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Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos de diferentes órganos

de Solanum tuberosum Grupo Phureja

Anngie Katherine Hernández Guzmán

Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina

Departamento de Ciencias Fisiológicas Maestría en Bioquímica

Bogotá, Colombia 2012

Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos de diferentes órganos

de Solanum tuberosum Grupo Phureja

Anngie Katherine Hernández Guzmán

Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título de: Magister en Bioquímica

Directora: M. Sc., Ph.D. María Mónica Guzmán Barney

Docente Asociado Coordinadora del Laboratorio de Virus Vegetales

Instituto de Biotecnología Universidad Nacional de Colombia

Línea de Investigación Virus Vegetales

Grupo de Investigación: Biología Molecular de Virus

Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina

Departamento de Ciencias Fisiológicas Maestría en Bioquímica

Bogotá, Colombia 2012

A Dios por haberme permitido llegar hasta

este punto.

A mi querida madre, a quien amo

profundamente, por haberme brindado su

comprensión y apoyo incondicional sin el cual

no habría sido posible alcanzar esta meta,

por sus consejos que me orientaron a tomar

las mejores decisiones y por creer en mí.

Agradecimientos

A mi familia por su afecto y consejos.

A la Universidad Nacional de Colombia, al programa de Bioquímica de la Facultad de

Medicina y a los docentes de la Maestría: Dr. Carlos Guerrero, Dr. Alberto Gómez y al Dr.

Orlando Acosta por el proceso de formación durante esta etapa académica.

Debo agradecer de manera especial a la Doctora Mónica Guzmán por todas sus

enseñanzas, la dirección de este trabajo y por todo el apoyo brindado durante este

proceso.

A la doctora Liliana Franco por su amplia colaboración y aportes que fueron muy valiosos

para este trabajo.

Al doctor Jorge Evelio Angel y al Profesor Carlos Ñustez por la evaluación de este

trabajo, y los aportes realizados.

A Carlos Fabián Gordillo, por haberme acompañado durante este proceso, por ser mi

motivación e inspiración para alcanzar esta meta.

A Angela Villamil, por la gran amistad que me brindó, por sus aportes, enseñanzas y

acompañamiento durante este proceso.

A Karen Cubillos, por estar a mi lado apoyándome, por los consejos recibidos y por

brindarme una bonita amistad.

A Rafael Guerrero, por su colaboración y solidaridad.

VIII Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja

A Lorena Vargas y Juan Esteban Cruz por su colaboración.

A Carlos Barragán por su colaboración en los ensayos de transmisión.

A Patricia Rodríguez, por su amistad y enseñanzas.

A Patricia Liévano por su valiosa colaboración y generosidad.

Al Instituto de Biotecnología, a Rocio Oliveros, Germán Bautista, Alejandra Cuellar,

Miriam Beltrán, Yurleidy Güaldrón, Andrés Castillo y Germán Orjuela por toda la

contribución en el desarrollo de este proyecto.

A cada una de las personas que de una u otra manera contribuyeron y estuvieron

pendientes de mi trabajo de grado.

Al Laboratorio de Biología Molecular de Plantas del Instituto de biotecnología por el

préstamo del equipo de PCR en tiempo real.

Al Laboratorio de Cultivo de Tejidos del Instituto de Biotecnología por la producción de

las plántulas in vitro

A la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia, por permitirme

realizar algunos ensayos en el invernadero.

A Colciencias y a la División de Investigaciones de Bogotá por la financiación de este

trabajo (Proyectos: 202010016358 y 201010018595-302010103).

Resumen y Abstract IX

Resumen

Potato vein yellow virus (PYVV) es un virus reemergente que infecta a la especie

Solanum tuberosum en algunos países andinos causando pérdidas importantes en la

producción. El virus ha sido detectado por RT-PCR convencional y en sólo dos

ocasiones se ha reportado el uso de PCR en tiempo real para el diagnóstico del virus. No

existen estudios sobre la distribución y acumulación de PYVV en diferentes órganos de

una planta infectada, por lo tanto no se sabe si la distribución del virus en plantas

infectadas es homogénea ó heterogénea. Teniendo en cuenta lo anterior el objetivo del

presente trabajo fue evaluar la distribución y acumulación viral del PYVV en muestras de

tubérculos y otros órganos de plantas de Solanum tuberosum Grupo Phureja variedad

Criolla Colombia infectadas con el virus.

Se hizo cuantificación absoluta utilizando la técnica de RT-PCR en tiempo real (qRT-

PCR) con Sondas TaqMan® la cual requiere tener un RNA de buena calidad y cantidad,

por lo tanto inicialmente se hizo una evaluación de tres métodos de extracción para el

aislamiento de RNA a partir de diferentes órganos de plantas de S. tuberosum Grupo

Phureja Variedad Criolla Colombia infectadas con el virus (foliolo, peciolo, tallo,

pedúnculo floral, antera, pétalo, raíz y brote de tubérculo). La evaluación se hizo en

términos del rendimiento, radio de las absorbancias 260/280nm, radio de la intensidad de

las bandas de las subunidades ribosomales 28S/18S, y la amplificación del gen de la

proteína mayor de la cápside (CP) de PYVV; los métodos evaluados fueron: Trizol®

(Invitrogen), fenol:cloroformo seguido de purificación con Sephadex y un método basado

en CTAB. Aunque con los tres métodos se logró la detección del virus en los diferentes

órganos evaluados, los resultados sugirieron que Trizol® (Invitrogen) era el mejor método

para la extracción de RNA a partir de diferentes órganos, debido a que este presentó la

mayor probabilidad de obtener un mayor rendimiento y relación 260/280nm, y se logró la

detección del virus por RT-PCR en un mayor número de muestras que con los otros dos

métodos de extracción.

X Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja

Posteriormente se analizó la acumulación del virus en diferentes órganos de plantas de

S. tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia infectadas por transmisión con el

vector natural, en donde PYVV presentó una distribución homogénea en plantas que no

expresaban síntomas de amarillamiento, mientras que las plantas que expresaron

síntomas de amarillamiento presentaron una distribución diferencial (heterogénea) entre

la zona aérea y la zona radical (con mayor acumulación en la zona aérea). En tubérculos

el virus también se distribuye heterogéneamente cuando las muestras provienen de

plantas que no expresan síntomas.

Es la primera vez que se detecta PYVV en muestras de diferentes órganos de plantas

infectadas. La información presentada en este trabajo puede resultar interesante para el

conocimiento del virus (distribución del virus en el hospedero) y puede ser importante en

programas de fitomejoramiento, indexado de plantas contra PYVV, programas de

cuarentena y certificación de semillas libres de virus.

Palabras clave: PYVD, distribución, RT-PCR en tiempo real, RT-PCR, Sondas

TaqMan®, Cuantificación absoluta, diferentes órganos.

Resumen y Abstract XI

Abstract

Detection and quantification of Potato yellow vein virus (PYVV) in isolates of different organs of Solanum tuberosum Grupo Phureja

Potato yellow vein virus (PYVV) is a re-emerging virus that infects the specie Solanum

tuberosum in some Andean countries causing significant losses in production. The virus

has been detected by conventional RT-PCR and in only two cases have been reported

using real-time RT-PCR for the diagnosis of the virus. There is not studies on the

distribution and accumulation of PYVV in different organs of a plant infected, therefore, it

is not known if the distribution of the virus in infected plants is homogeneous or

heterogeneous. Considering the above, the aim of this study was to evaluate the

distribution and accumulation of PYVV in tubers and other plant organs of Solanum

tuberosum Group Phureja variety Criolla Colombia infected with the virus.

Absolute quantification was made using real time RT-PCR technique (qRT-PCR) with

TaqMan® probes which requires having a good RNA quality and quantity, Initially was

made an evaluation of three methods for RNA extraction from various organs of plants S.

tuberosum Group Phureja cultivar Colombia Criolla infected with the virus (leaflet, petiole,

stem, peduncle, anther, petal, root and tuber shoot). Evaluations were made in terms of

yield, ratio of 260/280nm absorbance, radio of intensity bands of ribosomal subunits

28S/18S, and the amplification of gene major capsid protein (CP) of PYVV. The

evaluated methods were: Trizol ® (Invitrogen), phenol: chloroform followed by purification

with Sephadex and a CTAB-based method. Although all three methods are able to detect

the virus in different organs evaluated, the results suggested that Trizol ® (Invitrogen)

was the best method for extracting RNA from different organs, because this had the

highest probability of obtain a higher yield and 260/280nm ratio, and detection was

achieved by RT-PCR virus in a greater number of samples than the other two methods of

extraction.

Subsequently, the virus accumulation was analyzed in different organs of plants S.

tuberosum Group Phureja cultivar Criolla Colombia infected by transmission using the

natural vector. A homogeneous distribution of PYVV was presented in plants not

expressing symptoms of yellowing, while plants pexressin yellowing symptoms showed

XII Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja

differential distribution (heterogeneous) between the aerial zone and the radical zone

(with higher accumulation in the aerial zone). In tubers the virus was also distributed

heterogeneously in samples from plants that do not express symptoms.

It is the first report of detection of PYVV in samples from different organs of infected

plants. The information presented in this paper could be interesting for increase the

knowledge of the virus (virus distribution in the host) and could be important in breeding

programs, indexed plants against PYVV, quarantine programs, and certification of virus-

free seed.

Keywords: PYVD, distribution, Real time RT-PCR, RT-PCR, TaqMan® proof, Absolute

quantification, different organs.

Contenido XIII

Contenido

Resumen ....................................................................................................................... IX

Lista de Figuras ......................................................................................................... XVIII

Lista de tablas .............................................................................................................. XX

Lista de abreviaturas ................................................................................................... XXI

Introducción .................................................................................................................... 1

1. Justificación ............................................................................................................. 3

2. Hipótesis ................................................................................................................... 5

3. Objetivos ................................................................................................................... 7 3.1 Objetivo general............................................................................................... 7 3.2 Objetivos específicos ....................................................................................... 7

4. Marco teórico ............................................................................................................ 9 4.1 El cultivo de la papa ......................................................................................... 9

4.1.1 Plagas y enfermedades de la papa criolla ........................................... 10 4.2 PYVV (Potato yellow vein virus) ..................................................................... 12

4.2.1 Clasificación Taxonómica .................................................................... 12 4.2.2 Síntomas causados por PYVV ............................................................ 13 4.2.3 Transmisión de PYVV ......................................................................... 15

Transmisión por tubérculo ............................................................................. 15 Transmisión mecánica y por injerto................................................................ 16 Transmisión por vector natural, mosca blanca (T. vaporariorum) ................... 16

4.2.4 Genoma .............................................................................................. 18 D-RNAs (RNAs Defectivos) ...................................................................................... 20

4.2.5 Antecedentes: Estudios moleculares en PYVV ................................... 22 4.3 Extracción de RNA vegetal ............................................................................ 23

4.3.1 Ruptura del tejido y extracción ............................................................ 24 4.3.2 Precipitación diferencial del RNA ........................................................ 25

4.4 RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR) ............................................................... 25 4.4.1 Cuantificación ..................................................................................... 26

Umbral ........................................................................................................... 26 Cuantificación Absoluta y relativa .................................................................. 27 Químicas utilizadas en qPCR ........................................................................ 30

4.4.2 RT-PCR en tiempo real para el estudio de virus en el cultivo de la papa.37

XIV Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja

5. Metodología, Resultados y Discusión ...................................................................41

5.1 Resumen de la metodología del objetivo 1. ....................................................42 5.2 Resúmen de la metodología del objetivo 2 .....................................................43 5.3 Resúmen de la metodología del objetivo 3 .....................................................44

6. Artículo 1. ................................................................................................................45 Resumen ..................................................................................................................45 6.1 Introducción ....................................................................................................46 6.2 Materiales y Métodos .....................................................................................48

6.2.1 Material vegetal y aislados virales ........................................................48 6.2.2 Evaluación de los protocolos de extracción de RNA ............................48

Métodos de extracción de RNA ......................................................................49 Determinación de la concentración y evaluación de la calidad de los extractos | de RNA ..........................................................................................................50 Determinación de la integridad de los extractos de RNA ................................50 Síntesis de cDNA ...........................................................................................50 PCR ...............................................................................................................51

6.2.3 Análisis Estadísticos ............................................................................51 6.3 Resultados y Discusión ..................................................................................52

6.3.1 Rendimiento de la extracción de RNA, radio de la absorbancia 260/280nm y radio de la intensidad de las subunidades ribosomales 28S/18S. .52 6.3.2 Diferencias entre los tres métodos de extracción .................................57

Fase de extracción de ácidos nucleicos .........................................................58 Fase de precipitación de RNA ........................................................................58

6.3.3 Relación entre calidad, integridad y rendimiento ..................................60 6.3.4 . RT-PCR del gen CP de PYVV ...........................................................62

Agradecimientos .......................................................................................................66 Referencias ...............................................................................................................66

7. Artículo 2 .................................................................................................................69 Resúmen ..................................................................................................................69 7.1 Introducción ....................................................................................................70 7.2 Materiales y Métodos .....................................................................................71

7.2.1 Material vegetal y aislados virales ........................................................71 Plantas de S. tuberosum Grupo Phureja (papa criolla) infectadas con PYVV .71 Plantas de S. tuberosum Grupo Phureja libres de virus ..................................72

7.2.2 Transmisión de PYVV por vector natural T. vaporariorum (Westwood) 72 Cria de mosca blanca .....................................................................................72 Obtención del vector virulífero ........................................................................72 Ensayos de transmisión .................................................................................72

7.2.3 Extracción de RNA ..............................................................................73 Extracción de RNA del vector natural .............................................................73 Extracción de RNA vegetal .............................................................................73

7.2.4 Detección de PYVV por RT-PCR y qPCR ............................................74 Síntesis de cDNA ...........................................................................................74 PCR ...............................................................................................................74 PCR en tiempo real ........................................................................................75 Curva estándar para la cuantificación absoluta ..............................................76

7.2.5 Análisis Estadísticos ............................................................................77 7.3 Resultados .....................................................................................................78

7.3.1 Transmisión de PYVV utilizando el vector natural ................................78

Contenido XV

7.3.2 Detección del gen CP de PYVV por RT – PCR convencional en muestras de diferentes órganos de plantas transmitidas con PYVV por vector natural 79 7.3.3 PCR en tiempo real en diferentes órganos de plantas transmitidas con PYVV por vector natural .................................................................................... 81 7.3.4 Estimación del número de copias del gen CP de PYVV ...................... 82 7.3.5 Acumulación de PYVV en diferentes órganos de plantas con diferente grado de intensidad de la expresión de síntomas .............................................. 84

7.4 Discusión ....................................................................................................... 87 Agradecimientos ...................................................................................................... 92 Referencias .............................................................................................................. 92

8. Artículo 3. ................................................................................................................ 97 Resúmen .................................................................................................................. 97 8.1 Introducción ................................................................................................... 98 8.2 Materiales y Métodos ................................................................................... 100

8.2.1 Muestras de brotes de tubérculo y controles ..................................... 100 8.2.2 Extracción de RNA ............................................................................ 100 8.2.3 Pruebas basadas en PCR ................................................................. 100

Síntesis de cDNA ......................................................................................... 100 PCR ............................................................................................................. 101 PCR en tiempo real ..................................................................................... 101 Curva estándar para la cuantificación absoluta ............................................ 103

8.2.4 Análisis Estadísticos ......................................................................... 104 8.3 Resultados ................................................................................................... 104

8.3.1 RT – PCR y qPCR en muestras de brotes de tubérculo .................... 104 8.3.2 Estimación del número de copias del gen CP de PYVV en muestras de brote de tubérculo ........................................................................................... 105 8.3.3 Acumulación de PYVV en brotes de tubérculo provenientes de plantas sintomáticas y no sintomáticas ........................................................................ 107

8.4 Discusión ..................................................................................................... 109 Agradecimientos .................................................................................................... 112 Referencias ............................................................................................................ 112

9. Conclusiones y recomendaciones ...................................................................... 115 9.1 Conclusiones ............................................................................................... 115 9.2 Recomendaciones ....................................................................................... 117

Anexo A: Métodos de extracción de RNA ................................................................. 119 Anexo A.1: Extracción de RNA total con Trizol® (Invitrogen) .................................. 119

Anexo A.1.1 Extracción: .................................................................................. 119 Anexo A.1.2 Precipitación de RNA: ................................................................. 119

Anexo A.2: Extracción de RNA total con CTAB (López et al., 2006) ....................... 120 Anexo A.2.1 Composición de buffers:.............................................................. 120 Anexo A.2.2 Extracción: .................................................................................. 120 Anexo A.2.3 Precipitación: .............................................................................. 121

Anexo A.3: Extracción de dsRNA con fenol:cloroformo/Sephadex (Guzmán et al., 2006) 121

Anexo A.3.1 Composición de buffers:.............................................................. 121 Anexo A.3.2 Extracción: .................................................................................. 122 Anexo A.3.3 Purificación con columnas de Sephadex: .................................... 122

XVI Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja

Anexo A.4: SV Total RNA Isolation System (Promega) ........................................... 123

Anexo B: Cuantificación de RNA ................................................................................ 125 Anexo B.1: Cuantificación de RNA utilizando el kit Quant-iTTM RiboGreen Assay (Invitrogen).............................................................................................................. 125 Anexo B.2: Cuantificación de RNA por espectrofotometría a 260nm....................... 125

Anexo C: Estimación de la integridad de RNA .......................................................... 127 Anexo C.1 Gel de agarosa denaturante .................................................................. 127

Anexo C.1.1: Composición de buffers .............................................................. 127 Anexo C.1.2: Preparación del gel de agarosa denaturante .............................. 127 Anexo C.1.3: Denaturación de RNA ................................................................. 127 Anexo C.1.4: Cargar las muestras y correr la electroforesis ............................. 128

Anexo C.2: Determinación de la intensidad de las bandas para la estimación de la integridad del RNA .................................................................................................. 128

Anexo D. Reacciones de Amplificación ..................................................................... 129 Anexo D.1: Primers y sondas .................................................................................. 129 Anexo D.2: Retrotranscripción ................................................................................ 129 Anexo D.3: PCR ..................................................................................................... 130 Anexo D.4: qPCR.................................................................................................... 130

Anexo E. Transcripción in vitro .................................................................................. 133 Anexo E.1: Linearización del plásmido .................................................................... 133 Anexo E.2: Purificación del plásmido linearizado .................................................... 134 Anexo E.3: Transcripción in vitro ............................................................................. 135 Anexo E.4: Purificación de los transcritos ............................................................... 135 Anexo E.5: Tratamiento de los transcritos con DNasa I .......................................... 135

Anexo F. Resultados artículo 1. .................................................................................. 137 Anexo F.1: Determinación del rendimiento de los extractos de RNA....................... 137 Anexo F.2: Determinación de la calidad de los extractos de RNA y Resultados de RT-PCR .................................................................................................................. 141 Anexo F.3: Determinación de la integridad de los extractos de RNA....................... 146 Anexo F.5: Resúmen de resultados ........................................................................ 151 Anexo F.6: Resultados análisis estadísticos ........................................................... 151

Anexo F.6.1: Comparaciones entre métodos de extracción de RNA por órgano151 Anexo F.6.2: Efecto del órgano, el método de extracción y la interacción del órgano con el método de extracción en el rendimiento, calidad e integridad .... 153

Anexo G. Resultados artículo 2. ................................................................................. 155 Anexo G.1: Determinación del número de copias del gen CP de PYVV .................. 155 Anexo G.2: Resumen de resultados........................................................................ 159 Anexo G.3: Resultados análisis estadísticos ........................................................... 160

Anexo G.3.1: Comparación para evaluar el efecto del número de copias en RT-PCR 160 Anexo G.3.2: Comparación para evaluar la acumulación de PYVV en plantas con diferente grado de intensidad de la expresión de síntomas ....................... 160 Anexo G.3.3: Comparación para evaluar diferencias en el número de copias entre plantas con diferente grado de intensidad de expresión de síntomas ..... 161 Anexo G.3.4: Comparaciones entre órganos por planta ................................... 161

Contenido XVII

Anexo H. Resultados artículo 3. ................................................................................. 163 Anexo H.1: Determinación del número de copias del gen CP de PYVV en muestras de brote de tubérculo. ............................................................................................ 163 Anexo H.2: Resumen de resultados ....................................................................... 170

Anexo I. Presentaciones en congresos ..................................................................... 171 Anexo I.1: Resúmen presentación en el IV Simposio Nacional de Virología. Red Colombiana de Virología. Medellín, Colombia. 2011. ............................................. 171 Anexo I.2: Resumenes de presentaciónes en el XXV Congreso de la Asociación Latinoamericana de la Papa ALAP, Uberlandia, Brasil, 2012 ................................. 173

Bibliografía .................................................................................................................. 177

Lista de Figuras XVIII

Lista de Figuras

Pág. Figura 4-1. S. tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia. ................................ 9

Figura 4-2. Micrografía electrónica de partículas virales de PYVV. ................................. 12

Figura 4-3. Clasificación de la familia Closteroviridae. .................................................... 12

Figura 4-4. Sintomatología causada por PYVV ............................................................... 14

Figura 4-5. Formación de cuerpos de inclusión ............................................................... 15

Figura 4-6. Transmisión de PYVV a través de tubérculo ................................................. 15

Figura 4-7. Representación esquemática de los modos de transmisión por los vectores.16

Figura 4-8. T. vaporariorum (Mosca Blanca). .................................................................. 17

Figura 4-9. Distribución geográfica de PYVV, ................................................................. 18

Figura 4-10. Esquema representativo de la estructura genómica de PYVV .................... 19

Figura 4-11. Esquema representativo de la estructura de los D-RNAs de PYVV ............ 21

Figura 4-12. Modelo de la estructura secundaria para el UTR 3’ de los RNAs genómicos

de PYVV. ........................................................................................................................ 22

Figura 4-13 Cinética de la reacción de PCR en tiempo real. ........................................... 27

Figura 4-14. Curva estándar para la hacer cuantificación absoluta. ................................ 28

Figura 4-15. Cuantificación relativa ................................................................................. 29

Figura 4-16: Química de detección de SYBR® Green I.................................................... 30

Figura 4-17. Química de detección con Sondas TaqMan® ............................................. 31

Figura 4-18. Estructura de un molecular beacon.. ........................................................... 32

Figura 4-19. Hybridization probes ................................................................................... 33

Figura 4-20. Eclipse Probes ............................................................................................ 33

Figura 4-21. Amplifluor assay. ......................................................................................... 34

Figura 4-22. Scorpions primers. ...................................................................................... 35

Figura 4-23. LUX primers. ............................................................................................... 36

Figura 4-24. QZyme primers. .......................................................................................... 37

Figura 5-1. Esquema representativo primer objetivo. ...................................................... 42

Figura 5-2. Esquema representativo segundo objetivo. ................................................... 43

Figura 5-3. Esquema representativo tercer objetivo. ....................................................... 44

Figura 6-1. A. Distribución del rendimiento de RNA ........................................................ 54

Figura 6-2. Gel denaturante de agarosa 1%. .................................................................. 55

Figura 6-3. Gráficos del análisis de componentes principales. ........................................ 61

Figura 6-4. RT-PCR del gen de la proteína mayor de la cápside .................................... 62

Figura 6-5. Porcentaje de muestras RT-PCR positivas y RT-PCR negativas. ................. 63

Figura 7-1. Detección del gen de la proteína mayor de la cápside de PYVV por RT-PCR.

....................................................................................................................................... 79

Contenido XIX

Figura 7-2. Porcentaje de muestras RT-PCR positivas y RT-PCR negativas ................. 80

Figura 7-3. Curvas de amplificación obtenidas con la pareja de primers para COX. ....... 82

Figura 7-4. Curva estándar construida para la determinación del número de copias del

gen CP.. ......................................................................................................................... 83

Figura 7-5. Curvas de amplificación obtenidas con la pareja de primers para el gen de la

proteína mayor de la cápside de PYVV. ......................................................................... 84

Figura 7-6. Resultados de PCR en tiempo real para evaluar la acumulación del virus ... 85

Figura 7-7. Distribución de la carga viral en tres plantas con diferente grado de intensidad

de síntomas (No sintomático, Moderado y Severo). ....................................................... 86

Figura 8-1 .RT-PCR con la pareja de primers para la detección de la proteína mayor de la

cápside de PYVV ..........................................................................................................105

Figura 8-2. Estimación de la carga viral de PYVV en muestras de brotes de tubérculo. 106

Figura 8-3. Curvas de amplificación de brotes de tubérculo derivados de plantas

sintomáticas y no sintomáticas. .....................................................................................107

Lista de Tablas XX

Lista de tablas

Pág. Tabla 4-1: Genes codificados por PYVV y su posible función ......................................... 20

Tabla 5-1. Artículos planteados para la presentación de metodología, resultados y

discusión. ........................................................................................................................ 41

Tabla 6-1 Muestras utilizadas para hacer la evaluación de los métodos de extracción por

órgano ............................................................................................................................ 49

Tabla 6-2. Primers para la amplificación del gen completo de la proteína mayor de la

cápside de PYVV. ........................................................................................................... 51

Tabla 6-3. Resúmen de resultados de los parámetros evaluados para cada método de

extracción ....................................................................................................................... 53

Tabla 6-4. Efecto del órgano, método de extracción de RNA y su interacción en el

rendimiento, calidad e integridad .................................................................................... 57

Tabla 6-5. Diferencias entre los tres métodos de extracción ........................................... 57

Tabla 7-1. Muestras analizadas para evaluar la acumulación del virus en diferentes

órganos de plantas infectadas ........................................................................................ 74

Tabla 7-2. Primers para la amplificación del gen completo de la proteína de la cápside de

PYVV. ............................................................................................................................. 75

Tabla 7-3. Secuencias de los primers y sondas que se utilizaron en los ensayos de qPCR

....................................................................................................................................... 76

Tabla 7-4. Valores de p del contraste entre los órganos de la planta con sintomatología

moderada. Las celdas en negrilla corresponden a las parejas que presentaron diferencias

estadísticamente significativas (p<0.05). ......................................................................... 86

Tabla 7-5. Valores de p del contraste entre los órganos de la planta con sintomatología

severa. Las celdas en negrilla corresponden a las parejas que presentaron diferencias

estadísticamente significativas (p<0.05). ......................................................................... 86

Tabla 8-1. Muestras analizadas por RT-PCR y qPCR ................................................... 100

Tabla 8-2. Primers para la amplificación del gen completo de la proteína mayor de la

cápside de PYVV. ......................................................................................................... 101


..................................................................................................................................... 102

Tabla 8-4. Comparaciones para evaluar la acumulación de PYVV en las muestras de

tubérculo. ...................................................................................................................... 108

Lista de Abreviaturas XXI

Lista de abreviaturas

Abreviatura Término

APMoV Andean potato mottle virus cDNA DNA complementaria CERV Carnation etched ring virus

CEVIPAPA Centro de Desarrollo Tecnológico de la Cadena Agroalimentaria de la Papa

CIP Centro Internacional de la Papa COX Citocromo oxidasa CP Proteína mayor de la cápside CPm Proteína menor de la cápside o divergente Ct Cycle threshold CTAB Bromuro de hexadecil trimetil amonio CTV Citrus tristeza virus CVMV Carnation vein mottle virus CV% Porcentaje del coeficiente de variación dpt Días post-transmisión D-RNAs RNAs Defectivos DI-RNAs RNAs Defectivos Interferentes EDTA Ácido etilendiaminotetraacético ES Error estándar Fedepapa Federación Colombiana de Productores de Papa FRET Fluorescence Resonance Energy Transference GLaV Grapevine leafroll associated virus gRNA RNA genómico GTC Isotiocinato de guanidina HEL Helicasa Hsp70h Proteína homóloga a la proteina de choque térmico 70 IBUN Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia IMI Inmunoimpresión de tejido IVMV Ipomoea vein mosaic virus LCV Lettuce clorosis virus LIYV Lettuce infectious yellows virus L-Pro Dominio Proteasa M Sintomatología Moderada MADR Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural MMLV Moloney murine leukemia virus MTR Metiltransferasa MVBaV Mint vein banding associated virus NASH Nucleic acid spot hybridization NS No sintomática NS+ Planta no sintomática RT - PCR positivo NS- Planta no sintomática RT - PCR negativo

XXII Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja

Abreviatura Término

OD Densidad óptica OEPP-EPPO European and Mediterranean Plant Protection Organization ORF Open reading frame PCR Reacción en cadena de la polimerasa PLRV Potato leafroll virus PMTV Potato mop top virus PPIS Plant Protection and Inspection Services PPO Polifenol oxidasa PVA Potato virus A PVM Potato virus M PVS Potato virus S PVX Potato virus X PVY Potato virus Y PYVD Potato yellow vein disease PYVV Potato yellow vein virus qPCR PCR en tiempo real RdRp RNA polimerasa dependiente de RNA RFLPs Restriction Fragment Length Polymorphisms RT-PCR Retrotranscripción seguida de la reacción en cadena de la polimerasa S Sintomatología Severa S+ Planta sintomática RT - PCR positivo S- Planta sintomática RT - PCR negativo Sarkosyl Lauryl Sarcosyl de Sodio SDS Dodecil sulfato sódico SPCSV Sweet potato chlorotic stunt virus SPFMV Sweet potato feathery mottle virus SPLCV Sweet potato leaf curl virus SSCPs Single Strand Conformational Polymorphisms TICV Tomato infectious chlorosis virus TRV Tobacco rattle virus UMNG Universidad Militar Nueva Granada Unal Universidad Nacional de Colombia

USDA-APHIS United States Department of Agriculture – Animal and Plant Health Inspection Service

UTR Región notraducible ó untranslated region

Introducción

PYVV o virus del amarillamiento de las nervaduras de la hoja de la papa, hace parte de la

familia Closteroviridae y es una especie del género Crinivirus (Martelli et al., 2011;

Livieratos et al., 2004). La enfermedad causada por este virus (PYVD, Potato yellow vein

disease) fue observada hacia los años 50 en Antioquia (Colombia) (Alba, 1950), pero con

el incremento de las poblaciones de su vector (Trialeurodes vaporariorum, Westwood)

(Buriticá, 1971) y del transporte indiscriminado de germoplasma, el virus se ha

dispersado en diferentes regiones de Colombia y en países vecinos como Venezuela,

Ecuador y Perú (Salazar et al., 2000). Este virus es re-emergente (Müller et al., 2004) y

puede ocasionar pérdidas en la producción que pueden ir desde 25% en Solanum

tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia (Guzmán et al., 2011) hasta un 50%

o más en el Grupo Andígena variedad Diacol Capiro (Salazar et al., 2000), por dicha

razón ha sido considerado un patógeno cuarentenario en Europa y Estados Unidos por

algunas agencias fitosanitarias como OEPP-EPPO (European and Mediterranean Plant

Protection Organization) y USDA - APHIS (United States Department of Agriculture -

Animal and Plant Health Inspection Service) (OEPP/EPPO, 1979; USDA – APHIS, 2000).

Salazar et al. (2000) reportaron los primeros estudios sobre la morfología de PYVV en

donde se encontró que el virus es filamentoso y limitado al floema y también realizaron

algunos análisis moleculares basados en NASH (Nucleic acid spot hybridization) y RT-

PCR (retrotranscripción – reacción en cadena de la polimerasa). La detección de este

virus por RT-PCR también ha sido reportada por Offei et al. (2004) y Guzmán et al.

(2012). La primera secuencia completa del virus fue obtenida por Livieratos et al. (2004)

indicando que PYVV tiene un genoma tripartita con RNA de cadena sencilla de sentido

positivo y más tarde Eliasco et al. (2006) encontró que el genoma también cuenta con

dos RNAs defectivos (D-RNAs).

Algunos estudios han informado la presencia de algunas plantas que no expresan

síntomas en las que por medio de técnicas moleculares se ha detectado la presencia del

2 Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja

Introducción

virus en material foliar (Salazar et al., 2000; Arciniegas, 2003; CIP, 2003; Guzmán et al.,

2006; Vargas et al., 2010a; Guzmán y Rodríguez, 2010).

Hasta el momento no se ha estudiado si PYVV está presente en todos los órganos de la

planta, ni cómo es la distribución en plantas infectadas, siendo de especial interés

analizar cómo se distribuye PYVV en los tubérculos (semilla) de plantas infectadas,

debido a que este virus puede trasmitirse vegetativamente a partir de semilla, siendo este

uno de los factores que podría favorecer la dispersión de PYVV. Además se ha

observado que a partir de tubérculos (semilla) provenientes de plantas que expresan

síntomas se pueden obtener plantas que no expresan síntomas y viceversa (Salazar et

al., 2000; Guzmán y Rodríguez, 2010); aún es desconocida la razón por la que se puede

presentar este fenómeno, puede deberse a varios factores, se ha planteado que esto

puede ser debido a latencia viral o por resistencia, por lo tanto, a pesar de que estas

están infectadas por el virus no expresan síntomas (Salazar et al., 2000; Arciniegas,

2003; Vargas et al., 2010a); esto también podría ser explicado por una distribución

heterogénea del virus en los tubérculos lo que podría ser causa de que algunas plantas

provenientes de plantas sintomáticas puedan expresar síntomas mientras que otras no y

viceversa (Guzmán y Rodríguez, 2010). En el cultivo de papa esta situación es

impredecible y aumenta los riesgos de utilizar tubérculos-semilla infectados y sus

posteriores efectos para la producción.

Hasta el momento no existen estudios sobre la distribución de PYVV en diferentes

órganos por lo que la propuesta del presente proyecto es analizar foliolos, flores, raíz,

tallo, pedúnculo floral, pétalos, peciolo, antera y brotes de tubérculo provenientes de

plantas de S. tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia infectadas con el virus

para lo cual se utilizó la técnica de qRT-PCR.

La técnica de qRT-PCR para la detección de PYVV fue reportada inicialmente por López

et al. (2006) para la detección del virus en muestras de foliolo y Hernández et al. (2010)

la adaptaron preliminarmente para la detección de PYVV en muestras de brotes de

tubérculo. Por lo tanto, con este trabajo además de determinar cómo es la distribución del

virus en diferentes órganos de las plantas infectadas, se busca proporcionar información

sobre el uso de qRT-PCR para estudios de detección de PYVV, información que resulta

útil en programas de fitomejoramiento, certificación de semillas y en programas de

indexación.

1. Justificación

El cultivo de la papa es un alimento muy popular no sólo en este país si no en todo el

mundo formando parte fundamental de la alimentación a nivel mundial. En el 2011 el

cultivo se ubicó en el sexto lugar a nivel de producción nacional, y a pesar de que solo

una pequeña parte de la producción de papa entra en el comercio internacional y el

consumo interno se ha reducido durante los últimos años, es una actividad agropecuaria

que genera ingresos y empleos en varias regiones de este país, incluyendo

aproximadamente 90.000 familias que se benefician de las labores del cultivo (MADR,

2011).

Este cultivo se ha visto afectado por varios patógenos, dentro de los que se encuentran

algunos virus re-emergentes como PYVV (Müller et al., 2004) el cual es endémico de

Colombia (Salazar et al., 2000). Debido a la gran importancia de este cultivo en este país

y en la región Andina, además del efecto sobre la reducción de la productividad que tiene

PYVV en plantas infectadas (Salazar et al., 2000), es importante continuar con estudios

sobre este virus para aportar al conocimiento en algunos aspectos hasta el momento no

informados en la literatura científica, como es la distribución del virus en la planta.

Salazar et al. (2000) y Guzmán et al. (2011) han reportado la presencia de plantas no

sintomáticas derivadas de tubérculos de plantas sintomáticas. Por otro lado, López et al.

(2006) han sugerido que es posible que la distribución del virus en los tubérculos pueda

ser heterogénea, lo cual también podría presentarse en los demás órganos de plantas

infectadas.

Teniendo en cuenta que el virus está limitado al floema, se transmite vegetativamente de

manera masiva a través de tubérculo (semilla) y por vector natural (T. vaporariorum)

(Salazar et al., 2000), además de que se ha informado la presencia del virus en algunas

plantas que no expresan síntomas (Salazar et al., 2000; Franco-Lara et al,. 2009;

Guzmán et al., 2011; 2012), surge la pregunta de cómo es la distribución (homogénea o

heterogénea) del PYVV en muestras de semilla y en los diferentes órganos de una planta


infectada. Por tal razón, la propuesta del presente proyecto es analizar la acumulación de

PYVV utilizando la técnica qRT-PCR en aislamientos virales de muestras de foliolo,

peciolo, pedúnculo floral, antera, pétalo, tallo, flor, y tubérculo (diferentes brotes de un

tubérculo) provenientes de plantas de S. tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla

Colombia infectadas con PYVV.

Para cumplir con el objetivo se utilizó la técnica de qRT-PCR la cual permite hacer una

estimación precisa de la acumulación del virus en diferentes órganos de las plantas

infectadas, lo que no se logra con otras técnicas que son cualitativas (RT - PCR,

hibridaciones, secuenciación). Estudios que reporten el uso de esta técnica en PYVV son

escasos, (López et al., 2006; Hernández et al., 2010) y se ha utilizado con fines de

detección. En este trabajo se propone usar qRT-PCR como una herramienta útil en la

detección y en estudios sobre aspectos biológicos del virus, como por ejemplo, la

acumulación del virus dentro de plantas infectadas, la dispersión viral a partir de semilla-

tubérculo (transmisión vegetativa) y a través del vector natural. Además permite hacer la

detección de cargas virales bajas en diferentes órganos de plantas infectadas con el

virus, y en plantas que no expresan síntomas.

La información resultante es de interés para seleccionar órganos en procesos de

diagnóstico viral, para apoyar programas de cuarentena, programas de certificación de

semillas, de fitomejoramiento y para estudios de la biología y dinámica viral y de la

interrelación del virus con el hospedero y el vector.

2. Hipótesis

1. Es posible detectar PYVV en diferentes órganos de plantas de S. tuberosum

Grupo Phureja variedad Criolla Colombia infectadas con PYVV debido a que este

es limitado al floema (Salazar et al., 2000).

2. Algunos autores como Salazar et al. (2000) y Guzmán et al. (2011) han reportado

que a partir de plantas sintomáticas es posible obtener una progenie conformada

por plantas sintomáticas y no sintomáticas lo que sugiere que la distribución del

virus en tuberculos es heterogénea.

3. Las plantas de S. tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia infectadas

con PYVV presentan una acumulación y distribución heterogénea del virus en

diferentes órganos de plantas infectadas.

3. Objetivos

3.1 Objetivo general

Evaluar la distribución y acumulación (carga viral) del PYVV en tubérculos y otros

órganos de plantas de S. tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia infectadas

con el virus.

3.2 Objetivos específicos

1. Comparar métodos de extracción de RNA viral en diferentes órganos de plantas

de S. tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia infectadas con PYVV.

2. Determinar la carga viral de PYVV en un grupo de muestras de brotes de

tubérculos de plantas de S. tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia

infectadas con el virus.

3. Evaluar la distribución-carga viral de PYVV en diferentes órganos de plantas de S.

tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia infectadas con el virus.

4. Marco teórico

4.1 El cultivo de la papa

La papa (Solanum spp, Figura 4-1B) (Reino: Plantae¸ División: Magnoliópsida, Órden:

Solanales, Familia: Solanaceae, Género: Solanum), es originaria de América del Sur y

cultivada en todo el mundo por sus tubérculos comestibles (Estrada, 2000); este es uno

de los cultivos alimenticios que se ha venido expandiendo, en el año 2010 se ubicó como

el quinto alimento con mayor producción a nivel mundial después de la caña de azúcar,

maíz, arroz, y trigo (FAOSTAT, 2012).

Hacia 1990 la papa era producida y consumida en Europa, América del Norte y en los

países de la antigua Unión Soviética; desde entonces se ha incrementado la producción

y demanda de papa en otras regiones como Asia, África y América Latina. En 1991 la

producción mundial de papa era de 267.99 millones de toneladas y para el 2009 se

incremento a 317.25 millones de toneladas (FAOSTAT, 2012); en Colombia se ha

reportado que para el año 2010 se cultivaron 138.631 hectáreas con una producción de

2.652.449 toneladas (Villarreal, 2011, tomado de Ñustez, 2011).

Figura 4-1. S. tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia (papa criolla). A. Cultivo. B.

Planta.


Dentro de las variedades de papa que se producen en Colombia, la papa criolla (S.

tuberosum Grupo Phureja) (Figura 4-1A). Anteriormente clasificada como Solanum

phureja, pero recientemente ubicada como el Grupo Phureja dentro de la especie

Solanum tuberosum (Huamán y Spooner, 2002). El cultivo de la papa criolla en Colombia

se desarrolla a pequeña escala, para el 2009 del área total de papa sembrada en

Colombia (134.640 hectáreas), solamente el 5.9% corresponde a papa criolla (Villarreal,

2011; tomado de Ñustez, 2011); esto es debido a que este cultivo es más susceptible a

las heladas, a los problemas fitosanitarios y además presenta una alta perecebilidad

post-cosecha debido a que sus tubérculos no presentan dormancia (Ardila y Luis, 2009).

A pesar de lo anterior, Colombia es le primer productor mundial de papa criolla, se

siembra en promedio unas 8.500 hectáreas y se cosecha cerca de 100.000 toneladas por

año, especialmente en los departamentos de Cundinamarca, Nariño y Boyacá (Consejo

Nacional de la Papa, 2010) y se realizan exportaciones cercanas a 1000 toneladas por

año (Fedepapa, 2010).

4.1.1 Plagas y enfermedades de la papa criolla

Debido a que se produce vegetativamente a través de tubérculo, todos los grupos de

patógenos tienen una alta importancia económica. Las pérdidas estimadas para

patógenos, virus, pestes, y malezas entre 1996 – 1998 fue del 22%, 8%, 18% y 23%

respectivamente (Oerke y Dehne, 2004).

El cultivo de la papa criolla es más susceptible al ataque de plagas y enfermedades que

el de la papa común, por lo tanto es necesario tomar medidas preventivas a tiempo, una

de estas es la rotación de cultivos con otras especies agrícolas (otras variedades de

papa, trigo, zanahoria, arveja, cebada, calabaza, haba, maíz, fríjol, ajo, brócoli, caléndula,

coliflor, repollo y pastos); de la misma manera la presencia de cultivos asociados e

intercalados es fundamental para reducir la cantidad de inoculo de las enfermedades en

el campo (Estrada, 2000; Agronet, 2005).

La enfermedad de mayor incidencia en la papa es causada por la gota o tizón tardío cuyo

agente causal es el oomycete Phytophthora infestans el cual genera destrucción de hojas

y tubérculo durante la última fase de la infección manifestándose en necrosis de las

hojas, manchas y destrucción de tejido en los tubérculos (Estrada, 2000).

Marco Teórico 11

El cultivo de la papa criolla también es afectado por algunos hongos como:

Alternaria solani - tizón temprano ó mancha negra: Se manifiesta con manchas

necróticas en las hojas de color marrón a negro de diferentes tamaños y con anillos

concéntricos característicos que pueden juntarse. En los tubérculos las lesiones son

oscuras, hundidas, de forma circular e irregular (Estrada, 2000).

Rhizoctonia solani - sarna negra ó rhizoctoniasis: Frecuente en suelos fértiles, ácidos y

muy húmedos o con falta de drenaje. En la superficie de los tubérculos maduros se

forman esclerotos de color negro a castaño oscuro. Otros síntomas en los tubérculos

incluyen grietas, malformaciones, concavidades y necrosis en el extremo de unión con el

estolón (Estrada, 2000).

Los hongos y oomycetes no son los únicos agentes causales de enfermedades en papa

criolla algunas bacterias también pueden generar enfermedades en el cultivo dentro de

las que se encuentran:

Streptomyces scabies - sarna común: Afecta principalmente la calidad de los tubérculos

pero no su producción (Estrada, 2000).

Erwinia carotovora - podredumbre blanda: Enfermedad frecuente en ambientes húmedos.

Se manifiesta por la presencia de lesiones negras y secreciones muscilaginosas en el

tallo que van ascendiendo desde el tubérculo con pudrición blanda. Los tubérculos

nuevos se pudren a veces en el extremo del estolón (Estrada, 2000).

Por otro lado debido a su color claro, textura blanda y contenido alto de azúcares, la papa

criolla es muy susceptible al ataque de insectos (especialmente la polilla guatemalteca,

Tecia solanivora, y el gusano blanco, Premnotrypes vorax) (Estrada, 2000).

Las enfermedades causadas por virus constituyen uno de los factores que más afectan la

producción en el cultivo de la papa. Las virosis son las responsables primarias de la

degeneración gradual de las variedades, la cual se traduce principalmente en la pérdida

de rendimiento. En algunos casos los virus causan pérdidas cualitativas debido a la

reducción del valor de mercadeo y conservación de tubérculos. A nivel viral, los que

representan la principal amenaza para este cultivo son PVY, PVX, PLRV y PYVV

(Estrada, 2000; CIP, 2003; Müller et al., 2004).

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Escleroto&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Streptomyces_scabies&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/wiki/Estol%C3%B3n

http://es.wikipedia.org/wiki/Virus

http://es.wikipedia.org/wiki/Enfermedades_virales_de_la_papa


4.2 PYVV (Potato yellow vein virus)

4.2.1 Clasificación Taxonómica

PYVV pertenece al género Crinivirus, familia Closteroviridae (Martelli et al., 2011), el virus

presenta genoma tripartita es de RNA de cadena sencilla sentido positivo, con morfología

filamentosa (Figura 4-2), se localiza en el floema de la planta infectada. (Salazar et al.,

2000), y sus partículas son polares (tienen cabeza y cola) (Livieratos et al., 2002).

Figura 4-2. Micrografía electrónica de partículas virales de PYVV. La barra corresponde a 200nm (Tomada de Salazar et al., 2000).

Dependiendo del insecto vector, esta familia está dividida en tres géneros: Closterovirus

(Áfidos), Ampelovirus (Chinches) y Crinivirus (Mosca blanca) (Martelli et al., 2002) (Figura

4-3); además de algunos miembros sin género asignado como la especie MVBaV (Mint

vein banding associated virus) (Tzanetakis et al., 2005).

Figura 4-3. Clasificación de la familia Closteroviridae. Árbol filogenético construido con secuencias de las proteína homologa de choque térmico 70 (Hsp70h) con miembros de los tres géneros de la

Marco Teórico 13

familia. PYVV se encuentra dentro del género Crinivirus y es el miembro que está encerrado en el cuadro rojo (Modificado de Martelli et al., 2002).

Los miembros del género Closterovirus y Ampelovirus son monopartitas y los del género

Crinivirus son multipartitas. Los miembros del género Crinivirus son bipartitas, pero hasta

el momento PYVV ha sido reportado como el único tripartita de este género (Martelli et

al., 2010), este virus ha conservado un bloque marcador de genes característicos de la

familia Closteroviridae (Karasev, 2000; Martelli et al., 2002).

4.2.2 Síntomas causados por PYVV

Las plantas infectadas con el virus expresan inicialmente síntomas de amarillamiento en

la porción apical de las nervaduras terciarias de las hojas; generalmente solo se

observan unos pequeños puntos amarillos brillantes, pero a medida que avanza la

infección las nervaduras secundarias también se ven afectadas y al final de la

enfermedad la lámina foliar entre las venas también se vuelve amarilla; generalmente no

afecta las nervaduras primarias las cuales pueden permanecer verdes hasta que la

planta muere (Salazar et al., 2000) (Figura 4-4A, B y C). Los síntomas en hojas afectadas

secundariamente (producto del movimiento del virus a larga distancia) tienen el mismo

patrón de síntomas que los descritos anteriormente (Salazar et al., 2000).

Cuando la sintomatología aparece tempranamente, la planta entera puede llegar a verse

afectada. En algunos casos la remoción de las primeras hojas sintomáticas puede ser

suficiente para evitar la dispersión del virus a otras hojas, aunque hay que tener en

cuenta que hojas que no expresan síntomas pueden tener el virus (Salazar et al., 2000).

Otro de los síntomas que produce la infección por PYVV es la reducción en la producción

de tubérculos (Figura 4-4D), generalmente las plantas infectadas producen menos

tubérculos que las plantas sanas, en algunos casos puede darse una disminución de

hasta un 50% en S. tuberosum Grupo Tuberosum variedad Diacol Capiro (Salazar et al.,

2000); y en S. tuberosum Grupo Phureja hasta un 25% (Guzmán et al., 2011).


Figura 4-4. A. Síntoma de amarillamiento foliar por la infección por PYVV. B. Planta de S. tubersoum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia con síntomas de amarillamiento C. Cultivo de S. tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia ubicado en el municipio de Une (Cundinamarca) infectado con PYVV. D. En el panel izquierdo se observan los tubérculos producidos por una planta de S. tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia sana, en el panel derecho una planta infectada con PYVV (Figura Tomada de Vargas et al., 2010B).

Una de las características de la familia Closteroviridae es que son parásitos del floema

en donde inducen la formación de cuerpos de inclusión dentro de las células

acompañantes, estos cuerpos de inclusión incluyen membranas citoplasmáticas

vesiculadas dentro de las células del floema (Figura 4-5) (Medina et al., 2003; Rodríguez

et al., 2008). La presencia de estos depósitos se han relacionado con la obstaculización

de los haces vasculares lo que conduce a una alteración del metabolismo de la planta

(puede verse reflejado en algunos síntomas como enanismo) y de los cloroplastos (hojas

cloróticas) (Salazar et al., 2000).

Marco Teórico 15

Figura 4-5. Micrografía electrónica de tejido de Nicotiana benthamiana infectada con LIYV (Lettuce infectious yellows virus), miembro del género Crinivirus en donde se observan algunos cuerpos de inclusión. N: núcleo, IB: cuerpos de Inclusión. La barra corresponde a un tamaño de 0.73µm (Tomada Medina et al., 1998).

4.2.3 Transmisión de PYVV

Transmisión por tubérculo

Uno de los aspectos a tener en cuenta para el control y manejo de la enfermedad

producida por PYVV es la transmisión vegetativa del virus a través de tubérculo-semilla,

debido a que este puede perpetuarse en el campo por el uso de semilla proveniente de

plantas infectadas. Según Salazar et al. (2000) y Guzmán et al. (2011) es posible tener

progenies sintomáticas cuando se utilizan tubérculos provenientes de plantas

sintomáticas, aunque dentro de esta progenie pueden encontrarse plantas no

sintomáticas. No se ha podido demostrar si la transmisión del virus puede darse a través

de la semilla sexual (Figura 4-6).

Figura 4-6. Transmisión de PYVV a través de tubérculo (Tomada de Salazar et al., 2000)


Transmisión mecánica y por injerto

PYVV es transmitido fácilmente por injerto de tallo aéreo y subterráneo; Salazar et al.

(2000) tuvieron éxito en ensayos de transmisión del virus por injerto, después de un mes

el virus pudo ser recuperado por back grafting en plantas de papa y además resultaron

positivas por NASH, pero los ensayos de transmisión mecánica no fueron positivos.

Transmisión por vector natural, mosca blanca (T. vaporariorum)

La transmisión de los virus de la familia Closteroviridae se da por insectos homópteros

cuya transmisión es semipersistente (Karasev, 2000), lo que implica una asociación

temporal entre el virus y el vector, el virus puede ser adquirido en un determinado periodo

de tiempo que puede ser corto (10 minutos para algunos virus como LCV, Lettuce

clorosis virus; SPCSV, Sweet potato chlorotic spot virus; TICV, Tomato infectious

chlorotic virus), pueden ser retenidos en las moscas durante algunas horas como en el

caso de PYVV hasta algunos días (el periodo de tiempo depende del virus), existiendo

una correlación entre el periodo de adquisición, el de inoculación y el de transmisión

(Figura 4-7). A pesar de esta correlación, el virus solo es retenido en el aparato digestivo

del vector sin atravesar las barreras hematoencefálicas y sin replicarse dentro del vector

(Hull, 2002). En la actualidad no está bien descrito cuales son los determinantes

moleculares (proteínas virales) que están relacionados con la transmisión por vector

natural de miembros del género Crinivirus, pero se sabe que la adquisición e inoculación

están asociados con la alimentación por parte del vector en tejido floemático (Johnson et

al., 2002) y no parece haber implicación de proteínas no estructurales de origen viral

(Tian et al., 1999)

Figura 4-7. Representación esquemática de los modos de transmisión por los vectores. NC: Virus transmitidos de una manera no circulativa (no persistente), estos se restringen al aparato bucal

Marco Teórico 17

(negro); C: virus transmitidos de una manera circulativa (semi-persistente, verde) entran al hemoceloma (amarillo), no se replican dentro del vector y generalmente entran a las glándulas salivares desde la hemolinfa; P: virus transmitidos de manera propagativa (persistente, rojo), estos se replican dentro del vector (Tomada de Froissart et al., 2010).

Vega (1970), fue el primero en demostrar que la transmisión del agente causal de la

enfermedad del amarillamiento de las nervaduras de la hoja de la papa era T.

vaporariorum (Figura 4-8), lo cual fue confirmado posteriormente por varios autores

(Buriticá, 1971; Tamayo y Navarro, 1984; Chuquillanqui y Müller, 2002; Gamarra, 2002;

Arciniegas, 2003). Tanto en el trabajo de Alba (1952) como en el de Vega (1970) se

confirmó que el virus no podía ser transmitido por áfidos como algunos miembros de la

familia Closteroviridae.

Figura 4-8. T. vaporariorum (Mosca Blanca). En las tres primeras fotografías se pueden observar algunos estadios del ciclo de vida de la mosca blanca, y en la última el envés de una hoja con mosca blanca (Tomada de PPIS, Plant Protection and Inspection Services, 2009)

Recientemente la incidencia de PYVD ha incrementado debido a varios factores dentro

de los que se encuentra la falta de uso de semilla certificada, el transporte indiscriminado

de material vegetal y también a que las poblaciones de mosca blanca han incrementado

contribuyendo con la dispersión de la enfermedad (Zapata et al., 2004). En la figura 4-9

se muestra los países en los que se ha reportado PYVV (Colombia, Perú, Ecuador y

Venezuela) (Salazar et al., 2000).


Figura 4-9. Distribución geográfica de PYVV, los círculos rojos vacios indican que en esos países el virus solo está presente en algunas áreas. (Tomado de OEPP-EPPO, 2006).

4.2.4 Genoma

PYVV se caracteriza por presentar un genoma tripartita (Figura 4-10) de RNA de cadena

sencilla de sentido positivo, de aproximadamente 17kb en donde se encuentran

codificados 10ORFs (Livieratos et al., 2004).

El RNA1 (8035pb) contiene el modulo de replicación que codifica para: un dominio

proteasa similar a Papaina (L – Pro), un dominio metiltransferasa (MTR) y un dominio

helicasa (HEL) que conformarían el marco de lectura abierto 1a (ORF 1a); una RNA

polimerasa dependiente de RNA (RdRp) que corresponde al ORF 1b y el ORF2 que

corresponde a un marco de lectura abierto adicional (p7) que corresponde a una

pequeña proteína hidrofóbica.

En los RNAs 2 y 3 se encuentran repartidos un arreglo de genes altamente conservados

que son característicos de la familia Closteroviridae que está conformado por: los ORFs

Hsp70h, p60, p10, CP, CPm y p26. El RNA 2 (5339pb) contiene 5 ORFs , el primer ORF

corresponde a la proteína homóloga a la proteína de choque térmico (Hsp70h), la familia

Closteroviridae es la única familia de virus que tiene la proteína Hsp70h y se cree que es

Marco Teórico 19

producto de la incorporación de secuencias del hospedero (Martelli et al., 2002); una

proteína pequeña de 6.8KDa (p7, ORF 2), el ORF 3 que corresponde a la proteína p60

que es homóloga a la de otros miembros de los géneros Clostero - y Crinivirus, la cual ha

mostrado dominios similares a CP en otros miembros de la familia Closteroviridae, el

ORF 4 que es la proteína p10 la cual no tiene similaridad con ninguna secuencia

reportada, es única del género Crinivirus, y ORF 5 que codifica para la proteína de la

cápside de 28.2KDa.

Figura 4-10. Esquema representativo de la estructura genómica de PYVV (Tomado de Livieratos et al., 2004).

El RNA 3 (3892pb) tiene tres ORFs, el ORF 1 corresponde a la proteína p4 la cual no

tiene homología con ninguna secuencia ni contraparte con otra proteína de la familia

Closteroviridae, el ORF 2 a la proteína de cápside menor ó divergente (CPm), proteína

que le da una forma similar a un cascabel de serpiente a las partículas virales y el ORF 3

codifica una proteína única del género Crinivirus (Tabla 4-1) (Livieratos et al., 2004).


Tabla 4-1: Genes codificados por PYVV y su posible función

RNA ORF Tamaño

(KDa) Gen Proteína Función putativa

1

1ª 226

L-Pro Proteína similar a papaína

Procesamiento de poliproteínas Transporte de virus a larga distancia Replicación del RNA

MTR Metiltransferasa Replicación del RNA

HEL Helicasa Replicación del RNA

1b 59 RdRp RNA polimerasa dependiente de RNA

Replicación del RNA

2 7 p7 Proteína p7 Movimiento de virus célula a célula

2

1 62.3 Hsp70h Proteína homóloga a la de choque térmico

Ensamblaje de las partículas virales Movimiento de virus Estabilidad del virión

2 6.8 p7 Proteína p7 Movimiento del virus célula a célula

3 60 p60 Proteína p60 Ensamblaje de la cola del virión Movimiento del virus

4 9.8 p10 Proteína p10 Función desconocida (única del género Crinivirus)

5 28.2 CP Proteína de la cápside Ensamblaje de las partículas virales Protección del genoma

3

1 4 p4 Proteína p4 Función desconocida

2 77.5 CPm Proteína de la cápside menor ó divergente

Ensamblaje de las partículas virales Movimiento célula a células Transmisión del virus por el vector

3 26.4 p26 Proteína p26 Única del género Crinivirus Movimiento del virus

D-RNAs (RNAs Defectivos)

D-RNAs son formas delecionadas de los RNAs genómicos que retienen las señales de

replicación (UTR 5’ y 3’) y son generados por un mecanismo de recombinación (Rubio et

al., 2000 y 2002).

Aún no se conoce cuál es la importancia biológica de los D-RNAs, no se sabe si ellos son

útiles para los virus, si afectan el proceso infeccioso, o simplemente son productos de

errores durante la recombinación genética (Simon y Bujarski, 1994; Roossinck, 1997), lo

único que se sabe es que son el producto de eventos de recombinación, mecanismo que

le confiere mejor adaptabilidad al virus y una mayor diversidad genética, esta debe ser

una estrategia muy importante para la familia Closteroviridae debido a que presentan un

genoma grande, por recombinación se reduciría el riesgo de acumulación de mutaciones

deletéreas (Rubio et al,. 2000 y 2002).

Los D-RNAs son incapaces de replicarse en la ausencia del tipo silvestre o de un virus

helper que proveerá las funciones perdidas debidas al evento de recombinación, pero los

Marco Teórico 21

defectivos deben tener por lo menos las señales necesarias para que la polimerasa

pueda reconocerlo y se pueda llevar a cabo su replicación, la replicación del virus helper

o del virus de tipo silvestre a veces es menos eficiente debido a que los D-RNAs

compiten por las funciones de las que este carece, estos RNAs son conocidos como

RNAs defectivos interferentes (DI-RNA) (Roossinck, 1997). Dentro de la familia

Closteroviridae se ha observado que aparentemente los D-RNAs no interfieren con la

acumulación de los RNAs genómicos (Rubio et al., 2000 y 2002).

En PYVV, además de los tres RNAs genómicos (gRNA), su genoma cuenta con dos

RNAs adicionales de menor peso y cumplen con las características de RNAs defectivos

nombrados como DRNA A ó DRNA x (2082nt) y DRNA B ó DRNA y (1802nt) (Livieratos

et al., 2004) (Figura 4-11B). Estos se caracterizan por estar conformados por mezcla de

secuencias de los RNAs genómicos (principalmente de los extremos 3’ y 5’, Figura 4-

11A) y son conocidos como RNAs defectivos (Eliasco et al., 2006).

Ambos defectivos se caracterizan por presentar una composición rica en A/U (D-RNA x

67 % y D-RNA y 65%), el extremo 5’ de ambos proviene del extremo 5’ del RNA 1 (85%

de identidad) y el extremo 3’ de los dos proviene del UTR 3’ del RNA 3 (92% de

identidad) (Figura 4-11A). Predicciones de estructuras secundarias mostraron que las

estructuras putativas y las señales, tales como las involucradas en replicación y

posiblemente en encapsidación (Figura 4-12) fueron retenidas con menores variaciones

de secuencia al compararlas con las de RNA genómico (Eliasco et al., 2006).

Figura 4-11. A. Esquema representativo de la estructura de los D-RNAs de PYVV (Tomado de Eliasco et al, 2006) B. Gel de agarosa de una preparación de dsRNA de una planta infectada con PYVV, la línea 1 es el marcador de peso molecular y la línea 2 es la planta infectada (Modificado de Livieratos et al., 2004).

Genómicos

Defectivos

A B


Con respecto a los sitios de unión de los extremos 3’ y 5’ de ambos D-RNAs no se

encontró alguna repetición o secuencia de origen no viral como se observa en otros virus

como el Citrus tristeza virus (CTV). Las intersecciones de ambos RNAs parecen ser

mezclas de todos los RNAs genómicos (Figura 4-11A) (Eliasco et al, 2006).

Figura 4-12. Modelo de la estructura secundaria para el UTR 3’ de los RNAs genómicos de PYVV. La estructura está formada por cuatro stem loops (hpI –hpIV) (estructura típica en miembros del género Crinivirus), este tipo de estructura puede estar involucrada en procesos de replicación, empaquetamiento y traducción (Tomado de Livieratos et al., 2004).

4.2.5 Antecedentes: Estudios moleculares en PYVV

Hasta el momento hay poca información para este virus, los trabajos más relevantes en

los que se ha estudiado PYVV inician con Alba hacia 1950 los cuales se basan en la

expresión de síntomas en campo, y solamente hasta el año 2000 Salazar et al. hicieron

los primeros análisis moleculares de PYVV, en este trabajo se obtuvieron las primeras

microfotografías electrónicas de partículas virales y se dilucidaron algunos aspectos

básicos del virus como por ejemplo su distribución geográfica, transmisión y efectos

sobre la producción, parte de estos estudios fueron retomados en el 2003 por Arciniegas.

Salazar et al. (2000); Arciniegas (2003) y Guzmán et al. (2011) reportaron la presencia de

plantas que no expresaban síntomas en las que se pudo detectar el virus por pruebas

moleculares (RT - PCR y NASH).

En el año 2002, Livieratos et al. identificaron que el virus presentaba una proteína menor

de la cápside (CPm) razón por la cual PYVV tiene una estructura similar a la de una

serpiente de cascabel, presentando partículas con cabeza y cola. Hasta el año 2004,

Livieratos et al. obtuvieron la primera secuencia completa del genoma tripartita de PYVV,

año en el cual también se hicieron estudios de variabilidad del virus utilizando la técnica

de SSCPs (Single Strand Conformational Polymorphism) (Offei et al., 2004), en este

estudio se evaluaron los genes de la proteína mayor de la cápside (CP), la proteína

Marco Teórico 23

homóloga de choque térmico 70 (Hsp70h) y la región N-terminal del ORF p60, los

resultados de este estudio indicaron que había poca diversidad genética entre los

aislados de PYVV de Perú y Colombia (Offei et al., 2004), dos años más adelante

Guzmán et al. (2006) también reportaron un estudio de variabilidad basado en RFLPs

(Restriction Fragment Lenght Polymorphism) en el cual detectaron mayor variabilidad del

gen CP. Eliasco et al. (2006) informaron de la presencia de RNAs defectivos asociados

con este virus que parecerían ser el producto de eventos de recombinación genética

errónea. Además de los estudios mencionados anteriormente se han realizado otros

trabajos en este virus que se han basado en la detección de PYVV utilizando técnicas

como RT – PCR (Rodríguez et al., 2008 Guzmán et al., 2008 y 2009A; Wei et al., 2009).

Otros trabajos han reportado la susceptibilidad o tolerancia en accesiones colombianas

de S. tuberosum Grupo Phureja (Arciniegas, 2003; Guzmán et al., 2003 y 2009b; Vargas

et al., 2010b; Guzmán y Rodríguez, 2010). También se ha evaluado los efectos de PYVV

en los cultivos afectados en donde se ha observado una relación entre la infección del

virus con una reducción en la producción de los cultivos infectados (Salazar et al., 2000;

Vargas et al. 2010b); prevalencia de la enfermedad (Franco – Lara et al., 2009; Guzmán

y Rodríguez, 2010); transmisión (Chuquillanqui y Müller, 2002; Gamarra; 2002;

Arciniegas et al., 2003) y variabilidad (Rodríguez et al., 2009; Cubillos et al., 2010).

4.3 Extracción de RNA vegetal

Para la obtención de RNA de virus de plantas es necesario hacer una extracción del

material vegetal, en donde se encontrará una mezcla de RNA de la planta y del virus (ó

virus) que infectan la planta.

La obtención de RNA de alta calidad y en cantidades adecuadas es un paso crítico en

experimentos basados en reacciones de amplificación. Pero este procedimiento no es

muy fácil en tejidos vegetales debido a la presencia de paredes celulares y de algunos

compuestos polifenólicos, proteínas, carbohidratos de alto peso molecular, pigmentos,

metabolitos secundarios, entre otros que son inhibidores de las reacciones de

amplificación (Claros y Canovas, 1998; Kim y Hamada, 2005). En la actualidad hay una

gran cantidad de métodos de extracción que van desde protocolos de extracción hasta

kits comerciales que permiten la extracción de RNA vegetal.


Los protocolos de extracción de RNA esta divido en dos fases: la inicial que implica la

ruptura de tejidos y extracción de ácidos nucleicos , y la última fase de precipitación

diferencial de RNA.

4.3.1 Ruptura del tejido y extracción

Es el primer paso en el proceso y posiblemente uno de los más críticos para la obtención

de RNA de alta calidad y con un buen rendimiento. En plantas este proceso es difícil

debido a la composición de la pared celular, esta debe ser rota por acción mecánica para

lo cual se pulveriza el material vegetal utilizando nitrógeno líquido, para la extracción de

todo el contenido intracelular.

Posteriormente, se deben destruir las membranas celulares de manera que los ácidos

nucleicos acompañados de otras sustancias quedan expuestos para su posterior

extracción (Velazco, 2005), En esta fase se utilizan soluciones que pueden estar

compuestas por:

- Sales caotrópicas que destruyen rápidamente las membranas celulares, esto

también se puede lograr con la utilización de detergentes, (ex. CTAB que es un

detergente catiónico). La actividad de estas moléculas también contribuye con la

denaturación de proteínas (Sambrook et al., 1989).

- Un agente quelante para la inactivación de las RNasas (John, 1992; Kiefer et al.,

2000), muchas nucleasas tienen como cofactor Mg2+, aunque hay que tener en

cuenta que también hay RNasas que no tienen cofactor; por lo tanto se ha utilizado

sustancias como el isotiocianato de guanidina (Trizol®) (Chomczynski, 1993), el cual

a ser un agente caotrópico también afecta la actividad de estas enzimas (Sambrook

et al., 1989).

- NaCl para evitar la contaminación de las muestras con polisacáridos, debido a que

estos presentan una solubilidad diferencial en altas concentraciones de NaCl

precipitándolos por centrifugación (Chang et al., 1993; Meisel et al., 2005). Esta sal

se utiliza en esta fase cuando se utilizan detergentes catiónicos para el rompimiento

de las membranas, con el objetivo de competir en las interacciones formadas entre

los grupos PO4- del RNA y el detergente.

Marco Teórico 25

- SDS para solubilizar las proteínas y membranas evitando que los ácidos nucleicos

se mezclen (Sambrook et al., 1989).

- Polivinil pirrolidona (PVP) ó polivinil polipirrolidona (PVPP) el cual evita la

contaminación con polifenoles porque se une a estos y posteriormente pueden ser

eliminados por precipitación con etanol (Sambrook et al., 1989).

- El cloroformo y el fenol a un pH específico desnaturaliza las proteínas, y debido a

que estos dos son solventes orgánicos las proteína migran a esta fase mientras que

los ácidos nucleicos se mantienen en la fase acuosa, además a bajo pH el fenol

hace que el DNA sea un poco soluble en la fase orgánica. El cloroformo también

contribuye con la eliminación de lípidos (Sambrook et al., 1989).

4.3.2 Precipitación diferencial del RNA

Generalmente para la precipitación de RNA se utiliza algún etanol o isopropanol, los

cuales en presencia de cationes monovalentes como el Na+ y el Li+, neutralizan las

cargas reduciendo la hidrofilicidad del RNA y promoviendo su precipitación (Sambrook et

al., 1989). Dentro de las sales más utilizadas esta el LiCl debido a que este es soluble

con proteínas, carbohidratos y DNA permitiendo la precipitación del RNA. Dependiendo

de la concentración este es muy eficiente porque permite la precipitación del RNA y es

ineficiente para la precipitación de DNA proteína y carbohidratos (Barlow et al., 1963).

4.4 RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR)

Las técnicas basadas en PCR (Mullis y Faloona, 1987) han sido utilizadas como una

prueba gold standard para la detección de una gran variedad de moldes en diferentes

áreas del conocimiento, incluyendo virología (Heid et al., 1996; Makkouk y Kumari, 2006;

Feng et al., 2008). Para la observación de los amplificados se requiere de electroforesis,

un procesamiento post-PCR lo cual puede conllevar a problemas de contaminación, una

manera de sobrellevar este inconveniente, fue buscar una forma de poder visualizar los

productos a medida que se lleva a cabo la reacción, para lo cual se implemenntó la

técnica de qPCR (Lomeli et al., 1989), en la cual se hace un marcaje de los primers,

sondas o amplicones con moléculas fluorogénicas (Matthews y Kricka, 1988).


qRT-PCR está basada en PCR y se usa para amplificar y al mismo tiempo cuantificar

moléculas de cDNA (DNA complementario) específicas y así acceder a datos fiables y

precisos del número de copias de un gen (cuantificación absoluta) ó de la expresión

génica relativa (cuantificación relativa). En esta técnica el producto de la PCR se mide al

final de cada ciclo, mientras que en las reacciones de RT-PCR convencional el producto

solo puede ser visualizado cuando la reacción ha terminado (Heid et al., 1996; Makkouk y

Kumari, 2006; Feng et al., 2008).

Se han utilizado diferentes métodos para el diagnostico viral como anticuerpos mono y

policlonales, hibridaciones con sondas de DNA y RNA, RT – PCR, pero ninguno de estos

métodos permite una estimación precisa de la acumulación de virus en los tejidos

infectados (Ruiz – Ruiz et al., 2007), lo cual si puede llevarse a cabo con qPCR. qPCR se

ha convertido en una técnica ampliamente utilizada en estudios de expresión y regulación

génica y también en el diagnóstico y cuantificación de virus. Es una técnica que presenta

una alta sensibilidad, especificidad y reproducibilidad, además no requiere procesamiento

post PCR de la muestra, lo que reduce el riesgo de contaminación (Ruiz – Ruiz et al.,

2007; Feng et al., 2008).

4.4.1 Cuantificación

Se han utilizado varios métodos para la estimación de RNA, entre los que se encuentran:

nothern blot, ensayo de protección de la ribonucleasa, hibridación in situ, entre otros. Los

ensayos de northern blot y los ensayos de protección de la ribonucleasa requieren de

grandes cantidades de RNA, y por otro lado hibridación in situ es más cualitativa que

cuantitativa, mientras que qRT-PCR es fácil de realizar y no requiere grandes cantidades

de molde lo que la hace más conveniente para cuantificaciones en comparación con las

demás técnicas de cuantificación (Heid et al., 1996; Feng et al., 2008).

Umbral

Los resultados de qRT-PCR se basan en la detección y cuantificación de los marcadores

fluorescentes a lo largo de la reacción. Esto permite conocer la cantidad de fluorescencia

emitida durante la fase exponencial de la reacción, donde un aumento significativo del

producto de PCR se correlaciona con la cantidad inicial de DNA o cDNA en estudio (Feng

et al., 2008). Para poder hacer las cuantificaciones, se debe obtener el valor Ct (cycle

Marco Teórico 27

treshhold); para su determinación se debe establecer un umbral adecuado que debe ser

fijado por el investigador, en el que el valor Ct se determina por la identificación del ciclo

en el cual la emisión de la intensidad del marcador fluorescente se eleva por encima del

ruido de fondo en la fase exponencial de la reacción de PCR. Quiere decir que este valor

está representado por el ciclo en el cual la producción de fluorescencia cruza el umbral

establecido (Figura 4-13) (Bustin, 2002; Dorak, 2006).

Figura 4-13 Cinética de la reacción de PCR en tiempo real. En la gráfica puede observarse la línea base y el umbral a partir del cual se determinan los valores Ct (Tomada de Heid et al., 1996).

Cuantificación Absoluta y relativa

Con el uso de PCR en tiempo real la cantidad de molde puede ser cuantificado de

manera absoluta o relativa (Bustin, 2002):

Cuantificación Absoluta: El número de moléculas blanco presentes en la muestra es

determinada usando una curva estándar, construida por la amplificación de cantidades

conocidas del molde bajo condiciones idénticas a las de la muestra. Sin embargo, la

curva estándar tiene que ser rigurosamente validada con gran exactitud pues la

cuantificación depende exclusivamente de la precisión de los estándares empleados

(Figura 4-14) (Pfaffl, 2008).


Figura 4-14. Curva estándar para la hacer cuantificación absoluta. (Tomada de Heid et al., 1996). A. Curva estándar. B. Curvas de amplificación de los estándares utilizados para la construcción

de la curva estándar.

Cuantificación Relativa: Describe los cambios en la cantidad de una secuencia blanco en

comparación con un normalizador (corresponden a genes cuya expresión es constante

en las células estudiadas razón por la que habitualmente se utilizan genes

housekeeping), pero no se sabe el número de copias de molde presentes en cada

muestra. Los cálculos en cuantificación relativa de expresión genética se basan en la

comparación de los valores Ct utilizando la eficiencia de la reacción de la PCR como

factor de corrección (Pfaffl, 2008). La eficiencia se calcula a partir de la pendiente de la

curva teniendo en cuenta la siguiente ecuación:

En donde se espera que cuando la eficiencia es igual a 2 el porcentaje de eficiencia es

igual a 100%, lo que quiere decir que en cada ciclo de amplificación se duplica la

Marco Teórico 29

cantidad de producto con respecto al ciclo anterior, aunque hay que tener en cuenta que

la eficiencia nunca será igual a 2.

Figura 4-15. Cuantificación relativa (Figura tomada de Heid et al., 1996). A. Comparación de las diferencias entre la expresión de un gen de interés con uno de expresión constitutiva, el valor ∆∆Ct representa el número de veces en el cambio de la expresión génica. B. Resultados de un análisis de expresión relativa.

Generalmente la cuantificación relativa ofrece suficiente información y es más simple de

desarrollar, sin embargo cuando se requiere monitorear el progreso de una infección, la

cuantificación absoluta es muy útil para demostrar los cambios en el nivel de virus

(Mackay et al., 2002).

A

B


Químicas utilizadas en qPCR

En la actualidad hay dos formas para la detección de los productos de qPCR se basa en

la utilización de fluorocromos: los que se unen al DNA, y los que vienen unidos a los

primers ó sondas.

Fluorocromos que se unen al DNA: Esta es la química más usada para la detección de

productos de PCR en tiempo real, en donde generalmente se utiliza la molécula SYBR®

Green I. Esta molécula presenta baja fluorescencia cuando se encuentra libre, pero esta

incrementa hasta 1000 veces cuando se une al DNA de doble cadena, además la señal

de la fluorescencia es proporcional a la cantidad de dsDNA presente en la muestra. Debe

tenerse en cuenta que durante la reacción pueden formarse productos inespecíficos y

dímeros de primers, lo cual puede hacer que la interpretación de los resultados sea

confusa, para evitar esto es útil hacer curvas de fusión después de la amplificación para

determinar la temperatura de fusión a la que el amplicón es denaturado y de esta manera

poder discriminar la presencia de dímeros de primers debido a que estos presentan una

reducida temperatura de fusión comparada con la temperatura de los amplicones (Figura

4-16) (Mackay et al., 2002; Dorak, 2006).

Figura 4-16: Química de detección de SYBR® Green I. (Figura Tomada de BIO-RAD,

2012).

Marco Teórico 31

Primers ó sondas unidas a un fluorocromo: Dentro de esta categoría hay varias químicas:

- Sondas TaqMan®: Son una clase de sondas fluorogénicas basadas en FRET

(Fluorescence Resonance Energy Transference) entre un fluorocromo y un quencher

el cual dispersa la energía generada por el fluorocromo como calor más que como

fluorescencia, evitando la fluorescencia de la sonda. Con el quencher en algunos de

los extremos de la sonda, la fluorescencia es apagada debido a la proximidad del

fluorocromo y del quencher, pero esta es detectada después de que la DNA

polimerasa hidroliza la sonda permitiendo de esta manera que se pueda emitir la

fluorescencia generada por el fluorocromo (Figura 4-17) (Mackay, et al., 2002;

Bustin, 2002). Cuando se emplean este tipo de sondas se incrementa la

especificidad en comparación con los fluorocromos que se unen de manera

inespecífica al DNA, debido a que estos se unen a amplicones específicos por lo

tanto son muy precisos y se evita la cuantificación de dímeros de primers o

productos de amplificación inespecíficos (Dorak, 2006). A pesar de las ventajas

descritas anteriormente, las sondas TaqMan® no son útiles cuando se está

trabajando con muestras que presentan una alta variabilidad debido a que estas

requieren de que haya una alta complementariedad, para poder hacer la detección

en este tipo de muestras sería más eficiente la utilización de SYBR® Green I con

primers degenerados (Papin et al., 2004).

Figura 4-17. Química de detección con Sondas TaqMan® (Figura Tomada de BIO-RAD, 2012).


- Molecular beacons: Es un oligonucleótido entre 25 a 40 nt que tiene forma de hairpin

con un stem y un loop. Los extremos 3´y 5´tienen complementariedad entre 5 a 6

nucleotidos en el stem, y en el loop hay de 15 a 30 nucleotidos que se diseñan de

manera que hibridicen con la secuencia blanco. En uno de los extremos la sonda

esta marcado con un fluorocromo y en el otro extremo hay un quencher evitando que

se emita fluorescencia. (Figura 4-18). Durante el alineamiento en la reacción de

amplificación, la porción del loop del molecular beacon se une a la secuencia blanco,

haciendo que el stem se denature. En este tipo de química la cantidad de

fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de moléculas blanco. Estas

sondas resultan muy útiles debido a que tienen una especificidad muy alta; la

principal desventaja es que son difíciles de diseñar (BIO-RAD, 2012).

Figura 4-18. Estructura de un molecular beacon. (Figura Tomada de BIO-RAD, 2012).

- Hybridization probes: Utiliza dos sondas secuencia-específica, las dos son diseñadas

para unirse a secuencias adyacentes en el blanco (Figura 4-19). Las sondas son

marcadas con un par de fluorocromos que pueden emplear FRET. El fluorocromo

donador se une al extremo 3´de la primera sonda, mientras que el fluorocromo

aceptor se une al extremo 5´de la segunda sonda. Durante la reacción de tiempo

real, la excitación se hace a la longitud de onda del donador, y la reacción es

monitoreada a la longitud de onda del aceptor. Durante el alineamiento, las sondas

hibridizan en el blanco en un arreglo de cabeza y cola, dejando juntos a los dos

fluorocromos para que se lleve a cabo FRET (BIO-RAD, 2012).

Marco Teórico 33

Figura 4-19. Hybridization probes (Figura Tomada de BIO-RAD, 2012).

- Eclipse probes: Se utiliza dos primers y una sonda secuencia-específica. La sonda

eclipse es complementaria con una secuencia dentro del blanco y tiene un

fluorocromo en el extremo 3´ y un quencher en el extremo 5’. Cuando la sonda no

esta hibridizada esta adopta una forma de random coil uniendo al fluorocromo y al

quencher evitando la emisión de fluorescencia. Durante el alineamiento la sonda se

hibrida al blanco linearizandose, separando el quencher del fluorocromo permitiendo

la emisión de fluorescencia (BIO-RAD, 2012).

Figura 4-20. Eclipse Probes (Figura Tomada de BIO-RAD, 2012).

- Amplifluor assays: En este tipo de reacciones se utiliza una pareja de primers secuencia-

específica y un primer universal llamado UniPrimer. Una secuencia de 18nt (llamada la

secuencia Z) se extiende desde el extremo 5´de uno de los primers secuencia-


específica; esta misma secuencia forma el extremo 3´del Uniprimer. El Uniprimer forma

una estructura hairpin con un fluorocromo y un quencher en los extremos 5´y 3´del stem¸

respectivamente. En la conformación del hairpin, el fluorocromo y el quencher se

encuentran a corta distancia, por lo tanto no se emite fluorescencia. Durante el primer

ciclo de amplificación, el primer Z se hibrida con el molde y es extendido (Figura 4-21).

Durante el segundo ciclo de amplificación, el otro primer secuencia-específica, hibrida

con el producto del primero, y es usado para sintetizar un nuevo molde que contiene una

secuencia complementaria con la secuencia Z. El producto del segundo ciclo de

amplificación puede servir como el molde para el Uniprimer. En el tercer ciclo de

amplificación, el Uniprimer extendido sirve como molde para la amplificación del ciclo

siguiente ciclo de amplificación. En el cuarto ciclo, al extensión del molde a través el

Uniprimer hace que el hairpin se abra y adopte una configuración lineal, permitiendo que

se emita la fluorescencia. La amplificación exponencial usando el segundo primer

secuencia-específicay el Uniprimer ocurre en los siguientes ciclos (BIO-RAD, 2012).

Figura 4-21. Amplifluor assay. (Figura Tomada de BIO-RAD, 2012).

- Scorpions primers: Se utilizan dos primers, uno que sirve como sonda y contiene una

estructura stem-loop, con un fluorocromo en el extremo 5´y el quencher en el

Marco Teórico 35

extremo 3´. Durante el primer ciclo de amplificación el primer Scorpions, es

extendido, y la secuencia complementaria a la secuencia del loop se genera en la

misma hebra (Figura 4-22). La subsecuente denaturación y alineamiento permite que

el loop de la sonda Scorpion hibride a la secuencia blanco, separando el fluorocromo

del quencher. La sonda Scorpion contiene un bloqueador de PCR en el extremo

3´del quencher para prevenir lectura corrida durante la extensión de la cadena

opuesta (BIO-RAD, 2012).

Figura 4-22. Scorpions primers. (Figura Tomada de BIO-RAD, 2012).

- LUX primers: Utiliza dos primers, uno de los cuales tiene forma de hairpin con un

fluorocromo en el extremo 3´ (Figura 4-23). El reportero es apagado por la estructura

secundaria del hairpin. Durante la amplificación, el primer LUX es incluido en el

producto, permitiendo que se emita la fluorescencia del fluorocromo (BIO-RAD,

2012).


Figura 4-23. LUX primers. (Figura Tomada de BIO-RAD, 2012).

- QZyme primers: Se utiliza un primer secuencia-específica que contiene un

antisentido (inactivo), secuencia para un DNA catalítico, un sustrato para el DNA

catalítico (oligonucleótido), y un primer reverse secuencia-específico (Figura 4-24). El

sustrato ttiene un fluorocromo en el extremo 5´ y un quencher en el extremo 3´,

cuando el sustrato está intacto la fluorescencia es apagada. Durante el primer ciclo

de amplificación, el primer que tiene la secuencia catalítica antisentido es extendido.

En el segundo ciclo, el producto del primer ciclo sirve como molde para el primer

reverse secuencia-específico, el cual es extendido para crear un nuevo producto que

contiene la región de DNA catalítica en sentido (activo). En el siguiente paso de

alineamiento, el sustrato (oligonucleótido) marcado con un fluorocromo, hibrida con

la secuencia de DNA catalítica y es clivado. El rompimiento separa el fluorocromo del

quencher (BIO-RAD, 2012).

Marco Teórico 37

Figura 4-24. QZyme primers. (Figura Tomada de BIO-RAD, 2012).

4.4.2 RT-PCR en tiempo real para el estudio de virus en el cultivo de la papa.

Técnicas basadas en qPCR han sido utilizadas para la detección de varios virus en el

cultivo de la papa (Boonham et al., 2000; Klerk et al., 2001; Kokkinos y Clark, 2006;

Pompe-Novak et al., 2006, Agindotan et al., 2007; Ruíz-Ruíz et al., 2007 y 2009; Osman

et al., 2008; Kogovšek et al., 2008 y 2011; Mortimer-Jones et al., 2009) incluyendo a

PYVV (López et al., 2006; Hernández et al., 2010).

A pesar del amplio uso de esta técnica para la detección de otros virus, no ha sido muy

utilizada para el estudio de PYVV, solamente López et al. (2006) hicieron uso de esta

técnica (utilizando sondas TaqMan® amplificando el gen CP) para la detección de PYVV,

en este trabajo los autores evaluaron la sensibilidad de RT – PCR y de qRT – PCR, en

donde se observó que RT – PCR era 1000 veces menos sensible que qRT – PCR,

también se realizaron reacciones multiplex (reacción en la que se incluyen varias parejas

de primers permitiendo la detección de varios blancos) en la que se incluyó una pareja de

primers con la respectiva sonda para la amplificación del gen citocromo oxidasa (control


interno de amplificación de planta) observándose que en este tipo de reacción no se

afectó la sensibilidad de la reacción.

Muchos autores también han reportado el uso de esta técnica con fines de detección en

otros virus que infectan el cultivo de la papa. Algunos han hecho uso de reacciones

múltiplex para la detección simultánea de diferentes virus, aunque no es muy común,

debido a que el proceso de estandarización y de optimización no es muy fácil. Boonham

et al. (2000) realizaron reacciones múltiplex utilizando sondas TaqMan® para la detección

de TRV and Andean potato mottle top virus (APMoV) en muestras de tubérculo. Klerk et

al. (2001) también hicieron reacciones múltiplex para la detección de PLRV y PVY a partir

de material foliar. Agindotan et al. (2007) reportaron la detección de PLRV, PVA, PVX y

PVY a partir de tubérculo. En algunos casos se ha querido implementar técnicas de alto

rendimiento para la detección de varios virus simultáneamente como la planteó Mortimer-

Jones et al. (2009) quien propuso el uso de esta técnica para la detección de PLRV,

PVX, PVS y TSWV en material foliar y tubérculo

Esta técnica no sólo se ha utilizado con fines de detección, algunos autores han

reportado su uso para estudiar diferentes aspectos de la biología de virus que infectan el

cultivo de la papa, como en los siguientes casos:

- Kokkinos y Clark (2006) evaluaron la interacción entre virus, en donde haciendo uso

de reacciones simplex (con una sola pareja de primers) pudieron detectar miembros

del género Potyvirus: Sweet potato feathery mottle virus (SPFMV), e Ipomoea vein

mosaic virus (IVMV); el miembro del género Crinivirus SPCSV; y el miembro del

género Begomovirus Sweet potato leaf curl virus (SPLCV) de plantas de S.

tuberosum infectadas. En este trabajo se pudo encontrar que las cargas virales de

SPFMV, IVMV,y SPCSV eran mayores cuando las plantas presentaban infecciones

múltiples, y al igual que lo reportado en anteriores estudios se confirmó que la

técnica de qPCR fue más sensible que la técnica de PCR.

- Pompe Novak et al., (2006) evaluó los cambios de la expresión génica en plantas de

papa infectadas con PVYNTN, ellos encontraron que plantas infectadas inducen las

expresión de genes relacionados con respuestas a estrés como la proteína de

choque térmico, catalasa 1, β-1,3- glucanasa y genes involucrados en la fotosíntesis

Marco Teórico 39

- Kogovšek et al. (2008) reportaron el uso de la técnica para hacer la discriminación de

razas de PVY.

- Kogovšek et al. (2011) evaluaron la acumulación del virus PVY en diferentes órganos

de plantas de papa infectadas con PVY, el estudio indicó que el virus se encuentra

distribuido heterogéneamente, con una mayor acumulación en la zona aérea.

Esta técnica ha sido utilizada más ampliamente con otros virus miembros de la familia

Closteroviridae en particular en CTV. Ruíz-Ruíz et al. (2007) hicieron uso de esta técnica

para determinar la distribución del virus CTV en plantas infectadas, observándose que la

distribución del virus en toda la planta no es homogénea y que se concentra

principalmente en la corteza y frutos que en las hojas y raíces, posiblemente en el caso

de PYVV, la distribución del virus también sea diferencial, aunque aún no se sabe si

exista un tropismo en particular por determinados órganos de la planta infectada, como

ya está documentado para CTV. Un par de años más tarde Ruíz-Ruíz et al. (2009)

también le dio otra aplicación a esta técnica, utilizándola para la discriminación de

aislados de CTV (moderados y severos), para lograrlo se diseñó una pareja de primers

(diseñados a partir de regiones altamente conservadas), que permitieran la amplificación

de cualquier aislado de CTV y tres sondas específicas conservadas para que permitieran

reconocer cada uno de los aislados.

Dentro de familia Closteroviridae también se han hecho varios estudios de detección por

qPCR del virus Grapevine leafroll associated virus (GLaV) debido a la gran importancia

que este virus representa para la industria del vino. Osman et al. (2008) utilizaron

arreglos de baja densidad basados en qPCR con fines de diagnóstico.

5. Metodología, Resultados y Discusión

El análisis de la acumulación de PYVV utilizando qPCR en aislamientos de foliolo, tallo,

flor, raíz y principalmente tubérculo (diferentes brotes de un tubérculo) de plantas de S.

tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia infectadas con PYVV, se explica en

tres artículos científicos, detallando en cada uno de ellos la metodología, los resultados

obtenidos y la discusión, los cuales corresponden a los objetivos propuestos en la

presente investigación (Tabla 5-1).

Tabla 5-1. Artículos planteados para la presentación de metodología, resultados y discusión.

Objetivo Artículo

1. Comparar métodos de extracción de RNA en diferentes órganos de plantas de S. tuberosum Grupo Phureja variedad Colombia Criolla infectadas con PYVV

Evaluación de tres métodos de extracción de RNA para la detección por RT-PCR del Potato yellow vein virus (PYVV) en diferentes órganos de plantas de Solanum. tuberosum Grupo Phureja variedad Colombia Criolla.

2. Evaluar la distribución-carga viral de PYVV en diferentes órganos de plantas de S. tuberosum Grupo Phureja infectadas con el virus

PCR en tiempo real para la detección y cuantificación de Potato yellow vein virus (PYVV) en diferentes órganos de plantas de Solanum. tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia infectadas con el virus

3. Determinar la carga viral de PYVV en un grupo de muestras de brotes de tubérculos de plantas de S. tuberosum Grupo Phureja infectadas con el virus

Evaluación de la distribución del Potato yellow vein virus (PYVV) en brotes de tubérculos de Solanum tuberosum Grupo Phureja utilizando cuantificación absoluta por la técnica de PCR en tiempo real (qPCR) con Sondas TaqMan®.

Los resultados del primer artículo están plasmados en el artículo: “Comparación de

métodos de extracción 1 de RNA para la detección por RT-PCR del Potato yellow vein

virus (PYVV) en diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja” que ya fue

sometido a la Revista Colombiana de Biotecnología.

Los resultados del tercer objetivo hacen parte del artículo: “Tracking foliar symptoms

caused by tuber-borne Potato yellow vein virus (PYVV) in Solanum phureja (Juz et Buk)

cultivar “Criolla Colombia” ya sometido a la revista American Journal of Potato Research

(#AJPR-D-12-00392).


5.1 Resumen de la metodología del objetivo 1.

Figura 5-1. Esquema representativo de la metodología para comparar tres métodos de extracción de RNA en diferentes órganos de plantas de S. tuberosum Grupo Phureja infectadas con PYVV. Los valores en el paréntesis corresponden al número de muestras evaluadas por cada órgano.

Resumen de la metodología 43

5.2 Resúmen de la metodología del objetivo 2

Figura 5-2. Esquema representativo de la metodología para evaluar la distribución-carga viral de PYVV en diferentes órganos de plantas de S. tuberosum Grupo Phureja infectadas con el virus.


5.3 Resúmen de la metodología del objetivo 3

Figura 5-3. Esquema representativo de la metodología para determinar la carga viral de PYVV en un grupo de muestras de brotes de tubérculos de plantas de S. tuberosum Grupo Phureja infectadas con el virus.

6. Artículo 1.

Evaluación de tres métodos de extracción de RNA para la detección del Potato yellow vein virus (PYVV) por RT-PCR a partir de muestras de diferentes órganos de plantas de Solanum

tuberosum Grupo Phureja

Resumen

Potato yellow vein virus (PYVV) género Crinivirus, contiene genoma tripartita de RNA

positivo, se limita al floema de la planta y causa pérdidas en la producción entre 25% y

más del 50%. PYVV es un virus re-emergente, clasificado como cuarentenario por

agencias fitosanitarias en Europa y Estados Unidos. La detección se ha reportado en

muestras de brotes de tubérculo y foliolo utilizando RT-PCR, NASH y PCR en tiempo

real. No se sabe si PYVV se distribuye homogéneamente en toda la planta y si todos los

métodos de extracción de RNA son igualmente eficientes. Por lo tanto, el objetivo de este

trabajo fue detectar al virus en diferentes órganos (foliolo, peciolo, pedúnculo floral,

pétalos, tallo, raíz, antera y brotes de tubérculo) amplificando el gen de la proteina mayor

de la cápside por RT-PCR, para lo cual se evaluaron tres métodos de extracción: uno

basado en Trizol® (Invitrogen), uno basado en bromuro de hexadecil trimetil amonio

(CTAB) y fenol – cloroformo seguido por purificación con columnas de Sephadex G-50. A

cada método se le estimó la integridad (relación de las subunidades ribosomales

28S/18S), calidad (relación de las lecturas espectrofométricas 260/280nm) y rendimiento

de los extractos obtenidos. Con los tres métodos se detectó PYVV en todos los órganos

analizados. No se presentaron diferencias estadísticamente significativas entre los tres

métodos de extracción; sin embargo, por Trizol® (Invitrogen) se obtuvo extractos con

mayores valores de rendimiento, calidad e integridad, además se logró la detección del


virus por RT-PCR en todos los órganos evaluados (raíz, brote de tubérculo, tallo, foliolo,

pedúnculo floral, antera y pétalos).

Palabras claves: Solanum tuberosum, papa criolla, virus, extracción de RNA, detección.

6.1 Introducción

Potato yellow vein virus (PYVV) es un virus re-emergente, limitado al floema, miembro de

la familia Closteroviridae y del género Crinivirus (Salazar et al., 2000; Martelli et al.,

2002); sus partículas son filamentosas (Salazar et al., 2000) y su genoma es tripartita

ssRNA(+) (Livieratos et al., 2004). La enfermedad del amarillamiento de las nervaduras

de la hoja de papa (PYVD) fue observada por primera vez por Alba (1950) en Antioquia

(Colombia) y debido al incremento en las poblaciones del vector (Trialeurodes

vaporariorum, Westwood; Buriticá, 1971). y al transporte indiscriminado de tubérculos-

semilla, el virus se ha dispersado en Colombia y países vecinos como Venezuela, Perú y

Ecuador (Salazar et al., 2000). Los síntomas de PYVD son un amarillamiento apical de

nervaduras primarias y secundarias que puede extenderse a todo el folíolo conllevando a

reducción de la producción hasta un 50% en Solanum tuberosum Grupo Tuberosum cv

Diacol Capiro (Salazar et al., 2000) y aproximadamente 30 % en S. tuberosum Grupo

Phureja (Guzmán et al., 2011). Por esta razón es considerado un patógeno cuarentenario

por varias agencias fitosanitarias como OEPP-EPPO (European and Mediterranean Plant

Protection Organization) y USDA - APHIS (United States Department of Agriculture -

Animal and Plant Health Inspection Service) (OEPP/EPPO, 1979; USDA – APHIS, 2000).

PYVV se ha detectado molecularmente por medio de sondas utilizando NASH (Salazar et

al., 2000), amplificación de genes por RT-PCR (Offei et al., 2004; Guzmán et al., 2006;

2010; Wei et al., 2009) y por PCR en tiempo real (qPCR) (López et al., 2006; Hernández

et al., 2010). Esta última técnica es muy sensible, sin embargo, RT-PCR es de uso

rutinario para su diagnóstico (Guzmán et al., 2006; Guzmán y Rodríguez, 2010; Franco-

Lara et al., 2009). Para que esta técnica sea exitosa es necesario contar con buenos

extractos de RNA, en particular en plantas de papa debido a que algunos órganos

presentan una alta oxidación además de la presencia de paredes celulares, pigmentos,

polisacáridos, polifenoles y otros metabolitos secundarios que coprecipitan con el RNA

afectando el rendimiento y calidad de los mismos (Claros y Canovas, 1998; Kim y

Hamada, 2005).

Artículo 1. Evaluación de tres métodos de extracción de RNA para la detección del Potato yellow vein virus (PYVV) por RT-PCR a partir de muestras de diferentes órganos de plantas de Solanum tuberosum Grupo Phureja.

47

Se han reportado métodos de extracción de ácidos nucléicos, algunos podrían estar

clasificados en algunas de las siguientes categorías: basados en tioisocianato de

guanidina (Trizol®, Invitrogen; Chomczynski, 1993), basados en CTAB (Chang et al.,

1993) y basados en fenol:cloroformo.

Uno de los principales problemas durante la extracción de RNA es la actividad de las

nucleasas; el tioisocianato de guanidina inhibe la actividad de estas enzimas mejorando

la calidad del RNA (Chomczynski, 1993); en esta categoría se encuentra el producto

comercial Trizol® (Invitrogen) compuesto por una mezcla de tioisocianato de guanidina

(GTC), fenol, acetato de sodio, lauryl sarcosyl de sodio (Sarkosyl) y otros agentes

desnaturalizantes fuertes que permiten la extracción del RNA total (Liu et al., 1998).

En el método basado en CTAB se utiliza este detergente catiónico que solubiliza las

membranas celulares liberando los ácidos nucleídos y cuando se trabaja con soluciones

de alta concentración iónica forma complejos con los ácidos nucleicos permitiendo su

precipitación (Chang et al., 1993). A pesar de que hay muchas modificaciones de este

protocolo, durante el procedimiento se debe utilizar iones Na+ a una alta concentración

para crear un ambiente molecular de alta fuerza iónica favoreciendo la eliminación de

compuestos contaminantes (Chang et al., 1993; Meisel et al., 2005). Como agente

inhibidor de ribonucleasas se utiliza ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (John, 1992;

Kiefer et al., 2000).

La extracción de RNA utilizando fenol:cloroformo hace uso de un buffer que contiene

SDS (Docecil sulfato sódico), que es un detergente iónico que permite el rompimiento de

las membranas celulares liberando el contenido intracelular y posteriormente por la

utilización de fenol saturado en un buffer ácido se permite la extracción diferencial de

RNA, posteriormente se adiciona cloroformo que se encarga de denaturar las proteínas

haciéndolas solubles en la fase orgánica o interfase (Sambrook, et al., 1989). En este

trabajo se empleó el protocolo utilizado por Guzmán et al. (2006) en donde en la fase

final no se hace precipitación del RNA sino que este es purificado a través de una

columna de sephadex G-50 permitiendo la desalinización y eliminación de compuestos

fenólicos presentes en los extractos de RNA impuros (Sambrook et al., 1989)


PYVV se limita al floema (Salazar et al., 2000) y solamente se ha informado la detección

molecular a partir de muestras de foliolo y brotes de tubérculos (Salazar et al., 2000;

López et al., 2006; Guzmán et al., 2006; Wei et al., 2009; Guzmán et al., 2010;

Hernández et al., 2010). Aunque los virus se mueven dentro de la planta vía floema

(Serón y Haenni; 1996) no se sabe todavía si PYVV se puede detectar exitosamente en

todos los órganos. Por tal motivo, el objetivo de este trabajo fue evaluar tres métodos de

extracción para la obtención de RNA a partir de diferentes órganos (tallo, foliolo, peciolo,

raíz, pedúnculo floral, pétalos y anteras) de plantas de S. tuberosum Grupo Phureja

infectadas con PYVV para determinar cuál es el más apropiado para la detección de

PYVV en diferentes órganos de plantas infectadas por RT-PCR. La extracción de RNA de

alta calidad es útil en diferentes estudios virales para monitorear la presencia y dispersión

del virus en diferentes órganos, en programas de fitomejoramiento, de certificación de

semillas e indexación de material vegetal.

6.2 Materiales y Métodos

6.2.1 Material vegetal y aislados virales

Se hizo una visita a cultivos de papa en el municipio de Chipaque (Cundinamarca) donde

se tomaron tres plantas completas de papa criolla con sintomatología de PYVD que

tenían una edad de aproximadamente dos meses. Estas fueron sembradas en materas

utilizando como sustrato una mezcla de tierra:cascarilla de arroz (3:1) y se mantuvieron

en el patio del IBUN durante dos meses. Las plantas fueron regadas con agua dos veces

por semana y fueron fertilizadas con 15:15:15 (Nitrógeno: Fósforo: Potasio) el día de la

siembra en matera y un mes después. Adicionalmente se hizo control para hongos

fumigando una vez a la semana con Benlate 0.1% y para el control de mosca blanca

fumigando dos veces a la semana con Karate® 1.5cc/L.

6.2.2 Evaluación de los protocolos de extracción de RNA

Para determinar cuál es el mejor método de extracción para la obtención de RNA a partir

de diferentes órganos se evaluaron las tres metodologías de extracción de RNA

previamente reportadas en estudios de PYVV: uno basado en CTAB (López et al., 2006),

Trizol® (Invitrogen) y fenol:cloroformo con purificación por Sephadex G-50 (Guzmán et


49

al., 2006). Para esto se tomaron muestras de raíz, brotes de tubérculo, tallo, foliolo,

pétalo, antera y pedúnculo floral de S. tuberosum Grupo Phureja infectadas con PYVV

(Tabla 6-1), estas fueron recolectadas y pulverizadas de inmediato con nitrógeno líquido

para procesarlas por las tres metodologías. Se evaluaron 84 muestras por cada método

de extracción (4 de antera y 10 por cada uno de los órganos restantes).

Tabla 6-1 Muestras utilizadas para hacer la evaluación de los métodos de extracción por órgano

Zona Órgano

Número de muestras/ método de extracción

Trizol CTAB Fenol/Cloroformo

Sephadex

Radical Raíz

Primaria 10 10 10

Secundaria 10 10 10

Brote de tubérculo 10 10 10

Aérea

Foliolo 10 10 10

Flor

Pedúnculo 10 10 10

Pétalos 10 10 10

Anteras 4 4 4

Tallo Primario 10 10 10

Secundario (Peciolo) 10 10 10

Métodos de extracción de RNA

Extracción de RNA total con Trizol® (Invitrogen): Se partió de 100mg de tejido vegetal el

cual fue procesado de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Anexo A.1).

Extracción de RNA total con CTAB: Se partió de 150mg de tejido vegetal que fue

procesado utilizando el protocolo propuesto por López et al. (2006) (Anexo A.2).

Extracción de dsRNA con fenol:cloroformo/Sephadex: Se partió de 100mg de material

vegetal y se procesó teniendo en cuenta el protocolo propuesto por Guzmán et al. (2006)

.(Anexo A.3). En este protocolo se hizo una extracción inicial de RNA con

fenol:cloroformo el cual fue purificado a través de columnas de Sephadex G-50, Esta es

una columna de exclusión que permite la separación de moléculas entre 1.5 y 30KDa.

Todos los extractos de RNA fueron resuspendidos en 30µl de agua tratada con DEPC y

almacenados a -20°C hasta su procesamiento.


Determinación de la concentración y evaluación de la calidad de los extractos de RNA

Para la determinación de la concentración de RNA se utilizó fluorimetría con el kit Quant-

iTTM RiboGreen Assay (Invitrogen) teniendo en cuenta las instrucciones del fabricante

(Anexo B.1), la concentración de todos los extractos se ajustó a 20ng/µl.

Se calculó el rendimiento del proceso de extracción de RNA teniendo en cuenta la

siguiente ecuación:

La calidad de los extractos de RNA fue evaluada por espectrofotometría; para esto se

diluyó 10µl del extracto de RNA con 990µl de agua tratada con DEPC y utilizando una

celda de cuarzo de 1ml se hicieron lecturas a 260 y 280nm en un espectrofotómetro

SmartSpecTM Plus (BIO-RAD). Para la evaluación de la calidad se hizo la relación

260nm/280nm la cual debe tener un valor superior a 1.8, asumiendo que cuando el valor

es igual a 2 el extracto es puro (Sambrook et al., 1989).

Determinación de la integridad de los extractos de RNA

Los extractos fueron corridos en geles de agarosa denaturantes (Anexo C.1) y

posteriormente se estimó la intensidad de las bandas correspondientes a las

subunidades 28S y 18S utilizando el software ImageJ 1.37 (Anexo C.2) (Rasband, 1997).

Finalmente se estimó el radio de las intensidades 28S/18S.

Síntesis de cDNA

Los extractos obtenidos por las tres metodologías de extracción fueron evaluados por

RT-PCR utilizando una pareja de primers para la detección del gen completo de la

proteína mayor de la cápside de PYVV (769pb) (Rodríguez et al., 2009) (Tabla 6-2). La

síntesis de cDNA se llevo a cabo en un volumen final de 10µl adicionando una mezcla de

1X buffer de reacción (Epicentre), 1mM de dNTPs (Bioline), 10mM de DTT (Epicentre),

0.4µM de primer 3´ (Tabla 7-2), 1.6U de RNAse inhibitor (Fermentas), 8U de MMLV HP

(Epicentre) y 100ng de RNA, se incubó durante una hora a 42°C seguida de una

denaturación a 70°C por 10min.


51

PCR

Las reacciones de amplificación contenían 1.6µl de cDNA, 1X de buffer NH4 (Bioline),

2.5mM de MgCl2 (Bioline), 0.4µM de dNTPs (Bioline), 0.4µM de cada primer (F2/3´)

(Tabla 6-2) y 1U de Biolasa (Bioline) en un volumen final de 10µl. El programa de

amplificación consistió de una denaturación inicial a 94ºC durante 3min, 35 ciclos de

denaturación a 94ºC durante 1min, alineamiento a 55ºC durante 1min y extensión a 72ºC

durante 1min, y una extensión final a 72ºC durante 10min, condiciones que fueron

previamente establecidas en la Laboratorio de Virus vegetales del IBUN (Guzmán et al.,

2006).

Tabla 6-2. Primers para la amplificación del gen completo de la proteína mayor de la cápside de PYVV.

Primer Dirección Secuencia Referencia

3´ Reverse 5’ AAG CTT CTA CTC AAT AGA TCC TGC TA 3’ Rodríguez et al., 2009

F2 Forward 5’ CTC GAG GAT CCT CAT GGA AAT CCG AT 3’

Como control positivo se utilizó una muestra de planta que expresaba síntomas para

PYVV y que había sido positiva por RT-PCR y como controles negativos una muestra de

Calamondino (Citrofortunella madurensis, Lour) infectada con CTV y una muestra de S.

tuberosum Grupo Phureja libre de virus (obtenida por cultivo in vitro de meristemos

donada por el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del IBUN). Los productos de PCR fueron

visualizados en geles de agarosa 1% preparados en TAE 1X (0.04M Tris-Acetato,

0.001M EDTA) y teñidos con SYBR®Safe (Invitrogen), corridos a 70V constantes durante

una hora y visualizados en digitalizador Gel Doc® (BIO-RAD).

6.2.3 Análisis Estadísticos

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el Software R (R Development Core

Team, 2008). La distribución de todos los datos fue evaluada utilizando el test de

normalidad Shapiro Wilk. Debido a que los resultados no presentaron una distribución

normal las comparaciones entre los órganos por método de extracción y entre métodos

de extracción por órgano se determinaron mediante la aplicación de una prueba Mann-

Whitney acompañada de la corrección de Bonferroni a nivel de significancia (p<0.05)

para controlar la tasa de error (Yuan et al., 2006). Adicionalmente, se realizó un análisis

de componentes principales para evaluar las relaciones entre los parámetros


cuantitativos. Adicionalmente, se realizó un análisis factorial no paramétrico utilizando la

prueba de Kruskall-Wallis para analizar si el

6.3 Resultados y Discusión

En este trabajo se evaluaron tres métodos de extracción de RNA en términos de la

calidad, integridad, rendimiento, y amplificación por RT-PCR del gen CP de PYVV a partir

de diferentes órganos de plantas de papa criolla infectadas, para la selección del mejor

método de extracción que permita la detección del virus en varios órganos de plantas

infectadas mediante RT-PCR.

6.3.1 Rendimiento de la extracción de RNA, radio de la absorbancia 260/280nm y radio de la intensidad de las subunidades ribosomales 28S/18S.

En la tabla 7-3 se muestra el rendimiento (ng RNA/mg material vegetal) obtenido con

cada una de las tres metodologías de extracción empleadas, indicando también la

calidad o pureza del RNA con base en la presencia o no de contaminantes proteicos a

través de la relación de absorbancia (260/280nm), la integridad con relación a las

subunidades ribosomales (28S/18S), y la eficiencia de amplificación con relación a todas

las muestras analizadas por amplificación por RT-PCR (número de muestras

amplificadas sobre el total de muestras extraídas ) a partir de cada uno de los extractos

de RNA obtenidos.

Como se puede observar el rendimiento de RNA obtenido con Trizol® (Invitrogen) fue

casi el doble y significativamente mayor (414.25 24 ngRNA/mg de material vegetal) que

el obtenido con los otros dos métodos de extracción (Sephadex: 283.17 14.43 y CTAB:

248.99 16) (p<0.05). El resultado de rango de calidad del RNA, en el que se estima si

hay o no contaminación con proteínas indicó mejor calidad obtenida por el método Trizol®

(Invitrogen), debido a que este presentó valores más cercanos a dos en comparación con

los otros métodos de extracción. Con relación a la integridad esta fue similar en los tres

métodos de extracción, en donde el rango fue amplio para los tres casos, en algunos

extractos se presentó degradación de RNA (los que presentan valores lejanos de dos).


53

Finalmente con los tres métodos de extracción se pudo amplificar el gen de la proteína

mayor de la cápside en un número similar de muestras, aunque por Trizol® (Invitrogen)

se logró detectar el virus en un mayor número de muestras.

Tabla 6-3. Resúmen de resultados de los parámetros evaluados para cada método de extracción

Trizol CTAB Sephadex

Promedio del rendimiento (ng RNA/mg material vegetal)

414.25 24 248.99 16 283.17 14.43

Rango de la calidad (260/280nm)

1.65 – 2.05 1.34 – 1.93 1.39 – 1.98

Rango de la integridad (28S/18S)

1 – 1.98 1.17 – 2.13 0.87 – 1.97

Muestras amplificadas por RT-PCR

75/84 71/84 72/84

En la Figura 6-1A se presenta el rendimiento promedio obtenido en cada órgano por

método de extracción. En todos los órganos el mayor rendimiento se presentó en los

extractos obtenidos por Trizol® (Invitrogen) (Figura 6-1A, cajas de color verde), (p<0.05) y

el menor en los extractos obtenidos por CTAB (excepto en brotes de tubérculo en donde

el menor rendimiento se presentó en los extractos obtenidos con Sephadex) (Figura 6-1ª,

cajas de color azul).

Para la determinación de la calidad de los extractos de RNA se calculó la relación de las

lecturas espectrofométricas a 260nm y 280nm, el cual se debe encontrar entre 1.8 y 2.0

para ser considerado de buena calidad asumiendo que un valor de dos corresponde a un

RNA puro (Sambrook et al., 1989; Staub et al., 1995). Este valor presentó un rango entre

1.65 a 2.05 en los extractos obtenidos por Trizol® (Invitrogen) (Tabla 6-3) lo que indica

que en algunas muestras no hubo contaminación con proteínas y en otras la

contaminación fue baja, los valores de la relación fueron similares entre los otros

métodos de extracción: con el método basado en CTAB la relación se encontró entre

1.34 y 1.93 y en el método fenol:cloroformo seguido de purificación con Sephadex los

valores se encontraron entre 1.39 y 1.98 (Tabla 6-3); lo que indica que en algunos casos

se presentó contaminación por proteínas.

En la Figura 6-1B se presenta la distribución del radio de la absorbancia 260/280nm en

cada órgano por método de extracción. En todos los órganos evaluados la mayor relación

260/280 se encontró en los extractos obtenidos por Trizol® (Invitrogen) (Figura 6-1B,


Figura 6-1. A. Distribución del rendimiento de RNA (ng RNA/mg de tejido vegetal). B. Distribución de la relación de la absorbancia 260/280nm. C. Distribución de la relación 28S/18S de los extractos de RNA por órgano en las tres metodologías de extracción. Las cajas de color azul corresponden a los extractos obtenidos por CTAB, las de color rojo a los extractos obtenidos por Sephadex y las de color verde a los extractos obtenidos por Trizol

® (Invitrogen).


55

cajas de color verde) en algunos órganos la menor relación 260/280nm se presentó en

extractos obtenidos por CTAB (antera, foliolo, pétalo y raíz primaria), y en otros órganos

(peciolo, pedúnculo floral, tallo y raíz secundaria) la menor relación se presentó en los

extractos obtenidos por fenol:cloroformo seguido por purificación con Sephadex. (Figura

6-1B, cajas de color azul y rojo); lo que sugiere que Trizol® (Invitrogen) es más eficiente

en la eliminación de proteínas que los otros dos métodos de extracción, esto puede

deberse a que en este método se utilizan cuatro agentes denaturantes para cumplir con

esta función (sarkosyl, tioisocianato de guanidina, clorofomo y fenol) además se adiciona

acetato de sodio que contribuye con la precipitación de las proteínas denaturadas,

mientras que en los otros dos métodos de extracción sólo se utilizan dos agentes

denaturantes (fenol y cloroformo) (Tabla 6-5).

Adicionalmente se determinó la integridad de los extractos de RNA a partir de geles

denaturantes de agarosa en donde todas las muestras evaluadas (excepto las muestras

de raíz) mostraron dos bandas claras que representan las subunidades ribosomales 18S

y 28S (Figura 6-2), a partir de estos geles se estimó la densidad de las subunidades

ribosomales 28S y 18S, en donde se considera que un RNA que se encuentra casi

intacto debe presentar una relación 28S/18S igual o superior a dos (Conde et al., 2012).

Figura 6-2. Gel denaturante de agarosa 1% para la determinación de la densidad de las bandas 28S y 18S. En los tres carriles se encuentran extractos de RNA de muestras de tallo obtenidos por Trizol

® (Invitrogen). Los carriles 1 y 3 corresponden a extractos con buena integridad de RNA

debido a que la relación 28S/18S fue cercana a 2. En el carril 2 hay un extracto en donde se evidencia que hay un cierto grado de degradación debido a que la intensidad de las dos bandas es similar.


En la Figura 6-1C se encuentra la distribución de la relación de intensidad de las

subunidades ribosomales 28S/18S en cada órgano por método de extracción. Los

extractos obtenidos por Trizol® (Invitrogen) presentaron un radio de intensidad 28S/18S

entre 1 y 1.98, los extractos obtenidos por el método basado en CTAB entre 1.17 y 2.13 y

los extractos obtenidos por fenol cloroformo seguido por purificación con Sephadex entre

0.87 y 1.97 (Tabla 6-3), lo que indica que en los tres métodos de extracción algunas

muestras presentaron degradación de los extractos de RNA. Particularmente en las

muestras de raíz primaria y secundaria, en raíz secundaria no se logró la estimación del

radio en la mayoría de las muestras debido a que los geles presentaron un barrido que

no permitió la distinción de las dos bandas; esto pudo deberse a que la integridad puede

ser influenciada fuertemente por el proceso de maceración del material vegetal, en el que

se liberan nucleasas que conducen a la degradación de los ácidos nucleicos. La raíz fue

el tejido de mayor dificultad en la maceración por lo tanto es posible que durante este

proceso el RNA se haya visto afectado por estas enzimas.

Se encontró que en la mayoría de los órganos de la planta de papa criolla, excepto la raíz

y pedúnculo floral los mayores valores de la relación 28S/18S se presentaron cuando la

extracción se realizó con Trizol® (Invitrogen) lo que sugiere que en este método el

tioisocianato de guanidina es más eficiente para la inactivación de RNasas, debido a que

su espectro es mayor por su función de agente caotrópico que también contribuye con la

denaturación de otras proteínas, lo que no sucede con el EDTA que es la sustancia que

se utiliza para la inhibición de RNasas por los otros dos métodos de extracción (Tabla 6-

5), su espectro no es tan alto como el de tioisocianato de guanidina porque este sólo

actúa sobre las nucleasas que tiene como cofactor Mg2+, este agente quelante no puede

actuar sobre nucleasas que funcionen sin cofactor (Sambrook et al., 1989).

La calidad y cantidad de RNA obtenida en un proceso de extracción puede afectarse por

la presencia de sustancias fenólicas en los extractos de RNA (Kansal et al., 2008).

Aunque en este trabajo no se evaluó la presencia de estas sustancias, es posible que la

menor calidad y cantidad en los extractos obtenidos por el método basado en CTAB y el

método de fenol:cloroformo seguido por purificación con Sephadex podría ser el

resultado de la coprecipitación de polisacáridos y oxidación de compuestos fenólicos que

interactúan irreversiblemente con los ácidos nucleicos (Chan et al., 2004).


57

Finalmente se evaluó si el método de extracción de RNA, el órgano y la interacción entre

estos dos factores afecta el rendimiento, el radio de absorbancia 260/280nm y el radio de

intensidad de las subunidades ribosomales 28S/18S. Se determinó que los dos factores

independientes y, la interacción de los dos, afecta los tres parámetros evaluados

(p<0.05) (Tabla 6-4). Este aspecto debería ser tenido en cuenta en procesos de

muestreo de material vegetal y de selección de métodos de extracción, debido a que de

acuerdo al órgano o al método de extracción se puede obtener RNA de muy buena ó

mala calidad y cantidad.

Tabla 6-4. Efecto del órgano, método de extracción de RNA y su interacción en el rendimiento, calidad e integridad

Parámetro Valores de p de prueba de Kruskall-Wallis

Órgano Método Interacción Órgano – Método

Rendimiento < 2.6 10-16

< 2.6 10-16

1.65 10-15

Calidad 0.0408 < 2.6 10-16

1.35 10-5

Integridad < 2.6 10-16

2.82 10-10

2.42 10-12

6.3.2 Diferencias entre los tres métodos de extracción

Algunas sustancias utilizadas en las fases de extracción y de precipitación son distintas

en los tres métodos. En la tabla 6-5 se observan las diferencias entre los tres métodos de

extracción de RNA las cuales podrían afectar el rendimiento, la integridad y calidad del

RNA.

Tabla 6-5. Diferencias entre los tres métodos de extracción Trizol CTAB Sephadex

Agente para el rompimiento de las células

Sarkosyl Tioisocianato de Guanidina

CTAB SDS

Agente denaturante de proteínas

Sarkosyl Tioisocianato de Guanidina Cloroformo Fenol

CTAB Cloroformo: isoamil-alcohol

Fenol Cloroformo

Agente inhibidor de RNasas Tioisocianato de Guanidina EDTA EDTA

Eliminación de carbohidratos Fenol Cloroformo

Cloroformo Fenol Cloroformo

Eliminación de compuestos Fenólicos

Cloroformo Cloroformo: isoamil-alcohol PVP-40 Na2SO3

Cloroformo Sephadex

Precipitación de RNA Isopropanol LiCl -

Tiempo 1h 30min 2h 45min


Fase de extracción de ácidos nucleicos

En la fase de extracción la diferencia radica principalmente en el buffer, en donde el

agente utilizado para el rompimiento de las células (detergente o surfactante) tiene un

gran efecto sobre la integridad y rendimiento del RNA.

En el método CTAB el agente que se utiliza para el rompimiento de las células es CTAB

que es un detergente catiónico, mientras que el detergente aniónico SDS se utiliza en el

método fenol:cloroformo seguido de purificación con Sephadex. Por otro lado, en el

método Trizol® (Invitrogen) el agente es sarkosyl en compañía de tioisocianato de

guanidina que además de ayudar al rompimiento de las células actúa como un inhibidor

de RNasas (Tabla 6-5). Por lo tanto, la fase de extracción podría ser más eficiente en el

método de Trizol® (Invitrogen) en donde se utilizan dos agentes que ayudan a romper las

células además contribuyen con la denaturación de proteínas, asimismo este reactivo

tiene otros agentes denaturantes fuertes (no revelados) (Liu et al., 1998) que pueden

contribuir con la extracción reflejándose en un mayor rendimiento y una mejor calidad

(radio de la absorbancia 260/280nm) en los extractos obtenidos por este método de

extracción; mientras que en los otros dos métodos de extracción esta función sólo es

llevada a cabo por un detergente. Sin embargo, CTAB y SDS son detergentes iónicos

que tienen una fuerte capacidad de rompimiento de membranas.

Otro de los aspectos a tener en cuenta en la composición del buffer es la presencia de

sales sobre todo cuando el detergente utilizado es catiónico como el caso de CTAB, las

sales permiten la solubilización del RNA evitando que el detergente catiónico forme

complejos con el RNA, en algunos casos no sólo se solubiliza el RNA, sino también otras

sustancias como proteínas y polisacáridos afectando la calidad del RNA. Por esta razón,

es posible que en los extractos obtenidos por CTAB se presentaron valores más bajos

del radio 260/280nm.

Fase de precipitación de RNA

Los ácidos nucleicos son solubles en agua debido a que son polares por lo tanto pueden

interactuar electrostáticamente con las moléculas de agua (Sambrook et al., 1989). En

los métodos de extracción generalmente se utilizan sales con el objetivo de neutralizar

las cargas en las moléculas de RNA debido a que en solución las sales forman iones, por

lo tanto, los cationes producidos reaccionarían con los grupos fosfatos de las moléculas


59

de RNA, disminuyendo su solubilidad. Posteriormente, con la adición de etanol se

disminuye la hidrofilicidad de las moléculas de RNA conllevando a su precipitación

(Sambrook et al., 1989).

Una de las diferencias en los tres métodos de extracción de RNA utilizados fue el

proceso de precipitación: en el método basado en fenol:cloroformo seguido de

purificación por Sephadex no hay un proceso de precipitación como tal, en el método

basado en CTAB la precipitación se basa en LiCl, mientras que por Trizol® (invitrogen) la

precipitación se hizo con Isopropanol (Tabla 6-5).

Con el método basado en CTAB se obtuvo el menor rendimiento en la mayoría de los

órganos evaluados (excepto en brotes de tubérculo). La precipitación del RNA se realizó

con LiCl debido a que este permite la deshidratación del RNA haciendo que las

moléculas se agreguen contribuyendo con su precipitación, su gran utilidad en la

precipitación de RNA se ha atribuido a que este no es eficiente para precipitar sustancias

como DNA, proteínas y carbohidratos, permitiendo una precipitación eficiente del RNA

(Barlow et al., 1993). A pesar de esto, Chan et al. (2004) y Rubio y Zapata (2011) han

reportado que en algunas ocasiones las altas concentraciones de LiCl pueden contribuir

con un incremento en las cantidad de impurezas (polifenoles y carbohidratos) cuando se

realizan extracciones de RNA, lo cual afecta la concentración y calidad del RNA; que

posiblemente fue lo que pudo haber afectado el rendimiento en los extractos obtenidos

por este método.

A pesar de que por el método basado en CTAB se obtuvo el menor rendimiento, las

diferencias no fueron significativas (p<0.05) con respecto a los extractos obtenidos por

fenol cloroformo seguido por purificación con Sephadex en donde no se realizó un

proceso de precipitación. En este método el extracto impuro es purificado por medio de la

utilización de columnas de exclusión con Sephadex G-50 en donde se permite que

moléculas grandes como RNA (en particular de doble cadena) pasen rápidamente a

través de la columna y en la resina se quedan atrapadas moléculas de pequeño tamaño

como sales y fenoles (Amershan Biosciences, 2002). Probablemente durante el proceso

de purificación se disminuye el rendimiento debido a que través de la columna pueden

pasar algunas sustancias de alto peso molecular como polisacáridos y polifenoles,


proteínas de alto peso molecular, entre otras que afectan el rendimiento y calidad de los

extractos obtenidos por este método de extracción.

6.3.3 Relación entre calidad, integridad y rendimiento

En la Figura 6-3 se muestran los resultados del análisis de componentes principales, en

donde en la Figura 6-3ª se muestra el circulo de correlaciones de la integridad,

rendimiento y calidad, observándose, que integridad y rendimiento se encuentran

correlacionados debido a que el ángulo que se formó entre los dos vectores es pequeño,

esto puede ser debido a que una de las etapas más importantes durante la extracción es

la fase inicial (maceración del material vegetal y extracción) porque se da la liberación de

nucleasas que afectan el proceso de extracción, por lo tanto si no se tiene especial

atención en este aspecto se presentará una degradación del RNA (integridad) que a su

vez afectará el rendimiento de la extracción. A partir del círculo de correlaciones se

puede observar que los extractos de mayor calidad, rendimiento e integridad se

encuentran ubicados en los cuadrantes izquierdos.

En la Figura 6-3B se observan los resultados del análisis de componentes principales

agrupados por método de extracción en donde ser observa que no hay diferencias

estadísticamente significativas entre los tres métodos de extracción, a pesar de las

diferencias encontradas en los tres métodos de extracción y de que los parámetros

revisados hasta el momento parecen indicar que Trizol® (Invitrogen) reúne un mayor

número de atributos en términos de calidad, cantidad e integridad del RNA porque

presentó los mayores valores en estos tres parámetros. El grupo formado por los

extractos obtenidos por fenol cloroformo seguido por purificación con Sephadex es casi

idéntico al grupo constituido por los extractos obtenidos por CTAB, lo cual es debido a

que no se presentaron diferencias estadísticamente significativas entre los dos métodos

de extracción cuando se evaluaron los tres parámetros cuantitativos (p>0.05) y el grupo

formado por los extractos obtenidos por Trizol® (Invitrogen) no difiere mucho de los

grupos formados por los otros dos métodos de extracción; sin embargo, se encuentra

ubicado hacia los dos cuadrantes izquierdos (Figura 6-3B) en donde se encontrarían

localizados los extractos con mejor rendimiento, calidad e integridad de acuerdo a las

coordenadas del círculo de correlaciones (Figura 6-3ª).


61

Al evaluar los grupos formados en el análisis de componentes principales según órgano

(Figura 6-3C) se encontró que entre foliolo, peciolo, pétalos, tallo, raíz primaria y brotes

de tubérculo no se presentaron diferencias estadísticamente significativas, pedúnculo

floral que fue el órgano que presentó mayor rendimiento e integridad presentó diferencias

con los demás órganos excepto con antera que también fue un órgano con el que se

obtuvieron altos valores en estas dos variables, mientras que raíz secundaria que fue el

órgano con el que se presentaron los menores valores en los tres parámetros evaluados

Figura 6-3. Gráficos del análisis de componentes principales. A. Círculo de correlaciones. B. Agrupación de los resultados de análisis de componentes principales según método de extracción. En color azul los extractos obtenidos por Sephadex, en color rojo los obtenidos por CTAB y en verde los obtenidos por Trizol

® (Invitrogen). C. Agrupación de los resultados de análisis de

componentes principales según órgano. En color rojo las muestras de antera, en color azul brote de tubérculo, en azul claro las muestras de foliolo, en rosado las muestras de peciolo, en verde pedúnculo floral, en amarillo pétalo, en azul oscuro raíz primaria, en púrpura las muestras de raíz secundaria y en color café las muestras de tallo. D. Agrupación de los resultados del análisis de

componentes principales por resultado de RT-PCR.

A B

C D


se ubicó hacia los cuadrantes del lado derecho que de acuerdo al círculo de

correlaciones (Figura 6-3ª) correspondería a las muestras con menores valores de las

tres variables analizadas. Estos resultados sugerirían que muestras de antera y

pedúnculo floral podrían ser útiles a la hora de seleccionar órganos de plantas de papa

para procesos de extracción de RNA debido a que con estos dos órganos se presentaron

los mayores valores de rendimiento, integridad y calidad.

6.3.4 . RT-PCR del gen CP de PYVV

Para una síntesis de cDNA viral adecuada y el subsecuente uso para amplificación de

genes es necesario partir de una extracción de RNA que permita obtener un material de

alta cantidad y cantidad. Para evaluar los extractos obtenidos por los tres métodos de

extracción de RNA en los órganos evaluados se amplificó del gen completo de la

proteína mayor de la cápside de PYVV. Con los tres métodos de extracción se obtuvo

amplificados del tamaño esperado (769pb) en todos los órganos evaluados (Figura 6-4),

aunque en algunos órganos el porcentaje de detección no fue del 100% (Figura 6-5).

Figura 6-4. Gel de agarosa 1% de los productos de RT-PCR del gen de la proteína mayor de la cápside con extractos de todos los órganos evaluados extraídos con las tres metodologías de extracción (Tamaño esperado 759pb). Para los tres geles M corresponde al marcador de peso molecular GeneRuler 100pb (Fermentas), carril 1: antera, carril 2: foliolo, carril 3: peciolo, carril 4: pedúnculo floral, carril 5: pétalo, carril 6: brote de tubérculo, carril 7: tallo, carril 8: raíz primaria, carril 9: raíz secundaria, carriles 10 y 11: controles positivos, carril 12: muestra de S. tuberosum Grupo Phueja obtenida a partir de cultivo de meristemos y carril 13: muestra de C. madurensis,

Lour infectada con CTV.

Se evaluaron 84 muestras por cada método de extracción (4 de antera y 10 por cada uno

de los órganos restantes) y se encontró que por Sephadex se pudo amplificar el gen de

la proteína mayor de la cápside de PYVV en el 83.3% de las muestras analizadas, por

CTAB en el 85.7% y por Trizol® (Invitrogen) en el 89.3%. En la Figura 6-5 se puede

observar el porcentaje de muestras positivas y negativas por RT-PCR para el gen CP de


63

Figura 6-5. Porcentaje de muestras RT-PCR positivas y RT-PCR negativas obtenidos en todos los órganos evaluados en los tres métodos de extracción. La fracción de la barra de color azul claro corresponde a las muestras RT-PCR positivas y la fracción de color azul oscuro a las muestras RT-PCR negativas. En la tabla debajo de las gráficas se encuentra el número de muestras positivas y negativas en cada órgano.

PYVV, se encontró que en algunos órganos (foliolo, brote de tubérculo, raíz primaria y

raíz secundaria) no se logró detectar el virus en todas las muestras evaluadas por los

tres métodos de extracción, aunque hay que tener en cuenta que a pesar de esto se


logró detectar entre el 70% y el 90% de las muestras evaluadas, en antera se logró la

detección en todas las muestras obtenidas por los tres métodos de extracción, en

pedúnculo floral sólo se logró detectar el virus en todos los extractos obtenidos por CTAB

y Trizol® (Invitrogen), en peciolo y pétalo sólo se detectó el virus en la totalidad de las

muestras extraídas por Trizol® (Invitrogen).

El hecho de que en raíz se haya obtenido los extractos de menor rendimiento, calidad e

integridad (Figura 6-3C), además de un menor porcentaje de detección de PYVV por RT-

PCR que en los demás órganos (Figura 6-5) podría ser debido a la acumulación

diferencial de algunas sustancias en este órgano que afectan los procesos de extracción.

Por ejemplo los polisacáridos, estos presentan un mayor contenido en la zona radical de

plantas de papa (St-Pierre et al., 1996), es posible que en los tres métodos utilizados no

se haya eliminado completamente estas sustancias lo cual interfirió con los extractos

obtenidos a partir de este tejido.

Otras sustancias como los polifenoles también afectan el proceso de extracción, l-a

polifenol oxidasa (PPO) que es la enzima relacionada con el pardeamiento enzimático se

distribuye principalmente en tejidos en desarrollo como por ejemplo flores y en la zona

radical (Thygesen et al., 1995). Por lo tanto se esperaría que en estos órganos se

afectara la extracción de RNA, esto se evidenció en las muestras de la zona radical en

donde se obtuvieron los menores valores de los tres parámetros evaluados (Figura 6-3C)

y un menor porcentaje de detección de PYVV por RT-PCR que en los demás órganos,

pero no se relacionó con flor (pedúnculo, antera y pétalos), a pesar de que hay una alta

acumulación de esta enzima en este órgano, en los extractos obtenidos los valores de los

tres parámetros fueron aceptables, además al hacer RT-PCR para amplificar el gen CP

de PYVV en estas muestras se logró la detección del virus (Figura 6-5) (confirmando que

los extractos obtenidos eran adecuados en procesos de síntesis de cDNA y

amplificación), lo que sugiere que los procesos de extracción permitieron la eliminación

de estas sustancias en los extractos obtenidos a partir de órganos florales, es posible

que el procesamiento del material vegetal sea más fácil en muestras de órganos florales

que en la zona radical de la planta en donde en el proceso de maceración se da

oxidación del material (probablemente por la actividad de la enzima PPO).

Con respecto al tiempo el método de fenol:cloroformo seguido de Sephadex resulta ser el

método más rápido para el procesamiento de las muestras (Tabla 6-5), aunque en este


65

método hay que ser muy cuidadoso en la preparación de las columnas para poder

obtener resultados exitosos. El siguiente método en términos de duración de tiempo fue

Trizol® (Invitrogen) con una hora y media y el de mayor duración fue CTAB con dos horas

de procesamiento. A pesar de que Trizol® (Invitrogen) no presentó el menor tiempo de

procesamiento, los resultados obtenidos en los ensayos de amplificación de RNA,

determinación del rendimiento, integridad y calidad el método con el que se obtuvieron

los mejores resultados fue Trizol® (Invitrogen) además permitió la extracción y detección

del virus en todos los órganos evaluados, sin embargo no quiere decir que los otros dos

métodos no sean eficientes, estos fueron seleccionados debido a su gran utilidad en la

extracción de RNA vegetal en otros estudios realizados en el Laboratorio de Virus

Vegetales relacionados con la papa criolla.

Hay que tener en cuenta que PYVV se encuentra limitado al floema, por lo tanto

esperaría detectarse en casi toda la planta, a pesar de esto la extracción de RNA a partir

de algunos tejidos podría dificultarse como lo han propuesto López et al. (2006) quienes

han sugerido que por lo menos para tubérculo parecería que la distribución de PYVV

fuera irregular y con bajas cargas virales, lo que también podría ocurrir con el resto de la

planta; esto podría conllevar a obtener falsos negativos. A pesar de esto el virus logró ser

detectado por RT-PCR en todos los órganos evaluados: pétalo, tallo, peciolo, foliolo, raíz,

brotes de tubérculo, pedúnculo floral y antera; en donde los dos últimos presentaron

diferencias con los demás órganos con respecto a los tres parámetros evaluados

presentando los valores más altos (Figura 6-3C), lo que sugiere que estos dos órganos

serían un buen material de partida en procesos rutinarios de detección que impliquen la

extracción de RNA.

En este trabajo se analizó por primera vez diferentes órganos de papa como fuente para

la extracción del RNA de PYVV, un virus limitado al floema de la planta, el cual pudo ser

detectado en todos los órganos evaluados. Se concluye que Trizol® (Invitrogen) es un

método eficiente en cuanto a rendimiento, no presenta una alta contaminación con

proteínas y presentó una buena integridad, además es un método rápido que permitió la

amplificación de genes a partir de cualquier órgano. Los resultados obtenidos en este

trabajo resultan útiles para monitorear la presencia y dispersión del virus en diferentes


órganos, en programas de fitomejoramiento, de certificación de semillas e indexación de

material vegetal.

Agradecimientos

Esta investigación se realizó gracias al apoyo económico y técnico del Ministerio de

Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia y a Colciencias (201010016538). Al

Laboratorio de Microbiología del IBUN por el préstamo del espectrofotómetro para

realizar el ensayo de la estimación de la relación 260/280nm. Al Laboratorio de

Investigaciones de la Facultad de Medicina de la Universidad Militar Nueva Granada por

el préstamo de la celda de cuarzo.

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mailto:http://www.aphis.usda.gov/import_export/plants/plant_imports/downloads/RegulatedPestList.pdf

7. Artículo 2

PCR en tiempo real para la detección y cuantificación del gen de la proteína mayor de la cápside del Potato yellow vein virus (PYVV) en

diferentes órganos de plantas de Solanum tuberosum Grupo Phureja infectadas con el virus

Resúmen

Potato yellow vein virus (PYVV) se ha detectado en extractos de foliolos y en brotes de

tubérculos de papa por medio de NASH, RT-PCR y PCR en tiempo real (qPCR). En este

trabajo el gen de la proteína mayor de cápside (CP) se detectó por RT-PCR convencional

y PCR en tiempo real con Sondas TaqMan® a partir de muestras de diferentes órganos

de plantas de Solanum tuberosum Grupo Phureja (papa criolla) que expresaban

diferentes niveles de sintomatología o no sintomáticas (NS) pero RT-PCR positivas. Se

extrajo RNA de diferentes órganos de la zona aérea (foliolo, peciolo, tallo, pedúnculo

floral, pétalo y antera) y de la zona radical (raíz primaria y secundaria). PYVV se detectó

en todos los órganos evaluados utilizando ambas metodologías, aunque con una mayor

sensibilidad por qPCR (100 veces más sensible). Los resultados indican que en plantas

(NS RT-PCR +) no se hay diferencias en la acumulación de PYVV en los diferentes

órganos evaluados mientras que cuando la planta expresa síntomas la acumulación de

PYVV es diferencial (distribución heterogénea), con mayor acumulación en pedúnculo

floral y foliolo, y menor acumulación en zona radical y antera. Es la primera vez que se

hace un seguimiento de PYVV en diferentes órganos de papa criolla utilizando qPCR.

Los resultados proveen información sobre la distribución del virus tanto en plantas

infectadas que expresan síntomas como no sintomáticas y esta información podría ser de

interés para agricultores y fitomejoradores. Para la detección de PYVV en programas de


cuarentena así como en procesos de indexación de PYVV para la producción de semilla

libre de virus la técnica de qPCR podría ser muy útil.

Palabras claves: Papa, virus, qPCR, órganos, proteína de cápside.

7.1 Introducción

Potato yellow vein virus (PYVV) es miembro de la familia Closteroviridae considerado una

especie tentativa del género Crinivirus conformado por un genoma tripartita de ssRNA(+)

(Livieratos et al., 2004). Las partículas virales son filamentosas, están limitadas al floema,

es transmitido de manera vegetativa por los tubérculos (semilla) (Salazar et al., 2000) y

semipersistentemente por mosca blanca (Trialeurodes vaporariorum, Westwood)

(Buriticá, 1971, Gamarra et al., 2006).

PYVV es el agente causal de la enfermedad de amarillamiento de venas (PYVD)

reportada por Alba (1950) en Antioquia (Colombia). La enfermedad afecta la producción

de papa reduciéndola hasta en un 50% en Solanum tuberosum Grupo Tuberosum cv

Diacol Capiro (Salazar et al., 2000) y más de 25% en S. tuberosum Grupo Phureja

(Guzmán et al., 2011). PYVV es un virus reemergente declarado cuarentenario en

Europa y en Estados Unidos (OEPP/EPPO, 1979; USDA – APHIS, 2000). La dispersión

por tubérculos y vector natural es alta y los reportes indican que PYVV está presente en

algunos países andinos como Venezuela, Colombia, Ecuador y Perú (Salazar et al.,

2000).

El uso de técnicas moleculares como NASH (Salazar et al., 2000), RT-PCR (Offei et al.,

2004; Guzmán et al., 2006 y 2010; Wei et al., 2009) y qPCR (López et al., 2006;

Hernández et al., 2010) han permitido la detección de PYVV en extractos de muestras de

foliolo y en muestras de brotes de tubérculo (Guzmán et al. 2006 y 2010; Hernández et

al. 2010). Estudios basados en qPCR han informado sobre expresión de genes,

detección de secuencias específicas en diferentes tipos de muestras, diagnóstico

específico y cuantificación de virus (Bustin, 2002; Heid et al., 1996; Mackay et al., 2002).

La alta sensibilidad, alta especificidad, alta reproducibilidad, no requiere de un

procesamiento post-PCR, y permite hacer una estimación precisa del número de copias

de un gen blanco, hacen que qPCR sea una herramienta muy útil en estudios de

Artículo 2. PCR en tiempo real para la detección y cuantificación del gen de la proteína mayor de la cápside del Potato yellow vein virus (PYVV) en diferentes órganos de plantas de Solanum tuberosum Grupo Phureja infectadas con el virus

71

diferentes aspectos de la biología de virus (Bustin, 2002; Heid et al., 1996; Mackay et al.,

2002).

Como miembro de la familia Closteroviridae, PYVV se limita al floema y las células

adyacentes. Sin embargo, hasta el momento no se ha estudiado si PYVV se distribuye de

manera similar en todos los órganos de plantas de S. tuberosum Grupo Phureja o si la

acumulación viral es o no diferencial en estos órganos tanto en muestras de plantas

sintomáticas como no sintomáticas RT-PCR positivas para PYVV. El objetivo del

presente trabajo es analizar estos supuestos utilizando las técnicas de RT-PCR y qPCR

en muestras de diferentes órganos. De manera general, los resultados indican que PYVV

se distribuye en todos los órganos de la planta de papa criolla con acumulación viral

diferencial entre órganos aéreos y radicales de plantas sintomáticas pero con cargas

virales similares en los órganos de las plantas no sintomáticas.


7.2.1 Material vegetal y aislados virales

Plantas de S. tuberosum Grupo Phureja (papa criolla) infectadas con PYVV

Se recolectaron plantas de S. tuberosum Grupo Phureja en cultivos de papa criolla en el

municipio de Chipaque (Cundinamarca). Se tomaron diez plantas completas (parte aérea

y radical) con una edad aproximada de dos meses y que expresaban diferentes niveles

de sintomatología de PYVD: cinco con sintomatología severa (S) y cinco con

sintomatología moderada (M). Las plantas se transportaron al patio del Instituto de

Biotecnología de la Universidad Nacional (IBUN) donde fueron mantenidas durante dos

meses más. Estas fueron sembradas en materas utilizando como sustrato una mezcla de

tierra: cascarilla de arroz (3:1), se regaron con agua dos veces por semana y se

fertilizaron con Nitrógeno: Fósforo: Potasio (15:15:15) el día de la siembra en matera y un

mes después. Adicionalmente se hizo control para hongos fumigando una vez a la

semana con Benlate 0.1% y para el control de mosca blanca se fumigó dos veces a la

semana con Karate® 1.5cc/L. Estas plantas se denominaron plantas donadoras de

PYVV.


Plantas de S. tuberosum Grupo Phureja libres de virus

Como controles negativos se utilizaron plantas de papa criolla Clon 1 obtenidas a partir

de cultivo de meristemos in vitro adquiridas en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos y de

Biología Molecular de Plantas del IBUN. Las plántulas se propagaron por esquejes y se

trasplantaron a materas con turba para hacer el proceso de adaptación. Después de

ocho días se pasaron a materas con tierra: cascarilla de arroz (3:1), fueron mantenidas

en jaulas entomológicas en el patio del IBUN. Antes de la utilización de las plantas en los

ensayos de transmisión estas fueron analizadas por RT-PCR (reacción y condiciones

descritas más adelante) para el gen CP de PYVV utilizando material foliar para confirmar

que las plantas estaban libres de PYVV. Estas plantas se denominaron plantas

receptoras de PYVV.

7.2.2 Transmisión de PYVV por vector natural T. vaporariorum (Westwood)

Cria de mosca blanca

Inicialmente se estableció una cria de mosca blanca donadas por la Universidad Militar

Nueva Granada (UMNG) en plantas de calabacín (Cucurbita pepo), mantenidas en jaulas

entomológicas selladas con velo suizo en el invernadero de la Facultad de Agronomía de

la Unal.

Obtención del vector virulífero

Aproximadamente 700 adultos de T. vaporariorum avirulíferos se liberaron en una jaula

entomológica que contenía las plantas donadoras de PYVV (plantas de papa criolla que

habían sido confirmadas por RT-PCR como positivas para PYVV y con una edad

aproximada de tres meses) para su alimentación durante un periodo de 48h tiempo en el

cual se aseguraría la adquisición del virus (moscas virulíferas). La transmisión se realizó

en el invernadero en cajas entomológicas.

Ensayos de transmisión

Las moscas virulíferas se utilizaron para hacer un ensayo de transmisión para evaluar la

acumulación del virus en diferentes órganos de plantas infectadas, en el cual se liberaron


73

entre 20 a 50 moscas virulíferas por plántula receptora (12 plántulas) durante un periodo

de 48 horas sin limitación del sitio de inoculación y después de este periodo se fumigaron

con Karate® 1.5cc/L para eliminar la mosca blanca. Las plantas receptoras se

mantuvieron en jaulas entomológica y se fumigaron contra mosca blanca dos veces a la

semana. A estas plantas se les realizó un seguimiento de sintomatología y confirmación

de la presencia de PYVV por RT-PCR para el gen de la proteína mayor de la cápside.

7.2.3 Extracción de RNA

Extracción de RNA del vector natural

Para confirmar que las moscas eran portadoras del virus (moscas virulíferas) se utilizó el

protocolo previamente establecido por el grupo de Virus vegetales del IBUN (Barragán y

Guzmán. 2012), en donde se obtuvieron extractos de RNA a partir de T. vaporariorum

(Westwood) utilizando el kit SV Total RNA isolation (Promega) teniendo en cuenta las

instrucción del fabricante (Anexo A.4).

Extracción de RNA vegetal

Todos los extractos de RNA fueron obtenidos utilizando Trizol® (Invitrogen) de acuerdo a

las instrucción del fabricante (Anexo A.1). Se obtuvieron extractos de RNA de muestras

de foliolo de plantas receptoras y donadoras para confirmar la presencia de PYVV por

RT-PCR (reacción y condiciones descritas más adelante). De las plantas resultantes en

el ensayo de transmisión se seleccionaron tres RT-PCR positivas: una NS, una M y una

S para evaluar la acumulación del virus en varios órganos de plantas infectadas. De

manera aleatoria se tomaron muestras de diferentes órganos en estas plantas (Tabla 8-

1) y se hizo extracción de RNA.

Con el fin de tener la certeza de detectar el exclusivamente RNA viral, todos los extractos

fueron tratados con DNasa I para lo cual se adicionó 20U de enzima y se dejó incubar

durante 15min a 37°C.


Tabla 7-1. Muestras analizadas para evaluar la acumulación del virus en diferentes órganos de plantas infectadas

Zona Órgano

Planta

*No Sintomática

Sintomática

Moderado Severo

Radical Raíz Primaria 2 6 9

Raíz Secundaria 7 4 18

Aérea

Foliolo 24 27 36

Peciolo 24 27 39

Tallo 3 7 10

Pétalo 0 6 2

Pedúnculo floral 0 6 2

Antera 0 6 2

No se pudo evaluar muestras de tubérculo debido a que ninguna de las plantas tuberizó. * No se tomaron muestras de pétalos, anteras y pedúnculo floral debido a que esta planta no floreció.

7.2.4 Detección de PYVV por RT-PCR y qPCR

Extractos de RNA de muestras de foliolo de las plantas donadoras y receptoras en el

procesos de transmisión y las muestras utilizadas para la evaluación de la acumulación

del virus en diferentes órganos de plantas infectadas (Tabla 7–1) fueron evaluadas por

amplificación para el gen de la proteína mayor de la cápside de PYVV utilizando RT-PCR

convencional con los primers descritos en la Tabla 7-2 y por qPCR con los primers y

sondas descritos en la Tabla 7-3.

Síntesis de cDNA

A partir de los extractos de RNA se obtuvo cDNA el cual fue repartido en dos fracciones:

una para evaluación por PCR y la otra para evaluación por qPCR. La síntesis de cDNA

se llevo a cabo en un volumen final de 10µl adicionando una mezcla de 1X buffer de

reacción (Epicentre), 1mM de dNTPs (Bioline), 10mM de DTT (Epicentre), 0.4µM de

primer 3´ (Tabla 7-2), 1.6U de RNAse inhibitor (Fermentas), 8U de MMLV HP (Epicentre)

y 100ng de RNA, se incubó durante una hora a 42°C seguida de una denaturación a

70°C por 10min. El producto de esta reacción se repartió en dos: una fracción para

evaluación por PCR y la otra para evaluación por qPCR.

PCR




75


amplificación consiste de una denaturación inicial a 94ºC durante 3min, 35 ciclos de




2006).

Tabla 7-2. Primers para la amplificación del gen completo de la proteína de la cápside de PYVV.


3 Reverse 5’ AAG CTT CTA CTC AAT AGA TCC TGC TA 3’ Rodríguez et al., 2009


Como control positivo se utilizó una muestra foliar de una planta que expresaba síntomas

para PYVV y que había sido positiva por RT-PCR y como controles negativos una

muestra foliar de una planta de Calamondino (Citrofortunella madurensis, Lour). infectada

con el virus Citrus tristeza virus (CTV) de la familia Closteroviridae y una muestra foliar de

S. tuberosum Grupo Phureja libre de virus (obtenida por cultivo in vitro de meristemos).

Los productos de PCR fueron visualizados en geles de agarosa 1% preparados en TAE

1X (0.04M Tris-Acetato, 0.001M EDTA) y teñidos con SYBR®Safe (Invitrogen), corridos a

70V constantes durante una hora y visualizados en digitalizador Gel Doc® (BIO-RAD).

PCR en tiempo real

Las reacciones de qPCR se realizaron en el Laboratorio de Biología Molecular de Plantas

del IBUN con el equipo LightCycler 480 (Roche), usando la química de sondas TaqMan®

para amplificar un fragmento de 79pb de la proteína mayor de la cápside de PYVV y

como control interno se amplificó un fragmento de 79pb del gen Citocromo oxidasa

(COX) de expresión constitutiva en la planta (López et al., 2006). Se utilizaron las sondas

y primers reportados por López et al. (2006) con algunas modificaciones en el marcaje de

las sondas. En el trabajo de López et al. (2006) la sonda para detectar a COX estaba

marcada con JOE, en este caso el marcaje se hizo con HEX (Tabla 7-3)



Primer Sonda

Dirección Secuencia Gen Tamaño

esperado (pb)

PYVV-591-F Forward 5’ CGG AGA TTA TGT CAA TGG TTC GA 3’

Proteína mayor de la cápside

79 PYVV-670-R Reverse 5’ TTG CTG CAT TCT TGA ACA GGT AA 3’

Sonda CP (465:510)

5’ 6-FAM AAC CAA CAT TTC TGA TGA TGA TTT GAC TGC AA 3’ BHQ1

COX – F Forward 5’ CGT CGC ATT CCA GAT TAT CCA 3’ *Citocromo Oxidasa

79 COX – R Reverse 5’ CAA CTA CGG ATA TAT AAG AGC CAA AAC TG 3’

Sonda COX (533:580)

5’ HEX TGC TTA CGC TGG ATG GAA TGC CCT 3’ BHQ2

Los valores entre paréntesis corresponden a las longitudes de onda en nanómetros de excitación: emisión de los fluorocromos. * Control interno de la reacción

Las reacciones de amplificación se realizaron en placas opacas (Roche) de 98 pozos y

se utilizó 1X de buffer NH4 (Bioline), 5.5mM de MgCl2 (Bioline), 0.5mM de dNTPs

(Bioline), 0.3µM de cada primer, 0.24µM de la sonda (Tabla 7-3), 1U de biolasa, 2µl de

cDNA en un volumen final de 10µl. El programa de amplificación consiste de una

denaturación inicial durante 10min a 95ºC, 45 ciclos de amplificación con una

denaturación a 95ºC por 10s y alineamiento a 55ºC por 30s.

En las reacciones de qPCR se incluyeron los siguientes controles: (1) control positivo:

muestra de papa criolla infectada con PYVV RT-PCR positivo para el gen de la proteína

mayor de la cápside de PYVV, (2) control positivo: uno de los puntos utilizados para la

construcción de la curva estándar (3) control para evaluación de contaminación de

reactivos: reacción en la que el molde es agua, (4) control para la evaluación de

reacciones cruzadas con genes de otros virus: muestra de C. madurensis, Lour infectada

con CTV (5) control para la evaluación de reacciones cruzadas con genes de la planta:

muestra de planta de papa criolla libre de virus obtenida a partir de cultivo de meristemos

in vitro.(6) control para evaluar si los extractos están contaminados con DNA: muestra en

la cual el molde es el control positivo pero en este no se adiciona retrotranscriptasa

durante la síntesis de cDNA.

Adicionalmente cada una de las muestras fue amplificada con una pareja de primers para

el gen citocromo oxidasa (COX) con el objetivo de confirmar que las extracciones de

RNA fueron realizadas apropiadamente y para descartar falsos negativos.

Curva estándar para la cuantificación absoluta

Para poder determinar el número de copias del gen de la proteína mayor de la cápside

en cada una de las muestras, se construyó una curva estándar utilizando diluciones


77

seriadas de transcritos de RNA de concentración conocida obtenidos a partir de un

plásmido pGEM-T® (Promega) cuyo inserto era el gen completo de la proteína mayor de

la cápside de PYVV y que presentaba un promotor T7 para que pudiera ser utilizado para

hacer transcripción in vitro del gen (Anexo E) (aportado por la estudiante de doctorado

Patricia Rodríguez del Laboratorio de Virus Vegetales del IBUN).

Los transcritos fueron cuantificados utilizando el kit Quant-iTTM RiboGreen Assay

(Invitrogen) teniendo en cuenta las instrucciones del fabricante (Anexo B) y se utilizaron

para construir la curva estándar graficando el valor Ct (threshold cycle) de cada una de

las diluciones versus el logaritmo del número de copias del gen de la proteína mayor de

la cápside de PYVV. Cada punto de la curva estándar se corrió por duplicado y para

validar la cuantificación absoluta se corrió en tres ensayos independientes. Se pudo

determinar la carga viral en cada una de las muestras por la interpolación del valor Ct en

la curva estándar. La estimación del número de copias del gen CP de los estándares

utilizados para la construcción de la curva estándar se hizo de acuerdo a la siguiente

ecuación:

En donde la cantidad de transcrito de RNA debe ser expresada en mg, el número de

avogadro corresponde a , # pb a número de pares de bases del transcrito,

340 es el peso molecular de una hebra de RNA.

La eficiencia de amplificación fue calculada a partir de la pendiente de la curva estándar

usando la fórmula:


Se calculó el promedio del número de copias para cada órgano evaluado, la desviación

estándar y coeficiente de variación (CV%) inter-ensayo (porcentaje de la desviación

estándar en comparación con el promedio del número de copias). Los análisis


estadísticos se realizaron utilizando el Software R (R Development Core Team, 2008). La

distribución de todos los datos fue evaluada utilizando el test de normalidad Shapiro Wilk.

Debido a que los resultados no presentaron una distribución normal se realizaron

comparaciones para evaluar si se presentaban diferencias en la carga viral entre los

órganos mediante la aplicación de una prueba Mann-Whitney acompañada de la

corrección de Bonferroni a nivel de significancia (p<0.05) para controlar la tasa de error

(Yuan et al., 2006).

7.3 Resultados

7.3.1 Transmisión de PYVV utilizando el vector natural

En la Figura 7-1A se muestran los productos de RT-PCR para la detección del gen CP de

PYVV (fragmento de 769 pb) obtenidos en muestras de plantas donadoras con diferentes

niveles de intensidad de síntomas: síntoma S: carriles 1-5 y síntoma M: carriles 1-10. En

la Figura 7-1B se incluyen las muestras de plantas receptoras antes de la transmisión

(carriles 1-5) y muestras positivas del vector virulífero (carriles 6 y 7). En la Figura 7-1C

se muestra la detección de PYVV por RT-PCR en plantas receptoras después de un mes

de la transmisión en donde cinco plantas no expresaron síntomas (carriles 1-5) y siete si

expresaron síntomas (carriles 6-12).

El porcentaje de transmisión fue del 75%, de doce plantas transmitidas en nueve se pudo

detectar el virus por RT-PCR (Figura 7-1, carriles 2, 4, 6-12), de las cuales dos no

expresaron síntomas (Figura 7-1, carriles 2 y 4) durante el ciclo de vida de la planta.

Las plantas sintomáticas no tuvieron el mismo nivel de intensidad en la expresión d-e

síntomas; cuatro presentaron sintomatología S y tres sintomatología M. De las plantas

receptoras obtenidas en el proceso de transmisión, se seleccionaron tres plantas RT-

PCR positivas para evaluar la acumulación del virus en diferentes órganos: una NS, una

M y una S, las cuales fueron analizadas a los cuatro meses de edad evaluando diferentes

órganos (foliolo, peciolo, tallo, pedúnculo floral, pétalo, antera, raíz primaria y

secundaria).


79

Figura 7-1. Detección del gen de la proteína mayor de la cápside de PYVV por RT-PCR. En los tres geles M corresponde a marcador de peso molecular GeneRuler 100pb (Fermentas), el control positivo corresponde a una muestra de planta que expresaba síntomas para PYVV positiva por RT-PCR. Como controles negativos: Muestra de calamondino infectada con CTV y S. tuberosum Grupo Phureja libre de virus. A. RT-PCR de las plantas donadoras del virus; los carriles 1-10 corresponde a plantas de papa criolla sintomáticas para PYVV, del carril 1 al 5 muestras de plantas M, y del carril 6 al 10 muestras de plantas S, el carril 11 al control positivo y los carriles 12 y 13 a controles negativos B. RT-PCR de plantas receptoras antes de la transmisión (carriles 1-5), vector natural virulífero alimentado con plantas S, (carril 6) vector virulífero alimentado con plantas M, (carril 7), vector avirulífero (carril 8), el carril 9 corresponde al control positivo, y los carriles 10 y 11 a controles negativos. C. RT-PCR de plantas receptoras después de cuatro semanas de la transmisión; carriles 1-5 plantas que no expresaron síntomas, carriles 6-12 plantas que expresaron síntomas, carril 13 control positivo, carriles 14-15 controles negativos.

7.3.2 Detección del gen CP de PYVV por RT – PCR convencional en muestras de diferentes órganos de plantas transmitidas con PYVV por vector natural

En la Figura 7-2 se muestra el porcentaje de muestras RT-PCR positivas (color azul

claro) y RT-PCR negativas (color azul oscuro) obtenidos en los órganos evaluados en las

tres plantas escogidas con diferentes grados de sintomatología (M, S y NS), a partir de

estos resultados se observa que en las plantas sintomáticas (tanto M, como S) se detectó

el mayor porcentaje de muestras positivas (en plantas M del 95.5% y en plantas S del

92.3%), mientras que en la planta que no expresó síntomas sólo se detecto el virus en el

46.6% de las muestras, sin embargo en esta planta se detectó PYVV en muestras de

foliolo, raíz primaria y secundaria. Como las plantas no tuberizaron seguramente por las


Figura 7-2. Porcentaje de muestras RT-PCR positivas y RT-PCR negativas obtenidos en todos los órganos evaluados en las tres plantas con diferentes grados de sintomatología (Severa, Moderada, No Sintomática). La fracción de la barra de color azul claro corresponde a las muestras RT-PCR positivas y la fracción de color azul oscuro a las muestras RT-PCR negativas. En la tabla debajo de las gráficas se encuentra el número de muestras positivas y negativas en cada órgano.

condiciones de cultivo (ex. temperatura), no se pudo evaluar la presencia de PYVV en

muestras de tubérculo de estas plantas.


81

En las plantas que expresaron síntomas pudo lograrse la detección por RT-PCR en todos

los órganos evaluados lo cual no ocurrió en la planta no sintomática en donde no se

detecto el virus en muestras de tallo y sólo se detectó el virus en un bajo porcentaje de

las muestras de peciolo (4.1%). En pedúnculo floral, pétalo, antera y raíz primaria se

logró la detección del virus en todas las muestras evaluadas en las tres plantas (hay que

tener en cuenta que en la planta no sintomática no se evaluó pedúnculo floral, pétalo y

antera debido a que no se desarrollaron flores en la planta); en foliolo se detectó el virus

en más del 90% de las muestras analizadas en las plantas sintomáticas y en el 83.3% de

muestras provenientes de la planta no sintomática; en raíz secundaria se detectó el virus

en el 15% de las muestras provenientes de la plantas con sintomatología severa, 75% de

muestras de la planta con sintomatología moderada y en muestras de planta no

sintomática se detectó en un 71.4%; y en las muestras de peciolo y tallo el virus se

detectó en un alto porcentaje de las muestras provenientes de plantas que expresan

síntomas (mayor al 80%) pero en la planta no sintomática la detección se hizo en un muy

bajo porcentaje de las muestras (< al 5% para peciolo y del 0% en tallo) (Figura 7-2).

7.3.3 PCR en tiempo real en diferentes órganos de plantas transmitidas con PYVV por vector natural

Cada una de las muestras evaluadas por RT-PCR convencional fue evaluada por qPCR

amplificando un fragmento del gen de la proteína mayor de la cápside de PYVV y como

control interno el gen COX de expresión constitutiva en la planta, el cual fue amplificado

para descartar falsos negativos. En todas las muestras evaluadas se logró la

amplificación del control interno y los valores del Ct fueron muy similares en todas las

muestras con un promedio de 15.9 0.46 así como se muestra en la Figura 7-3. Además

el porcentaje del coeficiente de variación inter-ensayo no fue mayor al 7% indicando una

buena reproducibilidad.


Figura 7-3. Curvas de amplificación obtenidas con la pareja de primers para COX.

Una vez se descartaron problemas de inhibición en el proceso de amplificación por qPCR

teniendo como referencia la amplificación del gen COX, cada muestra se evaluó por

qPCR para la cuantificación absoluta del gen de la proteína mayor de la cápside de

PYVV para lo cual se utilizó una curva estándar construida con transcritos de diferentes

concentraciones del gen CP de PYVV. El virus logró ser detectado en la totalidad de la

muestras de plantas S, M y NS utilizando qPCR.

7.3.4 Estimación del número de copias del gen CP de PYVV

En la figura 7-4, se presenta la curva estándar construida con diluciones de transcritos de

concentración conocida (a partir de la concentración se calculó el número de copias)

cuyos valores del número de copias iban desde 106 hasta 1010. Cada una de las

diluciones se corrió por duplicado y se repitió tres veces en corridas independientes

teniendo en cuenta que los resultados de cuantificación absoluta deben ser muy

reproducibles para su validación. En los tres casos se obtuvo un resultado similar en

donde el valor de la eficiencia cercano a dos y la pendiente de la curva fue de -3.27.

Con la curva estándar y a partir del valor Ct para cada una de las muestras se estimó el

número de copias del gen CP y a pesar de que por RT-PCR no se detectó el virus en

todas las muestras (Figura 7-2), por qPCR con sondas TaqMan® se logró la detección del

virus en todas las muestras evaluadas, los controles positivos amplificaron y en cada

corrida el valor Ct no presentó variaciones en estas reacciones. No se amplificó ninguno

de los controles negativos (planta libre de virus, planta de calamondino infectada con

CTV) indicando que los reactivos no estaban contaminados y que no había reacción


83

cruzada con genes de la planta o de virus de la familia Closteroviridae; ni tampoco

amplificó el control en el cual no se hizo retranscripción del control positivo mostrando

que los extractos no estaban contaminados con DNA.

Figura 7-4. Curva estándar construida para la determinación del número de copias del gen CP. (Cada punto de la curva estándar se corrió por duplicado).

Al comparar los resultados de qPCR con los de RT-PCR convencional se encontró que

por esta última técnica se presentaron falsos negativos: el 6.2% de las muestras

provenientes de plantas sintomáticas (13/207) y el 53.3% (32/60) de las plantas

provenientes de plantas no sintomáticas fueron negativas por RT-PCR convencional,

pero estas pudieron ser detectadas por qPCR. Es posible que la concentración del virus

en la muestra analizada afecte la detección por RT-PCR convencional debido a que las

muestras que resultaron negativas por esta técnica presentaron una menor carga viral

que las que resultaron positivas (p=0.0123, Figura 7-6ª), lo cual se correlacionó con la

expresión de síntomas debido a que las plantas sintomáticas presentaron una mayor

carga viral que las plantas que no expresaron síntomas (p<0.05), encontrándose que

generalmente las plantas que no expresan síntomas presentan una menor carga viral y

por ende un menor porcentaje de detección (Figura 7-6).

El valor Ct para el gen CP estuvo entre 14.57 y 24.47 con un valor promedio de

18.89 2.22 (Figura 7-5) y los valores %CV inter-ensayo fueron menores al 10%


indicando una buena reproducibilidad de los ensayos. Por el lado del número de copias

del gen CP los valores se encontraron entre 9.17 106 hasta 4.86 109 con un promedio

de 5.22 108 7.05 107.

Figura 7-5. Curvas de amplificación obtenidas con la pareja de primers para el gen de la proteína

mayor de la cápside de PYVV.

7.3.5 Acumulación de PYVV en diferentes órganos de plantas con diferente grado de intensidad de la expresión de síntomas

Por qPCR se encontró que la planta que no expresaba síntomas presentó una

acumulación del virus significativamente menor que las plantas que expresaban síntomas

(p<0.05) (casi un grado de magnitud) (Figura 7-6B) y esto también se presentó en todos

los órganos (Figura 7-7). Entre la planta que presentó sintomatología moderada y la que

presentó sintomatología severa se evidenció que esta última tiene una mayor

acumulación del virus, pero la diferencia entre estas dos plantas no fue significativa

(p>0.05, Figura 7-6B).

La evaluación estadística de la acumulación de PYVV en diferentes órganos de las tres

plantas S, M y NS se presenta en Figura 7-7 y en las Tablas 7-4 y 7-5. Los análisis

permiten realizar las siguientes consideraciones:

(1) El órgano, el grado de intensidad de expresión de síntomas y la combinación de estos

dos factores afecta la acumulación del virus (p<0.005). Se pudo observar que el virus

tiende a acumularse principalmente en órganos de la zona aérea (Figura 7-7) y además

las plantas que presentan un mayor grado de intensidad de síntomas presentan una

mayor acumulación del virus (Figura 7-6B).


85

Figura 7-6. Resultados de PCR en tiempo real para evaluar la acumulación del virus A. Carga viral en muestras RT-PCR positivas y RT-PCR negativas. B. Carga viral en muestras con diferentes grados de intensidad de expresión de síntomas. Las barras de error corresponden a la desviación estándar.

(2) Hay heterogeneidad en la acumulación de PYVV en las plantas que expresan

síntomas (moderada y severa) encontrándose diferencias significativas (p<0.05) en la

carga viral entre los diferentes órganos evaluados por planta.(Figura 7-7 y Tabla 7-44 y

Tabla 7-55).

(3) Antera, que incluye las células sexuales masculinas, presentó una carga viral

significativamente menor que la mayoría de los órganos en las dos plantas sintomáticas

(S y M) y no presentó diferencias significativas con los dos tipos de raíces en la planta de

sintomatología moderada. En la planta con sintomatología severa, antera no presentó

diferencias en la acumulación de PYVV con raíz secundaria (Figura 7-7 y Tabla 7-4 y

Tabla 7-5).

(4) En la planta S se puede encontrar dos grupos con cargas virales similares

(exceptuando antera). El de mayor carga conformado por tallo, peciolo, foliolo y

pedúnculo floral y el de menor carga formado por las dos clases de raíces y pétalo. En

esta planta la mayor carga viral se presentó en foliolo la cual fue significativamente mayor

que en antera. Con el resto de los órganos las diferencias no fueron significativas (Figura

7-7 y Tabla 7-5).

(5) En la planta M, la acumulación del virus en los órganos evaluados fue errática (Figura

7-7 y Tabla 7-4 y Tabla 7-5). La mayor acumulación de PYVV se presentó en pedúnculo


floral el cual fue significativamente mayor con respecto a los dos tipos de raíces, tallo y

antera. Con el resto de los órganos las diferencias no fueron significativas en esta planta

(Figura 7-7 y Tabla 7-4).

Tabla 7-4. Valores de p del contraste entre los órganos de la planta con sintomatología moderada. Las celdas en negrilla corresponden a las parejas que presentaron diferencias estadísticamente significativas (p<0.05).

Antera Foliolo Peciolo Pedúnculo floral Pétalo Raíz Primaria Raíz Secundaria

Foliolo 7.4 10-5

Peciolo 5.6 10-6 0.90321

Pedúnculo floral 0.00013 1.00000 0.00081

Pétalo 0.00885 0.75350 1.00000 0.22517

Raíz Primaria 0.78000 0.00045 1.00000 0.00053 1.00000

Raíz Secundaria 0.65000 0.00369 0.04231 0.00200 0.00063 1.00000

Tallo 0.00312 0.05235 1.00000 0.00070 0.00501 1.00000 1.00000

Tabla 7-5. Valores de p del contraste entre los órganos de la planta con sintomatología severa. Las celdas en negrilla corresponden a las parejas que presentaron diferencias estadísticamente significativas (p<0.05).

Antera Foliolo Peciolo Pedúnculo floral Pétalo Raíz Primaria Raíz Secundaria

Foliolo 0.0038896

Peciolo 0.0048073 0.9997866

Pedúnculo floral 0.0099978 0.7980644 0.8686979

Pétalo 0.0099998 0.6690065 0.7586575 0.0099999

Raíz Primaria 0.0099998 0.1378152 0.3047982 0.0029999 1.0000000

Raíz Secundaria 0.8110348 0.2158231 0.0733825 0.0003999 1.0000000 1.0000000

Tallo 0.0099999 0.9453644 0.9894701 0.9861907 0.9570846 0.5062931 0.2572929

Figura 7-7. Distribución de la carga viral en tres plantas con diferente grado de intensidad de síntomas (No sintomático, Moderado y Severo). Las barras de error corresponden a la desviación estándar.


87

(6) En la planta NS la acumulación del virus en los órganos fue menor que en las otras

dos plantas y presentó homogeneidad, no se presentaron diferencias estadísticamente

significativas entre los órganos evaluados (p>0.05) (Figura 7-7).

7.4 Discusión

El virus PYVV es reemergente en Colombia y se ha diseminado a los países andinos

como Venezuela, Colombia, Ecuador y Perú afectando la producción en estos países con

pérdidas importantes en diferentes grupos de Solanum tuberosum (Salazar et al., 2000;

Guzmán et al., 2011). Aspectos moleculares de PYVV se han determinado solamente

desde la década pasada, en 2004 con la publicación del genoma (Livieratos et al, .2004)

y algunos pocos estudios sobre la variabilidad (Offei et al., 2004; Rodríguez et al., 2010).

Salazar et al. (2000) plantean que hay dificultad en los procesos de extracción y

diagnóstico de PYVV debido a que es un virus que está limitado al floema, es de difícil

extracción, algunas plantas pueden presentar cargas virales extremadamente bajas para

ser detectadas, o el virus es latente, además hay plantas que no expresan síntomas a

pesar de que estén infectadas con el virus. Al no existir trabajos que abordaran la

detección y cuantificación de PYVV en diferentes órganos de plantas de papa, en el

presente trabajo se evaluó la acumulación del virus en diferentes órganos de plantas de

S. tuberosum Grupo Phureja (papa criolla) infectadas con PYVV utilizando la técnica

qPCR con sondas TaqMan® para la cuantificación del virus en diferentes órganos (folíolo,

peciolo, tallo, antera, pedúnculo floral, pétalo y raíz) de plantas que expresan síntomas

severos, moderados y no sintomáticas pero positivas para el virus por RT-PCR.

Previamente la técnica de qPCR había sido utilizada para la detección de PYVV en

muestras foliares (López et al., 2006) pero en este trabajo es la primera vez que se utiliza

para cuantificar la acumulación de PYVV en diferentes órganos de papa criolla.

Inicialmente se obtuvieron plantas infectadas con PYVV a través de transmisión por

vector para lo cual se tuvo en cuenta que en algunas especies de plantas se ha

reportado coinfección con diferentes virus lo que puede resultar en una reducción de

síntomas ó en una exacerbación de los mismos afectando otros aspectos como rango de


hospederos (García-Cano et al., 2006), y diferencias de tropismo y de la carga viral

acumulada en diferentes órganos (Wege y Siegmund, 2007). Estudios serológicos

realizados en muestras de accesiones de bancos de germoplasma del Grupo Phureja,

han demostrado que una accesión de papa mantenida en campo puede estar infectada

con uno o varios grupos virales, como PVS, PLRV, PVY y PVX (Guzmán et al., 2010) y

por deep sequencing se ha detectado que muestras infectadas con PYVV pueden estar

infectadas con PVY (Silvestre et al., 2012). Hay que tener en cuenta que PVY es un

potivirus transmitido por otro vector (Myzus persicae) (Van Hoof, 1980). En este trabajo

se transmitió PYVV por medio de su vector natural (mosca blanca, T. vaporariorum), el

cual es específico para la transmisión de PYVV; por lo tanto las plantas receptoras se

infectaron exclusivamente con PYVV.

Los ensayos de transmisión fueron exitosos al utilizar como planta donadora una planta

con síntoma severa. Se logró la detección del virus por RT-PCR a los 21dpi (días post-

infección) y la expresión de síntomas entre 28 y 35dpi, estos resultados fueron similares

a los reportados por Arciniegas et al. (2003) en donde la expresión de síntomas se dio

entre 28 a 32 dpi en S. tuberosum Grupo Phureja.

Cuando la fuente de inoculo fue una planta de sintomatología moderada, en las plantas

receptoras no se dio expresión de síntomas, a pesar de esto el virus fue detectado por

RT-PCR (Figura 7-1C) y presentaron una menor carga viral que las plantas receptoras de

PYVV provenientes de la trasmisión con plantas de sintomatología severa (Figura 7-6B);

esto podría ser debido a problemas en la carga viral transmitida por el insecto vector la

cual depende de varios aspectos como: (1) el tiempo de adquisición del virus por el

vector (en este caso se permitió que las moscas tuvieran un tiempo de 48 horas para su

alimentación en las plantas infectadas), (2) el tiempo de retención (que para PYVV puede

ser de horas, tiempo suficiente para manipular las moscas mientras se hace la

transmisión) (3) el tiempo de inoculación (para que el proceso de transmisión sea exitoso

debe hacerse dentro del periodo de retención) (Froissart et al., 2010). Sin embargo, estos

aspectos no explican la falta de expresión de síntomas cuando se utilizó como fuente de

inoculo una planta con sintomatología moderada, es posible que la carga viral afecte la

transmisión y en las plantas de sintomatología moderada la carga viral es menor que en

las plantas de sintomatología severa (Figura 7-6B), lo cual afecta en casos en donde la

transmisión no es persistente o es semipersistente como PYVV (Salazar et al., 2000;


89

Díaz et al., 1990; Tamayo y Navarro 1984) debido a que no hay replicación del virus

dentro del insecto y por lo tanto, durante el periodo de adquisición la carga viral

alcanzada por el virus debería ser proporcional a la carga viral de la planta fuente de

inoculo.

En el presente trabajo se utilizó la metodología de qPCR con sondas TaqMan® propuesta

por López et al. (2006) para la detección de PYVV con algunas modificaciones, pues en

lugar de utilizar un solo paso para las reacciones de retrotranscripción y amplificación, se

utilizaron dos pasos independientes debido a que no se presentaron problemas de

contaminación, además esta modalidad de qPCR es más sensible para la detección

(Wacker and Godard, 2005). Se realizó la cuantificación absoluta a cada una de las

muestras utilizando una curva estándar externa (Fronhoffs et al., 2002; Rutledge y Coté,

2003) la cual permitió hacer la estimación precisa del número de copias del gen CP en

muestras de diferentes órganos de plantas infectadas con PYVV. Se pudo detectar PYVV

en muestras de diferentes órganos antes de la expresión de síntomas y además en

plantas que no expresaban síntomas o que habían sido negativas por RT-PCR.

PYVV pudo ser detectado en todos los órganos evaluados tanto por RT-PCR como por

qPCR con sondas TaqMan®, en todas las muestras evaluadas se pudo hacer la

detección del virus cuando se utilizó la técnica de qPCR, mientras que por RT-PCR sólo

se detecto el virus en el 90% de las muestras provenientes de plantas sintomáticas y en

el 46.6% de las muestras provenientes de plantas no sintomáticas. En muestras que

habían sido negativas por RT-PCR para PYVV se pudo hacer la detección del virus

utilizando qPCR, con una sensibilidad 100 veces mayor que RT-PCR convencional. Esto

puede ser debido al bajo número de copias del blanco el cual fue significativamente

menor en plantas que fueron negativas por RT-PCR lo que sugiere que la carga viral

puede afectar la detección por la técnica convencional (Figura 7-6A).

A partir de los resultados en la estimación de la carga viral se pudo establecer que en las

plantas que expresan síntomas de amarillamiento (M y S) hay heterogeneidad en la

acumulación de PYVV en los diferentes órganos evaluados, presentándose una

acumulación diferencial del virus entre los órganos de la zona radical y los de la zona

aérea, se obtuvo una mayor acumulación en foliolo cuando la planta es S y en pedúnculo


floral cuando la planta es M, a pesar de eso en ambas plantas no se presentaron

diferencias estadísticamente significativas entre estos órganos y los demás de la zona

aérea; en ambas plantas la menor acumulación se presentó en raíz, es posible que la

menor acumulación en este órgano sea debida a la presencia de polifenoles y

carbohidratos que interfieren con la extracción viral y la detección (Thygensen et al.,

1995; Hoover, 2001) debido a que son inhibidores de reacciones de amplificación. La

planta no sintomática (RT-PCR positiva para PYVV), presentó menor acumulación del

virus en todos los órganos analizados con respecto a las plantas que expresaron

síntomas lo que sugiere que podría existir una correlación entre la expresión de síntomas

y la carga viral, y además la distribución fue homógenea en plantas NS (Figura 7-7),

El hecho de que el virus esté acumulado principalmente en la zona aérea, puede ser una

estrategia de dispersión del virus porque al mantenerlo en esta zona el virus quedaría

más accesible a la mosca blanca contribuyendo de esta manera con la dispersión del

mismo, este aspecto no había sido estudiado previamente en PYVV pero si en otros virus

como por ejemplo Carnation etched ring virus (CERV) y Carnation vein mottle virus

(CVMV) que son transmitidos por miembros de la familia Aphididae, estos presentaron

una menor acumulación viral en la zona radical (Sánchez-Navarro et al., 2007), en casos

de virus que son transmitidos por hongos que habitan en el suelo o nemátodos se ha

descrito que estos se concentran principalmente en la zona radical como es el caso de

Carmovirus que son transmitidos por hongos del suelo (Gosalvez et al., 2003) y

Tobravirus que son transmitidos por nematodos (Schmitt et al., 1998; MacFarlane y

Popovich, 2000).

El folíolo fue uno de los órganos que presentó mayor carga viral y este es el órgano del

que prefiere alimentarse la mosca blanca, sumado a esto PYVV es un patógeno limitado

al floema y la mosca blanca solo puede alimentarse del floema (Cohen et al., 1996),

estos aspectos podrían resultar en un mayor éxito de transmisión. Los hábitos

alimenticios de la mosca blanca reforzarían la idea de que el virus se acumula en las

plantas de manera que sea muy accesible al vector, sugiriendo un proceso de

coevolución entre el vector y el virus (Lovisolo et al., 2003).

Hay que tener en cuenta que este virus también puede ser transmitido vegetativamente a

través de tubérculo, pero en este trabajo no se evaluó la acumulación del virus en

muestras de tubérculo debido a que las plantas no tuberizaron (este aspecto se evalúa


91

en el último artículo de esta tesis), podría esperarse que aunque el virus presentó una

baja carga viral en muestras de raíz, este pueda acumularse de una manera diferencial

en la zona radical con altas cargas virales en tubérculo, y de no ser así esto podría

indicar que la transmisión vegetativa no se afecta por la carga viral acumulada en el

tubérculo, de todas maneras esto estaría por demostrarse.

Este estudio es el primer reporte para la detección de PYVV en diferentes órganos de

plantas infectadas pero aún queda pendiente evaluar si estos patrones de acumulación

son generalizados o fueron el producto de las condiciones de ensayo utilizadas en este

trabajo. Además sería interesante evaluar cómo se da la acumulación del PYVV en

cultivares susceptibles y resistentes, y como es la cinética de la acumulación del virus en

los órganos en diferentes estadios fenológicos de plantas infectadas, es posible que

dependiendo de la etapa de desarrollo el virus pueda irse redistribuyendo de una manera

diferencial, en este trabajo sólo se evaluó como era la acumulación después de la

cosecha.

Es interesante que se detectara PYVV por primera vez en diferentes órganos, entre ellos

las anteras que tienen interés reproductivo. Sin embargo, no fue posible obtener semilla

sexual en las plantas analizadas, ni en recorridos de los cultivos, por lo que falta

establecer si es posible que PYVV sea detectado en semilla a pesar de que este virus no

se transmite por semilla sexual. En este trabajo también se logró la detección en

muestras de flor, Maruthi et al. (2005) reportaron que no se logró detectar Cassava brown

streak virus (CBSV) en muestras de semilla aunque el virus fue detectado en muestras

de flores y frutos, según estos autores posiblemente existe un mecanismo que excluye el

virus del embrión y por esta razón este virus no es transmisible sexualmente, quizás esto

sea lo que ocurre con PYVV pero es un aspecto por confirmar.

No se sabe si la acumulación de RNA en los diferentes tejidos se relaciona con la

acumulación de partículas virales, es posible que haya un alto número de copias de RNA

viral pero no de partículas virales, lo que se ha reportado en algunos virus como PVY en

donde no hay una relación entre partículas virales y RNA viral debido a que las partículas

virales son más lábiles a degradación, mientras que el RNA tiende a ser estable (Mehle

et al., 2004; Kogovšek et al., 2011).


La detección de plantas infectadas por virus y su eliminación es un paso importante en

los programas de manejo y control para poder evitar la dispersión viral; por lo tanto la

incorporación de técnicas de detección con un alto grado de sensibilidad (que permitan la

detección del virus tanto en plantas que expresen síntomas como en plantas que no

expresan síntomas a pesar de que presentan el virus) como es el caso de PCR en

tiempo real son una herramienta importante a tener en cuenta en procesos de

diagnóstico para la detección de plantas infectadas en bancos de germoplasma y en

programas cuarentenarios. Esta técnica permite evaluar la distribución del virus en

plantas infectadas lo que además de aportar información del virus, es una base para la

selección de órganos en los procesos de detección; además esta técnica también resulta

muy útil en estudios de expresión de genes y en diversos aspectos de la biología de

virus.

Agradecimientos


Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia y a Colciencias (201010016538). A Patricia

Rodríguez por la donación del plásmido con el inserto de la proteína mayor de la cápside

que sirvió de material de partida para el proceso de transcripción y por los aportes

hechos a este trabajo. Al Laboratorio de Biología Molecular de Plantas del IBUN por el

préstamo del equipo de PCR en tiempo real. A Carlos Barragán por su apoyo en la

realización de los ensayos de transmisión. A la Facultad de Ciencias de la Universidad

Militar Nueva Granada por la donación del inóculo de mosca blanca. A la Facultad de

Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia por el espacio en el invernadero.

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8. Artículo 3.

Evaluación de la distribución del Potato yellow vein virus (PYVV) en brotes tubérculos de

Solanum tuberosum Grupo Phureja utilizando cuantificación absoluta por la técnica de PCR en

tiempo real (qPCR) con Sondas TaqMan®

Resúmen

Potato yellow vein virus (PYVV) es un virus re-emergente que hace parte de la familia

Closteroviridae y al género Crinivirus y se caracteriza porque genera pérdidas en la

producción de hasta el 50% (dependiendo de la especie) razón por la que ha sido

clasificado como un patógeno cuarentenario en Europa y Estados Unidos. Teniendo en

cuenta que el virus está limitado al floema, que se ha detectado el virus en plantas no

sintomáticas a partir de semillas provenientes de plantas sintomáticas y que puede ser

transmitido vegetativamente a través de semilla, en este trabajo se evaluó la acumulación

de PYVV en muestras de brotes de tubérculo provenientes de plantas sintomáticas y no

sintomáticas utilizando la técnica de cuantificación absoluta por PCR en tiempo real

(qPCR) con la química de sondas TaqMan®, para determinar como es la distribución del

virus en la semilla. Se encontró que en las muestras sintomáticas el virus pudo ser

detectado por RT-PCR y por qPCR en todos los brotes analizados con una carga viral

promedio de 1.43 107 1.18 107 que fue significativamente mayor que en muestras no

sintomáticas con una carga viral promedio de 1.29 106 8.44 105 en donde se detectó el

virus en un 9.6% de las muestras evaluadas. Con respecto a la distribución del virus en

las muestras de brotes de tubérculo se pudo observar que no se presentaron diferencias

significativas en la carga viral acumulada en tubérculos de una misma planta (p=0.549),

ni tampoco entre brotes de un mismo tubérculo (p=0.118). A pesar de estos resultados,

se pudo encontrar que la distribución del virus en muestras provenientes de plantas no


sintomáticas presentó cierto grado de heterogeneidad debido a que en algunos casos el

virus fue detectado en uno de los brotes del tubérculo, o en varios brotes de un tubérculo

(más no en todos los brotes del tubérculo), o en varios tubérculos de una planta (más no

en todos tubérculos provenientes de una planta); lo que no se presentó en las muestras

provenientes de plantas sintomáticas en donde el virus fue detectado en todos los brotes

analizados.

Palabras claves: Solanum tuberosum Grupo Phureja, cuantificación absoluta, PCR en

tiempo real, tubérculo, RT-PCR, Sondas TaqMan®.

8.1 Introducción

La papa criolla (Solanum tuberosum Grupo Phureja) se ha expandido en los recientes

años encontrándose entre los cinco cultivos alimenticios más importantes a nivel mundial

(Oerke y Dehne, 2004; FAOSTAT, 2010). Esta especie es susceptible a muchos virus

dentro de los que se encuentran algunos re-emergentes como el Potato yellow vein virus

(PYVV) (Müller et al., 2004; Salazar, 2006).

Los síntomas causados por este virus son un amarillamiento que comienza en las

nervaduras secundarias y se va extendiendo hasta que cubre la lámina foliar, (Salazar et

al., 2000; Arciniegas et al, 2003) y una reducción en la producción que puede ser de

hasta un 50% dependiendo de la especie (Salazar et al., 2000; Guzmán et al., 2011).

PYVV se encuentra distribuido en países andinos: Colombia donde se hizo el primer

reporte de este virus (Alba, 1950), Perú, Ecuador, y Venezuela (Salazar et al., 2000).

Parece que la dispersión de este virus se ha debido al transporte indiscriminado de

germoplasma (Salazar et al., 2000) y al incremento de las población de su vector natural

(Trialeurodes vaporariorum) (Buriticá, 1971).

En previos estudios se ha hecho la detección de este virus utilizando NASH (Salazar et

al., 2000) RT – PCR (Salazar et al., 2000; Guzmán et al., 2006; Guzmán y Rodríguez,

2010; Wei et al., 2009) y qPCR (López et al., 2006; Hernández et al., 2010). Se ha

encontrado que en algunas plantas que no expresan síntomas se logró hacer la

detección molecular del virus; adicionalmente Salazar et al. (2000) y Guzmán et al.

(2011) reportaron que a partir de semillas provenientes de plantas sintomáticas se

pueden obtener plantas que expresan síntomas o viceversa; teniendo en cuenta esto, el

hecho de que este virus es limitado al floema y que puede ser transmitido

Artículo 3. Evaluación de la distribución del Potato yellow vein virus (PYVV) en brotes tubérculos de Solanum tuberosum Grupo Phureja utilizando cuantificación absoluta por la técnica de PCR en tiempo real (qPCR) con Sondas TaqMan®

99

vegetativamente a través de semilla; el objetivo del presente trabajo fue evaluar como era

la acumulación del virus en tubérculos de plantas infectadas (tanto tubérculos

provenientes de plantas sintomáticas como los provenientes de plantas no sintomáticas)

para determinar si la distribución del virus es homogénea o heterogénea dentro de los

tubérculos, aspecto aún no reportado para PYVV debido a que la detección de este virus

se ha realizado primordialmente en muestras de foliolo (Salazar et al., 2000; Guzmán et

al., 2006; Guzmán y Rodríguez, 2010; López et al., 2006) y en un par de ocasiones en

muestras de brotes de tubérculo (Guzmán y Rodríguez, 2010; Hernández et al., 2010),

pero aún no se ha informado como es la distribución del virus dentro de los tubérculos

infectados, esto podría ayudar a explicar el porque no toda la progenie obtenida a partir

de tubérculos provenientes de plantas sintomáticas no es sintomática (Salazar et al.,

2000; Guzmán et al., 2012).

Para lograr este objetivo se utilizó la técnica de PCR en tiempo real por su alta

sensibilidad, especificidad y reproducibilidad, además permite hacer una estimación del

número de copias de un blanco presente en una muestra haciéndola una técnica muy

poderosa para el estudio de muchos aspectos de la biología de muchos virus (Bustin,

2002; Mackay et al., 2002). Como se indicó anteriormente está técnica no ha sido muy

utilizada para estudios de este virus (solo ha sido reportada por López et al. (2006) y por

Hernández et al. (2010)), y las veces que se ha utilizado en estudios para PYVV ha sido

con fines de detección; con este trabajo se propone esta técnica como una herramienta

útil en el estudio de diferentes aspectos de la biología del virus.

Por otra parte, estos resultados podrían apoyar programas de fitomejoramiento, procesos

de indexación de plantas de papa, programas de cuarentena y en programas de

certificación de semillas de papa debido a que esta permite hacer la detección de cargas

virales bajas en diferentes órganos de plantas infectadas aunque no expresen síntomas,

lo que no se puede lograr con otras técnicas de detección.



8.2.1 Muestras de brotes de tubérculo y controles

Se tomaron muestras de brotes de tubérculos provenientes de plantas de papa criolla de

un cultivo establecido en el municipio de Mosquera (Cundinamarca). Estos fueron

almacenados en la oscuridad durante un periodo de 20 días esperando que germinaran,

debido a que el material analizado sería brote de tubérculo (Tabla 8-1)

Tabla 8-1. Muestras analizadas por RT-PCR y qPCR

Sintomatología Número de

Plantas Número de Tubérculos

Número de brotes

Sintomático 8 56 114

No sintomático 30 174 301

Se evaluaron de uno a siete brotes de tubérculo por tubérculo (en promedio cuatro brotes

de tubérculo/tubérculo). Como controles negativos se utilizaron plantas de papa criolla

Clon 1 obtenidas a partir de cultivo de meristemos in vitro las cuales fueron adquiridas en

el Laboratorio de Cultivo de Tejidos y de Biología Molecular de Plantas del IBUN. y una

planta de C. madurensis, Lour infectada con CTV.

8.2.2 Extracción de RNA

Se obtuvieron extractos de RNA a partir de las muestras de brotes de tubérculo para lo

cual se partió de 100mg de material pulverizado en nitrógeno líquido utilizando el

protocolo descrito por Guzmán et al. (2006) (Anexo A).

8.2.3 Pruebas basadas en PCR

Síntesis de cDNA

Se obtuvo cDNA a partir de cada uno de los extractos de RNA. La síntesis de cDNA se

llevo a cabo en un volumen final de 10µl adicionando una mezcla de 1X buffer de

reacción (Epicentre), 1mM de dNTPs (Bioline), 10mM de DTT (Epicentre), 0.4µM de

primer 3´ (Tabla 7-2), 1.6U de RNAse inhibitor (Fermentas), 8U de MMLV HP (Epicentre)

y 100ng de RNA, se incubó durante una hora a 42°C seguida de una denaturación a

70°C por 10min.


101

PCR




amplificación consiste de una denaturación inicial a 94ºC durante 3min, 35 ciclos de




2006).

Tabla 8-2. Primers para la amplificación del gen completo de la proteína mayor de la cápside de PYVV.


3 Reverse 5’ AAG CTT CTA CTC AAT AGA TCC TGC TA 3’ Rodríguez et al., 2009


Como control positivo se utilizó una muestra de planta que expresaba síntomas para

PYVV y que había sido positiva por RT-PCR y como controles negativos una muestra de

C. madurensis, Lour (Calamondino) infectada con CTV y una muestra de S. tuberosum

Grupo Phureja libre de virus (obtenida por cultivo in vitro de meristemos). Los productos

de PCR fueron visualizados en geles de agarosa 1% preparados en TAE 1X (0.04M Tris-

Acetato, 0.001M EDTA) y teñidos con SYBR®Safe (Invitrogen), corridos a 70V

constantes durante una hora y visualizados en digitalizador Gel Doc® (BIO-RAD).

PCR en tiempo real

Las reacciones de qPCR se realizaron en el Laboratorio de Biología Molecular de Plantas

del IBUN utilizando el equipo LightCycler 480 (Roche), usando la química de sondas

TaqMan® amplificando un fragmento de 79pb de la proteína mayor de la cápside de

PYVV y como control interno se amplficó un fragmento de 79pb de un gen de expresión

constitutiva de la planta (citocromo oxidasa). Se utilizaron las sondas y primers descritos

por López et al. (2006) con algunas modificaciones en el marcaje de las sondas (Tabla

8-3).



Iniciador Sonda

Dirección Secuencia Gen Tamaño

esperado (pb)

PYVV-591-F Forward 5’ CGG AGA TTA TGT CAA TGG TTC GA 3’

Proteína mayor de la cápside

79 PYVV-670-R Reverse 5’ TTG CTG CAT TCT TGA ACA GGT AA 3’

Sonda CP (465:510)

5’ 6-FAM AAC CAA CAT TTC TGA TGA TGA TTT GAC TGC AA 3’ BHQ1

COX – F Forward 5’ CGT CGC ATT CCA GAT TAT CCA 3’

*Citocromo Oxidasa

79 COX – R Reverse 5’ CAA CTA CGG ATA TAT AAG AGC CAA AAC TG 3’

Sonda COX (533:580)

5’ HEX TGC TTA CGC TGG ATG GAA TGC CCT 3’ BHQ2

Los valores entre paréntesis corresponden a las longitudes de onda en nanómetros de excitación:emisión de los fluorocromos. En el trabajo de López et al.(2006) la sonda para detectar a COX estaba marcada con JOE, en este caso el marcaje se hizo con HEX. • Control interno de la reacción

Las reacciones de amplificación se realizaron en placas opacas (Roche) de 98 pozos y

se utilizó 1X de buffer NH4, 5.5mM de MgCl2, 0.5mM de dNTPs, 0.3µM de cada primer,

0.24µM de la sonda (Tabla 8-3), 1U de biolasa, 2µl de cDNA en un volumen final de 10µl.

El programa de amplificación consiste de una denaturación inicial durante 10min a 95ºC,

45 ciclos de amplificación con una denaturación a 95ºC por 10s y alineamiento a 55ºC

por 30s.

En las reacciones de qPCR se incluyeron los siguientes controles: (1) control positivo:

muestra de papa criolla infectada con PYVV RT-PCR positivo para el gen de la proteína

mayor de la cápside de PYVV, (2) control positivo: uno de los puntos de la curva estándar

(3) control para evaluación de contaminación de reactivos: reacción en la que el molde es

agua, (4) control para la evaluación de reacciones cruzadas con genes de otros virus:

muestra de C. madurensis, Lour infectada con CTV que es un miembro de la familia

Closteroviridae (5) control para la evaluación de reacciones cruzadas con genes de la

planta: planta de papa criolla libre de virus obtenida a partir de cultivo de meristemos in

vitro.(6) control para evaluar si los extractos están contaminados con DNA: muestra en la

cual el molde es el control positivo pero en este no se adiciona retrotranscriptasa durante

la síntesis de cDNA.

Adicionalmente todas las muestras fueron amplificadas con una pareja de primers para el

gen citocromo oxidasa (CP) con el objetivo de validar los resultados negativos de los

ensayos de amplificación del gen de la proteína mayor de la cápside utilizando la misma

reacción y condiciones descritas anteriormente.


103

Curva estándar para la cuantificación absoluta

Para poder determinar el número de copias del gen de la proteína mayor de la cápside

en cada una de las muestras, se construyó una curva estándar utilizando diluciones

seriadas de transcritos de RNA de concentración conocida. Los transcritos se obtuvieron

a partir de un plásmido pGEM-T® (Promega) cuyo inserto era el gen completo de la

proteína mayor de la cápside de PYVV y que presentaba un promotor T7 para que

pudiera ser utilizado para hacer transcripción in vitro del gen (el plásmido fue donado por

Patricia Rodríguez del Laboratorio de Virus Vegetales del IBUN).

Los transcritos fueron cuantificados utilizando el kit Quant-iTTM RiboGreen Assay

(Invitrogen) teniendo en cuenta las instrucciones del fabricante (Anexo B) y se utilizaron

para construir la curva estándar graficando el valor Ct (threshold cycle) de cada una de

las diluciones versus el logaritmo del número de copias del gen de la proteína mayor de

la cápside de PYVV, el ensayo se realizó por duplicado en dos corridas independientes.

Con la curva estándar se pudo determinar la carga viral en cada una de las muestras por

la interpolación del valor Ct. La estimación del número de copias del gen CP de los

estándares utilizados para la construcción de la curva estándar se hizo de acuerdo a la

siguiente ecuación:

En donde la cantidad de transcrito de RNA debe ser expresada en mg, el número de

avogadro corresponde a , # pb a número de pares de bases del transcrito,

340 es el peso molecular de una hebra de RNA.

La eficiencia de amplificación fue calculada a partir de la pendiente de la curva estándar

usando la fórmula:



Se calculó el promedio del número de copias para cada órgano evaluado, la desviación

estándar y coeficiente de variación (CV%) interensayo (porcentaje de la desviación

estándar en comparación con el promedio del número de copias). Los análisis

estadísticos se realizaron utilizando el Software R (R Development Core Team, 2008). La

distribución de todos los datos fue evaluada utilizando el test de normalidad Shapiro Wilk

y debido a que los resultados no presentaron una distribución normal se realizaron

comparaciones para evaluar si se presentaban diferencias en la carga viral entre

tubérculo provenientes de plantas sintomáticas y no sintomáticas, entre los tubérculos

provenientes de la misma planta y entre los brotes provenientes de un mismo tubérculo

mediante la aplicación de la prueba Mann Whitney (Yuan et al., 2006).

8.3 Resultados

8.3.1 RT – PCR y qPCR en muestras de brotes de tubérculo

Se hizo ensayos de RT-PCR para la detección de PYVV en muestras de brotes de

tubérculo provenientes de plantas sintomáticas y no sintomáticas. El 93.8% de las

muestras de brotes de tubérculo provenientes de plantas sintomáticas (107/114) fueron

positivas por RT.-PCR convencional (Figura 8-1A, carril 2 una de las muestra

sintomáticas que resultó negativa por RT-PCR); mientras que en las muestras de brotes

de tubérculo provenientes de plantas no sintomáticas solamente tres de las 301 muestras

evaluadas resultaron positivas (Figura 8-1B, en el carril 9 se evidencia una de estas

muestras). En todas las reacciones se incluyó dos controles negativos para verificar la

especificidad de la reacción y en ningún caso se presentó la amplificación de estas

muestras.

A partir de los resultados de RT-PCR los brotes fueron clasificados en cuatro categorías:

sintomáticas RT-PCR positivo (S+), sintomáticas RT-PCR negativo (S-), no sintomáticas

RT-PCR positivo (NS+) y no sintomáticas RT-PCR negativo (NS-) (Figura 8-2C). Todas

las muestras de estas categorías fueron evaluadas por qPCR en donde se detectó el

virus en todas las muestras que habían resultado positivas en las reacciones de RT-PCR

convencional, y en el 12.7% de las muestras (39/305) que habían resultado negativas en

las reacciones de RT-PCR convencional, lo que indica que en RT-PCR convencional hay


105

una menor sensibilidad para la detección del virus encontrándose que el porcentaje de

falsos negativos para la detección del virus en muestras de tubérculo por RT-PCR fue del

12.7% (Figura 8-2C).

Figura 8-1 .RT-PCR con la pareja de primers para la detección de la proteína mayor de la cápside de PYVV (tamaño esperado 769pb) en muestras de brotes de tubérculo en ambos geles M corresponde al marcador de peso molecular GeneRuler 100pb (Fermentas), el control positivo corresponde a una muestra de planta que expresaba síntomas para PYVV y que había sido positiva por RT-PCR y como controles negativos una muestra de C. madurensis, Lour (Calamondino) infectada con CTV y una muestra de S. tuberosum Grupo Phureja libre de virus (obtenida por cultivo in vitro de meristemos) A. RT-PCR de muestras de brotes de tubérculo provenientes de plantas sintomáticas, carriles 1-7 corresponden a muestras de brote de tubérculo provenientes de plantas sintomáticas, carril 8 corresponde al control positivo y los carriles 9 y 10 a los controles negativos. B. RT-PCR de muestras de brotes de tubérculo provenientes de plantas no sintomáticas, carriles 1-10 corresponden a muestras de brote de tubérculo provenientes de plantas no sintomáticas, carril 11 corresponde al control positivo y los carriles 12 y 13 a los controles negativos

8.3.2 Estimación del número de copias del gen CP de PYVV en muestras de brote de tubérculo

Para poder estimar el número de copias del gen CP en cada una de las muestras de

brote de tubérculo se construyó una curva estándar para lo que se utilizaron transcritos

de RNA del gen de la proteína mayor de la cápside de PYVV de diferentes. La curva

construida presentó una alta eficiencia de amplificación (cercana a 2) y cubrió un amplio

rango de concentraciones (de 106 a 1010 número de copias del gen CP), mostró una alta

reproducibilidad (fue corrida en tres ensayos independientes y se obtuvo resultados

similares) permitiendo una cuantificación absoluta del número de copias del gen CP con

una alta precisión. Adicionalmente se incluyeron controles negativos los cuales no

cruzaron el umbral por lo tanto la reacción no presentó problemas de contaminación o de

reacción cruzada con otros genes.


El número de copias del gen de la proteína mayor de la cápside estimado en muestras de

brotes de tubérculo se encontró entre 7.04 105 y 6.93 107, en las Figuras 8-2ª y C

puede observarse que las muestras negativas por RT-PCR que lograron ser detectadas

por PCR en tiempo real presentaron una carga viral significativamente menor (p 0.0098)

que las muestras de brote de tubérculo detectadas por PCR en tiempo real que habían

sido positivas por RT-PCR convencional (1.41 107 1.18 107 en muestras RT-.PCR

positivas y 1.29 106 8.75 105 en muestras no sintomáticas).

Figura 8-2. Estimación de la carga viral de PYVV en muestras de brotes de tubérculo. A. Promedio del número de copias del gen CP acumulados en muestras RTR-PCR negativas y RT-PCR negativas. B. Promedio del número de copias del gen CP acumulado en muestras de brotes de tubérculo provenientes de plantas no sintomáticas y de plantas sintomáticas. C. Promedio del número de copias del gen CP acumulados en las cuatro categorías evaluadas. El radio que se encuentra dentro de las barras corresponde al número de muestras que pudieron ser detectadas por qPCR/número de muestras totales correspondientes a dicha categoría, y el valor entre paréntesis al porcentaje de muestras que resultaron positivas por qPCR

Las muestras de las categorías S- y NS- que lograron ser detectadas por qPCR

presentaron un promedio de la carga viral menor que los brotes de las categorías S+ y


107

NS+ así como se observa en la Figura 8-2C (NS-: 1.05 106 2.08 104; NS+:

3.31 106 2.77 105; S-: 1.54 106 6.49 105; S+:3.49 107 1.14 106).

En la Figura 8-2B se observa que las muestras de brote de tubérculo que provenían de

plantas sintomáticas presentaron una carga viral significativamente mayor (p 0.00212)

que las muestras provenientes de plantas no sintomáticas (1.43 107 1.18 107 en

plantas sintomáticas y 1.29 106 8.44 105 en plantas no sintomáticas) (Figura 8-2B).

En la Figura 8-3 se observa un grupo de muestras analizadas por qPCR que incluye

brotes de tubérculo provenientes de plantas no sintomáticas y sintomáticas, los controles

negativos no presentaron amplificación y se puede distinguir que el grupo de muestras de

brotes provenientes de plantas no sintomáticas presentaron un Ct mayor (superior a 26)

que el grupo de muestras de brotes de tubérculo provenientes de plantas sintomáticas

(Ct inferior a 24).

Figura 8-3. Curvas de amplificación de brotes de tubérculo derivados de plantas sintomáticas y no

sintomáticas.

8.3.3 Acumulación de PYVV en brotes de tubérculo provenientes de plantas sintomáticas y no sintomáticas

En las muestras de brotes de tubérculo provenientes de plantas sintomáticas se obtuvo

un resultado positivo en ambas técnicas en casi la totalidad de las muestras (113/114)

(Figura 8-2C, el virus no fue detectado en un brote de esta categoría), por consiguiente

todos los brotes provenientes de un mismo tubérculo (en los tubérculos en los que se

analizó más de un brote) fueron amplificados. Al analizar si se presentaban diferencias


en la acumulación de virus en brotes de tubérculo entre plantas de esta categoría se

encontró que las diferencias no fueron significativas lo que sugiere que la distribución era

homogénea (Tabla 8-4).

En las muestras de brotes de tubérculo provenientes de plantas no sintomáticas se

presentaron diferencias significativas en la carga viral acumulada entre las plantas de

esta categoría (Tabla 8-4) lo cual puede ser debido a: (1) para la categoría de plantas no

sintomáticas se analizó un total de 30 plantas, de las cuales en siete plantas sólo se

detectó el virus en un brote por planta, hay que tener en cuenta que en promedio por

planta se evaluó 6 tubérculos y en algunos casos se estimó la carga viral en más de un

brote por tubérculo (en promedio 4 brotes por tubérculo), para un total de más o menos

24 brotes de tubérculo por planta; (2) en cuatro plantas se detecto el virus en varios

tubérculos (un brote por tubérculo); (3) en tres plantas se logró detectar el virus en varios

brotes por tubérculo, en una se logró detectar el virus en todos los brotes de un

tubérculo, en las otras dos sólo se detectó el virus en algunos brotes (más no en todos).

(4). En las 16 plantas restantes no se detecto el virus en ninguno de los brotes

evaluados. Los anteriores resutlados sugieren que brotes provenientes de plantas no

sintomáticas presentan una distribución heterogénea del virus.

Finalmente se evaluó si se presentaban diferencias en la carga viral acumulada entre los

tubérculos provenientes de una misma planta y entre los brotes provenientes de un

mismo tubérculo y de acuerdo a los resultados se encontró que no se presentaron

diferencias estadísticamente significativas en la carga viral acumulada en tubérculos de

una misma planta, ni tampoco entre brotes de un mismo tubérculo (Tabla 8-4).

Tabla 8-4. Comparaciones para evaluar la acumulación de PYVV en las muestras de tubérculo.

Sintomatología Comparación Valor de p

No sintomática

Entre plantas 0.00466

Entre tubérculos de una misma planta 0.101

Entre brotes de un mismo tubérculo 0.985

Sintomática

Entre plantas 0.341

Entre tubérculos de una misma planta 0.816

Entre brotes de un mismo tubérculo 0.924


109

8.4 Discusión

En este trabajo se quería evaluar como era la distribución del virus en muestras de brotes

de tubérculo infectados con PYVV para ver si las observaciones realizadas por otros

autores como Salazar et al. (2000) y Guzmán et al. (2011) que habían reportado que a

partir de tubérculos infectados con el virus se puede obtener progenies conformadas por

plantas sintomáticas y no sintomáticas, eran debidas a la carga viral acumulada en los

tubérculos y a una posible distribución heterogénea del virus dentro del tubérculo.

Los resultados indican que la técnica de qPCR fue más sensible para la detección del

virus debido a que esta permitió detectarlo en muestras que habían resultado negativas

por RT-PCR convencional (6/7 muestras provenientes de plantas sintomáticas y 33/ 298

provenientes de no sintomáticas). Los resultados de PCR en tiempo real permitieron la

detección del virus en casi la totalidad de las muestras provenientes de plantas

sintomáticas (113/114); en muestras provenientes de plantas no sintomáticas se logró la

detección en el 11.9% de las muestras lo que indica que a pesar de que estas plantas no

expresaron síntomas posiblemente debido a su baja carga viral (Figura 8-2B), las plantas

madres pasaron el virus a los tubérculos; algunos autores como Silva et al. (2002) y

Basky y Almasi (2004) han reportado que el movimiento del virus a larga distancia sigue

las rutas de los metabolitos, generalmente de órganos fuente a vertederos, posiblemente

esto es lo que ocurre en las plantas de papa criolla en donde a pesar de que las que las

plantas madres no expresan síntomas durante su ciclo de vida si permiten el movimiento

de virus a través del floema hacia los tubérculo que son un órgano vertedero.

El hecho de que se haya presentado una carga viral significativamente mayor en

tubérculos provenientes de plantas sintomáticas hace pensar que la expresión de

síntomas sea dependiente de la carga viral (Figura 8-2B), pero los análisis de las cuatro

categorías obtenidas después de amplificación por RT-PCR convencional sugieren lo

contrario debido a que a pesar de que en las categorías S- y NS- se observó que la carga

viral fue significativamente menor (S-: 1.54 106 6.49 105; NS-: 1.05 106 2.8 104)

con respecto a la carga viral obtenida en las muestras de las categorías S+ y NS+ (S+:

3.49 107 1.14 106; NS+: 3.31 106 2.77 105), las categorías S- y NS- presentaron

cargas virales similares lo que sugiere que la carga viral no esta relacionada con la


expresión de síntomas. El rango del número de copias fue variable en ambas categorías

(S: 1.57 106 – 6.93 107; NS: 7.04 105 3.66 106) por lo tanto se puede observar que

algunas muestras no sintomáticas presentaron cargas virales dentro del rango de las

plantas sintomáticas y a pesar de esto no expresaron síntomas. De todas maneras, los

resultados en este ensayo no permiten concluir que hay una relación entre la expresión

de síntomas y la carga viral acumulada en tubérculos porque el hecho de que la carga

viral en el tubérculo sea baja no implicada que la carga viral de la parte aérea (zona de

expresión de síntomas) también sea baja.

A pesar de los resultados obtenidos al evaluar la carga viral acumulada en tubérculos de

una misma planta y en brotes de un mismo tubérculo (Tabla 8-4), los resultados

mostraron que cuando se analizó más de un brote de tubérculo por tubérculo en

muestras provenientes de plantas no sintomáticas en una sola ocasión se logró detectar

el virus en todos los brotes de tubérculo de un tubérculo, en otros casos solo se dio la

detección en algunos brotes de tubérculo/ por tubérculo, y en otros sólo se detectó el

virus en un brote de tubérculo por tubérculo lo que sugiere que la distribución del virus en

este órgano es irregular cuando la planta no expresa síntomas. No hay otros estudios

que evalúen la distribución de PYVV en muestras de tubérculos, pero si con otros virus

como PVY (Singh and Singh, 1996; Fox et al., 2005) y PVA (Singh and Singh, 1998)

quienes también reportaron la distribución heterogénea de estos virus en este órgano

La presencia de PYVV en brotes de tubérculo provenientes de plantas no sintomáticas

podría sugerir que factores medio ambientales, el tiempo que se demora el virus en llegar

al tubérculo, la carga viral, u otros factores pueden tener algún efecto en el desarrollo de

síntomas. Aunque esto también podría ser el resultado de eventos de coninfección que

pueden resultar en sinergismo en donde se puede dar un incremento en la expresión de

síntomas cuando hay coinfecciones así como lo reportaron Karyeija et al. (2000) y

Untiveros et al. (2007) en donde la coinfección entre SPCSV y SPFMV en camote

incrementa: la severidad de síntomas, la acumulación del virus, el movimiento del virus

en las plantas y afecta la producción. Para PYVV Silvestre et al. (2012) reportó la

coinfección de PYVV con PVY, y aunque aún no se ha evaluado si la interacción es

sinergística o no, podría especularse que cuando se da la expresión de síntomas en

plantas puede ser debido a la coinfección con PVY, mientras que las plantas no


111

sintomáticas posiblemente presenten el virus y este pueda ser transmitido a otras zonas

de la planta a través del floema.

La transmisión ineficiente del virus a través de tubérculos ha sido descrita para otros

virus como PLRV, el cual infecta el floema de las plantas (Taliansky et al., 2003), este

virus es transmitido eficiente a través de tubérculos de plantas infectadas de genotipos

susceptibles, sin embargo algunos autores han reportado que cultivares de papa

susceptibles pueden producir tubérculos libres de virus (Hutton and Brock, 1953; citado

por Wilson y Jones, 1992; y Solomon-Blackburn et al,. 2008). Según ellos, esto puede ser

debido a que hay un impedimento en el movimiento del virus en este órgano, previniendo

su dispersión en los tubérculos; pero esto estaría por confirmarse en PYVV en donde se

ha observado que posiblemente el mecanismo podría ser diferente debido a que se

reportan plantas no sintomáticas que en la progenie presentan hijas sintomáticas, lo que

sugiere un eficiente movimiento del virus en los tubérculos.

Otro aspecto que pueda explicar este fenómeno son infecciones tardías, es posible que

el insecto transmita el virus en plantas que ya se encuentran terminando su ciclo de vida

y por lo tanto no se alcanza a dar la expresión de síntomas, pero a pesar de esto el virus

puede ser transportado hasta el tubérculo a través del floema, en estos casos la

distribución podría ser heterogénea debido a que el tiempo no es suficiente para que el

virus alcancé a ser distribuido en toda la planta y de esta manera se distribuye

heterogéneamente.

La técnica de PCR en tiempo real ha demostrado ser altamente sensible y específica

para la detección de PYVV en muestras de brotes de tubérculo (Boonham et al., 2000),

además permite la detección de virus que se encuentre en bajas cargas virales y que no

expresan síntomas, que es un aspecto muy importante para tener presente en planes de

control porque además hay que tener en cuenta que este virus se distribuye

heterogéneamente. Los resultados obtenidos en el presente trabajo resultan muy útiles

en programas de certificación de semillas y de fitomejoramiento.


Agradecimientos


Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia y a Colciencias (201010016538). Al

Laboratorio de Biología Molecular de Plantas del IBUN por el préstamo del equipo de

tiempo real.

Referencias


Arciniegas, N., Guzmán, M. y Ñustez, C. 2003. Metodología de evaluación de resistencia al virus del amarillamiento de las venas de la papa (PYVV) en genotipos de la colección central colombiana de Solanum Phureja. Memorias XXIV Congreso de la Asociación Colombiana de Fitopatología ASCOLFI.

Basky, Z. and Almasi, A., 2004. Differences in aphid transmissibility and translocation between PVY

N and PVY

O isolates. Journal of Pest Science 78: 67 – 75.

Boonham, N., Walsh, K., Mumford, R. and. Barker, I. 2000. Use of multiplex real-time PCR (TaqMan®) for the detection of potato viruses. OEPP/EPPO Bulletin 30: 427 – 430.


Bustin, S. 2002. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT – PCR): Trends and problems. Journal of Molecular Endocrinology 29: 23 – 39.

FAOSTAT; 2010. Production. [http://faostat.fao.org].

Fox, A., Evans, F. and Browning, I. 2005. Direct tuber testing for Potato Y potyvirus by

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9. Conclusiones y recomendaciones

9.1 Conclusiones

1. En el presente trabajo se detectó por primera vez el virus PYVV en diferentes

órganos de plantas de S. tuberosum Grupo Phureja (papa criolla) como foliolo,

peciolo, tallo, pedúnculo floral, pétalo, brotes de tubérculo y raíz; utilizando la

técnica de PCR en tiempo real.

2. Los resultados obtenidos permiten confirmar las hipótesis planteadas en donde se

planteó que la distribución del virus era heterogénea en diferentes órganos de

plantas de S. tuberosum Grupo Phureja infectadas, principalmente muestras de

brotes de tubérculos.

3. En el presente trabajo se evaluaron tres métodos de extracción de RNA a partir

de muestras de diferentes órganos de plantas de S. tuberosum, debido a que se

que se planteó la realización de ensayos basados en PCR en diferentes órganos

de plantas de papa criolla y para lograrlo es necesario contar con un RNA de

buena calidad y cantidad. Trizol® (Invitrogen) reunió la mayor cantidad de

atributos para ser el método de elección para la extracción de RNA a partir de

diferentes órganos de plantas debido a que con este método se obtuvo el mejor

rendimiento y calidad (260/280nm), además se logró la detección del virus por

RT-PCR en todos los órganos evaluados (pedúnculo floral, antera, pétalo, tallo,

peciolo, foliolo, raíz y brotes de tubérculo) y en un mayor número de muestras que

por los otros dos métodos de extracción evaluados.

4. Los resultados obtenidos permiten hacer la selección de órganos que pueden ser

utilizados en procesos de detección, sugiriendo que los mejores órganos serían

pedúnculo floral y foliolo. En pedúnculo floral se detectó el virus en un alto

porcentaje de muestras infectadas, presentó una alta acumulación del virus, un


alto rendimiento, relación de absorbancias 260/280nm y una relación de las

subunidades ribosomales 28S/18S cercanas a dos en los extractos de RNA; y

foliolo que aunque no presentó los mayores valores en los parámetros evaluados

para la selección del mejor método de extracción si presentó la mayor

acumulación de PYVV y se logró la detección del virus en un alto porcentaje de

las muestras (mayor al 90%).

5. El órgano menos adecuado para la detección de PYVV fue raíz, este órgano

presentó los menores valores en los parámetros evaluados para la selección del

método más apropiado para la extracción de RNA, y a pesar de que el virus logró

ser detectado por RT-PCR y qPCR, PYVV presentó una menor acumulación en

este órgano.

6. No se encontró una relación entre el rendimiento de la extracción de RNA y la

carga viral acumulada debido a que en los ensayos de evaluación de los tres

métodos de extracción de RNA se observó que los órganos con los que se obtuvo

el mayor rendimiento de RNA fueron pedúnculo floral y antera y aunque en

pedúnculo se presentó una alta acumulación del virus, en antera la acumulación

fue baja.

7. En cuanto a la acumulación del virus las plantas que presentan síntomas de

amarillamiento (M y S) presentan heterogeneidad en la distribución de PYVV en

los diferentes órganos evaluados encontrándose una acumulación diferencial

entre los órganos de la zona aérea y los de la zona radical, mientras que en

plantas no sintomáticas el virus presenta una distribución homogénea.

8. Los ensayos de evaluación de la acumulación del virus en diferentes órganos de

plantas infectadas sugieren que hay una relación entre la expresión de síntomas y

la carga viral acumulada debido a que en todos los órganos evaluados se

presentó una menor acumulación de PYVV en muestras provenientes de plantas

no sintomáticas. Aunque esto no pudo ser confirmado para tubérculo en donde se

encontró que algunos tubérculos provenientes de plantas sintomáticas

presentaron cargas virales similares a las acumuladas en tubérculos provenientes

de plantas no sintomáticas (bajas cargas virales).

Conclusiones y Recomendaciones 117

9. En tubérculos provenientes de plantas no sintomáticas se encontró que la

distribución del virus era heterogénea, mientras que en tubérculos de plantas

sintomáticas la distribución parece ser homogénea.

10. Es la primera vez que se reporta la detección de PYVV en órganos reproductivos

como en antera, lo que podría aportar información sobre los mecanismos que

evitan la transmisión sexual de este virus.

11. La técnica de qPCR presentó un mayor porcentaje de detección en todos los

órganos (mayor al 90%) que la técnica de RT-PCR convencional encontrándose

que por esta última técnica se presentó un 12.7% de falsos negativos, mostrando

que la técnica de qPCR presenta una mayor sensibilidad para la detección del

virus, además permitió la detección de PYVV en muestras que provenían de

plantas no sintomáticas.

12. Es la primera vez que se utiliza la técnica de PCR en tiempo real para el estudio

de aspectos de la biología del virus. Previamente López et al. (2006) y Hernández

et al (2010) habían reportado el uso de esta técnica pero con fines de diagnóstico.

13. La información generada en este trabajo puede ser de gran importancia para

dilucidar algunos aspectos relacionados con la transmisión del virus tanto

vegetativamente a partir de semilla-tubérculo, como por transmisión por vector.

También puede ser útil en programas de fitomejoramiento, de indexado de

plantas de papa contra PYVV, programas de cuarentena y de certificación de

semillas de papa libres de virus.

9.2 Recomendaciones

1. Sería interesante ampliar la evaluación al órgano reproductor femenino (pistilo y

ovario) porque podría aportar información sobre los mecanismos que impiden la

transmisión sexual de este virus.

2. En este trabajo las plantas infectadas por vector y mantenidas en invernadero no

tuberizaron. Por lo tanto es recomendable ampliar la evaluación en estos

tubérculos para confirmar los patrones de acumulación del virus


3. Ampliar la evaluacióAmpliar el número de muestras para la evaluación de la

distribución del PYVV en diferentes órganos de plantas infectadas, incluyendo la

evaluación de muestras de tubérculo (que no fueron analizadas en este ensayo

debido a que las plantas no tuberizaron) para confirmar los patrones de

acumulación del virus.

4. Realizar un análisis focalizando en el sitio de infección para evaluar la distribución

y movimiento del virus en diferentes órganos de plantas infectadas, incluyendo el

uso de otras técnicas como inmunoimpresión de tejido (IMI), hibridación in situ o

microscopía electrónica de transmisión para hacer un análisis a nivel de tejido.

5. Hacer un análisis de la acumulación del virus en plantas de papa criolla que

presenten infecciones mixtas con PYVV para evaluar como es la interacción (si se

presenta o no sinergismo) y como se afecta la acumulación de los virus en los

diferentes órganos.

6. Se recomienda ampliar el estudio con otras variedades de papa, para ver si los

patrones encontrados son generalizados o pueden ser diferentes entre

variedades.

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