Diagnóstico Regional de los Contaminantes Orgánicos Persistentes (COPs) en la

Zona Costera de la Península de Yucatán y el Sur del Golfo de México

Informe Final Noviembre de 2005

Dr. Gerardo Gold Bouchot, Dr. Omar Zapata Pérez, M. en C. Víctor Ceja Moreno, M. en

C. Juan Pablo Rodas Ortíz, QBB. Jorge Arturo Domínguez Maldonado, Quím. Marcela

del Río y M. en C. Francisco Rodríguez QFB. Paulina Maribel Ku Chan, QFB. Dolly

Yngrid Espínola Pantí,

Departamento de Recursos del Mar

Cinvestav Unidad Mérida

1. Introducción

1.1 Antecedentes Generales

El gobierno mexicano firmó y ratificó su adhesión a la Convención de Estocolmo sobre

Contaminantes Orgánicos Persistentes (COPs). En esta convención se establecen una

serie de compromisos por los países signatarios, entre las que están el elaborar

diagnósticos sobre el uso, transporte, almacenamiento, distribución ambiental, efectos

ambientales, etc. En México no hay antecedentes de esfuerzos sistemáticos que

permitan determinar el estado y tendencias de las concentraciones ambientales de

estos compuestos, lo que dificulta el cumplimiento de las obligaciones contraídas en el

Convenio de Estocolmo.

Como ocurre en muchos campos relacionados con el medio ambiente, la contaminación

y ecotoxicología, etc. la mayoría de la información se encuentra en la llamada “literatura

gris”, esto es reportes técnicos, tesis, etc. que casi nunca están disponibles

públicamente, ni han sido evaluados por sus pares académicos, lo que pone cierta duda

sobre la validez de la información obtenida.

Una gran cantidad de sustancias producidas como resultado de las actividades

antropogénicas tienen como destino final el ambiente acuático. Dentro de esta gama de

sustancias, los contaminantes orgánicos persistentes (COPs) han llamado mucho la

atención en estudios de contaminación, ya que por sus características fisicoquímicas

son resistentes a la degradación y son altamente persistentes en el ambiente, por lo

que tienden a bioacumularse y biomagnificarse a lo largo de la cadena trófica. Los

COPs están representados por dos importantes subgrupos de compuestos: a)

Hidrocarburos Halogenados, grupo en el que se incluyen los bifenilos policlorados

(PCBs), las dibenzo-p-dioxinas policloradas, los dibenzofuranos policlorados y los

plaguicidas organoclorados; y b) Hidrocarburos Aromáticos Polinucleares (PAHs). En la

actualidad, cada vez son más los estudios que se interesan en la contaminación de tipo

crónico, con aporte de contaminantes en concentraciones subletales durante un tiempo

prolongado, en los que se espera conocer, no solamente los niveles de contaminantes

en el medio biótico y abiótico, sino los efectos que estos compuestos pueden causar en

los organismos, las poblaciones y las comunidades. En el área de la toxicología se

cuenta hoy en día con una amplia gama de metodologías que detectan cambios

biológicos a distintos niveles de organización, o “biomarcadores”, como resultado de la

presencia de contaminantes. Everaarts et al. (1993) definen un biomarcador como la

variación de componentes celulares o bioquímicos, procesos, estructuras y/o funciones

que se pueden medir en un sistema biológico. Por su parte, Beyer et al. (1996)

mencionan que los biomarcadores son las respuestas biológicas que pueden ser

relacionadas con la exposición a, o el efecto tóxico de, uno o varios compuestos

químicos en el ambiente. Así, los biomarcadores de exposición miden una sustancia

exógena o sus metabolitos y su interacción con alguna molécula biológica. Por otro

lado, los biomarcadores de efecto son mediciones de alteraciones bioquímicas,

fisiológicas o conductuales que se presentan en los organismos (Barrett et al. 1997).

Generalmente, los biomarcadores son herramientas de monitoreo sensibles y precisas

con capacidad predictiva en estudios de impacto por la presencia de contaminantes

(Gold-Bouchot y Zapata-Pérez, 2004). El enfoque de estudio usando biomarcadores ha

sido usado exitosamente en otros países (Barhoorn y van Vuren, 2004), así como

recientemente en México (Gold-Bouchot y Zapata-Pérez, en prensa) y en el programa

de monitoreo del Proyecto del Sistema Arrecifal Mesoamericano (Almada-Villela et al.,

2003), del que México forma parte.

Como parte de los ecosistemas acuáticos, los peces son afectados por los

contaminantes orgánicos, presentando respuestas muy variadas dependiendo del tipo y

concentración de los compuestos y del tiempo de exposición. La bioacumulación de

contaminantes en los peces y por consiguiente la magnitud de sus efectos, puede variar

de acuerdo a la especie, al sexo, a la edad y al grado de desarrollo de los organismos;

así como en relación a ciertos factores externos como la época del año, la temperatura

del agua, la salinidad y la dieta, entre otros (Buhler y Williams, 1988). Los efectos en un

organismo a causa de la presencia de contaminantes pueden observarse a diferentes

niveles de organización biológica y los peces no son la excepción. Existen

biomarcadores que permiten detectar respuestas tempranas como resultado de la

exposición a algún xenobiótico o sustancia extraña al organismo. Los más utilizados

intentan detectar la inducción o la inhibición de ciertos sistemas enzimáticos

encargados de metabolizar los contaminantes presentes en los peces; otros buscan

cambios a nivel genéticos (como por ejemplo, la asociación del contaminante con el

ADN, la presencia de mutaciones, las aberraciones cromosómicas) o cambios en las

células, sobre todo a nivel de membrana; y aquellos biomarcadores que se enfocan en

cambios a largo plazo, alteraciones irreversibles a causa de una exposición prolongada

y que afectan más claramente la salud de los peces, como es la aparición de lesiones a

nivel histológico. Los análisis histológicos son ampliamente reconocidos como una

herramienta útil y rápida para monitorear efectos adversos causados por contaminantes

antropogénicos. Estudios de campo y laboratorio han demostrado que existe una

relación entre la aparición de tumores o lesiones neoplásicas en peces y la presencia

de compuestos químicos xenobióticos en el ambiente y en los organismos. Estas

relaciones han sido más evidentes al considerar los niveles de hidrocarburos

aromáticos polinucleares (PAHs) y la presencia de neoplasmas hepáticos y lesiones

epidérmicas (Susani 1986; Hawkins et al. 1988). Asimismo, los trabajos realizados han

mostrado que el medir ciertos biomarcadores de respuesta temprana (por ejemplo,

alteraciones bioquímicas), en combinación con el estudio de la presencia de daños a

nivel histológico, permiten realizar una evaluación más consistente de los efectos por

exposición a contaminantes orgánicos en peces (Collier et al. 1998).

1.2 Antecedentes de los Sitios de Estudio

I.2.1 Celestún.

Se localiza en los 20° 46' y 20° 59' de latitud norte y los meridianos 90° 19' y 90° 28' de

longitud oeste, con una extensión de 28,400 Ha.

Origen: Tipo III. Plataforma de barrera interna. Depresiones inundadas en los márgenes

internos del borde continental, al que rodean superficies terrígenas en sus márgenes

internos y al que protegen del mar barreras arenosas producidas por corrientes y olas.

La antiguedad de la formación de la barrera data del establecimiento del nivel del agua

actual, dentro de los últimos 5 mil años. Los ejes de orientación paralelos a la costa.

Batimétricamente son típicamente muy someros, excepto en los canales erosionados,

modificados principalmente por procesos litorales como actividad de huracanes o

vientos; se localiza sedimentación terrígena. Laguna costera típica para muchos

autores, aparece a lo largo de planicies costeras de bajo relieve con energía de

intermedia a alta. A. Barrera de Gilbert Beaumont. Barreras arenosas externas,

ocasionalmente múltiples; escurrimiento ausente o muy localizado; forma y batimetría

modificadas por la acción de las mareas, oleajes tormentosos, arena traída por viento y

presencia de corrientes locales que tienden a segmentar las lagunas; energía

relativamente baja, excepto en los canales y durante condiciones de tormenta; salinidad

variable, según las zonas climáticas. Su clima es: BS1 (h') w (i') g.

Mapa 1. La ría de Celestún, dentro de la Reserva de la biosfera del mismo nombre, con las posiciones aproximadas de los sitios de muestreo.

I.2.2 Laguna de Términos

Se localiza entre los meridianos 91° 10' y 92° 00' de longitud oeste y los paralelos 18°

20' y 19° 00' de latitud norte. Hacia el norte la delimita la Isla del Carmen, de 37.5 km de

largo y 3 km de ancho, en cuyos extremos se ubican dos bocas que la comunican

permanentemente con el mar: la de Puerto Real y la del Carmen. Se halla en la zona de

transición entre las calizas de la Península de Yucatán y los terrenos aluviales del Golfo

de México. Destacan por su importancia en el aporte de agua a la laguna los ríos

Candelaria y Mamantel; el primero está en el extremo noroccidental y su cuenca se

localiza principalmente en la Península de Yucatán. Se calcula que el aporte de este río

con sus afluentes es de 21.5 m3/seg. Al extremo oriental de la de Términos

desembocan el río Sabancuy y los arroyos Colax, Lagartero, Chivoj Chico y Chivoj

Grande. El río Chumpan se forma en la planicie costera por los ríos Salsipuedes y San

Joaquín y desemboca finalmente a la laguna de Balchacah. El cauce de este río tiene

un área de 1,874 km2 y un volumen de escurrimiento anual de 1,368 millones de

metros cúbicos. Río y laguna forman el sistema Chumpan-Balchacah.

El río Palizada forma parte de la red hidrológica de los ríos Mexcalapa, Grijalva y

Usumacinta. Los ramales de este río, de manera conjunta con otros anexos menores,

dan origen a lagunas interiores: por un lado, a las lagunas del Vapor, el Este y San

Francisco, que en su conjunto constituyen el sistema Palizada del este; y por el

occidente, el sistema Pom-Atasta con varias lagunas menores anexas.

La descarga promedio anual de los ríos que desembocan en la laguna se estimó en

6.10 m3. Los vientos dominantes del este, la corriente litoral y la descarga de los ríos

provocan que el agua del Golfo entre a la laguna mediante la Boca de Puerto Real y

salga por la Boca del Carmen. Se ha reportado un flujo neto de 1,350 m3/seg. en

sentido oriente-occidente, y tiene una extensión de 196 000 Ha.

Es una laguna de Tipo II. Sedimentación terrígena diferencial. Lagunas costeras

asociadas con sistemas deltáicos fluviales producidos por sedimentación irregular o

subsidencias de superficie que causa la compactación de los efectos de carga. Se

formaron y varios se han modificado durante los últimos 5 mil años; algunos otros son

muy jóvenes geológicamente (cientos de años). Se forman rápidamente barreras

arenosas, que envuelven depresiones marginales o intradeltáicas muy someras; deltas

de insumo de sedimentos bajos que pueden ser someros y frecuentemente efímeras,

lagunas elongadas entre montículos de playa. Son frecuentes a lo largo de los planos

deltáicos de las regiones C y E. A. Depresión intradeltáica y marginal. Presenta típicas

barreras arenosas; el escurrimiento puede ser directo o el agua del río puede entrar a

las lagunas a través de ensenadas; ocurren rápidamente modificaciones en la forma y

batimetría; la energía es usualmente baja, excepto en los canales y ensenadas; hay

salinidad típicamente baja, pero puede mostrar estacionalidad y variaciones cortas en

tiempo.

Su clima es: Ax' (w2) (i') gw''

Mapa 2. Laguna de Términos, dentro del área de protección de flora y fauna del mismo nombre, y la posición aproximada de los sitios de muestreo.

I.2.3 Bocas de Dzilam

Se localiza en los meridianos de 88° 47’ 54.4’’ y 88° 47’ 49.7’’ de longitud Oeste y entre

los paralelos de 21° 26’ 33.4’’ y 21° 24’ 51.2’’ de latitud Norte, con una extensión de

61,700 Ha.

La mayor parte del estrato geológico de la reserva se originó como resultado de un

proceso de emersión de fondos marinos en el holoceno y pleistoceno, solo la parte sur

de la misma, la más distante al mar, data del plioceno y mioceno. La zona occidental de

la reserva forma parte del llamado “Anillo de Cenotes”, el cual es una franja semicircular

al norte de la Península de Yucatán donde se encuentran numerosos cuerpos de agua

dulce, resultado de la disolución diferenciada del carso durante el pleistoceno y que

representa un vertedero conductor de grandes masas de agua subterránea

provenientes de la llanura cárstica denudativa al sur de la reserva y desde el centro de

la Península de Yucatán. El clima del área corresponde a cálido-seco Bs1 (h’) w’’ (x’) i‘

intermedio entre los de tipo árido y húmedo, caracterizado por escasas lluvias. La

temperatura promedio anual es de 25.5 °C, precipitación promedio anual de 970 mm y

evaporación de 1800 mm.Durante el año se presentan tres temporadas climáticas:

secas, lluvias y nortes. La primera imperante durante los meses de marzo y mayo, con

las mínimas precipitaciones (de 0 a 30 mm.) del año y las más altas temperaturas (de

36 a 38 °C); la época de lluvias entre los meses de junio y octubre, con septiembre

como el mes con mayor precipitación (125 mm promedio). Durante los dos últimos

meses de esta temporada es común la llegada de huracanes, procedentes de la zona

sur del Mar Caribe, los que traen como consecuencia precipitaciones altas (de hasta

350 mm al mes) y rachas de vientos de hasta 250 km/hr. La época llamada de nortes,

se presenta de noviembre a febrero; Se caracteriza por la gran influencia de vientos

polares acompañados por bajas presiones atmosféricas, bajas temperaturas y lluvias, la

temperatura promedio para esta época es de 23 °C y la precipitación de 40 mm.

El elemento fisiográfico más conspicuo es la Laguna Costera de Dzilam,

permanentemente comunicada con el mar por medio de una fractura de la barra

arenosa llamada “las Bocas de Dzilam”; a través de la cual el mar la nutre como efecto

del movimiento de las mareas, al igual que lo hace el agua dulce proveniente del manto

freático vertida por manantiales en cenotes y petenes.La laguna tiene una longitud de

12.9 km., un ancho máximo de 1.6 km., una boca, el centro del sistema tiene 375 m. de

ancho y una superficie de 9.4 km². Su orientación es este-oeste con su principal eje

paralelo a la costa.

1.3. Antecedentes de COPs en los Ecosistemas Costeros Estudiados

En el caso de las lagunas propuestas en este estudio, no hay antecedentes en la

literatura científica de reportes de concentraciones o efectos de COPs para las lagunas

de Celestún y Nichupté. Solo hay artículos sobre este tema para la Laguna de

Términos, y algunos ecosistemas asociados como el Río Palizada y la Laguna de Pom.

Gold-Bouchot et al. (1993 y 1995) reportaron concentraciones de plaguicidas y PCBs en

Mapa 3. Bocas de Dzilam, y la posición aproximada de

los sitios de muestreo.

los sedimentos y biota (ostiones, almejas, camarones) de la parte baja del Río Palizada.

Los resultados obtenidos fueron relativamente bajos y no eran causa de preocupación

en ese entonces. En 1994 Alvarez-Legorreta et al. reportaron concentraciones de

hidrocarburos en la Laguna de Pom, en sedimentos y almejas. Las concentraciones

eran altas, si se les comparaba con las lagunas de Tabasco, consideradas como

impactadas por la industria petrolera. En 1995 Gold-Bouchot et al., reportaron

concentraciones de las distintas fracciones de hidrocarburos en ostiones. Las

concentraciones encontradas eran más altas que en las lagunas de Tabasco, que en

ese momento reportaban mortalidades masivas de ostión supuestamente por

contaminación petrolera. En 1999 Noreña-Barroso et al. reportaron concentraciones de

PAHs en ostiones, encontrando concentraciones mayores que las reportadas para la

misma especie en el Status and Trends Program de la NOAA en el Golfo de México de

los Estados Unidos. Los resultados también indicaron que los hidrocarburos provenían

de fuera de la Laguna, muy probablemente de los campos petroleros. En un estudio

reciente, Gold-Bouchot et al. (en prensa) determinaron la relación entre diversos

contaminantes y algunos biomarcadores en el ostión Crassostrea virginica,

demostrando que estos organismos están impactados por la presencia de

contaminantes, y que los biomarcadores estudiados son buenos indicadores del efecto

de los contaminantes. En conclusión, este importante ecosistema costero parece estar

impactado seriamente, según indican los estudios mencionados.

2. Objetivos del proyecto

2.1 Objetivo general

Diagnosticar el estado de los compuestos orgánicos persistentes en la zona costera de

la Península de Yucatán y el sur del Golfo de México.

2.2 Objetivos específicos

Colectar muestras de sedimentos recientes y peces (Ariopsis felis, o la especie

muy cercanamente relacionada Hexanematichthys assimilis, anteriormente

conocida como Ariopsis assimilis) en las dos épocas climáticas extremas de la

región, lluvias y secas, en las lagunas costeras Laguna de Términos, Campeche;

Celestún, Yucatán y Bocas de Dzilam, Yucatán.

Analizar las concentraciones de compuestos orgánicos persistentes (bifenilos

policlorados, plaguicidas organoclorados, y algunos metabolitos de estos

plaguicidas, hidrocarburos aromáticos policíclicos ó PAHs) en sedimentos

recientes y peces (Ariopsis felis, o la especie muy cercanamente relacionada

Hexanematichthys assimilis, anteriormente conocida como Ariopsis assimilis).

Evaluar el efecto de los contaminantes orgánicos persistentes en peces

mediante el uso de diferentes biomarcadores:

o Metabolitos de PAHs en bilis

o Actividad enzimática de la EROD en hígados de peces

o Expresión del Gen del CYP1A en hígados de bagres

o Expresión del Gen de la Vitelogenina en hígado de peces

Determinar si las diferencias de las concentraciones entre los ecosistemas y

entre las épocas climáticas son estadísticamente significativas mediante un

análisis de varianza.

Determinar las posibles relaciones entre las concentraciones de contaminantes y

los niveles de biomarcadores mediante un análisis estadístico multivariado

(Análisis de Redundancias, la forma restringida del Análisis de Componentes

Principales).

3. Materiales y Métodos

3.1 Reactivos

Todos los disolventes usados para la determinación y cuantificación de contaminantes,

así como los utilizados para la cuantificación de metabolitos de PAHs en bilis fueron de

calidad análisis de residuos o cromatográficos.

Los estándares utilizados para determinar los diferentes compuestos orgánicos son los

siguientes: 18 congéneres de los PCBs que usa la NOAA, más tres que se usan como

indicadores: PCBs 8, 18, 28, 29, 44,52, 66, 87, 101, 110, 118, 128, 138, 153, 170, 180,

187, 195, 200, 206 y 209. Dentro de los plaguicidas que se determinaron están: 1,2,4,5-

Tetraclorobenceno, 1, 2, 3, 4-Tetraclorobenceno, Pentaclorobenceno,

Hexaclorobenceno, Pentacloroanisol, α-, β-, γ- y δ-Hexaclorociclohexano, Heptacloro,

epóxido de Heptacloro, α- y γ-Clordano, cis-Nonaclor, trans-Nonaclor, Aldrin, epóxido

de Aldrin, Endrin, Dieldrin, Mirex, Endosulfan I, II y sulfato, o,p’-DDT, p,p’-DDT, o,p’-

DDD, p,p’-DDD, o,p’-DDE y p,p’-DDE. Y para las cuantificaciones de los PAHs se

utilizaron los estándares de: Naftaleno, 1 metil-Naftaleno, 2 Metil-Naftaleno, 2, 6-

Dimetil-Naftaleno, 1, 5-Dimetil-Naftaleno, 2, 3-Dimetil-Naftaleno, 1, 2, 4-Trimetil-

Naftaleno, 1, 3, 5-Trimetil-Naftaleno, Acenafteno, Acenaftileno, Fluoreno, Fenantreno,

Antraceno, 1 Metil-Fenantreno, 2 Metil-Fenantreno, Fluoranteno, Pireno,

Benzo(a)antraceno, Criseno, benzo(a)Pireno, Benzo(e)Pireno, y Perileno.

Finalmente para la determinación de los análisis bioquímicos y moleculares, la

ethoxiresorufina, el NADPH y todos los demás reactivos químicos usados para la

preparación de los microsomas y las actividades enzimáticas fueron obtenidos de

Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), mientras que los reactivos utilizados para evaluar

la expresión de los genes fueron de calidad molecular de la marca Invitrogen.

3.2 Trabajo de campo

Dada la gran variabilidad en los datos biológicos, y entre estaciones climáticas, se

recolectaron 10 peces por laguna, en las dos épocas climáticas (secas y lluvias),

procurando que todos los peces fueran machos y de longitud similar, para simplificar la

interpretación de los resultados.

Posteriormente, los peces fueron disectados en donde se les extrajo el hígado y la bilis.

El hígado, fue dividido en tres fracciones para la determinación de contaminantes, para

los análisis bioquímicos y para los análisis moleculares. La bilis fue colectada en tubos

eppendorff en donde se determinaron las concentraciones de compuestos

fluorescentes.

Después de la disección y de la extracción de los diferentes tejidos, los hígados fueron

colocados en tubos eppendorff y fueron almacenados y conservados en un tanque con

nitrógeno líquido a -110 °C para evitar la degradación del RNA. Finalmente, todas las

muestras de hígados de peces fueron transportadas al laboratorio de Geoquímica

Marina y Ecotoxicología del Cinvestav para realizarles los análisis químicos,

bioquímicos y moleculares

Cabe mencionar, que en las mismas estaciones donde se colectaron los peces y en las

mismas épocas climáticas, se colectaron muestras de sedimentos recientes (la capa

superior de 1 cm) para la determinación y cuantificación de compuestos orgánicos

persistentes. Una vez colectadas las muestras, éstas fueron congeladas a – 20°C y

posteriormente fueron liofilizadas para su proceso de extracción. En las figuras 1, 2 y 3

se muestran los puntos y las localidades en donde fueron colectadas las muestras de

sedimentos y organismos.

3.3 Trabajo de laboratorio

3.3.1 Análisis de Compuestos Orgánicos Persistentes.

Sedimentos

Los plaguicidas organoclorados en sedimentos fueron determinados de acuerdo a los

procedimientos descritos por Sericano et al. (1990), en donde, aproximadamente 30 g

de sedimento seco fueron extraídos con diclorometano por 8-12 horas, con equipo

soxhlet. El extracto concentrada mediante rotoevaporador hasta obtener una fracción

de aproximadamente 1 ml.

Posteriormente, la muestra fue separada y purificada por medio de una cromatografía

en columna utilizando óxido de aluminio y silica gel, parcialmente desactivada. Los

extractos obtenidos fueron eluídos con hexano y con una mezcla hexano-diclorometano

en donde los solventes finales fueron nuevamente concentrados por medio de equipos

Kuderna Dannish hasta un volumen de 0.5 ml. Las muestras fueron inyectadas en un

cromatógrafo de gases Hewlett-Packard 5890 Series II equipado con un detector de

captura de electrones, en donde se determinó y se cuantificó la concentración de los

hidrocarburos, plaguicidas y PCBs.

Las condiciones de operación del cromatógrafo de gases fueron:

Detector: Captura de electrones

Columna: Capilar 30 m X 32 mm, 0.25 mm de grosor de

capa, sílice fundido fenil-metil-silicona al 5%.

Gas acarreador: Nitrógeno, 1.5 ml/min

Gas de relleno: Nitrógeno, 28.5 ml/min

Temp. Inyección: 280°C

Temp. Detección: 300°C

Prog. Temperatura:

Temp. inicial 60°C

Tiempo inicial: 1 min

Rampa: 6°C/min

Temp. Final: 290°C

Tiempo final: 20 min

Organismos

El análisis de los plaguicidas organoclorados en los organismos se determinó de

acuerdo a los procedimientos descritos por Sericano et al. (1990). Aproximadamente 2

g de muestra seca fueron extraídos con diclorometano por 8 horas en equipos soxhlets.

El extracto del diclorometano fue evaporado con un equipo Kuderna Dannish y

posteriormente fue mezclado con la fracción del hexano. Esta mezcla orgánica fue

concentrada hasta obtener una fracción de aproximadamente 1 ml. Posteriormente,

esta fracción fue inyectada en un HPLC con una columna de exclusión y fue eluída con

diclorometano para eliminar los lípidos contenidos en la muestra. La evaporación, la

cromatografía en columna y la cuantificación por cromatografía de gases fue la misma

realizada con el procedimiento descrito anteriormente.

3.3.2 Control y aseguramiento de la calidad analítica.

En el caso de los análisis de contaminantes, se seguirán protocolos estrictos de control

y aseguramiento de la calidad analítica (QA/QC). En total, estos protocolos requieren

que se realicen aproximadamente un 20% adicional de análisis. Estos protocolos son

iguales para las muestras de sedimentos y de tejidos. En cada lote de muestras se

analizará un blanco de procedimiento y un blanco enriquecido con estándares, para

verificar la limpieza del material y reactivos, y la recuperación analítica,

respectivamente. También se analizarán materiales certificados de referencia

proporcionados por el Laboratorio Ambiental Marino de la Agencia Internacional de

Energía Atómica y Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente.

Finalmente, se analizará la reproducibilidad analítica al hacer un 10% de las muestras

en triplicado.

3.4 Determinación de Biomarcadores de Efecto y Exposición en Organismos.

En lo que respecta a los análisis bioquímicos y moleculares en los organismos, a

continuación se detallan las técnicas utilizadas en el presente estudio.

3.4.1 Metabolitos de PAHs en bilis.

Al momento de extraer los hígados de los peces se colectaron las muestras de bilis

mediante una jeringa hipodérmica, se colocaron en viales Eppendorf, y se congelaron

inmediatamente en nitrógeno líquido hasta su análisis.

Una vez en el laboratorio la bilis se diluyó en una solución agua/etanol (48/52 vol/vol), y

las concentraciones de metabolitos se determinaron por fluorescencia sincrónica,

manteniendo una diferencia constante entre los haces de excitación y emisión de 35

nm, usando como estándares el 1-OH-naftaleno (1-naftol), 1-OH-pireno, fenantreno y

benzo(a)pireno disueltos en la misma mezcla de agua/metanol (Ariese et al., 1993),

para lo cual su usó un espectrofluorómetro Shimadzu RF-5301PC.

3.4.2 Preparación de Microsomas.

La obtención de los microsomas fue realizado por la técnica propuesta por Mayer et al.

(1990), en la que los diferentes componentes celulares fueron obtenidos por

centrifugación diferencial a una temperatura de 4°C. Para la preparación de éstos, los

hepatopancreas fueron lavados con una solución amortiguadora Tris-HCl 20 mM, KCl

150 mM y EDTA-Na2, pH 7.6. Posteriormente, éstos fueron pesados y homogenizados y

la suspensión fue transferida a unos tubos de policarbonato para ser centrifugados a

9,000 rpm durante 25 min a una temperatura de 4°C. El sobrenadante fue transferido a

otros tubos limpios de policarbonato y las muestras fueron centrifugadas a 35,000 rpm

por 1 h a 4°C en una ultracentrífuga refrigerada. La pastilla obtenida fue nuevamente

resuspendida y homogenizada en solución amortiguadora y nuevamente centrifugada a

35,000 rpm por 1 h a 4°C. La pastilla obtenida fue resuspendida en una solución Tris-

HCl 20mM, KCl 150 mM y MgCl2 3 mM, glicerol al 15%, pH 7.6 y posteriormente esta

solución fue alicuotada y almacenada en diferentes tubos Eppendorf a una temperatura

de - 80°C.

3.4.3 Citocromo P450 (CYP) en Microsomas Hepáticos

La determinación del CYP total se realizó de acuerdo a la técnica propuesta por Omura

y Sato (1964), en la cual el hierro hémico es reducido por medio de la ditionita de sodio

y con la adición de monóxido de carbono, se forma un complejo colorido con la

característica única de tener un máximo espectro de absorción a una longitud de onda

de 450 nm. La suspensión microsomal se leyó en un espectrofotómetro Perkin-Elmer

UV/VIS Lambda 2S (Perkin-ELMER CO, Überlingen, Alemania).

3.4.4 Actividad Enzimática EROD (Ethoxyresorufinn-O- deethilasa)

La actividad enzimática EROD se midió según el método descrito por Burke et al.

(1995), en la cual la 7-ethoxresorufina es transformada por el CYP en resorufina. En

general, en esta técnica se mide el incremento de la fluorescencia por la resorufina

formada en el tiempo. La técnica consiste en poner en una celda fotométrica

aproximadamente 1910 µl de solución amortiguadora Tris-HCl 50mM, Mg2Cl3 25 mM,

pH 7.6, 40 µl de 7-ethoxyresorufin y 30 µl de suspensión microsomal. La mezcla se

incubó por 3 min a 37 °C y posteriormente se inició la reacción con la adición del

NADPH 50 mM. La producción de la resorufina fue monitoreada a una longitud de onda

de 585 nm de excitación y a 530 de emisión con amplitud de banda de 5 nm por

monocromador. El incremento de la resorufina se midió mediante un

espectrofluorómetro Perkin-Elmer LS 50B (Perkin-Elmer Ltd., Beaconsfield,

Buckinhamshire, Inglaterra). Las concentraciones finales se calcularon mediante una

curva de calibración con una solución estándar de resorufina (0, 5, 10, 15, y 50

pmol/ml). En los casos en los que la intensidad de la fluorescencia fue muy elevada se

diluyó la muestra y por el contrario cuando la actividad fue muy baja se incrementó el

volumen de la suspensión microsomal ajustando el volumen a 2 ml con la solución

amortiguadora.

3.4.5 Proteína Total

La proteína total se cuantificó de acuerdo a la técnica propuesta por Lowry (1954), la

cual se basa en un complejo colorido formado entre el Cu2+ reactivo de fenol y los

aminoácidos aromáticos tirosina y triptofano de las proteínas. Esta reacción se llevo a

cabo en dos partes; en la primera las proteínas reaccionan con los iones Cu2+ en medio

alcalino y en la segunda ocurre una reducción del reactivo de los ácidos fosfomolíbdico-

fosfotúngstico a azul de molibdeno y azul tungsteno por el complejo proteínas-Cu,

tirosina y triptofano. Las muestras fueron leídas en un espectrofotómetro modelo

Lambda 2S (Perkin Elmer, Norwalk, CT) a una longitud de onda de 750 nm. La

concentración final se calculó mediante una curva de calibración utilizando albúmina

sérica bovina (ABS) como estándar.

3.4.6 Determinación de los Biomarcadores de Efecto a Nivel Molecular

Extracción de RNA Total. El RNA total fue extraído con Trizol (Gibco-Invitrogen) y

tratado con DNAsaI (Promega). La síntesis de cDNA se llevó a cabo a 45ºC con la

ayuda de la enzima transcriptasa reversa (Promega) en presencia de los primers

específicos del CYP1A. Los oligos de PCR específicos para el CYP1A fueron diseñados

en el laboratorio de Ecotoxicología del Cinvestav, partiendo de las secuencias

reportadas de otros peces del CYP1A en el GenBank.

3.4.7 Evaluación de la Expresión del Gen CYP1A por Medio de la Técnica de RT-PCR.

Para llevar a cabo los análisis de RT-PCR, fue necesario sintetizar el cDNA usando 2

µg de RNA total y 200 U MMLV de la transcriptasa reversa. Posteriormente, las

reacciones de PCR fueron llevadas a cabo usando 3 µl de cDNA (~8 µg), 10 mM Tris-

HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.1% gelatina, 80 µM de cada nucleótido

(dATP, dGTP, dTTP), 20 pmol de cada oligonucleótido y 2.5 U de la Taq-polimerasa

(Gibco, BRL-Life Technologies, Rockville, MD). La amplificación del mRNA CYP1A se

realizó en un termociclador con el siguiente programa: 35 ciclos de (95°C, 1 min;

52.1°C, 1 min; 72°C, 1 min). Los productos resultantes del PCR fueron analizados por

electroforesis en un gel de agarosa al 1% y posteriormente fueron cuantificados por

medio de un programa de digitalización de imágenes (Kodak Digital Science EDAS 120

System Densitometer (Eastman Kodak, Co., Rochester, NY).

3.4.8 Evaluación de la Expresión del Gen de la VTG por Medio de la Técnica de RT-

PCR.

Una vez extraído el mRNA de los peces (ver sección extracción del mRNA), el gen de la

vitelogenina será evaluado por medio de de la técnica de RT-PCR. Para esto fue

necesario sintetizar oligonucleótidos (primers) iniciadores específicos para la VTG en el

laboratorio de Ecotoxicología del Cinvestav. Una vez diseñados los primers, éstos

fueron utilizados para amplificar el gen de la VTG en los peces colectados en la zona

costera del Golfo de México. Para llevar a cabo los análisis de RT-PCR, fue necesario

sintetizar el cDNA usando 2 µg de RNA total y 200 U MMLV de la transcriptasa reversa.

Posteriormente, las reacciones de PCR fueron llevadas a cabo usando 3 µl de cDNA

(~8 µg), 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.1% gelatina, 80 µM de

cada nucleótido (dATP, dGTP, dTTP), 20 pmol de cada oligonucleótido y 2.5 U de la

Taq-polimerasa (Gibco, BRL-Life Technologies, Rockville, MD). La amplificación del

mRNA de la VTG fue realizado en un termociclador con el siguiente programa: 35 ciclos

de (95°C, 1 min; 52.1°C, 1 min; 72°C, 1 min). Los productos resultantes del PCR fueron

analizados por electroforesis en un gel de agarosa al 1% y fueron cuantificados por

medio de un programa de digitalización de imágenes (Kodak Digital Science EDAS 120

System Densitometer (Eastman Kodak, Co., Rochester, NY).

4. Análisis de Resultados Se recolectaron muestras de sedimentos y peces del género Ariopsis (ahora

Hexanematichthys) en las siguientes lagunas costeras: Laguna de Términos

(Campeche), Ría de Celestún (Yucatán y Campeche) y Bocas de Dzilam (Yucatán).

En la Laguna de Nichupté (Quintana Roo) no se pudieron obtener peces del género

estudiado, por lo que se consultó al personal de la oficina regional de la SEMARNAT

para saber si existe algún registro sobre este pez en la laguna de Nichupté, el personal

de esta oficina nos notificó que no hay información sobre los peces residentes en esta

laguna. Debido a esto, y dado que si se usaba una especie de pez perteneciente a otro

género no se podrían comparar los resultados obtenidos con los de los peces de las

otras dos lagunas, se decidió recolectar muestras de sedimentos y peces de la laguna

Bocas de Dzilam en el estado de Yucatán.

En las tablas 1, 2 y 3 se muestran las localidades, así como las ubicaciones geográficas

y la época climática en donde fueron colectados todos los sedimentos y los organismos

analizados durante este trabajo. Tabla 1. Estaciones de muestreo en la Laguna de Celestún para las temporadas

de secas y lluvias.

secas lluvias Estación Latitud Longitud Latitud Longitud

1 20 47 07.7 90 24 22.1 1 20 47 04 90 24 26 2 20 48 36.4 90 23 39.9 2 20 47 00 90 24 10.7 3 20 49 52.4 90 23 09.0 3 20 48 03 90 23 47.7 4 20 51 15.8 90 22 55.2 4 20 48 13.1 90 24 00 5 20 52 29.1 90 21 54.6 5 20 48 59.5 90 23 28.8 6 20 53 42.6 90 21 11.4 6 20 49 07.1 90 23 35.5 7 20 55 16.2 90 20 42.6 7 20 50 01.5 90 23 18.2 8 20 56 52.0 90 20 11.3 8 20 50 02.5 90 23 12.8 9 20 47 00 90 24 20 9 20 51 09.9 90 23 05.7

10 20 47 00 90 24 10 10 20 50 58.2 90 22 59.3 11 20 48 00 90 24 30 11 20 51 50.8 90 22 20.8 12 20 48 00 90 23 50 12 20 52 24 90 22 07.9 13 20 49 00 90 23 20 13 20 52 50.3 90 21 55.4 14 20 49 00 90 23 40 14 20 53 03.6 90 21 34.5 15 20 50 00 90 23 05 15 20 54 02.6 90 21 24.9 16 20 50 00 90 23 10 16 20 53 45.6 90 21 03.9 17 20 51 00 90 23 00 17 20 54 57.2 90 21 04.1 18 20 51 00 90 22 50 18 20 54 28.5 90 21 13.8 19 20 52 00 90 22 30 19 20 55 56 90 20 45.9 20 20 52 00 90 22 15 20 20 56 00.5 90 20 15.4 21 20 53 00 90 21 40 21 20 56 32.2 90 20 48.7 22 20 53 00 90 21 20 22 20 56 31.8 90 20 14.5 23 20 51 30 90 23 00 23 20 57 00.2 90 20 41 24 20 51 30 90 22 50 24 20 51 31 90 22 48.9

25 20 51 30 90 22 56

Tabla 2. Sitios de muestreo en la Laguna Bocas de Dzilam, Yucatán.

secas lluvias Estación Latitud Longitud Latitud Longitud

1 21 25 34.1 88 43 36.4 1 21.45391 88.69456 2 21 25 59.2 88 42 59.4 2 21.49069 88.62968 3 21 26 25.7 88 42 12.8 3 21.49296 88.6342 4 21 26 56.2 88 41 36.6 4 21.49122 88.64065 5 21 27 37.8 88 40 48.0 5 21.48494 88.63544 6 24 28 06.5 88 39 46.8 6 21.47472 88.64328 7 21 28 28.4 88 38 45.6 7 21.47717 88.64846 8 21 29 09.1 88 38 16.8 8 21.47308 88.65607 9 21.46639 88.65748 10 21.46583 88.66458 11 21.46776 88.66824 12 21.46185 88.67563 13 21.46002 88.67615 14 21.45786 88.68155 15 21.46049 88.68532 16 21.4563 88.68922 17 21.45327 88.69375 18 21.44982 88.69359 19 21.44823 88.69699 20 21.44878 88.69767 21 21.44461 88.69898 22 21.44535 88.70001 23 21.44582 88.70239 24 21.44183 88.70523 25 21.44015 88.70132 26 21 26 17 88 42 186

Tabla 3. Sitios de muestreo en la Laguna de Términos, Campeche.

secas lluvias Estación Latitud Longitud Latitud Longitud

1 18 38 07.33 91 51 08.74 1 18 39 07.33 91 50 08.742 18 40 24.87 91 38 03.01 2 18 41 23.87 91 39 04.013 18 33 26.76 91 32 24.83 3 18 32 26.76 91 31 24.834 18 30 46.06 91 51 06.38 4 18 32 46.06 91 53 06.385 18 36 09.52 91 50 28.27 5 18 34 09.52 91 49 26.27

4.1 Metabolitos de PAHs en Bilis

Los resultados de los análisis de metabolitos de PAHs en bilis de bagres se presentan

en la Tabla 4. Los resultados de los metabolitos descritos en la tabla están expresados

en (µg/mL) y son reportados como la sumatoria del metabolito libre más los metabolitos

conjugados.

Tabla 4. Metabolitos de los PAHs en bilis de bagre, agrupados por tipo de compuesto.

Localidad OH-Pirenos OH-Naftalenos OH-Fenantrenos OH-Benzo(a)Pirenos (µg/mL) (µg/mL) (µg/mL) (µg/mL)

Celestún 0.495 12.446 80.972 0.729 Celestún 0.582 22.817 105.321 0.907 Celestún 0.503 11.974 129.334 0.756 Celestún 0.563 5.846 79.461 0.719 Celestún 0.487 11.031 121.105 0.679 Celestún 0.572 24.703 77.110 0.838 Celestún 0.548 3.253 70.393 0.781 Celestún 0.579 21.403 112.709 0.813 Celestún 0.388 10.560 76.942 0.666 Celestún 0.618 17.867 120.434 0.620 Celestún 1.228 91.645 238.483 1.697 Celestún 0.537 28.003 90.208 0.819 Celestún 0.580 9.617 113.885 0.863 Celestún 0.651 28.238 238.987 1.031 Celestún 0.553 25.881 214.470 0.987 Celestún 0.580 23.996 230.926 0.832 Celestún 0.391 ND 193.816 0.631 Celestún 1.102 26.588 235.460 1.066 Celestún 0.478 6.553 200.197 0.890 Celestún 0.667 11.267 177.527 0.924 Dzilam 0.107 22.691 16.572 0.212 Dzilam 0.149 18.542 10.653 0.274 Dzilam 0.107 16.110 17.641 0.211 Dzilam 0.124 29.845 14.090 0.238 Dzilam 0.101 21.260 0.458 0.203 Dzilam 0.099 25.266 14.930 0.200 Dzilam 0.089 34.137 28.294 0.185 Dzilam 0.043 16.110 13.211 0.115 Dzilam 0.092 15.967 3.971 0.189 Dzilam 0.116 17.541 19.092 0.224 Dzilam 0.064 ND ND 0.147 Dzilam 0.056 10.101 12.982 0.135

Dzilam 0.122 27.985 16.686 0.234 Dzilam 0.068 30.417 19.130 0.153 Dzilam 0.047 2.947 15.044 0.121 Dzilam 0.074 22.548 11.799 0.162 Dzilam 0.049 7.669 12.104 0.125 Dzilam 0.179 12.962 13.822 0.320 Dzilam 0.103 24.122 24.552 0.222

Términos 0.365 4.431 99.947 0.995 Términos 0.404 17.867 104.481 1.039 Términos 0.430 5.610 115.228 1.035 Términos 0.175 22.346 66.027 0.773 Términos 0.469 18.338 99.443 1.102 Términos 1.108 64.067 129.334 1.638 Términos 0.211 ND 67.874 0.916 Términos 0.226 ND 118.083 0.953 Términos 0.234 ND 76.102 0.849 Términos 0.218 0.896 76.942 0.846 Términos 0.197 ND 71.233 0.846 Términos 0.290 18.810 142.599 1.087 Términos 0.580 54.874 162.750 1.351 Términos 0.152 0.896 146.965 1.268 Términos 0.236 ND 107.504 0.899 Términos 4.157 27.531 144.447 4.254

*ND = No Detectado.

Las concentraciones medianas de las concentraciones de los metabolitos de los

naftalenos (dos anillos bencénicos) y fenantrenos (tres anillos bencénicos) se presentan

en la Figura 4.1.1.

Las concentraciones de naftalenos son muy similares entre los sitios estudiados, pero

de acuerdo a un análisis de varianza no paramétrico usando la técnica de Kruskal-

Wallis se encuentra que las diferencias entre las lagunas son significativas (H3,60 = 16.0;

P=0.001).

En el caso de los fenantrenos las concentraciones menores fueron en detectadas en

peces capturados en las Bocas de Dzilam, mientras que las máximas concentraciones

fueron detectadas en los peces de la laguna de Celestún. El resultado del análisis de

varianza demostró que si existieron diferencias estadísticas significativas entre las

launas de Términos y Celestún respecto a la de Dzilam (H3,60 = 36.7; P=0.0000), (Fig.

4.1.1).

Por otro lado, las concentraciones medianas de los metabolitos de los pirenos (cuatro

anillos bencénicos) y benzo(a)pirenos (cinco anillos bencénicos) se presentan en la

Figura 4.1.2.

Dzilam Celestún Términos

Sitio

-20

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

OH-NaftalenosOH-Fenantrenos

PAH

s (µ

g/ m

L)

Dzilam Celestún Términos

Sitio

-20

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

OH-NaftalenosOH-Fenantrenos

PAH

s (µ

g/ m

L)

Figura 4.1.1. Concentraciones medianas (± 1

intervalo intercuartílico) de los metabolitos de

naftalenos y fenantrenos en bilis de bagres

capturados en cuatro ecosistemas costeros del

Golfo de México.

Las concentraciones de estos compuestos son mucho menores que las de los

metabolitos de los naftalenos y fenantrenos. Esto puede deberse a diferencias en la

bioacumulación y/o en diferentes velocidades de biodegradación por la ruta del

Citocromo P-450.

Tanto para los pirenos como para los benzo(a)pirenos las menores concentraciones se

obtuvieron en Bocas de Dzilam, lo que confirma que este es un buen sitio de referencia.

Para ambos tipos de compuestos las diferencias fueron altamente significativas al ser

comparados con las concentraciones de metabolitos de PAHs en peces colectados en

las Bocas de Dzilam. Para los pirenos (H3,60 = 46.6; P=0.0000) y para los

benzo(a)pirenos (H3,60 = 46.1; P=0.0000).

Dzilam Celestún Términos

Sitio

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8OH-PirenosOH-Benzo(a)Pirenos

PA

Hs

(µg/

mL)

Dzilam Celestún Términos

Sitio

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8OH-PirenosOH-Benzo(a)Pirenos

PA

Hs

(µg/

mL)

Figura 4.1.2. Concentraciones medianas (± 1

intervalo intercuartílico) de los metabolitos de pirenos

y benzo(a)pirenos en bilis de bagres capturados en

tres ecosistemas costeros del Golfo de México.

Un resultado importante e inesperado es que las concentraciones de metabolitos en

bilis de bagre son muy similares, para todos los grupos estudiados, en las lagunas de

Términos y Celestún. La Laguna de Términos está muy cerca de la zona de extracción

petrolera del Golfo de México, donde se ha reportado una influencia clara sobre las

concentraciones de PAHs en ostiones (Crassostrea virginica) (Noreña-Barroso et al.,

1999). En la Laguna de Celestún no hay actividades que permitan suponer

concentraciones relativamente altas de estos compuestos.

4.2 Contaminantes en Sedimentos

Las concentraciones de las distintas fracciones de hidrocarburos en sedimentos, para la

temporada de secas, se presentan en la figura 4.2.1 y para la época de lluvias en la

figura 4.2.2. Por comodidad para la lectura, las tablas de resultados se presentan en el

anexo a este informe.

Dzilam Celestún Términos

Secas

0

10

20

30

40

50

60

Hid

roca

rbur

os (µ

g/g)

Ali fáticos UCM BPM APM PAHs Totales

Figura 4.2.1. Concentraciones medianas de las fracciones de

hidrocarburos en sedimentos durante la época de secas, en las

lagunas estudiadas.

La laguna de Términos en la época de secas, presenta mayor concentración en la

mezcla compleja no resuelta (UCM), con una mediana de 22.241 µg/g; y decrementado

para las lagunas de Celestún y Dzilam con unas medianas de 12.384 y 7.594 µg/g

respectivamente; los demás componentes de los hidrocarburos presentan

concentraciones similares (Alifáticos e hidrocarburos de alto y bajo peso molecular).

En la época de lluvias (Fig. 4.2.2), la laguna de Términos también presenta mayor

concentración en la mezcla compleja no resuelta (UCM), con una mediana de 18.910

µg/g; y decreciendo para las lagunas de Dzilam y Celestún con unas medianas de

10.458 y 10.013 µg/g respectivamente; los demás componentes de los hidrocarburos

presentan concentraciones similares (Alifáticos e hidrocarburos de alto y bajo peso

molecular).

Los plaguicidas organoclorados en la época de secas (Fig. 4.2.3), al igual que los

hidrocarburos, son en términos generales mal elevados que en los otros dos sistemas,

Dzilam Celestún Términos

Lluvias

0

10

20

30

40

50

60

Hid

roca

rbur

os (µ

g/g)

Alifáticos UCM BPM APM PAHs Totales

Figura 4.2.2. Concentraciones medianas de las fracciones de

hidrocarburos en sedimentos durante la época de lluvias, en las

lagunas estudiadas.

destacando principalmente clrorobencenos, clordanos y DDT´s con medianas de 9.335,

7.681 y 12.458 ng/g respectivamente; además de los plaguicidas clorados totales con

unas mediana de 54.883 ng/g. Sin embargo, son notables los valores altos de HCHs en

las lagunas de Dzilam y Celestún con máximos de 34.741 y 61.689 ng/g

respectivamente.

En cuanto a plaguicidas en época de Lluvias (Fig. 4.2.4), Los niveles de los grupos de

plaguicidas son más homogéneos, aunque destacan nuevamente los clorobencenos en

todas las lagunas, con medianas para Dzilam, Celestún y Términos de 4.623, 6.380 y

15.452 ng/g respectivamente, siendo este grupo de plaguicidas notoriamente más

elevado que el resto.

Dzilam Celestún Términos

Secas

0

20

40

60

80

100

120

Pla

guic

idas

(ng/

g)

Clorobenceno HCHs Clordanos Drines DDTs PC anisol Endosulfan II Mirex Totales

Figura 4.2.3. Concentraciones medianas de las fracciones de

plaguicidas organoclorados en sedimentos durante la época de

secas, en las lagunas estudiadas.

En la Figura 4.2.5, Se presentan los niveles de Bifenilos policlorados siendo estos

similares para todas las lagunas con medianas que van de 3.209, 0.010 y 3.982 ng/g

para Dzilam, Celestún y Términos respectivamente. Se observa un máximo en los

niveles de los PCBs de 2 anillos de 3.414 ng/g en la laguna de Celestún.

En la figura 4.2.6, Se muestran las concentraciones medianas de los PCBs en la época

de lluvias, es necesario precisar que los niveles de estos compuestos extremadamente

bajos.

Dzilam Celestún Términos

Lluvias

0

20

40

60

80

100

120

Pla

guic

idas

(ng/

g)

Clorobenceno HCHs Clordanos Drines DDTs PC anisol Endosulfan II Mirex Totales

Figura 4.2.4. Concentraciones medianas de las fracciones de

plaguicidas organoclorados en sedimentos durante la época de

lluvias, en las lagunas estudiadas.

Dzilam Celestún Términos

Lluvias

0

5

10

15

20

25

PC

Bs

(ng/

g)

Diclorados Triclorados Tetraclorados Pentaclorados Hexaclorados Heptaclorados Octaclorados Nonaclorados Decaclorados Totales

Figura 4.2.5. Concentraciones medianas de las fracciones de

bifenilos policlorados en sedimentos durante la época de secas,

en las lagunas estudiadas.

Dzilam Celestún Términos

Secas

0

5

10

15

20

25

PC

Bs

(ng/

g)

Diclorados Triclorados Tetraclorados Pentaclorados Hexaclorados Heptaclorados Octaclorados Nonaclorados Decaclorados Totales

Figura 4.2.6. Concentraciones medianas de las fracciones de

bifenilos policlorados en sedimentos durante la época de lluvias, en

las lagunas estudiadas.

Se realizó un ANOVA no paramétrico para determinar si existían diferencias

significativas en la concentración de hidrocarburos entre las dos épocas climáticas (fig.

4.2.7). La laguna de Dzilám no presentó diferencias entre épocas para ninguno de los

componentes de los hidrocarburos. La laguna de Celestún presentó diferencias

significativas para los PAHs de bajo y alto peso molecular con valores p < 0.05.

Finalmente se observaron diferencias significativas entre los alifáticos y los PAHs de

bajo peso molecular en la Laguna de Términos con valores p< 0.05

Dzilam SecasCelestún Secas

Términos SecasDzilam Lluvias

Celestún LluviasTérminos Lluvias

0

10

20

30

40

50

60

Hid

roca

rbur

os (µ

g/g)

Al ifáticos UCM BPM APM PAHs Totales

. . . .

Figura 4.2.7. Grupos de hidrocarburos en sedimentos con

diferencias significativas (punto azul) entre épocas de secas y

lluvias.

De la misma manera que con los hidrocarburos, se realizó un ANOVA no paramétrico

para determinar si existían diferencias significativas entre la concentración de

plaguicidas para las dos épocas climáticas (fig. 4.2.8). Los resultados demostraron que

la laguna de Dzilám presentó diferencias entre época para el grupo e los clordanos y

para el penta-cloro-anizol con valores p< 0.05, mientras que en la laguna de Celestún

presentó diferencias significativas para los clorobencenos, clordanos drines, DDTs y

plaguicidas totales con valores p < 0.05. Finalmente se observaron diferencias

significativas entre los HCHs, clordanos, drines, DDTs, Pentacloro anizol, Endosulfan II

y plaguicidas totales en la Laguna de Términos con valores p< 0.05.

Dzilam SecasCelestún Secas

Términos SecasDzilam Lluvias

Celestún LluviasTérminos Lluvias

0

20

40

60

80

100

120

Pla

guic

idas

(ng/

g)

Clorobenceno HCHs Clordanos Drines DDTs PC anisol Endosulfan Mirex Totales

. . . ....

.

...

.

.

.

Figura 4.2.8. Grupos de plaguicidas en sedimentos con diferencias

significativas (punto azul) entre épocas de secas y lluvias.

Se realizó un ANOVA no paramétrico para determinar si existían diferencias

significativas entre épocas climáticas (fig. 4.2.9). La laguna de Dzilám presentó

diferencias entre época para el todos los grupos de PCBs con valores p< 0.05. La

laguna de Celestún presentó diferencias significativas para los diclorados y

pentaclorados con valores p < 0.05. Se observaron diferencias significativas entre los

diclorados, tetraclorados y octaclorados en la Laguna de Términos con valores p< 0.05.

Para resumir, en las siguientes tablas se encuentran los grupos de contaminantes para

los que se observaron diferencias significativas en la comparación entre épocas, como

puede verse en las gráficas anteriores.

Dzilam SecasCelestún Secas

Términos SecasDzilam Lluvias

Celestún LluviasTérminos Lluvias

0

5

10

15

20

25

PC

Bs

(ng/

g)

Diclorados Triclorados Tetraclorados Pentaclorados Hexaclorados Heptaclorados Octaclorados Nonaclorados Decaclorados Totales

.........

..

..

.

.

Figura 4.2.9. Grupos de bifenilos policlorados en sedimentos con

diferencias significativas (punto azul) entre épocas de secas y

lluvias.

Tabla 4.2.1.Grupos de contaminantes que Presentaron diferencias significativas entre épocas para la laguna de Dzilam.

Dzilam H Valor p

Clordanos 4.7513 0.0293 PC anisol 4.6062 0.0319 Diclorados 31.4141 0 Triclorados 28.3971 0

Tetraclorados 17.5522 0 Pentaclorados 10.2888 0.0013 Hexaclorados 7.3884 0.0066 Heptaclorados 26.07132 0 Octaclorados 21.0423 0 Nonaclorados 21.0423 0 Decaclorados 11.8537 0.0006 PCBs Totales 21.6237 0

Nota: 0 = p< 0.0001

Tabla 4.2.2.Grupos de contaminantes que presentaron diferencias significativas entre épocas para la laguna de Celestun. Celestún H Valor p Clorobencenos 16.3946 0.0001Clordanos 5.4581 0.0195Drines 7.5786 0.0056DDTs 3.8544 0.0496Plaguicidas Totales 10.1977 0.0014BPM 4.25 0.0393APM 5.4967 0.0191Triclorados 4.3534 0.0369Pentaclorados 6.4187 0.0113PCBs Totales 8.1802 0.0042

Nota: 0 = p< 0.0001

Tabla 4.2.3.Grupos de contaminantes que presentaron diferencias significativas entre épocas para la laguna de Términos.

Existen ciertos criterios emitidos por la NOAA, que son utilizados para indicar si alguna

muestra de sedimentos es tóxica, en este sentido a continuación se mencionan algunos

de ellos:

TEL (Treshold Effects Level), es la concentración por debajo de la cual es poco

probable encontrar efectos adversos.

PEL (Probable Effects Level), es la concentración arriba de la cual frecuentemente se

encuentran efectos adversos; y finalmente concentraciones entre TEL y PEL indican

que es probable encontrar efectos adversos en los organismos.

En la siguiente tabla se observan los porcentajes de muestras de las tres lagunas en las

cuales se rebasan los criterios de PEL, los cuales nos indica que por arriba de

determinadas concentraciones (NOAA, 1999) es muy probable encontrar efectos

nocivos en los organismos. En la siguiente tabla se aprecia son principalmente los

grupos de PAHs de bajo peso molecular, los HCHs y los DDTs, los que

dominantemente rebasan los valores de PEL

Términos H Valor p HCHs 6.4533 0.0111

Clordanos 12.10435 0.0005 Drines 11.3701 0.0007 DDTs 15.0185 0.0001

Endosulfan II 4.8806 0.0272 Plaguicidas Totales 6.75 0.0094

ALIF 10.0858 0.0015 BPM 8.3333 0.0039

Diclorados 17.3492 0 Tetraclorados 10.7154 0.0011 Octaclorados 4.8 0.0285

Nota: 0 = p< 0.0001

Tabla 4.2.4. Grupos de contaminantes que rebasan los criterios de PEL para las tres lagunas y las dos épocas.

Secas Lluvias Dzilam Celestún Términos Dzilam Celestún Términos Media

PAHs - APM 0 0 0 0 0 0 0 PAHS - BPM 0 58.3 40 0 4.0 4.2 17.8 PAHs 0 0 0 0 0 0 0 Clordanos 0 0 80 0 0 0.0 13.3 HCHs 42.9 16.7 100 0 0 66.7 37.7 Drines 0 0 20 0 0 0 3.3 PCBs 0 0 0 0 0 0 0 DDTs 14.3 4.2 100 0 4.0 0 20.4 Media 7.1 9.9 42.5 0 1.0 8.9

En la siguiente tabla para la época de secas, se observa que son principalmente los

diversos grupos de hidrocarburos los que rebasan los criterios que indican que es

probable encontrar efectos adversos en los organismos, además de los drines y HCHs

principalmente.

Tabla 4.2.5. Gruposde contaminantes que rebasan los criterios de TEL y PEL durante la época de secas. Dzilam Celestún Términos < TEL > TEL y <PEL > PEL < TEL > TEL y <PEL > PEL < TEL > TEL y <PEL > PELPAHs - APM 14.3 85.7 0 29.2 70.8 0 40 60 0 PAHS - BPM 14.3 85.7 0 0 41.7 58.3 0 60 40 PAHs 14.3 85.7 0 25 75 0 20 80 0 Clordanos 100 0 0 100 0 0 0 20 80 HCHs 14.3 42.9 42.9 79.2 4.2 16.7 0 0 100 Drines 85.7 14.3 0 95.8 4.2 0 0 80 20 PCBs 100 0 0 100 0 0 80 20 0 DDTs 85.7 0 14.3 95.8 0 4.2 0 0 100

< TEL: Porcentaje de estaciones con concentraciones menores que el TEL (Treshold Effects Level) > TEL y < PEL: Porcentaje de estaciones que contienen concentraciones entre el TEL y el PEL (Probable Effects Level) > PEL: Porcentaje de estaciones que exceden el PEL

En la siguiente tabla para la época de lluvias, se observa que al igual a que en la época

de secas, son los diversos grupos de hidrocarburos los que rebasan los criterios que

indican que es probable encontrar efectos adversos en los organismos, además de los

HCHs principalmente.

Tabla 4.2.6. Grupos de contaminantes que rebasan los criterios de TEL y PEL durante la época de lluvias. Dzilam Celestún Términos < TEL > TEL y <PEL > PEL < TEL > TEL y <PEL > PEL < TEL > TEL y <PEL > PEL PAHs - APM 15.4 84.6 0 8 92 0 16.7 83.3 0 PAHS - BPM 3.8 96.2 0 8 88 4 20.8 75 4.2 PAHs 15.4 84.6 0 8 92 0 45.8 54.2 0 Clordanos 100 0 0 100 0 0 100 0 0 HCHs 30.8 69.2 0 68 32 0 8.3 25 66.7 Drines 100 0 0 100 0 0 79.2 20.8 0 PCBs 100 0 0 100 0 0 100 0 0 DDTs 100 0 0 96 0 4 100 0 0 < TEL: Porcentaje de estaciones con concentraciones menores que el TEL (Treshold Effects Level) > TEL y <PEL: Porcentaje de estaciones que contienen concentraciones entre el TEL y el PEL (Probable Effects Level) > PEL: Porcentaje de estaciones que exceden el PEL

4.3 Contaminantes en Peces

Las concentraciones de las distintas fracciones de hidrocarburos en organismos para la

temporada de secas, se presentan en la figura 4.3.1 y para la época de lluvias en la

figura 4.3.2. Las tablas de resultados se muestran en el anexo.

La laguna de Términos en la época de secas es la que presentó mayor concentración

de mezcla compleja no resuelta (UCM), con una mediana de 60.475 µg/g, decreciendo

para Celestún y Dzilam con medianas de 53.387 µg/g y 19.694 µg/g respectivamente.

Con respecto a las concentraciones de Alifáticos Dzilam presentó las concentraciones

más altas con una mediana de 48.405 µg/g. En general la laguna que tuvo las

mayores concentraciones de hidrocarburos totales fue la de Términos con una mediana

de 154.893 µg/g.

Para la época de lluvias, Términos y Dzilam tuvieron concentraciones similares para la

UCM con medianas de 126.595µg/g y 124.694µg/g respectivamente. En general la

laguna que presentó mayor concentración de hidrocarburos totales fue Dzilam con una

mediana de 300.295µg/g, seguida de Términos (282.701µg/g) y por último Celestún

(88.195µg/g).

Dzilam Celestún Términos

Secas

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

Hid

roca

rbur

os (µ

g/g)

Al ifáticos UCM BPM APM PAHs Totales

Figura 4.3.1. Concentraciones medianas de las fracciones de

hidrocarburos en organismos durante la época de secas, en las

lagunas estudiadas.

Las concentraciones de plaguicidas organoclorados en organismos se presentan por

época (seca y lluvias) en las figuras 4.3.3 y 4.3.4. En la figura 4.3.3 se puede observar

que los plaguicidas organoclorados en organismos, en la época de secas se encuentran

en mayor concentración en Términos destacando las medianas de HCHs (29.979 ng/g),

Clordanos (5.723 ng/g), DDTs (10.596 ng/g) y plaguicidas totales (87.296 ng/g), pero

cabe señalar que Celestún presentó la más alta concentración de Clorobenceno

(mediana =29.472 ng/g) y que en Dzilam se encontró la mayor concentración de Mirex

(mediana = 0.351 ng/g).

En la época de lluvias los plaguicidas organoclorados (figura 4.3.4), se encontraron en

mayor concentración en Dzilam destacando las medianas de Clorbenceno (45.414

ng/g), HCHs (34.732 ng/g), Clordanos (39.724 ng/g), DDTs (8.059 ng/g) y plaguicidas

totales ( 224.543 ng/g)

Figura 4.3.2. Concentraciones medianas de las fracciones de

hidrocarburos en organismos durante la época de lluvias, en las

lagunas estudiadas.

Dzilam Celestún Términos

Lluvias

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

Hid

roca

rbur

os (µ

g/g)

Alifáticos UCM BPM APM PAHs Totales

Figura 4.3.3. Concentraciones medianas de las fracciones de

plaguicidas organoclorados en organismos durante la época de

secas, en las lagunas estudiadas.

Dzi lam Cel est ún T érm inos

Secas

0

100

200

300

400

500

600

Pla

guic

idas

(ng/

g)

Clorobenceno HCHs Clordanos Drines DDT s PC aniso l Endosul fan M i rex T otales

Dzilam Celestún Términos

Lluvias

0

100

200

300

400

500

600

Plag

uici

das

(ng/

g)

Clorobenceno HCHs Clordanos Drines DDTs PC anisol Endosulfan Mirex Totales

Figura 4.3.4. Concentraciones medianas de las fracciones de

plaguicidas organoclorados en organismos durante la época de

lluvias, en las lagunas estudiadas.

En la figura 4.3.5 se presentan las medianas de las concentraciones de PCBs para la

época de secas, cabe mencionar que aunque en general las concentraciones obtenidas

son muy bajas, la mayor concentración de PCBs totales se encontró en Términos

(mediana = 57.368 ng/g) y que Celestún presentó la máxima concentración absoluta de

PCBs tetraclorados (473.229 ng/g) y de triclorados (153.679 ng/g).

Para la época de lluvias las concentraciones de PCBs de igual manera son muy bajas,

aunque en Dzilam se presentó la más alta concentración de PCBs totales (mediana =

83.557 ng/g) y de PCBs triclorados (mediana = 36.906 ng/g).

Dzilam Celestún Términos

Secas

0

100

200

300

400

500

PC

Bs

(ng/

g)

Diclorados Triclorados Tetraclorados Pentaclorados Hexaclorados Heptaclorados Octaclorados Nonaclorados Decaclorados Totales

Figura 4.3.5. Concentraciones medianas de las fracciones de

bifenilos policlorados en organismos durante la época de secas, en

las lagunas estudiadas.

Se realizaron ANOVAS no paramétricos para determinar diferencias significativas entre

épocas (secas-lluvias) los resultados se observan en las figuras 4.3.7, 4.3.8 y 4.3.9.

Los organismos capturados en Dzilam presentaron diferencias significativas (figura

4.3.7) entre secas y lluvias (p < 0.05), para Celestún solo se presento diferencia

significativa (p< 0.05) entres épocas para PAHs de bajo peso molecular y para

Términos se presentaron diferencias significativas entre épocas para PAHs de bajo

peso molecular y PAHs de alto peso molecular.

Dzilam Celestún Términos

Lluvias

0

100

200

300

400

500

PC

Bs

(ng/

g)

Diclorados Triclorados Tetraclorados Pentaclorados Hexaclorados Heptaclorados Octaclorados Nonaclorados Decaclorados Totales

Figura 4.3.6. Concentraciones medianas de las fracciones de

bifenilos policlorados en organismos durante la época de lluvias, en

las lagunas estudiadas.

Para plaguicidas en organismos se encontraron diferencias significativas (p<0.05) entre

épocas en Dzilan para Clorobenceno, Clordanos, Drines y plaguicidas totales. Para

Celestún no se observaron diferencias significativas entre épocas y para Términos se

presentaron diferencias significativas para todos los compuestos (p<0.05) a excepción

de Clorobenceno y Endosulfan II, los cuales no fueron diferentes estadísticamente.

Para PCBs en organismos (figura 4.3.9) se encontraron diferencias significativas

(p<0.05) en Dzilam entre secas y lluvias para los diclorados y decaclorados, así como

los PCBs totales. En Celestún se presentaron diferencias significativas para los

Tetraclorados y los PCBs totales y por último para Términos se obtuvieron diferencias

significativas para los PCBs diclorados, triclorados, tetraclorados, pentaclorados y los

PCBs totales.

Dzilam SecasCelestún Secas

Términos SecasDzilam Lluvias

Celestún LluviasTérminos Lluvias

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

Hid

roca

rbur

os (µ

g/g)

Alifáticos UCM BPM APM PAHs Totales

. .. . .. . . .

Figura 4.3.7. Grupos de hidrocarburos en organismos con diferencias

significativas (punto azul) entre épocas de secas y lluvias.

Dzilam SecasCeles tún Secas

Térm inos SecasDzilam Lluvias

Celes tún LluviasTérm inos Lluvias

S itio

0

100

200

300

400

500

600

Plag

uici

das

(ng/

g)

Clorobenceno HCHs Clordanos Drines DDTs PC anisol Endosulfan Mirex Totales

. ..

...... .

.

Figura 4.3.8. Grupos de plaguicidas en organismos con diferencias

significativas (punto azul) entre épocas de secas y lluvias.

Dzilam SecasCeles tún Secas

Térm inos SecasD zilam L luvias

Celes tún LluviasTérm inos Lluvias

0

100

200

300

400

500

600

PC

Bs

(ng/

g)

Diclorados Triclorados Tetraclorados Pentaclorados Hexaclorados Heptaclorados Octaclorados Nonaclorados Decaclorados Totales

.

.

.

. .

..

.

.

.

Figura 4.3.9. Grupos de bifenilos policlorados en organismos con

diferencias significativas (punto azul) entre épocas de secas y lluvias.

En las siguientes tablas se encuentran los grupos de contaminantes en organismos que

observaron diferencias significativas en la comparación entre épocas.

Tabla 4.3.1.Grupos de contaminantes en organismos que presentaron diferencias significativas entre épocas para la laguna de Dzilam.

Dzilam H Valor

p Clorobencenos 6.6269 0.01

Clordanos 9.4338 0.0021Drines 3.9837 0.0459

Plaguicidas Totales 15.58 0.0001ALIF 11.9501 0.0005UCM 12.6377 0.0004BPM 15.5806 0.0001APM 15.5806 0.0001PAHs 15.5806 0.0001

Hidrocarburos Totales 15.5806 0.0001Diclorados 8.8787 0.0029

Decaclorados 5.9905 0.0144PCBs Totales 8.5138 0.0035

Tabla 4.2.3.Grupos de contaminantes en organismos que presentaron diferencias significativas entre épocas para la laguna de Celestún.

Celestún H Valor

p BPM 14.47 0.0001

Tetraclorados 10.369 0.0013PCBs Totales 4.6755 0.0306

Tabla 4.2.3.Grupos de contaminantes en organismos que presentaron diferencias significativas entre épocas para la laguna de Términos.

Términos H Valor p

HCHs 21.2899 0 Clordanos 17.6641 0

Drines 8.2146 0.0042 DDTs 35.4681 0

PC anisol 8.1061 0.0044 Mirex 4.6304 0.0314

Plaguicidas Totales 14.0928 0.0002 BPM 24.0998 0 APM 16.0555 0.0001

Diclorados 4.6304 0.0314 Triclorados 9.972 0.0016

Tetraclorados 23.4348 0 Pentaclorados 5.3743 0.0204 PCBs Totales 27.0276 0

Nota: 0 = p< 0.0001

4.4 Biomarcadores Bioquímicos Época de Secas

Los resultados del contenido total de CYP, de la actividad enzimática de EROD y la

concentración de proteína total en los bagres Ariopsis felis colectados en las Lagunas

de Terminos, Celestún y Bocas de Dzilam, se muestran en la tabla 4.1.

4.4.1 Contenido Total de Citocromo P450 (CYP) Como se puede observar, la máxima concentración de CYP total en la época de secas,

fue encontrada en bagres colectados en la Laguna de Celestún, en donde la máxima

concentración fue de 158.62 pmol/mg de proteína, mientras que las menores

concentraciones de esta proteína fueron encontrados en peces capturados en la

Laguna de Términos y en la de Dzilam, con niveles de 46.86 y 49.65 pmo/mg de

proteína, respectivamente (Fig. 4.4.1).

Debido a que las concentraciones de CYP no presentaron una distribución normal se

realizó un análisis de varianza no paramétrica de Kruskal-Wallis, en donde los

resultados demostraron que si existieron diferencias estadísticas significativas entre las

concentraciones de CYP total de los peces colectados en la Laguna de Celestún y los

colectados en la Laguna de Términos y Dzilam (H= 9.1543; P< 0.003), (Fig. 4.4.1).

Fig. 4.4.1. Contenido total de CYP en hígados de bagres Ariopsis felis colectados en las lagunas de Términos, Celestún y Dzilam (Época de Secas).

T érm inos Celestún Dzi lam

Loca li dad

40

60

80

100

120

140

160

180

Con

teni

do T

otal

Cito

crom

o P

450

(nm

ol /

mg

prot

eína

)

Median 25%-75% Min-Max

Pez Laguna Época Climática CYP Total EROD Proteína Total Gen CYP1A Densitometría VTG

# nmol / mg de proteína pmol /min/mg de proteína mg / ml Unidades de Densitometría Unidades de Densitometría 1 Dzilam Secas 106.36 19.6 11.2 6142 211562 Dzilam Secas 102.24 14.7 9.58 4265 201653 Dzilam Secas 110.65 20.4 13.2 6532 216304 Dzilam Secas 96.65 11.6 8.95 5690 261585 Dzilam Secas 98.65 15.6 10.6 6321 320156 Dzilam Secas 49.65 16.7 11.3 4569 215607 Dzilam Secas 86.32 11.6 8.69 6148 269858 Dzilam Secas 78.60 16.3 8.65 6325 225699 Dzilam Secas 76.65 16.8 9.7 4986 3156010 Dzilam Secas 125.62 12.2 10.3 5698 3058911 Dzilam Secas 102.65 16.5 10.3 6547 3265912 Dzilam Secas 109.65 14.7 10.5 4965 3269513 Dzilam Secas 110.65 25.63 10.36 4569 2156014 Dzilam Secas 49.6 16.65 9.61 4265 3201515 Dzilam Secas 96.89 11.60 10.3 6547 016 Dzilam Secas 79.65 16.78 10.5 6532 2698517 Dzilam Secas 100.05 12.19 11.65 4569 019 Dzilam Secas 79.64 16.47 8.65 4569 3156018 Dzilam Secas 98.96 14.70 9.6 6547 225691 Celestún Secas 156.35 22.36 9.6 8848 378562 Celestún Secas 149.60 10.58 12.3 8119 356983 Celestún Secas 158.62 16.55 10.3 8121 345624 Celestún Secas 96.65 11.63 11.2 7652 326545 Celestún Secas 118.62 13.08 8.65 9422 375896 Celestún Secas 135.62 7.13 18.3 8110 412567 Celestún Secas 130.85 11.60 11.23 8120 423658 Celestún Secas 116.56 18.25 9.56 7640 403659 Celestún Secas 159.62 12.19 14.32 8848 3456210 Celestún Secas 94.65 14.70 11.6 8119 3653211 Celestún Secas 110.65 14.33 12.32 9422 3641212 Celestún Secas 154.89 9.06 14.6 8121 3625413 Celestún Secas 136.25 16.55 10.3 7652 3985614 Celestún Secas 125.3 8.15 8.69 8116 4210315 Celestún Secas 124.6 6.63 9.62 8841 4136516 Celestún Secas 98.65 8.29 10.36 9320 4123617 Celestún Secas 98.6 2.03 11.36 7890 4321018 Celestún Secas 149.65 6.80 11.32 8110 4156319 Celestún Secas 146.25 8.43 10.23 8850 4725620 Celestún Secas 110.23 13.20 9.86 9422 4125621 Celestún Secas 98.65 7.50 9.68 9320 4023622 Celestún Secas 99.65 8.32 10.32 8850 3896523 Celestún Secas 106.35 2.39 9.65 8110 3564124 Celestún Secas 108.65 7.84 8.98 8840 3845625 Celestún Secas 110.25 14.33 11.32 8792 3256376 Términos Secas 46.86 17.65 11.23 9612 4859677 Términos Secas 112.35 25.30 11.36 12120 4896578 Términos Secas 110.40 27.10 10.21 7855 4756379 Términos Secas 105.63 18.61 9.98 11751 5123680 Términos Secas 98.65 26.30 10.65 11609 6253681 Términos Secas 79.65 10.83 11.64711778 9612 6548982 Términos Secas 106.56 25.60 10.23 11751 7230183 Términos Secas 85.62 19.37 11.4 8792 6598784 Términos Secas 104.32 19.50 11.23 11560 7025685 Términos Secas 92.65 24.30 8.96 12650 5598786 Términos Secas 115.32 22.98 9.61 12100 5898687 Términos Secas 105.32 19.70 11.65 7855 6258988 Términos Secas 112.6 18.50 10.23 9865 5966289 Términos Secas 92.89 20.14 8.68 11056 5863290 Términos Secas 106.56 19.33 11.32 8100 7256091 Términos Secas 98.65 26.93 9.65 12120 7263292 Términos Secas 98.61 20.95 12.32 11609 74655

Tabla 4.4.1. Concentración de Citocromo P450 total (CYP), Actividad enzimática EROD y Expresión de los genes CYP1A y Vitelogenina en bagres Ariopsis felis colectados en las lagunas de Dzilam, Celestún y Términos. (Época de Secas).

4.4.2 Actividad Enzimática EROD (Ethoxyresorufin-O- deethilasa). Los resultados de la actividad EROD en los peces colectados en las diferentes lagunas

del Golfo de México en la época de secas se muestran en la tabla 4.1. Como se puede

observar en esta tabla, las mayores actividades enzimáticas de EROD fueron

encontradas en los bagres colectados en la Laguna de Términos en donde la mediana

de la actividad EROD fue de 21.99 pmol/min/mg de proteína (Fig. 4.2). Todo lo contrario

ocurrió con las actividades enzimáticas de los bagres colectados en la Laguna de

Celestún en donde se registraron las mínimas actividades enzimáticas de todo el

estudio (Fig. 4.2).

4.4.3 Biomarcadores Moleculares Época de Secas

Extracción del RNA.

Fig. 4.2. Actividad enzimática de EROD en hígados de bagres Ariopsis felis colectados en las lagunas de Términos, Celestún y Dzilam (Época de Secas).

T érm inos Celestún Dzi lam

Loc ali dad

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

34

Act

ivid

ad E

RO

D (p

mol

/min

/mg

de p

rote

ína)

Median 25%-75% Min-Max

Antes de evaluar la expresión del gen del CYP1A y de la VTG fue necesario evaluar la

integridad del RNA ya que en caso de haber una degradación del RNA no hubiera sido

posible determinar la inducción de estos genes. En la figura 4.3, se muestran los geles

en donde aparecen las dos bandas correspondientes a las dos subunidades del RNA.

La visualización de estas dos bandas nos indicó que el RNA se encontró en buen

estado y que por lo tanto es posible evaluar la expresión de los diferentes genes. En

esta misma figura, se muestran los geles con el RNA de todas las muestras de hígados

de bagres capturados en la zona de estudio.

Finalmente, para poder continuar lo análisis de expresión génica, el RNA total fue

cuantificado por medio de un espectrofotómetro a una longitud de onda de 260 y 280

nm. El RNA total extraído fue utilizado para evaluar la expresión de genes por medio de

la técnica de RT-PCR.

Fig. 4.3. Geles de agarosa al 1.5 % en donde se puede visualizar la integridad de las subunidades del RNA en muestras de hígado de pez de la especie Spheroides testudineus colectados en la costa del estado de Yucatán.

1KB 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1KB 1 2 3 4 5 6 7 8 9

CHUBURNA

CHELEM

CHICXULUB 1KB 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Subunidades del RNA

4.4.4 Evaluación de la Expresión del Gen CYP1A por Medio de la Técnica de RT-PCR.

Una vez confirmada la integridad y la concentración del RNA, se evaluó la inducción del

gen del CYP1A mediante la reacción de RT-PCR en los hígados de todos los bagres

colectados en la época de secas. En la figura 4.4 se muestran el gel conteniendo un

pool de todas las muestras en donde se puede visualizar una banda de 568 pb

correspondiente a un fragmento del gen del CYP1A. Adicionalmente, en esta misma

figura se muestra la banda de 280 pb que corresponde a un fragmento del gen

constitutivo llamado β-actina que fue utilizado como un estándar interno.

En esta misma figura las bandas más intensas correspondieron a los peces colectados

en la Laguna de Términos. Sin embargo, es importante mencionar que la inducción del

CYP1A en los peces de estas estaciones fue muy significativa, al ser comparada con

los niveles del CYP1A de los peces colectados en la Laguna de Dzilam en donde los

bagres no expresaron claramente la inducción de este gen.

CYP1A (568 pb)

ACTINA (280 pb)

Fig.4.4. Gel de agarosa en donde se visualiza los fragmentos amplificados por la técnica de RT-PCR. Carril 1, Marcador molecular. Carril 2, Muestras de Términos, Carril 3, Muestras de Dzilam, Carril 4, Muestras de Celestún.

1 2 3 4 5

Al analizar las densitometrías de todos los peces colectados en la época de secas

podemos observar si existieron diferencias significativas muy marcadas entre los

bagres colectados en la Laguna de Términos y Celestún con los colectados en la

Laguna de Dzilam (Fig. 4.5)

4.4.5 Evaluación de la Expresión del Gen Vitelogenina (VTG) por Medio de la Técnica de RT-PCR.

La inducción del gen de la VTG fue analizada evaluada mediante la reacción de RT-

PCR en los hígados de todos los bagres colectados en la época de secas. En la figura

4.6, se muestran los geles con los fragmentos amplificados de algunos los peces

colectados en donde se puede visualizar una banda de 568 pb correspondiente a un

fragmento del gen de la VTG. Adicionalmente, en esta misma figura se muestra la

banda de 300 pb que corresponde a un fragmento del gen constitutivo llamado β-actina

que fue utilizado como un estándar interno.

Celestún Dzi lam T érm inos

Localidad

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Uni

dade

s de

Den

sito

met

ría

Median 25%-75% Min-Max

Fig. 4.5 Análisis densitométrico del gen CYP1A de los bagres Ariopsis felis colectados en la Laguna de Celestún, en Dzilam y en Términos. (Época de secas).

Como se puede observar en esta misma figura las bandas más intensas

correspondieron a los peces colectados en la Laguna de Términos. Después de

considerar todas las densitometrías y después de realizar una prueba no paramétrica

de Kruskal Wallis, los resultados mostraron que si existieron diferencias estadísticas

significativas entre los niveles de la VTG (H= 52.60, P= 0.0003) en los peces

comparados entre las lagunas de Celestún, Dzilam y Términos (Fig. 4.7).

Fig. 4.7 Análisis densitométrico del gen de la VTG de los bagres Ariopsis felis colectados en la Laguna de Celestún, en Dzilam y en Términos (Época de secas).

Celestún T érm inos Dzi lam

Local idad

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

VTG

(Uni

dade

s de

Den

sito

met

ría)

Median 25%-75% Min-Max

Gen VTG

568 pb

Fig. 4.6. Gel de agarosa al 1 % donde se visualiza la expresión del gen de la Vitelogenina en hígado de bagres Ariopsis felis colectados en las lagunas de Celestún, Términos y Dzilam (Época de Secas).

Términos Celestún

Dzilam

4.5.1 Biomarcadores Bioquímicos Época de Lluvias

Los resultados del contenido total de CYP, de la actividad enzimática de EROD y la

concentración de proteína total en los bagres Ariopsis felis colectados en la época de

lluvias en las Lagunas de Terminos, Celestún y Bocas de Dzilam, se muestran en la

tabla 4.2.

4.5.2 Contenido Total de Citocromo P450 (CYP) Las máximas concentraciones de CYP total en la época de lluvias, fueron encontradas

en los bagres colectados en la Laguna de Términos y de Celestún, en donde las

máximas concentraciones fueron de 198.3 y 189.6 pmol/mg de proteína,

respectivamente, mientras que las menores concentraciones de esta proteína fueron

encontrados en peces capturados en la Laguna de Dzilam, con niveles de 42.6 pmo/mg

de proteína (Fig. 4.8). El resultado del análisis de varianza no paramétrica de Kruskal-

Wallis, demostró que si existieron diferencias estadísticas significativas entre las

concentraciones de CYP total de los peces colectados en la Laguna de Celestún y los

colectados en la Laguna de Términos y Dzilam (H= 10.6077; P< 0.0050).

Tabla 4.2. Concentración de Citocromo P450 total (CYP), Actividad enzimática EROD y Expresión de los genes CYP1A y Vitelogenina en bagres Ariopsis felis colectados en las lagunas de Dzilam, Celestún y Términos. (Época de Lluvias).

Pez Laguna Época Climática CYP Total EROD Proteína Total Gen CYP1A Densitometría VTG

# nmol / mg de proteína pmol /min/mg de proteína mg / ml Unidades de Densitometría Unidades de Densitometría 1 Dzilam Lluvias 89.65 12.19 8.65 7589 02 Dzilam Lluvias 78.95 14.70 9.65 5698 325633 Dzilam Lluvias 136.32 14.33 8.56 6985 04 Dzilam Lluvias 79.65 9.06 11 7896 365485 Dzilam Lluvias 113.35 16.55 9.32 6594 06 Dzilam Lluvias 113 8.15 8.25 8965 07 Dzilam Lluvias 142.3 12.35 10.23 8562 08 Dzilam Lluvias 42.6 9.65 9.65 6592 09 Dzilam Lluvias 76.56 16.98 11.23 5986 2156010 Dzilam Lluvias 58.96 15.32 10.36 7895 011 Dzilam Lluvias 136.32 21.23 9.325 9865 2163012 Dzilam Lluvias 109.6 18.65 11.2 4256 2615813 Dzilam Lluvias 78.95 19.45 9.56 9863 014 Dzilam Lluvias 92.65 16.32 8.98 6598 015 Dzilam Lluvias 79.65 17.56 11.64 7654 3265816 Dzilam Lluvias 113.35 12.45 7.61 9123 3265817 Dzilam Lluvias 109.6 16.80 7.65 8978 3021518 Dzilam Lluvias 142.3 20.30 9.62 9632 019 Dzilam Lluvias 42.6 18.90 8.6 8965 020 Dzilam Lluvias 41.65 16.50 8.65 7890 021 Dzilam Lluvias 111.32 14.60 9.58 8652 022 Dzilam Lluvias 113.2 15.30 11.23 9630 023 Dzilam Lluvias 49.68 12.50 11.36 7636 0101 Celestún Lluvias 116.32 32.68 9.6 10785 48652102 Celestún Lluvias 158.36 28.65 12.3 11650 51263103 Celestún Lluvias 165.32 26.35 10.3 12560 42108104 Celestún Lluvias 148.6 21.63 11.2 4856 40365105 Celestún Lluvias 123.65 33.20 8.65 16958 0106 Celestún Lluvias 79.65 17.65 18.3 7658 39856107 Celestún Lluvias 89.65 22.30 11.23 11520 0108 Celestún Lluvias 145.25 28.60 9.56 9265 36254109 Celestún Lluvias 178.2 22.30 14.32 10780 0110 Celestún Lluvias 146.36 24.70 11.6 11540 42103111 Celestún Lluvias 189.65 24.70 12.32 9420 0112 Celestún Lluvias 79.65 19.65 14.6 9630 0113 Celestún Lluvias 89.65 26.30 10.3 11560 396582114 Celestún Lluvias 158.36 18.90 8.69 10632 34562115 Celestún Lluvias 145.25 16.65 9.62 9654 0116 Celestún Lluvias 148.6 28.64 10.36 8965 36412117 Celestún Lluvias 123.65 22.36 11.36 10651 0118 Celestún Lluvias 110.36 36.20 11.32 9423 36532119 Celestún Lluvias 110.3 36.10 10.23 9180 72301120 Celestún Lluvias 165.32 33.20 9.86 8652 70256121 Celestún Lluvias 178.2 27.60 9.68 10560 55987122 Celestún Lluvias 115.3 28.60 10.32 8970 58986176 Términos Lluvias 123.63 30.20 11.23 8965 0177 Términos Lluvias 105.63 34.20 10.32 6520 0178 Términos Lluvias 98.65 39.60 14.32 12560 0179 Términos Lluvias 179.36 28.60 12.32 11985 67885180 Términos Lluvias 156.35 26.50 11.65 12569 0181 Términos Lluvias 110.36 39.50 9.65 13650 59868182 Términos Lluvias 149.60 31.29 8.26 13110 69854183 Términos Lluvias 158.62 32.60 10.36 13962 62589184 Términos Lluvias 96.65 31.2 11.23 12456 65231185 Términos Lluvias 118.62 39.8 8.96 12654186 Términos Lluvias 189.6 39.5 9.61 13692 72560187 Términos Lluvias 198.3 36.1 11.65 14652 69852188 Términos Lluvias 96.6 31.5 10.23 12456 65987189 Términos Lluvias 158.62 34.2 8.68 12698 0190 Términos Lluvias 96.65 36.7 11.32 16980 0191 Términos Lluvias 118.62 37.5 9.65 10786 0192 Términos Lluvias 113.2 35.20 12.32 14320 0193 Términos Lluvias 189.6 32.4 11.3 16951 65325194 Términos Lluvias 198.3 32.6 10.5 14326 0195 Términos Lluvias 178.2 39.6 11.6 13562 0196 Términos Lluvias 115.3 39.6 12.3 12941 353201197 Términos Lluvias 123.63 34.6 11.4 12659 0198 Términos Lluvias 100.36 35.3 10.6 13654 0199 Términos Lluvias 98.65 33.6 10.3 10785 56982200 Términos Lluvias 98.78 36.6 10.5 13265 0

4.5.3 Actividad Enzimática EROD (Ethoxyresorufin-O- deethilasa). Los resultados de la actividad EROD en los peces colectados en la época de lluvias en

los diferentes sistemas costeros del Golfo de México, se muestran en la tabla 2. Como

se puede observar en esta tabla, la mayor actividad enzimática de EROD fue

encontrada en los bagres colectados en la Laguna de Términos con un valor de 46. 6

pmol/min/mg de proteína (Fig. 4.9). Todo lo contrario ocurrió con las actividades

enzimáticas de los bagres colectados en la Laguna de Dzilam en donde se registraron

las mínimas actividades en la época de lluvias. De la misma forma que con el contenido

total de CYP, el resultado del análisis no paramétrico de Kruskal-Wallis, demostró que

si existieron diferencias estadísticas significativas entre las actividades de EROD de los

peces colectados en las Lagunas de Celestún, Términos y Dzilam (H= 22.3731; P<

0.0000), (Fig. 4.9).

Fig. 4.8. Contenido total de CYP en hígados de bagres Ariopsis felis colectados en las lagunas de Términos, Celestún y Dzilam (Época de Lluvias).

Celestún Dzi lam T érm inos

Local idad

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

Con

teni

do T

otal

de

CY

P (p

mol

/mg

prot

eína

)

Median 25%-75% Min-Max

4.5.4 Biomarcadores Moleculares Época de Lluvias

4.5.5 Evaluación de la Expresión del Gen CYP1A por Medio de la Técnica de RT-PCR.

En la figura 4.10 se muestra el análisis densitométrico de los fragmentos del gen

CYP1A de todos los peces colectados en las Lagunas de Celestún, Términos y Dzilam.

Como se puede observar las bandas más intensas correspondieron a los peces

colectados en la Laguna de Términos, seguidas por los peces de la Laguna de

Celestún. Estos resultados nos indican que los peces colectados en la laguna de

Términos presentan una alteración en su metabolismo producto de la exposición a

diferentes xenobióticos. Es importante mencionar que tal y como se observa en esta

Fig. 4.9. Actividad enzimática de EROD en hígados de bagres Ariopsis felis colectados en las lagunas de Términos, Celestún y Dzilam (Época de Lluvias).

Celestún Dzi lam T érm inos

Local idad (Epoca de l luvias)

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Act

ivid

ad E

RO

D (p

mol

/ m

in /

mg

prot

eína

)

Median 25%-75% Min-Max

misma figura, la inducción del CYP1A en los peces de esta laguna fue muy significativo,

al ser comparada con la densitometría de los demás peces.

4.5.6 Evaluación de la Expresión del Gen VTG por Medio de la Técnica de RT-PCR.

En la figura 4.11, se muestra un gel en donde se visualiza un fragmento amplificado del

gen de la VTG. Adicionalmente, en esta misma figura se muestra la banda de 300 pb

que corresponde a un fragmento del gen constitutivo llamado β-actina que fue utilizado

como un estándar interno.

La sobre expresión del gen de la VTG fue menos evidente en la época de secas. Sin

embargo, los peces que tuvieron una alta expresión en la época de lluvias fueron

colectados en la laguna de Términos.

Celestún Dzilam Términos

Local idad

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

Uni

dade

s de

Den

sito

met

ría Median

25%-75%

Min-Max

Fig. 4.10 Análisis densitométrico del gen CYP1A de los bagres Ariopsis felis colectados en la Laguna de Celestún, en Dzilam y en Términos. (Época de lluvias).

Al igual que con los resultados del gen del CYP1A, los resultados muestran que los

bagres colectados en esta laguna presentan una alteración en la expresión de este gen

y adicionalmente, en esta laguna se detectaron tres peces con células reproductoras

masculinas y en estos mismos peces células reproductoras femeninas en proceso de

vitelogénesis.

En la figura 4.12 se muestran las medianas de todas las densitometrías determinadas

en los bagres colectados en las tres lagunas. Como se puede apreciar el gen de la VGT

fue muy variable, sin embargo, los mayores niveles detectados fueron en los peces

colectados en la Laguna de Términos. El análisis de no paramétrico de Kruskall Wallis

demostró que no hubieron diferencias estadísticas significativas entre los niveles de la

VTG de todos los peces colectados en la época de lluvias.

Fig. 4.11. Gel de agarosa al 1.5 % donde se visualiza la expresión del gen de la Vitelogenina en hígado de bagres Ariopsis felis colectados en las lagunas de Celestún, Términos y Dzilam (Época de Lluvias).

Gen de la VTG

568 pb

De acuerdo con los resultados obtenidos en el muestreo de secas y de lluvias del 2005,

podemos observar que los niveles del CYP fueron relativamente mayores en los peces

colectados en la época de lluvias. Sin embargo, las menores concentraciones de CYP

fueron muy similares en ambas épocas climáticas (Fig. 4.13).

Aún cuando en la gráfica anterior se muestran que los niveles de CYP fueron

relativamente más altos en la época de lluvias, al comparar los valores de CYP de los

peces colectados en todas las lagunas en las dos épocas climáticas podemos observar

que si existió un incremento significativo en los valores de CYP en los peces colectados

durante la época de lluvias (Fig. 4.13). Estos resultados nos sugieren que en la época

de lluvias pueden estarse arrastrando diferentes compuestos orgánicos persistentes

que a la vez son absorbidos por los peces produciendo una mayor inducción de alguna

isoforma del CYP.

Fig. 4.12 Análisis densitométrico del gen de la VTG de los bagres Ariopsis felis colectados en la Laguna de Celestún, en Dzilam y en Términos (Época de lluvias).

Celestún Lluvias Dzilam Lluvias Términos Lluvias

Localidad

-10000

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

VTG

(Uni

dade

s de

Den

sito

met

ría)

Median 25%-75% Min-Max

Por otro lado, aún cuando los niveles de CYP total de los bagre Ariopsis felis fueron

variables el análisis de varianza demostró que si existieron diferencias significativas

entre las dos épocas climáticas (21.0133; p= 0.0008), (Fig. 4.14).

Por otro lado, al evaluar el comportamiento de la actividad de la enzima EROD (la cual

es una medición directa de la isoforma del CYP1A) pudimos observar que los peces

que tuvieron las mayores inducciones de este CYP1A fueron peces colectados en la

época de lluvias (Fig. 4.15). Estos datos nos confirman que los peces que tuvieron un

alto contenido de CYP también fueron los que incrementaron la isoforma CYP1A que

generalmente son inducidos por compuestos planos como los hidrocarburos aromáticos

policíclicos (PAHs), algunos plaguicidas organoclorados y los bifenilos policlorados

(PCBs).

secas l luvias

ÉPOCA CLIM ÁT ICA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

Con

teni

do T

otal

de

CY

P (p

mol

/ m

g pr

oteí

na)

Median 25%-75% Min-Max

Fig. 4.13. Contenido total de CYP en hígados de bagres Ariopsis felis colectados en todas las lagunas (Términos, Celestún y Dzilam) durante la Época de Secas y Lluvias.

Términos secas Celestún secas Dzilam secas Términos lluvias Celestún lluvias Dzilam lluvias

Localidad

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

Con

teni

do T

otal

de

CYP

(pm

ol /

mg

prot

eína

)

Median 25%-75% Min-Max

Fig. 4.14. Contenido total de CYP en hígados de bagres Ariopsis felis colectados en todas las lagunas de Términos, Celestún y Dzilam durante las dos épocas climáticas (Secas y Lluvias).

Secas Lluvias

ÉPOCA CLIMÁTICA

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Activ

idad

de

ERO

D (p

mol

/ m

in/ m

g pr

oteí

na)

Median 25%-75% Min-Max

Fig. 4.15. Actividad enzimática EROD en hígados de bagres Ariopsis felis colectados en todas las lagunas (Términos, Celestún y Dzilam) durante la Época de Secas y Lluvias.

Por otro lado, después de realizar un análisis de varianza no paramétrico sobre las

actividades de EROD, pudimos observar que si existieron diferencias estadísticas muy

significativas entre las dos épocas climáticas (H=37.2211; p= 0.0000), (Fig. 4.15). De la

misma forma, este comportamiento fue observado cuando comparamos los contenidos

totales de CYP de todos los bagres colectados tanto en la época de secas como en la

de lluvias, donde los mayores valores detectados fueron en los bagres colectados en

las lagunas de Términos y de Celestún (Fig. 4.16).

Las actividades EROD descritas en este estudio son ligeramente más altas a las

reportadas por Willett et al. (1997) en donde evaluaron estas mismas actividades en

peces colectados en la Bahía de Galveston. Sin embargo, las actividades de EROD

fueron mayores a las detectadas en los bagres Ariopsis felis de la Bahía de Chetumal

Términos secas Celestún secas Dzilam secas Términos lluv ias Celestún lluv ias Dzilam lluv ias

Localidad

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Activ

idad

ER

OD

(pm

ol /

min

/ m

g pr

oteí

na)

Median 25%-75% Min-Max

Fig. 4.16. Actividad enzimática EROD en hígados de bagres Ariopsis felis colectados en todas las lagunas de Términos, Celestún y Dzilam durante las dos épocas climáticas (Secas y Lluvias).

(Datos No publicados). Por otro lado, aunque existen trabajos en donde han encontrado

inducciones mayores a las observadas en este estudio (hasta 1700 pmol/min/mg de

proteína), es importante mencionar que estas actividades han sido determinadas en

diferentes especies a las utilizadas en este estudio y sobre todo han sido detectadas

con especies que habitan en otras partes del mundo y en zonas con diferentes

temperaturas (George et al., 1990; Gray et al., 1991; Monosson and Stegeman, 1994).

Los estudios de la actividad enzimática EROD para evaluar el efecto de los

contaminantes en peces y en diferentes sistemas acuáticos en diferentes partes del

mundo, son diversos (Armstrong et al., 1995; Hawkins et al., 1994; Hocutt 1975; Littler

and Murray 1975; Warwick et al., 1990). Sin embargo, en nuestro país aún no existen

trabajos disponibles en donde haya evaluado el impacto de los contaminantes utilizando

la actividad enzimática EROD como un biomarcador de efecto.

Los resultados de los hidrocarburos, plaguicidas y PCBs en tejidos de peces en la

época de secas reportados en este estudio mostraron que la concentración de

hidrocarburos aromáticos policíclicos e hidrocarburos totales fueron muy elevadas,

sobre todo en los peces colectados en las lagunas de Celestún y Términos. Sin

embargo, en la época de lluvias los peces que tuvieron las mayores concentraciones de

plaguicidas hidrocarburos y PCBs fueron los colectados en la laguna de Dzilam.

Es importante mencionar que aún cuando las concentraciones no han sido las mayores

detectadas en los peces en sistemas costeros del Golfo de México, si es muy claro que

estos peces muestran una fuerte evidencia de exposición a diferentes contaminantes.

Uno de los aspectos más sorprendentes de este estudio es que los peces colectados

en laguna de Dzilam (considerada como control debido a la falta de actividades

industriales y antropogénicas en esta zona) se detectaron altas concentraciones y

residuos de diferentes contaminantes orgánicos persistentes, así como altos niveles de

biomarcadores en los bagres que habitan estas lagunas.

Los bagres (Ariopsis felis) utilizados en este estudio normalmente se alimentan de

diferentes invertebrados bentónicos y estos peces no sólo están expuestos a los

contaminantes a través de la cadena trófica sino que también por la exposición directa

(por el contacto con los sedimentos) y a través de las branquias. Esta exposición de

contaminantes trae como consecuencia que los organismos modifiquen los niveles

enzimáticos en un afán de transformar y de eliminar a los diferentes contaminantes.

Dado que la fracción de los PAHs son importantes desde el punto de vista

ecotoxicológico y dado que los PAHs inducen al Citocromo P450 en peces y en una

amplia gama de animales (Stegeman et al., 1992), y James (1984) los resultados del

CYP1A (medido por la actividad EROD) mostraron que los bagres colectados en la

Laguna de Términos fueron los que presentaron las mayores actividades durante las

dos épocas climáticas. Los resultados de la actividad EROD y del Contenido total de

citocromo P450 en los peces colectados en las tres lagunas fueron variables tanto en la

época de secas como en la de lluvias, pero los resultados del análisis de varianza de

Kruskall Wallis demostraron que si existieron diferencias estadísticas significativas entre

las actividades de los bagres colectados en las lagunas de Términos, Celestún y Dzilam

(P= 0.002).

Aún cuando las actividades EROD fueron muy elevadas y consistentes en los bagres al

hacer un análisis de correlación de Spearman, los resultados mostraron una baja

correlación con los contaminantes. Las únicas correlaciones muy consistentes fueron

con los metabolitos en la bilis como el Benzo(a)pireno (r= 0.6987). y el 1.OH pireno (r=

0.6623). Estos resultados, nos indican la participación del gen CYP1A, específicamente

la actividad EROD en la transformación de los hidrocarburos aromáticos policíclicos.

Aún cuando mostramos una fuerte evidencia de las alteraciones enzimáticas de los

peces colectados en las diferentes lagunas, existe una falta de asociación y

significancia entre los contaminantes y las actividades EROD y el contenido Total de

CYP. Esto puede ser debido a la alta movilidad que presentan los peces de una zona a

otra, aunque en realidad, los resultados de las actividades EROD nos indican las

actividades enzimáticas de los bagres al momento de la colecta y estos niveles nos

indican que tan activos se encuentran estas enzimas en el proceso de transformación y

eliminación de los contaminantes. Por oro lado, de acuerdo a los resultados obtenidos

de los contaminantes en los tejidos de los peces, se puede observar que las

concentraciones de los contaminantes no son iguales en todos los peces, por lo que es

una causa muy sólida para poder entender la falta de asociación entre los

contaminantes y las actividades EROD.

Por otro lado, al comparar las actividades de EROD y el contenido total del CYP entre

las dos diferentes épocas climáticas se observa que hay una elevación muy significativa

en los niveles de estos biomarcadores en la época de lluvias. Este mismo

comportamiento se observa con los niveles de contaminantes en los peces. Esto nos

confirma que la entrada de los contaminantes es estacional y puede estar muy

relacionada con los escurrimientos, descargas y los arrastres de las zonas

continentales hacia las zonas estuarinas causando incrementos en la respuesta de los

peces.

Adicionalmente a los hidrocarburos y a los plaguicidas organoclorados hay evidencia de

que varios compuestos químicos en el ambiente pueden causar efectos negativos a la

salud de los organismos. Dentro de estos compuestos químicos se incluyen a aquellos

que están hechos por el hombre así como los que son de origen natural y que pueden

provenir de plantas como los fitoestrógenos.

Algunos de estos compuestos han sido descritos como disruptores endocrinos y

muchos de ellos son disponibles en Usa, en México y en Centro América. Sin embargo,

muchos de ellos han sido retirados de su uso por los efectos adversos que le pueden

causar a la salud de los humanos y a los organismos.

La disrupción endócrina ha sido estudiada en diferentes organismos y una manera para

evaluar el efecto en los organismos expuestos por diferentes contaminantes es

midiendo la expresión del gen de la vitelogenina (VGT) en organismos macho. Aún

cuando los niveles de la VGT no tuvieron una relación significativa con los

contaminantes en los tejidos de los peces, los resultados mostraron cambios muy

significativos entre los peces colectados en las diferentes lagunas pero sobre todo en

las dos épocas climáticas (Fig. 4.17). Desafortunadamente, es muy difícil confirmar si

existe disrupción endocrina o no pues se carece de estudios previos o basales de los

niveles de la expresión de estos bagres. Sin embargo, durante este estudio se

identificaron tres peces en la laguna de Términos que tuvieron alteraciones

reproductivas ya que en los peces machos se observaron ovocitos en proceso de

vitelogénesis. Estos hallazgos han sido descritos en diferentes partes del mundo que

han sido considerados como disrupción endócrina y han sido asociados a sitios

altamente impactados por compuestos orgánicos persistentes.

Las concentraciones de contaminantes en el hígado de los peces se analizó por medio

de un análisis de conglomerados, usando la estrategia de ward y la distancia

Manhattan. El resultado se muestra como un dendrograma en la Figura 4.18, donde

Celestún SecasDzi lam Secas

T érm inos SecasCelestún L luvias

Dzi lam LluviasT érm inos L luvias

Local id ad

-10000

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

VTG

(Uni

dade

s de

Den

sito

met

ría)

Median 25%-75% Min-Max

Fig. 4.17. Expresión del gen de la Vitelogenina (VGT) en hígados de bagres Ariopsis felis colectados en todas las lagunas de Términos, Celestún y Dzilam durante las dos épocas climáticas (Secas y Lluvias).

puede verse que los peces recolectados en la época de secas se separan de los

recolectados en la época de lluvias, con la excepción de los peces de Dzilam de Bravo,

que muestran una tendencia contraria a los de las otras lagunas estudiadas.

La Figura 4.19 presenta el mismo análisis, pero con los datos de biomarcadores. Se

forman claramente dos grupos de peces, uno para cada época climática, con la

excepción de los peces de Dzilam. Estos resultados son los mismos que se obtuvieron

con las concentraciones de contaminantes, por lo que se obtiene una buena separación

para los resultados de las dos épocas climáticas extremas. Los resultados de la laguna

Dzilam se comportan de manera inversa, posiblemente debido a que dentro de esta

laguna descarga agua freática a través del borde oriental del cráter de Chikxulub.

Te-L

luTe

-Llu

Te-L

luTe

-Llu

Ce-

Llu

Te-L

luC

e-Ll

uTe

-Llu

Te-L

luC

e-Ll

uC

e-Ll

uTe

-Llu

Ce-

Sec

Te-L

luTe

-Llu

Te-L

luTe

-Llu

Te-L

luTe

-Llu

Te-L

luTe

-Llu

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Llu

Ce-

Sec

Ce-

Sec

Te-L

luTe

-Llu

Te-L

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-Llu

Te-L

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ecTe

-Llu

Te-L

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-Llu

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z-Ll

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e-Ll

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-Sec

Dz-

Llu

Dz-

Llu

Ce-

Llu

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uC

e-Ll

uTe

-Sec

Ce-

Llu

Ce-

Llu

Ce-

Sec

Ce-

Sec

Ce-

Llu

Ce-

Sec

Ce-

Sec

Dz-

Llu

Dz-

Llu

Dz-

Llu

Dz-

Llu

Dz-

Llu

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Llu

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-Sec

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Dz-

Llu

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Llu

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Llu

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-Sec

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Dz-

Sec

Dz-

Sec

Dz-

Sec

Dz-

Sec

Dz-

Sec

Dz-

Sec

Dz-

Sec

Dz-

Sec

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Sec

Ce-

Sec

Dz-

Sec

Ce-

Sec

Dz-

Sec

Ce-

Llu

Ce-

Llu

Ce-

Llu

Dz-

Sec

Ce-

Sec

Dz-

Sec

0

20

40

60

80

100

120

Dis

tanc

ia d

e En

lace

Figura 4.18. Análisis de conglomerados de los contaminantes en hígado.

Una manera de ver la relación entre las concentraciones de contaminantes y los

biomarcadores es hacer un análisis canónico de correlación, donde se generan

funciones canónicas de cada grupo de variables, que se correlacionan entre sí. La

Figura 4.20 muestra los primeros ejes canónicos. El coeficiente de correlación

canónica, R, es de 0.77 (P=0.00000). La figura muestra una buena relación entre los

primeros ejes canónicos de cada grupo de variables.

Ce-

Llu

Te-S

ecTe

-Sec

Te-S

ecTe

-Sec

Te-S

ecTe

-Sec

Te-S

ecTe

-Sec

Te-S

ecTe

-Sec

Te-L

luTe

-Llu

Te-L

luTe

-Llu

Te-L

luTe

-Llu

Te-L

luTe

-Llu

Te-S

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ecTe

-Sec

Te-S

ecTe

-Llu

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Llu

Ce-

Llu

Ce-

Llu

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z-Ll

uD

z-S

ecD

z-S

ecD

z-S

ecD

z-Ll

uD

z-S

ec

0

10

20

30

40

Dis

tanc

ia d

e En

lace

Figura 4.19. Análisis de conglomerados de los biomarcadores.

Otra forma de visualizar la relación entre los contaminantes y los biomarcadores es usar

el análisis de redundancias, que es la forma restringida del análisis de componentes

principales. En esta forma se usan dos matrices de datos. La primer matriz se somete a

un análisis de componentes principales, con la diferencia de que además de buscar que

los ejes “expliquen” la mayor cantidad posible de la varianza tengan también la máxima

correlación con las variables de la segunda matriz. El programa CANOCO permite

realizar este análisis, además de permitir hacer un análisis de aleatorización, por lo que

es posible determinar la significancia estadística del resultado.

-2 -1 0 1 2 3

Eje Canónico Contaminantes 1 (26%)

-3

-2

-1

0

1

2

3

Eje

Can

ónic

o Bi

omar

cado

res

1 (3

6%)

Y = -1.8077E-8+0.7723*x

Figura 4.20. Análisis de correlación canónica entre los biomarcadores y

los contaminantes analizados. Se muestran los primeros ejes canónicos

para cada grupo de variables, y el porcentaje de varianza explicada

para cada grupo.

La Figura 4.21 muestra los dos primeros ejes del análisis, usando únicamente las

lagunas y las épocas de muestreo como variables “explicativas”.

Los resultados que se obtienen del programa son:

Solo con “Secas” y “Dzilam”

-0.8 0.8

-1.0

1.0

EROD

Proteina

CYP1A

Vitelogenina

Secas

Dzilam

Celestun

Terminos

Figura 4.21. Análisis de Redundancia (RDA) usando únicamente

las lagunas y las épocas como variables explicativas.

Test of significance of first canonical axis: eigenvalue = 0.298 F-ratio = 54.255 P-value = 0.0002 Test of significance of all canonical axes : Trace = 0.302 F-ratio = 27.714 P-value = 0.0002 ( 4999 permutations under reduced model) Axes Total variance 1 2 3 4 Species-environment correlations : 0.256 0.700 0.107 0.565 Cumulative percentage variance of species data : 29.8 30.2 99.1 99.8 of species-environment relation: 91.9 99.6 146.9 155.3

El resultado es altamente significativo usando 5,000 permutaciones de los datos. El

análisis “explica” el 30.2 % de la varianza total de los datos de biomarcadores. De la

figura puede verse que la vitelogenina aumenta en la época de secas, y en Celestún,

mientras que los otros biomarcadores tienden a ser mayores en Términos y en Dzilam y

la época de lluvias.

La Figura 4.22 muestra los resultados usando las concentraciones de contaminantes en

el hígado de los peces. Los resultados son:

Test of significance of first canonical axis: eigenvalue = 0.179 F-ratio = 27.598 P-value = 0.0004 Test of significance of all canonical axes : Trace = 0.179 F-ratio = 9.238 P-value = 0.0004

( 4999 permutations under reduced model) Axes 1 2 3 4 Total variance Species-environment correlations : 0.480 0.650 0.518 0.352 Cumulative percentage variance of species data : 17.9 17.9 17.9 98.7 of species-environment relation: 97.5 99.5 99.7 221.2 Sum of all eigenvalues 1.000 Sum of all canonical eigenvalues 0.233

-1.0 0.6

-0.8

0.6

EROD

Proteina

CYP1A

Vitelogenina

OH-Naftaleno

23_PAHs

TCBs

Figura 4.22 Análisis de Redundancias (RDA) usando los contaminantes en hígado

Puede verse que el análisis es altamente significativo, y que el OH-Naftaleno, los TCBs

(triclorobencenos) y los PAHs de bajo peso molecular son las variables que mejor

“explican” la estructura de los resultados de los biomarcadores. Estos resultados

“explican” otro 17.8 % de la varianza total de los datos de biomarcadores.

5. Conclusiones

En la generalidad, los mayores niveles de los diferentes biomarcadores analizados en

este estudio fueron detectados en los peces colectados en la Laguna de Términos

durante las dos épocas climáticas. La única excepción fue con la expresión del gen de

la vitelogenina donde las mayores expresiones fueron detectadas en los peces

colectados en la Laguna de Términos pero en la época de secas.

Aunque en otros trabajos se ha podido establecer un gradiente en la actividad EROD en

relación a los sitios contaminados, en este estudio no fue posible debido a la pequeña

dimensión y a la alta movilidad de los peces. Por otro lado, es importante mencionar

que los peces que presentaron las mayores concentraciones de contaminantes

orgánicos también fueron los que tuvieron las mayores actividades EROD y las

mayores concentraciones de metabolitos de PAHs, siendo el naftaleno y el fenantreno

los que tuvieron una mayor concentración.

Por último, como se mencionó anteriormente, se observó que la inducción del CYP1A

incrementó de manera significativa en peces expuestos a contaminantes, respecto a los

peces control (crecidos en cautiverio en zona libre de contaminantes) por lo que estos

resultados confirman que la inducción del CYP1A puede ser una herramienta sensible

para evaluar el efecto de algunos contaminantes en el ambiente.

Las concentraciones de metabolitos de los PAHs en bilis de bagres fueron mayores en

Celestún y la Laguna de Términos que en Bocas de Dzilam. Este resultado no se

esperaba, sobre todo para la laguna de Celestún, pues no está cercana a instalaciones

petroleras.

Se encontraron varias estaciones cuyas concentraciones de HCHs y Drines excedían el

PEL de la NOAA, lo que es motivo de preocupación, sobre todo considerando que la

zona de estudio no tiene una agricultura desarrollada.

Es necesario establecer un Plan Nacional de Monitoreo que permita establecer las

tendencias espaciales y temporales de los contaminantes orgánicos persistentes y

metales pesados, así como biomarcadores selectos, en la zona costera del país, ya que

el océano es el receptor final de muchas de estas sustancias.

VI. Recomendaciones

De manera preliminar, y en base a los resultados de esta primera temporada de trabajo

de campo, se recomienda sustituir la Laguna de Nichupté por la Laguna Bocas de

Dzilam.

Se recomienda continuar con este estudio, añadiendo otros biomarcadores como las

actividades de colinesterasa, glutatión transferasa y catalasa, que indican otras

respuestas ecotoxicológicas en los organismos.

Se recomienda continuar las gestiones para que el Lindano (γ-hexaclorociclohexano) se

incluya en la Convención de Estocolmo y en particular se recomienda incluir acciones

específicas para este compuesto en el Plan Nacional de Implementación de la

Convención de Estocolmo.

Es necesario desarrollar estudios para desarrollar indicadores pertinentes para las

condiciones ambientales de México, que permitan determinar si hay un peligro potencial

para el ambiente o la salud humana.

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