determinaciÓn del potencial de protecciÓn antioxidante de
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DETERMINACIÓN DEL POTENCIAL DE PROTECCIÓN ANTIOXIDANTE DE FITOTERAPÉUTICOS COMERCIALES TIPO SOFTGEL, MEDIANTE EL
USO DE LA TÉCNICA ORAC
1. Resumen Los fitoterapéuticos son preparados herbales que buscan concentrar principios activos de las plantas utilizadas en tratamientos de enfermedades crónicas. Dentro de los parámetros de calidad no están las pruebas de capacidad como parámetro de calidad y confiabilidad del producto. Este estudio pretende establecer una metodología efectiva a base de la solubilidad y polaridad de los principios activos de los fitoterapéuticos comercializados de forma libre tipo Softgel: Resveratrol, Vaccinium myrtillus, Vaccinium macrocarpon, Silybum marianum y Serenoa repens que a través de la medición de la capacidad antioxidante medidos por el método de Capacidad de Adsorción de Radicales de Oxigeno (ORAC) expresando los resultados en porcentaje de protección de la fluoresceína y a partir de estos inferir la calidad y confiabilidad de los extractos evaluados. La metodología utilizada fue la determinación de la solubilidad de los fitoterapéuticos en diferentes solventes (metanol, etanol, acetato de etilo, diclorometano, cloroformo y hexano) y en HCl, extrayéndose por reflujo obteniéndose extractos acuosos y determinándose la concentración por medio de la fracción soluble, posteriormente se elaboraron diluciones para la medición de la capacidad antioxidante por el método ORAC para determinar el IC50 analizando el área bajo la curva. Se obtuvo como resultado de la investigación se vio la solubilidad como un factor importante, estando en polaridades medias. Los que permitió concluir que el extracto con mayor capacidad antioxidante fue el de resveratrol (IC50 -568,4985 ppm) > Vaccinium macrocarpon (IC50 581,6033 ppm) > Silybum marianum (IC50 719,0476 ppm) > Vaccinium myrtillus (IC50 792,4534 ppm) > Serenoa repens.
2. Introducción Las especies vegetales dentro de su metabolismo producen metabolitos secundarios destinados a la protección de radicales libres formados en el ambiente contra el medio ambiente hostil como las radiaciones UV (Garzón et al 2010), una sustancia antioxidante es aquella que en menores concentraciones que los radicales libres es capaz de disminuir o anular el efecto de estos en un medio determinado (Gupta et al 2004). El uso de plantas como tratamiento a enfermedades es conocido por las sociedades desde sus inicios, estas tradiciones a través de la historia de han arraigado en las actual población, en esta se ha transmitido el conocimiento de generación en generación hasta llegar a la sociedad actual en donde se conocen la propiedades curativas por el estudio de las moléculas responsables de los beneficios a la salud obtenidos por su consumo.
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Los fitoterapéuticos son extractos de moléculas activas a partir de especies vegetales, generalmente conocidas siendo obtenidas a partir de diversas partes dependiendo del lugar en donde se localiza al molécula (Calixto 2000,López-Alarcón y Denicola 2013), la capacidad antioxidante, es la cualidad de proteger a las células del daño caudado por radicales libres, conservándose la dinámica celular normal repercutiendo esto en la salud de la población la que la consume siendo altamente aceptada este tipo de medicamentos (Calixto 2000). Son utilizadas por la población siendo estas asequibles para el público en general por ser medicamentos de venta libre, pudiendo afectar a la toda la población en general al ser consumido de manera de manera irresponsable por parte de una parte de la población que se auto recetar al dar la sensación de no tener efectos secundarios (Calixto 2000, Gülçin 2012). Su extracción en la presentación Softgel se hace por medio de solventes para su concentración en capsulas liquidas, estas capsulas tienen aditivos para facilitar su actividad en el organismo y mantener la estabilidad a través del tracto gastrointestinal garantizando su absorción posterior. El principio activo comúnmente es desconocido en el caso de muchos productos que se encuentra comercialmente, otros por el contrario tiene estudios sobre sus principios activos junto con estudio in vitro e in vivo para el aseguramiento de su calidad (Cravotto et al 2010). La legislación de los requisitos de los fitoterapéuticos es propia de cada país pero en el estudio de Gupta et al (2004) este mostro una heterogeneidad alta en países latino americanos (Decreto 2266, 2004). En la legislación colombiana establece el decreto 2266 del 2004, el principio activo del compuesto a partir de Vademécum colombiano de las especies aceptadas. En el caso de importación de producto pide el aval de una farmacopea europea, junto con literatura que respalde su calidad (Prior et al 2005), una desventaja en el aseguramiento de la calidad es la falta de la medición de la actividad de la actividad para la cual se especifica, la actividad antioxidante es un patrón común de los extractos pues esta actividad antimicrobiana, antitumoral, vasodilatadora entre otras se basa en la capacidad de oxidarse en lugar de las moléculas diana, mitigando el efecto de los prooxidantes presentes en el medio (Calixto 2000). El énfasis de este estudio es el desarrollo de una metodología de medición de fitoterapéuticos elaborados para el desarrollo de un método de cuantificación de la capacidad antioxidante del medicamento elaborado como para el desarrollo de un método in vitro de la calidad del producto, midiendo la calidad de los extractos resveratrol, arándano, arándano rojo americano, y cardo mariano y palma enana americano estudio preliminar a una posible estandarización de un parámetro de calidad. Esta es una investigación deductiva en la cual a partir de los fitoterapéuticos comerciales se va inferir la validez de la prueba.
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3. Marco teórico Niki, (2010) define un compuesto antioxidante como la sustancia que en pequeñas concentraciones, inhibe o retrasa significativamente la oxidación del sustrato (Gupta et al 2004). En la industria farmacéutica un antioxidante efectivo inhibe las reacciones de oxidación de las biomoléculas, previniendo su destrucción por desbalances osmóticos, apoptosis programada, desbalances mitóticos, entre otros (Huang et al 2005).
A nivel celular existen tres estadios diferentes de protección frente a sustancias oxidantes exógenas, el primero se basa en la presencia propia de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno contenidas en un liposoma, las cuales tienen la función de eliminar elementos extraños para la célula mediante reacciones de Oxido-Reducción, el segundo nivel de defensa está compuesto por enzimas y compuestos fenólicos intracelulares que remueven las especies reactivas (radicales) a nivel interno protegiendo moléculas como carbohidratos, ácidos grasos, ácidos nucleicos, aminoácidos y demás constituyentes principales de la célula, por último la tercera barrera es la reparación de nuevos antioxidantes intracelulares (Gupta et al 2004).
El estrés oxidativo es un desbalance entre la producción de las especies reactivas de oxígeno (ROS) y nitrógeno (NOS) (hidroxilo, alcoxilo, peroxil, superoxido, óxido nítrico, siendo los radicales hidroxil y alcoxil) (Gupta et al 2004) y la producción de sustancias antioxidantes intracelulares, teniendo como consecuencia el daño celular y biológico (López-Alarcón y Denicola 2013) reaccionando con ácidos nucleicos, ácidos grasos, aminoácidos y carbohidratos (Gupta et al 2004).
Los mecanismos de reacción de los antioxidantes en la naturaleza se basan en la presencia de moléculas con radicales libres para evitar la oxidación de moléculas importantes como los ácidos nucleicos, ácidos grasos, aminoácidos y carbohidratos siendo estas moléculas importantes para el funcionamiento celular.
La elaboración de ensayos in vitro para la medición de la capacidad antioxidante se encuentran resumidos en la tabla 1.
Tabla 1. Mecanismos de reacción
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Mecanismo de reacción
Características Métodos utilizados
Donación de átomos de hidrogeno (HAT,
Hidrogen Atom Tranfer )
Acción rápida, ausencia de presencia de metales, reacciones competitivas que estabilizan radicales
y aumentan la solubilidad lipídica. Hay presencia de agentes
reductores (Allen y Cornforth 2010, Huang et al 2005, Niki 2010)
ORAC (capacidad de absorbancia del radical
oxigeno) TRAP (parámetro
antioxidante total de captura de radical) utilizados para la evaluación de la
capacidad antioxidante en muestras
botánicas(Huang et al 2005, Allen y Cornforth
2010) inhibición inducida por la oxidación de LDL(Huang
et al 2005, Allen y Cornforth 2010)
TOSCA (ensayo de la capacidad total de
barrido del radical oxi) (Huang et al 2005, Allen
y Cornforth 2010)
Transferencia de electrones (SET, Single
Electron Transfer)
Reduce los iones metálicos, tiene
reacciones intermediarias con el
ácido ascórbico, polifenoles y aromáticos,
se basa en cambios colorimétricos,
dependiente de pH, reacción lenta, se utiliza para evaluar el potencial
antioxidante (Allen y Cornforth 2010, Cravotto
et al 2010).
TEAC (ensayo de capacidad antioxidante
por equivalencia de trolox) utilizado para evaluar capacidad
antioxidante en alimentos(Huang et al 2005, Allen y Cornforth
2010)
FRAC (reducción del ion férrico) (Huang et al
2005, Allen y Cornforth 2010)
DPPH (radical 2,2- difenil 1- picrihidrazil) utilizado
para evaluar la capacidad antioxidante
en frutas y verduras(Huang et al
2005, Allen y Cornforth 2010)
ABTS (radical 2,2 azinobis 3- etilbenzitiazo 6 sulfonico) (Huang et al 2005, Allen y Cornforth
2010)
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El método ORAC se basa en la protección de la oxidación de la fluoresceína (Allen y Cornforth 2010) de los radicales peroxilo, su medición se hace a través de la fluorescencia emitida (Huang et al 2005), hallándose el área bajo la curva (Huang et al 2005, Allen y Cornforth 2010, López-Alarcón y Denicola 2013) en función del tiempo. Las reacciones producidas en la etapa de iniciación se generan por la formación de radicales libres, posteriormente estos atacan la fluoresceína liberando radicales hidróxilo, llevando a la descomposición de la molécula, finalmente estos se estabilizan mediante la reacción con el sustrato restante en el medio (Allen y Cornforth 2010).
En la reaccion hay un flujo constante de radical peroxilo (Huang et al 2005) reduciendo la intensidad de la fluoresceína proveniente de la descomposicion del radical 2,2'-azobis (2 amidino propano) dihidrocloruro (AAPH) (Allen y Cornforth 2010) las condiciones del ensayo son 37°C, una longitud de onda de exitacion de 482 nm y de emision de 520 nm, como sustancia patron Trolox, la cual tiene una relacion dierectamente proprcional entre 0,78 y 12,6 µM (Huang et al 2005). Esta tecnica es utlizada en fitoterapeuticos solubles en solventes polares o apolares (Huang et al 2005, Allen y Cornforth 2010). La ventaja de la tecnica es la medicion simultanea de muestras o concentraciones, al elaborarse en una placa de 96 pozos (Huang et al 2005).
Los fitoterapéuticos son preparaciones herbales elaborado por medio de un proceso homogéneo y con las mismas características, las cuales contienen ingredientes activos con efectos farmacológicos conocidos por la presencia de sustancias farmacológicamente activas, que se encuentran en diferentes partes de la planta acorde con el metabolismo y requerimientos de las mismas como cascaras, hojas, tallos y flores (Calixto 2000, López-Alarcón y Denicola 2013). Estas han sido utilizadas para el tratamiento de varias enfermedades crónicas (Calixto 2000) como cáncer, diabetes, enfermedades neurodegenerativas y problemas circulatorios (Calixto 2000, López-Alarcón y Denicola 2013, Huang et al 2005). La consecución de estos fitoterapéuticos en el mercado es libre, es decir sin ningún tipo de prescripción médica y su presentación varía desde capsulas liquidas, sólidas hasta granulares. Este tipo de medicamentos son comercializados por diferentes tipos de empresas con gran éxito en el mercado, obteniendo ganancias de 7 billones de dólares solo en el mercado europeo en 1997 principalmente en Alemania, Francia, Italia, Reino Unido, en el siguiente año las ventas en este mercado aumentaron el 101% en el mercado estadounidense por más de 62 billones de dólares en el 2010 vendidos en suplementos herbales a partir de plantas medicinales, siendo la naturaleza un área inexplorada inclusive en la actualidad (Calixto 2000, Cravotto et al 2010) La principal ventaja per se de los fitoterapéuticos es la disminución total o parcial de los efectos secundarios ante tratamientos específicos (Calixto 2000), además de la renombrada presencia de sustancias antioxidantes presentes en la plantas y por ende en los comprimidos comerciales. Este tipo de compuestos en su mayoría son de tipo polifenólico, vitaminas liposolubles, hidrosolubles y carotenoides (Huang et al 2005) con diferentes tipos de polaridad de acuerdo a su estructura y función biológica (Cravotto et al 2010).
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Los comprimidos tipo Softgel están compuestos por extractos totales de plantas obtenidos mediante extracción con solventes polares como agua, etanol o una mezcla de los mismos. Estos fitoterapéuticos se comercializan como medicamentos preventivos para la longevidad cuyo efecto no es inmediato, además de ser aceptados por la sociedad al ser provenientes de plantas medicinales utilizadas para tratamiento de enfermedades de todo tipo (Calixto 2000). El consumo de fitoterapéuticos en la dieta está asociado con la prevención de enfermedades cardiovasculares, neurodegenerativas y cancerígenas (Gülçin 2012, López-Alarcón y Denicola 2013), diabetes, osteoporosis. En los fitoterapéuticos con compuestos activos como flavonoides, los cuales son extraídos de plantas con características antioxidantes, reduciendo el daño de los radicales libres de oxigeno (ROS) en las células del organismo (Carpenter et al 2007) encontrándose en el mercado más de 1300 Fitoterapéuticos (Carpenter et al 2007). Los extractos de resveratrol son obtenidos a partir de La uva (Vitis vinífera) y la centipodia de Japón (Polygonum cuspidatum) se caracterizan por tener un alto contenido de compuestos fenólicos como ácido cafeico, ácido ferulico, acido P-cumarico (Cruz-Galvez et al 2013), vitamina E y C siendo su principal compuesto antioxidante resveratrol (Ojeda 2007) este pertenece al grupo de los estilbenos (Lee et al 2003) el cual tiene actividad antioxidante in vivo e in vitro reportada entre otros por Carpenter et al (2007), actividad anticancerígena (Ojeda 2007) realizada mediante inhibición de la oxidación de lípidos y quelando iones de hierro según los estudios de Gulcin (2010), en las tres etapas de la colonización cancerígena: inicio, promoción y progresión (Manganaris et al 2014).
El arándano (Vaccinium myrtillus) perteneciente la familia Ericaceae (Gülçin 2010) nativa de Suramérica con fruto de 5-10 mm morado y sabor amargo característico (Ieri et al 2013), tiene un alto contenido de compuestos fenólicos principalmente antocianinas como cianidina, delfidina, petunidina, malvidina, peonidina, querecina, miriecina, ácido ferulico , cafeico y p-cumarico al igual que derivados del ácido benzoico (Lee et al 2003) actuando como pigmentos y acumulándose de manera natural en semillas y cascaras (Garzón et al 2010), también presente el resveratrol (Ojeda 2007, Aaby et al 2013). A esta fruta se le atribuye capacidades antioxidantes (Martz et al 2010), antiinflamatorias (Martz et al 2010), anticancerígenas, inductoras de la apoptosis celular (Chitur et al 2011). En plantas salvajes se ha encontrado una mayor cantidad de antocianinas con concentración de 705 mg en 100 g del peso fresco que en plantas cultivadas (Martz et al 2010).
El arándano rojo americano (Vaccinium macrocarpon) pertenece a la familia Ericaceae (Müller et al 2012) es nativo del este de Norteamérica, contiene como como componentes activos antioxidantes proantocianinas, antocianinas y flavonoides los cuales son responsables de la protección a la luz UV, defensa contra patógenos, polinizadores, pigmentos, astringentes y texturizadores del fruto. Están presentes en menores proporciones en la flor, protegiendo el desarrollo del fruto de patógenos y predadores (Booth et al 2012). En el estudio
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de Booth et al (2012) se encontró en extractos acuosos a partir de hojas en un ensayo semi-cuantitativo ácido cítrico, ascórbico y málico en un 15%, catequinas 3,48%, flavonoides glicosidados 18,13% (Müller et al 2012) atribuyéndosele efectos anti-inflamatorios, antimutagénicos y cardioprotectores (Vvedenskaya y Vorsa 2004).
El cardo mariano (Silybum marianum) pertenece a la familia Asteraceae, sus componentes principales son la silibinina, isosilibinina, silicristina y silidianina los extractos se obtienen a partir de hojas y flores, (Elberry et al 2010) su cinética de reacción se basa en la transferencia de electrones en medios acuosos (Ahmad et al 2013). Se le han atribuido capacidades antioxidantes, antiinflamatorias, anticancerígenas (Mikulski et al 2014), antibacteriales, hepato-protectoras, antivirales y vasodilatadoras mostrando por el método DPPH un 94,94% de capacidad antioxidante (Shaker et al 2010). Su demanda actual es de 18 a 20 toneladas por año (Elberry et al 2010).
La palma enana americana (Serenoa repens), de la familia Arecaceae, es una palma de crecimiento lento nativa del este de Norteamérica, el extracto de esta planta es rica en ácidos grasos teniendo un 70-95% como el ácido caprilico, caprico, laurico, miristico, oleico, linoleico, esteárico y palmítico, fitoesteroles como β-sitosterol, camperterol y estigmaterol en 0,1%, así como también ácido vainillinico, y derivados de la vitamina E (Akkaya y Yilmaz 2012). Los frutos se utilizan tratamientos contra la bronquitis, gripa, desordenes genitourinarios y estimulantes sexuales (Akkaya y Yilmaz 2012) hiperplasia prostática (Booker et al 2014), se le atribuyen efectos antinflamatorios, pro-apoptoticos y anticancerígenos (Akkaya y Yilmaz 2012).
4. Justificación y planteamiento del problema El principio activo de los fitoterapéuticos es desconocido ya que su estudio es costoso y a menudo ineficiente, pero la identificación del mismo es un parámetro de calidad (Huang et al 2005), deben estar avalados por investigaciones científicas serias dada la multiplicidad de efectos de los componentes activos, así como la evaluación de posibles efectos adversos, comprobándose por los resultados obtenidos en el estudio donde el uno entre 200 extractos su origen vegetal tienen toxicidad demostrada o causan alergia (Cravotto et al 2010) no teniendo todos tienen estudios clínicos sobre sus efectos in vivo, aunque no hay certeza o un ente que regule la eficacia de los mismos, como de sus efectos secundarios como daños por compuestos tóxicos presentes en el extracto, estos se puede presentar por el exceso de consumo o errores en la identificación de la planta, problemas de fabricación (Calixto 2000). La comprobación de la calidad se puede desde un inicio del proceso de elaboración comenzando por la correcta identificación de la planta, control de calidad de la materia prima, control de contaminación química o biológica, estandarización del proceso de elaboración por medio de Buenas Practica de Manofactura (BPM), y por último la comprobación de la presencia de la molécula activa como la medición de su actividad (Calixto 2000).
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En la revisión de Gupta et al (2004) se comparan las legislaciones sobre fitoterapéuticos en 16 países de Iberoamérica (Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Colombia, Costa Rica, Cuba, Ecuador, España, Guatemala, México, Nicaragua Panamá, Perú, República Dominicana y Venezuela), el 81% pide como requisito ensayos fitoquímicos y el 25% solicita ensayos de toxicidad, requiriéndose siempre la identificación del principio activo, cuantificación del material vegetal, parte de la planta utilizada, función de los componentes, modo de acción, entre otros. Se Encontrando un alto riesgo para los consumidores al no contar estos con estándares mínimos de calidad, resalta la heterogeneidad de definiciones y legislaciones para la inscripción de nuevos productos fitoterapéuticos estableciendo que ningún país sigue las pautas de la Organización Mundial de la Salud para la producción de fitoterapéuticos, comparan los países que tienen listados de platas medicinales (75%, 12 países) y plantas toxicas (50%, 8 países) (Decreto 2266 2004), esto refleja el conocimiento de la población sobre plantas medicinales nativas y en el uso de fitoterapéuticos. Un estudio desarrollado en el occidente de Estados Unidos se evaluó 110 fitoterapéuticos conocidos por su actividad antioxidante siendo los segundos más vendidos después de los empleados como antimicrobianos, de los extractos estudiados, el 20,9% tiene reportes fitoquímicos y el 50,9% tiene estudios in vivo e in vitro (Cravotto et al 2010). De ahí la importancia de la importancia de la certificación de la capacidad antioxidante como medida de calidad y confiabilidad del fitoterapéuticos vendido (Calixto 2000). En la legislación colombiana registrada en el decreto 2266 del 2004 un producto se define como fitoterapéutico un producto medicinal empacado y etiquetado en el cual sus sustancias activas es de origen vegetal para fines farmacéuticos, no tiene principios activos aislados ni químicamente definidos, el origen puede ser de la planta entera, fresca o desecada incluyendo líquenes, hongos superiores y algas, partes o productos de dichas plantas, debe estar en el Vademécum colombiano de plantas medicinales o las farmacopeas de ediciones vigentes British Herbal Pharmacopoeia, British Pharmacopeia, Real Farmacopea Española, o las que rigen para la Unión Europea (USP), Brasilera, Mexicana, el Codex Francés, o en los textos de Plantas Medicinales Iberoamericanas -Gupta M.P.- Cyted, Who Monographs On Selected Medicinal Plants, Plant Drug Análisis - Wagner (Decreto 2266 2004). Los controles de calidad exigidos en Colombia son: perfil cromatográfico o características fitoquímicas (Prior et al 2005), identificación del principio activo, procedencia, modo de acción, propiedades medicinales, características toxicológicas, efectos adversos ni otros parámetros específicos (Decreto 2266 2004) control microbiológico (hongos y levaduras, NMP de coliformes, determinación de microorganismos patógenos). En la etiqueta debe contener nombre del producto, tipo de producto fitoterapéutico (uso tradicional o a partir de planta medicina), nombre común y científico del material vegetal, nombre y domicilio del fabricante, forma farmacéutica, composición con la expresión cuantitativa en peso del material vegetal/extracto/tintura utilizado en el producto fitoterapéutico usando el sistema centesimal según la forma farmacéutica, uso terapéutico/tratamiento sintomático, contraindicaciones, advertencias, precauciones especiales y otras, Condición de venta, condición
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de venta, a vida útil del producto, presentaciones comerciales, observaciones entre otros (Prior et al 2005). Dados los estudios anteriores, el problema de investigación se basa en la falta de la medición de la capacidad antioxidante por parte de las empresas elaboradoras y la falta de normatividad en este sentido proponiendo así un forma de certificar la calidad y confiabilidad de fitoterapéuticos comercializados de forma libre Resveratrol, arándano, arándano rojo americano, Palma enana Americana y Cardo mariano.
5. Objetivos
5.1. Objetivo general
Evaluar la capacidad antioxidante de fitoterapéuticos comerciales tipo Softgel (Resveratrol, arándano, arándano rojo americano, Palma enana Americana y Cardo mariano) por el método de capacidad de adsorción de radicales de oxigeno (ORAC).
5.2. Objetivos específicos
Establecer una metodología efectiva de extracción en base a la solubilidad y polaridad de los compuestos presentes en los fitoterapéuticos en estudio.
Determinar la capacidad antioxidante expresada en % protección de los fitoterapéuticos comerciales, Resveratrol, arándano, arándano rojo americano, Palma enana Americana y Cardo mariano.
Comparar la capacidad antioxidante de los extractos evaluados frente a estándares químicos infiriendo calidad y confiabilidad de los fitoterapéuticos comerciales.
6. Metodología
6.1. Fitoterapéuticos de venta libre
Los fitoterapéutico de venta libre: Resveratrol (50 mg), Arándano (1000 mg), Arándano rojo americano (4200 mg), Cardo mariano (1000 mg) y Palma enana americana (1000 mg) de la marca Puritans Pride fueron comprados en tiendas naturistas de la ciudad de Bogotá.
6.2. Extracción y determinación de la solubilidad
Determinación de solubilidad: Se determinó la solubilidad de cada uno de los fitoterapéuticos en solventes de diferente polaridad a partir de 10mg de fitoterapéutico, adicionando de a 250-2000µL de solvente buscándose relaciones entre sí (Metanol, etanol, acetato de Etilo, diclorometano, cloroformo y hexano) posteriormente se elaboró pruebas de interacción entre la placa de poliestireno y el solvente para eliminar interferencias.
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Solubilizacion en acido: con la espátula se toma un poco del fitoterapéutico y se coloca en una placa de solubilizacion, con un pipeta se agregaron gotas de ácido clorhídrico concentrado (HCl 37%) revolviéndose para ver si la acidificación ayuda a solubilizar el fitoterapéutico.
Medición de la interacción de los solventes con la placa de medición: en una placa de medición del mismo material adicionando con una pipeta unas gotas del solvente en la placa dejándolo por 7 minutos y evaluando el efecto del solvente, lavándose posteriormente para observar.
Reflujo: dos gramos de fitoterapéutico son colocados en un balón redondo de 250 ml, donde se le agregaron 150 ml de agua destilada desionizada conectándose a un sistema de reflujo a temperatura de ebullición por 6 horas. Transcurrido el proceso se filtró con un papel filtro previamente pesado, este se secó en horno a 40°C por 24 horas y se pesó para determinar la proporción de fitoterapéutico soluble e insoluble obteniéndose la concentración real del extracto. La fracción liquida fue aforada a 250 ml y refrigerada para su posterior medición por el método ORAC. Este procedimiento se realizara tres veces en el tiempo.
6.3. Medición de la capacidad antioxidante por el método ORAC
Buffer fosfato: se elaborara un buffer fosfato a partir de (Na2H2PO4
12H2O) a concentración de 75 mM ajustado a pH 7,4
Fluoresceína: se realizó un stock inicial de fluoresceína a 1000ppm a partir del cual se elaboró una solución secundaria tomando 50μl de la solución stock aforándose a 10 ml, para obtener la solución de trabajo con 150 µl de la solución secundaria aforándose a 25 ml en matriz de buffer para las determinaciones a nivel experimental.
Preparación del radical AAPH: se prepara una solución 600 mM de (2,2'-azo-bis (2-amidino-propano) dihidrocloruro) (AAPH) en matriz buffer fosfato.
Preparación del patrón: a partir de un stock de 1000 ppm de estándares químicos Trolox y ácido ascórbico grado analítico se realizaran las curvas patrón a diferentes concentraciones de 100, 60, 40, 20 ppm de Trolox.
Protocolo de medición: se siembra la placa de 96 pozos los cuales contenen 150ul de la solución de trabajo de fluoresceína 80µl de radical AAPH y 20µl de extracto del fitoterapéuticos a evaluar o patrón antioxidante en cada pozo, la medición del extracto de del fitoterapéuticos se va a evaluar a diferentes concentraciones (1000, 500, 300,100, 50ppm) encontrándose el IC50. Paralelo a este procedimiento se sembró el blanco (sin adición de radical AAPH) y el control negativo (buffer en lugar de extracto del fitoterapéutico con radical AAPH) determinándose el 100% de protección de la reducción de la fluoresceína. La placa se precalentó a 37°C en el incubadora de
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microplacas Thermostar sin agitación por media hora, transcurrido se determinara la señal de fondo midiendo la disminución de la fluoresceína iniciando la lectura usando como longitud de onda de excitación de 485nm y de emisión de 520nm miendose 60 ciclos de 90 segundos cada uno. La adición de 80ul de radical 2,2'-azo-bis (2-amidino-propano) dihidrocloruro) (AAPH) se realiza en el tercer ciclo de lectura. El ensayo se hará por triplicado tres veces en el tiempo.
6.4. Análisis de datos
Se graficaron las absorbancias obtenidas a través del tiempo en el programa Excel (Microsoft corporation) junto con el control positivo y negativo, calculándose la ecuación de la curva mediante una modelación polinómica determinando coeficiente de correlación r2 y prueba de polinomios ortogonales. En base a la ecuación obtenida se calculó el área bajo la curva de cada una por medio del programa Wolfram Alpha para integrales definidas.
Se determinó el ajuste al modelo lineal de las concentraciones y el porcentaje de inhibición, encontrando la concentración de antioxidante a la cual hay una 50% de protección denominada IC50, para la comparación con otros estudios se determinara la equivalencia en mmol de trolox /g extracto.
6.5. Análisis estadístico
Los datos obtenidos fueron analizados en el programa Statistix 10 mediante un análisis de normalidad, definiendo si existen diferencias significativas entre los tratamientos. Se aplicaron pruebas a posteriori o Post Hoc de Turkey para establecer los extractos más representativos con mayor capacidad antioxidante.
7. Resultados
7.1. Pruebas de solubilidad Tabla 2. Pruebas de solubilidad del extracto de resveratrol.
Cantidad pesada
(mg) Solvente Solubilidad
Volumen agregado
(ml)
solvente mezclado
Volumen agregado
(ml)
10,6 Etanol parcialmente
insoluble 2
10,1 Acetato de
etilo parcialmente
soluble 1,5
10,6 Diclorometano parcialmente en emulsión
1,5 etanol 1
10,7 Cloroformo parcialmente en emulsión
2 etanol 1,5
10,2 Hexano parcialmente
soluble 1
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Imagen 1. Pruebas de solubilidad del fitoterapéutico resveratrol en: A hexano, B diclorometano, C acetato de etilo, D etanol, E cloroformo.
Cantidad pesada
(mg) Solvente Solubilidad
Volumen agregado
(ml)
solvente mezclado
Volumen agregado
(ml)
10,9 Etanol insoluble 1
10,5 Metanol Parcialmente
soluble 1
10,7 Isopropanol Insloluble 1
10 Acetato de etilo
parcialmente soluble
1,25
10,8 Diclorometano parcialmente
soluble 1
10,8 Cloroformo Parcialmente
soluble 1
10,4 Acetonitrilo insoluble 1
10,6 Hexano
parcialmente soluble
1,25
10,3 dimetilsulfoxido soluble 1 metanol 2
Tabla 3. Pruebas de solubilidad del extracto de Vaccinium myrtillus.
Imagen 2. Pruebas de solubilidaddel fitoterapeutico Vaciinium myrtillus en: A hexano, B diclorometano, C acetato de etilo, D etanol, E metanol, F acetonitrilo, E cloroformo, F isopropanol, G dimetilsulfoxido.
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Cantidad pesada
(mg) Solvente Solubilidad
Volumen agregado
(ml)
solvente mezclado
Volumen agregado
(ml)
10,1 Etanol insoluble 1,5
10,2 Metanol insoluble 2
10,2 Acetato de
etilo parcialmente
soluble 1,5
10,1 Dicloromet
ano parcialmente
soluble 1,75
10,4 Cloroformo Parcialmente
soluble 2 Etanol 1
10,1 Hexano parcialmente
soluble 1,75
Tabla 4. Pruebas de solubilidad del extracto de Vacinium macrocarpon.
Imagen 3. Pruebas de solubilidad del fitoterapéutico Vaccinium macrocarpon en: A hexano, B diclorometano, C acetato de etilo, D etanol, E cloroformo.
Cantidad pesada
(mg) Solvente Solubilidad
Volumen agregado
(ml)
solvente mezclado
Volumen agregado
(ml)
10,2 Etanol insoluble 1
10,3 Acetato de
etilo parcialmente
soluble 1
10 Diclormeta
no parcialmente
soluble 1
10,4 Cloroformo Parcialmente
soluble 2 etanol 1
10 Hexano parcialmente
soluble 1
Tabla 5. Pruebas de solubilidad del extracto de Silybum marianum.
14
Imagen 4. Pruebas de solubilidad del fitoterapéutico Silybum marianum en: A etanol, B acetato de etilo, C diclorometano, D hexano, E cloroformo.
Cantidad pesada
(mg) Solvente Solubilidad
Volumen agregado
(ml)
Solvente mezclado
Volumen agregado
(ml)
10,0 Etanol insoluble 1
10,3 Acetato de
etilo parcialmente
soluble 1
diclorometano
1
9,9 Diclorometano parcialmente
soluble 1
10,0 Cloroformo Parcialmente
soluble 2 etanol 1
10,5 Hexano parcialmente
soluble 1
Tabla 6. Pruebas de solubilidad del extracto de Serenoa repens.
Imagen 5. Pruebas de solubilidad del fitoterapéutico Serenoa repens en: A hexano, B diclorometano, C acetato de etilo, D etanol, E cloroformo.
15
7.2. Interacción entre la placa de medición y los solventes
Imagen 6. Interacción entre la placa con los solventes A cloroformo, B etanol, C Acetato de etilo, D metanol, E isopropanol, F hexano, G diclorometano, H acetonitrilo.
7.3. Pruebas de solubilidad en ácido clorhídrico concentrado
Tabla 7. Pruebas de solubilidad en ácido clorhídrico
Fitoterapéutico Solubilidad
Resveratrol Insoluble
Vaccinium myrtillus Insoluble
Vaccinium macrocarpon Parcialmente soluble
Silybum marianum Insoluble
Serenoa repens Insoluble
16
Imagen 7. Pruebas de solubilidad en acido clorhidrico A Vaccinium macrocarpon, B Vaccinium myrtillus, C Serenoa Repens, D Resveratrol, E Silybum marianum.
7.4. Extracción por reflujo
Tabla 8. Rendimientos obtenidos en las extracciones por reflujo.
Extracto Replica Gramos pesados
Tiempo extracción
(horas)
% soluble
% insoluble
Concentración (ppm)
Resveratrol
1 2,0134 6 15,1 84,9 1218,8
2 2,0033 6 13,2 86,8 1061,2
3 2,0067 6 16,4 83,6 1315,2
Vaccinium myrtillus
1 1,9853 6 78,9 21,1 6264,4
2 2,0342 6 66,1 33,9 5382
3 1,8841 6 62,9 37,1 4738
Vaccinium macrocarpon
1 1,9521 6 41,5 58,5 3238,4
2 1,9936 6 40,6 59,4 3239,2
3 1,9636 6 63,9 36,1 5016,4
Silybum marianum
1 2,086 6 44,9 55,1 3746,4
2 1,9423 6 43,5 56,5 3376,8
3 1,9089 6 66,3 33,7 5066
Serenoa Repens
1 2,1112 6 48,9 51,1 4129,2 2 2,0432 6 51,2 48,8 4185,6
3 1,9423 6 35,2 64,8 2735,2
17
Imagen 8. Imágenes extracciones por reflujo de los extractos A Reveratrol, B Vaccinium myrtillus C Vaccinium macrocarpon D Silybum marianum E Serenoa repens.
7.5. Medición de la capacidad antioxidante
7.5.1. Curva patrón Trolox
Tabla 9. Curva patrón trolox realizada por el método ORAC.
Concentración ppm
% protección
CV
10 17,3357 10,59 30 30,6044 3,75 70 50,4060 2,06
100 63,7965 2,08
Concetracion (ppm)
0 20 40 60 80 100
%in
hib
icio
n
0
10
20
30
40
50
60
70
Grafica 1. Curva patrón de trolox obtenida por el método ORAC.
y = 0,5102x + 13,752
R² = 0,9949
18
7.5.2. Protección dela fluoresceína de los extractos
Concetracion
0 200 400 600 800 1000
% p
rote
ccio
n
0
20
40
60
80
100
Resveratrol
V. myrtillus
V.macrocarpon
S. marianum
Grafica 2. Protección dela fluoresceína de los extractos obtenidos por el método ORAC.
Tabla 10. Ecuaciones y coeficiente de correlación lineal de los extractos de los extractos.
Extracto Ecuación de recta R2
Resveratrol y = 0,0333x + 68,931 0,9599 Vaccinium myrtillus y = 0,0322x + 24,483 0,9442
Vaccinium macrocarpon y = 0,0858x + 2,1381 0,9918 Silybum marianum y = 0,0369x + 25,345 0,9478
7.6. Equivalencia con trolox Tabla 11. Equivalencia con trolox e IC50 con regresión lineal.
Extracto μmol Trolox/g
extracto IC50 (ppm)
Resveratrol -499,3102 -568,4985
Vaccinium myrtillus 358,2004 792,4534
Vaccinium macrocarpon 508,8586 581,6033 Silybum marianum 394,7681 719,0476
Trolox (control)
71,0466
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Tabla 12. Equivalencia con trolox e IC50 con regresión polinomica grado 2.
Extracto IC50 (ppm) μmoltrolox/g
extracto
Resveratrol -98.390 -2,7772642
Vaccinium myrtillus 706,11 386,986481
Vaccinium macrocarpon 660,76 413,546559
Silybum marianum 469,49 582,025228
trolox 68,393
7.7. Serenoa repens Tabla 13. Protección de fluoresceína del extracto de Serenoa repens obtenido por el método ORAC.
Concentración (ppm)
% protección
4129 22,18
7.8. Análisis estadísticos
Análisis de varianza Tabla 14. Análisis de varianza obtenido por Statistix 10.
Fuente DF SS MS F P
Extracto 4 24342,7 6085,66 58,29 0,0000 Concentración 7 31243,7 4463,38 42,75 0,0000
Error 60 6264,0 104,40 Total 71
Comparación de Tukey Tabla 15. Comparación de Tukey (α 0,05) obtenido por Statictix 10.
Extracto Mean Grupos
homogéneos
Trolox (control) 69,094 A Resveratrol 67,544 A
S. marianum 30,277 B V. macrocarpon 21,610 B
V. myrtillus 21,610 B
20
Grafica 3. Prueba de normalidad de Shapiro-Wilk obtenida en Statistix 10.
Grafica 4. Grafica de valores residuales obtenida por Statistix 10 para
determinar homogeneidad de varianza.
Grafica 5. Comparación de medias de Tukey obtenida por Statictix 10 para
determinar la homogeneidad de varianza.
Normal Probability Plot
-3 -2 -1 0 1 2 3
-40
-20
0
20
40
Re
sid
ua
ls o
f R
TA
RankitsShapiro-Wilk W 0,9623 P(W) 0,0299 72 cases
Residuals by Fitted Values Plot for RTA
10 40 70 100 130
-27
-18
-9
0
9
18
27
Re
sid
ua
ls
Fitted values
Means of RTA for ext*conc
10 30 50 70 100 300 500 1000
-30
10
50
90
130
RT
A
conc
ext
1
2
3
4
5
21
8. Discusión
La solubilidad de los extractos se ve influida por los aditivos en los cuales viene el producto, en el caso de los extractos estudiados de resveratrol, arándano (Vaccinium myrttillus), arándano rojo americano (Vaccinium macrocarpon), cardo mariano (Silybum marianum) y palma enana americana (Serenoa repens), como compuestos declarados en la etiqueta sobre el contenido de las capsulas Softgel son: aceite de soya, glicerina vegetal colorantes, lecitina de soya (ver anexo 1); haciendo su extracción en medios polares por la naturaleza de su estructura, infiriéndose que la matriz de extracción es difícil en solventes polares teniendo más afinidad por la polaridad media (Chang 2013), estos se eliminan completamente después del proceso de extracción y elaboración delos fitoterapéuticos, como patrón común obtenido es la tendencia a ser soluble en de polaridades medias a apolares (diclometano, acetato de etilo y cloroformo).Gracias a su estructura aromática que tiene una tendencia apolar y los grupos hidroxilo responsables de la actividad antioxidante con tendencia polar.
En las pruebas de interacción entre la placa y la medición con los solventes, su interacción no fue favorable al diluir o derretir la placa. Estos solventes de polaridad media no pudieron ser utilizados por la anterior razón, motivo por el cual se optó por la evaluación de la capacidad antioxidante en extractos acuosos obtenidos por el método de reflujo con el riesgo de disminuir las mediciones por la pérdida de las características termolábiles de los productos.
Como pruebas adicionales elaboradas se determinó la interacción de los extractos con ácido clorhídrico concentrado como método para facilitar la extracción y de esta manera la disminución del calor, por ende la posible destrucción de los principios activos volviendo más más eficiente la extracción, facilitando su solubilizacion de los compuestos presentes por la lisis de proteínas y azucares presente. Con respecto a los resultados obtenidos solo el extracto de Vaccinium myrtillus obtuvo una solubilizacion parcial eliminando la acidificación del medio como método para facilitar la extracción al no poder unificarse.
Los solventes más utilizados en la industria para la extracción de compuestos activos de plantas y elaboración de fitoterapéuticos son los polares destacándose el agua y los alcoholes, no siendo el mejor método de extracción los solventes de polaridad media.
Resveratrol
La elaboración de extractos utilizados por los autores consultados en estudios de la molécula mencionada se encuentra que se utilizan como solventes agua, metanol, etanol y una mezcla de estos en diferentes proporciones (Lee et 2003, Hsu et al 2007, Pan et al 2007, Floegel et al 2011), en los resultados en el estudio realizado se obtuvo solubilidad parcial en acetato de etilo cloroformo y diclorometano, siendo esta una solución clara, la solución su interacción con el etanol fue la formación de una emulsión consiguiéndose la disolución completa con la mezcla diclorometano:cloroformo al poderse disolver los aditivos y compuestos activos presentes; en el extracto realizado se encontró la
22
solubilidad en agua del 15% esto pudo estar influido por la naturaleza polar de los aditivos dejando un alto porcentaje de extracto insoluble.
La actividad antioxidante del resveratrol obtenida en este estudio (ver anexo 5) fue de -499,3102 μmol Trolox/g extracto (IC50 -568,49ppm) reflejando una baja capacidad antioxidante en solución acuosa obteniéndose mejores resultados en la etanolica al tener una mayor actividad antioxidante 1055,3µmol trolox/100g y 1849µmol trolox/100g respectivamente en los resultados obtenidos por Cai et al (2004), Floegel et al (2011) el resultado obtenido fue de 1548µmol TE/100g en etanol al 95%, Guder et al (2014) 70% en una concentración de 50µg/ml. El IC50 obtenido por Hsu et al (2007) fue de 100 µg/ml estos se puede deber a su resuspensión en agua al no ser soluble la molécula, siendo más bajo que el obtenido en el estudios de Pan et al (2007) en el cual se obtuvo un IC50 de 0,8mg/ml (Cai et al 2004, Hsu et al 2007, Pan et al 2007, Floegel et al 2011, Güder et al 2014).
La presencia de fenoles totales en extractos etanolicos obteniéndose 8,08g/100g peso seco de muestra mientras que en los extractos acuosos se reduce a la mitad (4,54g/100g peso seco) identificándose la presencia de antraquinonas (emodina) antraglicosidos, estilbenos (resveratrol), y fenoles en la muestra demostrando que con la extracción del resveratrol, sustancia a la que se le responsabiliza de la capacidad antioxidante, con él se extraen fenoles antraquinonas y antraglicósidos que también actúan como antioxidantes no siendo la responsabilidad completa del resveratrol (Cai et al 2004).
El resveratrol es un estilbeno ampliamente estudiado conocido en el mundo por estar en la uva, un método de extracción indirecta utilizada inconscientemente utilizada ampliamente en la industria es en la elaboración de vino tinto conocido por sus beneficios a la salud mostrando capacidad de diluirse parcialmente en etanol lo que concuerda con lo obtenido. Una explicación de la baja actividad de los extracto obtenidos son la fotosensibilidad y termosensibilidad al ser expuesta al ambiente, haciéndola muy inestable, afectando directamente el método de extracción en la actividad para la cual es tomada. Las moléculas que posiblemente se solubilizaron en el extracto elaborado fue la emodina, fenoles, los antraglicosidos por la presencia de azucares en su estructura siendo solubles en agua explicando la diferencia entre la diferencias de solubilidad entre los extractos acuosos y los alcoholicos.
Vaccinium myrtillus
Los solventes utilizados para la elaboración de este extracto, en la literatura consultada fueron agua, metanol, etanol en diferentes proporciones (Paes et al, Faria et al 2005, Skrede et al 2012, Betz et al 2012), los resultados obtenidos mostraron una solubilidad parcial en polaridades medias en los solventes metanol, acetato de etilo y diclorometano y en solventes apolares como hexano y cloroformo indicando la polaridad de los compuestos es media a apolar. En el único solvente en el cual hubo una solubilidad completa fue en dimetilsulfoxido por la presencia del oxígeno en doble enlace con el azufre el cual tiene 2 electrones libres, teniendo también una afinidad por los apolares o medianamente apolares por la presencia de dos grupos metilo. La solubilidad en los extractos acuosos fue de 78,9% teniendo una concentración de 6264,4ppm esto se refleja en la capacidad antioxidante obtenida.
23
Los resultados obtenidos de la medición de la capacidad antioxidante en el estudio (ver anexo 6) fue de 358,2004μmol trolox/g (IC50 792,45ppm) obteniéndose una baja capacidad antioxidante con los resultados obtenido por Skrede et al (2012)(32,2µmol trolox/g), Paes et al (446µmol trolox/g) realizando este estudio una liofilización como método de extracción, la medición por el método DPPH se obtuvo una mayor capacidad antioxidante (17µmol trolox/g), Betz (2206µmol TEAC/g), Faria (5,366µmol trolox/g). Los datos dan una diversidad muy grande entre estudios, esto se puede deber al método de extracción siendo el mejor método reportado el de Faria et al (2005) al obtener una mayor capacidad antioxidante al estar disuelto en una solución de agua: etanol 1:1 a pH 1,5 viéndose un efecto positivo en la extracción la acidificación del medio (Faria et al 2005); consiguiéndose una menor capacidad antioxidante en los estudios de Betz et al (2012) por ser mediciones obtenidas a partir de un extracto comercial a partir de los frutos. Viéndose el efecto de los procesos de elaboración de los fitoterapéuticos como un factor que contribuye la disminución de dela capacidad antioxidante, siendo más soluble el principio activo en extractos a partir de los frutos (Paes et al, Faria et al 2005, Betz et al 2012, Skrede et al 2012).
En los estudios de Faria et al 2005 y Skrede et al 2012 estudiaron la presencia de fenoles totales medidas por el método de Folin-Cicocalteu obteniéndose 257mg/l y 576mg GAE/100g respectivamente, esta es una concentración alta, la medición de flavonoides totales el cual contiene 153,1mg/l y un contenido de pigmentos totales de 78,8mg/l (Faria et al 2005), en la medición de antocianinas totales en el extracto acuoso se obtuvo como resultado 458mg/100g peso seco, siendo las responsable de la pigmentación las antocianinas demostrando una mayor disolución en medios polares(Skrede et al 2012) , esta moléculas tienen la capacidad de oxidar radicales libres en el medio en donde se encuentren, esto se debe a la función que cumplen en la planta al estar principalmente en la cascara de los frutos para proteger a este de las radiación UV y mitigan el efecto de la formación de radicales libres consecuencia de la fotosíntesis las cuales la reducen; la importancia del lugar de extracciones primordial pues la mayor concentración de estos compuestos esta es en el fruto, en el estudio de Paes et al (2004) lo extrajo de dela piel de semillas y la pulpa por medio de liofilización para poder conservar las características antioxidantes no obteniéndose el mejor resultado por la concentración de compuestos en las semillas y la pulpa(Paes et al, Faria et al 2005, Skrede et al 2012)
Estos estudios relacionan directamente con la capacidad antioxidante confirmándose por la identificación y caracterización de los compuestos están delfidina, cianidina, petulina, peonidina, petunidina, malvidina (Faria et al 2005, Betz et al 2012) la solubilidad se ve afectada positivamente en solventes polares como el etanol y agua (Skrede et al 2012) al estar asociada estas moléculas con glúcidos. Esto afecta la asimilación en el organismo objetivo entrando más fácil en los fluidos, tras su posterior lisis del azúcar quedando en una ubicación en un ambiente oxidante.
Vaccinium macrocarpon
Los solventes utilizados en la extracción de este extracto son los mencionados por otros autores (Yu et al 2005, Floegel et al 2011, Namiesnik et al 2014):
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metanol y agua. En los estudios encontrados la extracción se elaboró en 2 fases: la primera en la cual el solvente común fue el metanol en diferentes proporciones con agua y la segunda donde se resuspendio en diferentes solventes y tratamientos: Yu et al (2005) en dimetilsufoxido, Floegel et al (2011) en metanol: agua 4:6 y Namiesik et al (2014) liofilizo la muestra y re suspendió la muestra en una muestra en una solución acusa. Los resultados obtenidos en el estudio de una solubilidad parcial en acetato de etilo, diclorometano, cloroformo y hexano, mientras que en etanol y metanol no se solubilizo. La solubilidad en los extractos acuosos fue de 41,5% teniendo una concentración de 32138,4ppm, esto se puede deber a los aditivos agregados en el fitoterapéuticos, mientras que en los estudios consultados la extracción se hace directa de los frutos (Çelik et al 2008, Floegel et al 2011, Caillet et al 2011, Namiesnik et al 2014) y las semillas (Namiesnik et al 2014).
Los resultados obtenidos de la capacidad antioxidante en el estudio (ver anexo 7) fueron 488,0597μmol trolox/g (IC50 581,60ppm), en comparación con los resultados obtenidos a partir del fruto en el estudio de Namiernik et al (2014) con mejores resultados (46,58mg trolox/g) (Namiesnik et al 2014), 9584µmol trolox/100g (Floegel et al 2011), la medición en semillas medida por Yu et al (2005) mostrando un alto contenido de principio activo con una medición 22,5µmol trolox/g (Yu et al 2005). Las diferencias de la capacidad antioxidante entre estudios se puede deber a varios factores como: la variadad de origen del extracto, los compuestos extraídos del fitoterapéuticos, el solvente y el método de extracción, mostrando menos eficiencia en los extractos acuoso que los metanolicos facilitando el metanol la solubilizacion por tener una naturaleza menos polar que el agua .
El contenido de fenoles totales obtenidos por Yu et al fue 1,61mg ácido gálico/g (Yu et al 2005) en comparación con el estudio de Maniesnik et al (2014) el cual obtuvo una menor concentración (22,13mg ácido gálico/g) y Çelik el al (2008) con resultado de 4745mg GE/kg el contenido de flavonas y flavonoides se encontraron valores de 467,36mg CE/g y 3,83mg CE/g encontrándose mayor cantidad de flavonoides presentes en el fruto al tener estos funciones protectoras, relacionándose con la capacidad antioxidante al contener grupos hidroxilo, permitiéndole proteger a otras moléculas de la oxidación (Çelik et al 2008, Namiesnik et al 2014).
Las moléculas encontradas en las mediciones cromatografícas en este fruto son ácido ascórbico, málico, cítrico (Çelik et al 2008), clorogenico, quinico, tartárico y 2,3 guacilpropanona (Namiesnik et al 2014), ácido ascórbico (4,6 mg/100g) (Çelik et al 2008), delfidina, cianidina, petulina, peonidina, petunidina, malvidina (Paes et al, Faria et al 2005). Asociándose estas moléculas a azucares y glúcidos facilitando su solubilizacion, siendo más afín con el metanol tendiendo este a ser menos polar. La mejor solubilizacion se fue en dimetilsulfoxido por la presencia de azufre el cual tiene dos electrones libres junto con la presencia de oxigeno extrayendo mejor los principios activos.
Silybum marianum
La elaboración de los extractos de este fruto en la bilbiografía consultada fueron: agua, metanol, etanol, dimetildsulfoxido como disolvente para estudio (Akkaya y Yilmaz 2012, Anthony y Saleh 2013). La solubilidad obtenida
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experimentalmente en el estudio revelo una tendencia media siendo parcialmente soluble en acetato de etilo, cloroformo, diclorometano y en solventes apolares como el hexano. La solubilidad completa se consiguió en una mezcla 2:1 de cloroformo: etanol mostrando la tendencia a las bajas y medias polaridades reflejándose en la solubilidad en los extractos acuosos fue de 43,5% teniendo una concentración de 3376,8ppm pudiendo afectar la unión de estas moléculas con azucares haciéndose más solubles en medios polares
La medición de la capacidad antioxidante obtenida en el estudio (ver anexo 8) fue de 394,7681μmol trolox/g (IC50 719,05ppm) encontrándose una menor capacidad antioxidante en comparación con los valores logrados por otros autores 61,95µmol trolox/g, 12,3µM/100g (Wojdilo et al 2007) en los resultados expresados en porcentaje de protección de obtuvo 94,94% en una solución en dimetilsufoxido (Anthony y Saleh 2013) y el 28% en una solución de etanol al 96% (Hadaruga y Hadaruga 2009), demostrando la influencia del solvente en los resultados obtenidos, siendo el 60,81% el mayor porcentaje de protección obtenido en el estudio, no extrayéndose 1/3 de las moléculas activas (Wojcikowski et al 2007).
En la identificación cromatográfica se identificaron como moléculas responsables querecina, catequinas, naringina, naringenina, resveratol (Skrede et al 2012), silibina y sus derivados como siendo esta la molécula característica de la especie vegetal (Betz et al 2012). Un análisis cromatografico a partir de un extracto de esta molécula mostro la presencia de taxifolina, silicristina, silidianina, silibina A, silibina B, isosilibina A, isosilibina B y silimarina (Anthony y Saleh 2013)
El IC50 de la silimarina es 100ug/ml medida por el método ABTS (Adhikari et al 2012). En el estudio de la identificación cromatografía y aislamiento de los compuestos presente en un extracto de silibina en el cual se midió la capacidad antioxidante de cada compuesto las mediciones del IC50 se destacaron la isolilibina A (855µM), isosilibna B (813µM) y la silibina A (311µM) y B (344µM) por el mismo método ABTS, la menor capacidad antioxidante obtenida en las mediciones por el método ORAC la mayor capacidad antioxidante se obtuvo en la toxifolina, encontrándose la menos equivalencia con Trolox estando por encima de la silibina con 280mg TE/g, junto con la salicristina 0,61mg TE, taxifolina 0,75mg TE y la silibina B 0,79mg TE en los resultados obtenidos por el método ABTS (Akkaya y Yilmaz 2012, Anthony y Saleh 2013).
La relación con el contenido totales de fenoles presentes y su medición dela capacidad antioxidante en el estudio de Wojdilo en el (2007) 4,77mg GAE/100mg, es proporcional (Wojdyło et al 2007), por la presencia de radicales hidroxilo presentes en el anillo B de la querecina al ser donadores de hidrógenos (Akkaya y Yilmaz 2012) afectando la naturaleza dla estructura en la solubilidad al extraerse menos del 50% del extracto pudiendo estar presente en el la querecina, catequinas, naringina, naringenina, resveratol (Skrede et al 2012), silibina A y B, silimamrina, isolilibina, y isosilibna B, taxifolina, saliscristina, silidianina (Anthony y Saleh 2013) mostrando estas moléculas una solubilidad media y por ende no extrayéndose completamente en soluciones acuosos. La presencia de estas moléculas se puede dar por los enlaces con azucares en estos medios polares. Demostrando un una protección del 94% en una disolución completa del extracto en dimetilsulfoxido por la presencia del
26
oxígeno en doble enlace con el azufre el cual tiene 2 electrones libres, teniendo también un afinidad por los apolares o medianamente apolares por la presencia de dos 2 grupos metilo .
Serenoa repens
La solubilidad del extracto de Serenoa repens acuoso obtenido en el estudio (ver anexo 9) fue una solubilidad parcial en los solventes de polaridades medias y apolares (diclorometano, cloroformo y hexano) la solubilizacion completa se obtuvo en las mezclas acetato de etilo: diclorometano 1:1 y cloroformo: etanol 1:1. La solubilidad en los extractos acuosos fue de 48,9% teniendo una concentración de 4129,2ppm.
En el estudio de Stockhammer et al (2008) se extrajo con heptano, etanol, agua obteniéndose un mayor rendimiento en las extracciones con la etanolica seguido por las acuosos y por ultimo las de las soluciones con heptano obteniéndose valores de 45,9, 28,9 y 5,4g/kg de material extraído respectivamente mostrando una mayor solubilidad en solventes de polaridad media y apolares (Stockhammer et al 2009). En los estudios elaborados por Wojcikwski et al (2007) la mayor capacidad antioxidante se obtuvo en los extractos metanolicos (48,5µmol trolox/g) en comparación con el extracto metanol: agua 1:1 (69,95µmol trolox/g) (Wojcikowski et al 2007). Al ser el agua una molécula muy polar puede afectar las extracciones al crear uniones por puentes de hidrogeno.
En la medición de la capacidad antioxidante obtenido en el estudio anterior medido por el método DPPH de 15,9mg ácido rosmerico/g seguido por el obtenido a partir del fruto (3,0mg rae/g), en el extracto acuoso (2,6mg ácido rosmerico/g) obteniéndose la menor capacidad antioxidante en los extractos cuyo solvente fue el heptano (Stockhammer et al 2009), los resultados obtenidos en el estudio realizado son bajos en comparación con los estudios al tener un porcentaje de protección dela fluoresceína del 22,18% en su mayor concentración (40129,2ppm), indicando una baja concentración de compuestos activos extraídos en un medio polar.
En comparación con la medición por el método de fotoquimio-luminiscencia donde se la diferencia de luminiscencia de los extractos a través del tiempo cuyo solvente fue el heptano, seguidos por los acuosos y los etanolicos este método es más apto para la medición de los extractos de esta planta. La relación entre los fenoles totales fue indirectamente proporcional para este extracto al tener la mayor cantidad los extractos acuosos obteniéndose 107,6 equivalentes de trolox seguido por los extractos etanolicos de 29,3 equivalentes de trolox , y el los heptanolicos 0,6 equivalentes de trolox (Stockhammer et al 2009 ) esto puede ser debido a que las moléculas responsables de la capacidad antioxidante ácidos grasos (ácido caprilico, caprico, laurico, miristico, oleico, linoleico, esteárico y palmítico, fitoesteroles como β-sitosterol, camperterol y estigmaterol), teniendo esto más afinidad por los solventes apolares como el heptano explicando la relación inversa entre fenoles totales y su capacidad. la capacidad antioxidante puedo ser responsabilidad de ácido vainillinico, y derivados de la vitamina E (Akkaya y Yilmaz 2012) siendo estos solubles en medios polares, pero estando en concentraciones más bajas 5-
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30% dificultando su extracción para su medición antioxidante acorde a la poca bibliografía encontrada.
La solubilidad en agua de los extractos evaluados Vaccinium myrtillus, con el mayor porcentaje de solubilizacion del 78,9% seguido de Serenoa repens, este extracto a pesar de ser uno de los más solubles aparentemente obtuvo la menor capacidad antioxidante por la polaridad de los ácidos grasos insaturados siguiéndole Silybum marianum con un 43,5%, Vaccinium macrocarpon con un 41,5%, teniendo la mayor medición de la capacidad antioxidante y finalizando con el extracto de Resveratrol el cual tuvo un 15,1%, se puede ver una tendencia a la disminución de la solubilidad en agua a medida que aumenta la capacidad antioxidante siendo una relación inversamente proporcional.
Los extracto con mayor capacidad antioxidante fue el de Resveratrol > Vaccinium macrocarpon > Silybum marianum > Vaccinium myrtillus > Serenoa repens afectando la presencia de fenoles en los extractos viéndose una relación directa con la capacidad antioxidante en todos los extractos evaluados con excepción del obtenido a partir de Serenoa repens por la presencia de ácidos grasos insaturados difíciles de extraer en medos polares como lo es el reflujo siendo estos los principales responsables de esta.
El test de normalidad Shapiro-Wilk (α=0,05, p=0,0299) mostraron diferencias estadísticas significativas entre los tratamientos al arrojar valores de P menores a 0,05. En las pruebas Post Hoc se buscaron los subgrupos homogéneos formados por el análisis de Tukey (α 0,05) diferenciándose dos grupos el del control y resveratrol reiterando la mejor capacidad antioxidante separándose de los extractos de V. myrtillus, V. macrocarpon y S. marianum creando estos un grupo homogéneo al tener varianzas parecidas dentro del grupo, resaltándose una diferencia menor entre los extractos de V. myrtillus y V. macrocarpon temiendo este una mayor capacidad antioxidante.
9. Conclusión
La solubilidad de los principios activos se ve influido por la solubilidad de la
molécula en el medio por la naturaleza apolar de los compuestos, tendiendo a
la polaridad media siendo mejores solventes para la extracción el
diclorometano, acetato de etilo y el cloroformo y relacionándose con, los
aditivos presentes en los Softgels evaluados, facilitando estos la estabilidad del
compuesto inclusive en un medio acido. La medición de la capacidad para
medicamentos fitoterapéuticos es una medida de control de calidad de estos,
obteniendo resultados significativos en los extractos acuosos de resveratrol,
arándano (Vaccinium myrtillus), arándano rojo americano (Vaccinium
macrocarpon) y cardo mariano (Silybum marianum) teniendo mayor capacidad
antioxidante el extracto de resveratrol seguido por el extracto de arándano
(Vaccinium myrtillus). En la extracción del extracto de palma enana americana
(Serenoa repens) no se obtuvieron resultados significativos por las
características de polaridad elaboradas por este estudio. La calidad de los
fitoterapéuticos evaluados no es buena pues pudo ser afectada por el proceso
de extracción y por ende no es confiable el producto.
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Recomendaciones
En base a los análisis realizados se recomienda realizar una estandarización de un método de extracción efectivo para la medición de fitoterapéuticos ya elaborados para mejorar el método de control de estos medicamentos y en especial para el extracto de Serenoa repens aumentando el conocimiento por medios de estudios in vitro sobre esta especie vegetal dada la falta de reportes bibliográficos referentes a las actividades biológicas de la especie vegetal. Exigir mediante las legislaciones de los países estudios de este tipo como requisito para su liberación al mercado y posterior comercialización, asegurando su calidad y confiabilidad del producto.
Buscar un método de elaboración de fitoterapéutico en el cual el proceso no tenga un impacto sobre la actividad antioxidante, función para cual fue elaborado.
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