deteccion de antigeno de giardia duodenalis en eluido de
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DETECCION DE ANTIGENO DE Giardia duodenalis EN ELUIDO DE HECES
MEDIANTE ELISA INDIRECTO UTILIZANDO ANTICUERPOS
POLICLONALES
DIANA DEL PILAR SERRANO MARTINEZ
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BACTERIOLOGIA
BOGOTA, D.C.
JUNIO DE 2001
DETECCION DE ANTIGENO DE Giardia duodenalis EN ELUIDO DE HECES
MEDIANTE ELISA INDIRECTO UTILIZANDO ANTICUERPOS
POLICLONALES
DIANA DEL PILAR SERRANO MARTINEZ
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
Para optar el título de
BACTERIOLOGA
Directora Co-Director SOFIA DUQUE BELTRAN RUBEN SANTIAGO NICHOLLS O.
Biólogo, M.Sc. Parasitología Médica Médico cirujano, M,Sc. Parasitología Medica
Asesora Externa Asesora Interna ADRIANA AREVALO JAMAICA CARMEN INES MORA Bacterióloga, M.Sc. Microbiología Parasitóloga Universidad Javeriana
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BACTERIOLOGIA
BOGOTA, D.C.
JUNIO DE 2001
“La Pontificia Universidad Javeriana no se hace responsable por los conceptos
emitidos por sus alumnos en sus tesis de grado”
DETECCION DE ANTIGENO DE Giardia duodenalis EN ELUIDO DE HECES
MEDIANTE ELISA INDIRECTO UTILIZANDO ANTICUERPOS
POLICLONALES
DIANA DEL PILAR SERRANO MARTINEZ
APROBADO
________________________________ ________________________________ Director Co-Director
________________________________ ________________________________ Asesora Externa Asesora Interna
________________________________ ________________________________ Jurado Jurado
A mis padres
AGRADECIMIENTOS
Quiero expresar mis más sinceros agradecimientos
A la Dra Sofía Duque Beltrán, Biológo, M.Sc. Parasitología Médica, al Dr. Rubén
Santiago Nicholls Orejuela, M.D., M.Sc. Parasitología Médica, por su invaluable
dirección, dedicación, apoyo, interés y consejos sin los cuales no hubiese sido posible
la realización de esta investigación.
A la Dra Adriana Arévalo Jamaica, Bacterióloga, M.Sc. Microbiología, por su
asesoría, consejos y ayuda para la ejecución de este trabajo.
Al Instituto Nacional de Salud (INS), Laboratorio de Parasitología, por su
cooperación y capacitación científico-técnica que permitió el desarrollo del presente
estudio.
Al Dr Rafael Guerrero Lozano, M.D, Pediatra, M.Sc. Gastroenterología Pediátrica,
por su invaluable colaboración en el diagnóstico clínico de los pacientes y la
consecución de muestras de pacientes con giardiosis.
A la Dra Carmén Ines Mora, Parasitóloga de la Universidad Javeriana, por su asesoría
y colaboración.
A todas aquellas personas que de una u otra forma hicieron posible la realización de
este trabajo.
TABLA DE CONTENIDO
Pág
LISTA DE FIGURAS x
LISTA DE TABLAS xi
RESUMEN xii
1. OBJETIVOS 1
2. INTRODUCCION 2
3. JUSTIFICACION 5
4. MARCO TEORICO 6
4.1. GIARDIOSIS 6
4.2. DISTRIBUCION 6
4.3. TAXONOMIA 6
4.4. CICLO DE VIDA 8
4.5. AGENTE ETIOLOGICO 9
4.5.1. TROFOZOITO 9
4.5.2. QUISTE 10
4.6. TRANSMISION 10
4.7. PATOGENESIS 14
4.8. DIAGNOSTICO 15
4.8.1. DIAGNOSTICO CLINICO 15
4.8.2. DIAGNOSTICO IMAGENOLOGICO 16
4.8.3. DIAGNOSTICO PARASITOLOGICO 17
4.8.3.1. IDENTIFICACION DE Giardia 17
4.8.3.2. DETECCION DE ANTIGENO DE Giardia 18
4.9. DETECCION DE ANTIGENO DE Giardia 19
4.9.1. CONTRAINMUNOELECTROFORESIS (CIE) 19
4.9.2. ENSAYO INMUNOENZIMATICO (ELISA) 19
4.9.3. dot-ELISA 20
5. MATERIALES Y METODOS 21
5.1. TIPO DE ESTUDIO 21
5.2. MUESTRAS 21
5.2.1. ELUIDO DE MATERIA FECAL HUMANA 21
(COPROANTIGENO)
5.2.2. DIAGNOSTICO PARASITOLOGICO 22
5.3. SUERO HIPERINMUNE ANTI-Giardia EN CONEJOS 24
ANTI-Giardia EN CONEJOS
5.4. DETECCION DE ANTIGENO DE Giardia EN ELUIDO 25
DE MATERIA FECAL HUMANA MEDIANTE ELISA
INDIRECTO
5.4.1. ESTANDARIZACION 25
5.4.1.1. DETERMINACION DE LA CONCENTRACION OPTIMADE 25
ANTICUERPO POLICLONAL ANTI-Giardia
5.4.1.2. DETERMINACION OPTIMA DE LA DILUCION DE 26
CONJUGADO
5.4.1.3. DETERMINACION DE LA DILUCIÓN DEL ELUIDO DE 26
MATERIA FECAL
5.4.2. PROCEDIMIENTO PARA LA DETECCION DE ANTIGENO 27
DE Giardia EN ELUIDO DE MATERIA FECAL
HUMANA MEDIANTE ELISA INDIRECTO
5.4.3. VALIDACION 28
5.4.3.1. ANALISIS ESTADISTICO 28
5.4.3.1.1.DETERMINACION DEL PUNTO DE CORTE 29
5.4.3.1.2.DETERMINACION DE LOS PARAMETROS DEL ELISA 29
6. RESULTADOS 31
6.1. DETECCION DE ANTIGENO DE Giardia EN ELUIDO DE 31
MATERIA FECAL HUMANA MEDIANTE ELISA INDIRECTO
6.1.1. ESTANDARIZACION 32
6.1.1.1. CONCENTRACION OPTIMA DE ANTICUERPO 32
POLICLONAL ANTI-Giardia
6.1.1.2. DILUCION OPTIMA DE CONJUGADO 34
POLICLONAL ANTI-Giardia
6.1.1.3. DILUCION OPTIMA DE ELUIDO DE 34
MATERIA FECAL
6.1.2. VALIDACION DE LA DETECCION DE ANTIGENO DE Giardia 37
EN ELUIDO DE MATERIA FECAL HUMANA MEDIANTE
ELISA INDIRECTO
6.1.2.1. DETERMINACION DEL PUNTO DE CORTE 37
6.1.2.2. DETERMINACION DE LOS PARAMETROS DEL ELISA 39
7. DISCUSION 42
8. CONCLUSIONES 48
9. RECOMENDACIONES 49
APENDICES 50
BIBLIOGRAFIA 52
LISTA FIGURAS
Pág
Figura 1. Trofozoíto de Giardia duodenalis 12
Figura 2. Quiste de Giardiaduodenalis 13
Figura 3. Estandarización. Concentración óptima de anticuerpo policlonal 33
Figura 4. Estandarización. Dilución óptima de conjugado 35
Figura 5. Estandarización. Dilución óptima de eluidos de materia fecal 36
Figura 6. Inmunodetección de antígeno de Giardia lamblia por ELISA 38
en 331 muestras de eluído de materia fecal.
LISTA DE TABLAS
Pág
Tabla 1. Características morfológicas de los estadíos de Giardia duodenalis 11
Tabla 2. ELISA. Validación 41
RESUMEN
La giardiosis es una enfermedad intestinal causada por el protozoario, flagelado,
Giardia. La transmisión se efectúa por la ingestión de quistes del parásito
directamente de persona a persona, por contaminación oral- fecal, a través de agua y
alimentos contaminados. La Giardia tiene un ciclo de vida simple, que consiste de un
quiste infectante y un trofozoíto vegetativo. El diagnóstico convencional se realiza
por el examen microscópico de heces para determinar la presencia de quistes y/o
trofozoítos, éstos últimos más frecuentes en heces diarréicas. La utilización de
métodos alternativos de diagnóstico, tales como la observación de líquido duodenal o
la biopsia de mucosa del intestino delgado, aumentan la sensibilidad, pero son
métodos invasivos. Los problemas antes mencionados han estimulado el desarrollo de
inmunoensayos que permiten la detección de antígenos del parásito en las heces. La
presente investigación se propuso estandarizar y evaluar un ELISA sandwich
indirecto utilizando anticuerpos policlonales, anti-quiste y anti-trofozoíto de cepas
colombianas de Giardia desarrollados en conejo para la detección de antígeno del
parásito en eluído de materia fecal humana. El Laboratorio de Parasitología del
Instituto Nacional de Salud (LP-INS) suministró 331 muestras de eluído de materia
fecal humana, a las cuales se les había realizado diagnóstico parasitológico. A 134 de
1
éstas muestras se les observó quistes y/o trofozoítos de Giardia y 197 sin presencia
de Giardia. La concentración óptima de anticuerpos policlonales anti-quiste y anti-
trofozoíto de Giardia suministrados por el LP-INS, mezclados en proporción 1Q: 2T
fue de 0.25 µg/ml y la dilución óptima de anti- inmunoglobulina G de conejo
(conjugado comercial) fue de 1:10.000. El valor de absorbancia (punto de corte) que
diferenció una muestra negativa de una positiva fue de 0.303. Los parámetros de la
prueba del ELISA indirecto estandarizado y evaluado en el estudio para la detección
de antígeno de Giardia en eluído de materia fecal fueron: sensibilidad: 93%,
especificidad: 99%, valor predictivo positivo: 98% y valor predictivo negativo: 95%.
El ELISA del estudio servirá para el diagnóstico parasitológico de pacientes con
giardiosis.
2
DETECCIÓN DE ANTÍGENO DE Giardia intestinalis EN
ELUÍDO DE HECES MEDIANTE ELISA INDIRECTO
UTILIZANDO ANTICUERPOS POLICLONALES
Diana Del P. Serrano M., Sofía Duque Beltrán1, Rubén S. Nicholls Orejuela1,
Adriana Arévalo Jamaica1, Rafael Guerrero Lozano2, Sonia Montenegro-
James3,4, Mark James4, Carmen Inés Mora5.
1. LABORATORIO DE PARASITOLOGÍA, INSTITUTO NACIONAL DE
SALUD,
BOGOTÁ, D.C. – COLOMBIA.
2. PROGRAMA DE POSGRADO, GASTROENTEROLOGÍA PEDIÁTRICA
UNIVERSIDAD EL BOSQUE, BOGOTÁ, D.C. – COLOMBIA.
ENTIDAD VINCULADA AL INICIO DE LA INVESTIGACION: SERVICIO DE GASTROENTEROLOGÍA HOSPITAL INFANTIL UNIVERSITARIO "LORENCITA VILLEGAS DE SANTOS" SANTA FE DE BOGOTÁ, D.C. - COLOMBIA.
3. OCHSNER MEDICAL FOUNDATION. NEW ORLEANS, LA. - UNITED
STATES OF AMERICA.
4. DEPARTMENT OF TROPICAL MEDICINE, TULANE UNIVERSITY
MEDICAL CENTER. NEW ORLEANS, LA. - UNITED STATES OF
AMERICA.
3
5. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA – PARASITOLOGIA.
RESUMEN
La giardiosis es una enfermedad intestinal causada por el protozoario,
flagelado, Giardia. La transmisión se efectúa por la ingestión de quistes del
parásito directamente de persona a persona, por contaminación fecal-oral, a
través de agua y alimentos contaminados. La Giardia tiene un ciclo de vida
simple, que consiste de un quiste infectante y un trofozoíto vegetativo. El
diagnóstico convencional se realiza por el examen microscópico de heces
para determinar la presencia de quistes y/o trofozoítos, éstos últimos más
frecuentes en heces diarréicas. La utilización de métodos alternativos de
diagnóstico, tales como la observación de liquido duodenal o la biopsia de
mucosa del intestino delgado, aumentan la sensibilidad, pero son métodos
invasivos. Los problemas antes mencionados han estimulado el desarrollo de
inmunoensayos que permiten la detección de antígenos del parásito en las
heces. La presente investigación se propuso estandarizar y evaluar un ELISA
sandwich indirecto utilizando anticuerpos policlonales, anti-quiste y anti-
trofozoíto de cepas colombianas de Giardia desarrollados en conejo para la
detección de antígeno del parásito en eluído de materia fecal humana. El
Laboratorio de Parasitología del Instituto Nacional de Salud (LP-INS)
suministró 331 muestras de eluído de materia fecal humana, a las cuales se
4
les había realizado diagnóstico parasitológico. A 134 de éstas muestras se
les observó quistes y/o trofozoítos de Giardia y 197 sin presencia de Giardia.
La concentración óptima de anticuerpos policlonales anti-quiste y anti-
trofozoíto de Giardia suministrados por el LP-INS, mezclados en proporción
1Q: 2T fue de 0.25 µg/ml y la dilución óptima de anti-inmunoglobulina G de
conejo (conjugado comercial) fue de 1:10.000. El valor de absorbancia (punto
de corte) que diferenció una muestra negativa de una positiva fue de 0.303.
Los parámetros de la prueba del ELISA indirecto estandarizado y evaluado
en el estudio para la detección de antígeno de Giardia en eluído de materia
fecal fueron: sensibilidad: 93%, especificidad: 99%, valor predictivo positivo:
98% y valor predictivo negativo: 95%. El ELISA del estudio servirá para el
diagnóstico parasitológico de pacientes con giardiosis.
Palabras claves: Giardiosis, inmunoensayo, estandarizar, evaluar.
5
ABSTRACT
Giardiasis is an intestinal sickness caused by the flagellate protozoan Giardia.
It can be trasmited from person to person through the ingestion of cysts of the
parasites, through fecal-oral contamination, through contaminated water and
food.
The Giardia has a simple life cicle that consists of an infective cysts and a
vegetative trophozoite. The conventional diagnosis consists of a
microscopical examination of faeces in order to detect the presence of cysts
and/or trophozoites. These are frequently found in diarreical faeces. The use
of alternative methods of diagnosis such as the observation of duodenal liquid
or the small intestinal biopsies increase the sensibility however, these
methods are invasives. The problems above estimulated the development of
immunoassays that permit the detection of antigens of the parasite s in the
faeces. This project standarized and evaluated indirect ELISA sandwich using
polyclonal antibodies, anti-cysts and trophozoite of colombian strain of
Giardia.These antibodies were developed in rabbits in order to detect the
antigen of the parasites presented in human faeces. The Parasitology Lab of
the National Institute of Health (LP-INS) gave 331 samples of human faeces.
Previously these samples presented cysts and/or Giardia trophozoites. 197
didn’t present any Giardia.The optimal concentration of polyclonal antibodies,
anti-cysts and anti-trophozoites of Giardia given by the LP-INS, mixture in
1Q:2T proportion was 0.25 µg/ml. The optimal dilution of rabbit anti-
6
immunoglobulin G (Commercial conjugate) was 1:10000. The value of
absorbance that permit the difference between a positive and negative
sample was 0.303. The parameters of the standarized indirect ELISA testing
and evaluates in the study to detect the Giardia antigenin in faeces were:
sensibility: 93%, especificity:99%, Positive predictive value:985 and negative
predictive value:95%. The ELISA of the study would permit the parasitic
diagnosis of patients with giardiasis.
Key words: Giardiasis, immunoassays, standarize, evaluate.
7
INTRODUCCION
La giardiosis es una enfermedad intestinal causada por el protozoario,
flagelado, Giardia. Su distribución es mundial y lo mismo afecta a países
industrializados que aquellos que se encuentran en vías de desarrollo (1). La
prevalencia depende de la sensibilidad del método de detección, la
localización geográfica y la población estudiada (2,3).
Las especies de Giardia: agilis, muris, psitaci, ardeae y duodenalis, infectan a
anfibios; roedores, pájaros y reptiles; loros; garzas y humanos, conejos y
perros, respectivamente (4). La Giardia tiene un ciclo de vida simple, que
consiste de un quiste infectante y un trofozoíto vegetativo. La transmisión se
efectúa por la ingestión de quistes del parásito directamente de persona a
persona, por contaminación fecal-oral, a través del agua y alimentos
contaminados (5-7).
La giardiosis presenta un amplio espectro clínico; desde asintomático hasta
sintomático. La sintomatología varía desde malestar inespecífico a diarrea
que puede degenarar en el síndrome de mal absorción (8).
La identificación parasitológica de trofozoítos y/o quistes de Giardia
duodenalis en muestras de materia fecal, puede fallar debido a la toma por
parte del hospedero de medicamentos y componentes anti-diarréicos antes
8
de la recolección de la muestra de heces; a la posible inexperiencia del
microscopista y a la excreción intermitente de quistes (9). La sensibilidad de
la identificación del parásito en heces oscila entre 73% y 85% para el
examen de la primera y tercera muestra de materia fecal respectivamente
(10). Se podría recurrir a la identificación del parásito en aspirado duodenal,
biopsias e improntas, pero la adquisición de las muestras requieren de
métodos invasivos.
Actualmente se recurre a la detección de antígeno del parásito en eluídos de
heces mediante la contrainmunoelectroforesis (CIE) (11), el inmunoensayo
(ELISA) (12) y el dot-ELISA (13). La sensibilidad de los métodos varía desde
88-98% utilizando CIE, del 68-100% mediante ELISA y del 92% con el dot-
ELISA. La especificidad de la CIE, ELISA y dot-ELISA oscila entre 90-97% y
del 81-100% para las dos primeras y del 100% para la última.
Existen comercialmente varios estuches inmunodiagnósticos para detectar
antígeno de Giardia en eluídos de materia fecal. La sensibilidad de éstos
varía entre el 85 al 98% y la especificidad entre el 90 al 100% (14-22).
Se conoce que la sensibilidad y la especificidad de los métodos depende de
la cepa de Giardia circulante en una área geográfica y de la variabilidad
genética inherente al parásito (23).
9
El estudio estandarizó y evaluó la detección de antígeno de Giardia
duodenalis en eluídos de materia fecal humana utilizando anticuerpos
policlonales, anti-quiste y anti-trofozoíto de cepas colombianas del parásito,
mediante ELISA indirecto.
10
MATERIALES Y METODOS
TIPO DE ESTUDIO
Se realizó un estudio de tipo analítico experimental (24).
MUESTRAS
ELUIDO DE MATERIA FECAL HUMANA (COPROANTIGENO)
Los eluídos de materia fecal de pacientes con y sin giardiosis fueron
suministrados por el Laboratorio de Parasitología del Instituto Nacional de
Salud (LP-INS). El LP-INS había recolectado las materias fecales de
pacientes con giardiosis clínicamente sintomáticos o asintomáticos y sin
giardiosis a las cuales se les había identificado parásitos intestinales.
11
DIAGNOSTICO PARASITOLOGICO
Examen directo en solución salina fisiológica y lugol.
Se tomó con la punta de un aplicador materia fecal de diferentes partes de la muestra
homogenizándose perfectamente en una gota de solución salina fisiológica y lugol,
independientemente. Se cubrieron las preparaciones con una laminilla de 22 x 22 mm y se
observaron al microscopio con objetivo 10X y 40X (25,26).
Concentración Formol-éter
Se agregó 10 ml de formol al 10% a un gramo de materia fecal. Se
homogenizó perfectamente la muestra y se filtró a través de gasa doble. Se
adicionó un ml de éter etilico al filtrado obtenido, se agitó vigorosamente y se
centrifugó a 1000 g durante 5 minutos. Se examinó una gota del sedimento
en solución salina y lugol, independientemente, utilizando objetivos de 10 y
40X (27,28).
12
COPROANTIGENO
Se homogenizó perfectamente, aproximadamente un gramo de materia fecal en 10 mililitros
de solución salina reguladora de fosfatos (PBS) pH 7.2. Se filtró el homogenizado a través
de gasa doble. Se permitió la sedimentación de partículas grandes presentes en las heces
durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se almacenó el eluído de materia fecal
(coproantígeno) a -20°C (29) y se descongeló en el momento de realizar la prueba para la
detección de antígeno de Giardia mediante ELISA indirecto.
SUERO HIPERINMUNE ANTI-Giardia EN CONEJOS
Los anticuerpos policlonales anti-quiste y anti-trofozoíto de Giardia fueron
suministrados por el LP-INS, los cuales fueron purificados mediante sulfato
de amonio y ácido caprílico (30,31)
DETECCION DE ANTIGENO DE Giardia EN ELUIDO DE MATERIA FECAL
HUMANA MEDIANTE ELISA INDIRECTO
ESTANDARIZACION
Determinación de la concentración óptima del anticuerpo policlonal anti-
Giardia (32)
13
Se realizaron diluciones del suero hiperinmune purificado (anticuerpos
policlonales anti-Giardia mezclados en proporción 1:2 de anti-quiste y anti-
trofozoíto del parásito, respectivamente) de 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2.5, 5 y 10
µg/ml en solución reguladora 0.05M de carbonato/bicarbonato pH 9.6. Se
seleccionó una muestra de coproantígeno humano positiva (eluído de
materia fecal que presentaba Giardia y había sido confirmada
parasitológicamente) y una muestra negativa (eluído de heces sin presencia
de Giardia). Se preparó el conjugado (anti-IgG de conejo) en la dilución
1:4.000, 1:4500, 1:5.000, 1:5500, 1:6.000, 1:6500, 1:7.000, 1:7500, 1:9.000,
1:9500, 1:10.000, 1:10500 y 1:11.000 en PBS-T. Se realizó un ELISA
indirecto según el procedimiento que se describe posteriormente.
Determinación óptima de la dilución de conjugado (32)
Se realizaron diluciones del suero hiperinmune purificado (anticuerpos
policlonales anti-Giardia previamente mezclados en proporción 1:2 de anti-
quiste y anti-trofozoíto del parásito, respectivamente) en un rango de
concentración de 0.1 – 10 µg/ml en solución reguladora 0.05M de
carbonato/bicarbonato pH 9.6. Se seleccionó una muestra de coproantígeno
humano positiva (eluído de materia fecal que presentaba Giardia y había sido
confirmada parasitológicamente) y una muestra negativa (eluído de heces sin
presencia de Giardia). Se prepararon diluciones 1:4000, 1:4500, 1:5000,
14
1:5500, 1:6000, 1:6500, 1:7000, 1:7500, 1:9000, 1:9500, 1:10.000, 1:10500 y
1:11.000 de conjugado en PBS-T. Se realizó un ELISA indirecto según el
procedimiento que se describe posteriormente.
Procedimiento para la detección de antígeno de Giardia en eluído de materia
fecal humana mediante ELISA indirecto
Se realizó la dilución óptima del anticuerpo policlonal, Inmunoglobulina IgG
anti-Giardia (1Q:2T), en solución reguladora 0.05M de carbonato/bicarbonato
pH 9.6. Se utilizaron placas de poliestireno (Ref:95029380 Combiplate 12 x
25 flat bottom universal 250 / crt , Labsystem). Se adicionaron 100µl, en cada
pozo de la placa, de la dilución óptima del anticuerpo policlonal anti-Giardia.
Se incubó en cámara húmeda a temperatura ambiente durante tres horas. Se
lavó tres veces consecutivas con solución reguladora de fosfatos
0.15M,pH:7.4 más 0.05% de Tween 20 (PBS-T), durante cinco minutos cada
vez. Se realizó la dilución del eluído de heces con gelatina 1% disuelto en
PBS-T, en una proporción 1:1 respectivamente. Se adicionaron 100 µl en
cada pozo de la placa. Se incubó la placa en cámara húmeda a temperatura
ambiente durante dos horas. Se lavó tres veces consecutivas con PBS-T,
durante cinco minutos cada vez. Se realizó la dilución óptima del anticuerpo
policlonal, inmunoglobulina IgG anti-Giardia (1Q:2T), en PBS-T. Se
adicionaron 100µl en cada pozo de la placa. Se incubó la placa en cámara
15
húmeda a temperatura ambiente durante dos horas. Se lavó tres veces
consecutivas con PBS-T, durante cinco minutos cada vez. Se preparó el
conjugado IgG anti-conejo unido a fosfatasa alcalina, en la dilución óptima,
en PBS-T. Se adicionaron 100µl en cada pozo de la placa. Se incubó la placa
en cámara húmeda a 4ºC durante 18 horas. Se lavó tres veces consecutivas
con PBS-T, durante cinco minutos cada vez. Se adicionó 100µl del sustrato
(p-nitrofenilfosfato) en concentración 1 mg/ml de solución reguladora de
dietanolamina 0.1M, pH:9.8. Se incubó a temperatura ambiente durante 30
minutos. Se detuvo la reacción con 25µl de hidróxido de sodio (NaOH) 3N.
Se determinó el valor de absorbancia a una longitud de onda de 405 nm en
un espectrofotometro MultiSkan MS.
VALIDACION
Análisis estadístico
Se realizó la validación de la detección de antígeno de Giardia en eluído de
materia fecal humana mediante ELISA indirecto, determinando el punto de
corte (33,34) y los parámetros de la prueba (35).
Determinación del punto de corte (33,34)
16
Se calculó la media de los valores de absorbancia obtenidos para las
muestras negativas y se adicionó a ésta dos desviaciones estándar, lo que
ofrece un 95% de confiabilidad y diferencia a una muestra positiva de una
negativa.
Determinación de los parámetros del ELISA
Se determinaron los parámetros de la prueba: sensibilidad (S), especificidad
(E), valor predictivo positivo (VPP) y valor predictivo negativo (VPN)
utilizando una tabla de contingencia de 2 x 2 (35).
RESULTADOS
DETECCION DE ANTIGENO DE Giardia EN ELUIDO DE MATERIA FECAL
HUMANA MEDIANTE ELISA INDIRECTO
ESTANDARIZACION
CONCENTRACION OPTIMA DE ANTICUERPO POLICLONAL ANTI-Giardia
17
La concentración óptima de anticuerpo policlonal anti-Giardia que permitió
diferenciar claramente una muestra positiva de una negativa fue de
0.25µg/ml. Figura 1.
DILUCION OPTIMA DEL CONJUGADO
La dilución óptima de conjugado fue de 1:10.000, ya que ésta permitió
diferenciar entre una muestra positiva de una negativa. Figura 2.
VALIDACION DE LA DETECCION DE ANTIGENO DE Giardia EN ELUIDO
DE MATERIA FECAL HUMANA MEDIANTE ELISA INDIRECTO
DETERMINACION DEL PUNTO DE CORTE
El punto de corte definido como la media de los valores de absorbancia de
las muestras negativas (ausencia de antígeno de Giardia en eluído de
materia fecal) más dos desviaciones estándar fue de 0.300. Figura 3.
DETERMINACION DE LOS PARAMETROS DEL ELISA
Los parámetros de la prueba fueron: Tabla 1.
18
Sensibilidad : 93%
Especificidad : 99%
Valor predictivo positivo : 98%
Valor predictivo negativo : 95%
De las 331 muestras de materia fecal diagnosticadas parasitológicamente: 80
presentaron Giardia, 54 Giardia y otros parásitos intestinales, a 103 no se les
observó parásitos intestinales y a 94 no se les identificó Giardia, pero si otros
parásitos intestinales como protozoos y helmintos: 4 con Trichuris trichiura, 3
con Trichomonas hominis, 6 con Entamoeba hitolytica, 7 con Endolimax
nana, 3 con Chilomastix mesnili, 6 con Blastocystis hominis, 24 con
Entamoeba coli, 2 con Uncinarias, 1 con Taenia sp, 15 con Ascaris
lumbricoides, 2 con Enterobius vermicularis, 1 con Iodamoeba butschilii y
Entamoeba hartmani, 2 con Entamoeba. histolytica y Entamoeba coli, 1 con
Blastocystis hominis y Chilomastix mesnili, 3 con Chilomastix mesnili y
Entamoeba coli, 2 con Chilomastix mesnili y Ascaris lumbricoides, 1 con
Endolimax nana y Chilomastix mesnili, 3 con Endolimax nana y Entamoeba
coli, 1 con Entamoeba coli y Trichuris trichiura, 3 con Entamoeba hartmani y
Entamoeba coli, 1 con Blastocystis hominis, Ascaris lumbricoides y
Entamoeba hartmani, 1 con Entamoeba coli y Ascaris lumbricoides, 1 con
Entamoeba coli, Chilomastix mesnili y Enterobius vermicularis y 1 con
Entamoeba hartmani y Chilomastix mesnili.
19
DISCUSION
El patrón de oro en cualquier enfermedad es identificar el agente etiológico
causal de ésta. En la giardiosis, la identificación de Giardia se realiza
demostrando la presencia de quistes y/o trofozoítos del parásito en muestras
de materia fecal, aspirado duodenal, biopsia intestinal, e improntas de éstas
pero las tres últimas se obtienen mediante procedimientos invasivos (36). Se
conoce que Giardia no siempre puede identificarse en materia fecal por la
excreción intermitente del parásito en las heces y ello se debe a un factor
inherente al parásito conocido como variabilidad genética (23). Por ello, los
investigadores han desarrollado pruebas inmunodiagnósticas para detectar
antígeno de Giardia en eluído de heces cuando la identificación del agente
etiológico no es posible en materia fecal (12).
La materia fecal se puede obtener del huésped sin métodos invasivos; es manejable para su
recolección, envase y transporte y puede realizarse coproantígeno de ésta para detectar
Giardia mediante inmunoensayos como la contrainmunoelectroforesis (CIE) (11), los
ensayos inmunoenzimáticos ELISA directo (29) o indirecto (12) y el inmunoensayo
enzimático de punto (dot -ELISA) (13). Se conoce que el ELISA es más sensible que la CIE
(12), por ello el estudio estandarizó y evaluó un ELISA indirecto para la detección de
antígeno de Giardia en eluídos de heces. La mayoría de los investigadores desde la década
de los ochenta han desarrollado el ELISA directo o indirecto para tal fin.
20
El ELISA directo captura el antígeno del parásito entre los anticuerpos
policlonales desarrollados contra Giardia y la visualización de la unión
antígeno de Giardia-anticuerpo policlonal anti-Giardia se observa por la
reacción de la enzima unida al anticuerpo policlonal anti-Giardia y el sustrato
específico de la enzima utilizada. El ELISA indirecto permite la visualización
de la unión antígeno del parásito -anticuerpo policlonal anti-Giardia
adicionando una anti-inmunoglobulina específica del animal utilizado para
desarrollar los anticuerpos policlonales anti-parásito y la cual ya tiene la
enzima ligada. La ventaja es que este conjugado es elaborado
comercialmente, a gran escala, rutinariamente, no requiere de importación de
reactivos y es fácil de adquirir. A diferencia del conjugado elaborado uniendo
una enzima al anticuerpo policlonal anti-Giardia que no sólo es en la
actualidad difícil de importar la enzima sino que su costo es mayor al de un
conjugado comercial.
El ELISA indirecto para detectar antígeno de Giardia en eluído de heces ha
sido desarrollado por Ungar et al, 1984; Nash et al, 1987 y Stibbs et al, 1988.
El inmunoensayo enzimático ELISA estandarizado y evaluado en el estudio
presenta similitudes y diferencias con los desarrollados por los
investigadores. Los ELISAs mencionados y el del estudio utilizan cepas de
Giardia aisladas de humano pero los anticuerpos policlonales adheridos a las
placas de microELISA son diferentes.
21
Ungar et al, 1984 y Nash et al, 1987, desarrollaron anticuerpos contra sólo el
trofozoíto de Giardia, Stibbs et al,1988, sólo contra el quiste de éste y el
estudio utilizó anticuerpos policlonales anti-trofozoíto y anti-quiste del
parásito. El huésped desarrolla anticuerpos contra ambos estadíos del
parásito por lo tanto es recomendable utilizar anticuerpos policlonales
desarrollados contra ambos estadíos del parásito.
Los anticuerpos policlonales anti-Giardia utilizados por Ungar et al, 1984,
Nash et al, 1987 y Stibbs et al, 1988 fueron desarrollados tanto en cabra
como en conejo. Los suministrados por el Laboratorio de Parasitología del
Instituto Nacional de Salud para el estudio fueron desarrollados en conejo.
Los dos primeros investigadores utilizaron los anticuerpos policlonales en
dilución de 1:50,000. Stibbs et al, 1988, y el Laboratorio de Parasitología del
Instituto Nacional de Salud los utilizaron en concentración definida de 2 y
0.25 µg/ml, respectivamente. Es más funcional trabajar con concentración
definida que con diluciones desconocidas debido a que no es lo mismo una
dilución de 1:50,000 de una concentración de 2 µg/ml de anticuerpo
policlonal anti-Giardia que una dilución de 1:50,000 a partir de una
concentración desconocida. La dilución puede efectuarse en concentraciones
de picogramos , nanogramos, microgramos o miligramos por mililitro del
anticuerpo policlonal anti-Giardia. Las últimas permiten reproducibilidad de la
prueba lo que no ofrece las diluciones de concentraciones desconocidas.
22
Los autores tratan de eliminar inespecificidad bloqueando ya sea sitios
inespecíficos en la microplaca de ELISA como lo realizó Stibbs et al, 1988,
utilizando albúmina sérica bovina al 2% o eliminando sustancias
inespecíficas en la muestra como lo realizó Ungar et al, 1984, utilizando
gelatina al 5% en proporción 1:3; y en el presente estudio se bloqueó la
muestra con gelatina disuelta en un PBS más tween 20 que actuó como un
segundo bloqueador y se utilizó concentración al 1% en proporción 1:1
diferentes a las de Ungar et al, 1984.
Se prefirió utilizar en el estudio un conjugado comercial anti-inmunoglobulina
G de conejo unido a fosfatasa alcalina que a peroxidasa o ureasa. La enzima
peroxidasa posee la desventaja de ser muy sensible a la luz lo que la hace
inestable. Una enzima ideal es aquella que sea económica, muy estable y
fácil de unir al anticuerpo a utilizar. La fosfatasa alcalina cumple con los
requisitos anteriormente mencionados y permite que el ELISA sea más
sencillo y fácil de realizar tal como se desarrolló en el estudio. El ELISA del
estudio utilizó anti-IgG de conejo (conjugado comercial), ofreciendo una
mejor alternativa para el desarrollo del inmunoensayo. Este es más facil de
adquirir que el conjugado anti- Giardia, utilizado en ELISA directo que debe
ser elaborado a nivel local.
La aplicabilidad de un inmunoensayo se encuentra relacionada con los
valores de sensibilidad y especificidad que éste ofrezca. El ELISA indirecto
23
desarrollado por Ungar et al, 1984, Nash et al, 1987 y Stibbs et al, 1988,
ofrecen una sensibilidad del 92%, 94.5% y 91.5%, respectivamente y todos
una especificidad del 100%. El ELISA indirecto desarrollado en el estudio
ofrece una especificidad del 99% que aunque es menor tan sólo en 1% a la
de los otros investigadores, probablemente representa los casos no
diagnósticados de giardiosis, microscópicamente, debido posiblemente a la
excreción intermitente de quistes del parásito. Las dos muestras que dieron
positivas por ELISA, en el cual el parásito no se pudo visualizar directamente,
sugiere que la prueba puede detectar antígenos de organismos en
desintegración o tal vez productos de excreción/secreción; por lo tanto,
podría ser usado para la identificación de personas con excreción no activa
de quistes y casos asintomáticos relevantes en un medio donde la infección
de Giardia es endémica. El ELISA indirecto de la presente investigación
ofrece una sensibilidad del 93% que es menor a la de Nash et al, 1987, pero
mayor a la de Ungar et al, 1984 y Stibbs et al, 1988; lo cual sugiere que el
fallo del ELISA para identificar Giardia en nueve muestras a las que
microscópicamente se les observó el parásito podría deberse a que el
antígeno de excreción/secreción de Giardia presente en los eluídos de heces
pudo haber sufrido desnaturalización.
El ELISA del estudio tiene la ventaja de utilizar anticuerpos policlonales, anti-
estadío de cepas colombianas de Giardia y requiere solamente de una
muestra de materia fecal para realizar el diagnóstico de giardiosis a
24
diferencia del diagnóstico parasitológico en heces que requiere de múltiples
muestras (coprológico seriado). El inmunoensayo puede ser usado como un
método diagnóstico en personas con ausencia del parásito en el examen
microscópico y con sospecha de giardiosis clinicamente sintomáticos o
asintomáticos.
25
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30
TABLA 1. ELISA. VALIDACION
DIAGNOSTICO PARASITOLOGICO
E
Giardia
PRESENTE
Giardia
AUSENTE
TOTAL
L
I
POSITIVO
≥0.300
125 2 127
S
A
NEGATIVO
<0.300
9 195 204
TOTAL 134 197 331
SENSIBILIDAD : 93%
ESPECIFICIDAD : 99%
VALOR PREDICTIVO POSITIVO : 98%
VALOR PREDICTIVO NEGATIVO : 95%
31
FIGURA 1. Estandarización. Dilución óptima de anticuerpo policlonal.
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0.1 0.25 0.5 0.75 1 2.5
MICROGRAMOS POR MILILITRO
AB
SO
RB
AN
CIA
405
nm
POSITIVO
NEGATIVO
32
FIGURA 2. Estandarización. Dilución óptima de conjugado.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
0 4000 5000 6000 7000 9000 10000 10500
DILUCIÓN CONJUGADO (1:X)
AB
SO
RB
AN
CIA
405
nm
POSITIVO
NEGATIVO
33
1. OBJETIVOS
1.1. OBJETIVO GENERAL
Detectar antígeno de Giardia duodenalis en eluídos de materia fecal humana
utilizando anticuerpos policlonales, anti-quiste y anti-trofozoíto del parásito,
mediante ELISA indirecto.
1.2. OBJETIVO ESPECIFICO
Estandarizar y evaluar el inmunoensayo ELISA indirecto para la detección de
antígeno de Giardia utilizando el anti-IgG de conejo (conjugado comercial).
34
2. INTRODUCCION
La giardiosis es una enfermedad intestinal causada por el protozoario, flagelado,
Giardia. Este fue uno de los primeros en describirse cuando Antonie Van
Leeuwenhoek, en 1681, descubrió los trofozoítos en sus propias muestras de materia
fecal (Dobell,1920). Aunque la Giardia se descubrió hace muchos años, en 1926 se
informó que ésta causaba el síndrome de malabsorción y por lo tanto se consideró
como parásito patógeno para el hombre (Miller,1926). Su distribución es mundial y lo
mismo afecta a países industrializados que aquellos que se encuentran en vías de
desarrollo (Sotelo-Cruz,1998).
La Giardia duodenalis pertenece a la familia Hexamitidae, orden Diplomonadida,
clase Zoomastigophora. Los tres subtipos más importantes son: Giardia agilis en
anfibios, Giardia muris en roedores, pájaros y reptiles, Giardia duodenalis en
humanos, conejos y perros; más recientemente se ha descrito Giardia psitaci en loros
y Giardia ardeae en garzas (Meyer,1990). La transmisión se efectúa por la ingestión
de quistes del parásito directamente de persona a persona, por contaminación oral-
fecal, a través del agua y alimentos contaminados (Barbour et al, 1976, Craun, 1986,
Petersen et al, 1988).
35
La Giardia tiene un ciclo de vida simple, que consiste de un quiste infectante y un
trofozoíto vegetativo. El quiste es relativamente resistente al medio ambiente y al
jugo gástrico del hospedero. Después de la ingestión del quiste, éste se desenquista en
el intestino delgado dando origen a dos trofozoítos. Estos se dividen por fisión binaria
en el intestino delgado y son los responsables de la sintomatología de la giardiosis.
Algunos de los trofozoítos se enquistan y el ciclo se completa cuando los quistes
pasan en las heces y son ingeridos por otro hospedero (Adam, 1991).
Después de la ingestión de quistes de Giardia, el período de incubación es
generalmente de 1 a 2 semanas (Hill,1993). La infección con Giardia presenta un
amplio espectro clínico; desde asintomático hasta sintomático. La sintomatología
varía desde malestar inespecífico a diarrea que puede degenarar en el síndrome de
malabsorción (Botero y Restrepo,1998).
El contacto del parásito con el huesped induce la formación de anticuerpos, sin
embargo la detección de èstos no permite diferenciar entre una infección pasada de
una activa (Duque y Nicholls, 1997).
El diagnóstico convencional se realiza por el examen microscópico de heces para
determinar la presencia de quistes y/o trofozoítos, éstos últimos más frecuentes en
heces diarréicas (Torres et al, 1997). Sin embargo el 100% de sensibilidad en el
diagnóstico parasitológico en heces no puede lograrse, ya que ello no depende de la
metodología utilizada, sino que es debido a la variabilidad genética del parásito y a la
36
excreción intermitente de quistes de Giardia en las heces. La utilización de métodos
alternativos de diagnóstico, tales como la observación de líquido duodenal o la
biopsia de mucosa del intestino delgado, aumentan la sensibilidad, pero son métodos
invasivos. Los problemas antes mencionados han estimulado el desarrollo de
inmunoensayos que permiten la detección de antígenos del parásito en las heces
(Torres et al, 1997).
37
3. JUSTIFICACION
La identificación parasitológica de trofozoítos y/o quistes de Giardia duodenalis en
muestras de materia fecal, puede fallar debido a la toma por parte del hospedero de
medicamentos y componentes anti-diarréicos antes de la recolección de la muestra de
heces; a la posible inexperiencia del microscopista y a la excreción intermitente de
quistes (Knisley et al, 1989). La sensibilidad de la identificación del parásito en heces
oscila entre 73% y 85% para el examen de la primera y tercera muestra de materia
fecal respectivamente (Goka et al, 1990). Se podría recurrir a la identificación del
parásito en aspirado duodenal, biopsias e improntas, pero la adquisición de las
muestras requieren de métodos invasivos.
Actualmente se recurre a la detección del antígeno del parásito en heces mediante
inmunoensayos como la contrainmunoelectroforesis (Craft y Nelson, 1982), el ELISA
directo ( Green et al, 1985) o indirecto (Ungar et al, 1984) y el ELISA de punto (dot-
ELISA) ( Vinayak et al, 1991). Por ello el presente trabajo estandarizó y evaluó el
ELISA indirecto para la detección de antígeno de Giardia en heces.
38
4. MARCO TEORICO
4.1. GIARDIOSIS
La giardiosis es una enfermedad intestinal causada por el protozoario, flagelado,
Giardia. Este fue uno de los primeros en describirse cuando Van Leeuwenhoek, en
1681, descubrió los trofozoítos en sus propias muestras de materia fecal (Adam,
1991). Sin embargo, la Giardia, sólo hasta 1972 se aceptó universalmente como
parásito patógeno para el hombre (Petersen, 1972).
4.2. DISTRIBUCION
La Giardia se encuentra distribuída a nivel mundial y su prevalencia depende de la
sensibilidad del método de detección, la localización y la población estudiada
(Petersen, 1972, Bundy et al, 1994).
4.3. TAXONOMIA
La Giardia se clasifica mediante la siguiente nomenclatura (Adam, 1991, Levine et
al, 1980):
39
Phylum : Sarcomastigophora
Clase : Zoomastigophora
Orden : Diplomonadida
Género : Giardia
Especie : duodenalis
Alrededor de cuarenta especies de Giardia se han descrito siendo la Giardia lamblia
"Giardia duodenalis" la que infecta al humano (Adam, 1991). Sin embargo, la
clasificación del parásito que hoy en día se utiliza preferencialmente, está basada en:
La forma de sus cuerpos parabasales y se divide en tres grandes grupos como se
describe a continuación (Levine et al, 1980):
ESPECIES TROFOZOITO
DIMENSION MORFOLOGIA CUERPO
MEDIAL
Giardia agilis 20-30 um largo Alargado Piriforme
4-5 um ancho
Giardia muris 9-12 um largo Redondeado Redondo
5-7 um ancho
Giardia lamblia 12-15 um largo Piriforme Falciforme
"Giardia duodenalis" 6-8 um ancho
40
Recientemente han sido descritas otras dos especies de Giardia; en las que se
encuentran, Giardia psitaci infectando a loros y Giardia ardeae infectando a garzas;
estas pueden ser distinguidas por la disposición de los flagelos ventrolaterales y uno
simple caudal (Meyer,1990).
4.4. CICLO DE VIDA
Los trofozoítos se localizan en la parte superior del intestino delgado donde viven
estrechamente adaptados a la mucosa. Estos pueden penetrar a los túbulos secretorios
de la mucosa y ocasionalmente pueden encontrarse en la vesícula biliar. Los
trofozoítos se multiplican por división binaria. Los trofozoítos que se eliminan en las
heces diarréicas mueren en el exterior y los que caen a la luz intestinal dan origen a
los quistes (Botero y Restrepo, 1998).
Los quistes se eliminan con las materias fecales y pueden permanecer viables en el
suelo húmedo o en el agua por varios meses. Estos son infectantes por vía oral y
después de ser ingeridos resisten la acción del jugo gástrico. Cada quiste se rompe en
el intestino delgado dando origen a 4 trofozoítos. Cuando los trofozoítos se eliminan
en las heces diarréicas mueren en el exterior (Botero y Restrepo, 1998).
41
4.5. AGENTE ETIOLOGICO
La Giardia es un protozoario, intestinal flagelado binucleado y uno de los más
primitivos de todos los eucariotes según en la secuencia de rARN y la ausencia de
muchos organelos usualmente asociados con eucariotes (Hill, 1993).
4.5.1. TROFOZOITO
El trofozoíto de Giardia duodenalis mide aproximadamente de 10 a 12 µm de
longitud y de 5 a 7 µm de ancho (Adam, 1991). Tiene forma piriforme y en la parte
anterior tiene dos núcleos. Los dos núcleos poseen nucleolos centrales y están unidos
entre sí por los rizoplastos que terminan en el extremo anterior del axostilo en dos
órganos puntiformes llamados blefaroblastos. Posee una cavidad o ventosa que ocupa
la mitad anterior de su cuerpo, la cual utiliza para fijarse a la mucosa intestinal. Posee
en su diámetro longitudinal y en la parte central, una barra doble o axostilo de cuyo
extremo anterior emergen 4 pares de flagelos. El axostilo es atravesado en el centro
por dos estructuras en forma de coma llamadas cuerpos parabasales. El trofozoíto
tiene capacidad de translación con movimiento lento, vibratorio y a la vez rotatorio,
lo cual permite observar la cavidad correspondiente a la ventosa o disco suctorio
(Adam, 1991,Ortega y Adam, 1997). La presencia del aparato de Golgi se ha
informado en el proceso de enquistamiento de los trofozoítos. Otros organelos que se
distinguen, incluyen vacuolas lisosomales, gránulos de glucógeno y ribosomales,
presentes en el citoplasma (Adam, 1991). Tabla 1. Figura 1.
42
4.5.2. QUISTE
El quiste de Giardia duodenalis es de apariencia ovoide o elíptica, mide
aproximadamente de 7 a 10 µm de longitud (Feely et al, 1990), posee doble
membrana, de 2 a 4 núcleos y el axostilo (Botero y Restrepo, 1998). El quiste es poco
refráctil a la luz cuando se observa al microscopio de alta densidad (Feely et al,
1990). Tabla 1. Figura 2.
4.6. TRANSMISION
La giardiosis se transmite mediante la ingestión de los quistes, que son infectantes tan
pronto salen en las materias fecales. Su diseminación se hace a través de manos
sucias, aguas y alimentos contaminados y por cualquier otro mecanismo que permita
la contaminación fecal, como sucede en la amibiasis y otras infecciones entéricas
bacterianas y virales. La giardiosis puede presentarse en forma epidémica por
contaminación de acueductos, aún en aquellos con tratamiento de cloración. En
algunos países, la prevalencia de Giardia es más alta que la de Entamoeba histolytica
(Hill, 1993). La infección es principalmente persona a persona, pero se ha
comprobado que algunos animales como perros, gatos, castores y rumiantes, pueden
ser reservorios de Giardia duodenalis y por consiguiente dan origen a infección en
humanos, en cuyo caso esta parasitosis se puede considerar como una zoonosis
(Barbour et al,1976, Craun, 1996, Petersen et al, 1988).
43
4.7. PATOGENESIS
El principal mecanismo de acción patógena en la giardiosis se debe a la acción
mecánica de los parásitos sobre la mucosa del intestino delgado, principalmente del
duodeno y yeyuno. La patología principal se encuentra en infecciones masivas, en
cuyo caso la barrera mecánica creada por los parásitos y la inflamación intestinal
puede llegar a producir síndrome de malabsorción. En estos casos las vellosidades
intestinales se encuentran atrofiadas, hay inflamación y alteraciones morfológicas de
las células epiteliales (Ament y Rubin, 1972, Wolfe, 1992).
Las pruebas de absorción de vitaminas A y B12 y de la D-xilosa, están alteradas. Se
ha relacionado la patología de esta parasitosis con la presencia de
hipogammaglobulinemia, principalmente deficiencia de IgA secretora. Algunos casos
de giardiosis graves se han asociado con la presencia de hiperplasia nodular linfoide
en intestino delgado y grueso (Solomons, 1982, Sutton y Kamath, 1985).
Después de la ingestión de quistes de Giardia, el período de incubación es
generalmente de 1 a 2 semanas. Algunos pacientes podrían presentar síntomas en
pocos días antes de la salida de los quistes en la materia fecal. Aunque cerca del 50%
de nuevas personas infectadas desarrollan síntomas, más del 15% son asintomáticos y
presentan quistes en las heces y el resto no tienen indicio de infección. La duración de
la infección asintomática es desconocida, aunque se sabe que en algunos niños se han
demostrado quistes en la materia fecal durante seis meses (Hill, 1993).
44
Pacientes sintomáticos de giardiosis presentan desórdenes gastrointestinales
significativos. Ellos se quejan de diarrea aguda al comienzo de la enfermedad (90%),
calambres abdominales (71%), distensión abdominal (71%) y flatulencia (75%). Al
inicio de la infección, las heces son abundantes y acuosas pero después éstas pueden
ser grasosas y de olor fétido (75%). Los pacientes no eliminan sangre, pus o moco.
Otros síntomas frecuentes incluyen malestar (86%), náuseas (69%), anorexia (66%),
eructo mal oliente y pérdida de peso (66%). El vómito (23%), fiebre (15%) y pujo
(13%) son poco comunes en giardiosis (11). Las manifestaciones extraintestinales son
inusuales y entre las descritas se encuentran la urticaria (10%), artritis y desórdenes
del tracto biliar (Clyne, 1989, Shaw y Stevens, 1987).
4.8. DIAGNOSTICO
4.8.1. DIAGNOSTCO CLINICO
La sintomatología en la giardiosis es de un gran espectro el cual se caracteriza desde
asintomático hasta sintomático (Hill, 1993).
La sintomatología presenta grados variables de acuerdo a la intensidad de la infección
y a la deficiencia inmunológica. Los mecanismos patogénicos, además de la actividad
mecánica, se deben a otros factores como: secreción de sustancias citopáticas,
inhibición de actividad enzimática de las disacaridasas (lactosa, sucrosa y maltosa) y
45
de tripsina y lipasa, de conjugación de las sales biliares, incremento de la flora
bacteriana y trastornos en el transporte de sodio y cloro (Botero y Restrepo, 1998).
Las formas leves de la giardiosis se caracterizan por dolor epigástrico de poca
intensidad y alteración en el ritmo de la defecación. Las formas moderadas de la
enfermedad se manifiestan por un cuadro de duodenitis, con dolor frecuente en región
epigástrica, a veces náuseas, flatulencia y diarrea. La giardiosis severa presenta,
además de la duodenitis, esteatorrea o lientéria con heces abundantes, pastosas o
líquidas de muy mal olor, lo que se asocia con flatulencia. En casos crónicos con
mala absorción, los niños presentan retardo de crecimiento y pérdida de peso (Botero
y Restrepo, 1998).
4.8.2. DIAGNOSTICO IMAGENOLOGICO
Los estudios radiográficos no son necesarios y sus hallazgos no son especificos (Hill,
1993).
46
4.8.3. DIAGNOSTICO PARASITOLOGICO
4.8.3.1. IDENTIFICACION DE Giardia
La identificación de quistes y/o trofozoítos de Giardia se realiza en muestras de
materia fecal (una muestra o coprológico seriado), aspirado duodenal, impronta y
biopsia de intestino delgado (Goka et al, 1990 y Wolfe, 1990).
El diagnóstico parasitológico convencional se realiza por el examen microscópico de
las heces para determinar la presencia de quistes y/o trofozoitos, los últimos más
frecuentes en las heces diarréicas (Torres et al, 1997). El examen microscópico tiene
una sensibilidad que oscila entre 73% y 85% para el examen de la primera y tercera
muestra de materia fecal, respectivamente (Goka et al, 1990). La no identificación de
quistes y/o trofozoítos de Giardia, en las heces puede deberse al patrón intermitente
de excreción de quistes del parásito (Faubert y Belosevic, 1990). La búsqueda del
parásito mediante la identificación de éste en líquido duodenal o biopsia de mucosa
de intestino delgado aumentan la sensibilidad pero se requieren de métodos invasivos
para el paciente (Torres et al, 1997).
Las preparaciones realizadas con solución salina y/o lugol a partir de heces permiten
observar la morfología de los quistes y/o trofozoítos. En solución salina es posible
visualizar la motilidad de los trofozoítos y algunos de sus flagelos al igual que las
estructuras internas de ambos estadíos. Los métodos de concentración se utilizan para
47
identificar quistes del parásito y especialmente para agruparlos en mayor número. Las
coloraciones especiales facilitan la observación de las estructuras internas de cada
uno de los estadíos del parásito (Markell et al, 1986, Manson-Bahr y Bell, 1987).
4.8.3.2. DETECCION DE ANTIGENO DE Giardia
Los antígenos de Giardia que se detectan en heces corresponden a los metabolitos de
excreción/secreción del parásito. Las pruebas inmunológicas para la detección de
antígeno de Giardia que se han utilizado son la contrainmunoelectroforesis (CIE)
(Craft y Nelson, 1982), el inmunoensayo (ELISA) (Ungar et al, 1984) y el dot-ELISA
(Vinayak et al, 1991). La sensibilidad de los métodos varía desde 88-98% utilizando
CIE, del 68-100% mediante ELISA y del 92% con el dot-ELISA. La especificidad de
la CIE, ELISA y dot-ELISA oscila entre 90-97% y del 81-100% para las dos primeras
y del 100% para la última.
Existen comercialmente varios estuches inmunodiagnósticos para detectar antígeno
de Giardia en las muestras de materia fecal. La sensibilidad de éstos varía entre el 85
al 98% y la especificidad entre el 90 al 100% (Addiss et al, 1991, Aldeen y Hale,
1992, Aldeen et al, 1995, Danciger y Lopez, 1975, Garcia y Shimizu, 1997, Mank et
al, 1997, Rosenblat et al, 1993, Rossoff et al, 1989, Stibbs et al, 1988).
Se conoce que la sensibilidad y la especificidad de los métodos depende de la cepa de
Giardia circulante en una área geográfica y de la variabilidad genética inherente al
parásito (Faubert y Belosevic, 1990).
48
4.9. DETECCION DE ANTIGENO DE Giardia
4.9.1. CONTRAINMUNOELECTROFORESIS (CIE)
La CIE se realiza para la detección de antígeno de Giardia en eluídos de heces
utilizando anticuerpos policlonales desarrollados en conejo contra quistes y/o
trofozoítos del parásito. Los anticuerpos anti-estadio de Giardia se confrontan con
antígenos del parásito presentes en los eluídos de materia fecal y posteriormente se
somete electroforesis. El eluído de materia fecal se ubica en el cátodo y los
anticuerpos anti-parásito en el ánodo. La unión antígeno-anticuerpo se visualiza
mediante la presenc ia de una banda de precipitación (Craft y Nelson, 1982).
4.9.2. ENSAYO INMUNOENZIMATICO (ELISA)
Se lleva a cabo para la detección de antígeno del parásito en eluídos de materia fecal
mediante métodos inmunológicos directos e indirectos.
Método directo: Se fija a una microplaca anticuerpo policlonal anti-parásito obtenido
de la inmunización de conejos con trofozoítos y/o quistes de Giardia. Se confronta
con antígeno de Giardia presente en los eluídos de heces. La unión antígeno-
anticuerpo se visualiza utilizando el anticuerpo policlonal anti-Giardia unido a una
enzima, peroxidasa o fosfatasa alcalina, la cual en la presencia de su respectivo
sustrato desarrolla un color café o amarillo, respectivamente (Green et al, 1985).
49
Método indirecto: Se diferencia del directo en que el conjugado utilizado es aquel que
identifique la IgG del ejemplar donde se desarrollaron los anticuerpos policlonales
anti-parásito (Ungar et al, 1984).
4.9.3. dot-ELISA
Se basa en la detección de antígeno de Giardia en eluídos de materia fecal con el
fundamento del ELISA tradicional pero se diferencia de éste en que se utiliza como
soporte una membrana de nitrocelulosa (MNC) y la unión antígeno-anticuerpo se
evidencia por la presencia de un punto color café sobre la MNC debido a la acción
del 4-cloro-1-naftol con la enzima peroxidasa del conjugado (Vinayak et al, 1991).
50
5. MATERIALES Y METODOS
5.1. TIPO DE ESTUDIO
Se realizó un estudio de tipo analítico experimental (Beaglehole, 1994).
5.2. MUESTRAS
5.2.1. ELUIDO DE MATERIA FECAL HUMANA (COPROANTIGENO)
Los eluídos de materia fecal de pacientes con y sin giardiosis fueron suministrados
por el Laboratorio de Parasitología del Instituto Nacional de Salud (LP-INS).
- El LP-INS había recolectado las materias fecales de pacientes con giardiosis
clínicamente sintomáticos o asintomáticos y sin giardiosis a las cuales se les había
identificado parásitos intestinales.
51
5.2.2. DIAGNOSTICO PARASITOLOGICO
Examen directo en solución salina fisiológica
- Se colocó una gota de solución salina fisiológica en una lámina porta objeto.
- Se tomó con la punta de un aplicador materia fecal de diferentes partes de la
muestra.
- Se homogenizó la muestra perfectamente en la gota de solución salina fisiológica.
- Se cubrió la preparación con una laminilla de 22 x 22 mm.
- Se observó al microscopio en objetivo 10X.
- Se examinó toda el área bajo la laminilla sistemáticamente. Cuando se observó algo
que morfológicamente era semejante a un agente parasitario, se examinó el
especimen en objetivo de 40X (Manson-Bahr y Bell, 1987).
Examen directo coloración con lugol
- Se colocó una gota de lugol en una lámina portaobjeto.
- Se tomó con la punta de un aplicador materia fecal de diferentes partes de la
muestra.
52
- Se homogenizó la muestra perfectamente en la gota de lugol.
- Se cubrió la preparación con una laminilla de 22 x 22 mm.
- Se examinó al microscopio como se describió anteriormente (A1) ( Department of Medical
Protozoology-LSHTM, 1989).
Concentración Formol-éter
- Se agregaron 10 ml de formol 10% en un vaso plástico pequeño desechable.
- Se adicionó 1 gramo de materia fecal.
- Se homogenizó perfectamente la muestra.
- Se filtro el homogenizado a través de gasa doble.
- Se agregó 1 ml de éter etilico al filtrado obtenido.
- Se agitó vigorosamente la mezcla.
- Se centrifugó a 1000 g durante 5 minutos.
- Se eliminó el sobrenadante.
- Se colocó una gota del sedimento en el centro de la lámina porta objeto.
- Se agregó una gota de solución salina.
- Se homogenizó la preparación perfectamente en la gota de lugol.
- Se cubrió la preparación con una laminilla de 22 x 22 mm.
- Se examinó al microscopio (Ridley, 1956, Allen, 1970).
Preparacion de coproantigeno
53
- Se homogenizó perfectamente, aproximadamente un gramo de materia fecal en 10
mililitros de solución salina reguladora de fosfatos (PBS) pH 7.2 (A2).
- Se filtró el homogenizado a través de gasa doble.
- Se transfirió el filtrado a un tubo de centrífuga.
- Se permitió sedimentación de partículas grandes presentes en las heces durante 20
minutos a temperatura ambiente.
- Se transfirió el eluído de materia fecal-coproantígeno (sobrenadante) a viales de vidrio.
- Se almacenó el coproantígeno a -20°C (Green, 1985).
- Se descongeló el coproantígeno en el momento de realizar la prueba para la
detección de antígeno de Giardia mediante ELISA indirecto utilizando anticuerpos
policlonales.
5.3. SUERO HIPERINMUNE ANTI-Giardia EN CONEJOS
Los anticuerpos policlonales anti-quiste y anti- trofozoíto de Giardia fueron
suministrados por el LP-INS, los cuales fueron purificados mediante sulfato de
amonio y ácido caprílico (Lane, 1988, Montenegro-James S y James M.
Comunicación personal)
54
5.4. DETECCION DE ANTIGENO DE Giardia EN ELUIDO DE MATERIA
FECAL HUMANA MEDIANTE ELISA INDIRECTO
5.4.1. ESTANDARIZACION
5.4.1.1.DETERMINACION DE LA CONCENTRACION OPTIMA DEL
ANTICUERPO POLICLONAL ANTI-Giardia
(McLaren, 1981)
- Se realizaron diluciones del suero hiperinmune purificado (anticuerpos policlonales
anti-Giardia mezclados en proporción 1:2 de anti-quiste y anti-trofozoíto del
parásito, respectivamente) de 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2.5, 5 y 10 µg/ml en solución
reguladora 0.05M de carbonato/bicarbonato pH 9.6.
- Se confrontó con cada una de las diluciones anteriores de anticuerpo policlonal anti-
Giardia una muestra de eluído de materia fecal humana que presentaba Giardia y
había sido confirmada parasitológicamente (muestra positiva) y un eluído de heces
sin presencia de Giardia (muestra negativa).
- Se preparó el conjugado en la dilución 1:4.000, 1:4500, 1:5.000, 1:5500, 1:6.000,
1:6500, 1:7.000, 1:7500, 1:9.000, 1:9500, 1:10.000, 1:10500 y 1:11.000 en PBS-T.
- Se realizó un ELISA indirecto según el procedimiento que se describe
posteriormente en el numeral 5.4.2.
55
5.4.1.2. DETERMINACION OPTIMA DE LA DILUCION DE CONJUGADO
(McLaren, 1981)
- Se realizaron diluciones del suero hiperinmune purificado (anticuerpos policlonales
anti-Giardia previamente mezclados en proporción 1:2 de anti-quiste y anti-
trofozoíto del parásito, respectivamente) en un rango de concentración de 0.1 – 10
µg/ml en solución reguladora 0.05M de carbonato/bicarbonato pH 9.6.
- Se confrontó con cada una de las diluciones anteriores de anticuerpo policlonal anti-
Giardia una muestra de eluído de materia fecal humana que presentaba Giardia y
había sido confirmada parasitológicamente (muestra positiva) y un eluído de heces
sin presencia de Giardia (muestra negativa).
- Se prepararon diluciones 1:4000, 1:4500, 1:5000, 1:5500, 1:6000, 1:6500, 1:7000,
1:7500, 1:9000, 1:9500, 1:10.000, 1:10500 y 1:11.000 de conjugado en PBS-T.
- Se realizó un ELISA indirecto según el procedimiento que se describe posteriormente en el
numeral 5.4.2.
5.4.1.2.DETERMINACIÓN DE LA DILUCIÓN OPTIMA DEL ELUIDO DE
MATERIA FECAL
- Se seleccionó una muestra de eluído de materia fecal humana que presentaba
Giardia y había sido confirmada parasitológicamente (muestra positiva) y un eluído
de heces sin presencia de Giardia (muestra negativa).
56
- A partir del eluido de materia fecal que estaba en una dilución 1:10, se realizó el procedimiento de
liofilización durante 3 horas.
- Después de liofilizadas las muestras, se prepararon diluciones 1:1, 1:2, 1:4, 1:5,
1:8, 1:10, 1:20, 1:40 y 1:80 en PBS-T.
- Se realizó un ELISA indirecto según el procedimiento que se describe
posteriormente en el numeral 5.4.2.
5.4.2. PROCEDIMIENTO PARA LA DETECCION DE ANTIGENO DE
Giardia EN ELUIDO DE MATERIA FECAL HUMANA MEDIANTE
ELISA INDIRECTO
- Se realizó la dilución óptima del anticuerpo policlonal, Inmunoglobulina IgG anti-
Giardia (1Q:2T), en solución reguladora 0.05M de carbonato/bicarbonato pH 9.6.
- Se utilizaron placas de poliestireno (Ref:95029380 Combiplate 12 x 25 flat bottom
universal 250 / crt , Labsystem).
- Se adicionaron 100µl, en cada pozo de la placa, de la dilución óptima del anticuerpo
policlonal anti-Giardia
- Se incubó en cámara húmeda a temperatura ambiente durante tres horas.
- Se lavó tres veces consecutivas con solución reguladora de fosfatos 0.15M,pH:7.4 más 0.05% de
Tween 20 (PBS-T), durante cinco minutos cada vez.
- Se realizó la dilución del eluído de heces con ge latina 1% disuelto en PBS-T, en una
proporción 1:1 respectivamente.
- Se adicionaron 100 µl en cada pozo de la placa.
57
- Se incubó la placa en cámara húmeda a temperatura ambiente durante dos horas.
- Se lavó tres veces consecutivas con PBS-T, durante cinco minutos cada vez.
- Se realizó la dilución óptima del anticuerpo policlonal, inmunoglobulina IgG anti-
Giardia (1Q:2T), en PBS-T.
- Se adicionaron 100µl en cada pozo de la placa.
- Se incubó la placa en cámara húmeda a temperatura ambiente durante dos horas.
- Se lavó tres veces consecutivas con PBS-T, durante cinco minutos cada vez.
- Se preparó el conjugado IgG anti-conejo unido a fosfatasa alcalina, en la dilución
óptima, en PBS-T.
- Se adicionaron 100µl en cada pozo de la placa.
- Se incubó la placa en cámara húmeda a 4ºC durante 18 horas.
- Se lavó tres veces consecutivas con PBS-T, durante cinco minutos cada vez.
- Se adicionó 100µl del sustrato (p-nitrofenilfosfato) en concentración 1 mg/ml de
solución reguladora de dietanolamina 0.1M, pH:9.8.
- Se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos.
- Se detuvo la reacción con 25µl de hidroxido de sodio (NaOH) 3N.
- Se determinó el valor de absorbancia a una longitud de onda de 405 nm en un
espectrofotómetro Multiskan MS.
58
5.4.3. VALIDACION
5.4.3.1. ANALISIS ESTADISTICO
Se realizó la validación de la detección de antígeno de Giardia en eluído de materia
fecal humana mediante ELISA indirecto, determinando el punto de corte
(Richardson, 1983, Kurstak, 1985) y los parámetros de la prueba (Griner,1981).
5.4.3.1.1. DETERMINACION DEL PUNTO DE CORTE
(Richardson, 1983, Kurstak, 1985)
Se determinó el punto de corte tomando el valor de absorbancia que diferenció entre
muestra positiva y negativa. Este valor se calculó adicionando al valor de la media de
las muestras negativas dos desviaciones estándar. Lo que ofrece un 95% de
confiabilidad.
5.4.3.1.2. DETERMINACION DE LOS PARAMETROS DEL ELISA
Se determinaron los parámetros de la prueba: sensibilidad (S), especificidad (E), valor
predictivo positivo (VPP) y va lor predictivo negativo (VPN) utilizando una tabla de
contingencia de 2 x 2 (Griner, 1981).
59
DIAGNOSTICO PARASITOLOGICO
E
Giardia
PRESENTE
Giardia
AUSENTE
TOTAL
L
I
POSITIVA A b a+b
S
A
NEGATIVA C d c+d
TOTAL a+c b+d a+b+c+d
a : Número de positivos verdaderos
b : Número de positivos falsos
c : Número de negativos falsos
d : Número de negativos verdaderos
Sensibilidad : Probabilidad de que la prueba sea positiva en las
personas que tienen la enfermedad.
a/(a+c)
Especificidad : Probabilidad de que la prueba sea negativa en
las personas que no tienen la enfermedad.
d/(b+c)
Valor predictivo positivo : Probabilidad de que la persona tenga la
60
enfermedad cuando la prueba da un resultado
positivo.
a/(a+b)
Valor predictivo negativo : Probabilidad de que la persona no tenga la
enfermedad cuando la prueba da un resultado
negativo.
d/(c+d)
61
6. RESULTADOS
6.1. DETECCION DE ANTIGENO DE Giardia EN ELUIDO DE MATERIA
FECAL HUMANA MEDIANTE ELISA INDIRECTO
6.1.1. ESTANDARIZACION
6.1.1.1.CONCENTRACION OPTIMA DE ANTICUERPO POLICLONAL
ANTI-Giardia
Se observó diferencia entre una muestra positiva y una negativa en las diluciones 0.1
a 2.5 µg/ml de anticuerpo policlonal anti-Giardia. Sin embargo la concentración
óptima de anticuerpo policlonal anti-Giardia que permitió diferenciar claramente una
muestra positiva de una negativa fue de 0.25µg/ml. Las concentraciones del
anticuerpo superiores a esta, a medida que incrementaron , los valores de absorbancia
realizarón el mismo comportamiento. Figura 3.
62
63
6.1.1.2. DILUCION OPTIMA DEL CONJUGADO
La dilución óptima de conjugado fue de 1:10.000, ya que ésta permitió diferenciar
entre una muestra positiva de una negativa.
El conjugado en la dilución 1:4.000 no evidenció diferenciación entre muestra
positiva y negativa. Este a partir de las diluciones 1:5.000 a 1:9.000 presentó
diferenciación entre muestra positiva y negativa pero los valores de absorbancia
fueron decreciendo a medida que la dilución de conjugado fue menor, lográndose la
verdadera diferencia entre muestra positiva y negativa en la dilución 1:10.000 y
permaneciendo constante a partir de ésta. Figura 4.
6.1.1.3. DILUCIÓN OPTIMA DE ELUIDO DE MATERIA FECAL
Se observó diferencia entre una muestra positiva y una negativa en todas las
diluciones de eluido de materia fecal. Sin embargo en las diluciones 1:1 y 1:2 la
absorbancia de la muestra positiva fue mayor que la obtenida en la
estandarización del presente estudio, con relación al punto de corte. Los
resultados de las diluciones 1:4 – 1:40 fueron de acuerdo con respecto a nuestro
punto de corte; y los resultados de la muestra negativa en la dilución 1:80 estan
por debajo del punto de corte del presente estudio. Figura 5.
64
6.1.2. VALIDACION DE LA DETECCION DE ANTIGENO DE Giardia EN
ELUIDO DE MATERIA FECAL HUMANA MEDIANTE ELISA
INDIRECTO
6.1.2.1. DETERMINACION DEL PUNTO DE CORTE
El punto de corte definido como la media de los valores de absorbancia de las
muestras negativas (ausencia de antígeno de Giardia en eluído de materia fecal) más
dos desviaciones estándar fue de 0.300. Figura 6.
65
6.1.2.2. DETERMINACION DE LOS PARAMETROS DEL ELISA
Los parámetros de la prueba fueron: Tabla 2.
Sensibilidad : 93%
Especificidad : 99%
Valor predictivo positivo : 98%
Valor predictivo negativo : 95%
De las 331 muestras de materia fecal diagnosticadas parasitológicamente: 80
presentaron Giardia, 54 Giardia y otros parásitos intestinales, a 103 no se les observó
parásitos intestinales y a 94 no se les identificó Giardia, pero si otros parásitos
intestinales como protozoos y helmintos: 4 con Trichuris trichiura, 3 con
Trichomonas hominis, 6 con el complejo Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar, 7
con Endolimax nana, 3 con Chilomastix mesnili, 6 con Blastocystis hominis, 24 con
Entamoeba coli, 2 con Uncinarias sp, 1 con Taenia sp, 15 con Ascaris lumbricoides,
2 con Enterobius vermicularis, 1 con Iodamoeba butschilii y Entamoeba hartmanni,
2 con Entamoeba histolytica y Entamoeba coli, 1 con Blastocystis hominis y
Chilomastix mesnili, 3 con Chilomastix mesnili y Entamoeba coli, 2 con Chilomastix
mesnili y Ascaris lumbricoides, 1 con Endolimax nana y Chilomastix mesnili, 3 con
Endolimax nana y Entamoeba coli, 1 con Entamoeba coli y Trichuris trichiura, 3 con
Entamoeba hartmanni y Entamoeba coli, 1 con Blastocystis hominis, Ascaris
66
lumbricoides y Entamoeba hartmanni, 1 con Entamoeba coli y Ascaris lumbricoides,
1 con Entamoeba coli, Chilomastix mesnili y Enterobius vermicularis y 1 con
Entamoeba hartmanni y Chilomastix mesnili.
67
TABLA 2. ELISA. VALIDACION
DIAGNOSTICO PARASITOLOGICO
E
Giardia
PRESENTE
Giardia
AUSENTE
TOTAL
L
I
POSITIVO
≥0.300
125 2 127
S
A
NEGATIVO
<0.300
9 195 204
TOTAL 134 197 331
SENSIBILIDAD : 93%
ESPECIFICIDAD : 99%
VALOR PREDICTIVO POSITIVO : 98%
VALOR PREDICTIVO NEGATIVO : 95%
68
7. DISCUSION
La identificación del agente etiológico causante de la parasitosis es lo ideal. En la
giardiosis, la identificación de Giardia se realiza demostrando la presencia de quistes
y/o trofozoítos del parásito en muestras de materia fecal, aspirado duodenal, biopsia
intestinal, e improntas de éstas pero las tres últimas se obtienen mediante
procedimientos invasivos (Goka et al, 1990, Wolfe, 1990). Se conoce que Giardia no
siempre puede identificarse en materia fecal por la excreción intermitente del parásito
en las heces y ello se debe a un factor inherente al parásito conocido como
variabilidad genética (Faubert y Belosevic, 1990). Por ello, los investigadores han
desarrollado pruebas inmunodiagnósticas para detectar antígeno de Giardia en eluído
de heces cuando la identificación del agente etiológico no es posible en materia fecal
(Ungar et al, 1984).
La materia fecal se puede obtener del huésped sin métodos invasivos; es manejable para su
recolección, envase y transporte y puede realizarse coproantígeno de ésta para detectar Giardia
mediante ensayos como la contrainmunoelectroforesis (CIE) (Craft y Nelson, 1982), los ensayos
inmunoenzimáticos ELISA directo (Green et al, 1985) o indirecto (Ungar et al, 1984) y el
inmunoensayo enzimático de punto (dot-ELISA) (Vinayak et al, 1991). Se conoce que el ELISA es
más sensible que la CIE
69
(Ungar et al, 1984), por ello el estudio estandarizó y evaluó un ELISA indirecto para la detección de
antígeno de Giardia en eluídos de heces. La mayoría de los investigadores desde la década de los
ochenta han desarrollado el ELISA directo o indirecto para tal fin.
El ELISA directo captura el antígeno del parásito entre los anticuerpos policlonales
desarrollados contra Giardia y la visualización de la unión ant ígeno de Giardia-
anticuerpo policlonal anti-Giardia se observa por la reacción de la enzima unida al
anticuerpo policlonal anti-Giardia y el sustrato específico de la enzima utilizada. El
ELISA indirecto permite la visualización de la unión antígeno del parásito-anticuerpo
policlonal anti-Giardia adicionando una anti- inmunoglobulina específica del animal
utilizado para desarrollar los anticuerpos policlonales anti-parásito y la cual ya tiene
la enzima ligada. La ventaja es que este conjugado es elaborado comercialmente, a
gran escala, rutinariamente, no requiere de importación de reactivos y es fácil de
adquirir. A diferencia del conjugado elaborado uniendo una enzima al anticuerpo
policlonal anti-Giardia que no sólo es en la actualidad difícil de importar la enzima
sino que su costo es mayor al de un conjugado comercial.
El ELISA indirecto para detectar antígeno de Giardia en eluído de heces ha sido
desarrollado por Ungar et al, 1984; Nash et al, 1987 y Stibbs et al, 1988. El
inmunoensayo enzimático ELISA estandarizado y evaluado en el estudio presenta
similitudes y diferencias con los desarrollados por los investigadores. Los ELISAs
mencionados y el del estudio utilizan cepas de Giardia aisladas de humano pero los
anticuerpos policlonales adheridos a las placas de microELISA son diferentes.
70
Ungar et al, 1984 y Nash et al, 1987, desarrollaron anticuerpos contra sólo el
trofozoíto de Giardia, Stibbs et al,1988, sólo contra el quiste de éste y el estudio
utilizó anticuerpos policlonales anti-trofozoíto y anti-quiste del parásito. El huésped
desarrolla anticuerpos contra ambos estadíos del parásito por lo tanto es
recomendable utilizar anticuerpos policlonales desarrollados contra ambos estadíos
del parásito.
Los anticuerpos policlonales anti-Giardia utilizados por Ungar et al, 1984, Nash et al,
1987 y Stibbs et al, 1988 fueron desarrollados tanto en cabra como en conejo. Los
suministrados por el Laboratorio de Parasitología del Instituto Nacional de Salud para
el estudio fueron desarrollados en conejo. Los dos primeros investigadores utilizaron
los anticuerpos policlonales en dilución de 1:50,000. Stibbs et al, 1988, y el
Laboratorio de Parasitología del Instituto Nacional de Salud los utilizaron en
concentración definida de 2 y 0.25 µg/ml, respectivamente. Es más funcional trabajar
con concentración definida que con diluciones desconocidas debido a que no es lo
mismo una dilución de 1:50,000 de una concentración desconocida que una
concentración de 2 µg/ml de anticuerpo policlonal anti-Giardia a partir de una
concentración madre de 14 mg/ml de ésta. La dilución puede efectuarse en
concentraciones de picogramos , nanogramos, microgramos o miligramos por
mililitro del anticuerpo policlonal anti-Giardia. Las últimas permiten
71
reproducibilidad de la prueba lo que no ofrece las diluciones concentraciones
conocidas.
Los eluídos de materia fecal humana utilizada en la estandarización se les había
realizado una dilución 1:10 previamente, sin embargo se realizó un ensayo con
diferentes diluciones de la muestra, con el fin de determinar si la dilución utilizada
era la más óptima. La mayoría de las diluciones dieron resultados favorables (1:1-
1:40) incluyendo la utilizada en la estandarización del ELISA indirecto desarrollado
en la presente investigación, siendo esta más favorable, debido a que es una dilución
más facil de manejar y los resultados de absorbancia siguen siendo muy estables con
relación a los obtenidos en nuestro estudio-. En la dilución 1:80 los resultados de la
muestra negativa no concordaron, probablemente debido a que la dilución utilizada
era muy alta.
Los autores tratan de eliminar inespecificidad bloqueando ya sea sitios inespecíficos
en la microplaca de ELISA como lo realizó Stibbs et al, 1988, utilizando albúmina
sérica bovina al 2% o eliminando sustancias inespecíficas en la muestra como lo
realizó Ungar et al, 1984, utilizando gelatina al 5% en proporción 1:3; y en el
presente estudio se bloqueó la muestra con gelatina disuelta en un PBS más tween 20
que actuó como un segundo bloqueador y se utilizó concentración al 1% en
proporción 1:1 diferentes a las de Ungar et al, 1984.
Se prefirió utilizar en el estudio un conjugado comercial anti- inmunoglobulina G de
conejo unido a fosfatasa alcalina que a peroxidasa o ureasa. La enzima peroxidasa
72
tiene la desventaja de ser muy sensible a la luz lo que la hace inestable. Se
recomienda utilizar una enzima que sea económica, muy estable y fácil de unir al
anticuerpo a utilizar. La fosfatasa alcalina cumple con los requisitos anteriormente
mencionados y permite que el ELISA sea más sencillo y fácil de realizar tal como se
desarrolló en el estudio.
La aplicabilidad de un inmunoensayo se encuentra relacionada con los valores de
sensibilidad y especificidad que éste ofrezca. El ELISA indirecto desarrollado por
Ungar et al, 1984, Nash et al, 1987 y Stibbs et al, 1988, ofrecen una sensibilidad del
92%, 94.5% y 91.5%, respectivamente y todos una especificidad del 100%. El ELISA
indirecto desarrollado en el estudio ofrece una especificidad del 99% que aunque es
menor tan sólo en 1% a la de los otros investigadores, probablemente representa los
casos no diagnósticados de giardiosis, microscópicamente, debido posiblemente a la
excreción intermitente de quistes del parásito. Las dos muestras que dieron positivas
por ELISA, en el cual el parásito no se pudo visualizar directamente, sugiere que la
prueba puede detectar antígenos de organismos en desintegración o tal vez productos
de excreción/secreción; por lo tanto, podría ser usado para la identificación de
personas con excreción no activa de quistes y casos asintomáticos relevantes en un
medio donde la infección de Giardia es endémica. El ELISA indirecto de la presente
investigación ofrece una sensibilidad del 93% que es menor a la de Nash et al, 1987,
pero mayor a la de Ungar et al, 1984 y Stibbs et al, 1988; lo cual sugiere que el fallo
del ELISA para identificar Giardia en nueve muestras a las que microscópicamente
73
se les observó el parásito podría deberse a que el antígeno de excreción/secreción de
Giardia presente en los eluídos de heces pudo haber sufrido desnaturalización.
El ELISA indirecto desarrollado en el estudio requiere solamente de una muestra de
materia fecal para realizar el diagnóstico de giardiosis a diferencia del diagnóstico
parasitológico en heces que requiere de múltiples muestras (coprológico seriado). El
ELISA estandarizado y evaluado puede ser usado como un método diagnóstico en
personas con ausencia del parásito en el examen microscópico y con sospecha de
giardiosis clinicamente sintomáticos o asintomáticos.
74
8. CONCLUSIONES
El inmunoensayo ELISA del estudio ofrece una sensibilidad del 93% siendo ésta
mayor a la obtenida en el diagnóstico parasitológico de una muestra de materia fecal
que es del 73%.
El ELISA del estudio tiene la ventaja de utilizar anticuerpos policlonales, anti-estadío
de cepas colombianas de Giardia.
El ELISA indirecto estandarizado y evaluado, utiliza anti-IgG de conejo (conjugado
comercial), ofreciendo una mejor alternativa para el desarrollo del inmunoensayo.
Este es más facil de adquirir que el conjugado anti- Giardia, utilizado en ELISA
directo que debe ser elaborado a nivel local..
75
9. RECOMENDACIONES
Realizar el ELISA indirecto desarrollado en la investigación utilizando eluídos de
materia fecal de gerbil (Meriones unguiculatus), como modelo animal para estudios
de giardiosis, para posteriormente de acuerdo a los resultados que se obtengan
extrapolarlo a la detección de antígeno de cepas colombianas de Giardia en heces
humanas.
76
APENDICES
A1 LUGOL
Iodo 1 g
Ioduro de potasio 2 g
Agua destilada 50 ml
Disolver el yodo y el ioduro de potasio en 10 ml de agua destilada agitando
constantemente hasta completar 50 ml.
A2 SOLUCION SALINA REGULADORA DE FOSFATOS (PBS)
pH 7.2 +/- 7.4
Cloruro de sodio 8.00 g
Cloruro de potasio 0.20 g
Fosfato monobásico de potasio 0.20 g
Fosfato dibásico de sodio 0.15 g
Agua destilada 100 ml
77
A3 SOLUCION CARBONATO/BICARBONATO
Carbonato de sodio 0.159 g
Carbonato monobásico 0.293 g
Agua destilada 100 ml
Mezclar y ajustar a pH 9.6 con HCl 1N o NaOH 1N.
A4 SOLUCION DE DIETANOLAMINA pH 9.8
Dietanolamina 97 ml
Agua destilada 800 ml
Clorurode magnesio hexahidratado 100 mg
Agua destilada csp 1000 ml
A5 SOLUCION SUSTRATO
Para-nitro-fenil- fosfato 1.0 mg
Dietanolamina 1.0 ml
78
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