir de

pX nn −

=≡1

1µ

IQ-2003-02-08

65

• El peso molecular promedio numérico

snn MM µ=

donde Ms es el peso molecular promedio de las unidades estructurales.

• El segundo momento da preponderancia a las cadenas mas largas

∑∞

=

=1

22

jjPjλ

• La masa por unidad de volumen de cada especie polimérica es MsjPj. La

longitud de cadena promedio por masa es el cociente del momento 2 entre

el momento 1

∑∑===

j

jw jP

PjWACL

2

1

2 µλλ

• El peso molecular promedio por peso es

wsw MM µ=

IQ-2003-02-08

66

• El índice de polidispersidad (D) es

21

20

λλλ

µµ

==n

wD

Una polidispersidad de 1 implica que todos los polímeros tienen la misma longitud,

y una polidispersidad de 3 implica que existe una distribución muy amplia de

tamaños de polímero. El valor típico se encuentra entre 2 y 10.” 51

2.5.3.7. Estadísticas de Flory de la distribución de pesos moleculares

“La fracción molar de polímero con longitud de cadena j es

1)1( −−= jj ppy

En términos de la concentración de polímero

120 )1( −−== j

jj ppMMyP

El peso molecular promedio numérico es


IQ-2003-02-08

67

∑∑ ∑ =−

=−

−=−=== −∞

=

∞

=

sns

sj

sj j

sjjjn MXp

Mp

pMjppMMjyMyM1)1(

1)1()1( 21

1 1

La fracción por peso de polímero con longitud de cadena j es

12

21

1

1

12

12

111

)1(

)1(1

)1(

)1(

−

∞

=

−

∞

=

−

−

∞

=

∞

=

∞

=

−=

−=

−

−====

∑

∑∑∑∑

jj

j

j

j

j

j

jj

j

jjs

sj

jjj

jjj

ppjw

pjpdonde

jpp

ppj

jP

jP

jPM

MjP

MP

MPw

El peso molecular promedio por peso es” 52

∑ ∑∞

=

∞

= −

+===

1 1 )1(

)1(

js

jjsjjw

p

pMjwMMwM

2.5.3.8. Variaciones en la velocidad de reacción de la polimerización de

hemoglobina libre de estroma

La manipulación de las diferentes variables de polimerización, puede tener efectos

sobre la velocidad de reacción. Uno de los principales requisitos para el escalado

52 Referencia 16 pg. 373

IQ-2003-02-08

68

industrial de un proceso, es hacer mas eficiente el proceso con respecto a sus

costos y su tiempo de desarrollo, esto hace que el estudio de la cinética de

polimerización sea un proceso muy importante en el desarrollo de transportadores

de oxigeno intravascular basados en la polimerización de hemoglobina libre de

estroma.

2.5.3.8.1. Efecto de la razón molar de hemoglobina a glutaraldehido

La variación en concentración de los dos agentes que hacen parte del proceso de

polimerización, el glutaraldehido y la hemoglobina, causan variaciones sobre la

velocidad de reacción de la polimerización. Al aumentar la cantidad de

glutaraldehido y manteniendo la cantidad de hemoglobina estable, se supone que

el proceso de polimerización se ve acelerado, ya que se aumenta la probabilidad

de encuentro entre los grupos amino de la hemoglobina y el grupo aldehído del

glutaraldehido que causan el entrecruzamiento.

Hay que tener en cuenta que el glutaraldehido es un agente desnaturalizante de la

hemoglobina, y que su razón molar con relación a la hemoglobina no puede ser

aumentada de manera infinita ya que el efecto deseado seria el contrario, y la

polimerización no se llevaría acabo, desnaturalizando la hemoglobina, y haciendo

inutilizable el producto de polimerización. Chang, a modificado recientemente el

proceso de polimerización aumentando la razón molar de agente de

IQ-2003-02-08

69

polimerización a hemoglobina de 16:1 a 17:1 y con una concentración de

glutaraldehido de 0.5 M, obteniendo tiempos de polimerización de 5 horas,

comparado con tiempos previos de 12 a 18 horas.53,54

2.5.3.8.2. Efecto de la variación del pH

La hemoglobina tiene 44 grupos amino que se encuentran ionizados (NH3+) y

cuatro grupos amino terminales que no se encuentran ionizados (NH2) a pH = 7.4.

los grupos amino no ionizados son los que reaccionan con el glutaraldehido

formando la base de Schiff permitiendo el proceso de polimerización.

La hipótesis presentada en este trabajo, es el manejo del pH de la solución de

hemoglobina libre de estroma, ya que la velocidad de reacción se puede ver

acelerada, al aumentar el numero de sitios activos donde el glutaraldehido puede

reaccionar. Al variar el pH de la solución de hemoglobina libre de estroma, los

grupos amino que se encuentran ionizados se pueden desionizar y se convierten

en un sitio activo de polimerización. La formación de los puentes intermoleculares

depende en el numero total de grupos amino reactivos y en particular de su

distribución en la superficie de la hemoglobina.

53 Referencia 18 54 Referencia 9

IQ-2003-02-08

70

Existen limitaciones en el proceso de variación de pH, ya que la hemoglobina

conserva su estructura cuaternaria entre pH’s entre 6 y 8, por debajo o por encima

de estos valores la hemoglobina se desnaturaliza haciendo inutilizable el producto

de polimerización.

2.5.4. Otros procesos utilizados

Durante la producción de la solución de hemoglobina libre de estroma

polimerizada y piridoxilada, otros procesos son necesarios, diferentes a los de

piridoxilación y polimerización de la hemoglobina, para preparar una adecuada

solución de hemoglobina para el siguiente paso.

2.5.4.1. Ultrafiltración

2.5.4.1.1. Definición

“La ultrafiltración es un proceso de membrana a baja presión usado para separar

compuestos de alto peso molecular la una línea de alimentación. La ultrafiltración

tiene poros de mayor diámetro que la nanofiltración y osmosis reversa y es por lo

tanto la menos costosa de las tres. Como resultado, la ultrafiltración requiere de

menores elementos de membrana y menores requerimientos de presión para su

operación. La ultrafiltración es excelente para separar materiales delicados, como

IQ-2003-02-08

71

proteínas, ya que es un método de separación no desnaturalizante. En general,

sales y especies de bajo peso molecular pueden pasar a través de la membrana

mientras los sólidos suspendidos van aumentando su concentración en el otro

lado de la membrana. El flujo tangencial al poro es comúnmente utilizado para la

concentración y purificación de proteínas y otras partículas biológicas de

suspensiones. La ultrafiltración es capaz de concentrar bacterias, proteínas como

la hemoglobina y constituyentes que tiene pesos moleculares mayores a 10,000

Daltons. La ultrafiltración es independiente de la carga de la partícula y es mas

concerniente con el tamaño de esta.” 55

2.5.4.1.2. Proceso de ultrafiltración

El proceso es llevado acabo en una unidad de ultrafiltración, que básicamente

consta de un medio mecánico que genera presión como bombas de

desplazamiento positivo y/o de vacío, y un ultraflitro el cual separa las fases. Esta

puede ser llevada acabo en una unidad de diálisis que debe ser bypaseada y

ningún tipo de solución de diálisis es puesta en contacto en contraflujo con la

solución a ultrafiltrar. El tamaño de poro del ultrafiltro depende en las propiedades

de la solución que es ultrafiltrada, y de que se quiere separar en esta solución, lo

cual depende del tamaño de la proteína o proteínas a concentrar.

55 http://www.osmonics.com/products/page835.htm y http://www.rpi.edu/dept/chem-

IQ-2003-02-08

72

2.5.4.2. Diálisis

2.5.4.2.1. Definición

“La diálisis es un proceso que separa electrolitos y coloides que se encuentran en

disolución, dependiendo de su velocidad de difusión a través de una membrana

semipermeable. La solución que debe ser dializada es introducida entre la

membrana semipermeable y los electrolitos pasan a través de la membrana que

retiene los coloides.” 56

2.5.4.2.2. Proceso de diálisis

Remover el exceso de reactivos es muy importante. Diálisis contra Lactato de

Ringer remueve glutaraldehido libre y el exceso de lisina, además que permite que

los electrolitos sean ajustados a condiciones y niveles fisiológicos57. El proceso de

diálisis es llevado acabo usando un tubo de membrana de diálisis, como los de

celulosa regenerada. Es recomendado permitir una buena relación superficie-

volumen para un adecuado proceso de diálisis, para esto, pequeños volúmenes,

por ejemplo 10 ml , son colocados en el tubo y dejados en diálisis por lo menos 3

horas, en este tiempo el dializado se equilibra con la solución de diálisis.

eng/BiotechEnviron/Projects00/memfilt/ultrafiltration.htm 56 Referencia 11 volume 4 pg 1207 57 Referencia 2 pg 31

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73

2.5.4.3. Electroforesis SDS-PAGE

2.5.4.4. Definición

“La base de la separación de proteínas con el procedimiento de SDS-PAGE, es

recubrir las proteínas con dodecil sulfato de sodio (sodium dodecyl sulfate) para

que todas las proteínas tengan una carga uniforme. Por lo tanto la separación es

dependiente de tamaño del complejo proteína - dodecil sulfato de sodio. Este

detergente aniónico se une fuertemente a la mayoría de proteínas a una razón de

1.4 mg SDS/mg de proteína, dándole a todas la proteínas una carga negativa. El

SDS interrumpe todos los enlaces no covalentes y causa que las moléculas se

desdoblen. Las partículas cargadas son forzadas a girar hacia el electrodo de

carga positiva bajo la influencia de un campo eléctrico aplicado externamente. Las

fuerzas generadas por el campo eléctrico son contrarrestadas por las

interacciones con la matriz de gel de poliacrilamida, que actúa como un tamiz. La

fuerza generada por el campo eléctrico y la fuerza opuesta generada por la matriz

de gel resultan en diferentes tasas de migración para las diferentes proteínas.

Para obtener un campo eléctrico con magnitud y dirección constante a través de

un volumen de espacio especifico, dos placas planas de metal son colocadas

paralelamente, como se indica en la figura 15. Cuando las terminales de una

terminal de poder con un voltaje V son conectadas a estos platos, como se indica

IQ-2003-02-08

74

en la figura, un campo eléctrico uniforme E es producido entre los platos. Afuera

de estos platos y cerca de los extremos el campo no es uniforme.

Figura 15. Diagrama de una electroforesis55

Por lo tanto, todas las proteínas recubiertas por SDS (cargadas negativamente),

migran hacia el ánodo a tasas inversamente proporcionales al logaritmo de su

peso molecular. Esto es:

donde r es la tasa de migración y PM es el peso molecular. Las proteínas de bajo

peso molecular migran mas rápido que las de mayor peso molecular. El peso

molecular es determinado por medio de comparación con estándares de peso

molecular.

)log(1PM

r =

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75

Generalmente la electroforesis en SDS-PAGE es realizado en geles horizontales.

Este tipo de electroforesis es un sistema discontinuo compuesto por dos geles

diferentes: un gel de separación o inferior y un gel superior o de apilamiento. Los

geles se funden con diferentes porosidades, pH’s y fuerzas iónicas.” 58

58 ntri.tamuk.edu/electrophoresis

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76

3. METODOLOGIA

3.1. Piridoxilación de la hemoglobina libre de estroma

La primera modificación realizada a la hemoglobina libre de estroma es la

piridoxilación, este proceso, como se explico anteriormente, mejora el P50 de la

hemoglobina libre de estroma entrecruzando intermolecularmente las dos

subunidades β de la hemoglobina formando un puente de fosfato entre ellas.

3.1.1. Materiales y equipo

3.1.1.1. Reactivos

• TRIS-HCl buffer (polvo)

• NaOH (pellets)

• Piridoxal 5’ fosfato (polvo)

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77

• Glucosa (polvo)

• Glutationa

• ácido ascórbico (polvo)

• Gas nitrógeno

• Borohidruro de sodio (polvo)

• HCl (liquido)

• Agua destilada

3.1.1.1.1. Equipo

• Balanza de peso

• pH-metro

• Flujómetro de nitrógeno conectado a un dispersor de burbujas por medio de

una manguera.

• Material de laboratorio como pipetas, vasos, erlenmeyers, vasos volumétricos

etc. Sus capacidades dependen de la cantidad de hemoglobina libre de

estroma a ser piridoxilada.

• Medidor de concentración de hemoglobina.

• Agitador magnético con su barra de agitación.

IQ-2003-02-08

78

3.1.2. Preparación de soluciones utilizadas

Además de la solución de hemoglobina libre de estroma, se necesita una solución

de NaOH 2 M, para ajustar el pH de la solución de hemoglobina al valor deseado.

Durante todo el proceso de piridoxilación y polimerización, se puede decir que

para una cantidad de 500 ml de hemoglobina libre de estroma, no mas de 30 ml

son necesarios generalmente. Por cada mililitro de NaOH 2 M a preparar se pesan

80 mg de NaOH y se añade agua hasta alcanzar un volumen de un mililitro. Se

recomienda trabajar con una solución de hemoglobina libre de estroma con una

concentración inicial de 18 g/dl, con el fin de que al terminar los procesos de

piridoxilación y polimerización la concentración final de hemoglobina este en 14.5

g/dl.

3.1.3. Proceso de piridoxilación

Todo el proceso debe ser llevado a cabo a 4°C, de lo contrario la formación de

metahemoglobina será marcada durante el proceso. La solución de hemoglobina

libre de estroma es agitada continuamente. Se mide la concentración de

hemoglobina con la ayuda de un medidor de concentración de hemoglobina total.

Por cada 100 ml de hemoglobina libre de estroma al 18% w/v, se añaden se

añaden 1.576 g de TRIS-HCl buffer para obtener una concentración final de 0.1 M.

Se ajusta el pH de la solución a 7.4 ya sea con NaOH, HCl o ácido láctico (este

IQ-2003-02-08

79

ultimo es preferible). Por cada gramo de hemoglobina presente en la solución, se

añaden 17.11 mg de piridoxal 5’ fosfato para obtener una relación molar de 4:1

con la hemoglobina (PM = 61986 Da). Se añade glucosa y glutationa hasta

obtener una concentración de 2 g/L, y de ácido ascórbico para obtener una

concentración de 1 g/L. Estos se añaden para minimizar la formación de

metahemoglobina. Se pueden añadir antibióticos para remover cualquier

contaminante, así: 50,000 unidades/L de penicilina, 50 mg/L de gentamicina y 50

mg/L de streptomicina para así garantizar la esterilidad. Se revisa nuevamente el

pH y se ajusta a 7.4, nuevamente con NaOH, HCl o ácido láctico. La solución de

hemoglobina se desoxigena por 2 horas, se debe tener cierta precaución, ya que

la hemoglobina produce espuma durante el proceso de desoxigenado. El enlazado

covalente de la hemoglobina con el piridoxal 5’ fosfato se lleva acabo añadiendo

12.206 mg de NaBH4 (96%) por cada gramo de hemoglobina presente en la

solución para obtener una razón molar de NaBH4 a hemoglobina de 20:1, diluido

en un volumen manejable pero mínimo de NaOH 0.001 M, que es preparado

diluyendo 2000 veces una parte de NaOH 2 M en agua destilada.

El burbujeo con nitrógeno se continua por otras 12 horas, para que la formación

del enlace entre la hemoglobina y el piridoxal 5’ fosfato se lleve acabo. En el

apéndice I se muestra un diagrama de flujo del proceso de piridoxilación.

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80

3.2. Polimerización de la hemoglobina libre de estroma piridoxilada

La segunda modificación realizada a la ahora hemoglobina libre de estroma

piridoxilada, es el entrecruzamiento intermolecular de los tetrámeros de

hemoglobina para formar una hemoglobina libre de estroma piridoxilada y

polimerizada (Poly-PLP-SFHb). Este proceso previene la dimerización de la

molécula de hemoglobina.

3.2.1. Materiales y equipo

3.2.1.1. Reactivos

• Glutationa

• L-lisina monoclorhidrato

• Buffer de fosfato (K2HPO4 y KH2PO4)

• Glutaraldehido (liquido al 25%)

• Agua destilada

3.2.1.2. Equipos

• Balanza de peso

• pH-metro

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81

• Agitador magnético con su barra de agitación.

• Equipo de laboratorio como pipetas, vasos, erlenmeyers etc. Sus capacidades

dependen de la cantidad de hemoglobina libre de estroma piridoxilada a

polimerizar.

• Medidor de concentración de hemoglobina

• Filtro de ultrafiltración y equipo de diálisis.

• Osmómetro

3.2.2. Preparación de las soluciones utilizadas

Las siguientes soluciones son preparadas, debido a que son necesarias durante el

proceso de polimerización.

3.2.2.1 Hemoglobina libre de estroma piridoxilada

Es recomendado trabajar con una solución de hemoglobina a una concentración

inicial de 16 g/dl de hemoglobina, que generalmente resulta después del proceso

de piridoxilación al iniciar con una concentración de hemoglobina libre de estroma

de 18 g/dl. De lo contrario, se puede ultrafiltrar o diluir la hemoglobina piridoxilada

a 16 g/dl o al final del proceso de polimerización se puede ultrafiltrar o diluir hasta

obtener una concentración de 14.5 g/dl, que es la concentración fisiológica de

hemoglobina.

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82

3.2.2.1.1. Solución de lisina

Esta solución es usada como agente regulador y como agente de terminación de

la polimerización. Un mililitro de esta solución se prepara como se describe a

continuación: se añaden 237.44 mg de L-lisina monoclorhidrato para obtener una

concentración final de 1.3 M, se añaden 87.09 mg de K2HPO4 y 68.04 mg de

KH2PO4 para obtener una concentración final de 0.5 M de buffer de fosfato y todo

se lleva a un volumen de 1 ml. Se ajusta el pH de esta solución a 7.4 adicionando

NaOH 2M, HCl o ácido láctico. Por cada 100 ml de hemoglobina al 16% w/v a

polimerizar, se necesitan 3.25 ml de la solución de lisina.

3.2.2.1.2. Solución de glutaraldehido

El glutaraldehido es el agente de polimerización que es utilizado. Esta solución se

prepara diluyendo una solución de glutaraldehido al 25% en un volumen igual de

buffer de fosfato 0.5 M. Un mililitros de la solución de glutaraldehido se prepara

como se describe a continuación: se añaden 43.54 mg de K2HPO4 y 34.02 mg de

KH2PO4 y se lleva a un volumen de 0.5 ml para obtener una concentración final de

buffer de 0.5 M con agua destilada. Se añaden 0.5 ml de la solución de

glutaraldehido al 25% y se obtienen de esta manera 1 ml de la solución de

glutaraldehido para polimerizar. Por cada 100 ml de hemoglobina al 16% w/v a

IQ-2003-02-08

83

polimerizar, se requieren 3.33 ml de la solucion de glutaraldehido, esto quiere

decir que por cada gramo de hemoglobina presente en la solución a polimerizar,

se necesitan 0.208 ml de la solución de glutaraldehido preparada anteriormente, lo

que resulta en una razón de hemoglobina a glutaraldehido de 1:16. El pH de la

solución se ajusta a 7.4 ya sea con HCl, NaOH o ácido láctico.

3.2.3. Proceso de polimerización

Todo el proceso es llevado acabo a 4°C, de lo contrario la formación de

metahemoglobina será marcada durante la reacción. La solución de hemoglobina

libre de estroma piridoxilada es agitada continuamente. Todas las cantidades

descritas a continuación se basan trabajando con 100 ml de la solución de

hemoglobina libre de estroma piridoxilada a una concentración inicial de

hemoglobina de 16 g/dl. Primero ajuste el pH de la solución de hemoglobina a 7.4

adicionando NaOH 2 M, HCl o ácido láctico y mida su osmolaridad. Luego añada

1.25 ml de la solución de lisina preparada anteriormente para obtener una razón

molar de hemoglobina a lisina de aproximadamente 17:107. Se añaden 150 mg de

glutationa para minimizar la formación de metahemoglobina y obtener una

concentración de 1.5 g/L. Se añade 3.3 ml de la solución de trabajo de

glutaraldehido, de una manera lenta, preferiblemente por goteo para evitar la

desnaturalización de la hemoglobina. La osmolaridad de la solución es medida

periódicamente hasta alcanzar el nivel isoosmótico de 300 mOsm/kg, usualmente

IQ-2003-02-08

84

este nivel es alcanzado en un periodo de 12 a 18 horas. Para terminar la reacción,

se añaden 2 ml de la solución de trabajo de lisina, para obtener una razón molar

de hemoglobina a lisina de aproximadamente 1:10 y se pasa directamente a

ultrafiltración y así retirar los reactivos en exceso que se tienen en la hemoglobina

libre de estroma polimerizada. Después se reconstituye el ultrafiltrado por medio

de diálisis contra lactato de Ringer por tres horas a 4°C. Esto remueve el exceso

de glutaraldehido y el exceso de lisina y permite que los electrolitos se ajusten a

condiciones y concentraciones fisiológicas. En el apéndice II se muestra un

diagrama de flujo del proceso de polimerización.

3.3. Evaluación de las propiedades físico-químicas de la hemoglobina

modificada.

3.3.1. Concentración de hemoglobina


Como se explico anteriormente, la hemoglobina es la proteína responsable de la

distribución de oxígeno a los tejidos. Alrededor de 23 ml de oxígeno por cada 100

ml de plasma son necesarios para lograr una adecuada oxigenación a los tejidos.

Basados en la capacidad de transporte de oxígeno de la hemoglobina, su

IQ-2003-02-08

85

concentración en el plasma debe estar dentro del rango de 13.5 a 17.5 g/dl en los

hombres y en el rango de 12 a 16 g/dl para las mujeres59. La concentración media

de hemoglobina en el plasma es de 14.7 g/dl. Su determinación se obtiene con

medidores de concentración de hemoglobina que la determinan por métodos

espectofotométricos.

3.3.2. Presión osmótica coloidal

3.3.2.1. Definición60

“La presión osmótica a través de una membrana es ejercida por un soluto

impermeable o inequilibrado. La presión necesaria para detener el movimiento

osmótico de agua a una solución, es conocido como presión osmótica”61. Bajo

condiciones fisiológicas, las proteínas del plasmas son los únicos solutos que no

pueden pasar velozmente a través de las paredes capilares. Por lo tanto, las

proteínas del plasma ejercen una presión osmótica coloidal conocida como

presión oncótica. Bajo condiciones fisiológicas, el efecto neto de la presión

oncótica es el movimiento del fluido dentro de los capilares.

59 Referencia 12 pg 48 60 Referencia 2 pg 35 61 Referencia 13 pg 160

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86

La concentración de proteína en el plasma es alrededor de 7 g/dl. La hemoglobina

dentro del glóbulo rojo se encuentra separada del plasma y no esta disuelta en

este. Por lo tanto, no ejerce presión oncótica.

La concentración de numero de partículas solubles decide la cantidad de presión

oncótica. Cada tetrámero de hemoglobina libre se comporta como una partícula.

Una molécula de hemoglobina libre de estroma piridoxilada y polimerizada

formada por partículas entre una a cuatro o mas hemoglobinas se comporta como

una partícula, debe ejercer una menor presión oncótica que los tetrámeros de

hemoglobina libres. En términos generales, 14 g/dl de hemoglobina libre de

estroma piridoxilada y polimerizada ejercen la misma presión oncótica que 7 g/dl

de hemoglobina libre. Son por lo tanto isooncóticas en el plasma, como las

sintetizadas en este trabajo.

3.3.2.2. Determinación

Durante los proceso de polimerización de la hemoglobina libre de estroma

polimerizada, el único soluto presente en la solución que ejerce una presión

osmótica coloidal significante es la hemoglobina. La presión isoosmótica del

plasma es alrededor de 300 mOsm/kg, y la de la sangre varia entre 275 y 295

mOsm/kg. Cuando la presión osmótica coloidal alcanza el punto isoosmótico, el

IQ-2003-02-08

87

proceso es detenido. Este se mide con la ayuda de un Osmómetro de punto de

congelación.

3.3.3. Densidad


Como es bien conocido, la densidad es la relación entre la masa y el volumen de

un cuerpo o una solución, esta representa la cantidad de masa presente por

unidad de volumen. La densidad de la sangre humana varia entre 1.40 y 1.85

g/cm3.62


La determinación de la densidad de la hemoglobina libre de estroma piridoxilada y

polimerizada o de cualquier otro fluido se realiza con la ayuda de un picnómetro,

este recipiente, generalmente fabricado de vidrio, es calibrado a un volumen

predeterminado al cual el picnómetro debe ser llenado con el fluido al cual la

densidad se quiere determinar. El picnómetro es pesado antes y después de ser

llenado con el fluido, la diferencia entre estas dos mediciones es la masa del fluido

62 Referencia 19

IQ-2003-02-08

88

que se encuentra dentro del picnómetro. Por lo tanto, la relación entre masa y

volumen del fluido determina su densidad.

3.3.4. P50


“La afinidad de la hemoglobina por el oxígeno es caracterizada con el P50. El P50

es la presión parcial de oxígeno a la cual la hemoglobina se encuentra saturada al

50%.

La hemoglobina se encuentra saturada al 100% a una pO2 de 108 mmHg63. El P50

mide la facilidad de la hemoglobina para descargar el oxígeno como es requerido

en los capilares que suplen los tejidos.

La hemoglobina dentro del glóbulo rojo tiene un P50 de alrededor de 26 mmHg” 64.

Una curva de disociación de oxígeno es útil para medir diferentes características

de las soluciones de hemoglobina, como el P50 (ver figura 15).

63 Referencia 12 64 Referencia 2 pg 23

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89

Figura15. Típica curva de disociación de oxígeno.65

3.3.4.2. Determinación66,67,68

Para obtener el P50 de cualquier solución de hemoglobina, como la hemoglobina

libre de estroma piridoxilada y polimerizada, una curva de disociación de oxígeno

debe ser obtenida. Para su obtención, la solución de hemoglobina debe ser

tonometrada con un gas con diferentes concentraciones de oxígeno y condiciones

estándares de pCO2 y temperatura (pCO2 = 40 mmHg y T= 37°C) y luego el pH el

65 Referencia 2 pg 24 66 Referencia 9 67 Referencia 10 68 Referencia 5

IQ-2003-02-08

90

pCO2 y el pO2 son medidos en un analizador de gases arteriales y corregidos a las

condiciones estándar de pH y pCO2 (pH = 7.4 y pCO2 = 40 mmHg).

3.3.5. Coeficiente de Hill


“El oxígeno se une cooperativamente a la hemoglobina debido a que la unión de

oxígeno a un monómero del tetrámero de la molécula de hemoglobina, facilita la

unión de mas oxígeno a los otros tetrámeros de la misma molécula. La razón para

este efecto es que durante la unión al oxígeno, el monómero del tetrámero de la

molécula de hemoglobina lleva acabo un cambio conformacional. Por lo tanto,

existe una comunicación entre los grupos hemo de toda la molécula de

hemoglobina.” 69

“La medida cuantitativa de la cooperatividad de la hemoglobina es el coeficiente

de Hill “n”. “n” se incrementa con el incremento de cooperatividad. El máximo valor

de “n” es el numero de sitios de unión al oxígeno en una molécula de

hemoglobina, que son en total cuatro, uno por cada monómero del tetrámero. Un

coeficiente de Hill n = 1 indica que no existe cooperatividad alguna entre los

69 Referencia 2 pg 25

IQ-2003-02-08

91

monómeros del tetrámero de la molécula de hemoglobina. Para la sangre, es

coeficiente de Hill es alrededor de n = 2.8.”57

3.3.5.2. Determinación70

El coeficiente de Hill se determina a partir de la curva de disociación de oxígeno a

condiciones estándar de pH = 7,4 pCO2 = 40 mmHg y T = 37°C, con la ecuación

de Hill:

Donde %sat es el porcentaje de saturación de oxígeno a una pO2 fijada.

Varios puntos de cada lado del P50 de la curva de disociación de oxígeno, son

acomodados a la ecuación de Hill por medio de una regresión lineal. La pendiente

de esta regresión indica el coeficiente de Hill de la solución de hemoglobina

analizada.

3.3.6. pH


70 Referencia 9

502 loglog%100

%log PnpOnsat

sat−=⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛

−

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92

El pH indica la concentración de iones hidrogeno en una disolución, por lo que

mide la acidez de una disolución. El pH se defino como:

Donde [H+] es la concentración de hidrogeno en moles/L71. El pH de la sangre esta

en el rango entre 7.35 y 7.4572.


La determinación se realiza normalmente con la ayuda de un pHimetro, que

realiza la medición de pH basándose en la conductividad de la disolución

3.3.7. Efecto de Bohr


“La habilidad de la hemoglobina de liberar oxigeno se ve afectada por el pH, CO2 y

por las diferencias en la concentración de oxigeno entre los pulmones y los tejidos.

El pH en los tejidos es considerablemente mas bajo (mas ácido) que en los

71"pH", Enciclopedia Microsoft® Encarta® 98 © 1993-1997 Microsoft Corporation. 72 Referencia 12 pg 76

[ ]+−= HpH log

IQ-2003-02-08

93

pulmones. Se generan protones por la reacción entre dióxido de carbono y agua

para formar bicarbonato:

+− +→+ HHCOOHCO 322

Esta acidez funciona para dos propósitos. El primero, es que los protones

disminuyen la afinidad de la hemoglobina por el oxigeno, permitiendo una

liberación mas fácil en los tejidos. Cuando las cuatro moléculas de oxigeno se

liberan, la hemoglobina se une con dos protones, ayudando a mantener el

equilibrio hacia el lado derecho de la ecuación. Este efecto se conoce como el

efecto de Bohr, y es vital para remover el dióxido de carbono como desecho,

debido a que el CO2 es muy poco soluble en el plasma., pero el ion bicarbonato es

mucho mas soluble y puede ser transportado hacia los pulmones. Si la

hemoglobina no pudiera unirse a los dos protones, el equilibrio se desplazaría

hacia la izquierda, y el dióxido de carbono no podría ser removido.

En los pulmones el efecto trabaja en la dirección opuesta. En la presencia de altas

concentraciones de oxigeno, la afinidad por los protones decrece y estos son

liberados, el equilibrio de la reacción se desplaza hacia la izquierda y se forma

CO2 como gas insoluble que es expulsado al exterior a través de los pulmones.

La afinidad de la hemoglobina por el oxígeno se ve modificada por el pH y la

concentración de dióxido de carbono. Bajo condiciones fisiológicas, la disminución

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94

del pH aumenta el P50 y la curva de disociación de oxígeno es desplazada hacia la

derecha (ver figura 13). El incremento de dióxido de carbono sin modificación del

pH también desplaza la curva de disociación de oxígeno a la derecha. Esta

propiedad de desplazamiento hacia la derecha causada por disminución de pH o

incremento de dióxido de carbono es conocida como el efecto de Bohr. Esto tiene

una importante significancia fisiológica. Tejidos activos como un músculo en

contracción, libera mayores cantidades de dióxido de carbono y ácido, por lo que

el efecto de Bohr le permite a la hemoglobina descargar mas oxígeno, el cual es

requerido por tejidos activos.” 73


“El efecto de Bohr es determinado ajustando el pH de las muestras tonometradas

a condiciones estándar (pCO2 = 40 mmHg, T = 37°C) con la ayuda de un ácido

como el ácido láctico o el ácido clorhídrico, o una base como es hidróxido de

sodio, y después obteniendo la curva de disociación de oxígeno como se explico

anteriormente, en un rango de pH entre 6 y 8. Una grafica de log P50 vs. pH es

obtenida y la pendiente de esta curva representa el efecto de Bohr.” 74

73 Referencia 2 pg 25 74 Referencia 9

IQ-2003-02-08

95

3.3.8. Viscosidad


“La viscosidad es la propiedad de los fluidos a oponerse a su sentido flujo cuando

una fuerza es aplicada a este. La fuerza con la cual una capa de fluido en

movimiento se arrastra con su capa adyacente determina la viscosidad del fluido.

Basados en la teoría molecular, cuando un fluido se mueve influenciado por la

gravedad, las moléculas de las capas estacionarias tienen que cruzar una frontera

o limite para entrar en la región de flujo. Una vez que este limite es cruzado, estas

moléculas reciben energía de las moléculas en movimiento y empiezan a fluir. Al

mismo tiempo, las moléculas que se encuentran en la capa de movimiento

transmiten un impulso a las molécula estacionarias. El resultado global es que el

fluido reduce su velocidad, y el fluido estacionario empieza a fluir, y las capas en

movimiento adquieren una velocidad media.

Para mantener una capa de fluido en movimiento a una mayor velocidad que otra

capa, es necesario aplicar una fuerza continua. La viscosidad en poises es

definida como la magnitud de la fuerza necesaria para mantener en equilibrio una

IQ-2003-02-08

96

diferencia de velocidad de 1 cm/s entre capas separadas por un centímetro. La

viscosidad es medida con la ayuda de un equipo llamado viscosímetro.” 75


La determinación de la viscosidad de la Poly-PLP-SFHb se realiza con la ayuda de

un viscosímetro Brookfield modelo DV-III. El protocolo para la utilización de este

equipo se describe a continuación.

3.3.8.2.1. Materiales y equipos

• Jeringas desechables

• Guantes quirúrgicos

• Agua destilada

• Agua

• Toallas absorbentes

• Computador con software Rheocalc V2.3: Rheometer #1.

• Viscosímetro Brookfield modelo DV-III

• Baño de Temperatura Controlada modelo TC-101

• Kit de Spindle SC4-18 con su recipiente y tapa

75"Viscosidad", Enciclopedia Microsoft® Encarta® 98 © 1993-1997 Microsoft Corporation.

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97

3.3.8.2.2. Encendido de Equipos

3.3.8.2.2.1. Encendido del Viscosímetro

Accionar el interruptor localizado en la parte posterior del viscosímetro; La pantalla

mostrará el nombre y modelo del viscosímetro de la siguiente manera: Brookfield

Rheometer Model DV-III.

Iniciar el computador después de encender el viscosímetro y esperar hasta que se

encuentre bajo ambiente Windows. Activar el software Rheocalc V2.3: Rheometer

#1, navegando por las ventanas auxiliares, con ayuda del mouse o del teclado,

como indica el protocolo de la figura 16:

Figura 16. Protocolo para activar el software Rheocalc V2.3: Rheometer #1

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98

3.3.8.2.2.2. Encendido del baño de temperatura controlada

Encender el baño de temperatura usando dos interruptores: el primero ubicado en

la parte posterior del controlador y el segundo en la parte frontal. Accionar primero

el interruptor de la parte posterior y luego el de la parte frontal.

3.3.8.2.3. Montaje de la muestra en el viscosímetro

3.3.8.2.3.1. Montaje de la muestra en el recipiente

Colocar en el recipiente del Spindle SC4-18 el fluido a trabajar, la cantidad

aproximada de fluido debe ser de 5 ml.

3.3.8.2.3.2. Montaje Spindle en el recipiente

Después de haber agregado el fluido a trabajar, colocar el Spindle SC4-18 en el

recipiente.

3.3.8.2.3.3. Montaje del recipiente en el viscosímetro

Insertar el recipiente con el Spindle y la muestra dentro un cilindro que tiene un

pin. El pin asegura que el recipiente con el Spindle y la muestra, no se caigan del

IQ-2003-02-08

99

montaje. Introducir el recipiente por la parte inferior del cilindro hasta que la

ranura de dicho recipiente encaje con el pin.

3.3.8.2.4. Condiciones de trabajo

3.3.8.2.4.1. Temperatura de trabajo

En el controlador de temperatura encontrado en baño de temperatura, oprimir el

botón SET/ENTER y con la perilla, graduar la temperatura deseada. Oprimir

nuevamente SET/ENTER y esperar a que el tablero muestre la temperatura

establecida. Esta temperatura tiene un rango de variación entre 0.1 a 0.4 ºC

aproximadamente.

Para realizar las mediciones del fluido, esperar de 15 a 25 minutos, de esta

manera, la muestra en el recipiente adquirirá la temperatura establecida por el

baño de temperatura y las mediciones serán más confiables.

Conectar el cable de temperatura del viscosímetro a la celda del recipiente del

Spindle. Donde va la muestra para llevar el registro de temperatura de dicha

muestra.

IQ-2003-02-08

100

3.3.8.2.4.2. Unidades de trabajo

En el menú dashboard del software en uso, seleccionar las unidades de

temperatura y las unidades de medición. Con el botón izquierdo del mouse pulsar

en la opción para escoger las unidades de temperatura (Temperature Units),

repitiendo el mismo procedimiento para escoger las unidades de medición

(Measurements Units).

Figura 17. Menú Dashboard

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101

3.3.8.2.5. Inicialización del viscosímetro

Con ayuda del mouse, hacer clic en la opción de inicializar (zero) del menú

dashboard. Esta opción se encuentra ubicada en la parte inferior izquierda en

recuadro blanco como esta indicado en menú dashboard que se muestra en la

figura 17.

3.3.8.2.6. Ensamble del Spindle

3.3.8.2.6.1. Unión del Spindle con el soporte

El Spindle va unido a un soporte que a su vez es acoplado al mecanismo de

rotación del viscosímetro. Efectuar la unión entre el soporte y el Spindle por medio

de un adaptador.

3.3.8.2.6.2. Unión del soporte con el mecanismo de rotación

El mecanismo de rotación se encuentra localizado en la parte inferior del tablero

del viscosímetro y es el encargado de hacer girar el Spindle a las diferentes

revoluciones que necesite; es un adaptador con rosca externa que se une con el

soporte del Spindle. Esta unión debe efectuarse por medio de roscado ya que el

soporte tiene una rosca interna.

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102

3.3.8.2.6.3. Colocación de la tapa

Terminado el montaje, colocar una tapa. La tapa permite que no entre ningún

agente externo, como se puede ver en la figura 18.

Figura 18. Montaje del viscosímetro

3.3.8.2.7. Implementación del programa

En el menú programs se encuentran los diferentes parámetros para cargar el

programa. Ver figura 19.

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103

Figura 19. Menú programs

3.3.8.2.7.1. Organización de los parámetros en el programa

Los parámetros para correr el programa son seis en total y deben colocarse en el

siguiente orden: 1. SSN, 2. LSC, 3. WTI, 4. DSP, 5. SSI y 6. LEC.

3.3.8.2.7.2. Significado de los parámetros escogidos

Los significados de los parámetros escogidos son los siguientes:

• SSN: Indica la velocidad de arranque.

• LSC: Indica el número de intervalos.

• WTI: Indica el tiempo de cada intervalo.

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104

• DSP: Toma la medida en cada intervalo.

• SSI: Indica el incremento de velocidad por intervalo.

• LEC: Finaliza el conteo y comienza una nueva corrida.

De los parámetros escogidos, LEC y DSP son parámetros fijos que no pueden

variar, en cambio, los otros parámetros varían dependiendo el tipo de fluido a

analizar.

3.3.8.2.7.3. Parámetros del programa

En el menú programs que se encuentra en la figura 19, en la parte superior

derecha del menú se encuentra la lista de los diferentes parámetros necesarios

para correr el programa que realiza las mediciones. En la parte superior izquierda

del menú programs, se encuentra un panel al cual se llevan los parámetros de la

lista. Para llevar estos parámetros, con ayuda del mouse, pulsar en el parámetro

escogido y nuevamente con el mouse, pulsar en el comando de insertar (insert)

que se encuentra en la parte superior derecha del panel.

En caso de haber cometido un error insertando un parámetro diferente u ordenado

de otra manera, con el mouse, seleccionar el parámetro equivocado en el

recuadro y luego, con el mouse nuevamente, pulsar en el comando para borrar

(delete) que se encuentra debajo del comando de insertar localizado en el panel.

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105

3.3.8.2.8. Corrida del programa

Después de cargar el programa, en el menú programs se presenta la opción de

guardar save, esta opción sirve para grabar el programa en la memoria del

computador. Después de grabar, en el menú dashboard se encuentra la opción de

correr el programa (run) para que el programa comience a correr.

Para volver a cargar el programa sin necesidad de volver a repetir los pasos

anteriores, en el menú programs se encuentra la opción de cargar (load). Con el

mouse hacer clic en load y de esta manera llamar el programa que se guardó

anteriormente.

En el instante que empieza a correr el programa el viscosímetro también corre.

3.3.8.2.9. Finalización de la corrida

3.3.8.2.9.1. Recolección de los datos obtenidos

Cuando el programa termine de correr, dirigirse al menú view/edit donde

aparecen todos los datos en forma de tabla como se ve en la figura 20. En este

menú se encuentran todos los valores calculados a las distintas velocidades

utilizadas en la corrida del programa. Los datos que aparecen después de

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106

realizarse las mediciones, se pueden guardar en el computador, exportándolos a

Excel. Para exportar los datos, en el menú view/edit en la parte inferior, localizar el

comando de exportar (export) y con el mouse pulsar en este comando; se

grabarán dichos datos.

Con estos datos se pueden hacer graficas para estudiar el comportamiento del

fluido del punto de vista grafico, Y el análisis el comportamiento del fluido desde

un punto de vista matemático, además muestra la confiabilidad de las mediciones

realizadas.

Figura 20. Menú view/edit

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107

3.3.8.2.9.2. Gráficas

En el menú plot mostrado en la figura 21, en la parte derecha se observa un

cuadro el cual tiene coordenadas X, Y. En la parte izquierda del cuadro se

encuentran dos recuadros especificando los parámetros del eje X y Y. Estos

parámetros pueden variar dependiendo el tipo de gráfica que se quiera estudiar.

Para seleccionar el tipo de gráfico con el mouse se pulsa en el recuadro amarillo

tanto para el eje X como para él Y, y se seleccionan los parámetros a medir

pulsando con el Mouse sobre dicho parámetro.

El software hace las gráficas automáticamente al realizar la primera corrida,

cuando se cambian los parámetros de la gráfica también sé gráfica

automáticamente. Para una nueva corrida, en la parte inferior del menú se

encuentra la opción de graficar nuevamente (replot), con el mouse pulsar sobre la

opción y automáticamente hace la gráfica. Para graficar con otros parámetros se

hace el procedimiento anterior, dado que al usar la función de graficar nuevamente

quedan los valores de la corrida nueva.

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108

Figura 21. Menú plot

3.3.8.2.9.3. Análisis

En el menú analysis mostrado en la figura 22. En este menú aparece en la parte

de derecha un cuadro con coordenadas X, Y, en la parte superior izquierda se

encuentran diferentes tipos de modelos matemáticos que son utilizados para

analizar el comportamiento del fluido estudiado. En parte inferior izquierda se

observa el cuadro de los resultados obtenidos después de realizar el análisis. Para

el análisis con el mouse se escoge el modelo a utilizar pulsando sobre él círculo

que aparece al lado izquierdo del modelo. Ya escogido el modelo nuevamente con

el mouse pulsando en la opción calcular (calculate).

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109

Los modelos son escogidos dependiendo el tipo de fluido utilizado, y los

resultados del análisis se muestran en una gráfica que muestran el

comportamiento del fluido, muestra la viscosidad promedio y el intervalo de

confianza de la muestra.

Figura 22. Menú Analysis

3.3.8.2.9.4. Corrida nueva

En caso de ser necesarias nuevas corridas para el programa, se presenta la

opción en el menú programs; con el mouse, pulsando en la opción run; este

proceso puede repetirse varias veces. Los criterios para realizar nuevas corridas

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110

dependen del tipo de estudio realizado al fluido. Si se quiere estudiar el

comportamiento estadístico de una muestra para su caracterización se deben

realizar varias corridas.

3.3.8.2.10. Factores que afectan las pruebas

3.3.8.2.10.1. Tipos de fluidos

El tipo de fluido es un factor muy importante dado que no todos los fluidos tienen

el mismo comportamiento.

3.3.8.2.10.2. Temperatura

La temperatura de trabajo depende mucho del fluido, hay fluidos que a ciertas

temperaturas cambian su estructura molecular y por lo tanto las pruebas pueden

resultar no válidas.

Cuando se trabaja con temperaturas mayores a la temperatura ambiente (27ºC),

las condiciones ambientales de las instalaciones no resultan relevantes, sin

embargo, si se va a trabajar a temperatura ambiente, las instalaciones deben tener

temperatura controlada, para que los cambios bruscos no afecten las mediciones.

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111

3.3.8.2.10.3. Número de corridas

Este factor depende del tipo de fluido y de la temperatura a la cual se trabaja ya

que, en fluidos como la sangre, si se hacen muchas corridas, teniendo en cuenta

la temperatura a la que se realizan las mediciones, se va solidificando, cambiando

bruscamente la medición.

3.3.8.2.11. Finalización de la medición

3.3.8.2.11.1. Cierre del programa

Al terminar las mediciones en cualquiera de los menús, en la parte inferior

derecha, se encuentra la opción de salir del programa (exit). Al hacer clic con el

mouse en esta opción, el software se cierra automáticamente.

3.3.8.2.11.2. Apagado de los equipos

Después de haber cerrado el software, apagar los equipos; para apagar el baño

de temperatura, accionar primero el interruptor de la parte frontal del controlador,

luego el interruptor ubicado en la parte posterior del controlador de temperatura

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112

Para apagar el viscosímetro, accionar el interruptor ubicado en la parte posterior.

Con los equipos debidamente apagados, efectuar la limpieza.

3.3.8.2.12. Limpieza del Viscosímetro

3.3.8.2.12.1. Retiro del recipiente

Para retirar el recipiente, primero se retira la tapa que cubre el recipiente del

Spindle, luego desenroscar el soporte que se conecta al mecanismo de rotación y

retirar de la celda el cable de temperatura. Luego, desencajar el recipiente del pin

que tiene el cilindro y sacarlo por la parte inferior.

3.3.8.2.12.2. Retiro de la muestra

Luego de retirar el recipiente, sacar el Spindle del recipiente y colocarlo en papel

de secar; retirar la muestra utilizada con una jeringa desechable y volverla a

colocar en su envase de almacenamiento original.

3.3.8.2.13. Lavado de los implementos

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113

Para lavar el recipiente es necesario el uso de jeringas desechables para que no

entre agua en la celda del recipiente del Spindle. Después de limpiar el interior de

este recipiente se seca con toallas absorbentes

Colocar el Spindle en un recipiente lleno de agua y enjuagar hasta que quede

totalmente limpio; secar con toallas absorbentes.

3.3.8.2.14. Normas para colocar y retirar la muestra

Para la colocación y el retiro de la muestra es necesario utilizar siempre los

guantes quirúrgicos, lo mismo en el momento en que se están lavando los

implementos.

3.4. Determinación de la cinética de polimerización

La determinación de la cinética de polimerización de la Poly-PLP-SFHb se realiza

haciendo un seguimiento al cambio o aumento de peso molecular durante el

tiempo que se encuentra reaccionando con el agente de polimerización utilizado,

que para este caso es el glutaraldehido. Para mirar el cambio en la velocidad de

reacción dependiente del pH, se realizan polimerizaciones a diferentes pH

variando entre 6 y 8, donde la hemoglobina conserva su estructura cuaternaria.

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114

3.4.1. Preparación de los lotes de polimerización

Se preparan cuatro lotes de 100 ml de hemoglobina libre de estroma piridoxilada,

cada lote se prepara siguiendo la metodología propuesta en el numeral 3.2,

adicionando 1.576 g de TRIS-HCl para obtener una concentración final de 0.1 M.

Con la ayuda de NaOH, HCl o ácido láctico (este ultimo es preferible) para llevar el

pH de dos lotes a 6 y el pH de los otros dos lotes a 8. El proceso de polimerización

se continua como se describe en el numeral 3.2, excepto que la solución de

glutaraldehido también debe ser llevada a pH 6 u 8 con la ayuda de NaOH, HCl o

ácido láctico, dependiendo del lote al que vaya a ser adicionado respectivamente.

Al iniciar la adición de la solución de glutaraldehido, se inicia el conteo de tiempo

de polimerización. Cada lote es polimerizado durante 12 horas.

3.4.2. Muestreo

Para determinar la cinética de polimerización en el tiempo, es necesario tomar

muestras periódicas de la solución de hemoglobina que se encuentra

polimerizando a un pH determinado.

Se realizan polimerizaciones de los cuatro diferentes lotes durante 12 horas y se

toma una muestra cada hora, deteniendo la polimerización en la muestra con la

adición de exceso de solución de lisina 1.3 M. En viales con capacidad de 1.5 ml

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115

se adicionan 0.6 ml de lisina 1.3 M y se adicionan 0.6 ml de la muestra de

hemoglobina para detener la polimerización. Estos viales son agitados y

conservados a 4°C.

3.4.3. Electroforesis SDS-PAGE

3.4.3.1. Preparación de los patrones de peso molecular

Los patrones de peso molecular deben ser diluidos y desnaturalizados con la

ayuda de un buffer. Su preparación se describe a continuación en la tabla 5.

Tabla 5. Reactivos para la preparación del buffer de la muestra Reactivo Cantidad

Agua desionizada 3.8 ml Tris-HCl 0.5 M pH 6 1.0 ml Glicerol 0.8 ml SDS 10% (W/V) 1.6 ml 2-mercaptoetanol 0.4 ml Azul de bromofenol 1% (w/v) 0.4 ml

El patrón de peso molecular se diluye 4:1 en el buffer, con el fin de obtener una

concentración de proteínas de aproximadamente 0.25 g/L. Luego los patrones de

peso molecular son calentados a 95°C durante 4 minutos. Se recomienda seguir

las instrucciones del proveedor de peso molecular a utilizar para la preparación de

los patrones.

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116

3.4.3.2. Preparación del gel de poliacrilamida al 7.5%

Para la preparación de 5 ml de gel al 7.5%. Con el cual se forma el gel donde se

realiza la corrida se necesitan los reactivos que se describen a continuación en la

tabla 6. La poliacrilamida es una sustancia toxica, por lo tanto se recomienda el

uso de guantes de cirugía y mascara.

Tabla 6. Reactivos para la preparación del gel de poliacrilamida al 7.5% Reactivos Cantidad

Agua bidestilada 2.42 ml Tris – HCl 1.5 M pH 8.8 1.25 ml SDS 10% (w/v) 50 µl Solución de acrilamida/bisacrilamida al 30% 1.25 ml Persulfato de amonio 10% (recién preparado) 25 µl TEMED 10 µl

Una vez agregado el TEMED, el gel debe ser colocado rápidamente entre las

laminas de vidrio.

3.4.3.3. Preparación de del stacking gel al 4%

El stacking gel, es el gel que se utiliza para armar el “recipiente” donde se

adicionan las muestras que van a ser corridas en la electroforesis. En la tabla 7 se

describen los reactivos necesarios para la preparación de este gel.

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117

Tabla 7. Reactivos para la preparación del stacking gel Reactivo Cantidad

Agua bidestilada 1.6 ml Ttris-HCl 0.5 M, pH 6.8 625 µl SDS 10% (W/V) 25 µl Acrilamida + Bisacrilamida (30 g + 1.6 g)/100 ml - 375 µl Persulfato de amonio 10% (recién preparado) 21 µl TEMED 28 µl

Este gel debe ser colocado encima del gel de poliacrilamida al 7.5% y se coloca la

peineta que forma los pozos donde se coloca la muestra de proteína a correr. Se

debe esperar 30 min a que este gel se endurezca.

3.4.3.4. Preparación del buffer de la muestra

Las muestras de hemoglobina polimerizada deben ser diluidas y desnaturalizadas

con un buffer. Su preparación se describe a continuación en la tabla 8.

Tabla 8. Reactivos para la preparación del buffer de la muestra Reactivo Cantidad

Agua desionizada 3.8 ml Tris-HCl 0.5 M pH 6 1.0 ml Glicerol 0.8 ml SDS 10% (W/V) 1.6 ml 2-mercaptoetanol 0.4 ml Azul de bromofenol 1% (w/v) 0.4 ml

Las muestras se encuentran inicialmente a una concentración de 8 g/dl

aproximadamente, ya que se diluyo la Poly-PLP-SFHb, que se encontraba a 16

g/dl durante el proceso de polimerización, y se diluyeron en un volumen igual de

lisina 1.3 M para detener la polimerización, como se describe en el numeral 3.4.2.

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118

Las muestras se diluyen 80:1 con agua destilada para obtener una concentración

de hemoglobina de 1 g/L, y luego se diluyen 4:1 con el buffer para obtener una

concentración final de 0.25 g/L. Las muestras son calentadas a 95°C durante 4

minutos.

3.4.3.5. Preparación del buffer de corrida

El buffer donde se genera el campo eléctrico se prepara como se describe a

continuación en la tabla 9.

Tabla 9. Reactivos para la preparación del buffer de corrida Reactivo Cantidad

Glicina 14.4 g Trizma base 3.03 g SDS al 20% 5 ml Agua desionizada completar a 1000 ml

En el gel de poliacrilamida se colocan en cada pozo 20 µl de muestra y se dejan

dos carriles donde se adiciona 20 µl de patrón de peso molecular. Luego la

cámara se tapa y se verifica el color de los electrodos para que el campo eléctrico

tenga el sentido correcto de flujo. Se aplica el buffer de corrida cubriendo los

electrodos y se coloca el sistema a 18 mA constantes hasta que las muestras

lleguen al final del gel.

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119

3.4.3.6. Fijación de las proteínas

Una vez terminada la electroforesis, se sumergen los vidrios con el gel durante 5

minutos en la solución de fijado ( metanol, agua, ácido acético 25:75:7) luego con

ayuda de una micro-espátula se despegan los vidrios y se libera el gel en la

solución y se deja allí por más de 1 hora.

3.4.3.7. Tinción de proteínas

Después de la fijación, se sumerge el gel en solución de azul de coomassie al

0.2% durante media hora. (Se disuelven 0.2 g de azul de coomassie en 50 ml de

metanol , 5 ml de ácido acético glacial y se lleva a 100 ml con agua destilada).

3.4.3.8. Decoloración del gel

Se sumerge el gel coloreado en solución de ácido acético al 10% y 30% de

metanol. La solución se cambia unas 3 o 4 veces hasta obtener una buena

coloración.

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120

3.4.4. Determinación del peso molecular promedio

Para la determinación del peso molecular se utiliza el software Quantity One de

BIO-RAD. La polihemoglobina sigue una curva de distribución desde hemoglobina

tetramérica hasta pesos moleculares mas altos. La determinación del peso

molecular promedio se realiza calculando un promedio ponderado con cada

fracción de hemoglobina que se genera en el gel de SDS-PAGE. El Software

calcula la fracción de cada peso molecular por densidad óptica y por el área de la

banda que se este analizando y genera una curva de distribución de peso

molecular. Luego, conociendo el peso molecular de las diferentes bandas, ya que

todas son múltiplos de el peso molecular de una sola molécula de hemoglobina

(62,000 Da) se puede determinar el peso molecular, al multiplicar el peso

molecular de la banda correspondiente por su fracción. Un ejemplo de esta

determinación se muestra en la tabla 10.

Tabla 10. Calculo de peso molecular promedio Peso Molecular fracción Peso ponderado

744000 10% 74400434000 23% 99820248000 39% 96720124000 21% 2604062000 7% 4340

TOTAL 100% 301320

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121

3.4.4.1. Abrir la imagen

Se selecciona la opción de “open” en el file menu o se presiona el icono de “open”

en los file commands como se muestra a continuación en la figura 23.

Figura 23. Barra principal

Luego le aparecerá la ventana de “open dialog box”, donde se escoge la imagen

del gel que va a analizar y se presiona el icono de “open” para cargar la imagen.

Esta ventana se muestra a continuación en la figura 24.

Figura 24. Ventana “open dialog box”

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122

3.4.4.2. Definir los carriles

Después de escanear el gel, y cargar la figura escaneada del gel en el software, lo

primero que hay que hacer el definir los carriles que se encuentran en el gel. Los

carriles pueden ser generados por el mismo software con la ayuda del con la

ayuda del icono “Auto Frame Lanes” como se muestra en la figura 25.

Figura 25. Auto Frame Lanes

El gel va a quedar marcado junto con sus carriles como se muestra en la figura 26.

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123

Figura 26. Característica de los Frame Lanes

3.4.4.3. Definir las bandas

Después de definir los carriles, se deben definir las bandas. Para identificar las

bandas, se utiliza la herramienta de detección de bandas, como se muestra en la

figura 27.

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124

Figura 27. Menu da bandas y barra de herramientas de bandas

Se selecciona la opción o se prime el botón de detección de bandas, y se abre

automáticamente el dialogo de detección de bandas, como se muestra en la figura

28.

Figura 28. Dialogo de detección de bandas

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125

Y se presiona el icono de detectar, así el software identificara las bandas en el gel.

3.4.4.4. Generar distribución de densidad

Para obtener el dato de distribución de densidad de las bandas y poder calcular la

fracción a la que cada banda corresponde sobre el 100% del carril, se selecciona

la banda que se quiere analizar y se la opción de atributos de banda del menu de

banda de la barra de herramientas y se abre automáticamente el dialogo de

atributos como se muestra en la figura 29.

Figura 29. Dialogo de atributos de banda

Se selecciona la opción de “Relative Qty” y se presiona OK, y aparecerá la

fracción que tiene la banda seleccionada con respecto a todo el carril.

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126

Al realizar este procedimiento con todas las bandas se tiene la fracción

correspondiente a cada banda de cada carril, y se puede calcular el peso

molecular promedio ponderado como se explico anteriormente.

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127

4. RESULTADOS

4.1. Piridoxilación de la hemoglobina libre de estroma

El proceso es llevado acabo a 4°C, con la ayuda de un pequeño refrigerador, en

donde se pueden introducir el vaso de reacción y el agitador magnético. Las

soluciones utilizadas en este proceso fueron mantenidas previo a la piridoxilación

a esta misma temperatura para evitar cambios bruscos de temperatura. La

desoxigenación fue llevada acabo por medio de una manguera de látex que

transportaba el oxígeno dentro del refrigerador al vaso de reacción, como se

muestra en la figura 30.

IQ-2003-02-08

128

Figura 30. Representación esquemática del proceso de piridoxilación.

Siguiendo el método de preparación descrito en el numeral 4.1, 485 ml de

hemoglobina libre de estroma preparados previamente como se describe en la

referencia 4 fueron utilizados.

TRIS-HCl buffer (Applichem GmbH) fue añadido como polvo hasta obtener una

concentración de 0.1 M. Como es bien conocido, la molaridad se define como:

Entonces, para 485 ml de hemoglobina libre de estroma, 0.0485 moles de TRIS-

HCl buffer eran necesarios, el peso molecular del TRIS-HCL buffer es de 157.6

litromolesMolaridad =

IQ-2003-02-08

129

g/mol con una pureza del 99.5%, por lo que la cantidad de TRIS-HCL necesarios

en gramos fueron:

En una balanza de peso, 7.667 g de TRIS-HCl buffer fueron pesados, y esto fue

añadido a la solución de hemoglobina libre de estroma.

después, el pH de la solución fue medido tres veces con la ayuda de un pHimetro,

con una media de 6.5 y una desviación estándar de 8,54x10-2, que da un intervalo

de confianza del 95% de 6.50 ± 0.14, calculado con una prueba estadística t-

student de dos grados de libertad.

El pH de la solución debía ser llevado a un pH fisiológico de 7.4, con la adición de

NaOH 2 M (Merck & Co. Inc.). 30 ml de esta solución fueron preparados. Para

obtener una concentración de 2 M, 0.06 moles fueron necesarias:

El peso molecular del NaOH es de 40 g/mol, por lo que la cantidad necesaria en

gramos de NaOH fue:

( ) gpurezapureza

molesmol

ggTRIS 682,7

%5,99%100

0485,06,157][ =⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛⎟⎠⎞

⎜⎝⎛=

moleslitrosMvolumenmolaridadmoles 06,0)03,0)(2())(( ===

( ) gmolesmolg

gNaOH 4,206,040][ =⎟⎠⎞

⎜⎝⎛=

IQ-2003-02-08

130

En una balanza de peso, 2.391 g de NaOH fueron pesados y puestos en un vaso

volumétrico de 100 ml. Luego se adiciono agua destilada hasta la marca de 30 ml.

Esta solución de NaOH va a ser utilizada durante los procesos de piridoxilación,

polimerización y obtención de curvas de disociación de oxígeno, que serán

explicados posteriormente.

Con la ayuda de una pipeta, volúmenes de 0.5 ml fueron añadidos hasta que el pH

de la solución de hemoglobina libre de estroma estuviera alrededor de 7.4. Un

total de 4.5 ml de NaOH fueron necesarios. El pH fue medido tres veces dando un

pH medio de 7.42 con una desviación estándar de 4,51x10-2, que da un intervalo

de confianza de 7.42 ± 0.07, calculado con una prueba estadística t-student de

dos grados de libertad.

La concentración de hemoglobina fue medida con la ayuda de un medidor de

concentración de hemoglobina (β-hemoglobina Test System, Hemocue) dando un

valor de 10.0 g/dl. Esto significa que en el volumen total de 485 ml de hemoglobina

libre de estroma había 48.5 g de hemoglobina, como el peso molecular de la

hemoglobina es de 64,459 g/mol, el numero total de moles presentes se pudo

calcular como sigue:

( ) molesx

molgg

WMHb

Hbhemoglobin

gramsmoles

41052,7/458,64

5,48..

−===

IQ-2003-02-08

131

Piridoxal 5’ fosfato monohidratado (Applichem GmbH) debía ser añadido a la

solución de hemoglobina a una razón molar de piridoxal a hemoglobina de 4:1. Por

lo tanto, las moles de piridoxal 5’ fosfato monohidratado necesarias son cuatro

veces las de hemoglobina presente, estas son 3x10-3 moles. El peso molecular del

piridoxal 5’ fosfato es 265.16 g/mol con una pureza del 98%, por lo que la cantidad

de piridoxal 5’ fosfato monohidratado necesario es:

En una balanza de peso, 0.816 g de piridoxal 5’ fosfato fueron pesados y luego

añadidos a la solución de hemoglobina libre de estroma. El pH fue nuevamente

medido dando como resultado una media de 6.97 con una desviación estándar de

3,94x10-2, que da un intervalo de confianza de 6.97 ± 0.07, calculado con una

prueba estadística t-student de dos grados de libertad.

Esta solución fue nuevamente llevada a un pH de 7.4 con la adición de NaOH 2 M

preparado anteriormente, dando como resultado un pH de 7.39 con una

desviación estándar de 3.4 x 10-2, que da un intervalo de confianza de 7.39 ± 0.06,

calculado con una prueba estadística t-student de dos grados de libertad.

La hemoglobina libre de estroma ya con el piridoxal 5’ fosfato añadido, fue

desoxigenada durante dos horas con la ayuda de gas nitrógeno (AGA FANO S.A.)

( ) gpurezapureza

molesmol

ggpyridoxal 814,0

%98%100

003,016,265][ =⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛⎟⎠⎞

⎜⎝⎛=

IQ-2003-02-08

132

como se muestra en la figura 14. Durante la desoxigenación, espuma es

producida, por lo que la solución debe ser continuamente agitada para reducir los

niveles de espuma.

Para lograr la unión del piridoxal 5’ fosfato a la hemoglobina, NaBH4 (Applichem

GmbH) debe ser añadido a una razón molar de NaBH4 a hemoglobina de 20:1,

como se calculo anteriormente, por lo tanto, 1.50x10-2 moles de NaBH4 son

necesarios. El peso molecular del NaBH4 es de 37.83 g/mol con una pureza del

96%. La cantidad de NaBH4 necesario en gramos se puede calcular:

En una balanza de peso 0.602 g fueron pesados y fueron diluidos en 3 Ml de

NaOH 0.001 M, que fueron preparados añadiendo 1.5 µL de NaOH 2 M en 3 ml de

agua destilada. Esto fue añadido a la solución de hemoglobina libre de estroma

El burbujeo con nitrógeno fue continuado por 10 minutos adicionales, para poder

dejar este proceso sin ningún tipo de vigilancia, y debido a la falta de un sistema

para controlad la espuma formada, la manguera de látex fue localizada de tal

manera que el nitrógeno entrara en contacto superficial con la solución de

hemoglobina libre de estroma, pero que en ningún momento entrara en contacto

( ) gpurezapureza

molesxmol

ggNaBH 591,0

%96%100

105,183,37][ 24 =⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛⎟⎠⎞

⎜⎝⎛= −

IQ-2003-02-08

133

con esta, como se muestra en la figura 31. Este proceso se dejo por otras 18

horas adicionales para permitir la unión covalente del piridoxal 5’ fosfato a la

hemoglobina.

Figura 31. Proceso de desoxigenación realizado con nitrógeno para prevenir la formación de

espuma en la solución de hemoglobina libre de estroma. La manguera es colocada justo encima de

la superficie de la solución.

4.2. Ultrafiltración de la hemoglobina libre de estroma piridoxilada

después del proceso de piridoxilación, la concentración de hemoglobina fue

medida tres veces con la ayuda del medidor de concentración de hemoglobina,

dando una media de 6.4 y una desviación estándar de 5,8x10-2, que da un

intervalo de confianza de 6.4 ± 0.11, calculado con una prueba estadística t-

student de dos grados de libertad. Para el proceso de polimerización, la

concentración de hemoglobina en la solución debe estar alrededor de 16 g/dl, por

lo que un proceso de ultrafiltración es necesario. Este proceso fue llevado acabo

IQ-2003-02-08

134

en un equipo de hemodiálisis Baxter modelo 1550 con un filtro de ultrafiltración C-

110 de Baxter (Este equipo fue facilitado por RTS Ltda. en asociación con la

Fundación Cardio-infantil). El equipo fue bypaseado, para que ninguna solución

dializante entrara en contacto con la solución de hemoglobina libre de estroma

piridoxilada, y las líneas arterial y venosa fueron colocadas en el mismo reservorio

con el fin de formar un circuito cerrado, como se muestra en la figura 32.

Figura 32. Proceso de ultrafiltración en circuito cerrado realizado a la hemoglobina libre de estroma

piridoxilada.

IQ-2003-02-08

135

El equipo de diálisis es programado para que retire la cantidad necesaria de

kilogramos de agua por hora y así la presión transmembrana es ajustada

automáticamente y se programa el tiempo total de ultrafiltrado. Durante este

proceso especifico de ultrafiltración, el equipo no puedo controlar de manera

adecuada la cantidad de agua retirada, debido al pequeño volumen que fue

ultrafiltrado, y burbujas de aire se crearon en el circuito cerrado. Aunque el agua a

ser retirada programada, era el necesario para llevar la concentración de

hemoglobina a 18 g/dl, la concentración final de hemoglobina tenia una media de

24.5 con una desviación estándar de 2,08x10-1 , y dando un intervalo de confianza

de 24.5 ± 0.35 g/dl, calculado con una prueba estadística t-student de dos grados

de libertad. El volumen final fue de 105 ml, y se diluyo a 160 ml con la adición de

lactato de Ringer, para obtener una concentración final de 16.0 ± 0.4 g/dl a un

nivel de confiabilidad del 95%, calculado con una prueba estadística t-student con


4.3. Polimerización de la hemoglobina libre de estroma piridoxilada

El proceso fue llevado acabo a 4°C, con la ayuda de un pequeño refrigerador. Las

soluciones utilizadas durante el proceso de polimerización fueron preparadas con

anterioridad y fueron almacenadas a esta misma temperatura, para evitar choques

IQ-2003-02-08

136

térmicos al ser adicionadas a la solución de hemoglobina libre de estroma

piridoxilada.

Del proceso de ultrafiltración, la hemoglobina libre de estroma piridoxilada tiene un

volumen de 160 ml y una concentración de 16.0 ± 0.4 g/dl a un nivel de

confiabilidad del 95%, calculado con una prueba estadística t-student de dos

grados de libertad.

Siguiendo el proceso de polimerización descrito en el numeral 4.4, primero, la L-

lisina monohidroclorato (Merck & Co. Inc.) fue preparada. Para los 160 ml de

hemoglobina libre de estroma piridoxilada, un volumen total de 32 ml fueron

necesarios. Por cada mililitro de solución de lisina, 239.84 mg de lisina son

necesarios para obtener una concentración final de 1.3 M, por lo que un total de

7.675 g fueron necesarios. En una balanza de peso 6.678 g fuero pesados en un

vaso de vidrio. Luego el buffer de fosfato debe ser añadido. Por cada mililitro de

solución de lisina, 87.09 mg de K2HPO4 y 68.04 mg de KH2PO4 son necesarios

para dar una concentración final de 0.5 M. En una balanza de peso, 87.12 mg de

K2HPO4 y 68.14 mg de KH2PO4 fueron pesados en el mismo vaso donde se

encuentra la lisina. Luego, este vaso fue llevado a un volumen final de 32 ml

añadiendo agua destilada. El pH fue medido dando un valor de 6.37, por lo que 5

ml de NaOH 2M debieron ser añadidos para dar al final un pH con 7.35 y

IQ-2003-02-08

137

desviación estándar de 0,02 obteniendo un intervalo de confianza al 95% de 7.35

± 0.034, calculado con una prueba estadística t-student de dos grados de libertad.

Luego la solución de trabajo de glutaraldehido debía ser preparada. Para los 160

ml de solución de hemoglobina libre de estroma piridoxilada, se necesitan 5.3 ml.

El glutaraldehido debe ser diluido en un buffer de fosfato, 461.58 mg de K2HPO4 y

360.61 mg de KH2PO4 deben ser añadidos a este volumen para obtener una

concentración final de buffer de 0.5 M, en una balanza de peso 0.463 g de K2HPO4

y 0.363 mg de KH2PO4 fueron pesados y 3.8 ml de agua destilada fueron añadidos

con pipeta. 1.3 ml de glutaraldehido al 50% fueron medidos en una pipeta y

añadidos a la solución de buffer. El pH fue medido dando una media de 7.41 con

una desviación estándar de 0.02, obteniendo un intervalo de confianza al 95% de

7.35 ± 0.034, calculado con una prueba estadística t-student con dos grados de

libertad.

A la solución de hemoglobina libre de estroma piridoxilada se le midió el pH dando

un valor de 7.1, por lo que 2 ml de NaOH 2 M fueron añadidos dando un pH con

media de 7.37 y desviación estándar de 0.03, obteniendo un intervalo de confianza

del 95% de 7.37 ± 0.05, calculado con una prueba estadística t-student de dos

grados de libertad.

IQ-2003-02-08

138

La osmolaridad de la solución de hemoglobina libre de estroma piridoxilada fue

medida tres veces con la ayuda de un Osmómetro (ONE-TEN osmometer, Fiske),

dando una media de 727 mOsm/kg y una desviación estándar de 8 mOsm/kg,

IQ-2003-02-08

139

ultrafiltración. La solución de hemoglobina libre de estroma fue ultrafiltrada como

se describe en el numeral 5.2 para eliminar el exceso de reactivos. En la tabla 11,

se muestra el comportamiento del descenso de la osmolaridad durante la reacción

y en la figura 33 estos datos están graficados.

Tabla 11. medición de osmolaridad

durante el proceso de polimerización

Tiempo [h] Osmolaridad [mOsm/kg]

0 727

1 712

2 704

3 691

4 662

5 647

6 616

7 587

8 553

9 497

10 472

11 395

12 352

13 338

14 312

IQ-2003-02-08

140

300350400450500550600650700750

0 2 4 6 8 10 12 14

Tiempo [h]

Osm

olar

idad

[mO

sm/k

g]

Figura 33. Comportamiento de la osmolaridad durante el proceso de polimerización de la

hemoglobina libre de estroma piridoxilada vs. el tiempo de la reacción.

después de realizar el proceso de ultrafiltración, con la modificación de añadir

cada media hora 200 ml de lactato de Ringer tres veces, para lavar la solución de

hemoglobina libre de estroma piridoxilada y polimerizada, se midió la

concentración de hemoglobina dando una concentración media de 22 g/dl con una

desviación estándar de 0.4 con un intervalo de confianza del 95% de 22 ± 0,7 g/dl

calculado con una prueba estadística t-student de dos grados de libertad, con un

volumen final de 99 ml. La solución de hemoglobina libre de estroma piridoxilada y

polimerizada fue diluida a una concentración final de 14.5 g/dl ml con la adición de

51 ml de lactato de Ringer.

IQ-2003-02-08

141

4.4. Diálisis de la hemoglobina libre de estroma piridoxilada y polimerizada

El proceso final realizado a la hemoglobina libre de estroma piridoxilada y

polimerizada es una diálisis contra lactato de Ringer. Este proceso ayuda a

remover el glutaraldehido y la lisina que se encuentran en exceso que no

reaccionaron durante el proceso de polimerización y no fueron removidas durante

la ultrafiltración, y su eliminación es muy importante. Además, este proceso de

diálisis permite ajustar los electrolitos a condiciones y concentraciones fisiológicas

normales.

El proceso es llevado acabo a 4°C, y la solución dializadora es lactato de Ringer

(Baxter Laboratories) a esa misma temperatura. El volumen total de hemoglobina

libre de estroma piridoxilada y polimerizada es de 150 ml, por lo que se divide este

volumen en 6 volúmenes parciales de 20 ml y uno final de 30 ml. La membrana de

acetato de celulosa regenerada (Fisher Scientific) es preparada para que todos los

restos de sulfuro y metales pesados sean retirados, como se describe en el

“Ensayo sensitivo de pretratamiento de la membrana”, que se encuentra en el

boletín instructivo. Por cada 20 ml de hemoglobina libre de estroma piridoxilada y

polimerizada, 16 cm de membrana son utilizados, esta longitud permite que la

membrana sea sellada en sus extremos con la ayuda de grapas plásticas, y se

necesitan 2 L de lactato de Ringer. Este proceso es llevado acabo por tres horas

por lo menos, que garantiza que ocurra el equilibrio electrolítico. Al final del

IQ-2003-02-08

142

proceso de diálisis la hemoglobina libre de estroma piridoxilada y polimerizada

tenia una concentración con media de 14.5 g/dl y desviación estándar de 0.4 con

un intervalo de confianza del 95% de 14.5 ± 0.7 g/dl y un pH con media de 7.166 y

desviación estándar de 0.0224 con un intervalo de confianza del 95% de 7.166 ±

0.184, ambos datos calculados con una prueba estadística t-student de dos

grados de libertad.

4.5. Evaluación de las propiedades físico-químicas de la hemoglobina

libre de estroma piridoxilada y polimerizada

4.5.1. Curvas de disociación de oxígeno

Para la evaluación del P50, el coeficiente de Hill y el efecto de Bohr, curvas de

disociación de oxígeno de la hemoglobina libre de estroma piridoxilada y

polimerizada debían ser obtenidas. Estas curvas fueron descritas anteriormente en

el numeral 4.3.4.1

4.5.1.1. Equipos y reactivos

• Agitador magnético con su barra de agitación y control de temperatura

• Analizador de gases arteriales

IQ-2003-02-08

143

• Jeringas

• Tanques de gas calibrado con pCO2 = 40 mmHg, y pO2 con rangos desde 0

mmHg hasta 100 mmHg balanceados en nitrógeno.

• solución de NaOH 2M.

• HCl 2 M.

4.5.1.2. Soluciones utilizadas

Las soluciones de NaOH 2 M y HCL 2 M utilizadas anteriormente serán utilizadas

durante este procedimiento, para variar el pH de la solución de hemoglobina libre

de estroma piridoxilada y polimerizada a los valores deseados, para la

determinación del efecto de Bohr, coeficiente de Hill y p50.

4.5.1.3. Gases calibrados

Os gases calibrados que fueron utilizados fueron obtenidos de Oxígenos de

Colombia S.A. Un total de seis tanques con composiciones conocidas de oxígeno

y pCO2 = 40 mmHg balanceados en nitrógeno fueron solicitados. La tabla 12

resumen la información de la composición solicitada y la composición entregada

en tanques de 1 m3.

IQ-2003-02-08

144

Tabla 12. Gases de calibración balanceados en nitrógeno76

OXÍGENO DIOXIDO DE CARBONO

PORCENTAJE presión [mmHg] Porcentaje presión [mmHg] Tanque Teórico Real Teórico Real Teórico Real Teórico Real

1 1.32 1.35 10.03 10.26 5.26 5.30 40 40.28

2 1.77 1.85 13.45 14.06 5.26 5.18 40 39.37

3 2.24 2.25 17.02 17.10 5.26 5.34 40 40.58

4 2.70 2.77 20.52 21.05 5.26 5.30 40 40.28

5 3.16 3.21 24.02 24.40 5.26 5.27 40 40.05

6 3.68 3.68 27.97 27.97 5.26 5.25 40 39.90

4.5.1.4. Procedimiento para la obtención de las curvas de disociación de

oxígeno

Debido a que la determinación de efecto de Bohr se necesitan curvas de la

solución de hemoglobina libre de estroma piridoxilada y polimerizada a diferentes

pH’s, tres soluciones fueron preparadas. Se uso una solución con el pH obtenido

después del proceso de diálisis, esta tiene una media de 7.166 con una desviación

estándar de 0.2044 dando un intervalo de confianza del 95% de 7.166 ± 0.1502.

Otras dos muestras fueron preparadas, una con pH medio de 6.961 y desviación

estándar de 0.1016 dando un intervalo de confianza del 95% de 6.961 ± 0.0746 y

otra con media de 6.824 con desviación estándar de 0.1378 dando un intervalo de

76 Ver apéndice III para los análisis de cromatografía realizados por Oxigenos de Colombia S.A.

IQ-2003-02-08

145

confianza del 95% de 6.824 ± 0.1012, todas calculadas con una prueba estadística

t-student de dos grados de libertad. Estas fueron preparadas adicionando HCl 2 M.

Luego, cada una de las tres soluciones fue colocada en el agitador magnético. El

control de temperatura fue programado a 50°C, y la temperatura fue revisada

constantemente con la ayuda de un termómetro de mercurio para mantenerla a

37°C.

Cada una de las tres muestras de hemoglobina libre de estroma piridoxilada y

polimerizada fue tonometrada con los seis gases calibrados por 10 minutos con

cada tanque, empezando con el tanque de menor concentración de oxígeno y

cambiando el tanque hasta que el ultimo con la mayor concentración de oxígeno

fue burbujeado. Después de 10 minutos de burbujeo con cada tanque, con la

ayuda de una jeringa, una muestra del fondo del recipiente fue tomada e

inmediatamente tapada para prevenir el contacto directo con oxígeno, debido a

que la concentración de oxígeno en el aire es mucho mayor que la concentración

de cualquiera de los seis tanques, y la difusión de oxígeno en la hemoglobina es

muy alta, por lo que podía ganar oxígeno del aire modificando la concentración de

oxígeno conocida y los resultados de saturación de oxígeno serian incorrectos.

IQ-2003-02-08

146

El pO2, pCO2, pH y concentración de hemoglobina de cada una de las muestras

fue medida con la ayuda de un analizador de gases arteriales (Blood Gas Analyzer

BMG 1312, Instrumentation Laboratory).

El resultado de pCO2 medido con el analizador de gases arteriales era diferente de

las condiciones estándares de los tanques de gas calibrados, por lo que cada

muestra debió ser normalizada a la condición estándar de pCO2 = 40 mmHg. El

proceso de normalización se realizo de la siguiente manera: si el resultado de

pCO2 medido por el analizador de gases arteriales era de 32 mmHg y el pO2

medido era de 45 mmHg, para normalizarlos fueron multiplicados por un factor de

corrección definido por:

Para este ejemplo, un factor de corrección de 1.25 es usado, por lo que las

presiones normalizadas son:

Para determinar la desviación estándar de la población, para la primera muestra

medida, se realizaron tres repeticiones dando una desviación estándar

normalizada de 1.42, esto se muestra en la tabla 13.

medidopCOmmHgFC

,2

40.. =

mmHgpOmmHgpCO

onormalizad

onormalizad

25.5640

,2

,2

=

=

IQ-2003-02-08

147

Tabla 1377. Determinación de la desviación estándar (Todas la

presiones en mmHg)

Repetición pCO2 pO2,hemoglobina

Factor de normalización pCO2 pO2,hemoglobina

1 34.9 25 1.15 40 28.65

2 36.7 24 1.09 40 26.16

3 35 25 1.14 40 28.57

desviación estándar 1.42

Por lo que para cada muestra tonometrada y analizada, el intervalo de confianza

del 95% para la pO2 es de ± 2.4, calculado con una prueba estadística t-student de


Para determinar el porcentaje de saturación de oxígeno de la hemoglobina, se

asumió que a 108 mmHg en nivel de saturación de la hemoglobina era del 100%78.

Por lo que para determinar el porcentaje de saturación de cada muestra una

simple regla de tres es necesaria.

Todos estos cálculos se resumen en la tabla 14, tabla 15 y tabla 16.

77 ver Apendice III 78 Referencia 12

IQ-2003-02-08

148

Tabla 1479. solución de hemoglobina libre de estroma piridoxilada y

polimerizada a un pH = 7.166 (todas la presiones en mmHg)

normalización

Muestra pO2,gas pH pCO2 pO2,hemoglobina Factor de normalización pCO2 pO2,hemoglobina % sat O2

Tanque 1 10.26 6.583 30.4 20 ± 2.4 1.32 40 26.32 ± 2.4 24.37 ± 2.2

Tanque 2 14.06 6.805 60.2 59 ± 2.4 0.66 40 39.20 ± 2.4 36.30 ± 2.2

Tanque 3 17.1 7.123 51.4 64 ± 2.4 0.78 40 49.81 ± 2.4 46.12 ± 2.2

Tanque 4 21.052 7.684 54.1 79 ± 2.4 0.74 40 58.41 ± 2.4 54.08 ± 2.2

Tanque 5 24.396 7.677 51.8 90 ± 2.4 0.77 40 69.50 ± 2.4 64.35 ± 2.2

Tanque 6 27.968 7.125 42 83 ± 2.4 0.95 40 79.05 ± 2.4 73.19 ± 2.2



normalización


Tanque 1 10.26 6.886 35.53 22 ± 2.4 1.13 40 24.77 ± 2.4 22.93 ± 2.2

Tanque 2 14.06 7.115 53 41 ± 2.4 0.75 40 30.94 ± 2.4 28.65 ± 2.2

Tanque 3 17.1 6.816 54.7 52 ± 2.4 0.73 40 38.03 ± 2.4 35.21 ± 2.2

Tanque 4 21.052 6.786 66.2 78 ± 2.4 0.60 40 47.13 ± 2.4 43.64 ± 2.2

Tanque 5 24.396 7.344 67.2 98 ± 2.4 0.60 40 58.33 ± 2.4 54.01 ± 2.2

Tanque 6 27.968 6.820 46.1 81 ± 2.4 0.87 40 70.28 ± 2.4 65.08 ± 2.2



normalización


Tanque 1 10.26 7.114 50.6 28 ± 2.4 0.79 40 22.13 ± 2.4 20.49 ± 2.2

Tanque 2 14.06 6.548 47.1 32 ± 2.4 0.85 40 27.18 ± 2.4 25.16 ± 2.2

79 Ver apendice IV 80 Ver apendice V 81 Ver apendice VI

IQ-2003-02-08

149

Tanque 3 17.1 6.548 47.9 37 ± 2.4 0.84 40 30.90 ± 2.4 28.61 ± 2.2

Tanque 4 21.052 6.550 55.3 54 ± 2.4 0.72 40 39.06 ± 2.4 36.17 ± 2.2

Tanque 5 24.396 7.093 58.3 72 ± 2.4 0.69 40 49.40 ± 2.4 45.74 ± 2.2

Tanque 6 27.968 7.092 63.9 90 ± 2.4 0.63 40 56.34 ± 2.4 52.16 ± 2.2

De estas tablas, se grafican las tres curves de disociación de oxígeno (ver figura

34).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920212223242526272829

pO2 [mmHg]

%sa

t O2

pH = 7.166

pH = 6.961

pH = 6.824

Figura 34. Curvas de disociación de oxígeno de la hemoglobina libre de estroma piridoxilada y

polimerizada a diferentes pH’s.

4.5.2. Efecto de Bohr

El efecto de Bohr fue determinado por el ajuste de pH realizado a las tres

muestras de hemoglobina libre de estroma piridoxilada y polimerizada que fueron

tonometradas con los tanques de gas calibrados.

IQ-2003-02-08

150

El P50 para cada curva de pH fue determinado de las curves de disociación de

oxígeno de la figura 18, trazando una línea al nivel de saturación de 50% y

hallando el correspondiente valor de pO2 cuando se intercepta con las curvas de

pH, este punto representa el P50 para cada valor de pH (Ver tabla 17).

Tabla 17. P50 para los diferentes valores de pH de las curves de disociación de oxígeno para la

determinación del efecto de Bohr.

pH P50 log P50

7.166 ± 0.1502 19 ± 2.2 1.28

6.961 ± 0.0746 23.2 ± 2.2 1.37

6.824 ± 0.1012 26.7 ± 2.2 1.43

Luego, una grafica del log P50 vs. pH fue construida y la pendiente de esta recta

(∆log P50/∆pH) representa el efecto de Bohr82, como se puede ver en la figura 35.

1.001.101.201.301.401.50

6.8 6.85 6.9 6.95 7 7.05 7.1 7.15 7.2

pH

Log

p50

Figura 35. Determinación del efecto de Bohr en la hemoglobina libre de estroma piridoxilada y

polimerizada.

82 Referencia 9

IQ-2003-02-08

151

Se realizo una regresión lineal y la ecuación resultante fue:

Para calcular el intervalo de confianza del efecto de Bohr, se utilizo la definición de

la pendiente de la recta obtenida por regresión lineal:

Donde para este caso “x” representa el pH, “y” representa el log P50 y “n”

representa el numero de datos acomodados en la regresión.

Recordando la propagación de error, cuando dos valores diferentes son

multiplicados o divididos, el error total se define como:

Y el porcentaje de error se define como:

9998.0

3692.44313.02

50

=

+−=

R

pHLogP

−−

−=−

−

−=

∑ ∑∑ ∑ ∑

XbYy

nx

x

nyx

xyslope

int

)( 22

2 22

21 %%% valorvalortotal errorerrorerror +=

valorxerrorerror 100)(% =

IQ-2003-02-08

152

Y cuando los valores son sumado o restados, el error total es simplemente la raíz

cuadrada de la suma de los errores al cuadrado.

En la tabla 18 se puede ver el error y el porcentaje de error para cada valor.

Tabla 18. Error y porcentaje de error para diferentes valores

usados en la determinación de efecto de Bohr.

pH error %error P50 error %error log P50 error %error

7.166 0.1502 2.096 19 2.2 11.579 1.28 0.14806621 11.5789474

6.961 0.0746 1.0717 23.2 2.2 9.4828 1.37 0.12948593 9.48275862

6.824 0.1012 1.483 26.7 2.2 8.2397 1.43 0.11754025 8.23970037

Finalmente, el error total del efecto de Bohr se puede calcular y el intervalo de

confianza del 95% para el coeficiente de Bohr es [-0.40,-0.47], calculado con una

prueba estadística t-student.

Para el calculo de intercepto “y”, Y = 1.36 y X = 6.984, por lo que el intervalo

donde el intercepto “y” debe estar localizado es [4.1535, 4.6423].

4.5.3. Coeficiente de Hill

El coeficiente de Hill se calculo de la curva de disociación de oxígeno a un pH =

7.166, que fue el pH resultante después del proceso de diálisis de la hemoglobina

libre de estroma piridoxilada y polimerizada, con la ayuda de la ecuación de Hill:

IQ-2003-02-08

153

Primero, el P50 fue calculado como se describe en el numeral 4.5.2, y se obtuvo un

valor de 19 ± 2.2 mmHg. Luego, un punto a cada lado del P50 en la curva de

disociación de oxígeno fue acomodado mediante una regresión lineal a la

ecuación de Hill, la pendiente de esta recta representa el coeficiente de Hill para la

solución de hemoglobina libre de estroma piridoxilada y polimerizada (ver tabla

19).

Tabla 19. Determinación del coeficiente de Hill

pO2 % sat log (s/1-s) log pO2 log P50 n

17.1 46.12 -0.07 1.23 1.28 1.48

21.052 54.08 0.07 1.32 1.28 1.60

El coeficiente de Hill resultante, tiene una media de 1.54 con una desviación

estándar de 0.0848, obteniendo un intervalo de confianza del 95% de 1.54 ±

IQ-2003-02-08

154

4.5.4. pH

El pH fue medido a las seis muestras de la solución de hemoglobina libre de

estroma piridoxilada y polimerizada con la ayuda del analizador de gases

arteriales, y se obtuvo un pH con media de 7.166 con desviación estándar de

0.224, y se obtuvo un intervalo de confianza del 95% de 7.166 ± 0.184, calculado

con una prueba estadística t-student de 5 grados de libertad. El pH del plasma se

encuentra en un intervalo de confianza del 95% de 7.40 ± 0.0583.

4.5.5. P50

El P50 de la solución de hemoglobina libre de estroma piridoxilada y polimerizada

se calculo extrapolando el valor de P50 obtenido en el pH = 7.166 con la ayuda del

efecto de Bohr a las condiciones fisiológicas de pH = 7.4. Para obtener un P50

máximo y un P50 mínimo, la extrapolación se realizo con los valores máximo y

mínimo del efecto de Bohr y el intercepto “y” de la regresión lineal, con la que el

efecto de Bohr fue calculado (ver numeral 4.5.2.). El valor máximo del P50 se

obtiene con el valor máximo del efecto de Bohr, y los mismo se realizo con el valor

mínimo, esto dio como resultado:

83 Referencia 12 pg 76.

IQ-2003-02-08

155

4.5.6. Viscosidad

Las mediciones de viscosidad fueron realizadas con la ayuda de un viscosímetro

(Digital Viscometer model DV-II, Brookfield), con un disco numero 6 y a una

velocidad constante de 100 rpm a 25°C. Primero, se calculo la viscosidad del agua

bajo estas mismas condiciones, y se obtuvo como resultado una media de 11.6 cp

con una desviación estándar de 0.2 y un intervalo de confianza del 95% de 11.6 ±

0.9 cp a 25°C, calculado con una prueba estadística t-student de 2 grados de

libertad. A esta temperatura, se encuentra en la literatura que la viscosidad real

del agua es de 0.9 cp84. Por lo tanto, se puede calcular el factor de corrección con

al ecuación que se describe a continuación:

077.06.119.0.. ===

cpcpCF

medida

real

υυ

84 www.pump.net

mmHgP

mmHgP

ypHBohrP

6,1610

6,1510

int))((log

6423,4)4,7)(47,0(50

1535,4)4,7)(4,0(50

50

==

==

−+=

+−

+−

IQ-2003-02-08

156

Luego se midió la viscosidad de cada muestra de la solución de hemoglobina libre

de estroma piridoxilada y polimerizada, y se corrigió con el factor de corrección

descrito anteriormente. Estos resultados se muestran en la tabla 20.

Tabla 20. Viscosidad de la solución

de hemoglobina libre de estroma

piridoxilada y polimerizada @ 25°C

viscosidad [cp] normalizada [cp]

70 5.43

60 4.66

60 4.66

70 5.43

Esto da como resultado una viscosidad con media de 5.05 con desviación

estándar de 0.444 y un intervalo de confianza del 95% de 5.05 ± 0.523 cp,

calculada con una prueba estadística t-student de tres grados de libertad.

4.6. Determinación de la cinética de polimerización

Se prepararon cuatro lotes de polimerización, cada uno de 100 ml de hemoglobina

libre de estroma piridoxilada que había sido preparada y almacenada a 4ºC meses

antes. Cada lote tenia una concentración media hemoglobina de 16 g/dl con una

desviación estándar de 0.165, lo que da una intervalo de confianza del 95% de

16.00 ± 0.28 g/dl, calculado con una prueba estadística t-student de dos grados de

IQ-2003-02-08

157

libertad. En la tabla 21 se resumen los datos de pH de los cuatro lotes, calculados

con una prueba t-student de dos grados de libertad al 95%.

Tabla 21. pH's de los diferentes lotes de polimerización

LOTE pH 1 6.06 ± 0.03 2 6.12 ± 0.04 3 7.94 ± 0.03 4 7.92 ± 0.05

Las diferentes soluciones de polimerización fueron preparadas como se describe

en el numeral 3.2. Los cuatro lotes fueron polimerizados por un tiempo de 12

horas, empezando el conteo de tiempo cuando se añade inicialmente la solución

de glutaraldehido, aunque este es añadido por goteo durante la primera media

hora para evitar desnaturalización de la solución de hemoglobina libre de estroma

piridoxilada.

Siguiendo el método de electroforesis SDS-PAGE descrito en el numeral 3.4.3 se

prepararon cinco geles de corrida de diez carriles cada uno, junto con las

muestras de hemoglobina polimerizada y los patrones de peso molecular. Se

utilizaron dos patrones de peso molecular, uno de Bio-Rad que varia entre 16,000

– 240,000 Da y otro de Sigma-Aldrich que varia entre 100,000 – 500,000 Da. El

primer patrón se corrió en el carril 1 y el segundo patrón en el carril 6. Una imagen

de uno de los geles se muestra a continuación en la figura 36.

IQ-2003-02-08

158

Figura 36. Corrida en SDS-PAGE de Poly-PLP-SFHb

Como se puede ver en la figura 36, en los carriles donde se corrieron las muestras

de la Poly-PLP-SFHb, no se marca ningún tipo de peso molecular, y las corridas

muestran que la proteína que se esta corriendo tiene un peso molecular promedio

de 48,000 Da, lo cual es totalmente falso, ya que la hemoglobina tiene un peso

molecular de 62,000 Da. Esto mismo sucedió con los otros cuatro geles de

electroforesis, donde se corrieron las muestras de los cuatro lotes de

polimerización.

Inicialmente se pensó que este resultado se debía a que el glutaraldehido que se

estaba utilizando como agente de polimerización tenia fecha de vencimiento de

IQ-2003-02-08

159

octubre del 2002. Se consiguió glutaraldehido con fecha de vencimiento de

octubre 2004, pero los resultados fueron los mismos. Se piensa que la razón para

este resultado es la hemoglobina piridoxilada utilizada no este en las condiciones

adecuadas y probablemente este dimerizada y desnaturalizada por lo que no se

puede polimerizar. Esta conclusión se da por el resultado de las electroforesis, que

muestran rastros de proteína por debajo de los 48,000 Da, y que únicamente

podría ser hemoglobina dimerizada que tiene un peso molecular de 31,000 Da.

Desafortunadamente por cuestiones de tiempo no se pudo purificar y piridoxilar un

nuevo lote de hemoglobina, por lo que la cinética de la polimerización de la

hemoglobina libre de estroma piridoxilada no se pudo determinar.

Es de igual manera interés del departamento de ingeniería química, del grupo de

ingeniería biomédica y de este investigador, determinar la cinética de

polimerización, la cual será desarrollada en próximos meses a la publicación de

esta tesis.

IQ-2003-02-08

160

5. DISCUSION

5.1. Evaluación de las propiedades físico-químicas de la hemoglobina libre

de estroma piridoxilada y polimerizada

5.1.1. Comparación con otros autores

La comparación de los resultados obtenidos se hizo con los resultados obtenidos

en los trabajos de los autores Chang85, Sehgal86, y Alza Corporation87. Los

resultados de estos tres autores se muestran el la tabla 22.

85 Referencia 2 86 Referencia 9 87 Referencia 7

IQ-2003-02-08

161

Tabla 22. Resultados de las características de la hemoglobina libre de estroma

piridoxilada y polimerizada de diferentes autores.

autor Parámetro Chang Sehgal Alza Corporation Este trabajo

presión osmótica [mOsm/kg] 312 280-310 300 357 ± 13

Coeficiente de Hill 1.88 1.5-2 1.16-1.92

Efecto de Bohr -0.33 y -0.2 -0.40 y -0.47

P50 [mmHg] 15-18 14-16 22 15.6-16.6

pH 7.3-7.4 7.35-7.45 7.1 6.98-7.35

viscosidad [cp] 4.5 4.53-5.57

densidad[gr/cm3] 0.9-1.3

5.1.1.1. Presión osmótica

El resultado final de la presión osmótica de la hemoglobina libre de estroma

piridoxilada y polimerizada después del proceso final de diálisis es de 357 ± 13

mOsm/kg. Comparado con los otros tres autores, la presión osmótica final es un

poco elevada pero no critica. Unidades de glóbulos rojos concentrados se

encuentran alrededor de este valor. La presión osmótica se puede disminuir si la

reacción de polimerización es llevada acabo por mas tiempo, aunque el grado de

polimerización afecta el P50, el coeficiente de Hill y el efecto de Bohr88,

decreciendo los tres parámetros. Se debe decidir cual de los efectos tiene menor

significancia en condiciones fisiológicas, cuando esta solución de hemoglobina

modificada sea infusionada, ya sea tener un nivel osmótico un poco elevado, o

nivelar la presión osmótica al nivel isoosmótico de 300 mOsm/kg y tener como

IQ-2003-02-08

162

resultado una disminución que puede ser significante o no en los niveles de P50,

efecto de Bohr y coeficiente de Hill.

De todas formas, se demuestra por la disminución en la presión osmótica inicial de

727 mOsm/kg a la presión osmótica final 357 mOsm/kg que el proceso de

polimerización se llevo acabo adecuadamente, y por lo tanto la concentración de

hemoglobina se pudo aumentar a niveles fisiológicos normales de 14.5 g/dl para

producir una oxigenación correcta en los tejidos. Esto se debe demostrar

posteriormente en modelos animales y pruebas clínicas.

5.1.1.2. Coeficiente de Hill

La medición final de la cooperatividad de la hemoglobina es el coeficiente de Hill,

este determina la afinidad de la hemoglobina por la captación de oxígeno. El

resultado final del coeficiente de Hill después del proceso de polimerización de la

hemoglobina libre de estroma piridoxilada se encuentra en el intervalo de

confianza del 95% de [1.16 – 1.92]. Siguiendo el método de la referencia 14, una

comparación de medias con una prueba-t, donde el valor de comparación es t y

los grados de libertad se definen como:

88 Referencia 9

IQ-2003-02-08

163

Donde xn son las medias a comparar, sn es la desviación estándar de cada

población y nn es el numero de datos de cada población. Realizando estos

cálculos, y teniendo medias de 1.54 para este trabajo y 1.75 para el trabajo de

Sehgal73, con desviaciones estándar de 0.0848 y 0.807 y con un numero de datos

de tres y de 30 respectivamente, se obtiene como resultado un valor de “t” de

comparación de t = -1.2882, con los grados de libertad siendo ν = 1.369 ≈ 2, y el

valor t para estos grados de libertad por tablas de 4.303, se puede concluir que no

existe una diferencia significante entre las dos medias a una confianza del 95%.

Este resultando es entonces comparable al obtenido por el trabajo de Sehgal.

Comparado con el plasma normal, una gran disminución en el coeficiente de Hill

es obtenida debido al proceso de polimerización, ya que el valor del coeficiente de

Hill plasma es de 2.589. Esta perdida se ve reflejada en la perdida de la forma

sigmoidal de la curva de disociación de oxígeno y por lo tanto una disminución de

73 Referencia 9 89 Referencia 2 pg 38.

11 1

2

2

22

1

2

1

21

2

2

212

1

21

1

21

1

21

2

_

1

_

−

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛

+−

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+

=

+

−=

nns

nns

ns

ns

ns

ns

xxt

ν

IQ-2003-02-08

164

la pendiente de la curva en valores cercanos al P50, como se puede ver en la

figura 18. Las curvas de disociación de oxígeno en el rengo entre 0 mmHg y 30

mmHg son casi lineales, con ningún inicio sigmoidal diferenciable a simple vista y

sin un cambio diferenciable a simple vista entre otros valores y valores cercanos al

P50 de la solución de hemoglobina libre de estroma. Esto puede ser causado por el

efecto de polimerización, debido a que le bolsillo donde cada monómero del

tetrámero de la hemoglobina se une al oxígeno de uno u otra forma se encuentra

mas inaccesible en su forma polimerizada que en su forma libre, pero esta

hipótesis debe ser demostrada. Este efecto no ha sido bien establecido aun90.

5.1.1.3. Efecto de Bohr

El resultado final del efecto de Bohr después del proceso de polimerización de la

hemoglobina libre de estroma se encuentra en el intervalo de confianza del 95%

de [-0.40, -0.47]. Comparado con los resultados obtenidos por el trabajo de

Sehgal, el efecto de Bohr es mucho menor. Existen dos posibilidades por las

cuales se da este resultado: la primera, como se explica en el numeral 5.1.1.1. el

grado de polimerización varia el efecto de Bohr, debido a que los grupos amino

terminales, histidina y cisteina, de la hemoglobina son responsables del control del

efecto de Bohr, y son también las responsables en la reacción de polimerización

con el glutaraldehido, sufriendo modificaciones y por lo tanto disminuyendo el

90 Referencia 9

IQ-2003-02-08

165

efecto de Bohr91. La segunda posible explicación es que los tres puntos de las tres

curvas de disociación de oxígeno a diferentes pH’s no son significantes para

realizar la regresión lineal que determina el efecto de Bohr, y por lo tanto mas

curvas de disociación de oxígeno entre pH’s variando desde 6 hasta 8 deben ser

construidas, y el espectro de pH utilizado entre 6.8 y 7.2 no es lo suficientemente

amplio para determinar de una manera más precisa el efecto de Bohr de esta

hemoglobina libre de estroma piridoxilada y polimerizada. Desafortunadamente, el

numero de pruebas realizadas no fue el deseado y el numero de curvas de

disociación de oxígeno no es el necesario para este calculo del efecto de Bohr.

Por esta razón, mas pruebas deben ser llevadas acabo, y calcular el efecto de

Bohr nuevamente para comparar los resultados con los obtenidos en el trabajo de

Sehgal.

5.1.1.4. P50

El proceso de piridoxilación es el responsable de el aumento del P50 a niveles

muchos mas cercanos a los del plasma normal (28 mmHg). Durante el proceso de

piridoxilación, ningún tipo de prueba fue llevada acabo para demostrar que este

proceso estaba ocurriendo de la manera como se deseaba y poder monitorearlo.

Por lo tanto, solo hasta el finadle los proceso de piridoxilación y de polimerización,

cuando las curvas de disociación de oxígeno fueron obtenidas, se obtuvo

91 Referencia 9

IQ-2003-02-08

166

información acerca del proceso de piridoxilación. El P50 es una medida indirecta

del proceso de piridoxilación, ya que este es el que se ve afectado cuando este

proceso es llevado acabo correctamente. Existen otros procedimientos directos

como la electroforesis en geles de acetato de celulosa en EDTA-Tris-borato,

donde la fase de hemoglobina piridoxilada migra mas rápidamente que la fase de

hemoglobina no modificada por la piridoxilación, y se puede determinar el grado

de piridoxilación de la hemoglobina libre de estroma92. Desafortunadamente no

existió la posibilidad de realizar esta prueba durante el proceso de piridoxilación.

El P50 obtenido en este trabajo se encuentra en el intervalo de confianza del 95%

de [15.6 – 16.6]. De todas maneras, cuando se comparan los resultados finales de

los tres autores en la tabla 21 con el presente trabajo, el P50 obtenido cae en el

intervalo obtenido por el trabajo de Chang y es mayor al resultado obtenido por el

trabajo de Sehgal. Esto muestra que el proceso de piridoxilación fue llevado acabo

satisfactoriamente con niveles de piridoxilación comparables a el trabajo de Chang

y mayores a el trabajo de Sehgal. De todas maneras pruebas para determinar la

cinética de la reacción de piridoxilación y la obtención de mayores ratas de

piridoxilación con el fin de elevar al máximo el P50 deben ser llevadas acabo.

5.1.1.5. pH

92 Referencia 5

IQ-2003-02-08

167

El resultado final de pH se encuentra en el intervalo de confianza del 95% de [6.98

- 7.35]. Aunque el resultado final se encuentra por debajo de los niveles normales

del plasma de 7.35 a 7.45, esto no representa ningún problema ya que el pH

puede ser modificado con la adición de una base o un ácido como se explico

anteriormente. También puede ser dejado en diálisis por un mayor tiempo,

cambiando la solución dializadora dos o mas veces hasta nivelar el pH al punto

deseado o se puede llevar acabo una hemodiálisis con el equipo de diálisis como

es utilizado en este trabajo cuando las cantidades producidas sean mayores a las

actuales y los volúmenes sean manejables por un equipo como este.

5.1.1.6. Viscosidad

El resultado final de la viscosidad se encuentra en un intervalo de confianza del

95% de [4.53 – 5.57] cp. Aunque el resultado final es comparable con el de la

sangre normal93, preocupaciones concernientes a efectos cardiacos han sido

propuestos. De todas maneras, la viscosidad es dependiente del tamaño de

partícula de la macromolécula de hemoglobina libre de estroma piridoxilada

obtenida durante la polimerización, proceso que es controlable. Futuras

manipulaciones serán dirigidas a la obtención de tamaños de partícula mas

pequeños y por lo tanto viscosidades controlables.

IQ-2003-02-08

168

Actualmente en la Universidad de California en San Diego, se esta llevando a

cabo un estudio para determinar el efecto de los perfiles de velocidades

generados por diferentes hemosustitutos comparados por el perfil generado por la

sangre normal, ya que existe una hipótesis en la cual el perfil de velocidad afecta

de manera significativa la oxigenación en los diferentes capilares y vasos

sanguíneos del cuerpo humano, y la viscosidad es una variable de la cual

depende el perfil de velocidad generado. Seria interesante ver los resultados de

esta investigación y modificar la solución de hemoglobina libre de estroma

piridoxilada y polimerizada para que los perfiles generados por este tipo de

transportador de oxígeno intravascular sean los apropiados.

5.1.1.7. Densidad

Las pruebas de densidad dieron como resultado un intervalo de confianza del 95%

de [0.9 – 1.3] g/cm3, el plasma normal tiene una densidad94 de 1.6 g/cm3. La razón

que explica este resultado, es que la hemoglobina libre de estroma piridoxilada y

polimerizada no tiene la presencia de otras proteínas como la albúmina, que

ayudan a aumentar su densidad. Esto no debe tener efectos fisiológicos

importantes como no lo tienen otras soluciones intravasculares como la solución

salina y el lactato de Ringer.

93 Referencia 9

IQ-2003-02-08

169

5.1.2. Estudio de comparación de costos de obtención

La siguiente tabla (tabla 23) describe todos los reactivos utilizados, sus cantidades

y su costo, sin incluir los costos de los equipos usados durante los procesos de

purificación de hemoglobina, piridoxilación de hemoglobina libre de estroma y

polimerización de la hemoglobina libre de estroma piridoxilada.

Tabla 23. Costo de los reactivos usados durante la producción de una unidad de hemoglobina libre

de estroma piridoxilada y polimerizada.

Reactivo PresentaciónPrecio en dólares

Cantidad usada

Precio en dólares

NaOH 12 kg $101.40 2.4 g $0.02

TRIS HCl 5 kg $418.95 43.72 g $3.66

Piridoxal 5’ phosphate 25 g $159.05 1.26 g $8.01

HCl 18 L $34.00 20 ml $0.04

NaBH4 500 g $98.45 0.917 g $0.18

Nitrogeno 6.5 m3 $30.00 1.5 m3 $6.92

Lisina monohidroclorato 5 Kg $183.95 30.95 g $1.14

glutaraldehido 3L $97.90 8 ml $0.26

Hemoglobina libre de estroma95 1 unidad $19.00 1 unidad $19.00

Glutationa 25 g $76.20 1.75 g $5.33

Glucosa 5 kg $73.10 1 g $0.01

ácido ascórbico 2 kg $110.20 0.25 g $0.02

Lactato de Ringer unidad $1.00 50 unidades $50.00

TOTAL $94.59

94 Referencia 19 95 Referencia 4

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170

Como se menciono anteriormente, el costo final de una unidad de sangre donada

después de todas la pruebas clínicas es de alrededor de U$ 250 dólares,

comparado con los U$ 94.59 dólares de la hemoglobina libre de estroma

piridoxilada y polimerizada. Para una planta de producción de este tipo de

producto, alrededor del 50% de los costos de producción son los costos de los

reactivos. Esto significa que una unidad de sangre donada cuesta alrededor de U$

60.82 dólares mas que una unidad de hemoglobina libre de estroma piridoxilada y

polimerizada, esto con reactivos de grado biológico y no de grado U.S.P. que son

muchos mas económicos y las cantidades utilizadas no son significantes para una

reducción en el precio por parte del fabricante. además este tipo de transportador

de oxígeno intravascular tiene las ventajas de ser almacenado hasta por 3 años96,

no tiene ningún tipo de problema referente al tipo de sangre del paciente, puede

ser liofilizado y almacenado en polvo e inclusive transportado en las ambulancias y

reconstituido antes de su uso con solución salina y no presenta ningún tipo de

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171

6. CONCLUSIONES Y COMENTARIOS

Un transportador de oxígeno intravascular debe tener la capacidad normal de

transporte de oxígeno. Los procesos de piridoxilación y polimerización llevados

acabo en este trabajo normalizan la concentración de hemoglobina total mientras

mantiene la capacidad de transporte de oxígeno, la osmolaridad y otras variables

físico-químicas comparables a la sangre total. Esto hace de este transportador de

oxígeno intravascular un excelente sustituto de la sangre donada.

Auque el proceso de piridoxilación fue llevado acabo satisfactoriamente como se

ve en el resultado del P50, que es comparable a los datos obtenidos por los

trabajos de Chang y Sehgal, ni hubo un método directo para controlar y determinar

el grado de piridoxilación obtenido después de las 12 horas de desoxigenación

con nitrógeno y reducción del piridoxal 5’ fosfato con NaBH4, para lograr la unión

covalente entre las dos subunidades β de la hemoglobina. Existe un método

directo para la determinación del grado de piridoxilación obtenida durante el

proceso, y no tener que esperar hasta la obtención de curvas de disociación de

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172

oxígeno. Este método esta basado en una electroforesis en gel de acetato de

celulosa en un buffer de EDTA-Tris-borato a un pH = 8. La fracción piridoxilada

migra a una rata de velocidad mucho mayor que la fracción no piridoxilada de

hemoglobina97. Se recomienda la adquisición de este tipo de tecnología para

determinar el grado de piridoxilación y poder calcular la cinética del proceso de

piridoxilación, para que se puedan optimizar los costos y los tiempos de

producción de hemoglobina libre de estroma piridoxilada pensando en un escalado

a nivel industrial de todo el proceso de producción de hemoglobina libre de

estroma piridoxilada y polimerizada. Normalmente el grado de piridoxilación

obtenido es alrededor del 70%83. Las dos fracciones de hemoglobina pueden ser

separadas por lotes en DEAE-Sephadex a diferentes pH’s, esto puede ser un

buen método para la obtención de una mayor rata de piridoxilación cercana al

100%, que incrementara el P50 de la solución de hemoglobina libre de estroma

piridoxilada y polimerizada a niveles mas cercanos a los de la sangre normal.

De todas maneras, aunque en comparación con la sangre, el P50 obtenido es bajo,

alrededor de 16 mmHg de la hemoglobina libre de estroma piridoxilada y

polimerizada contra 28 mmHg de la sangre normal, se ha demostrado en pruebas

in vivo que este P50 permite una liberación de oxígeno adecuada a los tejidos en

97 Referencia 5

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173

ausencia de una membrana que recubra la hemoglobina como en el caso de los

glóbulos rojos98.

Otro inconveniente durante el proceso de piridoxilación es la producción de

espuma, se recomienda para pruebas futuras, que un sistema antiespumante sea

diseñado para el proceso. Esto requiere de un detector de espuma, una bomba de

desplazamiento positivo y un reservorio con un antiespumante que no genere

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174

estroma piridoxilada y polimerizada. La presión osmótica es un parámetro indirecto

de esta medida de presión osmótica coloidal ya que también los iones libres en la

solución ejercen presión osmótica haciendo de la medición de la presión oncótica

inexacta.

Los procesos de piridoxilación y polimerización de la hemoglobina libre de estroma

deben ser llevados acabo a 4°C para controlar la formación de metahemoglobina.

Esta atmósfera se logro con la ayuda de un pequeño refrigerador con el set-point

de temperatura a 4°C. además no hubo ningún tipo de condiciones estériles

durante los procesos de purificación de la hemoglobina, la piridoxilación de la

hemoglobina libre de estroma y la polimerización de la hemoglobina libre de

estroma piridoxilada. Se recomienda la adecuación de un laboratorio a estas

condiciones de temperatura y esterilidad para la consecución de dichos procesos,

o al menos pasar la solución de hemoglobina libre de estroma a través de un filtro

estéril de 22 mm y realizar pruebas de esterilidad con muestras sobre agar e

inoculación con tioglicolato antes de realizar las pruebas animales subsecuentes.

El proceso para la determinación de las curvas de disociación de oxígeno es un

poco inexacto y requiere de demasiado tiempo para su obtención. Esto se debe a

que cuando las muestras que son analizadas posteriormente en el analizador de

gases arteriales son tomadas con la jeringa, aunque se hicieron con cuidado,

existe la posibilidad de que entre en contacto con el oxígeno presente en el aire y

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175

la pO2 fuera modificada y por lo tanto diferente a la presente en los tanques de

gases de tonometría, y como el analizador de gases arteriales no determina la

pO2, el nivel de saturación no era conocido exactamente. Lo que se hizo fue

predecir a la concentración de oxígeno suministrado el nivel de saturación de

oxígeno con las curvas de disociación presentadas por Chang, si los resultados

eran parecidos esa prueba era utilizada, de lo contrario era descartada, por esta

razón muchas muestras tuvieron que ser repetidas por inconsistencia en sus

resultados de saturación de oxígeno. Existen en el mercado equipos para la

determinación de curvas de disociación de oxígeno, como por ejemplo el Hemo-O-

scan o el Hemoxanalyzer. Se recomienda adquirir esta tecnología para futuras

experimentaciones para obtener curvas de disociación de oxígeno mas exactas y

de mayor confianza a las que se obtienen actualmente, además de que son

pruebas realizadas en minutos y no en días como las realizadas en este trabajo.

Existe otro tipo de prueba mucho mas precisa que la presentada por estos

equipos, es un método enzimático para la obtención de curvas de disociación de

oxígeno desarrollado por medio de métodos enzimáticos99, el cual puede ser

implementado en Colombia con la tecnología existente en La Universidad de Los

Andes.

Aunque este es el comienzo para el desarrollo de transportadores de oxígeno

intravasculares basados en hemoglobina modificada en Colombia, los resultados

99 Referencia 20

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176

iniciales son comparables a los parámetros obtenidos por otros autores, y por lo

tanto extremadamente satisfactorios. Existen ciertos requerimientos mencionados

anteriormente, especialmente en la adquisición de tecnología para la

determinación mas precisa de diferentes parámetros y la infraestructura para llevar

acabo este tipo de experimentos.

La determinación del peso molecular promedio de la Poly-PLP-SFHb necesario de

calcular para la determinación de la cinética de polimerización, no tuvo los

resultados deseados. La hipótesis de falla es la utilización de hemoglobina libre de

estroma piridoxilada conservada en frío durante 8 meses. también una segunda

posible razón, es la electroforesis en SDS-PAGE, por razones no conocidas,

ningún grupo a nivel internacional realiza la determinación del peso molecular por

medio de electroforesis, sino por medio de cromatografía en gel de Sephadex.

Desafortunadamente por falta de presupuesto, esta prueba de cromatografía no se

pudo realizar por los costos que tiene el gel en Colombia. Actualmente estamos

esperando financiación de Colciencias y del Banco de la Republica para la

determinación de la cinética y para nuevos procesos de modificación de

hemoglobina como la encapsulación de membranas de fosfolípido y biopolímero

fabricando así glóbulos rojos artificiales. también para la adecuada determinación

de la cinética, se debe estudiar tanto la aparición de macromoléculas de

hemoglobina, como la desaparición del agente de polimerización utilizado, que en

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177

este caso es el glutaraldehido. Nuevamente se recomienda la adquisición de los

equipos y reactivos necesarios para esta determinación.

Un punto muy importante para discutir es el costo de producción de este tipo de

transportadores de oxígeno intravascular, como se puede ver, el costo de

producción de una unidad de solución de hemoglobina libre de estroma

piridoxilada y polimerizada es menor que el costo de una unidad de sangre

donada, sin mencionar que son mucho mas seguras y accesibles.

Trabajo futuro en este tema incluye: producción de hemoglobina conjugada,

producción de hemoglobina encapsulada, obtención de diferentes fuentes de

hemoglobina como de origen bovino o recombinante, pruebas in Vitro y pruebas

animales, con el fin de desarrollar un numero limitado de formulaciones para ser

llevado a pruebas clínicas y comparar entre todos los tipos de transportadores de

oxígeno intravascular basados en hemoglobina modificada, cual es mas factible

para las capacidades y condiciones tecnológicas y de salud presentes en

Colombia. Es el deseo de este autor, del Grupo de Ingeniería Biomédica de La

Universidad de Los Andes y del departamento de Ingeniería Química de La

Universidad de Los Andes, que estas investigaciones sean continuadas, para el

futuro desarrollo a escala industrial de transportadores de oxígeno intravascular en

Colombia y ser lideres en Latinoamérica y en el mundo en este tema. Estudios

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178

posteriores en este tema parecen garantizados debido a los resultados obtenidos

hasta ahora.

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179

Apendice I. Diagrama de flujo del proceso de piridoxilación.

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180

Apendice II. Diagrama de flujo del proceso de polimerización

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181

Apendice III. Datos de cooximetria de las muestras de polihemoglobina, 3

repeticiones para la determinación de la desviación estandar.

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182

Apéndice IV. Datos de cooximetria para calculo de curva de disociación de

oxigeno a pH = 7.166

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183

Apéndice V. Datos de cooximetria para calculo de curva de disociación de


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184

Apéndice VI. Datos de cooximetria para calculo de curva de disociación de


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185

ANEXO I. Datos de certificado de análisis de gases de los tanques tonometrados

para la obtención de curvas de disociación de oxigeno (Oxígenos de Colombia).

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191

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