Introducción:El trabajar con diluciones es algo rutinario en un laboratorio de biología molecular e investigación ya sea porque necesitas concentraciones muy pequñas para pesar y medir por lo que tienes que partir de una solución mas concentrada a una menor o porque las soluciones comerciales vienen a unas concentraciones (stocks) altas y se usan a unas concentraciones (working) mas ligeras. Igualmente en el conteo de células o bacterias para sembrar o cuantificar se usa mucho el concepto de diluciones en serie.

Diluciones:Cuando se hacen diluciones siempre se comienza con una concentración de algo y añades mas solvente, bajando la concentración del soluto. Asi que si haces cálculos y ves que la concentración aumenta!!... algo hicistes mal! Revisa el trabajo para asegurarte que la concentración disminuyó.

Lo importante aqui es definir las variables bien.

Ej: Si tienes un buffer de fosfato de sodio 0.2M, y tomas 10 ml de el y lo añades a 90 ml de agua. Cual es la concentración final de la nueva solución o de la dilución? Para esta fórmula necesitas 3 de las 4 variables;C1= concentración inicial, 0.2MV1= volumen inicial, 10mlC2 = ? concentración final a la queda que no sabemos, x, lo que nos preguntan!V2= volumen final, _____ml. Este es un posible punto de error: 90 ml no es el volumen final, es 100ml.

Factores de dilución (fd): es la segunda forma de hacer diluciones. - Un factor de dilución es una expresión matemática que te permite calcular cuanto más diluído está una

solución resultante preparada a partir de una solución stock o mas concentrada. Se calcula como el volumen final dividido entre el volumen inicial (el que tomastes del concentrado). Cual es el factor de dilución en el ejercicio anterior?

100ml/10ml = 10 o lo que es igual, una dilución de 1 en 10; o sea 0.1 o sea diluido 10 veces!, Una vez tienes el factor de dilución, que se hace con el?

- ó lo multiplicas por la C1 C2=C1 x fd C2= 0.2M x 0.1 = 0.02M- ó divides la C1 entre el fd. C2=C1/fd; C2= 0.2M/10 = 0.02M - la [ ] sera 1/10 de la original!

Diluciones Múltiples:Si vas a hacer un dilución en serie (3 veces o n veces), la concentración final se calcula de la siguiente

forma:Fd1= 100ml/10ml = 10Fd2 = 50ml/2ml = 25Fd3 = 90ml/30ml= 3

Calculando el FD para cada paso de la serie y luego multiplicando los tres factores de dilución

FDTotal= 10x25x3= 750 a 1

Si comenzamos con el mismo 0.2M cual sera la nueva concentración:Cfinal= C1/fdtotal = 0.2M/750 = 0.00027 M = 0.27mM = 270 μM ó ________________________

GráficasGeneralmente los resultados de experimentos se reportan o resumen en forma de gráficas. Repasaremos

como hacer gráficas manuales y por computadoras.

Manual: Una gráfica es una representación de la relación entre dos variables ó 2 cantidades. Una es la que se controla, se llama variable independiente y se coloca en el eje de X. La otra cantidad es la que cambia conforme cambia la independiente, se le llama variable dependiente y se coloca en el eje de Y.

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C1V1=C2V2

Ejercicio: Se colocaron distintas cantidades de proteína en una serie de tubos y por espectrofotometría se midió la absorbancia. Cuál es la variable independiente? La dependiente? Prepara una gráfica donde se representa p (proteina) vs q (Absorbancia), donde p va en x y q en y usando papel de gráfica. (Recuerda poner título, leyenda y descripción de que es lo representado en la gráfica)

Data: Concentración de proteinas (mg)

Absorbancia

0.0010.0030.0050.0070.008

0.050.160.2250.330.375

Dibujar la Línea y La EscalaDebes conocer algo sobre el sistema y los resultados esperados. Por ejemplo con el ejercicio de proteina se espera una línea recta, al menos hasta un límite de cantidad (ug) de proteina en el tubo. Asi que se espera o se trata de dibujar una linea recta, la mejor que pase por los puntos. Se hace por computadoras, con una calculadora con estadísticas que saca pendiente e intercepto, o al ojo, pero NO uniendo todos los puntos con una línea en zigzag tiene que ser una recta. Si la relación que se espera es una lineal, la mejor línea será determinada por una regresión linear, (operación que reduce la distancia entre la línea y los puntos que debe tocar). Esto tambien se conoce como el método de los cuadrados mínimos. Explicar dicho método está fuera del objetivo de este ejercicio se asume que usted ya lo conoce.

A veces el problema esta en como representar los números en la gráfica por el número de ceros. Lo mejor es usar exponente o en este ejemplo, cambiar la unidad de mg a μg.

Otro punto importante es la escala. A cuantos cm equivale un ug por ejemplo? Y siempre hay que ser consistente en la misma gráfica, no hagas ajustes para acomodar data a la mala. También es importante usar la gráfica completa y tratar de que el ángulo de la línea sea lo mas cerca a un angulo de 45o.

Los ejes tienes un X 10 o X1000, que dicen lo que se ha hecho con los números que están en el eje. Se multiplicaron por 10 o por 1000. Asi que el eje de x indica que el valor representa el número de ug de proteina multiplicado por 1000. Cuales fueron las medidas originales de Abs?

En cuanto al 0, mucha gente piensa que debe ser un punto en la gráfica siempre, hay veces que si y hay veces que no. Por ejemplo prepara la siguiente grafica. Se está graficando log de peso molecular de un fragmento de DNA vs su mobilidad en una gelatina.

Mobilidad LogMW MW62.910.1

4.184.64.824.95

15,00040,00066,00090,000

Si la gráfica se comienza en el origen (0) se vera comprimida en el eje de Y, si la comenzamos de 4 en adelante se usa mucha mas area.

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ug proteina Absorbancia

0 010 0.120 0.230 0.0540 0.450 0.5

Escalas logarítmicas:

Para hacer gráficas con estas escalas se puede utilizar papel “semilog”, el cual prácticamente hace los cálculos para uno. Este viene divididos en ciclos. En cada ciclo se puede poner la data que caiga dentro de una potencia de 10. La data desde 15000 a 90000 cae toda dentro de un ciclo (10000 a 100000). Si quieres incluir también a 200000, necesitas otro ciclo. En un papel logarítmico tu colocas los números 15000, 40000 etc directamente en la gráfica en Y. NO trates de poner 4.18, 4.60 … etc en el papel log.!

Puntos de data corruptosEscojer cuando estos puntos existen es algo que se puede hacer mejor a ojo que a computadora.Si tu quieres poner en gráfica los datos de la tabla a la derecha tu notarás 5 de los 6 puntos caerán perfectamente bien en la línea recta. Pero un punto va a estar bien afuera. La mayoría de los programas de computadoreas dibujarán un línea incluyéndolo, cuando en realidad no se debe incluir. Lo que se debe hacer es o repetir la lectura de 30 ug ó hacer la línea sin incluirlo y si usando los otro 5 puntos. Obviamente la linea que mejor recoge la tendencia de esta data es la que no lo incluye . Como será la línea si eliminas el punto (30, 0.05). Demuestrálo.

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Nota la diferencia entre la distribución de la data en el toda el área de la gráfica. El error al tratar de interpolar en la gráfica será mayor mientras menos area de esta se use.

Graficas con computadorasLa mayoría de las computadoras que tenemos en nuestras casas u oficinas incluyen un paquete de programas que traen un “spreadsheet” que trae capacidad para hojas de hacer cálculos y graficar. Entre programas para este tipo de análisis están Sigmaplot, Quatro, SPSS, y Excell. En nuestro lab lo mas que tendremos oportunidad para usar es Excel asi que ese será el ejemplo para seguir.

El primer paso es colocar la data en la página de cálculos. Columnas identificadas por Letras y líneas identificadas por Números. Cada combinación entre estas es una celda. La data debe estar como en la tabla que sigue.

Al subir el programa Excell te abre una página vacía con celdas. Puedes poner o no titulos a la columnas. Coloca lo que va en el eje de X en la columna de la izquiera Asi se verá en Excell.

Para crear la gráfica luego que tengas la data en la hoja es cuestión de seguir las instrucciones del programa.- En primer lugar seleccionar las celdas que incluyen la data que ira en la gráfica. Ej desde A1 a A6 y B1 a

B6, todo junto. - Luego hacer click en el ícono de chart, escoger el tipo de gráfica (línea, barra, pie)- Escoges “scatter plot” que no tenga líneas sobre la data, la que tiene líneas busca un 0,0.- Le das next y te pregunta la fuente de la data, esta fue seleccionada ya, asi que next- Lo próximo sería formatear la gráfica para ver como va a lucir (titulo, rotulos de los ejes, etc) la mini

gráfica te da una idea de como se ve. Puedes ir adelante y atrás si cambias de idea.- Luego escojes incluirla en la misma hoja de cálculos o en hoja aparte.

Hasta el momento la gráfica se verá como la de la izquierda. Como verás no hay línea que conecte los puntos para que la máquina no una los puntos. Asi escogeremos la regresión lineal que asegura la línea que major pasa por los puntos. Para hacer la linea:

- escojer en “chart” en los menus superiores y luego “add trendline”. Lo que sale ahora te da varias opciones incluyendo la linea recta de regresión.

- Ademas de esto escojes en “option” para que puedas presentar en la grafica la ecuación y el coefficiente R de regresión.

- La gráfica se vera como la de la derecha.

Ug de proteina Absorbancia01020304050

00.10.20.290.400.52

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Graficas No-lineares

Que hacer si la gráfica no presenta una relación lineal? La gráfica la harás igual que siempre pero usarás el wizard de gráficas para adaptar la gráfica. Por ejemplo analiza un experimento de cinética de enzimas. Cuando se representa la velocidad de una enzima vs la concentración de sustrato, se obtiene una relación hiperbólica (abajo izq). Luego que creas la gráfica sin línea, añades “trendline” como antes. Para gráficas hiperbólicas no hay un menu ideal. Lo mejor que se puede hacer es escojer “logarítmica” en trendline. Y saldrá una curva hiperbólica. Esta se ve razonable, solo que es una función logarítmica. Una gráfica logarítmica es curva como una hiperbólica pero la equación no parea. Si se intenta interpolar valores dara resultados erróneos. Se puede usar el “spreadsheet” para manipular la data de la siguiente forma.

Si tomas el recíproco de la data y esta es la que pones en la gráfica estarás haciendo una gráfica Lineweaver-Burk (abajo). Si ahora usas el “trendline podrás hacer una linea recta que se extenderá cruzando el eje de y hasta interceptar el eje de X. De alli podrás obtener constantes cinéticas de la gráfica y valores como Km y Vmax.

La capacidad para intrapolar dentro de la gráfica es posible con la línea recta en lugar de la hiperbole.

Barras de Errores en Gráficas

Un aspecto que le da mayor validez y solidez a resultados presentados en forma de gráfica es el poder incluirles análisis estadísticos en ellas. Entre los análisis estadisticos mas comunes estan el promedio y la desviación o el error estandar. Ambas son medidas de dispersión que permiten tener una idea de cuanto se desvian o alejan del valor promedio las muestras analizadas en la prueba.

En el siguiente ejemplo se realizaron unas medidas en triplicado de conteo radioactivo para 4 muestras.. Prepare la gráfica donde presente individualmente cada muestra. Calcule el promedio para cada muestra y la desviación estandar y prepare la gráfica donde solo se presenten los promedios. Incluya en esta última las barras de errores en Y con el valor de la desviación estándar.

Coloque la data en el “spreadsheet” como se muestra. Luego para la gráfica de barra utilice el Wizar de Excell escojiendo la opción de graficas de barras.

Prepare la siguiente data en una gráfica de barras:Control 3H DDT DEHP

1000 8000 4500 70001500 7500 5000 75001250 9200 6000 6500

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Vel Conc 1/Vel 1/Conc0.25 0.083 4 12.048190.5 0.127 2 7.8740161 0.158 1 6.3291142 0.178 0.5 5.6179784 0.203 0.25 4.9261085 0.249 0.2 4.016064

Si le da next a todos los pasos la grafica que saldra es la de la izquierda que muestra como comparan los valores de cada medida con los de su grupo (1000, 1500, 1250; 8000, 7500, 9200; etcetera) pero esto no dice mucho sobre el resultado general del experimento porque estos valores son repeticiones (triplicados) de una misma prueba.Lo correcto aquí seria obtener el promedio de cada grupo (control, 3H, DDT, DEHP) y comparar estos promedios.

Para esto haremos uso de las funciones y formulas de Excell para calcular. Colocas el cursor en la celda debajo de 1250 y les das “insert” “function”. Aquí abren dos columnas, a la izquierda categorías de formulas (escoge Statistics) y a la derecha las formulas de esta categoria (escoge Average). En la linea de number 1 seleccionas las celdas que corresponden a los 3 valores para control, enter y te coloca en la celda el valor del promedio de esos tres datos. Haces “copy” a esa celda, seleccionas las otras 3 celdas a la derecha y haces “paste” y verás que hace el mismo cálculo para los otras celdas. A la izquierda rotula con AVG. Has la gráfica de barra pero solo seleccionando los valores en AVG para cada muestra (arriba, derecha).Ahora en la celda debajo del AVG para control, insertas la función para STDEV. Escoje las mismas celdas que usastes para calcular el AVG del control y de las otras 3 muestras. La hoja presentará ahora la desviación estandar de cada promedio. Para incorporar este valor a la gráfica de barras haces doble click sobre cualquiera de las columnas de la nueva grafica y abre un menu donde escogerás, “Y error bar”. Luego escoges custom y alli pones el cursor al lado del signo + y seleccionas las celdas con los STDEV y luego lo pones al lado del signo (-) y colocas las mismas celdas, OK. En las columnas saldrá una barra vertical que dice que ese promedio puede subir hasta un máximo o bajar hasta un mínimo, o sea fluctuar por la cantidad del STDEV como un mas o menos.

Preguntas para contestar:

Como las ecuaciones de las lineas rectas se pueden usar para predecir resultados?

Prepara las misma graficas menos las ultima en papel de gráfica manualmente.

Prepara una grafica con la siguiente data de forma manual y en la computadora

Ug de prot Absrobancia0 02 0.124 0.286 0.408 0.5210 0.6312 0.72

Usa la ecuación de la recta de esta ultima data para interpolar, calcula los μg de proteínas en muestras que leen Abs de 0.45 y 0.25.

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