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DIAGNÓSTICO DE ENTEROPARASITOSIS HUMANAS
MÉTODOS DE ESTUDIO DE LAS
ENTEROPARASITOSIS
Prof. Adjta. Dra. Nora Fernández
Depto. Parasitología y Micología
IMPORTANCIA
Diagnóstico
- Enteroparasitosis sintomática
- Detección precoz, asintomática.
Diagnóstico diferencial de infecciones entéricas: parasitarias, bacterianas, virales.
Diagnóstico diferencial con otras patologías del tubo digestivo.
Instaurar el mejor tratamiento (específico).
Valorar respuesta al tratamiento.
Prevención.
COPROLOGÍA
Del griego ´´kopros´´: excremento, estudio de las materias fecales.
Comprende la observación microscópica, macroscópica y el análisis químico de las materias fecales (coprofuncional).
El examen de las heces tiene su indicación clínica en las diarreas, en procesos que cursan con insuficiencia digestiva o en los que se busca un agente etiológico:
Coprovirológico
Coprocultivo
Coproparasitario
COPROPARASITARIO
Se trata de un conjunto de técnicas complementarias, quepermiten demostrar la presencia de las diferentes formasevolutivas de los protozoos y helmintos enteroparásitos:esporas, trofozoítos, quistes, ooquistes, huevos, larvas yadultos.
Se utiliza también para el diagnóstico de parasitosis de
glándulas anexas Ej.: hígado. En la fascioliasis los huevos
de Fasciola hepatica son eliminados con las heces.
CONJUNTO DE TÉCNICAS ?
No existe un único método capaz de demostrar todas las formas evolutivas parasitarias
Diferente morfología y ciclos.
Diferencias estructurales y tintoriales.
Diferencias en la viabilidad debido a : pH, tratamientos farmacológicos, etc.
Distinta localización en el tubo digestivo por lo que su distribución y ubicación de los parásitos en el bolo fecal será diferente: centro o en la periferia.
Variaciones en la resistencia de las formas evolutivas.
La eliminación intermitente hace que existan períodos negativos.
ETAPAS DEL PROCESO DIAGNÓSTICO
PREANALÍTICA: está sujeta a mayor porcentaje de errores,insume mayor tiempos e involucra solicitud, asesoramiento,,obtención, almacenamiento, transporte y recepción en ellaboratorio.
ANALÍTICA: corresponde a la realización delprocedimiento diagnóstico.
- Incluye: elección de los métodos, la estandarización, larealización de control de calidad, etc.
POSTANALÍTICA: interpretación de resultados, validación,emisión del informe.
FASE ANALÍTICA
TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS EN LAS
ENTEROPARASITOSIS
IMPLEMENTACIÓN DE TÉCNICAS
Planta física del laboratorio, equipamiento, insumos, costos
“racionalización”.
Recursos humanos capacitados y entrenados.
Tiempo.
Actualmente existen diferentes metodologías diagnósticas
con diferente costo, utilidad, simplicidad y sensibilidad.
ELECCIÓN
Se debe tener presente la población y el objetivo del estudio:
Diagnóstico: orientación de acuerdo a los datos clínicos:
- Edad, procedencia, antecedentes personales; patológicos;
familiares; ambientales: acceso al agua potable,
saneamiento; control de tratamientos: antiparasitarios;
otros tratamientos : antidiarreicos, laxantes, etc.
Estudio epidemiológico: guarderías, escuelas, asentamientos,
población rural, hospitales, residencias para ancianos, carné
de salud para manipuladores de alimentos, viajes, etc.
Investigación:
‾ Especies y variedades
‾ Fármacos
OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
DE HECES PARA COPROPARASITARIO
Emisión
‾ Espontánea.
‾ Se puede administrar laxantes salinos, no oleosos (vaselina, glicerina).
‾ No luego de estudio radiográfico c/bario.
‾ No en período menstrual.
Régimen alimentario
- Hay quienes indican durante las 48 -72 hrs previas a la recolección de la
muestra no ingerir frutas, verduras y grasas. Desde nuestro punto de vista
no es necesario.
Cantidad de muestra
- Aproximadamente 50 grs (tamaño de una nuez) para heces formadas;
liquidas al menos 4 mL (10-15 mL).
- En frasco de plástico limpio de boca ancha y tapa rosca.
- Rotulada con nombre paciente, C.I, Nº registro del
laboratorio.
- La de la mañana o la noche anterior, conservación en
heladera hasta 24 horas (sin conservantes).
- Muestra inadecuada aquella que se mantuvo más de 24 hrs a
temperatura ambiente.
- Si se utilizan sustancias para conservar la muestra, tener en
cuenta sus efectos sobre las formas evolutivas y
contaminación del medio ambiente.
- Evitar contaminación con orina, detergentes, hipoclorito de
Na +.
- La fermentación altera trofozoítos y las larvas de
Strongyloides stercoralis.
OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
RECOMENDACIONES PARA USUARIOS
No dejar las heces expuestas al aire
Cada laboratorio debe tener sus pautas
Debe existir comunicación entre :
‾ mensajero-recepcionista-técnicos-médicos-enfermeras
Se deben examinar lo mas rápido posible (condición ideal).
Cuando se reciben varias muestras al mismo tiempo, sedeberá separar las que son líquidas, tienen pus, mucus osangre, y deberán ser examinadas antes que las demás, yaque puede haber trofozoítos de amebas, los que con eltranscurso del tiempo pierden movilidad.
RECOMENDACIONES PARAPERSONAL TÉCNICO-NO TÉCNICO
NÚMERO DE MUESTRAS
Existen varios criterios al respecto.
Para diagnóstico de enfermedad por enteroparásitos
COPROPARASITARIO SERIADO 3 MUESTRAS
- Separadas c/3-7 días.
Se considera que una única muestra tiene una sensibilidad
del 40%-60%, ya que existen períodos negativos por los
propios ciclos biológicos de los enteroparásitos (eliminación
intermitente).
Múltiples muestras de material fecal, aumenta la probabilidad
de hallazgo.
Concentración de múltiples muestras en un solo examen.
Aplicación de un algoritmo ante la presencia de un resultado
negativo y la persistencia de síntomas.
POSITIVA
• Diagnóstico y mejoría con tratamiento. No justifica 2 muestra
• NEGATIVA
• Desaparición de los síntomas; se halló otra causa.
• Sin otra causa ni mejoría: solicitar 2 muestra
POSITIVA
• Diagnóstico y mejoría con tratamiento. No justifica 3 muestra
• NEGATIVA
• Desaparición de los síntomas; se halló otra causa.
• Sin otra causa ni mejoría: solicitar 3 muestra
POSITIVA
• Diagnóstico y mejoría con tratamiento.
• NEGATIVA
• Desaparición de los síntomas; se halló otra causa.
• Sin mejoría y firme sospecha de enteroparasitosis, evaluar detección de coproantígenos, Acs, realización de sondeo duodenal, biopsia, etc.
ALGORITMO CLÍNICO-PARASITOLÓGICO
1
2
3
ESTUDIO DE ENTEROPARÁSITOS
Métodos directos:
Coproparasitario
Coloraciones
Detección de coproantígenos
Método de Graham (espátula adhesiva)
Métodos Indirectos:
Detección de anticuerpos (Acs) en suero.
Utilizados para amebiasis, fascioliasis, estrongiloidiasis y
esquistosomiasis, etc.
1- MACROSCÓPICO
PARÁSITOS
PSEUDOPARÁSITOS
SANGRE
MUCUS
PUS
COLOR
CONSISTENCIA
LIENTERIA
2 –MICROSCÓPICO
a) Directo en fresco c/ SF
Heces s/concentrar
b) Técnicas de concentración
Para heces
c) Directo en fresco c/ colorantes: lugol, azul de tionina, etc.
d) Recuento de huevos
e) Coloraciones permanentes
f) Método de Graham
COPROPARASITARIO
COPROPARASITARIO
3
INMUNOLÓGICOS
Detección de coproantígenos
5
BIOLOGÍA
MOLECULAR
PCR
4
CULTIVOS
INVESTIGACIÓN
Laboratorios de referencia *
6
MICROSCOPÍA
ELECTRÓNICA
INVESTIGACIÓN
Laboratorios de referencia
Depende de la dieta y de la ingesta
de agua.
1 y 2 indican constipación.
5-7 indican diarrea.
1- MACROSCÓPICO
2a- MICROSCÓPICO : directo en fresco c/ SF
formadas
pastosas
semi-líquidas
líquidas
quistes
trofozoítos
ooquistes
DATOS QUE APORTA
Las heces s/concentrar
Movilidad de trofozoítos y
larvas.
Células de mucosa intestinal.
Células inflamatorias.
Productos de una mala
digestión/ absorción de
alimentos.
2a - PREPARACION DEL EXAMEN DIRECTO
En portaobjetos colocar
1 gota de SF y otra de lugol.
Se hace una suspensión
c/ aprox. 2 mg de heces.
Se coloca un cubreobjetos de
24 x 24 mm y se observa al
MO a 10 x y luego a 40 x.
La suspensión de heces
preparada debe permitir leer a
través de la preparación.
2a- MICROSCÓPICO : directo en fresco c/ SF
Quistes de Giardia lamblia
Huevos de Hymenolepis diminuta
Fundamento: aumentar el número de parásitos a
partir de un volumen de heces preestablecido.
Procedimientos
a) Sedimentación
b) Flotación
c) Biológicos
Cada uno posee ventajas y desventajas.
Sensibilidad variable para protozoos y helmintos.
2b- TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN
a) SEDIMENTACIÓN
Están basados en la utilización de agua u otros líquidos debaja densidad, recobrándose las formas evolutivasmicroscópicas de los parásitos, en el fondo de un y tubocónico, donde se depositan por ser más densos.
Sedimentación espontánea o simple
Sedimentación-centrifugación
Telemann (éter-ácido clorhídrico)
Carles y Barthélémy (éter -ácido cítrico)
Ritchie (formol-éter)
Se homogeniza 2-5 grs de heces en 10 mL de SF.
La mezcla se vierte en tubo cónico de 50 mL de capacidad, filtrándola
a través de gasa (se puede utilizar las unidades de filtración).
Se completa el volumen solución salina y se tapa.
Se agita y se deja reposar 45 minutos.
Se elimina el sobrenadante .
Se toma con una pipeta una muestra del fondo del tubo.
Se colocan 3 gotas en dos láminas portaobjetos diferentes y se cubre
c/laminilla.
Sensibilidad 55 %
No requiere centrífuga
Disponible http://www.uady.mx/sitios/biomedic/revbiomed/pdf/rb061722.pdf
TÉCNICA DE SEDIMENTACIÓN ESPONTÁNEA
TÉCNICA DE SEDIMENTACIÓN/CENTRIFUGACIÓN
MÈTODO DE RITCHIE
Fundamento: lavados/centrifugados sucesivos partiendo de
un volumen de heces preestablecido, para eliminar la mayor
cantidad de restos vegetales y grasas que estén presentes,
ya que pueden interferir en la visualización microscópica.
Es el más utilizado, por su reproducibilidad, sensibilidad y
bajo costo.
Con el transcurso del tiempo se han incorporado diferentes
variantes de la misma; también hay varios kits comerciales.
ÉTER
Tapón de
grasa y
restos
vegetales
FORMOL
10%
SEDIMENTO
RITCHIE FORMOL / ÉTER
También se usa
acetato de etilo
NO INFLAMABLE
VARIACIONES DEL RITCHIE
HOMOGENEIZADO
Proporción 1volúmen de materias fecales y 9 volúmenes de solución salina.
En heces líquidas no es necesario agregar SF, se agita el recipiente que contiene la muestra y se procede a la filtración.
FILTRACIÓN
En heces c/grasas o mucus, pueden quedar atrapados en la gasa, por lo que puede ser innecesario la utilización.
LAVADOS
Hasta 3 lavados.
KITS COMERCIALES DE SEDIMENTACIÓN/CENTRIFUGACIÓN
ASPECTOS COMUNES
Unidades de filtración
Limpios
Bioseguridad
DIFERENCIAS
tubos
c/ conservantes o sin
c/surfactante o sin
Cucharitas
Hisopos
bolsasCOSTOS
Reemplaza el embudo y la gasa.
Un vial 30 mL adapta a una unidad de filtración de 50 mL.
Los orificios del filtro miden 0,6 mm de diámetro, permitiendo el pasaje
de larvas, huevos, quistes y retiene la mayor parte de los desechos
fecales.
Surfactante Tritón X-100, disuelve y disgrega las heces y el mucus.
FECAL PARASITE CONCENTRATOR JUMBO EVERGREEN ®
FECAL PARASITE CONCENTRATOR JUMBO EVERGREEN ®
PARATEST ®
Utiliza como conservante formol tamponado al 5 %.
En un solo paso se procede a la dilución, filtrado y
concentración de la muestra.
Posee un filtro de 266 mm.
Disponibles 2 tipos más de conservantes: el SAF útil en
laboratorios que realizan la coloración tricrómica y el Greenfix ,
biodegradable, no contamina el medio ambiente ni es tóxico.
VIDEOS ON LINE
http://www.youtube.com/watch?feature=player_detailpage&v=Lu4Cq53l36Y
http://www.youtube.com/watch?v=01__FSqIqH8&feature=related
OTROS KITS COMERCIALES
b) FLOTACIÓN
Los elementos parasitarios se recogen de la superficie de unlíquido denso, a la cual ascienden por su menor pesoespecífico.
Flotación simple, Bass.
Faust (sulfato de zinc) huevos de helmintos, estudios detierra.
Sheather modificado ( azúcar) para coccidios.
Isospora
Cyclospora
Cryptosporidium
Sedimento
Película
superficial
Sulfato de
Zn
b) FAUST
FUNDAMENTO
Los elementos parasitarios se recogen de
la superficie de un liquido denso al cual
ascienden por su menor peso especifico.
CLASIFICACIÓN
Flotación Simple
Flotación / Centrifugación
c) BIOLÓGICOS
HARADA-MORI Strongyloides stercoralis
Fundamento:
Busca embrionar huevos de tremátodos y cestodos.
Separar larvas de nemátodos .
Sobre papel de filtro.
Agua destilada
Incubación a 20º C
Examinar luego de 3 días.
MÉTODO DE BAERMANN Strongyloides stercoralis
Basados en el conocimiento y la aplicación del ciclo vital del
parasito, fundamentalmente en formas juveniles.
Apropiado para el diagnostico de estrongiloidiasis.
Las larvas poseen termotropismo e hidrotropismo +.
Útil en coproparasitarios reiteradamente negativos.
c) BIOLÓGICOS
HARADA-MORI Strongyloides stercoralis
30-60% de sensibilidad para 1 sola muestra
c) BIOLÓGICOSMÉTODO DE BAERMANN
Gasa
Heces, tierra, cultivo: 8- 10 grs
Malla
Agua 40º C
Se deja por 60-90 minutos.
Las larvas sedimentan en el tubo.
Se abre la pinza, para obtener
gotas en portaobjetos, y se
observan al MO.
30-60% de sensibilidad para 1 sola muestra
2c- MICROSCÓPICO : directo en fresco c/ lugol
Quistes de Giardia lamblia
Forma vacuolar
Blastocystis hominis
Larvas de Strongyloides stercoralis
d) RECUENTO DE HUEVOS
Se utilizan para saber la intensidad de la infección de
helmintos transmitidos por el suelo.
Ascaris lumbricoides
Trichuris trichura
Hymenolepis nana, entre otros.
Tiene utilidad en estudios epidemiológicos y clínicos (eficacia
de tratamiento).
Cuantifican el número de huevos por gramo de materias
fecales (h.p.g):
- Leves
- Moderadas
- intensas
Recuento en placa microscópica
Sencillo, poco exacto.
Se realiza un ex. directo que contenga aproximadamente 2
mg de heces, se cubre c/ laminillas de 22 x 22 mm.
Se recorre toda la laminilla y el número de huevos se
multiplica por 500, el resultado se informa en h.p.g.
Técnica de Kato-Katz
Es el sugerido por la OMS, para diagnósticos individuales,
como para investigaciones epidemiológicas.
Más compleja, exacta.
Disponible kit comercial.
d) TÉCNICAS PARA RECUENTO DE HUEVOS
Heces frescas s/concentrar
Heces concentradas
Rotular con lápiz
Confección
Fijación: metanol
Luego de la coloración
pueden sellarse
e) COLORACIONES PERMANENTES: PREPARACIÓN DE FOTIS
1) Kinyoun
2) Kinyoun modificado
3) Safranina
4) Tricrómica
5) Tricrómica modificada
e) COLORACIONES PERMANENTES
1
5
3 4
2
Diagnóstico de oxiurosis : Enterobius vermicularis.
FUNDAMENTO
Sobre la base del ciclo biológico del agente, obtener
huevos de E. vermicularis que están en la región peri-anal.
Mediante la aplicación de un baja lenguas c/ cinta adhesiva
o paleta de plástico engomada, alrededor de dicha zona.
Durante 3 mañanas consecutivas.
Higiene la noche previa; no aplicar cremas.
Realizar el estudio en la mañana antes de que el niño se
levante.
Si usa pañal y a la mañana nota que está con materias
fecales : no realizar el estudio ese día.
No requiere refrigeración.
Lavarse las manos después de realizar la toma de muestra.
f) MÉTODO DE GRAHAM
f) MÉTODO DE GRAHAM
DETECCION DE COPROANTÍGENOS
Productos específicos parasitarios
Utilizan anticuerpos (Acs) mono o policlonales
Los Acs se inmovilizan en diferentes tipos de soporte
sólido: microplacas , membranas cromatográficas y otros
materiales inertes.
ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO
DETECCIÓN DE COPROANTÍGENOS
Duración del ensayo 1h:20’
Placas con AcMo proteínas específicas: de la pared quística, membrana, etc.
Giardia lamblia (GSA 65 CWP1)
Cryptosporidium sp
Entamoeba histolytica (lectina Gal/gal Nac)
Cualitativo.
VENTAJAS
> Sensibilidad
Estudios de campo
DESVENTAJAS
Costo
Equipos
INMUNOFLUORESCENCIA
Giardia lamblia
Crypstosporidium sp
Microsporidios
VENTAJAS
Mayor sensibilidad
DESVENTAJAS
Costo
Microscopio IF
INMUNOCROMATOGRÁFICOS
Heces frescas.
No concentradas.
Diluidas en buffer NaNO3 al 0,1%.
Ac conjugado con fosfatasa alcalina a un sustrato (indoxil fosfato) la reacción positiva da una línea azul.
AcMo ESPECÍFICOS
E.histolytica proteína 29kDa
G.lamblia a-l-giardina
C. parvum proteína disulfido isomerasa
Sensibilidad y especificidad menor para E. histolytica
FUNDAMENTO
Reacción Ag-Ac colorimétrica
Técnica cualitativa
DETECCIÓN DE ANTICUERPOS
Única herramienta: Estrongiloidiasis, Fascioliasis.
Herramienta complementaria: Amebiasis, Criptosporidiosis,
Giardiasis.
Se realizan en suero.
Presentan mayor sensibilidad que las técnicas clásicas.
VENTAJAS
Buena sensibilidad y especificidad.
Control de tratamiento, negativización/ quimioterapia eficaz.
Diferenciación especies de amebas.
Procesar gran número de muestras simultáneamente.
DESVENTAJAS: COSTOS
EN SUMA:
Recursos de cada laboratorio.
Población a estudiar.
Orientación clínica
Implementación de coloraciones permanentes.
Capacitación
Controles
Métodos tradicionales siguen siendo los de primera línea.
Racionalización de todos los recursos.