detección de resonancia raman de antioxidantes carotenoides en tejido vivo humano

7/21/2019 Detección de Resonancia Raman de Antioxidantes Carotenoides en Tejido Vivo Humano

http://slidepdf.com/reader/full/deteccion-de-resonancia-raman-de-antioxidantes-carotenoides-en-tejido-vivo 1/16

Detección de Resonancia Raman de antioxidantes carotenoides en tejido

vivo humano

El aumento de la evidencia apunta a los efectos beneciosos de los

antioxidantes carotenoides en el cuerpo humano. Varios estudios, por

ejemplo, apoyan el papel protector de la luteína y la eaxantina en la

prevención de enfermedades oculares relacionadas con la edad. !i est"

presente en altas concentraciones en la re#ión macular de la retina, la

luteína y la eaxantina proporcionar pi#mentación en este punto de la retina

sensible a la mayoría de la lu, y como resultado de la ltración de la lu y $

o acción antioxidante, retrasar la aparición de de#eneración macular con el

aumento de edad. %tros carotenoides, como el licopeno y beta&caroteno,

jue#an un papel importante tambi'n en la protección de la piel de los rayos

(V y la radiación visible de corta lon#itud de onda. )a luteína y el licopeno

tambi'n pueden tener la función de protección para la salud cardiovascular,

y el licopeno pueden ju#ar un papel en la prevención del c"ncer de próstata.

*otivado por la creciente importancia de los carotenoides en la salud y la

enfermedad, y reconociendo la falta de cual+uier tecnolo#ía no invasiva

aceptado para la detección de carotenoides en el tejido vivo humano,

exploramos resonancia espectroscopia Raman como un nuevo m'todo para

la detección de carotenoides óptica l"ser no invasivo. !e revisan los

principales resultados alcanados recientemente con el enfo+ue de

detección de Raman. nicialmente se aplicó el m'todo para la detección de

pi#mentos carotenoides maculares, y m"s recientemente a la detección de

carotenoides en la piel humana y tejidos de las mucosas. El uso de

instrumentos Raman carotenoides piel, medimos la respuesta de

carotenoides de la capa de estrato córneo de la palma de la mano para una

población de -./0 sujetos y desarrollamos un esc"ner Raman piel port"til

para los estudios de campo. Estos experimentos revelan +ue los

carotenoides son un buen indicador del estado antioxidante. Ellos muestran

+ue las personas con alto estr's oxidativo, como los fumadores, y los

sujetos con alta exposición al sol, en #eneral, han reducido los niveles de

carotenoides en la piel, independientemente de su consumo de

carotenoides en la dieta. 1os encontramos con la t'cnica Raman para ser

precisos, especíca, sensible y bien adecuado para clínica, así comoestudios de campo. )a t'cnica de l"ser no invasiva puede lle#ar a ser un

m'todo 2til para la correlación entre los niveles de carotenoides de tejido y

ries#o de neoplasias mali#nas u otras enfermedades de#enerativas

asociadas con el estr's oxidativo.

3alabras clave4 la espectroscopia Raman, carotenoides, la piel humana,

m"cula, antioxidantes, detección no invasiva, luteína, eaxantina, licopeno,

5&caroteno

r4



-. ntroducción

Espectroscopia Raman es una forma muy especíca de la espectroscopia

vibracional +ue ha sido utiliado rutinariamente para identicar y cuanticar

compuestos +uímicos. *ol'culas carotenoides son especialmente

adecuados para las mediciones Raman, ya +ue pueden estar entusiasmadoscon la lu se superponen sus bandas de absorción visibles. 6ajo esta

condición de excitación, exhiben un 7RR!8 de respuesta muy fuerte

dispersión Raman de resonancia, con un factor de mejora de alrededor de

cinco órdenes de ma#nitud con respecto a no resonante Raman

spectroscopy.- Esto permite a uno para detectar los niveles de ener#ía de

vibración característicos de carotenoides a trav's de su correspondiente

rma huella espectral incluso en los sistemas bioló#icos complejos, como en

el tejido vivo humano. 9ual+uier fuera de resonancia Raman respuesta de

otras mol'culas presentes en el volumen de muestreo sería fuertemente

suprimida en estas condiciones y sería enterrado en el ruido de fondo.:dem"s, el entorno del tejido de los carotenoides tiene sólo un efecto

insi#nicante sobre la ener#ía de vibración, con lo +ue la rma Raman

pr"cticamente id'ntica para la mol'cula aislada de carotenoides, la

mol'cula en solución, o la mol'cula en un entorno celular.

*otivado por la creciente importancia de los antioxidantes carotenoides en

la salud y la enfermedad, y reconociendo la falta de cual+uier tecnolo#ía no

invasiva aceptado para la detección de antioxidantes carotenoides en el

tejido vivo humano, empeamos a mirar en RR! como un nuevo m'todopara la detección no invasiva, laseroptical. nicialmente, se aplicó este

nuevo m'todo para la detección de pi#mentos carotenoides maculares 7*38,

+ue se componen de las especies de carotenoides luteína y eaxantina.

6ound al tejido macular en concentraciones muy altas, se cree +ue estos

pi#mentos a ju#ar un papel importante en la prevención de de#eneration.;

macular relacionada con la edad (so de RR! en una #eometría de

retrodispersión estamos desarrollando la tecnolo#ía para mediciones in vivo

*3 en el laboratorio y clínicos <,&= ensayos independientes +ue utilian la

tecnolo#ía Raman ocular para estudios de población y en relación con

patolo#ías oculares ahora est"n en curso en varios sitios >orld>ide./&-;Recientemente hemos empeado a desarrollar RR! espectroscopia para la

detección de antioxidantes carotenoides en la piel humana y tejido de la

mucosa, -&-= tejidos donde se cree +ue otras especies de carotenoides

como el licopeno y beta&caroteno para ju#ar un importante papel protector,

como en la protección de la piel de los rayos (V y la radiación visible de

onda corta. El carotenoides luteína y el licopeno tambi'n pueden tener

funciones de protección para la salud cardiovascular, y el licopeno pueden

ju#ar un papel en la prevención del c"ncer de próstata. Es concebible +ue

los niveles de la piel de estas especies se correlacionan con los niveles

correspondientes de los tejidos internos. Estudios clínicos independientes+ue utilian la detección Raman de carotenoides en la piel +ue investi#an



posibles correlaciones entre los niveles de carotenoides de la piel y de

mama y el c"ncer de próstata en #randes bases de sujetos han sido

recientemente iniciado en el ?ospital 9harit', en 6erlín, @ermany.-/

r4

; 3ropiedades ópticas y RR! de carotenoides

)os carotenoides son mol'culas de cadena de carbono de electrones A&

conju#ado y son similares a los polienos con respecto a su estructura y

propiedades ópticas. )as características distintivas son el n2mero de

enlaces dobles de carbono conju#ado 7bonos 9 BB 98, el n2mero de #rupos

laterales metilo unidos, y la presencia y la estructura de #rupos terminales

conectados. )as estructuras moleculares de al#unas de las especies de

carotenoides m"s importantes +ue se encuentran en el tejido humano, juntocon sus espectros de absorción, se muestran en la Ci#. -. Ellos incluyen 5&

caroteno, eaxantina, licopeno, luteína, y toueno. )as absorciones

electrónicos son fuertes en cada caso, se producen en bandas anchas 7

-<< nm de anchura8, y cambian a mayor lon#itud de onda con el aumento

de n2mero de lon#itud de conju#ación eca de la mol'cula

correspondiente. )a absorción de toueno 7cinco conju#ado 9 BB bonos c8

se posiciona en el (V cercanoF 5&caroteno, luteína, eaxantina y 7--,-< y --

9 BB bonos 9, respectivamente8 se centran en GG< nm, y el licopeno 7--

enlaces8 picos a G0< nm. Hodas las absorciones muestran una

subestructura vibrónica claramente resuelto debido a la d'bil acoplamientoelectrón&fonón, con una separación de -G<< cm&-. Hransiciones de

absorción fuertes, el'ctrico&dipolo permitidos se producen entre los orbitales

A deslocaliados de las mol'culas del estado fundamental sin#lete - -:# al

estado excitado sin#lete - -6( 7ver recuadro de la Ci#. -8.

Ci#. -

Ci#. -

Espectros de absorción, estructuras moleculares, y el es+uema de nivel deener#ía de las principales especies de carotenoide +ue se encuentra en el

tejido humano, incluyendo 5&caroteno, eaxantina, licopeno, luteína, y

toueno. *ol'culas carotenoides, +ue cuentan con una paridad par inusual

...

En todos los casos, la excitación óptica dentro de la banda de absorción -

-:# I - -6( conduce a solamente muy d'bil transitions luminiscencia 7no

mostrado8. )a eciencia cu"ntica extremadamente bajo de la luminiscencia

es causada por la existencia de un se#undo estado de sin#lete excitado, un

estado -:# ;, +ue se encuentra por debajo del estado - -6( 7ver Ci#. -recuadro8. Despu's de la excitación del estado - -6(, la mol'cula de



carotenoide relaja muy r"pidamente, >ithin-J ;<< a ;0< fs, a trav's de

transiciones no radiantes, a este estado inferior ; -:# partir de la cual la

emisión electrónica al estado fundamental es la paridad&prohibido

7discontinua, +ue apunta hacia abajo superior echa en el recuadro de la

Ci#. -8. El bajo -6( - I - -:# eciencia resultante de luminiscencia 7-<&0 a

-<&G8, y la ausencia de ; -:# I - -:# de uorescencia de las mol'culas, lepermite a uno para detectar la respuesta RR! de las vibraciones

moleculares 7+ue se muestra como sólido, abajo echa apuntando en la

inserción de la #. -8, sin potencialmente enmascarar las seKales de

uorescencia. Especícamente, RR! detecta las vibraciones de estiramiento

de la columna vertebral polieno, así como la #rupos.- lado de metilo

3ara soluciones de tetrahidrofurano de los carotenoides de la Ci#. -

obtenemos los espectros RR! se muestra en la Ci#. ;. El beta&caroteno,

eaxantina, licopeno, luteína y todos tienen seKales fuertes y claramente

resueltas Raman superpuestas sobre un fondo d'bil uorescencia, con tres

prominentes líneas Raman !toLes appearin#- en -0;0 79 BB 9

estiramiento8, --0M 79 BB 9 estiramiento8 y -<<J cm&- 79&9? mecedora

movimientos8. En la mol'cula de toueno de cadena m"s corta, sólo

aparece el tramo 9 BB 9, y se desplaa de manera si#nicativa a

frecuencias m"s altas 7por G< cm&-8.

Ci#. ;

Ci#. ;

Resonancia Raman espectros de 5&caroteno, eaxantina, licopeno, luteína, y

soluciones toueno, mostrando los tres principales Nhuella di#italN picos

espectrales Raman de carotenoides procedentes de balanceo movimientos

de los componentes de metilo ...

Dispersión Raman no re+uiere de excitación resonante, en principio, y es por

lo tanto adecuado para detectar simult"neamente las transiciones

vibratorias de todos los compuestos activos Raman en una muestra dada.!in embar#o, compensación de resonancia dispersión Raman es un efecto

óptico muy d'bil, lo +ue re+uiere una intensa excitación l"ser, tiempos de

ad+uisición de seKales de lar#o, y muy sensible, enfriado crio#'nicamente

detectores. :dem"s, en los sistemas bioló#icos, los espectros tienden a ser

muy complejos debido a la diversidad de compuestos presentes. Este

escenario cambia dr"sticamente si las bandas de absorción compuestos

presentan debido a transiciones electrónicas dipolares de las mol'culas,

particularmente si 'stos se encuentran en el ran#o de lon#itud de onda

visible. 9uando se ilumina con lu monocrom"tica superpuestas una de

estas bandas de absorción, la lu dispersada Raman exhibir" una mejora

sustancial de resonancia. En el caso de los carotenoides, GJJ&nm de lu

l"ser de ar#ón proporciona una mejora extraordinariamente alto de



resonancia de la si#nals- Raman del orden de -<0. 1o hay otras mol'culas

bioló#icas +ue se encuentran en concentraciones si#nicativas en los tejidos

humanos exhibir mejora resonante similar en esta lon#itud de onda de

excitación, por lo +ue en Vivo espectros RR! carotenoides son notablemente

libre de confundir respuestas Raman.

)a dispersión Raman es una espectroscopia lineal, lo +ue si#nica +ue la

intensidad de dispersión Raman es escalas linealmente con la intensidad de

la lu incidente ) siempre y cuando el compuesto de dispersión puede ser

considerado como ópticamente del#ada. :dem"s, en intensidad de la lu

incidente ja ), y siempre +ue los dispersores pueden ser considerados

como ópticamente del#ada, la respuesta Raman escala con la densidad de

población de los dispersores 1 7E8 de una forma lineal de acuerdo H%

s B 1 7Ei8 O PR O ).

:+uí, PR es una constante cuya ma#nitud depende de la #eometría de

excitación y colección. En los medios ópticamente #ruesas, como en el

tejido #eom'tricamente del#ada pero ópticamente denso, se puede producir

una desviación de la respuesta Raman lineal de s frente a la concentración

1, de ejemplo supuesto&para, debido a la auto&absorción de la línea de

!toLes Raman por la fuerte absorción electrónica . En #eneral, esto puede

tenerse en cuenta, sin embar#o, al menos en un intervalo de concentración

limitado, calibrando la respuesta Raman con fantasmas de tejidos

adecuados.

Espectroscopia RR! tiene una ventaja adicional sobre espectroscopia Raman

ordinaria en la posibilidad de inuir en la respuesta Raman por elección

juiciosa de la lon#itud de onda de excitación. Esto le permite a uno para

mejorar selectivamente la respuesta Raman de una especie de carotenoides

sobre otra en una mecla de compuestos. 3or ejemplo, excitando una

mecla de toueno y luteína a G0< nm solamente resultaría en unarespuesta RR! de luteína 7ver Ci#. -8, lo +ue nos permite cuanticar

selectivamente luteína en esta mecla.

Varias especies de carotenoides est"n usualmente presentes en los tejidos

bioló#icos complejos. 3ara la cuanticación de la respuesta compuesta RR!

lo +ue es importante para dar cuenta de las respuestas individuales de los

RR! especies excitadas. 3uesto +ue la respuesta RR!, en #eneral, si#ue la

forma de la línea de absorción, la respuesta individual RR! depende de la

extensión de la superposición del l"ser de excitación con la absorción. En elcaso de secciones i#uales Raman eca de dispersión, realiado cuando



emocionante todos los carotenoides en sus respectivos m"ximos de

absorción, las respuestas RR! deben aKadir. 3ara vericar esta hipótesis, se

midió espectros RR! de soluciones de 5&caroteno, licopeno, y una mecla de

ambos. )os resultados se muestran en la Ci#. de soluciones con

concentraciones de carotenoides +ue son mayores +ue las concentraciones

sioló#icas típicas encontradas en el tejido humano, y vemos +ue larespuesta RR! para el carotenoide es aproximadamente i#ual a la suma de

las respuestas de las concentraciones individuales.

Ci#.

Ci#.

Espectros de absorción y las respuestas de resonancia Raman para las

soluciones de 5&carotenos, licopenos, y una mecla de ambos. )a respuestaRaman para la mecla corresponde a la suma de las respuestas de las

concentraciones individuales, medidos con GJJ nm de excitación. ...

)a especicidad de RR! para la detección de carotenoides se ilustra en la

Ci#. G, donde la respuesta del RRV en el 9 BB 9 ran#o de frecuencia de

estiramiento se muestra para soluciones frescas de 5&caroteno, junto con

los compuestos noncarotenoid "cido ascórbico y Q&tocoferol. *ientras +ue la

respuesta Raman de la solución de carotenoides aumenta al aumentar la

concentración, no se observa respuesta Raman para los antioxidantes

noncarotenoid.

Ci#. G

Ci#. G

Respuestas RR! en la ona espectral de la 9 BB 9 frecuencia de tensión,

medida por diversos antioxidantes como una función de la concentración en

etanol bajo excitación y detección id'ntica condiciones& , 5&carotenoF S, ...

3ara evaluar la respuesta relativa RR! para varios carotenoides +ue seencuentran en el tejido humano tales como la piel, preparamos soluciones

etanólicas de 5&caroteno, luteína, eaxantina y licopeno, y se midió su

respuesta en un intervalo de concentración de #ran tamaKo. )os resultados

se muestran en la Ci#. 0 y revelan una respuesta lineal en un ran#o de

concentración muy #rande +ue supera las concentraciones de carotenoides

+ue se encuentran en la piel humana. 3e+ueKas variaciones en las laderas

de las soluciones de carotenoides en la muestra se encuentran en muy buen

acuerdo con sus respectivas eciencias de excitación.

Ci#. 0



Ci#. 0

RR! respuesta de varias soluciones de carotenoides bajo excitación GJJ nm,

+ue se muestran como una función de concentraciones crecientes llena de

tri"n#ulo, 5&carotenoF tri"n#ulo abierto, eaxantinaF abrir cuadrado, luteínaF

y el círculo abierto, el licopeno. )a respuesta ...

r4

Detección de Raman de *acular 3i#mentos

.- *acular 3i#mentos y m'todos de medición existentes

!e ha planteado la hipótesis de +ue el macular pi#mentos carotenoides

luteína y eaxanthin-M,;< podrían desempeKar un papel en el tratamiento y

prevención de de#eneration;-,;; macular relacionada con la edad 7:*D8.En los Estados (nidos, esto causa principal de ce#uera afecta a <T de

los ancianos mayores de /< aKos de edad :n"lisis de los ojos relacionada

con la edad Disease !tudy 7:RED!8 datos reportados en las reuniones

clínicos recientes han conrmado los halla#os epidemioló#icos iniciales de

la enfermedad de 9ontrol de la caja de los ojos study;,;G +ue el consumo

elevado de frutas y verduras ricas en luteína y eaxantina se asocian con un

ries#o relativo si#nicativamente menor de :*D. )os resultados fueron lo

sucientemente convincentes +ue un estudio :RED! est" previsto +ue

incorporar" la luteína y $ o suplementación eaxantina en un placebo

aleatoriado a #ran escala controlado ensayo clínico prospectivo. :n"lisisUuímicamente cromato#rafía lí+uida de alta resolución 7?3)98W de los ojos

de cad"ver humano con y sin antecedentes conocidos de :*D asimismo

demuestra una correlación entre los niveles bajos de la luteína y la

eaxantina y risL;0 de :*D, y reciente fotometría de parpadeo y la

resonancia Raman estudios clínicos alcanados el mismo conclusion.=,;=

)os estudios espectroscópicos de secciones de tejido de m"culas primate

las centrales de 0 a = mm de la retina, ver #. = 7a8W indican +ue hay muy

altas concentraciones de pi#mentos carotenoides, +ue se muestran como"rea sombreada en la Ci#. = 7b8, en la capa de bras de ?enle la fóvea y

cantidades m"s pe+ueKas en la capa plexiforme interna, ;/ v'ase la Ci#. =

7b8W. )os mecanismos por los +ue estos dos pi#mentos maculares, derivados

exclusivamente de fuentes diet'ticas como las verduras de hoja verde y

frutas y verduras de color naranja y amarillo, podrían prote#er contra la

D*:E todavía no est" claro. Ellos son conocidos por ser excelentes

antioxidantes radicales libres de barrido en un tejido en alto ries#o de daKo

oxidativo debido a los altos niveles de exposición a la lu, y abundante

lipids.;-,;;,;J,;M altamente insaturado :dem"s, ya +ue estas mol'culas

absorben en el ran#o espectral aul&verde, act2an como ltros +ue pueden



atenuar el daKo foto+uímico y $ o de#radación de la ima#en provocada por

la lu visible de onda corta de lle#ar a la retina.<

Ci#. =

Ci#. =

7:8 foto#rafía del fondo de ojo de la retina humana sana, +ue muestra la

cabea del nervio óptico 7punto brillante a la i+uierda8 y la m"cula "rea

sombreada oscura esboar pi#mento macular 7*38 distribucionesW, y 7b8

Representación es+uem"tica de las capas de la retina +ue participan en la

absorción de lu,. ..

Existe un considerable inter's para medir los niveles de *3 no invasiva en la

población anciana de determine;= si los bajos niveles de *3 se asocian con

un mayor ries#o de D*:E. :ctualmente, el m'todo no invasivo m"s

utiliado para medir los niveles de *3 humanos es una prueba subjetiva

fotometría psicofísica parpadeo heterochromatic la participación de la

intensidad del color a jue#o de un ha de lu diri#ido a la fóvea y otro

destinado a la area.- perifoveal !in embar#o, este m'todo es bastante

tiempo consumiendo y re+uiere una alerta, sujeto cooperativo con una

buena a#udea visual, y pueden exhibir una alta variabilidad intrasujeto

cuando las densidades de pi#mento macular son bajos o si la patolo#ía

macular si#nicativo se present.; 3or lo tanto, la utilidad de este m'todo

para evaluar los niveles de pi#mento macular en los ancianos población con

mayor ries#o de :*D es muy limitada. !in embar#o, los investi#adores han

utiliado la fotometría de parpadeo para investi#ar cuestiones importantes,

como la variación de la densidad del pi#mento macular con la edad y la

dieta. En un estudio reciente fotometría de parpadeo, por ejemplo, la

densidad del pi#mento se encontró a aumentar li#eramente con la edad, de

aKos, mientras +ue otros estudios encontraron el trend.G opuesta

(n n2mero de t'cnicas objetivas para la medición de la *3 en la retina

humana se han explorado recientemente como alternativas a las pruebaspsicofísicas subjetivos. )os principios subyacentes de la óptica de estas

t'cnicas se basan ya sea en fundus reexión o uorescencia del fondo de

ojo espectroscopia 7autouorescencia8. En reectometría fundus tradicional,

+ue utilia una fuente de lu con un amplio continuo espectral, espectros de

reectancia de la retina blan+ueada se miden por separado para fóvea y

perifovea. )a absorción de doble camino de la *3 se extrae de la relación de

los dos espectros mediante la reproducción de su forma espectral en un

procedimiento de ajuste utiliando multiparam'trico de absorción adecuado

y dispersando los perles de las diversas capas del tejido del fundus

atravesados por la fuente li#ht.0&J (na de las variantes de im"#enes de

fondo de ojo reectometría utilia un reectómetro de im"#enes de fondo

de ojo con sede en HV con secuencial, estrecho ancho de banda de



excitación de lu en el ran#o de lon#itud de onda visible y fondo di#italiado

ima#es.M %tra variante poderosa utilia un oftalmoscopio l"ser de

exploración, G<,G- empleando trama de exploración de la fondo de ojo con

lon#itudes de onda de excitación l"ser discretos para producir información

muy detallada sobre el distributionG;&G= espacial de *3 7y fotopi#mentos8.

En espectroscopia de autouorescencia, lipofuscina en el epiteliopi#mentario de la retina se excita con lu dentro y fuera de la #ama de

lon#itudes de onda de la absorción del pi#mento macular. )a medición de

los niveles de uorescencia lipofuscina para fóvea y perifovea, una

estimación de la absorción de un solo paso de *3 puede obtained.G/,GJ En

un reciente estudio, la comparación de reectometría, oftalmoscopia l"ser

de barrido 7!)%8 y el parpadeo fotometría en la medición de la luteína

macular captación, !)% se encontró +ue era superior a la reectancia

espectral del fondo de ojo mientras +ue las mediciones psicofísicas

produjeron variando ampliamente results.J,GM

.; %cular Raman *ediciones

?emos investi#ado RR! como una novela :pproach; para la medición de los

niveles de *3 en vivir eyes.0<,0- la t'cnica es objetivo, así como no

invasiva, parece ser r"pido y cuantitativo, y su especicidad para

carotenoides si#nica +ue podría ser utiliado para los pacientes con una

variedad de patolo#ías oculares.

n vivo espectroscopia RR! en el ojo se aprovecha de varias propiedades

anatómicas favorables de las estructuras de tejido se encuentran en las vías

de dispersión de lu. En primer lu#ar, el principal sitio de deposición de

carotenoides macular en la capa de bras ?enle es del orden de tan sólo

-<< m de thicLness.;/ Esto proporciona una distribución cromóforo se

asemeja muy de cerca una película ópticamente del#ada +ue no tiene auto&

absorción si#nicativa de la lu iluminada o dispersas . En se#undo lu#ar,

los medios oculares 7córnea, cristalino, humor vítreo8 son por lo #eneral dela claridad suciente para no atenuar la seKal, y deben re+uerir factores de

corrección adecuadas sólo en casos de patolo#ía sustancial como cataratas

visualmente si#nicativas. En tercer lu#ar, ya +ue los carotenoides

maculares est"n situados en sentido anterior en la vía óptica a trav's de la

retina ver Ci#. = 7b8W, la lu +ue ilumina y la lu retrodispersada 1unca tuve

nin#2n pi#mentos altamente absorbentes tales como la rodopsina

fotorreceptores y R3E de melanina, mientras +ue la lu no absorbida por los

carotenoides maculares y el Delantero y lu dispersada lado ser" absorbido

ecientemente por 'stos pi#ments. En contraste, la emisión de lipofuscina

utiliado en autouorescencia 7:C8 basados en mediciones de *3 debeatravesar la capa de fotorreceptores ver Ci#. = 7b8W.



1uestros Nprueba de principioN estudios iniciales de la espectroscopia

Raman de resonancia carotenoide ocular emplearon una laboratory#rade de

alta resolución espectrómetro Raman y retinas de cad"ver humano&planas

montada, ojeras humanos, y al#unos ojos de rana enteros. ?emos sidocapaces de #rabar característica espectros RR! de carotenoides a partir de

estos tejidos con una resolución espacial de aproximadamente -<< micras, y

fuimos capaces de conrmar la linealidad de la respuesta mediante la

extracción y el an"lisis de los carotenoides de tejido por ?3)9 despu's de la

naliación de la measurements.; Raman 3ara experimentos in vivo y el uso

clínico, hemos desarrollado un nuevo instrumento con una menor resolución

espectral pero altamente rendimiento mejorado lu. )a versión m"s reciente

de instrumentos, +ue se muestra es+uem"ticamente en la Ci#. / 7a8,

consiste en un l"ser de ar#ón refri#erado por aire de baja potencia, +ue

proyecta un - mm de di"metro, -,< mX, punto GJJ nm en la re#ión fovealdurante <,; s a trav's de una lu retrodispersada pupil.G

farmacoló#icamente dilatada en -J< #rados es colimada con una lente, la

lu dispersada en la lon#itud de onda de excitación de l"ser es rechaada

por un ltro de paso de banda de alta eciencia, y el resto se enruta a

trav's de la bra óptica a una combinación de c"mara espectró#rafo $ 99D

Raman. El instrumento est" interconectado a un ordenador personal

e+uipado con soft>are de diseKo personaliado +ue puede restar la

uorescencia de fondo y cuanticar la intensidad de los picos Raman. !e

pidió a los sujetos humanos +ue viven a jarse en un objetivo adecuado

para ase#urar la auto&alineación, mientras +ue en experimentos con monos,se utilió un sistema de vi#ilancia de vídeo adicional y ha de encuadre

l"ser rojo para conrmar la orientación foveal. El instrumento puede ser

calibrado contra soluciones de luteína y eaxantina en cubetas de cuaro de

- mm ópticamente del#ados colocados en el punto focal de una lente cuyo

poder duplicar la óptica de refracción del ojo humano. Respuesta del

detector fue lineal hasta densidades ópticas de casi <,J, mucho m"s all" de

los niveles de carotenoides +ue normalmente se encuentran en la m"cula

humana. (sando viven ojos mono, linealidad de la respuesta en los niveles

de iluminación l"ser Nse#uraN de los ojos de nuevo se pudo establecer

relación con el an"lisis de ?3)9, como podemos ver en la #ura. J, en la

+ue traó la respuesta RR! de seis retinas mono frente datos ?3)9

derivada

Ci#. /

Ci#. /

7:8 Es+uema de macular detector de resonancia Raman pi#mento diseKado

para los estudios clínicos en humanos. )a lu procedente de un l"ser de

ar#ón se enruta a trav's de bra óptica en una cabea de la sonda óptica7se indica por la línea de traos8 y desde allí en el ojo de un sujeto ...



Ci#. J

Ci#. J

)a correlación de seKales RR! obtenidos para el 9 BB 9 doble vibración

bono a -0;0 cm&- con el contenido de carotenoides de retinas seis mono

se#2n lo determinado por ?3)9. (n ajuste lineal a los resultados de los

datos en un coeciente de correlación de <,=J.

Espectros Hípica RR!, medida desde la m"cula de un voluntario humano

sano, medida con pupila dilatada, se muestran en la Ci#. / 7c8. El panel de la

i+uierda de esta #ura muestra un espectro típico obtenido a partir de una

sola medición y revela claramente seKales Raman carotenoides

superpuestas en una d'bil y espectralmente amplio uorescencia de fondo.

El fondo es causada en parte por la debilidad de la uorescencia intrínseca

de carotenoides, y en parte por la lon#itud de onda corta cola emisión de

uoróforos lipofuscina depositadas en la capa del epitelio pi#mentario de laretina. )a relación entre las intensidades de la carotenoide 9 BB 9 pico

Raman y la uorescencia de fondo es lo sucientemente alta 7 <,;08 +ue

es f"cilmente posible cuanticar la amplitud de la 9 BB 9 pico despu's de

sustracción de fondo di#ital panel de la derecha de la #ura . / 7c8W.

Espectros de carotenoides RR! obtenida de la m"cula humano vivo eran

indistin#uibles de los espectros procedentes de soluciones espectros RR! de

luteína pura o solutions.= eaxantina

. 9onsideraciones de se#uridad l"ser

3ara cumplir con las normas de se#uridad :1!, los niveles de exposición

oculares utiliados en nuestro instrumento Raman tienen +ue permanecer

por debajo de ciertos niveles de umbral especicados. De acuerdo con el

2ltimo n2mero, 0; :1! Y-=.-&;<<<, los niveles de exposición ocular debe

limitarse a prote#er el ojo, tanto de la lesión de la retina foto+uímicamente

y t'rmicamente inducida en las condiciones de medición 7lu visible cerca

de <,0 micras, ojos inmoviliados, tiempo de exposición de <,;0 s8. El límitefoto+uímico para la lesión de la retina 7!ec. J..- de directrices :1!8 se

enumera como 96 ;,/ Z $ cm;, donde 96 es un factor de corrección de

lon#itud de onda, y los resultados en -0,0 Z $ cm;, utiliando 96 B 0,/0 para

GJJ nm. El límite t'rmico para la lesión de la retina 7!ec. J..;.8, V"lido para

un tiempo de exposición <,</ [t [<,/ s, deben calcularse desde el punto

l"ser presentes en la córnea, y aparece como -.J 7Q $ -.08 t< <,/0 mZ $ cm;.

:+uí, Q es el "n#ulo de la fuente de l"ser en la ubicación del espectador,

medido en milirradianes. El uso de t B <,</ s y Q B 0J,J O -<& rad, se

obtiene una densidad de ener#ía de M,= mZ $ cm; a la córnea para el límite

de exposición t'rmica de la retina.



En una medición&exposición 2nica típica con nuestro instrumento 7<,;0 s

exposición ocular con la lu de - mX a GJJ nm8, una ener#ía l"ser total de

<,;0 mZ se proyecta en un lu#ar de J mm de di"metro en la córnea, y un -

punto &mm&di"metro en la retina. Esto corresponde a un nivel de exposición

de la retina de ; mZ $ cm;, +ue es GJ< veces menor +ue el límite

foto+uímico -0.0&Z $ cm;. 3ara la exposición ocular utiliado, se calcula unnivel de <,0 mZ $ cm;, considerando +ue la ener#ía de la lu de <,;0 mZ se

distribuye sobre un di"metro de tamaKo de punto de J mm en la córneaF 3or

lo tanto, este nivel de exposición es de -M veces por debajo del límite

t'rmico de M,= mZ $ cm; para la lesión de la retina.

.G Resultados clínicos

!e midió los niveles de pi#mento macular carotenoide de cientos de seres

humanos en el 9entro %ftalmoló#ico *oran de la (niversidad de (tah

utiliando espectroscopia de RR!. )a mayoría de los pacientes pueden

realiar f"cilmente la prueba con intrasesión aceptable y intersesión

repetibilidad de \ -<T, siempre y cuando han conservado jación central

7típicamente una a#udea visual de ;<$J< o mejor8. )os sujetos observaron

una estela central desde la iluminación l"ser despu's de cada medición +ue

se sentían era similar a la de un ash de la c"mara. Esta ima#en residual

#eneralmente se desvaneció en un minuto o dos. )os sujetos con

opacidades de medios densos, como las cataratas visualmente si#nicativaso con mala dilatación pupilar de [= mm fueron #eneralmente excluidos de

las mediciones en nuestros estudios clínicos por+ue encontramos sus

mediciones sean articialmente bajos.

9uando medimos una #ran población de sujetos normales, nin#uno de los

cuales estaban consumiendo suplementos +ue contienen cantidades

sustanciales de luteína o eaxantina, encontramos un sorprendente

descenso del promedio de los niveles de carotenoides maculares con la

edad, veces un fenómeno observado con otros *3 medicióntechni+ues.-;, 0 3arte de este descenso se explica por NamarillentaN del

cristalino con la edad, lo +ue atenuaría parte de la lu +ue ilumina y

retrodispersados, pero tambi'n encontró consistentemente bajos niveles *3

incluso en pacientes +ue habían tenido previamente una ciru#ía de

cataratas con implante de ópticamente transparente lenses intraocular

prot'sica 7pseudofa+uia8. Hambi'n, hemos observado +ue los pacientes con

cataratas unilaterales despu's de un traumatismo o la reparación del

desprendimiento de retina suelen tener RR! muy similares niveles de

carotenoides en el normal y en el ojo pseudof"+uico. 3or lo tanto, lle#amos

a la conclusión de +ue hay una disminución de los carotenoides maculares+ue alcana un estado de e+uilibrio baja justo en el momento en +ue la



incidencia y prevalencia de :*D comiena a aumentar de manera

espectacular. )a conclusión se ve conrmado por el an"lisis ?3)9 reciente

*3 en GM ojos extirpados donantes, donde encontramos una disminución de

los niveles de *3 con la edad 7datos no publicados8. Estos resultados

tambi'n ponen de relieve la importancia de ase#urar +ue las poblaciones

est'n correctamente emparejados por edad utiliando espectroscopia deRR! en estudios de casos y controles.

(n ejemplo para RR! mediciones clínicas de un sub#rupo relativamente

joven 7 ojos8, de edades comprendidas del ;- al ;M anos se muestra en la

#ura. M. !i bien las reducciones *3 dependientes de la edad a2n no se

pueden ver en este #rupo de edad, una observación sorprendente es el

hecho de +ue los niveles medidos *3&RR! varían dr"sticamente entre los

individuos 7el cambio -< veces8. Dado +ue las propiedades de transmisión

oculares en este #rupo de edad se puede suponer +ue ser muy similares, las

variaciones se pueden atribuir a diferentes niveles fuertemente *3. Esta

conclusión se ve apoyada por el hecho de +ue vemos la misma variación

dr"stica entre los niveles de *3 individuales con fotometría de parpadeo,

una t'cnica +ue se correlaciona con Raman measurements.-;,0G )os

sujetos con niveles extremadamente bajos de carotenoides pueden estar en

mayor ries#o de desarrollar de#eneración macular m"s tarde en la vida.

Ci#. M

Ci#. M

*ediciones RR! *3 de ojos normales para un joven #rupo de sujetos con

edades ;-&;M de aKos. Hen#a en cuenta el #ran tamaKo 7 -< veces8 la

variación de los niveles de RR! entre los individuos. Dado +ue las

propiedades de transmisión oculares en este #rupo de edad puede

suponerse +ue ...

!e compararon varias poblaciones diferentes con patolo#ía macular

si#nicativo frente a los controles de la misma edad. 3acientes con D*:E+ue no consumen re#ularmente suplementos de luteína o eaxantina,

tuvieron mediciones Raman carotenoides maculares ;T m"s bajos +ue los

de la misma edad controls.= 9uriosamente, los pacientes con D*:E +ue

habían estado consumiendo suplementos de luteína en dosis altas 7]G m# $

día8 durante al menos meses despu's de su dia#nóstico de :*D tenía

niveles de carotenoides maculares +ue en promedio serían considerados

normales para su edad. Estos resultados son un #ran apoyo de la hipótesis

de +ue los niveles de carotenoides maculares bajos pueden ser un factor de

ries#o para :*D y +ue los niveles de pi#mento macular se pueden modicar

a trav's de suplementos, incluso en una población de ancianos con

patolo#ía macular si#nicativo.



Ci#. -<

Ci#. -<

r4

Ci#. --

Ci#. --

-; 7a8.



Ci#. -;

Ci#. -;

Ci#. -

Ci#. -

Ci#. -G

Ci#. -G

...

Ci#. -0

Ci#. -0

...

9omo se ve en la Ci#.

Ci#. -=

Ci#. -=

...



Ci#. -/

Ci#. -/

Ci#. -J

Ci#. -J

r4

0. 9onclusiones

detección de resonancia raman de antioxidantes carotenoides en tejido vivo humano

Documents