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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293
Co nta cto :Co nta cto : [email protected]
Tesis Doctoral
Detección, localización y análisis deDetección, localización y análisis deeventos singulares deeventos singulares de
reconocimiento molecular mediantereconocimiento molecular mediantemicroscopías avanzadasmicroscopías avanzadas
von Bilderling, Catalina
2013
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis FedericoLeloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the correspondingcitation acknowledging the source.
Cita tipo APA:
von Bilderling, Catalina. (2013). Detección, localización y análisis de eventos singulares dereconocimiento molecular mediante microscopías avanzadas. Facultad de Ciencias Exactas yNaturales. Universidad de Buenos Aires.
Cita tipo Chicago:
von Bilderling, Catalina. "Detección, localización y análisis de eventos singulares dereconocimiento molecular mediante microscopías avanzadas". Facultad de Ciencias Exactas yNaturales. Universidad de Buenos Aires. 2013.
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Física
Detección, localización y análisis de eventos singulares de
reconocimiento molecular mediante microscopías avanzadas
Trabajo de Tesis para optar por el título de
Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área Ciencias Físicas
por Catalina von Bilderling
Directoras de Tesis: Dra. Lía I. Pietrasanta y Dra. Andrea V. Bragas
Consejera de estudios: Dra. Silvina Ponce Dawson
Lugar de Trabajo: Centro de Microscopías Avanzadas y Laboratorio de Electrónica
Cuántica, FCEyN, UBA.
Marzo 2013
A mis padres Silvia y Carlos
a mis hermanos Clara y Hase
y a mi amiga Meri
Del mismo modo que el ovillo está ahí (o la madeja, su pequeño mar fofo naranja o verde
sobre la falda) y vos tirás de una punta, entonces la punta se entrega, la sentís ceder
desenvuelta, oh pibe qué estupendo tirar y tirar, sobre un cachito de cartón vas envolviendo el
hilo para hacer un buen ovillo sin nudos, nada de ovillado, algo continuo y terso como la
avenida General Paz. Perfectamente sacás el hilo y te parece que después de todo el otro
ovillo no estaba tan enredado, empezás a pensar que estás perdiendo el tiempo, siempre el
hilo viniendo mansito a ponerse sobre sí mismo en el cartón, lo de más abajo tapado por lo de
más arriba que en seguida es lo de más abajo ([...])
porque viene otra capa de hilo a arrollarse por encima –que en seguida es lo de
más abajo.
Todo va así perfectamente, y a vos te parece que estás perdiendo el tiempo porque el
ovillo no estaba enredado, el hilo viene y viene sin tropiezo, parece increíble que de esa masa
glutinosa nazca el hilillo claro que sube por el aire hasta tu mano. Y entonces oís (los dedos
sienten sonar esta ruptura terrible) que algo se resiste, se pone de pronto tenso, el hilo zumba
envuelto en su polvillo de talco y pelusa, un nudo cierra la salida, cierra el ritmo feliz, el
ovillo estaba enredado
en
redado
ahí dentro entonces hay cosas que no son el hilo
solamente, el ovillo no es un hilo arrollado sobre sí, dentro del mundo del ovillo entrevé
ahora tu sorpresa cosas que no son hilo, ahora ya sabés que hilo más hilo no basta para dar
ovillo. Un nudo, qué es un nudo, hilo mordiéndose, sí pero nudo, no solamente hilo dentro de
hilo. Nudo otra cosa que hilo. Globo terrestre ovillo, ahora ves mares, continentes...
Julio Cortázar, Divertimento.
i
Resumen
Las células pueden ser concebidas como dispositivos capaces de procesar
información bioquímica, cuya respuesta al entorno depende del estado funcional de
proteínas organizadas espacialmente en una compleja red. Entender la función celular
integrando la actividad molecular con la organización espacial representa un gran
desafío para la biología moderna.
Las fuerzas mecánicas tienen un papel importante en la organización,
crecimiento, maduración y función de los tejidos. A nivel celular la transmisión de las
fuerzas externas, a través de las adhesiones focales (FAs) y uniones adherentes,
parece controlar la maduración o el ensamblado de estas adhesiones e iniciar las
cascadas de señalización. En respuesta a las fuerzas aplicadas externamente, las
células reacondicionan activamente la organización y la actividad contráctil del
citoesqueleto y redistribuyen sus fuerzas intracelulares. Con el objetivo de estudiar la
regulación dinámica de los contactos adhesivos y la arquitectura del citoesqueleto de
la célula así como su influencia en la señalización celular, en este trabajo de Tesis se
estudió la relación entre una fuerza (local o global) aplicada a la célula y el
ensamblado, mecánica y dinámica de las adhesiones focales. El objetivo principal de
este trabajo fue estudiar la respuesta dinámica de las proteínas de las FAs ante un
estímulo mecánico controlado. En este contexto, se implementaron y desarrollaron
técnicas de Microscopía de Fluorescencia, Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) y
Espectroscopía de Fuerza (FS) aplicadas a distintos sistemas biomoleculares, desde
plataformas biomiméticas hasta células vivas. Se optimizaron las mediciones de
fuerza a nivel intermolecular y se investigaron la dinámica de las proteínas y las
interacciones proteína-proteína en las FA de células vivas.
Se implementó la FS mediante el estudio de las fuerzas de interacción entre
grupos funcionales químicos y el sistema modelo ligando-receptor, biotina-
ii
estreptavidina. Se logró caracterizar la fuerza de interacción a nivel de moléculas
individuales entre el sitio de unión RGD de la fibronectina y su receptor, la proteína
integrina, en la membrana de células HC11 in vivo. Se obtuvo una fuerza característica
de ruptura del complejo RGD-integrina de (37.6 ± 0.7) pN.
Se expresaron las proteínas de las FAs zixina, vinculina, FAK, paxilina, integrina
y actina unidas a proteínas fluorescentes visibles (VFPs) en células epiteliales
mamarias de ratón HC11. Se diseñó y construyó un dispositivo estirador de células,
para explorar la relación entre un estímulo mecánico global y los cambios en la
dinámica y en las interacciones entre las proteínas. Mediante técnicas de microscopía
de fluorescencia como FRAP (Recuperación de la Fluorescencia luego del
Fotoblanqueo), FRET (Transferencia de Energía Resonante de Förster) y N&B
(Número y Brillo), se estudió el estado mecánico general de las FAs, determinando la
tasa de disociación de las proteínas a las FAs (koff) y el estado de agregación de las
mismas.
Se trabajó en la adaptación de un microscopio combinado AFM/ Fluorescencia
desarrollado en el Laboratorio de Electrónica Cuántica (FCEN-UBA) para su utilización
en condiciones fisiológicas y con células vivas. Se demostró que dicho microscopio es
capaz de obtener imágenes combinadas en condiciones fisiológicas, con alta calidad
óptica y con un rango vertical para AFM que permite que la visualización de células in
vivo sea de rutina. Mediante la medición de las fuerzas de interacción entre el par
ligando-receptor biotina-estreptavidina, se corroboró que el microscopio combinado
alcanza la resolución requerida para cuantificar fuerzas de interacción entre moléculas
individuales. Utilizando este nuevo microscopio combinado, se estudió mediante
fluorescencia la evolución temporal de las proteínas de las FAs, zixina y vinculina, en
respuesta a un estímulo mecánico local aplicado por AFM con un sensor de fuerza
funcionalizado. Se observó el remodelado de las FAs maduras y el reclutamiento de la
proteína vinculina para la formación de nuevas FAs en respuesta a la fuerza local
aplicada.
En este contexto, se presenta una estrategia novedosa que permite obtener
imágenes de alta resolución y medir fuerzas al nivel de moléculas individuales en tiempo
real. Nuestra estrategia combina metodologías de alta resolución para sensar y
iii
caracterizar cambios físicos/bioquímicos en células vivas. En conclusión, se
implementaron técnicas de AFM y fluorescencia para estudiar algunos aspectos de la
compleja maquinaria celular. De la correlación directa de estas técnicas en el nuevo
microscopio combinado estaríamos en condiciones de abordar nuevos desafíos
fundamentales en el entendimiento de la biofísica y la biología celular.
iv
v
Detection, localization and analysis of single molecular
recognition events using advanced microscopies
Abstract
The cell can be conceived as a biochemical information-processing device
whose response to the environment depends on the state of spatially organized
networks of protein activities. Understanding cell function by integrating molecular
activities with spatial organization is an important challenge for modern biology.
Mechanical forces play an important role in the organization, growth,
maturation, and function of living tissues. At the cellular level, many of the biological
responses to external forces originate at two types of specialized structures: focal
adhesions and adherent junctions. In order to explore the dynamic regulation of
adhesive contacts and of the cytoskeleton architecture of cells, as well as its resultant
influence on cellular activities, we are focused on the relationship between local force
applied to the cell and the assembly, mechanics and dynamics of focal adhesions (FA).
The goal of our work is to study the dynamic response of FA proteins when a precise
and punctual force is applied. In this context, we have applied Fluorescence
Microscopy (FM), Atomic Force Microscopy (FM) and Force Spectroscopy (FS)
techniques on different biomolecular systems -from biomimetic platforms to living
cells- in order to optimize force measurements at the intermolecular level and
investigate protein dynamics and protein-protein interactions on FA of living cells.
We have implemented FS measurements by studying the interaction forces
between chemical functional groups and the well known ligand-receptor pair, biotin-
streptavidin. We were able to characterize the fibronectin binding site RGD-integrin
vi
interaction at the single molecule level by measuring rupture forces between RGD
functionalized probe-tips and the integrin receptors in the membrane of living HC11
cells. We found a characteristic interaction force of (37.6 ± 0.7) pN for the single RGD-
integrin complex.
We have expressed in HC11 epithelial mammalian living cells the FA
component proteins zyxin, vinculin, FAK, paxilin, integrin and actin tagged with visible
fluorescent proteins (VFPs), and also designed and constructed a cell stretching device
to explore the relationship between a global mechanical stimulus and changes in
protein dynamics and interactions. By fluorescence techniques such as fluorescence
recovery after photobleaching (FRAP), Förster Resonance Energy Transfer (FRET) and
Number and Brightness (N&B), we studied the mechanical state of the FAs,
determining the dissociation rate constant parameter (kOFF) and the aggregation state
of different FAs proteins.
We worked on the adaptation of a combined AFM/Fluorescence microscope,
designed and assembled at the Quantum Electronics Lab (FCEyN-UBA) for working
under physiological conditions in liquid environments. The combined microscope was
tested and validated by successfully imaging of living cells. We also validated the
possibility of measuring interaction forces based on molecular recognition of the pair
biotin-streptavidin. With this novel combined microscope we studied by fluorescence
the temporal evolution of the FAs proteins, vinculin and zyxin, in response to a
mechanical local and functional stimulus applied with an AFM force-probe. We were
able to observe the remodeling of mature FAs and the recruitment of vinculin to form
nascent FAs in response to the locally applied force.
In this context, we present a new approach that can be employed for real-time,
high-resolution imaging and measurements of forces at the single molecule level. Our
strategy combines very highly sensitive technologies for probing and detection of
biochemical/physical changes within living cells. In summary, we implemented both AFM
and fluorescence techniques to study some aspects of the complex molecular machinery
of the cell. From the direct correlation of these techniques in the new combined
microscope we may now afford a new level of insight into cell biology and biophysics.
vii
viii
ix
Índice General
I. Introducción general
I.1 Interacciones moleculares............................................................................
4
I.2 Nanotecnología y microscopías avanzadas para el estudio de
interacciones biomoleculares...........................................................................
4
I.3 Mecánica y fuerzas en sistemas biológicos: el mecanoma.......................... 5
I.4 Mecanotransducción celular: interacciones moleculares citoesqueleto-
membrana-matriz extracelular.........................................................................
8
I.5 Objetivos de este trabajo de Tesis............................................................... 11
I.6 Referencias................................................................................................... 13
II. Fundamentos e implementación de las técnicas experimentales
II.1 Microscopía de Fuerza Atómica………………………………...............……………
17
II.1.1 El Microscopio de Fuerza Atómica……………………………...........……... 19
II.1.2 Sensores de fuerza……………………………………….......………............... 24
II.1.3 Espectroscopía de Fuerza …………………………………………..............…. 27
II.1.4 Calibración de la constante elástica de los sensores de fuerza.
Desarrollo de herramientas para su implementación en el Centro de
Microscopías Avanzadas (CMA).................................................................
30
II.1.5 Funcionalización de los sensores de fuerza y espectroscopía de
fuerza a través de espaciadores flexibles...........………………………..............
32
II.1.6 Referencias........................................................................................ 35
II.2 Microscopía de Fluorescencia………………....................................................
37
II.2.1 El Microscopio de Fluorescencia…………………………………….............. 39
II.2.2 Microscopía confocal de barrido láser……………….............................. 40
x
-El microscopio confocal Olympus FV1000 espectral......................... 41
II.2.3 Proteínas fluorescentes en el visible (VFPs)..…….…………………..…….. 44
- Proteína verde fluorescente (GFP)………………….............……………. 45
- Proteínas fluorescentes derivadas de GFP....................................... 46
II.2.4 Fotoblanqueo………….................................................................……. 47
II.2.5 Técnicas asociadas a la Microscopía de Fluorescencia………….....……. 48
II.2.5 a FRET………………………………………………………....................... 49
II.2.5 b FRAP……………………………………………………..............………… 50
II.2.5 c N&B…………………………………...………………....................……. 51
- Modificación para modo pseudo-conteo de fotones y calibración de los
detectores.................................................................................................
54
II.2.6 Referencias....................................................................................... 57
II.3 Microscopía Combinada AFM-Fluorescencia..............................................
59
II.3.1 Microscopía Combinada AFM-óptica................................................. 61
II.3.2 El microscopio combinado del laboratorio de Electrónica Cuántica.... 61
II.3.3 Adaptación del microscopio combinado para trabajar en condiciones
fisiológicas.................................................................................................
65
II.3.4 Microscopía de fluorescencia. Caracterización de la iluminación y
ruido de fondo para el análisis cuantitativo de las imágenes.......................
67
II.3.4 a Iluminación............................................................................. 67
II.3.4 b Ruido de fondo....................................................................... 68
II.3.4 Referencias........................................................................................ 69
II.4 Cultivo celular y dispositivo estirador de células vivas………………..........…
71
II.4.1 Cultivo celular: línea celular utilizada .....……………………………........... 73
II.4.2 Protocolos de cultivo celular y crio-preservación .....………………........ 74
II.4.3 Transfecciones ...............................…………………………………............ 74
II.4.4 Proteínas expresadas y plásmidos …………………………………............. 76
II.4.5 Dispositivo estirador de células vivas: diseño y calibración del
estiramiento..............................................................................................
79
xi
II.4.6 Referencias....................................................................................... 82
III. Microscopía de fuerza atómica y espectroscopía de fuerza
avanzadas: visualización y propiedades mecánicas. Detección y
localización de eventos singulares de reconocimiento molecular.
Capítulo 1. Caracterización de un biosensor amperométrico-enzimático
basado en reconocimiento molecular……………………………..............................
87
1.1 Introducción…………………………………………………..................………….. 89
1.2 Biosensor de glucosa capa-por-capa……………………………………........... 89
Uso de capas bioensambladas de dextrano como barreras................ 91
1.3 Estudio de la topografía de cada capa mediante Microscopía de Fuerza
Atómica……………………………………………………………....................………...
93
1.4 Conclusiones……………………………………………………………................... 96
1.5 Referencias.......................................................................................... 97
Capítulo 2. Microscopía de Fuerza Atómica para la medición de fuerzas de
interacción entre moléculas………………………………………...…...........................
99
2.1 Introducción……………………………………………………........................….. 101
2.2 Microscopía de Reconocimiento Químico: interacciones CH3-CH3 y
COOH-COOH……………………………….………………………...................………
102
2.2.1 Antecedentes………………………………………………...................... 102
2.2.2 Modificación de sensores de fuerza y sustratos mediante
alcanotioles …………………………...………………………...................…….
103
2.2.3 Visualización de patrones por fricción…………………...........….… 104
2.2.4 Fuerzas de interacción …………………………………...............….… 106
2.3 Microscopía de Reconocimiento Molecular: interacción del complejo
biotina-estreptavidina…………………………………………………..….........………
108
2.3.1 Antecedentes………………………...……………………...................… 108
2.3.2 Modificación de sensores de fuerza y sustratos.……….....…….… 109
2.3.3 Fuerzas de interacción …………………………………….................… 111
xii
2.4 Interacción RGD-integrina………………………………………….................... 112
2.4.1 Antecedentes en el estudio de la interacción fibronectina-
integrina ………………………...…………………….....................................
112
2.4.2 Preparación de células y funcionalización de los sensores de
fuerza................................................................................................
114
2.4.3 Fuerzas de interacción RGD-integrina en células vivas.............. 115
2.5 Conclusiones........................................................................................ 117
2.6 Referencias.......................................................................................... 117
IV. Microscopía de fluorescencia multidimensional: visualización,
localización y distribución de los complejos adhesivos. Análisis del
estado mecánico de una célula viva, determinación de las constantes
cinéticas, correlación entre concentración y estado de agregación de
los complejos de adhesión.
Capítulo 3. Expresión y visualización de proteínas de las adhesiones focales
por Microscopía Confocal de Fluorescencia……..................................…......…..
121
3.1 Introducción………………………………………………................................... 123
3.2 Células HC11 para las mediciones de fluorescencia............................... 123
3.2 Visualización de proteínas de las adhesiones focales en células HC11… 124
3.3 Estiramiento mecánico de células vivas en cultivo…................…….....… 127
3.4 Conclusiones……………………………..................……............................... 131
3.5 Referencias........................................................................................... 132
Capítulo 4. Determinación de las constantes cinéticas de proteínas de las
adhesiones focales mediante Recuperación de la Fluorescencia después del
fotoblanqueo (FRAP)……….………………..………….................………….............….
133
4.1 Introducción……………………………..................………….......................... 135
4.2 FRAP en adhesiones focales: experimento y modelos.......................... 135
Modelo de recuperación en adhesiones focales................................. 138
xiii
4.3 Parámetros de la cinética molecular de proteínas de las adhesiones
focales mediante FRAP..............................................................................
142
4.4Respuesta de la cinética de zixina ante estímulos mecánicos y
diferencias en la composición y rigidez de la matriz extracelular................
144
4.5 Conclusiones………….................…………………………............................. 147
4.6 Referencias.......................................................................................... 150
Capítulo 5. Determinación del estado de agregación de proteínas de
adhesiones focales en células vivas por Número y Brillo (N&B)…....................
153
5.1 Introducción…………………………………………………………….................... 155
5.2 N&B en adhesiones focales. Experimento y análisis.....……................... 155
Calibración del brillo molecular del monómero.................................. 157
5.3 Caracterización del estado de agregación de proteínas de las
adhesiones focales.....................................................................................
158
5.4 Estudio del estado de agregación de la proteína de adhesiones focales
zixina en respuesta a un estímulo mecánico………………………...........……...
161
5.5 Estado de agregación de la proteína zixina durante el desensamblado
de una adhesión focal………………………………………………….................…...
162
5.6 Conclusiones…………………………………………………………..................…. 164
5.7 Referencias.......................................................................................... 165
Capítulo 6. Sensor de tensión de vinculina: caracterización de fuerzas
mecánicas en células vivas por transferencia de energía resonante de
Förster (FRET)………..........................................................................................
167
6.1 Introducción…………………………………………………………….................... 169
El sensor de vinculina………………………………………......….................. 169
6.2 FRET por Ratio-imaging……………………………………………….................. 171
6.3 Controles por sangrado espectral.…………………………….…….............… 172
6.4 Visualización del sensado de tensión in vivo…................................…… 174
6.5 Conclusiones…………………………………………………………..................…. 177
6.6 Referencias.......................................................................................... 177
xiv
V. Microscopía multi-análisis AFM/fluorescencia: visualización, detección, integración y respuesta. Reclutamiento de proteínas de
las adhesiones focales en respuesta a un estímulo mecánico local y
funcional.
Capítulo 7.......................................................................................................... 181
7.1 Introducción......................................................................................... 183
7.2 Detección de fuerzas en el orden de los pN. Sistema ligando-receptor:
biotina-estreptavidina................................................................................
183
7.3 Visualización de adhesiones focales en células vivas............................. 185
7.4 Combinación de topografía y fluorescencia para estudiar células vivas. 186
7.5 Experimentos en respuesta a un estímulo mecánico local..................... 187
7.5.1 Evolución temporal de la proteína adhesiva zixina en respuesta
a un estímulo mecánico local.............................................................
191
7.5.2 Evolución temporal de la proteína adhesiva vinculina en
respuesta a un estímulo mecánico local.............................................
198
7.5 Conclusiones........................................................................................ 202
7.6 Referencias........................................................................................... 203
VI. Conclusiones generales y perspectivas…………........................……….....
205
VII. Agradecimientos…................................…………........………......................
211
I. Introducción general
Una función celular es el resultado de una compleja secuencia de interacciones
moleculares, interacciones que representan cada eslabón de una cascada de señalización.
En este contexto, la estrategia de este trabajo de Tesis consistió en combinar distintas
técnicas de microscopía de fluorescencia y de microscopía de fuerza atómica (AFM),
que nos permitieron visualizar y localizar complejos multiproteicos en células, analizar
su dinámica y estado de agregación, caracterizar las interacciones ligando-receptor,
perturbar externamente la superficie celular, y observar la respuesta de la célula en
distintas condiciones.
En conjunto, este trabajo de Tesis consistió en la puesta a punto de diferentes
metodologías que permitieron estudiar interacciones entre biomoléculas, y la utilización
de dichas técnicas en diferentes sistemas: desde plataformas biomiméticas hasta células
vivas. Se trata de un trabajo de carácter interdisciplinario, en el que se desarrollaron y
combinaron herramientas de nanotecnología, microscopías y espectroscopías avanzadas,
fisicoquímica de superficies y biología molecular y celular. La combinación de todas
estas disciplinas resulta necesaria dada la complejidad del tipo de preguntas biológicas
que queremos contestar.
En esta sección describo cómo se dan en general las interacciones moleculares
en el complejo sistema de una célula viva, y en particular de qué se trata y qué
conocemos acerca del proceso de mecanotransducción celular, nuestro proceso
biológico de interés. Pretendo así dar el marco en el que surge el desafío de combinar
las diversas técnicas biofísicas que se abordaron en este trabajo de Tesis para responder
sólo algunas preguntas en el complejo marco de dicho proceso biológico.
I. Introducción
4
I. 1 Interacciones moleculares
Las células pueden ser concebidas como dispositivos capaces de procesar
información bioquímica, cuya respuesta al entorno depende del estado funcional de
proteínas organizadas espacialmente en una compleja red. Entender la función celular
integrando la actividad molecular con la organización espacial representa un gran
desafío para la biología moderna. La gran heterogeneidad en la estructura y en la
composición de las células requiere de mediciones en condiciones fisiológicas en una
escala de tiempo que van desde décimas de segundo hasta los minutos y días. Además,
la naturaleza molecular de las cascadas de señalización y las fuerzas de interacción
involucradas demandan una sensibilidad en la escala de los nanómetros y a nivel de
piconewtons.
La intercomunicación celular se da a través de señales de todo tipo (hormonas,
citocinas, factores de crecimiento, pequeños péptidos, etc.) que regulan la proliferación,
la diferenciación, el metabolismo, el comportamiento celular, e incluso la muerte celular
programada (apoptosis). Cuando una molécula (ligando) llega para comunicar cierta
información a la célula, interacciona con su respectivo receptor y se produce la
activación de rutas específicas de transducción de señales. Seguidamente, las señales
son transmitidas hacia el interior de la célula, hasta los puntos en que se regula el
metabolismo, la transcripción y la traducción de genes para generar la respuesta
adecuada. Cada señal extracelular es transducida a través de múltiples rutas, o cascadas
de señalización, en las que intervienen numerosas proteínas que interactúan ganando
y/o perdiendo su actividad biológica mediante diversas modificaciones tales como
fosforilación, desfosforilación y translocación intracelular. Entender cómo la célula
ensambla estos complejos proteicos de señalización resulta crítico para descifrar los
procesos que se dan en enfermedades, y por lo tanto de esencial importancia para
diseñar estrategias terapéuticas.
I.2 Nanotecnología y microscopías avanzadas para el estudio de interacciones
biomoleculares
I. Introducción
5
El principal desafío de la biología actual es descifrar la arquitectura jerárquica de
las redes moleculares que componen las cascadas de señalización y su funcionamiento.
Para ello se requiere una comprensión cuantitativa acerca de cómo los componentes
moleculares de las células interactúan unos con otros y cómo se organizan en módulos
funcionales con tareas discretas específicas que una única clase de moléculas no podría
cumplir. En este sentido, las herramientas desarrolladas por la nanotecnología han
comenzado a dilucidar algunas piezas de este entramado rompecabezas y nos han
permitido avanzar en el conocimiento de cómo trabajan las células.
Tanto la nanotecnología como las microscopías avanzadas han aportado en los
últimos años una diversidad de técnicas que permiten estudiar las características
biofísicas y químicas de las moléculas y sus ensamblados. Esto incluye el seguimiento
de las moléculas en su movimiento dentro de la célula con alta resolución espacio-
temporal desde su síntesis hasta su degradación1, y el potencial sensado de las fuerzas a
las que son sometidas2. Ha sido también posible analizar la cinética de los procesos de
ensamblado molecular in vivo3, obtener información cuantitativa de la cinética de las
modificaciones químicas de todos los componentes moleculares asociados a una dada
cascada de señalización, y cómo estas cascadas se interrelacionan4. Mediante el uso de
microscopías avanzadas se ha podido no sólo visualizar, sino también detectar (sensar)
y cuantificar la interacción entre biomoléculas correlacionando esta información con la
localización espacial, lo cual resulta de esencial importancia en el contexto de una
célula.
I.3 Mecánica y fuerzas en sistemas biológicos: el mecanoma
La genómica y en general las áreas definidas con el sufijo “ómica” como la
proteómica entre otras, abarcan poderosas herramientas a nivel de sistemas en biología.
Todas ellas están basadas en grandes avances en instrumentación y computación, tales
como secuenciadores de ADN y espectrómetros de masa, críticos en lo que se
denomina la “secuenciación” del genoma humano. En este sentido, en biofísica y
biomecánica se han producido significativos avances en los métodos experimentales, y
el desarrollo de nuevas microscopías han hecho posibles mediciones de alta resolución a
nivel celular y molecular . El mecanoma se ha definido para describir el rol general de
I. Introducción
6
la fuerza y la mecánica en biología. Así como el genoma, el mecanoma promete superar
nuestro entendimiento de la maquinaria biológica y abrir nuevas estrategias que
permitan combatir enfermedades.
Muchos procesos en enfermedades son de naturaleza mecánica. Por ejemplo, el
cáncer progresa de muchas maneras mecánicas5, como la maquinaria de la infección
viral responsable de la hepatitis B, el virus de papiloma humano y otros tipos de cáncer
relacionados. La metástasis involucra el desprendimiento de las células tumorales desde
el sitio inicial de crecimiento, su migración, circulación, y subsecuente invasión a través
de la adhesión a nuevos lugares del organismo6. Cambios intracelulares en células
cancerosas traen aparejados un crecimiento y proliferación celular, motilidad y adhesión
anormales.
Los procesos mecánicos son críticos, no sólo a nivel molecular sino también en
tejidos y a niveles más altos de organización. De hecho la mecánica del entorno
extracelular es un factor importante en el destino de la célula. Células madre cultivadas
en sustratos de diferente dureza se diferencian en distintos tipos celulares. Por ejemplo,
células madre mesenquimales crecidas en matrices con elasticidades similares a las de
cerebro (1 kPa), músculos (10 kPa) y huesos (100 kPa) se diferencian en células tipo
neuronas, células musculares y osteoblastos respectivamente7.
Con el avance en instrumentación y métodos experimentales actuales, estamos
en condiciones de dilucidar el mecanoma a nivel molecular. Por ejemplo, la microscopía
de fuerza atómica, que permite aplicar fuerzas controladas a estructuras mientras se las
visualiza con resolución nanométrica, puede ser utilizada para medir transiciones
mecánicas en el desplegado de proteínas8, la ruptura de uniones moleculares
individuales9 y la movilidad de motores moleculares10.
Este tipo de mediciones requieren sensibilidad en un amplio rango de fuerzas.
En la Tabla I.1 se presentan algunos ejemplos de fuerzas características de ciertos
procesos que van desde niveles celulares hasta niveles moleculares. Un amplio abanico
de metodologías para sensar fuerzas se complementan para cubrir todo este rango de
fuerzas. En él se incluyen la microscopía de fuerza atómica (AFM), la
micromanipulación con micropipetas, pinzas magnéticas y pinzas ópticas. Las pinzas
ópticas, una técnica establecida en la investigación de la biofísica de moléculas
individuales, es también una herramienta muy utilizada para sensar interacciones
moleculares en motores biológicos e interacciones ligando-receptor11.
I. Introducción
7
Proceso
Fuerza requerida / generada
Referencia bibliográfica
Contracción celular ~2 �N 12
Ruptura de enlace covalente ~4 nN 13
Desplegado de dominios de proteínas
solubles en agua ~100-200 pN 14
Desplegado y separación de proteínas
de membrana desde la bicapa lipídica ~100-150 pN 15
Ruptura de interacciones ligando -
receptor ~20-200 pN 16
Proteínas motoras del citoesqueleto ~2-10 pN 17
Tabla I.1 Fuerzas características de procesos celulares (adaptado de18).
La Microscopía de fluorescencia es otra técnica muy poderosa para observar
moléculas individuales. Con los últimos avances en esta tecnología, la misma puede ser
usada para seguir motores moleculares marcados fluorescentemente con resolución
nanométrica19. Los métodos de transferencia de energía resonante de Förster (FRET)20
entre un par de fluoróforos proporcionan una regla molecular con una dependencia en
distancia (r) de 1/r6 en la escala de unos pocos nanómetros, lo que las vuelve muy útiles
para monitorear cambios conformacionales21.
Muchos otros avances, como los métodos de cortes láser, la recuperación de la
fluorescencia luego del fotoblanqueo (FRAP)22, la liberación fotoactivada de
compuestos y las mediciones resueltas en el tiempo se pueden integrar para producir
nuevas herramientas muy poderosas.
La evolución también fue muy importante en la tecnología de los ensayos, la
biología molecular y la química de las funcionalizaciones. Las estrategias de biología
molecular, como la posibilidad de utilizar la proteína verde fluorescente23 (GFP) para
marcar genéticamente las proteínas de interés, han hecho progresar el área
significativamente. Se han desarrollado también nuevas sondas, como colorantes
orgánicos intensificados o puntos cuánticos (quantum dots) que permiten visualizar
moléculas individuales por períodos extensos de tiempo24.
Con las herramientas y los avances en los ensayos descriptos, se puede decir que
estamos empezando a sensar la maquinaria de la naturaleza. Se espera así avanzar en un
I. Introducción
8
entendimiento cuantitativo de la maquinaria molecular y celular, medir las fuerzas y
dilucidar los pasos mecánicos involucrados en el mecanoma. Una vez que entendamos
las leyes físicas que gobiernan los sistemas biológicos y podamos entender la
maquinaria de la naturaleza, seremos eventualmente capaces de “secuenciar” el
mecanoma.
I.4 Mecanotransducción celular: interacciones moleculares citoesqueleto -
membrana - matriz extracelular
La mayoría de las células en órganos y tejidos están sujetas a estímulos
mecánicos externos constantes, los cuales modulan casi todos los aspectos de la función
celular, mantenimiento de la forma y función del tejido25. Cada proceso de la superficie
celular se basa en fuerzas moleculares que reflejan la compleja relación que existe entre
interacciones químicas, biológicas y físicas26. Dilucidar cuándo y dónde ciertas
interacciones determinan procesos biológicos en una célula es como descifrar un
lenguaje molecular básico. Entender este lenguaje significa describir cómo un receptor
de membrana plasmática encuentra a su ligando específico, cómo y dónde se unen los
ligandos, y por qué mecanismo los ligandos cambian el estado funcional de su blanco.
También incluye describir cómo las interacciones celulares modulan el ensamblado de
las moléculas y el estado funcional de los receptores de la superficie celular. Así, las
células generan, sensan, resisten y responden a fuerzas mecánicas en un rango de
fuerzas va desde unos pocos pN hasta nN12,17. Para entender cómo los sistemas
biológicos responden al estrés mecánico, las fuerzas a las cuales se disocian los
ensamblados moleculares, es relevante considerar los eventos de ruptura de las
interacciones y los de desplegado de dominios moleculares. Comenzando a nivel de
moléculas individuales, la ruptura del enlace covalente C-C es de ~4 nN13. Esto es
considerablemente más grande que la fuerza que se necesita para desplegar un dominio
proteico de la proteína titina14 (~150 a 200 pN), y ligeramente menor a las fuerzas que
se necesitan para desplegar secuencialmente, y extraer de la membrana celular, los
dominios estructurales de proteínas integrales de membrana15. De especial interés es el
rango de fuerzas de unión de las interacciones ligando-receptor16, las cuales caen entre
20 y 200 pN. La forma y el estado funcional de las células eucariotas están definidos
por ciclos de mecanosensado, mecanotransducción y mecanorespuesta27. De esta forma
I. Introducción
9
las células sensan las fuerzas específicas y las convierten en señales bioquímicas28, a la
vez que son extremadamente sensibles a varias características del microentorno,
incluyendo la naturaleza química de las moléculas adhesivas de la superficie29, su
distribución espacial precisa a nivel de micro y nanómetros30, y las propiedades físicas
de la superficie, tales como topografía31, rigidez32, anisotropía33y dimensionalidad34.
Cómo las células detectan las señales externas, las integran y convierten en respuestas
bioquímicas, es un área del conocimiento de intenso estudio. Este proceso llamado
mecanotransducción celular es complejo y cuenta con múltiples participantes donde
se destacan la matriz extracelular (ECM), receptores de adhesión que son proteínas
transmembrana (integrinas), estructuras del citoesqueleto y moléculas de las cascadas de
señalización35. Muchas enfermedades aparentemente no relacionadas como pueden ser
la insuficiencia cardíaca, hipertensión arterial, cáncer, asma, sordera congénita,
disfunción sexual, incontinencia urinaria, tienen en común que su etiología o
presentación clínica resulta de un proceso de mecanotransducción anormal36. Entender
los principios de la mecanotransducción celular es fundamental, no sólo para conocer
mejor cómo funciona una célula, sino también para desarrollar nuevas tecnologías.
A nivel celular, las respuestas biológicas a fuerzas externas se originan en dos
tipos de estructuras especializadas: adhesiones focales (célula-matriz extracelular) y
uniones adherentes (célula-célula)37. Estos sitios de adhesión son complejos de
proteínas dispuestos en ensamblados multi-moleculares que unen la matriz extracelular,
a través de receptores integrales de membrana, a componentes del citoesqueleto. Las
adhesiones focales, también conocidas como contactos focales, son estructuras planas,
alargadas de unos pocos micrones cuadrados que a menudo están localizadas en la
periferia de las células, y que además funcionarían como organelas de señalización en el
proceso de mecanotransducción celular38. A pesar del enorme progreso hecho en la
caracterización a nivel molecular de estas estructuras en los últimos años39, todavía
existen interrogantes sin contestar acerca de su formación y de su dinámica. Los detalles
de cómo se transmiten las fuerzas o cómo son transducidas mecano-químicamente no se
conocen. Cómo las células pueden variar activamente la fuerza de adhesión y cuáles son
los elementos involucrados son preguntas abiertas.
Es importante destacar que, con la excepción de las integrinas, las proteínas de
las adhesiones focales son citoplasmáticas. Por esta razón, los métodos usados para
I. Introducción
10
medir las propiedades de unión de los receptores integrinas a su ligando (fibronectina)
de la matriz extracelular no pueden emplearse para estudiar interacciones similares entre
las proteínas de adhesiones focales (FA) asociadas al citoesqueleto in situ (actina, FAK,
vinculina, zixina, paxilina, talina, entre otras). Tomando el receptor integrina, que es
una proteína integral de membrana, separamos las interacciones que ocurren en el
dominio extracelular de aquellas que tienen lugar en el dominio intracelular del
receptor. En la Figura I.1 se presentan un esquema del sistema general estudiado,
partiendo de la célula sometida a los estímulos mecánicos presentes en su entorno
natural (Figura I.1 A), las adhesiones focales como la unión de la célula con la matriz
extracelular (unión integrina-fibronectina, Figura I.1 B), y por último indicando la
complejidad de la composición de las FAs a nivel intracelular, que involucra numerosas
proteínas ya sea como componentes de la FA o como parte de la cascada de
señalización activada por fuerza (Figura I.1 C).
Figura I.1 Adhesiones focales. A Las células están expuestas a múltiples tipos de fuerzas, como el flujo
de fluido (shear), las tensiones producidas por la matriz extracelular (ECM) y las fuerzas contráctiles
generadas por el propio citoesqueleto. El esquema muestra una célula unida a la ECM. B Detalle de una
adhesión focal, donde se observa el balance de las fuerzas interna y externa (Fext y Fcell, respectivamente).
Se ven las fibras de actina (rojo), unidas a las FAs (arreglo de varias proteínas) que se unen a la ECM
(azul) a través de las integrinas (marrón). C Detalle de la composición intracelular de las FAs, en las que
se presentan algunas de las alrededor de 160 proteínas que las conforman. Adaptado de 39, 40.
A
B
C
I. Introducción
11
I.5 Objetivos de este trabajo de Tesis
El objetivo general del proyecto en el que se enmarca este trabajo de Tesis es el
de estudiar la estructura, respuesta mecánica y dinámica de las adhesiones focales en
células vivas. En particular nos interesa el rol del anclaje citoesqueleto-receptores de
adhesión en la formación de las adhesiones focales y la señalización intracelular
inducida por la formación de los complejos adhesivos en respuesta a un estímulo
mecánico.
En este contexto, los objetivos específicos de esta Tesis involucran tres aspectos
generales:
• la medición de fuerzas de interacción en la escala de los pN, aplicada a la
detección y localización de eventos de reconocimiento molecular
• el análisis del estado mecánico de una célula viva, la determinación de las
constantes cinéticas, y la correlación entre concentración y el estado de
agregación de los complejos de adhesión.
• la integración entre un estímulo dado por el reconocimiento molecular y la
respuesta global de la célula.
Cada uno de estos objetivos requirió el desarrollo de técnicas asociadas a
diferentes microscopías avanzadas.
En primer lugar, mediante microscopía de fuerza atómica y espectroscopía de
fuerza avanzadas, se puso a punto la detección y localización de eventos singulares de
reconocimiento molecular (Sección III). Se comenzó con el estudio de un biosensor
amperométrico-enzimático basado en reconocimiento molecular (Capítulo 1), para el
cual se estudió la organización de multicapas proteicas a través del análisis cuantitativo
de imágenes topográficas. Se implementó posteriormente la medición de fuerzas de
interacción moleculares (Capítulo 2), desde la medición de fuerzas de interacción entre
grupos funcionales químicos, pasando por la interacción del sistema modelo biotina-
estreptavidina a nivel de moléculas individuales, hasta la medición de la fuerza de
interacción del complejo adhesivo RGD-integrina en células vivas.
En segundo lugar, se utilizó la microscopía de fluorescencia multidimensional
para analizar el estado mecánico de una célula viva (Sección IV). Se expresaron las
proteínas de las FA en células y se visualizaron los complejos y su respuesta a un
estiramiento controlado (Capítulo 3). Se puso a punto la técnica de recuperación de la
I. Introducción
12
fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP) para estudiar las constantes cinéticas de
asociación y disociación de estas proteínas a las FAs (Capítulo 4). Se analizó el estado
de agregación de las proteínas de las adhesiones focales en función de su localización en
la célula y en respuesta a un estímulo mecánico macroscópico (Capítulo 5) mediante el
método número y brillo (N&B). Se utilizó también la técnica de transferencia de energía
resonante de Förster (FRET) para analizar la distribución de fuerzas en las FA mediante
un sensor de tensión basado en la proteína adhesiva vinculina (Capítulo 6).
Por último, se implementó la microscopía multi-análisis AFM/Fluorescencia
en células vivas (Sección V, Capítulo 7), logrando la detección de interacciones
ligando-receptor a nivel de moléculas únicas. Mediante esta microscopía fue posible
realizar un estímulo mecánico local y funcional en células vivas y estudiar la respuesta
temporal de las proteínas de las FAs por fluorescencia.
En la Sección VI se resumen las conclusiones y perspectivas del trabajo.
En la Figura I.2 esquematizo los objetivos de la tesis y las microscopías que se
utilizaron para abordarlos.
Figura I.2 Esquema de objetivos y técnicas de este trabajo de Tesis. Perturbando externamente la
célula (AFM) podemos disparar la formación de una adhesión inicial, medir la interacción específica
entre las proteínas de la ECM y los receptores de membrana integrina, y generar el estímulo mecánico
para poder estudiar la respuesta celular. Por otro lado, podemos estudiar las adhesiones focales estables ya
formadas con el sustrato (microscopía de fluorescencia) analizando su composición, su estado mecánico
general y, en particular, la dinámica y el estado de agregación de las proteínas intracelulares. Por último,
combinando ambas técnicas (microscopía AFM/Fluroescencia) podemos analizar los cambios en el
estado mecánico de la célula como respuesta al estímulo aplicado. Adaptado de 41.
Adhesión focal
Adhesión inicial AFM formación
reconocimiento –
interacción
composición
estado mecánico
dinámica
estado de agregación
Fluorescencia
Microscopía Combinada
respuesta
estímulo
I. Introducción
13
I.6 Referencias 1 Wouters,F. S.; Verveer,P. J.; Bastiaens,P. I. H., Trends Cell Bio 11: 203 (2001); Lichtman J.
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I. Introducción
14
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Sokurenko, E., Annu. Rev. Biophys., 37: 399 (2008). 27 Gumbiner, B. M., Nat.Rev. Mol. Cell Biol., 6: 622 (2005); Discher, D. E., Janmey, P. & Wang,
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Opin Cell Biol,21:38 (2009). 36 Ingber, D. E., Ann. Med., 35:1 (2003); Jaalouk D. E. and Lammerding J., Nat. Rev. Mol. Cell Biol.,
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(2001). 40 Chen C. S., J. Cell Sci. 121: 3285-3292 (2008). 41 Galbraith C. G., Yamada K. M. and Sheetz M. P., J. Cell Biol., 159 (4): 695 (2002).
II. Fundamentos e
implementación
de las técnicas
experimentales
II.1
Microscopía de Fuerza Atómica
En este capítulo introduzco la Microscopía de Fuerza Atómica, su principio de
funcionamiento, modos de operación y las bases de la espectroscopía de fuerza. Detallo
cómo se implementó la calibración de los sensores de fuerza para su utilización en la
medición precisa de fuerzas de interacción moleculares. Por último describo las
características particulares de la espectroscopía de fuerza a través de espaciadores
flexibles.
II.1 Microscopía de Fuerza Atómica
19
II.1.1 El Microscopio de Fuerza Atómica
El Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) fue desarrollado en 1986 por Binnig,
Quate y Gerber1 para vencer una limitación importante de su predecesor, el Microscopio
de efecto túnel (STM). Mientras el STM requiere que las muestras sean conductoras, el
AFM abrió las puertas al estudio de muestras no conductoras y en especial de muestras
biológicas. Debido a su capacidad de permitir la observación y manipulación de
biosuperficies en condiciones fisiológicas, el Microscopio de Fuerza Atómica ha
revolucionado la forma de investigar estructuras biológicas a nivel de moléculas
individuales2. Además de proporcionar imágenes tridimensionales con una resolución
sin precedentes y con una preparación de muestras mínima3, la espectroscopía de fuerza
por AFM permite la medición de las fuerzas del orden de los piconewtons asociadas a
moléculas individuales4, proporcionando información fundamental en el entendimiento
de las bases moleculares de fenómenos biológicos y propiedades como el
reconocimiento molecular5, el plegado y desplegado de proteínas6, la mecánica del
ADN7 y la adhesión celular8.
Un microscopio de fuerza atómica, como todos los microscopios de barrido por
sondas, es bastante diferente de los microscopios convencionales ya que no forma una
imagen enfocando la luz o los electrones sobre una superficie, como un microscopio
óptico o un microscopio electrónico. El principio de operación del AFM se basa en
hacer barrer una punta extremadamente filosa sobre (en contacto o a una distancia muy
próxima) la muestra que se quiere estudiar. Las dimensiones usuales de esta punta son
de algunos micrones de alto y menos de 10 nm de diámetro, y su ubicación en el
extremo libre de un fleje o cantilever permite que pueda detectarse la deflexión del
mismo durante el barrido para obtener una imagen de la topografía de la muestra
(Figura II.1 A). El microscopio consta básicamente de tres partes: base, barredor o
escáner y cabeza (Figura II.1 B). El escáner es un piezoeléctrico tubular que permite
mover la muestra colocada sobre él en las tres direcciones. La cabeza posee el sistema
de detección óptico compuesto por un diodo láser (Figura II.1 B 1), un espejo (Figura
II.1 B 4) y un fotodetector (Figura II.1 B 5). Dentro de la cabeza se coloca la pieza que
sirve como soporte para el sensor de fuerza (Figura II.1 B 3). La parte posterior de la
punta es iluminada con el láser y el reflejo del mismo en el detector de cuatro
cuadrantes permite medir la deflexión (vertical o lateral) del extremo libre del
II.1 Microscopía de Fuerza Atómica
20
cantilever. Un lazo de realimentación permite ajustar durante el barrido la distancia
punta-muestra de manera de evitar el riesgo de dañar la punta.
cabeza
escáner
base
A B
cabeza
escáner
base
A B
Figura II.1 Microscopio de Fuerza Atómica. A Imagen del AFM utilizado en este trabajo, en el cual se
distinguen sus partes principales. B Esquema de la cabeza del AFM, donde se aprecian los tornillos
utilizados para la alineación del láser y del detector. Imagen modificada del manual de la empresa
Bruker.
Mediante el barrido de la punta sobre la muestra es posible entonces adquirir una
imagen que representa la topografía de la misma, es decir un mapa de altura (z) en
función de la posición lateral (en las dos direcciones, x e y), que resulta en una imagen
tridimensional. Mientras que la resolución en las direcciones laterales está dada por el
tamaño y la forma de la punta (de radios de curvatura del orden de los nanómetros), la
resolución en z puede ser mucho menor ya que no depende de la punta sino que está
relacionada con la gran sensibilidad de detección del método óptico y limitada
solamente por el ruido en la posición del fleje causado por fluctuaciones térmicas.
Dependiendo de la estabilidad en las condiciones de medición, con el AFM se pueden
ver los átomos de una estructura cristalina9 o por ejemplo obtener imágenes de rutina de
moléculas individuales de ADN (de espesores de alrededor de 2 nm) en ambiente
líquido.
Se han desarrollado distintos modos de operación del AFM relativos a la forma
en la que la punta toma contacto con la muestra y la señal utilizada como lazo de
II.1 Microscopía de Fuerza Atómica
21
realimentación. Existen dos modos básicos para la obtención de imágenes de topografía,
según se mida la deflexión estática o la oscilación dinámica del cantilever:
• Modo Contacto
El modo contacto (del inglés, Contact Mode o CM) del AFM opera barriendo la punta
en las direcciones x e y en contacto permanente con la muestra. Durante la medición el
ciclo de retroalimentación mantiene constante la deflexión (la resta entre los cuadrantes
superior e inferior del detector) del cantilever ajustando la posición vertical de la
muestra con el escáner. El parámetro que regula el valor de la deflexión es el Deflection
Setpoint, que determina el valor de deflexión al que se debe mantener el cantilever. El
aumento de este parámetro hace que, por la ley de Hooke (F = - K.d si consideramos al
cantilever como un fleje elástico de constante K, F la fuerza y d la deflexión), se realice
sobre la muestra una fuerza mayor. La imagen topográfica de la muestra se obtiene
graficando este desplazamiento vertical del escáner para cada punto (x, y). Se generan
también imágenes de la deflexión para cada punto, que no proporcionan información
cuantitativa pero suelen presentar mayor contraste en los bordes que posea la muestra
(se suele denominar también señal error, dado que presenta mayor contraste en los
bordes de las estructuras a medir, en donde el lazo de retroalimentación no llega a
corregir la deflexión constante). El tercer tipo de imágenes que se pueden obtener en
este modo es el de la fricción o deflexión lateral, señal obtenida de la resta entre los
cuadrantes izquierdo y derecho del detector. Esta señal proporciona información relativa
a la interacción entre la punta y la muestra.
Utilizando el modo contacto es posible obtener imágenes con muy alta resolución, éste
es de hecho el modo utilizado para tomar imágenes con resolución atómica. Es también
el modo más rápido. Como desventaja, la punta sensora y la muestra están
constantemente en contacto y ejerciendo fuerza entre sí (en la dirección normal a la
muestra y en el eje del barrido) lo que puede ocasionar daños tanto en la muestra como
en la punta.
• Modo Contacto Intermitente
En el modo de contacto intermitente u oscilante (del inglés, Tapping Mode® o TM) el
sensor de fuerza barre la muestra oscilando a una frecuencia cercana a su frecuencia de
resonancia. Cuando se aproxima o se aleja de la superficie de la muestra, la amplitud de
la oscilación cambia debido a la interacción entre la punta propiamente dicha y el
II.1 Microscopía de Fuerza Atómica
22
campo de fuerza de la muestra. En este caso el escáner ajusta la altura z a través del lazo
de realimentación para mantener una amplitud constante, lo que hace que la sonda
permanezca a una distancia fija de la muestra. El parámetro que determina el valor de
amplitud en el que debe mantenerse la oscilación es el Amplitude Setpoint. Cuanto
mayor es este parámetro es mayor la amplitud y por lo tanto mayor la distancia punta-
muestra. Asociadas a este modo se pueden obtener también las señales de la amplitud
o de la fase de la oscilación para cada punto del barrido, generando cada una de ellas
imágenes con diferentes contrastes que suman información al estudio.
El modo intermitente es en general el utilizado para estudiar muestras biológicas, ya que
al no estar en contacto permanente con la muestra se reduce el riesgo de dañarla. Como
desventaja, este modo es menos estable por lo que la resolución alcanzada suele ser
menor.
En la Figura II.2 se esquematizan los dos modos de operación utilizados en esta
Tesis.
A BA B
Figura II.2. Esquema de funcionamiento de los dos modos de operación del AFM. A Modo contacto
y B modo contacto intermitente. Tomados del manual de la empresa Bruker.
En este trabajo se utilizó un AFM de la firma Digital Instruments (Veeco, y
actualmente Bruker, Santa Barbara, EEUU), modelo Multimode (Figura II.1A), con
controlador Nanoscope IIIa, Quadrex y un módulo de acceso a señales (SAM) que
permite monitorear externamente cualquiera de las señales medidas con el microscopio.
Se utilizó un escáner que permite barrer un área de 120 µm x 120 µm, y un movimiento
en el eje vertical de hasta 4 µm.
II.1 Microscopía de Fuerza Atómica
23
Durante la primera etapa de mi tesis doctoral, me familiaricé con el Microscopio
de Fuerza Atómica obteniendo imágenes de muestras diversas, en los diferentes modos
de operación. En la Figura II.3 presento algunas de las imágenes obtenidas.
A B C
D E F
A B C
D E F
Figura II.3 Imágenes AFM. A Grilla de calibración NanoGauge NGR-2 (NanoDevices, Santa Barbara,
EEUU), TM en aire (topografía, escala 0-30 nm). Se superpuso un perfil de la imagen en donde puede
apreciarse la altura y el período de la grilla: 20 nm y 10 µm, respectivamente. B Grilla de calibración
TGT01(NT-MDT, Moscú, Rusia), CM en aire (deflexión, escala 0-5 nm). Permite analizar la forma de la
punta propiamente dicha. C Sustrato AF45 biotinilado (oro "Robax", Berliner Glas KG, Berlín,
Alemania), CM en aire (altura, escala 0-30nm). D Solución de la proteína estreptavidina 20 nM adsorbida
sobre mica, TM en solución de buffer Hepes (altura, escala 0-5 nm) E-F Moléculas de polisacáridos de
Rhizobium wild type adsorbidas sobre mica, TM en aire (topografía, E: escala 0-5 nm, F: escala 0-5 nm,
dilución 1/100). Todas las escalas xy en µm.
La microscopía de fuerza atómica permite obtener imágenes que muestran
detalles topográficos que por microscopía óptica no es posible observar, proporcionando
fácilmente imágenes de moléculas aisladas. Mientras que la resolución en xy es <10 nm
para AFM, la misma es de 300 nm en la microscopía confocal de barrido con láser.
Cuando consideramos el eje z las diferencias son aún más importantes: mientras que en
AFM esta resolución es de 0.1 nm, la microscopía confocal sólo nos permite resolver
800 nm.
II.1 Microscopía de Fuerza Atómica
24
La obtención de imágenes de células vivas mediante AFM es, sin embargo, un
gran desafío, ya que las células suelen tener una altura mínima del orden de la decena de
µm y, dependiendo del escáner utilizado, en general el rango de movimiento en el eje
vertical es del mismo orden. Además, la superficie de las células es elástica y sufre la
indentación producida por la fuerza que la punta sensora del AFM le imprime. De
hecho, suele usarse esta microscopía para mapear el módulo de elasticidad de las
células. Sin embargo, en general se obtienen muy buenas imágenes de células fijadas
químicamente. En la Figura II.4 se pueden ver imágenes de células de la línea HeLa
(células de tumor de cuello uterino humano) fijadas con paraformaldehído (PFA). Las
imágenes fueron adquiridas en modo de contacto intermitente, en solución.
Figura II.4 Visualización de células HeLa por AFM. Células HeLa fijadas en 3.7 % PFA visualizadas
por AFM. La visualización se realizó en buffer fosfato salino (PBS) en modo tapping, utilizando un
sensor de fuerza NP Veeco (nitruro de silicio, constante elástica fue k = 0.58 N/m, radio nominal de la
punta de 20 nm).
II.1.2 Sensores de fuerza
El conjunto fleje-punta (del inglés, cantilever-tip) suele denominarse sensor de
fuerza. Existe una gran diversidad de tipos de sensores de fuerza, y dependiendo de la
aplicación se elegirá el sensor más adecuado (Tabla II.1). Alguna de las
consideraciones a tener en cuenta en la elección del sensor son las siguientes:
II.1 Microscopía de Fuerza Atómica
25
Modelo RTESP NP/SNL biolevers OTR4-PG
Material
Si
Si4N3
Si4N3
Si4N3
Constante
elástica (N/m)
40
(0.58; 0.12; 0.32; 0.06)
(0.03; 0.006)
(0.08; 0.02)
Frecuencia de
resonancia (kHz) 300 (57; 20; 56; 18) (37; 13) (34; 11)
Radio de
curvatura (nm)
8
20 / 2
30
40
Longitud (µm) 125 (120; 205; 120; 205) (60; 100) (100; 200)
Forma
Rectangular
Triangular
Rectangular
Triangular
Cobertura No tiene Oro reflectivo Oro reflectivo y en la
punta
Oro reflectivo y en la
punta
Modo de
operación TM en aire
CM aire. CM y TM
solución. FS.
Especialmente
diseñados para FS.
CM aire. CM y TM
solución. FS.
Tabla II.1 Características de diferentes tipos de sensores de fuerza utilizados en este trabajo (FS =
espectroscopía de fuerza). Los datos fueron tomados de las especificaciones de los distintos fabricantes.
• Punta propiamente dicha: la característica más importante de la punta es el radio
de curvatura, ya que define la resolución en el eje lateral; puntas más filosas tendrán
mejor resolución lateral. La geometría de la punta también cambia de un sensor a
otro, pudiendo ser piramidal, parabólica, cilíndrica entre otras. También conviene
considerar el ángulo de apertura de la punta.
• Cantilever: la característica más importante del cantilever es su constante elástica
dado que el valor de la misma determina la sensibilidad del sensor de fuerza en
términos de fuerza; constantes más pequeñas resultan en una mayor sensibilidad en
fuerza. La constante elástica está determinada por la geometría del cantilever -que
puede ser rectangular o triangular-, por el material que lo compone -usualmente
silicio o nitruro de silicio-, y las dimensiones. También son importante la frecuencia
de resonancia del cantilever y el amortiguamiento, principalmente cuando se lo utiliza
en el modo de contacto intermitente.
Entonces para la elección del sensor de fuerza adecuado para cada muestra se
debe tener en cuenta las especificaciones referidas al cantilever y a la punta
propiamente dicha. En general, los radios de curvatura son del orden de la decena de nm
II.1 Microscopía de Fuerza Atómica
26
pero existen puntas comerciales de radio de curvatura menor a 2 nm. El cantilever se
selecciona según la aplicación, el modo de operación o la resolución en fuerza que se
desee obtener. Para el modo de contacto intermitente en aire se usan cantilevers de
silicio, rectangulares y de constante elástica del orden de las decenas de N/m. Para
modo contacto, trabajando en aire o en solución, y para el modo de contacto
intermitente en solución se necesitan cantilevers más blandos de manera de evitar el
posible daño de las muestras. Los cantilevers de nitruro de silicio son los más indicados
en este caso ya que presentan constantes elásticas de entre 0.02 y 0.5 N/m, son en
general triangulares y presentan una baja resistencia mecánica a la deflexión vertical y
una alta resistencia a la torsión lateral.
Para la medición de fuerzas se utiliza el modo contacto y, dado que la fuerza está
dada por la deflexión multiplicada por la constante elástica del cantilever (ec. II.1), las
constantes más pequeñas permiten que la deflexión sea detectable para medir fuerzas
del orden de los pN.
En la Figura II.5 se presentan imágenes de microscopía electrónica de barrido
(SEM) de diferentes tipos de sensores de fuerza donde se pueden distinguir claramente
las puntas y los cantilevers.
A B
C D
Figura II.5 Sensores de fuerza. (A-B) Imágenes SEM correspondientes a la punta propiamente dicha
(A) y al cantilever rectangular (B) de silicio modelo RTESP. (C-D) Imágenes correspondientes a la punta
piramidal (C) y un cantilever triangular (D) de nitruro de silicio de sensores OTR4-10. Archivo CMA.
II.1 Microscopía de Fuerza Atómica
27
En este trabajo se utilizaron sensores de fuerza de la empresa Bruker, modelo
RTESP para las imágenes tomadas en modo de contacto intermitente y el modelo NP o
SNL para las imágenes en modo contacto. Para las mediciones de fuerzas, se utilizaron
los sensores NP o SNL, y en algunos casos los OTR4-PG o los biolevers, cuya punta
está recubierta por una capa de oro lo que los hace ideales para su funcionalización a
través de moléculas de tioles. En cada experimento de este trabajo de Tesis se detallará
el modelo de sensor utilizado.
II.1.3 Espectroscopía de fuerza
El Microscopio de Fuerza Atómica permite medir con mucha precisión la
deflexión del fleje o cantilever del que pende la punta sensora. Si se considera que el
cantilever cumple la ley de Hook, esa deflexión d puede traducirse, a través de la
constante elástica K del cantilever, en la fuerza de interacción F entre la punta y la
muestra (ec. II.1).
KdF −= II.1
Una de las alternativas que ofrece el AFM es por lo tanto la técnica denominada
Espectroscopía de Fuerza (FS), que aborda el estudio de fuerzas de interacción entre
sistemas moleculares que puedan estar presentes en la punta y/o la muestra del AFM.
Dada la gran sensibilidad con la que puede medirse la deflexión y los rangos de
constantes elásticas de los cantilevers comerciales (0.01-50 N/m), la FS permite medir
fuerzas en un amplio rango que va de los pN a los µN.
Para medir la interacción entre la punta del sensor de fuerza y la superficie de la
muestra se registra lo que se denomina una curva de fuerza, una curva de la fuerza
medida en función de la distancia entre la punta y la muestra. Cuando se adquiere una
curva de fuerza el movimiento lateral (x e y) del escáner se detiene permitiendo
solamente desplazamientos en el eje vertical (z). De esta forma, el sensor de fuerza
realiza un ciclo que comienza con el sensor de fuerza alejado de la muestra, luego se lo
acerca a la muestra hasta producir el contacto y finalmente se lo retira hacia la posición
inicial. En la Figura II.6, se presentan las distintas etapas en la curva de fuerza para el
II.1 Microscopía de Fuerza Atómica
28
sistema más simple en el que la punta y la muestra presentan solamente adhesión10. En
A el sensor de fuerza se acerca a la muestra; en B, toma contacto; en C, ejerce presión
sobre la misma, y en D-E, finalmente se aleja. Se mide la interacción entre la punta y la
muestra como la diferencia entre el valor de fuerza antes de tocar la muestra y el valor
en el que se desprende la punta de la muestra en el ciclo de retracción.
Figura II.6. Esquema de una curva de fuerza. Curva fuerza–distancia que describe un ciclo de
aproximación – retracción de la punta del sensor de fuerza a la muestra. La punta se aproxima a la
superficie (A), esta atracción inicial entre la punta y la superficie está dada por fuerzas de tipo van der
Waals que conducen al contacto (B). La punta ejerce presión sobre la superficie y ésto conduce a la
indentación de la muestra y a la deflexión del cantilever (C). Luego, la punta se aleja de la superficie (D-
E). Se mide la adhesión entre la punta y la muestra como la diferencia entre el valor de fuerza antes de
tocar la muestra y el valor en el que se desprende la punta de la muestra (F) en el ciclo de retracción.
Adaptado de la referencia 3.
La gran utilidad de esta técnica es que permite medir directamente la fuerza
entre moléculas que están sobre la punta y sobre la superficie de la muestra. Debido a
que el sensor de fuerzas puede ser muy flexible y la sensibilidad en la medición de la
deflexión mediante instrumentos ópticos es muy alta, estudiar la interacción entre
moléculas individuales es posible. La dificultad para estudiar distintos tipos de
interacciones a nivel molecular radica en la química que se debe hacer para lograr que
en el ápice de la punta “cuelguen” moléculas individuales para interactuar con la
muestra. En el caso del estudio de fuerzas de desplegado de proteínas es relativamente
II.1 Microscopía de Fuerza Atómica
29
sencillo dado que las moléculas se adsorben al material de la punta con una fuerza de
interacción mayor a la necesaria para desenrollar los dominios. La posibilidad de tener
en la punta una única moléculas dependerá entonces del radio de curvatura de la punta y
la concentración de la muestra. No es el caso de la medición de interacciones ligando-
receptor individuales, para la que la modificación química de las puntas que resulta en
moléculas únicas es un área de investigación en constante evolución11.
El AFM se utiliza además en la modalidad de diversas espectroscopías de fuerza
(Figura II.7): espectroscopía de fuerza de moléculas individuales (SMFS, por sus siglas
en inglés, single molecule force spectroscopy), microscopía de fuerzas químicas (CFM,
por sus siglas en inglés, chemical force microscopy), mapeo de reconocimiento
molecular (MRM, por sus siglas en inglés, molecular recognition mapping) y
espectroscopía de fuerza de células individuales (SCFS, por sus siglas en inglés, single
cell force spectroscopy).
Figura II.7 El AFM utilizado en la modalidad de espectroscopía de fuerza. A. La punta del sensor de
fuerza se utiliza para detectar interacciones en la superficie celular con resolución de moléculas
individuales. Ejemplos que muestran: la punta sensora funcionalizada con un ligando para detectar la
interacción con su receptor (izquierda), una punta con una proteína de adhesión celular para medir
interacciones con otras moléculas de adhesión (centro), y una punta recubierta con grupos químicos para
detectar las interacciones de interés (derecha). B. Funcionalización de las puntas del AFM o del cantilever
para detectar interacciones biológicas, celulares, virales o químicas específicas. Modificado de
referencia12.
La fuerza de adhesión o despegado característica observada durante el
despegado de la punta del AFM es el parámetro clave que brinda información sobre la
II.1 Microscopía de Fuerza Atómica
30
interacción ligando-receptor (en SMFS), sobre la distribución espacial de la interacción
química (en CFM), sobre la distribución espacial de receptores individuales (MRM) y
sobre las fuerzas que gobiernan las interacciones célula-célula y célula-sustrato (en
SCFS).
II.1.4 Calibración de la constante elástica de los sensores de fuerza. Desarrollo de
herramientas para su implementación en el Centro de Microscopías Avanzadas
(CMA)
El AFM permite entonces medir la deflexión del cantilever con mucha
precisión, y esta deflexión puede traducirse en un valor de fuerza igual al valor de
deflexión multiplicado por la constante elástica del fleje. Debido a que en el proceso de
fabricación es difícil controlar el espesor de cada cantilever, el valor nominal de la
constante elástica de los cantilevers informado por los fabricantes tiene una incerteza
del 50%. Esta gran incerteza se traduce en la imposibilidad de medir fuerzas con la
precisión pretendida en experimentos de fuerzas a nivel molecular. Por esta razón es
necesario calibrar los sensores de fuerza individualmente, determinando su constante
elástica con una incerteza que se independice de la variabilidad introducida por su
fabricación.
La técnica más utilizada para determinar experimentalmente la constante elástica
de los sensores de fuerza es la conocida como método térmico (thermal tune method) 13.
Este método consiste en considerar al cantilever como un oscilador armónico y
relacionar, a través del Teorema de Equipartición, la energía del oscilador con la energía
térmica, pudiendo calcularse la constante elástica k a partir de la temperatura (T), la
constante de Boltzmann (kB) y el valor medio del cuadrado de la deflexión 2x (ec.
II.2):
2x
Tkk B= II.2
II.1 Microscopía de Fuerza Atómica
31
2x resulta igual al área debajo de la Densidad de Potencia Espectral (PSD)
correspondiente a la serie temporal de la señal de deflexión de la oscilación libre del
cantilever (a partir de la igualdad de Parseval). Puede medirse registrando la señal de
deflexión en función del tiempo para un sensor que oscila libremente debido a la energía
térmica (sin estar en contacto con la muestra). La PSD presenta una forma Lorenziana.
Como parte de este trabajo de Tesis, se implementó el método de calibración por
ruido térmico en el Centro de Microscopías Avanzadas. El proceso para la calibración
involucra la medición de la señal de deflexión por ruido térmico y su análisis espectral a
través de la PSD. Dado que la frecuencia de muestreo del controlador Nanoscope IIIa
del AFM utilizado es de un máximo de 60 kHz y las frecuencias de resonancia de los
sensores llegan a los 300 kHz, la señal de deflexión se debe registrar de forma externa.
Esto se realizó a través de un módulo de acceso a señales (Signal Access Module de
Bruker) que permite tomar la señal de deflexión cruda y registrarla en un osciloscopio
digital (Tektronix TDS840). Las series temporales de deflexión se adquirieron mediante
una interfase en Labview. Para facilitar la medición se toma también con el osciloscopio
y a través de la misma interfase curva de fuerza que determina la calibración de la
sensibilidad para traducir el voltaje medido en valores de deflexión del cantilever (en
nm).
Se desarrolló además una interfase en Matlab para obtener la constante elástica
de cada sensor a partir del análisis de los datos adquiridos, de manera que la calibración
de los sensores de fuerza está disponible para cualquier usuario del laboratorio. En la
Figura II.8 se presenta la pantalla de la interfase, denominada calibración_GUI,
mediante la que se calibran las constantes elásticas de los cantilevers a partir de los
datos de curvas de fuerza y ruido térmico adquiridos con el osciloscopio. En primer
lugar se obtiene la sensibilidad en nm/V mediante el ajuste de una curva de fuerza
realizada sobre una superficie rígida (típicamente sobre mica). De los datos de ruido
térmico se calcula la PSD y se ajusta con una función Lorenziana de manera de calcular
2x como el área debajo de la curva ajustada para minimizar el error. El valor de la
constante de fuerza se calcula entonces a partir de estos datos y el valor de temperatura
ambiente, según una ecuación análoga a II.2 con un factor de corrección según L´evy y
Maaloum14, que considera entre otras cosas que el cantilever no es un oscilador ideal y
que el análisis tiene en cuenta sólo el primer modo de oscilación.
II.1 Microscopía de Fuerza Atómica
32
Figura II.8 Interfase para la calibración de sensores de fuerza. Panel Sensibilidad: permite leer los
datos de una curva de fuerza y calibrar la sensibilidad del detector, i.e. traducir voltaje de la señal a nm de
deflexión del cantilever. Panel PSD: a partir de los datos de ruido térmico calcula la PSD y la ajusta por
una Lorenziana. Mediante la temperatura y el valor medio del cuadrado de la deflexión (área debajo de la
Lorenziana) calcula el valor de la constante elástica del sensor de fuerza.
La calibración de los sensores de fuerza fue entonces implementada con éxito en
el Centro de Microscopías Avanzadas y puede realizarse para cualquier tipo de
cantilever. La incerteza en las constantes elásticas obtenidas por este método de
calibración es típicamente del 10 %.
II.1.5 Funcionalización de los sensores de fuerza y espectroscopía de fuerza a
través de espaciadores flexibles.
Medir interacciones moleculares con el AFM requiere la funcionalización de las
puntas con las moléculas o grupos químicos específicos. La funcionalización de las
puntas para la MRM es un área que continúa en desarrollo, pero típicamente hay dos
estrategias de modificación que son las más establecidas. La primera consiste en
modificar puntas con un recubrimiento de oro uniéndoles covalentemente una
monocapa autoensamblada (SAM) de tioles (moléculas con el grupo terminal SH,
II.1 Microscopía de Fuerza Atómica
33
Figura II.9 A). Esta estrategia ha sido la más utilizada en los comienzos de la técnica y
es todavía vigente dada su simplicidad.
La estrategia más utilizada en la actualidad fue desarrollada por el grupo del Dr.
Hinterdorfer, uno de los pioneros en la técnica, y consiste en modificar las puntas de
nitruro de silicio con grupos amino por silanización, y utilizar para unir el ligando o la
molécula de interés una molécula que funciona como espaciador flexible (Figura II.9
B). Las superficies amino-modificadas reaccionan con un espaciador o crosslinker que
le da a la biomolécula de interés más libertad de movimiento para interactuar con su
receptor y previene su desnaturalización. Típicamente, se utilizan como espaciadores
moléculas de polietilenglicol (PEG), que tienen dos terminales funcionales diferentes:
uno que se une al grupo NHS de la punta amino-funcionalizada y el otro que depende de
cómo vaya a unirse al ligando de interés.
Figura II.9. Funcionalización de sensores de fuerza. A Esquema de funcionalización de sensores de
fuerza recubiertos de oro a través de tioles. B Esquema de funcionalización de sensores de fuerza por
silanización y a través de espaciadores flexibles.
En el caso particular en que la funcionalización de las puntas se realiza a través
de una molécula espaciadora como el PEG, es importante tener en cuenta que, en las
curvas de fuerza, durante la retracción de la punta, y antes de que se produzca la ruptura
del complejo, se producirá un estiramiento de la molécula espaciadora. En la Figura
II.10 se muestra una curva de fuerza típica de este tipo para un sistema antígeno-
anticuerpo, en la que se observa que durante la mayoría del tiempo de acercamiento
(puntos 1 al 5) la deflexión del cantilever es nula dado que las moléculas no interactúan.
Una vez en contacto (4) el cantilever se deflecta hacia arriba (4 a 5) debido a una fuerza
A B
II.1 Microscopía de Fuerza Atómica
34
repulsiva que aumenta linealmente a medida que la punta es empujada por la superficie.
Si en el ciclo no se produce la interacción del ligando con el receptor, la retracción de la
punta desde la superficie da lugar a una relajación gradual del cantilever a su posición
de equilibrio (1) generando una curva de retracción muy similar a la de acercamiento.
Por otra parte, si se produce la interacción, el cantilever se deflectará hacia abajo a
medida que se separa de la superficie (4 a 7). Dado que el estiramiento se produce a
través de la molécula espaciadora, la forma de la curva fuerza-distancia es no lineal, y
corresponde al estiramiento de la molécula precedente a la ruptura del complejo
ligando-receptor que se evidencia por un salto pronunciado (7).
Figura II.10. Curva de reconocimiento a través de un espaciador flexible. Un ciclo de acercamiento y
retracción para un par antígeno-anticuerpo en PBS (tomado de 15 ). La unión del anticuerpo inmovilizado
en la punta al antígeno en la superficie se da durante el acercamiento (puntos 1 al 5) resulta en una curva
de retracción no lineal (puntos 6 al 7) que refleja el estiramiento del crosslinker. La fuerza aumenta hasta
que se produce la ruptura a una fuerza de 268 pN (puntos 7 al 2).
La forma exacta de la curva de retracción antes de la ruptura depende de las
propiedades elásticas del espaciador usado para la funcionalización, pero refleja un
aumento de la constante elástica del crosslinker durante su extensión.
II.1 Microscopía de Fuerza Atómica
35
II.1.6 Referencias 1 Binnig G., Quate C. F., Gerber C., Phys Rev Lett 56: 930 (1986). 2 Jena P. B. and Hörber J. K., Atomic Force Microscopy in Cell Biology, Methods in Cell
Biology Vol. 68 , Academic Press, San Diego (2002). 3 Engel A. and Müller D. J., Nat. Struct. Biol. 7: 715 (2000). 4 Clausen-Schaumann H., Seitz M., Krautbauer R. and Gaub H.E., Curr. Opin. Chem. Biol. 4:
524 (2000). Fisher T.E., Marzalek P. E. and Fernandez J. M., Nat. Struct. Biol. 7: 719 (2000). 5 Hinterdorfer P. and Dufrêne Y. F., Nat. Meth. 3: 347 (2006). 6 Rief M., Gautel M., Oesterhelt F., Fernandez J. M. and Gaub H. E., Science 276: 1109 (1997). 7 Rivetti C., Walker C. and Bustamante C., J. Mol. Biol. 280: 41 (1998). 8 Helenius J., Heisenberg C. P., Gaub H. E. and Muller D. J., J Cell Sci 121:1785 (2008). 9 www.bruker-axs.com/atomicforcemicroscopy.html
10 Shahin V., Ludwig Y., Schafer C., Nikova D., and Oberleithner H., J Cell Sci 118: 2881
(2005). 11 Ebner A., Wildling L., Zhu R., Rankl C., Haselgrübler T., Hinterdorfer P. and Gruber H. J.,
Top Curr Chem 285: 29 (2008). 12 Müller D. J, Krieg M., Alsteens D., Dufrêne Y. F., Curr Op in Biotechnol 20: 4 (2009). 13 Hutter J. L. and Bechhoefer J., Rev. Sci. Instrum. 64:1868 (1993). 14 L´evy R. and Maaloum M., Nanotechnology 13: 33 (2002). 15 Hinterdorfer P. en Springer Handbook of Nanotechnology, Springer, p. 476 (2010).
II.2
Microscopía de Fluorescencia
En este capítulo introduzco la Microscopía de Fluorescencia, en particular el principio
de operación del Microscopio Confocal de Fluorescencia utilizado en este trabajo de
Tesis. Discutiré los controles a realizar en los experimentos y sentaré las bases teóricas
y la puesta a punto de las técnicas asociadas a esta microscopía que se utilizaron en esta
Tesis: FRET (Transferencia de energía de resonancia de Förster), FRAP (Recuperación
de la fluorescencia después del fotoblanqueo), y N&B (Número y Brillo).
II.2 Microscopía de Fluorescencia
39
II.2.1 El Microscopio de fluorescencia
La fluorescencia refiere al proceso mediante el cual un espécimen absorbe y
subsecuentemente emite luz, en un intervalo de tiempo, entre la absorción de la luz de
excitación y la emisión de la luz fluorescente, que es usualmente de pocos
nanosegundos. La Microscopía de Fluorescencia es la herramienta que permite estudiar
materiales fluorescentes, ya sea de manera natural (materiales autofluorescentes) o
tratados con sondas fluorescentes.
El Microscopio de Fluorescencia fue desarrollado a principios del siglo veinte
por August Köhler, Carl Reichert, y Heinrich Lehmann, entre otros. Sin embargo no fue
sino hasta décadas después que se descubrió su potencial, siendo hoy una técnica
indispensable en biología celular. La principal diferencia del Microscopio de
Fluorescencia con un microscopio óptico convencional es que permite irradiar al
espécimen con la luz de excitación y separar la luz fluorescente emitida, que es mucho
más débil, de la luz de excitación. Así, sólo la luz emitida por el espécimen es detectada
por el ojo o el detector (usualmente una cámara digital). Como resultado, las partes
fluorescentes de la muestra brillan contra un fondo (background) oscuro con suficiente
contraste como para permitir la detección. La Figura II.11 presenta un esquema de lo
que ocurre cuando un espécimen fluorescente es observado a través de un Microscopio
de Fluorescencia.
Luz proveniente de la fuente
Filtro de excitación
Luz de excitación
Muestra fluorescente
Filtro de emisión
Luz proveniente de la fuente
Filtro de excitación
Luz de excitación
Muestra fluorescente
Filtro de emisión
Figura II.11 Representación de una muestra en el Microscopio de Fluorescencia. Por medio de un
filtro de excitación se seleccionan las longitudes de onda específicas de la luz de una fuente UV-visible.
Un filtro de emisión permite el paso de la luz fluorescente emitida bloqueando la luz UV reflejada. La
fluorescencia se irradia en todas las direcciones independientemente de la dirección de la luz de
excitación. Tomado de1 .
II.2 Microscopía de Fluorescencia
40
La microscopía de fluorescencia es una herramienta de inestimable valor ya que
permite alcanzar altos niveles de sensibilidad y resolución, permitiendo una apreciación
diferente de la información que se puede obtener de los especímenes y que
generalmente pasa desapercibida2. El uso de fluoróforos ha permitido identificar células,
componentes celulares sub-micrométricos y otras entidades con un alto grado de
especificidad. Más aún, esta microscopía permite la detección del material fluorescente
con una altísima sensibilidad: puede ser detectada una cantidad muy pequeña de
moléculas fluorescentes (unas 50 moléculas por µm3). En una misma muestra,
diferentes sondas fluorescentes permiten apreciar distintos tipos de moléculas gracias a
las técnicas de marcado específico.
II.2.2 Microscopía confocal de barrido láser
La microscopía confocal de barrido láser, es una técnica de observación basada
en fluorescencia que presenta numerosas ventajas respecto de la microscopía de
fluorescencia convencional o “widefield”. Entre ellas, la habilidad de controlar la
profundidad de campo, la eliminación o reducción de la luz proveniente de regiones
fuera del plano focal (que en general da lugar a la degradación de las imágenes) lo que
proporciona imágenes de mayor nitidez y contraste y por sobre todo la posibilidad de
adquirir “secciones ópticas” de la muestra permitiendo su estudio tridimensional.
Aunque el principio de la microscopía confocal fue concebido y patentado hace
varios años (Minsk, 1957) y los primeros microscopios basados en esta técnica fueron
descritos por Petran et al. en 1968, su gran aceptación y desarrollo no ha tenido lugar
hasta hace unos años con el desarrollo del láser3. Esta microscopía ha logrado una gran
popularidad en el presente gracias a la facilidad con la que pueden obtenerse con ella
imágenes de una muy alta calidad de especímenes preparados para microscopía de
fluorescencia convencional, y al creciente número de aplicaciones en biología celular
que se basan en el estudio de células y tejidos tanto fijados como in vivo.
La microscopía confocal emplea un láser enfocado que ilumina un punto o
región de la muestra a la vez. La señal emitida por la región iluminada vuelve por el
mismo camino óptico, pasa a través de un espejo dicroico y es enfocada en un detector
(en general un fotomultiplicador –PMT- o fotodiodo de avalancha). Un pequeño
II.2 Microscopía de Fluorescencia
41
diafragma o “pinhole” es colocado delante del detector para eliminar las señales
procedentes de la zona fuera de foco. La luz recolectada de la muestra, que proviene del
plano focal del objetivo, es reenfocada y transmitida por el pinhole sin ninguna pérdida.
En cambio, la luz dispersada o emitida por los puntos que se encuentran fuera del plano
de la imagen es atenuada o bloqueada completamente, como se muestra en la Figura
II.12. De esta manera, se obtiene una imagen de alto contraste y definición de un punto
en el plano focal, sin que haya una contribución significativa de las regiones que se
encuentran fuera de foco.
Muestra fluorescente
Planos focales
Láser de excitación
Pinhole de iluminación
Luz de excitación
Filtro de excitación
Objetivo
Filtro dicroico
Filtro de emisión
Pinhole de detección
Detector (PMT)
Luz fuera de foco
Luz proveniente del foco
Figura II.12 Principio de microscopía confocal. La luz procedente de los puntos fuera del plano focal
es eliminada por el diafragma o pinhole. Tomado de 2.
Para poder generar una imagen completa del plano, el microscopio realiza un
barrido o escaneo punto a punto en el plano X-Y moviendo la dirección del láser a los
distintos puntos de la muestra. En cada uno de esos puntos el PMT detecta la
fluorescencia emitida (filtrada por el pinhole) y le asigna una intensidad de píxel
(generalmente de 8 bits = valores de 0 a 255). Utilizando la intensidad de cada píxel se
reconstruye una imagen digital.
El microscopio confocal Olympus FV1000 espectral
En este trabajo de Tesis se utilizó un microscopio confocal espectral de la firma
Olympus, modelo FluoView 1000 (FV1000), el cual se encuentra instalado en el
II.2 Microscopía de Fluorescencia
42
laboratorio de Microscopías y Microespectroscopías (LMM) del departamento de Física
y forma parte de un consorcio del que el Centro de Microscopías Avanzadas es
integrante. El microscopio está compuesto por un módulo confocal espectral, unido a un
microscopio invertido IX81. Tiene tres láseres que proveen en total cinco longitudes de
onda de excitación: láser multilínea de Argón (457 nm, 488 nm, 515 nm), láser de
Helio-Neón (543 nm) y un láser diodo de estado sólido (635 nm). Una unidad
combinadora de láseres permite iluminar a la muestra simultáneamente con tres
longitudes de onda. Consta de tres canales de detección, dos de ellos espectrales. Los
detectores son fotomultiplicadores de alta sensibilidad con eficiencia cuántica ~100%
para 500 nm (Hamamatsu).
Figura II.13 Unidad confocal espectral del microscopio FV1000. En el esquema se aprecian los tres
canales de detección, dos de ellos espectrales.
El sistema de detección (Figura II.13), que se encuentra dentro de la unidad
confocal, tiene dos sistemas de red de difracción (para los dos primeros canales) con
una resolución de 2 nm que trabajan en todo el espectro visible 400 nm a 700 nm. El
tercer canal posee filtros de barrera. Un par de espejos galvanómetros permiten generar
imágenes por barrido, con una velocidad máxima de 16 cuadros por segundo, para una
imagen de 256 x 256 píxeles. La máxima resolución es de 4096 x 4096 píxeles y el
mínimo intervalo de detección es de 2 µs.
El microscopio cuenta con diversas lentes objetivos, además de una platina
motorizada en X-Y (Scientific Roper) y una cámara ambiental (Solent Scientific) para
mantener la temperatura constante que permite trabajar con células vivas. En la Figura
II.2 Microscopía de Fluorescencia
43
II.14 se presentan dos fotografías donde se pueden observar los diferentes componentes
del sistema.
Figura II.14 Microscopio confocal espectral Olympus FV1000. A Vista lateral, en la que se muestran
el módulo confocal espectral y la base del microscopio IX81. B Se señalan la cámara ambiental y la
platina motorizada, con su palanca de mando. Gentileza L. Sigaut.
Además de funcionar como microscopio confocal, utilizando láseres como
fuente de iluminación y permitiendo imágenes con alta resolución axial, el FV1000
funciona también como microscopio de fluorescencia convencional mediante una
lámpara de mercurio como fuente de iluminación. Esto permite visualizar las muestras
mediante un ocular, lo que hace mucho más fácil ubicar las células de interés en
preparados realizados por transfecciones transientes como la gran mayoría de los
estudiados en este trabajo de Tesis.
Cámara ambiental
Platina motorizada
A
B
II.2 Microscopía de Fluorescencia
44
II.2.3 Proteínas fluorescentes en el visible (VFPs)
El descubrimiento y desarrollo de proteínas naturalmente fluorescentes y sus
mutantes derivadas ha posibilitado en el último tiempo avanzar rápidamente en la
investigación de un gran número de procesos intracelulares en organismos vivos. Estas
sondas fluorescentes biológicas han permitido visualizar, localizar y seguir moléculas
individuales con una alta resolución espacial y temporal, en experimentos tanto en
equilibrio como dinámicos. Una variedad de organismos marinos han sido la fuente de
las más de 25 proteínas fluorescentes, que proveen una amplia paleta de sondas no
invasivas para el análisis de fluorescencia multiespectral. Entre las ventajas de las
proteínas fluorescentes por sobre las sondas orgánicas tradicionales o las nanopartículas
semiconductoras la más importante es que pueden ser expresadas por las células
utilizando vectores de expresión, lo que sumado a su baja o nula toxicidad
fotodinámica, y su compatibilidad con tejidos y organismos intactos las convierten en
las sondas más utilizadas para la visualización de células vivas.
- Proteína verde fluorescente (GFP)
El primer miembro de esta familia de proteínas fluorescentes descubierto fue la
proteína verde fluorescente (GFP), aislada de la medusa Aequorea victoria. Existen
diferentes tipos de GFPs en varios celenterados, como Aequorea, Obelia, Phialidium, y
Renilla4. Posteriormente a su descubrimiento y clonado, se demostró que la sola
expresión de GFP es suficiente para producir fluorescencia en distintos organismos5.
El cromóforo de GFP salvaje consiste en el tripéptido serina, tirosina y glicina
(Ser/Thr65-Tyr66-Gly67) y está protegido por una capa compuesta por once láminas β
(que forman un barril β) y una hélice α (Figura II.15 A). La maduración del cromóforo
requiere varios pasos autocatalíticos que involucran cambios conformacionales en la
secuencia, el ciclado y la deshidratación entre la serina y la glicina, y la oxidación de
tirosina4. El proceso de oxidación puede producir una molécula de peróxido de
hidrógeno, lo que explica por qué la sobre-expresión de GFP puede resultar dañina para
la célula6. Los extremos N y C terminales son flexibles7, mientras que el barril β es
rígido, protegiendo de esta manera el cromóforo de GFP4.
II.2 Microscopía de Fluorescencia
45
La fusión de la secuencia de GFP u otras VFPs a genes que codifican una
proteína de interés da lugar a proteínas quimera, análogas funcionales de las proteínas
de interés que no presentan efectos biológicos adversos. De hecho, las proteínas
fluorescentes pueden fusionarse a prácticamente cualquier proteína en células vivas
usando la tecnología de clonado por ADN recombinante, y la subsecuente construcción
de ADN para la proteína de fusión puede ser expresada en líneas celulares con
metodologías de cultivo tradicionales (Figura II.15B).
Figura II.15 Principio de la marcación con GFP. A Estructura de la proteína GFP. B Representación
esquemática de un gen recombinante conteniendo el ADN de una molécula de interés fusionado al gen
que codifica GFP. La expresión del gen recombinante en la célula permite observar la proteína
recombinante por fluorescencia, con longitudes de excitación y emisión propias de GFP (488 y 510 nm
respectivamente). Esquema tomado de 8.
- Proteínas fluorescentes derivadas de GFP
Los experimentos de mutagénesis con GFP han producido un gran número de
variantes de características de plegado y expresión mejoradas, eliminando además la
dimerización de la proteína salvaje y optimizando sus propiedades espectrales. Una de
las primeras fue la proteína verde fluorescente intensificada (EGFP), de menor
sensibilidad a la temperatura y mayor eficiencia de expresión. Estudios de mutación
adicionales han logrado obtener variantes de la GFP que exhiben una variedad de
características de emisión y absorción cubriendo prácticamente la totalidad del espectro
de luz visible4. Esto ha permitido utilizar este tipo de sondas para la observación
simultánea de dos o más proteínas fluorescentes en el mismo organismo.
Gen recombinante
Proteína de interés
transcripción traducción
Proteína recombinante
Proteína de interés
Gen recombinante
Proteína de interés
transcripción traducción
Proteína recombinante
Proteína de interés
A B
II.2 Microscopía de Fluorescencia
46
3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 00 .0
0 .2
0 .4
0 .6
0 .8
1 .0
Inte
nsid
ad n
orm
aliz
ada
λ (n m )
m T F P E G F P V e n u s m C h e rry
Figura II.16 Espectros de las proteínas fluorescentes utilizadas. Espectros de absorción (líneas
punteadas) y emisión (líneas llenas) de las proteínas fluorescentes utilizadas en este trabajo de Tesis:
mTFP (en cian), EGFP (en verde), Venus (en amarillo) y mCherry (en rojo). Datos tomados de
www.tsienlab.ucsd.edu.
En este trabajo de Tesis utilizamos vectores de fusión para las proteínas de las
adhesiones focales unidas a las VFPs: EGFP, mCherry, Venus (variante mejorada de la
proteína amarilla YFP) y Turquesa (mTFP). En la Figura II.16 se muestran los
espectros de absorción y emisión de las mismas.
II.2.4 Fotoblanqueo
El fotoblanqueo (en inglés photobleaching) ocurre cuando un fluoróforo pierde
de manera permanente su capacidad de emitir fluorescencia debido a un daño químico y
modificación covalente fotoinducidos. Estas modificaciones covalentes irreversibles
pueden producirse por la interacción con otra molécula a partir de la transición desde un
estado excitado de tipo singlete al estado excitado triplete. El número promedio de
ciclos de excitación y emisión de un fluoróforo particular antes de que se produzca su
fotoblanqueo depende de la estructura molecular y del ambiente local en el que se
encuentra el fluoróforo. Algunos fluoróforos se fotoblanquean rápidamente después de
emitir sólo algunos fotones, mientras que otros más robustos pueden realizar miles y
hasta millones de ciclos antes de fotoblanquearse.
Las consecuencias del fotoblanqueo se presentan en todos los tipos de
microscopías de fluorescencia, y resultan en una pérdida efectiva de los niveles de
II.2 Microscopía de Fluorescencia
47
emisión. Es muy importante tener en cuenta este fenómeno a la hora de diseñar los
experimentos y sobre todo ante la necesidad de cuantificar la intensidad para obtener
información biológica relevante. Suele denominarse fotoblanqueo por adquisición al
fotoblanqueo producido por el sólo hecho de tomar imágenes sucesivas en el tiempo.
El fenómeno del fotoblanqueo puede describirse mediante la expresión cinética
de la ecuación II.3:
Cdt
dCλ−= II.3
donde C es la concentración de moléculas fluorescentes y � la tasa de fotoblanqueo. El
valor preciso de � depende de las condiciones en las que se toman las imágenes, como la
potencia de láser, tiempo de exposición por píxel, magnificación, etc. Cuanto más se
ilumina la muestra más se fotoblanqueará, siendo la tasa de fotoblanqueo proporcional a
la intensidad de iluminación9.
En términos de la intensidad de fluorescencia I (proporcional a la concentración
de moléculas fluorescentes) en función del tiempo, esta ecuación nos da una evolución
temporal como la de la ecuación II.4:
)exp()exp()( 00τ
λt
ItItI−
=−= II.4
donde I0 es el valor de intensidad inicial y � el tiempo característico del proceso (� =
1/�). Es importante aclarar que la intensidad en términos de la concentración de
moléculas fluorescentes tiene en cuenta que a las señales se les restó la señal de fondo o
background.
Bajo ciertas circunstancias, el efecto del fotoblanqueo puede ser utilizado para
obtener información específica que no sería accesible de otra manera, como resulta en el
caso de la técnica de recuperación de la fluorescencia después del fotoblanqueo
(FRAP), descripta en la siguiente sección.
II.2.5 Técnicas asociadas a la Microscopía de Fluorescencia
En esta sección se describen brevemente las tres técnicas asociadas a la
microscopía de fluorescencia utilizadas en este trabajo de Tesis. Ellas son: transferencia
de energía por resonancia de Förster (FRET), recuperación de la fluorescencia después
del fotoblanqueo (FRAP) y número y brillo (N&B). Se mencionan los controles
II.2 Microscopía de Fluorescencia
48
realizados en cada una de las técnicas, así como los detalles de la puesta a punto de las
mismas para su utilización en este trabajo de Tesis.
II.2.5.a Transferencia de energía por resonancia de Förster - FRET
La transferencia de energía por resonancia de Förster es un proceso no radiativo
en el que la energía de un fluoróforo dador es transferida a un fluoróforo aceptor que se
encuentra a una distancia de rango nanométrico. FRET es un fenómeno fotofísico muy
útil para sensar interacciones entre proteínas, dado que la eficiencia E a la que se
produce la transferencia de energía depende fuertemente de la distancia r entre los dos
fluoróforos y está dada por (ec. II.5):
( )60/1
1
RrE
+= II.5
donde R0 es la distancia a la que se transfiere el 50% de la energía (Figura II.17 A),
suele ser del orden de unos nm. El proceso de transferencia de energía involucra el
acoplamiento resonante de los dipolos de emisión y absorción de ambas moléculas10, y
requiere que el espectro de emisión del dador se solape con el espectro de excitación del
aceptor (Figura II.17 B).
Figura II.17. Bases de FRET. A Eficiencia de FRET en función de la distancia entre fluoróforos
(normalizada al radio de Förster R0): cuando el dador y el aceptor están a una distancia corta comparada
con R0, la energía se transfiere eficientemente dando como resultado una emisión menor del dador y una
emisión sensibilizada del aceptor (esquema tomado de11). B Solapamiento espectral (en gris) entre los
espectros normalizados de emisión del dador (en este caso GFP, línea sólida verde) y excitación del
aceptor (en este caso mCherry, línea de puntos roja).
Efi
cien
cia
de
FR
ET
> FRET
< FRET
Efi
cien
cia
de
FR
ET
> FRET
< FRET
300 400 500 600 700 800
I (u
.a.)
λλλλ (nm )
G FP m C h erry J( λλλλ )
A B
II.2 Microscopía de Fluorescencia
49
FRET requiere por otra parte que el par de moléculas utilizadas como dador y
aceptor presenten espectros de emisión y excitación separados entre sí, de manera que
no se produzca “entrecruzamiento” o solapamiento al excitar con una misma longitud de
onda a ambos fluoróforos. La transferencia depende también de que los fluoróforos
presenten un alto coeficiente de absorción, rendimiento cuántico elevado y
fotoestabilidad. El radio de Förster (R0) está dado por la ecuación II.6:
( ) 2420 107.9)( 6
1
×××××= −QnJR λκ II.6
en la que κ2 describe la orientación relativa en el espacio de los dipolos de transición
entre dador y aceptor, J(λ) es la integral de la región de superposición entre los
espectros de emisión del dador y de absorción del aceptor, n representa el índice de
refracción del medio, y Q es el rendimiento cuántico del dador. Este valor dependerá
entonces de las propiedades fotofísicas del par de fluoróforos elegidos para FRET. Para
la mayoría de los pares de fluoróforos utilizados para FRET biológicamente relevantes,
el valor de R0 está en el orden de los 5 nm, por lo que el hecho de que se produzca la
transferencia se considera indicativo de la interacción entre las proteínas marcadas.
FRET puede detectarse experimentalmente mediante una amplia variedad de
técnicas (una buena revisión de las mismas puede encontrarse en12). Tradicionalmente
se mide la emisión sensibilizada del aceptor al iluminar en la longitud de onda de
excitación del dador13. Sin embargo, este tipo de mediciones requiere la corrección
cuidadosa de la fluorescencia del aceptor (en ausencia de dador) al iluminar en la
longitud de onda de excitación del dador y de la emisión del dador (en ausencia del
aceptor) en el canal del aceptor (lo que se denomina sangrado espectral). Otra manera
común de medir FRET es mediante el fotoblanqueo del aceptor, dado que en presencia
del mismo una fracción de la energía de excitación del dador no se emite como
consecuencia de la transferencia. Así, se obtiene una medida de FRET cuantificando la
fluorescencia del dador antes y después de fotoblanquear completamente el aceptor14.
En este trabajo de Tesis utilizamos el método de FRET por Ratio-imaging, que
se basa simplemente en iluminar al dador, registrar los canales dador y aceptor, y tomar
el cociente entre ambos. Este método es el más utilizado cuando se emplean sensores
basados en FRET, como el sensor de tensión de vinculina utilizado en este trabajo.
II.2 Microscopía de Fluorescencia
50
Tanto la descripción del sensor como la aplicación del FRET por Ratio-imaging a
nuestros experimentos serán tratadas en detalle en el Capítulo 5.
En cada una de las técnicas para FRET se define alguna cantidad, dependiendo
de las imágenes adquiridas, que resulta proporcional a la eficiencia de FRET (eficiencia
aparente). Si bien no es generalmente cuantificable a partir de estas mediciones la
distancia a la que se encuentran las proteínas estudiadas, la eficiencia aparente de FRET
(calculada píxel a píxel a partir de las imágenes registradas) nos proporciona un mapa
de la interacción entre las proteínas. Es decir que, por ejemplo dentro de una célula,
podemos cuantificar la interacción relativa de las proteínas con la resolución espacial
del microscopio. La técnica de FRET resulta entonces una herramienta muy poderosa
para el estudio y localización de interacciones moleculares directas. En este sentido, ha
permitido monitorear cambios de actividad de enzimas, interacciones proteína-proteína,
y la activación de moléculas de señalización mediante la utilización de biosensores
basados en FRET.
II.2.5.b Recuperación de la fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP)
La recuperación de la fluorescencia luego del fotoblanqueo (FRAP), es una
técnica que utiliza el fotoblanqueo de la fluorescencia para observar el movimiento de
moléculas en el entorno intracelular15. Se basa en fotoblanquear al marcador
fluorescente en un pequeño volumen dentro de la célula y registrar en el tiempo la
recuperación de la fluorescencia en la zona fotoblanqueada. En la Figura II.18 A se
muestra un esquema del experimento.
La recuperación de la fluorescencia está relacionada con los procesos de
difusión y/o químicos (unión-disociación) a los que está sujeto el marcador unido a la
proteína de interés. Las curvas de la recuperación de la fluorescencia F(t) se obtienen de
los valores de intensidad en función del tiempo según la ecuación II.7:
00
0)()(
II
ItItF
t −
−=
<
II.7
donde I(t) es la fluorescencia en el volumen de detección, I0 es la fluorescencia
inmediatamente después de fotoblanquear, y It<0 es el valor medio de la fluorescencia
II.2 Microscopía de Fluorescencia
51
antes del fotoblanqueo. Esta curva toma un valor de 1 antes del fotoblanqueo y decae a
0 en t = 0, tomado como el instante al que se registra la primer imagen después del
fotoblanqueo.
Figura II.18. A Esquema del experimento de FRAP y curva de recuperación característica de la
fluorescencia. B Las curvas de recuperación reflejan diferentes procesos dinámicos de las proteínas.
Tomado de 16
La forma de la curva dependerá del proceso o los procesos involucrados (Fig.
II.18 B). En el caso de una difusión simple, la recuperación sigue una curva
exponencial que retorna al valor inicial, y el tiempo de recuperación está asociado al
coeficiente de difusión de las moléculas unidas al fluoróforo. En casos en que la
recuperación no es total, por ejemplo en una difusión restringida, se define como
fracción móvil f al valor de la recuperación a tiempos largos. f corresponde a la
proporción de la intensidad recuperada, y puede interpretarse como la proporción de
moléculas en movimiento. En algunos casos puede estar involucrado más de un
proceso, teniendo que considerarse todas las posibilidades a la hora de ajustar las curvas
para obtener la información biológicamente relevante. En el Capítulo 5 se describirá en
detalle el modelo utilizado para analizar este tipo de experimentos en adhesiones
focales.
II.2.5.c Número y brillo (N&B)
El método número y brillo (N&B)17, una técnica derivada de la espectroscopía
por correlación de fluorescencia (FCS), se basa en el análisis de las fluctuaciones de la
Difusión simple
Difusión restringida
Proceso complejo
Difusión simple
Difusión restringida
Proceso complejo
A B
tiempo
Fotoblanqueo a t = 0
F(t)
tiempo
Fotoblanqueo a t = 0
F(t)
II.2 Microscopía de Fluorescencia
52
intensidad de la fluorescencia en cada píxel de una secuencia de imágenes,
determinándose el primer y segundo momento de su distribución. Mediante N&B se
determina el número promedio y el brillo promedio de las moléculas fluorescentes en
cada píxel de una imagen, permitiendo determinar el estado de agregación de proteínas
en la célula y diferenciarlo de su concentración. En la Figura II.19 se presenta un
esquema del análisis de N&B, que permite discriminar, a través del análisis de la
dispersión en la señal de fluorescencia, una situación en la que se tienen pocas
moléculas brillantes o agregados (A, C y E) de otra con muchas moléculas poco
intensas (B, D y F).
Figura II.19 Los esquemas A y B representan los volúmenes de detección correspondientes a dos píxeles
(k y j, respectivamente) de la imagen cuya evolución temporal en intensidad se corresponden con las
series temporales C y D. El valor medio de ambas es el mismo, no así sus desviaciones estándar como se
ve en los respectivos histogramas E y F. El histograma que presenta una mayor desviación (E)
corresponde a las fluctuaciones producidas por unas pocas partículas muy brillantes (A) mientras que el
de menor desviación se corresponde con una mayor cantidad de partículas menos brillantes. Imagen de
Digman et al.17.
Para el análisis de los datos, en el caso de una serie de K imágenes se definen
para cada píxel el valor medio <k> (ec. II.8) y la varianza �2 (ec. II.9) de la intensidad:
Tiempo (s) Tiempo (s)
Inte
nsi
dad
(kc
ps)
Inte
nsi
dad
(kc
ps)pixel k pixel j
Fre
cuen
cia
Fre
cuen
cia
A
C
E
B
D
F
II.2 Microscopía de Fluorescencia
53
K
k
k i
i�= II.8
( )
K
kki
i� −
=
2
2σ II.9
donde ki es la intensidad en el píxel para la imagen i de la secuencia.
Dadas dos series con el mismo <k>, cuanto mayor es la varianza, más grandes
son las partículas. El cociente entre <k>2 y �2 es proporcional al número de partículas.
Se definen entonces el número de moléculas aparente N (ec. II.10) y el brillo aparente B
(ec. II.11) como:
2
2
σ
kN = II.10
kN
kB
2σ== II.11
Para obtener el brillo molecular verdadero ε y el número de moléculas
verdadero n, el método asume que la agregación no cambia ε, y que la varianza tiene 2
componentes: fluctuaciones debidas a las moléculas (de varianza �n) y al ruido del
detector (de varianza �d) (ec. II.12):
222dn σσσ += II.12
donde cada una de dichas varianzas tiene una dependencia diferente con el brillo
molecular verdadero. Mientras que la varianza producida por la entrada y salida de
moléculas del volumen confocal depende cuadráticamente de � ( 22εσ nn = ), la varianza
del detector se debe a la estadística de conteo de fotones y tiene con el brillo una
dependencia lineal ( εσ nd =2 ). El brillo molecular verdadero está relacionado con el
brillo aparente mediante la ecuación II.13:
122222
+=+=+== εσ
ε
εσσσ
kn
n
kkkB ddn
II.13
de donde claramente el brillo molecular verdadero corresponde a la parte de B
producida por las fluctuaciones debidas a la dinámica de las moléculas. Entonces, los
píxeles donde las fluctuaciones de la intensidad son debidas a la difusión de partículas
presentan un B > 1, mientras que la fracción inmóvil tiene B =1.
II.2 Microscopía de Fluorescencia
54
Por simplicidad suele trabajarse con los valores aparentes (B y N) y finalmente
calcular los valores biológicamente relevantes (n y ε), pero pueden calcularse
directamente desde la intensidad media y la varianza utilizando las ecuaciones II.14 y
II.15:
k
kn
−=
2
2
σ II.14
k
k22 −
=σ
ε II.15
Para analizar el estado de agregación de las moléculas en la célula, es necesario
realizar la calibración del brillo molecular verdadero de la proteína monomérica. Esta
calibración puede hacerse utilizando el fluoróforo monomérico en solución, o si se trata
de proteínas fluorescentes también expresando únicamente la VFP (no unida a la
proteína de interés) en las células y repitiendo el experimento en el citoplasma. Se
supone que al expresar sólo la VFP, no formará agregados.
Es importante notar que el tiempo por píxel elegido para tomar las imágenes
debe ser lo suficientemente corto como para no promediar las fluctuaciones ocasionadas
por la entrada y salida de algunas moléculas en el volumen confocal iluminado. Por otra
parte, el tiempo entre imágenes (i.e. el tiempo entre los valores de ki de la secuencia de
intensidad para cada píxel) debe ser lo suficientemente largo como para que las
mediciones sean independientes entre sí, dado que al hacer la estadística no queremos
que haya correlación entre un valor y el siguiente. Asimismo, tanto B como ε dependen
de la potencia láser empleada, por lo cual la calibración del brillo del monómero debe
hacerse en las mismas condiciones que el experimento.
N&B permite entonces la determinación del estado de agregación y
concentración de proteínas en células vivas. En su versión con dos fluoróforos
(crossN&B), permite además detectar la interacción entre proteínas marcadas con
distintos fluoróforos, y a partir del brillo revelar la estequiometría de los complejos18.
- Modificación para modo pseudo-conteo de fotones y calibración de los detectores
Las consideraciones hasta aquí descriptas de N&B tienen en cuenta que los
detectores permiten el conteo de fotones. Sin embargo, la mayoría de los microscopios
II.2 Microscopía de Fluorescencia
55
confocales comerciales no cuentan con este tipo de detectores, como es el caso del
Olympus FV1000 utilizado en este trabajo de Tesis. La técnica N&B puede ser
adaptada tanto al modo analógico tradicional del microscopio como al modo pseudo-
conteo de fotones que el mismo también provee19.
Para adaptar la técnica al modo analógico, hay que tener en cuenta que en lugar
de contar fotones la señal corresponde a niveles digitales (relacionados con el número
de fotones por un factor S), y que hay un valor de offset (doffset) y un ruido adicional en
el detector (o readout noise, �02). En este caso, se deben considerar estos tres
parámetros en el cálculo de la varianza del detector y en el valor medio de la intensidad
(ecuaciones II.16 y II.17):
20
2σεσ += Snd II.16
offsetdnk += ε II.17
El modo pseudo-conteo de fotones del FV1000 detecta, para señales bajas y de
anchos de banda menores a 100 MHz, la señal del fotomultiplicador como una serie de
pulsos en el ánodo que son procesados digitalmente, reduciendo dramáticamente el
ruido. En este modo, utilizado en todos los experimentos de N&B que se presentan en
este trabajo de Tesis, no están presentes ni la señal de continua (doffset = 0) ni el ruido de
readout (�02 = 0). En este caso el valor de B puede escribirse como la ecuación II.18:
Sn
nS
n
nS
kkB dn )1(
222
+=+=+= εε
ε
ε
εσσ
II.18
donde ahora el valor de B para muestras de fluoróforos inmóviles ( 02=nσ ) es S. En
este modo de adquisición, para determinar el valor del brillo molecular verdadero
necesitamos calibrar el valor de S del detector. Dado que S corresponde al valor de B de
una muestra inmóvil, el factor S suele obtenerse por ejemplo, calculando el valor de B
para una secuencia de imágenes de ruido de oscuridad (ruido térmico de los detectores,
obtenido adquiriendo con el camino óptico obturado).
Una vez determinado el factor S, se obtiene � fácilmente según la ecuación II.19:
1−=S
Bε II.19
Resulta fundamental para este tipo de experimentos hacer un estudio previo de
caracterización de los detectores. En particular, para los detectores del FV1000 utilizado
II.2 Microscopía de Fluorescencia
56
en este trabajo, encontramos que el valor de calibración del factor S para los
experimentos de N&B medido a partir del ruido térmico resultó de una variabilidad muy
alta. Más aún, el valor de S calibrado y su variación en el tiempo a partir de que son
encendidos los detectores dependen fuertemente del estado de la cámara ambiental que
posee el microscopio para medir en células vivas.
En la Figura II.20 se muestra el estudio de la calibración del factor S y su
evolución en el tiempo a partir de que se encienden los detectores (tiempo tomado como
t = 0). Esta caracterización consistió simplemente en tomar secuencias del ruido de
oscuridad de los tres detectores del microscopio en las mismas condiciones en que se
realizaron los experimentos de N&B. El procedimiento se repitió a intervalos
espaciados de tiempo, y para cada secuencia se calibró mediante estas mediciones el
factor S. Se realizó en tres condiciones diferentes de la cámara ambiental: cámara
encendida a 37°C al momento de encender los detectores (Fig. II.20 A), mediciones a
temperatura ambiente sin encender la cámara (Fig. II.20 B) y cámara a 37°C encendida
durante toda la noche anterior a realizar la calibración (Fig. II.20 C).
Figura II.20. Evolución del factor de calibración S para N&B en modo pseudo-conteo de fotones. Se
presenta la evolución de S en tres condiciones diferentes de la cámara ambiental: cámara a 37°C
encendida a al momento de encender los detectores (A), mediciones a temperatura ambiente sin encender
la cámara (B) y cámara a 37°C encendida durante toda la noche anterior a realizar la calibración (C).
Cada color corresponde a uno de los tres detectores disponibles en el microscopio FV1000 utilizado.
Como se ve en este estudio, el valor del factor de calibración S tiene una alta
variabilidad y depende de las condiciones de la cámara ambiental. Observamos que en
todas las condiciones de la cámara y para los tres detectores, se da un aumento
progresivo de S desde que se encienden los detectores que se estabiliza en menos de 150
minutos. Es por ello que las mediciones de N&B fueron realizadas dos horas después de
encender los detectores. Por otro lado, una vez estabilizado el valor de S presenta de
0 100 200 300 400 500 600
5
6
7
S
t (min)
Ch1 Ch2 Ch3
0 100 200 300 400
5
6
7
S
t (min)
Ch1 Ch2 Ch3
0 100 200 300 400 500
5
6
7
S
t (min)
Ch1 Ch2 ch3
A B C
cámara encendida a t=0 cámara no encendida cámara encendida a t<-12hs
II.2 Microscopía de Fluorescencia
57
todos modos una variabilidad que es comparable con los cambios en el brillo entre por
ejemplo un monómero y un dímero. Por esta causa la calibración del valor de S se
realiza en cada experimento de N&B tomando una secuencia de ruido de oscuridad
inmediatamente antes o inmediatamente después de la secuencia de medición.
II.2.6 Referencias 1 Davison M., Abramowitz M., Introduction to Fluorescence. Olympus Microscopy Resource
Center (http://www.olympusmicro.com/index.html). 2 Lichtman J. W. and Conchello J. A., Nature Methods 2: 910 (2005). 3 Wilson and Sheppard C. J. R.. Theory and practice of scanning optical microscopy. Academic
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Edition, Capítulo 6. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2010). 12 Jares-Erijman E. A. and Jovin T. M., Nat Biotechnol 21(11):1387 (2003). 13 Gadella T. W. J., Fret and Flim Techniques, Elsevier, Capítulo7 (2009). 14 Wouters, F. S.; Verveer, P. J.; Bastiaens, P. I. H., Trends in Cell Biology 11: 203 (2001). 15Axelrod D., Koppel D. E., Schlessinger J., Elson E., and Webb W.W., Biophys. J., 16(9):1055
(1976). Braeckmans L., Peeters N. N., Sanders S., De Smedt C., and Demeester J., Biophys. J.,
85:2240 (2003).
II.2 Microscopía de Fluorescencia
58
16 Verkman A. S., Trends Biochem Sci. 27(1):27 (2002). 17 Digman, M.A., Dalal, R., Horowitz, A.F. and Gratton, E., Biophys. J. 94: 2320 (2008). 18 Digman M. A., Wiseman P. W., Choi C., Horwitz A. R., and Gratton E., PNAS 106: 2170
(2009). 19 Dalal R. B., Digman M.A., Horwitz A. F., Vetri V., and Gratton E., Microscopy Res. And
Tech. 71: 69 (2008).
II.3
Microscopía Combinada AFM/Fluorescencia
En este capítulo describo el microscopio combinado AFM-óptico desarrollado en el
Laboratorio de Electrónica Cuántica, y las modificaciones que se realizaron durante este
trabajo de Tesis para su utilización en el estudio de células vivas. Presento también la
caracterización de la iluminación y el ruido de fondo para el análisis cuantitativo de las
imágenes de fluorescencia provenientes del microscopio combinado.
II.3 Microscopía combinada AFM/Fluorescencia
61
II.3.1 Microscopía Combinada AFM-Fluorescencia
Tanto la microscopía óptica como la microscopía de fuerza atómica han
avanzado significativamente en los últimos años. Varios métodos de microscopía óptica
han permitido romper el límite de difracción de Abbe1, mientras que el microscopio de
fuerza atómica ha sido aplicado para obtener no sólo imágenes topográficas sino
también propiedades químicas y mecánicas de material biológico2. Combinar estas dos
técnicas abre numerosas posibilidades tanto en biofísica como en nanobiotecnología,
siendo nuestro interés particular la interacción entre una punta sensora de AFM y una
célula, y la simultánea medición de su respuesta por fluorescencia. La motivación para
combinar microscopía de fluorescencia con AFM surge de la necesidad de explotar las
ventajas de ambas técnicas de forma complementaria3. Mientras que la fluorescencia
ofrece una alta resolución temporal y sensibilidad fisicoquímica local, la AFM
constituye una herramienta única para obtener topografía en una escala nanométrica, y
brinda la posibilidad de manipular mecánicamente y detectar fuerzas de interacción
entre moléculas individuales. En este sentido, con un microscopio combinado
AFM/Fluorescencia podríamos iniciar localmente reacciones biológicas mientras
observamos cambios conformacionales y funcionales a nivel molecular y celular,
cubriendo dos escalas muy diferentes que no pueden ser abarcadas por una sola
microscopía. En el Laboratorio de Electrónica Cuántica se ha desarrollado un
microscopio multi-análisis que representa el estado del arte en tecnología. Este
microscopio combinado, AFM/Fluorescencia, podrá combinar el poder de resolución
funcional de las microscopías y espectroscopía de fuerza con la alta resolución espacial
y temporal de la microscopía multifotónica.
II.3.2 El microscopio combinado del laboratorio de Electrónica Cuántica
En el Laboratorio de Electrónica Cuántica (FCEyN-UBA) se diseñó y construyó
un microscopio multifunción como parte del trabajo de tesis doctoral del Lic. Martín
Masip y del Lic. Martín Caldarola, cuyo desarrollo es contemporáneo a esta tesis
doctoral. Este microscopio, que llamamos AFM/Fluorescencia, combina un microscopio
óptico de campo lejano, con microscopías de barrido por sonda. De esta manera se
obtiene una caracterización del material estudiado, en la escala nano y micrométrica.
II.3 Microscopía combinada AFM/Fluorescencia
62
Está diseñado para muestras transparentes en una configuración invertida, lo cual lo
hace adaptable para el estudio de muestras biológicas. El diseño es modular, de manera
que permite el armado de la configuración deseada para cada aplicación.
En la Figura II.21 se presenta un esquema del microcopio en la configuración
AFM-Fluorescencia utilizada en este trabajo de Tesis. El cabezal de AFM fue
enteramente diseñado en el Laboratorio de Electrónica Cuántica (LEC) y permite
trabajar con los sensores de fuerza comerciales tradicionales. La electrónica que
controla el AFM (RHK Technology, SM100-AFM100) adquiere y procesa la señal del
detector de cuatro cuadrantes para registrar la deflexión del cantilever. Dicha
electrónica maneja también el lazo de realimentación así como el movimiento axial y
lateral de la muestra a través de una platina xyz piezoeléctrica (PI, P517) de
posicionamiento axial con una resolución subnanométrica y con un rango dinámico de
movimiento de 20 µm. El AFM funciona tanto en modo contacto como en tapping
mode, pudiendo realizar también la espectroscopía de fuerza.
muestra
AFM
Wide Field
CCD
objetivo
Filtro em. (GFP)
Filtro exc.(GFP)
Dicroico (GFP)
LED
Tubelens
Platina xyz muestra
AFM
Wide Field
CCD
objetivo
Filtro em. (GFP)
Filtro exc.(GFP)
Dicroico (GFP)
LED
Tubelens
Platina xyz
Figura II.21 Esquema del microscopio combinado en la configuración AFM/Fluorescencia. El juego
de filtros se seleccionó para la detección de la proteína verde fluorescente (GFP). Gentileza LEC.
El cabezal AFM funciona sobre un microscopio óptico invertido, que puede
operarse como microscopio de fluorescencia convencional utilizando como fuente de
luz un LED azul (Tolket, SRL). Para las aplicaciones de este trabajo de Tesis, se
seleccionaron filtros de excitación, dicroico y de emisión para la proteína verde
fluorescente GFP (Chroma 49002-ET-EGFP)). Se cuenta además con un filtro notch
II.3 Microscopía combinada AFM/Fluorescencia
63
para suprimir la longitud de onda del láser utilizado para AFM. Para la detección se
utilizó una cámara CCD (Apogee Imaging Systems, Alta U2000).
En la Figura II.22 se muestran imágenes del microscopio combinado
AFM/Fluorescencia. Todo el microscopio está montado sobre una mesa óptica
antivibratoria, por lo que el inconveniente de las vibraciones, que suele afectar la
resolución en los dispositivos comerciales que se encuentran en el mercado, ha sido
subsanado.
Figura II.22 El microscopio combinado AFM/Fluorescencia del LEC. Vista general del microscopio
(izquierda) y detalle del AFM (derecha).
Este equipo ha demostrado ya la operación como microscopio de fuerza atómica
alcanzando una alta resolución, del orden de los nanómetros en las imágenes de fuerza.
En la Figura II.23 se muestran imágenes AFM de grillas de calibración tomadas en el
microscopio.
Figura II.23 Imágenes AFM del microscopio combinado AFM/Fluorescencia. A. Grilla TGZ01 (NT-
MDT, Moscú, Rusia), imagen de topografía modo contacto en aire (altura en unidades según escala
indicada, barra 5µm). B. Grilla TGT01 (NT-MDT, Moscú, Rusia), imagen obtenida utilizando la señal
error del lazo de control, modo contacto en aire (deflexión en unidades arbitrarias, barra 4µm). Gentileza
LEC4.
Óptico
AFM
láser
detector
sensor de fuerza
espejo
A B
II.3 Microscopía combinada AFM/Fluorescencia
64
Utilizando este microscopio se han obtenido también imágenes de fluorescencia
en modo wide field de alta calidad. Por ejemplo, en la Figura II.24 se muestra la
imagen de fluorescencia de una muestra comercial de células de arteria pulmonar
bovina fijadas, cuyos microtúbulos fueron inmunomarcados con anticuerpos anti-
tubulina unidos al fluoróforo BODIPY.
Figura II.24 Imagen de fluorescencia del microscopio combinado AFM/Fluorescencia. Muestra
comercial de células de arteria pulmonar bovina fijadas químicamente e inmunomarcadas con anticuerpos
anti-tubulina unidos a BODIPY (barra 50 µm). Gentileza LEC.
Por último, el microscopio también ha demostrado la operación simultánea
óptica-fuerza, en muestras de células HeLa expresando un receptor de membrana unido
a GFP, fijadas químicamente con paraformaldehído (Figura II.25).
Figura II.25 Imagen simultánea AFM/Fluorescencia del microscopio combinado LEC. Se muestra la
imagen de topografía por AFM, la imagen de fluorescencia y ambas superpuestas, de células HeLa
expresando un receptor de membrana (receptor de insulina) unido a GFP, fijadas químicamente. Se
observa que de las 5 células presentes en la muestra, sólo una expresa el receptor unido a la proteína
fluorescente verde (gentileza LEC3).
II.3 Microscopía combinada AFM/Fluorescencia
65
Cabe aclarar que el microscopio aquí descripto está diseñado para poder realizar
alternativamente microscopía confocal y multifotónica. Para la microscopía
multifotónica se cuenta con un láser de Ti:Za pulsado, sintonizable en el rango 750 a
850 nm, que provee pulsos de 50 fs, y de una fuente solitónica de pulsos de 40fs
sintonizable entre 850nm y 1200nm. Para la detección confocal cuenta también con un
detector APD (Perkin Elmer modelo SPCM AQR-13). Actualmente el barrido con el
láser y el barrido de la sonda local se realizan ambos con la platina motorizada, por lo
que todavía no es posible utilizarlos simultáneamente. Es por esto que en este trabajo se
utilizaron la microscopía AFM y la microscopía de fluorescencia convencional (wide
field).
II.3.3 Adaptación del microscopio combinado para trabajar con células en
condiciones fisiológicas
El microscopio combinado representa una herramienta única dado que nos
permitirá ejercer fuerzas de forma cuantitativa y puntual sobre una célula, a la vez que
desencadenamos la formación de la adhesión focal, y seguimos en función del tiempo la
respuesta bioquímica mediante la visualización y localización de proteínas componentes
de la adhesión focal o de la cascada de señalización fusionadas a VFPs. Todas las
técnicas descriptas para AFM/FS y microscopía de fluorescencia por separado, podrán
combinarse en este microscopio multi-análisis.
Como parte de este trabajo de Tesis, participé en la adaptación del microscopio
combinado AFM/Fluorescencia para poder realizar mediciones en condiciones
fisiológicas. En estas condiciones, podemos repetir y combinar todos los experimentos
pensados tanto para biomoléculas individuales como para células vivas.
En este sentido, la modificación más importante que tuvo que hacerse fue lograr
que el microscopio pueda trabajar en medio líquido dado que se necesita que la muestra
esté cubierta por la solución. En el caso de células vivas es necesario mantener las
condiciones fisiológicas. En principio, el hecho de que la muestra esté cubierta por
líquido hace que el láser del AFM se vea deflectado en un ángulo diferente al que
presenta en el aire, por lo que se debe adecuar la alineación del mismo. Ahora bien, si la
interfase líquido-aire cambia su forma ya sea por el movimiento de la platina o bien por
II.3 Microscopía combinada AFM/Fluorescencia
66
la evaporación del líquido durante la medición, la alineación no puede mantenerse
durante el experimento. Es por ello que se diseñó una pieza que puede unirse al cabezal
en el que se coloca el sensor de fuerza, que aprisiona la gota de solución debajo de una
interfase de vidrio de manera tal que la alineación se mantenga constante durante todo el
experimento. En la Figura II.26 se muestra el detalle del cabezal de AFM trabajando en
solución, con la pieza diseñada.
Figura II.26 Cabezal AFM y celda para trabajar en solución.
En la Figura II.27 se muestran imágenes de la grilla de calibración TGZ01 (NT-
MDT, Moscú, Rusia) tomada en solución, en las que puede verse que la resolución del
microscopio se mantiene al trabajar en líquido.
Figura II.27 Imágenes AFM del microscopio combinado AFM/Fluorescencia en solución. Grilla
TGZ01 (NT-MDT, Moscú, Rusia), imagen en modo contacto de topografía (izquierda) y la señal error
(derecha). Gentileza LEC.
En el Capítulo 7 se presentan los resultados obtenidos con este microscopio en
condiciones fisiológicas, tanto para biomoléculas como para células vivas.
interfase de vidrio gota de solución
pieza diseñada
II.3 Microscopía combinada AFM/Fluorescencia
67
II.3.4 Microscopía de fluorescencia. Caracterización de la iluminación y ruido de
fondo para el análisis cuantitativo de las imágenes
Para poder hacer un análisis cuantitativo de las imágenes de fluorescencia
adquiridas en el microscopio combinado AFM/Fluorescencia, caracterizamos tanto la
uniformidad en la iluminación como el ruido de fondo y sus fuentes. Los dos
parámetros fueron optimizados de manera de minimizar tanto la no uniformidad en la
iluminación como el background. Presentamos aquí la caracterización de ambos
factores.
II.3.4 a Iluminación
Para caracterizar la uniformidad en la iluminación de la luz de excitación del
microscopio combinado, tomamos imágenes en fluorescencia de un portaobjetos de
plástico uniformemente fluorescente comercial (autofluorescent plastic slide, Chroma
Technology, Vermont, Estados Unidos). En la Figura II.28 se muestra una imagen del
portaobjeto de diagnóstico en fluorescencia, de todo el campo visual.
Figura II.28 Caracterización de la iluminación. A. Imagen de un portaobjetos uniformemente
fluorescente, tomada en todo el campo del microscopio (barra 50 µm). Se nota la no uniformidad en los
bordes del objetivo, además de granos sobre la superficie correspondientes a suciedad en el portaobjetos.
B. Imagen A en forma tridimensional, donde puede notarse la no uniformidad en términos de intensidad.
C. Histograma de intensidades de la imagen, que presenta una desviación estándar del 13.5%.
2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000Intensidad
Fre
cuen
cia
A
B C
II.3 Microscopía combinada AFM/Fluorescencia
68
Puede verse en los bordes un círculo a partir del cual la fluorescencia es menos
intensa, esto se corresponde con los bordes de la lente objetivo. Los granos más oscuros
que se observan en la superficie corresponden a suciedad en el portaobjetos
fluorescente, no estando relacionados con la iluminación.
Si bien se ve una clara no uniformidad en la iluminación, en los experimentos
realizados en este trabajo se tomaron imágenes en la zona central del campo de
iluminación en la que las diferencias son menores. En cada experimento, como se
detallará en el Capítulo 7, se analizó cuidadosamente la iluminación en la zona
estudiada y se cuantificó la misma para considerar sus posibles efectos en los
resultados.
II.3.4 b Ruido de fondo
Se caracterizaron también las señales de ruido de fondo o background para el
microscopio combinado AFM/Fluorescencia. En la Figura II.29 A se ve una imagen
del ruido de oscuridad, con el LED apagado y también apagando el láser de la cabeza
del AFM. Es importante notar que si bien el microscopio cuenta con un filtro notch para
suprimir la longitud de onda del láser utilizado para el AFM, la señal proveniente de
este láser no es despreciable, como se observa en la Figura II.29 B.
Figura II.29 Caracterización de las señales de fondo. A. Ruido de oscuridad, tomado con el LED azul
y el láser del AFM apagados. Barra 50 µm. B. Ruido proveniente del láser utilizado para AFM (tomado
sobre una muestra de perlas fluorescentes, con el LED apagado). Se puede ver la sombra del sensor de
fuerza, debida a la señal transmitida del láser de AFM. Ambas imágenes tomadas con 1 segundo de
integración, y binning 4x4. Los recuadros internos muestran los histogramas de intensidad de cada
imagen.
A B
II.3 Microscopía combinada AFM/Fluorescencia
69
Esta observación explica por qué en las imágenes de fluorescencia se puede ver
la sombra del sensor de fuerza que no debería registrarse con la epi-iluminación del
LED. La luz transmitida del láser rojo del AFM es la que provoca entonces una sombra
debajo del cantilever, generando un ruido de fondo en esta zona diferente respecto del
background general de la imagen. Este hecho será tenido en cuenta a la hora de analizar
los datos, como se detallará en el Capítulo 7.
II.3.5 REFERENCIAS
1 Hell S. W., Science 316:1153 (2007). 2 Hinterdorfer P., Dufrene Y. F., Nat. Meth. 3: 347 (2006). 3 Dufrêne Y. F., Evans E., Engel A., Helenius J., Gaub H. E. & Müller D. J, Nat. Meth. 8: 123
(2011). 4 Masip, M. E, Microscopía combinada de alta resolución. Aplicaciones a la plasmónica y la
biofísica. Tesis Doctoral, Departamento de Física, FCEyN, UBA (2011).
II.4
Cultivo celular y dispositivo estirador
de células vivas en cultivo
Como parte de mi formación en este trabajo de Tesis, me familiaricé con las técnicas de
cultivo celular, crio-preservación y transfección para poder preparar todas las muestras
utilizadas en los experimentos. En este capítulo describo el modelo celular utilizado en
el estudio de la mecanotransducción celular, la línea HC11, y los protocolos para la
preparación de las muestras y conservación de las células. Menciono también los
plásmidos con los que se expresaron las proteínas quimeras (VFP-proteína de adhesión)
en las células para su visualización. Por último presento el dispositivo especialmente
diseñado y construido para el estiramiento mecánico de las células en cultivo y su
calibración.
II.4 Cultivo celular y dispositivo estirador de células vivas
73
II.4.1 Cultivo celular: línea celular utilizada
La mayoría de las células animales y vegetales aisladas pueden vivir,
multiplicarse, e incluso presentar ciertas propiedades diferenciales, si se las cultiva en
placas de plástico y con medios de cultivo adecuados. Así, las células pueden ser
observadas continuamente bajo el microscopio o analizadas bioquímicamente, para
estudiar los efectos del agregado o remoción de moléculas específicas, como hormonas
o factores de crecimiento. Los cultivos se establecen principalmente a partir de
suspensiones celulares generadas por disgregación de tejidos. La mayoría de las células
que forman parte de tejidos no pueden vivir en suspensión, y requieren una superficie
sólida sobre la cual crecer y multiplicarse. Es por esto que se cultivan en placas de Petri
o botellas de cultivo de plástico.
Las líneas celulares son células en cultivo que proliferan indefinidamente, ya sea
naturalmente o por la adición de algún gen específico. Son muy útiles en la
investigación celular, como fuente de un gran número de células uniformes, que pueden
ser conservadas y almacenadas en nitrógeno líquido (a -196 °C) por un período muy
largo de tiempo, reteniendo su viabilidad y siendo un buen modelo experimental para
las primeras etapas de una investigación. A pesar de la gran similitud que las células de
una línea tienen entre sí, no son idénticas. La uniformidad genética en una línea celular
puede mejorarse por clonado celular, a través del cual se aísla una sola célula, la que
prolifera para formar una colonia de células clonales (idénticas).
En este trabajo de Tesis se utilizó como sistema biológico modelo la línea
celular HC11, línea celular de tipo epitelial mamaria normal de ratón. Las HC11
constituyen un excelente modelo para el estudio de las modificaciones fisiológicas,
morfológicas y morfométricas que caracterizan el proceso biológico de
mecanotransducción celular1. El desarrollo postnatal de la glándula mamaria es un
proceso finamente regulado. Su progresión a través de los distintos estadios, conocidos
como virginidad, preñez, lactancia e involución ocurre por la interacción de múltiples
factores que influencian la migración, proliferación, diferenciación y muerte de los
distintos tipos celulares presentes en la glándula2. La evolución de las FAs durante el
desarrollo y su influencia sobre la fisiología de la glándula mamaria es todavía
desconocida.
II.4 Cultivo celular y dispositivo estirador de células vivas
74
El medio de cultivo RPMI 1640 en el que crece la línea HC11, suero fetal
bovino (SFB), los antibióticos penicilina y estreptomicina, y la tripsina utilizados para
cultivo celular fueron de GIBCO, Invitrogen (Grand Island, EEUU). Se utilizó también
la solución tampón o buffer fosfato salino, PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 100 mM
Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4).
II.4.2 Protocolos de cultivo celular y crio-preservación
-Mantenimiento del cultivo celular
Las células HC11 se mantuvieron en medio RPMI 1640 suplementado con
insulina 5 µg/ml penicilina (10 UI/ml), estreptomicina (10 µg/ml) y 10 % (v/v) suero
fetal bovino (SFB): de ahora en adelante, RPMI completo, a 37 ºC en 5 % CO2 y 98 %
de humedad. Cuando las células alcanzaban una confluencia aproximada del 90- 95 %
fueron lavadas con PBS y tratadas con 0.25 % tripsina / 0.53 mM EDTA a 37 ºC hasta
observar en el microscopio que se despegaran de la superficie de la placa. En este
momento se las resuspendió en medio fresco realizándose la dilución deseada.
-Crio-preservación
Cuando los cultivos celulares alcanzaron el 90 % de confluencia, las células
fueron colectadas como se describió anteriormente, centrifugadas durante 4 minutos a
800 rpm y luego resuspendidas en medio de cultivo con 20 % SFB (v/v), agregándole
luego el mismo volumen de medio con 20 % SFB (v/v) y 20 % DMSO (v/v). Las
células fueron fraccionadas en alícuotas de 1 ml en crio-tubos y colocadas en un
dispositivo “cryo-cooler” a -80 ºC. Luego de por lo menos 24 h las células fueron
transferidas a un tanque con nitrógeno líquido para preservarlas hasta su utilización.
II.4.3 Transfecciones
La transfección se define como la introducción dentro de una célula eucariota de
una molécula de ADN que no pertenece a la célula. Como resultado, la célula presenta
en general un gen mutado además de su gen normal (en células haploides el gen puede
II.4 Cultivo celular y dispositivo estirador de células vivas
75
ser reemplazado). Cuando el gen normal continúa presente, sólo se observan factores
dominantes de la alteración en análisis fenotípicos.
Las técnicas de transfección celular han permitido en gran medida ampliar los
conocimientos acerca de la regulación génica y de la función de las proteínas en los
sistemas celulares. En este caso la introducción de una construcción de ADN
recombinante en la que se ha situado una secuencia codificante de un gen reportero,
como los que codifican las proteínas fluorescentes en el visible (VFPs: GFP, CFP, YFP,
mCherry, etc.), permite identificar y observar la dinámica dentro de la célula de las
proteínas de interés mediante microscopía de fluorescencia.
En este trabajo se utilizó el método de transfección por lipofección, basado en la
formación de complejos entre lípidos catiónicos y ADN. El complejo tiene afinidad por
la membrana y permite la entrada del ADN en el citosol. Existen un gran número de
lípidos que se emplean en lipofección, aunque hay una estructura consenso de un lípido
catiónico sintético, a partir de la cual se han diseñado muchas variantes. Es esencial
optimizar las condiciones específicas de transfección para obtener buenas eficiencias de
transfección, que suelen ser en buenas condiciones de entre el 70 y el 90% de las células
de la placa. Las desventajas del método son, aparte del elevado precio de los lípidos, el
hecho de que no todos los lípidos funcionan en todos los tipos celulares, y que hay que
optimizar el ensayo para cada tipo celular. Los parámetros a optimizar son la relación
entre lípido y ADN (relación de cargas), la cantidad de ADN empleado, el tiempo que
se exponen las células al complejo, y la presencia o ausencia de suero. En este caso el
lípido de transfección utilizado fue Lipofectamina (Invitrogen)3.
Protocolo de transfección
Las células se plaquearon sobre cubreobjetos de 25 mm en placas de 6 pocillos
(5 x 105 células/pocillo) en RPMI completo. Al día siguiente se lavaron con PBS
agregando luego 500 �l de RPMI sin suero y sin antibióticos. Se prepararon por otro
lado dos soluciones (por pocillo): A) 50 �l Optimem + 4 µl de Lipofectamina y B) 50 µl
Optimem + 4 �g de ADN. Las soluciones A y B se incubaron 5 min a temperatura
ambiente (TA) y luego se combinaron incubándolas 20 min a TA, agregándolas
finalmente al pocillo con células y medio de cultivo de a gotas. Las células se
mantuvieron a 37 ºC con esta mezcla durante 5 h, posteriormente se las lavó con PBS y
se las dejó en RPMI completo durante toda la noche. Al día siguiente se lavaron
II.4 Cultivo celular y dispositivo estirador de células vivas
76
nuevamente con PBS y se renovó el medio dejándolas aproximadamente 40 h antes de
realizar los experimentos. En el caso de las membranas de silicona, se plaquearon en
placas de Petri de 60 mm de diámetro (12 x 105 células/placa) y se utilizaron 5 µl de
lipofectamina y 4 µg de ADN por placa para las soluciones de transfección. Estas
condiciones se determinaron como óptimas para cada plásmido. Para evaluar la
eficiencia de transfección por microscopía de fluorescencia se observó la expresión de
las proteínas marcadas. Se cuantificó la eficiencia de transfección como el cociente
entre el número de células transfectadas (presencia de proteína marcada) y el número
total de células.
II.4.4 Proteínas expresadas y plásmidos
Para la elección de las proteínas de las adhesiones focales estudiadas, se tuvieron
en cuenta los antecedentes respecto de cuáles de las aproximadamente 160 proteínas que
componen las adhesiones focales (FAs) son las posibles sensoras de fuerzas mecánicas.
Se conoce que el agregado de integrinas promueve el reclutamiento de varias
proteínas en sus dominios citoplasmáticos, lo que hace que las integrinas queden unidas
mecánicamente a la proteína actina del citoesqueleto4. Las moléculas reclutadas para
anclar el citoesqueleto a las FAs incluyen talina, vinculina, �-actinina, zixina y FAK5.
De esta manera las FAs establecen una conexión entre la matriz extracelular y la actina
del citoesqueleto, y sirven como puntos de tracción para la célula. Las adhesiones
focales a menudo están localizadas en la periferia de las células, son estructuras
transientes planas, alargadas de unos pocos micrones cuadrados, las cuales además han
sido postuladas como “organelas de señalización” en el proceso de mecanotransducción
celular6. Las FAs se ensamblan o reorganizan en forma dinámica en las células7, y este
continuo remodelado es crucial para el movimiento celular8 y las respuestas a fuerzas
mecánicas9. Ejemplos de mecanismos moleculares mecanosensitivos en las FAs
involucran a FAK10 (quinasa de adhesión focal), paxilina11 (proteína adaptadora), Src
(tirosina quinasa) y p130Cas12. Dentro de la célula, el movimiento interno de los
filamentos de actina también sería detectado por las FAs a través de un mecanismo
complejo basado en las múltiples interacciones transientes proteína-proteína que tienen
lugar en la adhesión focal13. A pesar del enorme progreso hecho en la caracterización a
II.4 Cultivo celular y dispositivo estirador de células vivas
77
nivel molecular de estas estructuras en los últimos años14, todavía existen interrogantes
sin contestar acerca de su composición, su formación y su dinámica.
Recientemente se ha postulado a la proteína zixina como una potencial proteína
mecanosensitiva en la adhesión celular. La zixina, proteína adaptadora presente en las
FAs, reúne varias características que nos permitirían identificarla como protagonista
importante en el proceso de mecanotransducción celular: 1) está localizada
predominantemente en las adhesiones focales, el sitio donde se piensa que reside el
mecanosensor15; 2) sirve de andamiaje o plataforma en la FA al unirse/reclutar a varias
proteínas tales como �-actinina y miembros de la familia Ena/VASP16; 3) interacciona
directamente con la proteína p130Cas que es potencialmente una molécula
mecanosensora17; 4) su reclutamiento en las FAs dependería de la fuerza mecánica
ejercida sobre la FA18; 5) su asociación con los extremos de las fibras de actina y su
capacidad de promover el ensamblado del filamento de actina son consistentes con su
participación en la remodelación del citoesqueleto en respuesta a una carga mecánica19;
6) su ablación genética o deslocalización deriva en una deficiencia en la migración de
las células20; 7) su translocación al núcleo en células expuestas a un estiramiento cíclico
alteraría la expresión de genes mecanosensitivos21. Estos resultados sugerirían que
existe una conexión entre el estímulo mecánico y el comportamiento de la zixina en las
adhesiones focales. Sin embargo, no hay evidencias cuantitativas de la relación entre
fuerzas moleculares y dinámica intracelular de la proteína. Los detalles de qué
molécula/s sensa/n las fuerzas mecánicas y reclutan a la zixina a las FAs, fibras de
estrés o al núcleo, cómo es la interacción entre la zixina y F-actina en función del estrés
mecánico, cómo variaciones en la unión de zixina en la FA afectan la morfología y
respuesta a la deformación mecánica, cómo se transmiten las fuerzas o cómo son
traducidas mecano-químicamente, no se conocen.
La vinculina es una proteína intracelular de FAs en cuya estructura se distinguen
dos dominios: una cabeza (Vh) y una cola (Vt) separadas por un espaciador flexible22.
Al igual que zixina, reúne varias características que nos permitirían identificarla como
protagonista importante en el proceso de mecanotransducción celular: 1) es la proteína
más abundante de las FAs23; 2) interactúa con varias proteínas de las FAs como talina,
paxilina, α-actinina y actina; 3) la unión de Vh a talina recluta vinculina a las FAs
II.4 Cultivo celular y dispositivo estirador de células vivas
78
mientras que Vt se une a F.actina y paxilina24; 4) el reclutamiento de esta proteína es
regulado por fuerzas mecánicas generadas en el exterior o en el interior de la célula25; 5)
células deficientes en vinculina presentan una migración defectuosa y ejercen fuerzas de
tracción menores26; 6) es un elemento molecular clave que permitiría el acople
mecánico entre las integrinas y el citoesqueleto27; 7) colocaliza con áreas de fuerzas con
valores altos durante la migración celular. Estos resultados sugerirían que existe una
relación entre el estímulo mecánico y el comportamiento de la vinculina en las
adhesiones focales.
En este contexto, tanto la zixina como la vinculina parecen estar involucradas en
la transducción de los estímulos mecánicos. Es por ello que pusimos especial interés en
el estudio de ambas. Por otra parte, la utilización del sensor de tensión basado en
vinculina nos proveyó una herramienta única para estudiar el estado mecánico de las
FAs.
En la Tabla II.2 se indican los plásmidos utilizados en todos los experimentos
de esta Tesis, que fueron generosamente cedidos por distintos laboratorios.
Proteína VFP Origen
zixina GFP Dr. D. Ingber
FAK GFP Dr. J.T. Parsons
paxilina GFP Dr. Tamada
paxilina mCherry Dr. E. Gratton
vinculina GFP Dr. B. Geiger
lifeACT (actina) mCherry Dr. A. Cáceres
Sensores de vinculina Venus-cerulean Dr. H. Grecco
Tabla II.2 Resumen de los plásmidos utilizados para las transfecciones realizadas en este trabajo de
Tesis. La primer columna indica la proteína de interés, la segunda las proteínas fluorescentes a las que
están unidas. La tercera columna menciona los grupos que generosamente nos cedieron las
construcciones.
II.4 Cultivo celular y dispositivo estirador de células vivas
79
II.4.5 Dispositivo estirador de células vivas en cultivo: diseño y calibración del
estiramiento
Para estudiar los cambios generados en las interacciones moleculares en células,
en respuesta a un estímulo mecánico externo global, utilizamos un estirador mecánico
de células. Modificamos el diseño de un dispositivo estirador de células28 para utilizarlo
en el microscopio confocal, para lo cual las piezas fueron torneadas en el taller del
Departamento de Física. El diseño del estirador se presenta en la Figura II.30.
Este dispositivo utiliza una membrana flexible de silicona (Silicone Sheeting
.005” NRV 40D Gloss/Gloss, Specialty Manufacturing, Inc.) cubierta con fibronectina
sobre la que se cultivan las células. Al estirar la membrana de silicona también se
estiran las células, en dirección radial.
Figura II.30 Estirador mecánico de células vivas en cultivo. Fotografías digitales que muestran las
distintas piezas que componen el dispositivo y el ensamblado del mismo.
Calibración del estiramiento
El primer paso para la utilización del estirador mecánico fue cuantificar el
estiramiento radial producido en cada vuelta de rosca dada. Para ello utilizamos
microesferas fluorescentes (marcadas con el fluoróforo Dragon Green, Bangs
Laboratories) y realizamos una calibración utilizando las distancias entre las
microesferas antes y después de cada vuelta de estiramiento. Seguimos los siguientes
pasos para la calibración:
- Marcamos con marcador la membrana de silicona con 5 cruces (dispuestas en forma
de cruz, separadas 7mm) para identificar las microesferas a medir.
II.4 Cultivo celular y dispositivo estirador de células vivas
80
- Dejamos por 20 minutos una solución de microesferas de 500nm de diámetro, Dragon
Green (excitación 480nm, emisión 520nm, Bangs Laboratory CP01F) recubiertas con la
proteína estreptavidina. Del stock comercial usamos una dilución 1:500000 (1/500k);
colocamos una gota de 50µl, dejamos por 20 minutos y luego retiramos y secamos con
nitrógeno.1
- Identificamos algunas microesferas y medimos las mismas distancias (tomadas en
diferentes direcciones) antes y después de cada vuelta de rosca del estirador.
Un ejemplo de estas mediciones de estiramiento tomadas con una lente objetivo
de magnificación 10X y apertura numérica (NA) 0.3 se muestra en la Figura II.31. En la
tabla se presentan los valores medidos de las distancias asignadas en el gráfico.
Figura II.31 Calibración del estirador mecánico. Imagen de microesferas fluorescentes sobre la
membrana de silicona, tomada con un objetivo 10X, que muestra en forma representativa la
caracterización del estirador mecánico: se seleccionan ciertas microesferas en la imagen y se cuantifican
todas las distancias marcadas, para compararlas con las distancias equivalentes después de realizar el
estiramiento mecánico.
1 Para probar concentración de microesferas, del stock comercial hicimos diluciones 1:500; 1:5k; 1:50k, 1:500k, 1:5M, una gota se depositó sobre un cubreobjetos y se observó en el microscopio de fluorescencia. La dilución elegida es la de 1/500k ó 1/5M.
x3
x2
x1
y2
y1
y3
dd1
dd2
dd3
da1 da2
da3
II.4 Cultivo celular y dispositivo estirador de células vivas
81
Las imágenes para la calibración fueron tomadas con dos lentes objetivos a
distintas magnificaciones (10X NA 0.3 y 40X NA 0.75) y se corroboró la linealidad del
estiramiento en ambos casos. En la Figura II.32A presento la curva de calibración
obtenida.
Figura II.32 Calibración del estirador mecánico. A Resultados de la fracción de estiramiento en
diferentes direcciones en función del número de vueltas. La línea representa el ajuste lineal, con una
pendiente de (0.05651 +/- 0.00068). B Análisis de la reversibilidad del estiramiento: a partir de la vuelta
número 7 se aflojó la membrana vuelta a vuelta, y se continuaron midiendo las mismas distancias.
Como puede verse la dependencia de la fracción de estiramiento con el número
de vueltas resultó lineal en todas las direcciones estudiadas, lo que corrobora que el
estiramiento del dispositivo diseñado es radial. Se encontró que el estiramiento radial es
de un (5.65± 0.07) % por cada vuelta.
Por otra parte, analizamos la reversibilidad del estiramiento midiendo las
mismas distancias al hacer el proceso inverso al estiramiento. Se obtuvo que la
respuesta no es lineal ni tampoco reproducible. En la Figura II.32B se presentan los
valores medios de las distancias para las dos acciones: estirar y aflojar.
-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
dist
anci
a es
tirad
a / d
ista
ncia
inic
ial
# vueltas
A
0 2 4 6 8 10 12 14
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5 B
dist
anci
a es
tirad
a/di
stan
cia
inic
ial
# vueltas
7 vueltas
II.4 Cultivo celular y dispositivo estirador de células vivas
82
II.4.6 Referencias
1 Humphreys R. C. and Rosen J. M., Cell Growth & Differentiation 8: 839 (1997); Merlo G.
R., Graus-Porta D., Cella N., Marte B. M., Taverna D., Hynes N. E., Eur J Cell Biol. 70: 97
(1996). 2 Richert M. M., Schwertfeger K. L., Ryder J. W., Anderson S. M., J Mammary Gland Biol
Neoplasia 5: 227 (2000). 3 Lipofectamine 2000 (http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/lipofectamine2000_man.pdf) 4 Wang N., Butler J.P., Ingber D.E.. Science, 260: 1124 (1993) 5 Zamir E., Geiger B., J. Cell Sci., 114: 3583 (2001). 6 Geiger B, Spatz J. P. and Bershadsky A. D., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 10: 21 (2009). 7 Guo, W. and Wang, Y. L., Mol. Biol. Cell 18: 4519 (2007); Ezratty E. J., Bertaux C.,
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Sheetz, M. P., Cell, 127: 1015 (2006). 13 Hu, K., Ji, L., Applegate, K. T., Danuser, G. and Waterman-Storer, C. M., Science, 315: 111
(2007). 14 Geiger B., Bershadsky A., Pankov R. and Yamada K. M., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2: 793
(2001). 15 Beckerle, M.C., Bioessays, 19: 949 (1997); Bershadsky, A.D., Balaban N.Q., and Geiger B..
Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 19: 677 (2003). 16 Drees, B., Friederich, E., Fradelizi, J., Louvard, D., Beckerle, M. C. and Golsteyn, R. M., J.
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M., Small J. V., Wehland J., Mol Biol Cell, 12: 3103 (2001); Lele T. P., Pendse J., Kumar S.,
Salanga M., Karavitis J., Ingber D. E., J Cell Physiol, 207: 187 (2006).
II.4 Cultivo celular y dispositivo estirador de células vivas
83
19 Fradelizi, J., V. Noireaux, J. Plastino, B. Menichi, D. Louvard, C. Sykes, R.M. Golsteyn, and E.
Friederich, Nat. Cell Biol., 3: 699 (2001); Yoshigi M., Hoffman L. M., Jensen C. C., Yost H. J.,
and Beckerle M. C., J. Cell Biol., 171: 209 (2005). 20 Drees B. E., Andrews K. M., Beckerle M. C., J Cell Biol , 147: 1549 (1999); Hoffman L. M.,
Jensen C. C., Kloeker S., Wang C. L. A, Yoshigi M., Beckerle M. C., J Cell Biol, 172: 771
(2006). 21 Cattaruzza M., Lattrich C. and Hecker M., Hypertension; 43: 726 (2004). 22 Bakolitsa C., Cohen D. M., Bankston L. A., Bobkov A. A., Cadwell G. W., Jennings
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(2008). 25 Galbraith, C. G., Yamada, K. M. & Sheetz, M. P., J. Cell Biol. 159: 695 (2002); Riveline D.,
Zamir E., Balaban N. Q., Schwarz U. S., Ishizaki T., Narumiya S., Kam Z., Geiger B.,
Bershadsky A. D., J. Cell Biol. 153: 1175 (2001). 26 Xu, W., Baribault, H.&Adamson, E. D., Development 125: 327 (1998); Alenghat F. J., Fabry
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H., Biophys. J. 94 : 661 (2008). 27 Hu, K., Ji, L., Applegate, K. T., Danuser, G. & Waterman-Storer, C. M., Science 315: 111
(2007). 28 Quaglino A., Salierno M., Pellegrotti J., Rubinstein N., and Kordon E. C, BMC Cell Biology
10: 1 (2009).
III. Microscopía de fuerza
atómica y espectroscopía de
fuerza avanzadas: visualización
y propiedades mecánicas.
Detección y localización de eventos
singulares de reconocimiento molecular.
Capítulo 1
Caracterización de un biosensor amperométrico-
enzimático basado en reconocimiento molecular
En este capítulo presento la caracterización de interacciones moleculares mediante el
estudio de un biosensor por Microscopía de Fuerza Atómica. El sistema de estudio es
una plataforma multiproteica ensamblada capa-por-capa, un biosensor amperométrico
enzimático de glucosa basado en reconocimiento molecular. Mediante el estudio de la
topografía de cada capa del biosensor durante el proceso de fabricación corroboramos
las interacciones moleculares entre las diferentes capas complementando otras técnicas.
1. Caracterización de un biosensor amperométrico-enzimático basado en reconocimiento molecular
89
1.1 Introducción
El desarrollo de interfaces bioelectrónicas, con una arquitectura supramolecular
composicional y topológicamente controlada, ha resultado de gran interés en el campo de la
bioelectrónica y el biosensado, un área que evoluciona día a día. En este capítulo se describe
el estudio de un biosensor de glucosa preparado mediante el ensamblado capa-por-capa sobre
un electrodo de oro teniendo en cuenta el reconocimiento molecular de glicoenzimas. El
diseño de esta arquitectura con interfaces multiproteicas está basado en las interacciones
supramoleculares multivalentes del tipo carbohidratos-lectinas entre glicoproteínas redox y
derivados de la proteína Concanavalina A (Con A).
Los experimentos descriptos en este capítulo fueron realizados en colaboración con el
grupo del Dr. Omar Azzaroni (INIFTA), en el que se diseñó el biosensor y se caracterizó por
diferentes técnicas: microbalanza de cuarzo con disipación (QCM-D), y técnicas
electroquímicas (EC).
Mediante Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) realizamos un estudio topológico/
estructural del biosensor diseñado que permitió, en combinación con resultados obtenidos
mediante otras técnicas, obtener información sobre las interacciones biomoleculares entre las
proteínas que se ensamblaron en cada capa. En el marco de esta Tesis, los experimentos
descriptos en este capítulo resultaron muy importantes como introducción a la microscopía y
su utilización en condiciones fisiológicas a través de un sistema sencillo.
1.2 Biosensor de glucosa capa-por-capa: fabricación y caracterización
La plataforma para construir los ensamblados supramoleculares fue obtenida a partir
de modificar láminas delgadas de oro con grupos manosa, siguiendo un protocolo descripto
por Willner y colaboradores para la inmovilización de Con A a través de interacciones
carbohidratos-lectinas1. Específicamente, se utilizaron Con A nativa o marcada con un
derivado de osmio como es el complejo [Os(bpy)2Clpy]2+ (Os-Con A) para dirigir, en un
proceso topológicamente controlado, el ensamblado de las proteínas: peroxidasa del rábano
(HRP) y la glucosa oxidasa (GOx). En esta configuración, la GOx es el elemento de
bioreconocimiento al estímulo de glucosa, mientras que la HRP es el elemento transductor de
la señal.
1. Caracterización de un biosensor amperométrico-enzimático basado en reconocimiento molecular
90
En la Figura 1.1 se presenta un esquema del ensamblado. El proceso de ensamblado
se realiza incubando el sustrato para cada capa en las soluciones de las diferentes moléculas,
por distintos tiempos. Partiendo de electrodos de oro manosilados (para lo que se trataron
primero con una solución de cistamina en etanol y luego se modificaron con una monocapa de
fenil α-D-manopiranósido), se autoensamblaron las capas sucesivas de: Con A redox-activa,
HRP, Con A y GOx, como se muestra en el esquema.
Figura 1.1. Esquema ilustrativo del sensor de glucosa capa-por-capa ensamblado por reconocimiento molecular.
La figura describe los bloques de construcción que participan en la generación de la señal bioelectrónica en
presencia de glucosa: Con A redox-activa, HRP, Con A y GOx. Tomado de 2.
En nuestro contexto experimental, cada bloque de construcción contribuye a una
función particular del ensamblado completo. GOx es el elemento de bioreconocimiento que
cataliza la transformación química del estímulo químico (la glucosa), HRP es el elemento
bioactivo transductor y Con A actúa como el puente biosupramolecular que une las capas
glicoproteicas. En esta arquitectura de interfaces la primera capa de lectinas (Os-Con A) es la
responsable de actuar no sólo como “pegamento biosupramolecular” para facilitar la unión
robusta de HRP sin afectar su actividad catalítica, sino también como una fase conductora de
electrones que permita la comunicación entre el grupo prostético de la enzima y el electrodo
sustrato. Por otro lado, el rol de la última capa de lectinas (Con A nativa) es solamente el de
ensamblar la HRP y la GOx muy próximas a través de uniones robustas, específicas y no
covalentes.
1. Caracterización de un biosensor amperométrico-enzimático basado en reconocimiento molecular
91
El grupo del Dr. Azzaroni caracterizó previamente la formación y funcionalidad del
biosensor mediante otras técnicas como microbalanza de cristal de cuarzo y técnicas
electroquímicas Por un lado, mediante microbalanza de cuarzo con monitoreo de disipación
(QCM-D) se siguió en tiempo real el crecimiento del ensamblado multicapas guiado por
reconocimiento molecular entre los sucesivos bloques de construcción. Los cambios
observados tanto en la frecuencia como en la disipación permitieron inferir las características
del ensamblado para demostrar que cada capa es eficientemente ligada a la estructura
supramolecular y que en la superficie del sensor no quedan proteínas unidas débilmente. Por
otro lado, utilizaron voltametría cíclica para estudiar la respuesta química bioelectrocatalítica
de los ensamblados supramoleculares de HRP/Con A/GOx formados en los electrodos de oro
modificados con la Con A redox-activa. Mediante esta técnica electroquímica verificaron
entonces la funcionalidad en cada capa como transductora de la señal de bioreconocimiento.
Observaron también que ensamblados supramoleculares análogos que contienen Con A nativa
(no electroactiva) no presentan actividad electrocatalítica, lo que corroboró que la capa de
Con A modificada con OsII/III actúa no sólo como una plataforma de bioafinidad para unir la
peroxidasa sino también como conductora conectando eléctricamente a los electrodos de oro.
Los resultados experimentales de esta caracterización previa exceden el marco de esta Tesis,
pero se detallan en el trabajo publicado por el grupo2.
Uso de capas bioensambladas de dextrano como barreras
La GOx en su forma reducida puede interactuar con el OsIII generado por la reacción
de la HRP, promoviendo una disminución temporaria en la magnitud de la señal
electroquímica catódica de la cadena biomimética completa. La presencia de de centros de Os
cercanos a la GOx introduce una ruta no deseada para la transducción electroquímica de las
transformaciones bioquímicas (Fig. 1.2 A), un escenario similar al ya descripto por otros
autores en electrodos bienzimáticos3. Es por esto que para una conversión óptima de la cadena
de señales biomiméticas es necesario desacoplar el proceso bioquímico que ocurre en la
región externa del ensamblado (oxidación de la glucosa en presencia de GOx y O2 fisiológico)
de la transferencia de electrones en presencia de HRP en las primeras capas del bioconjugado.
Con este fin, se exploró el uso de dextrano como una intercapa permeable que permite la
separación física de los centros de Os unidos a la primer capa de Con A de la capa de GOx
1. Caracterización de un biosensor amperométrico-enzimático basado en reconocimiento molecular
92
ensamblada al final del film multiprotecio. El dextrano es un polisacárido que se une
específicamente a la Con A4.
Figura 1.2. Esquema de los dos posibles escenarios en que se transduce la señal biomimética. A La presencia de
GOx en su forma reducida puede reaccionar con sitios de OsIII vecinos generados a través de la reacción de la
HRP. Esta configuración interfacial puede promover una disminución temporaria en la magnitud de la señal
catódica proveniente de la cadena de señales biomiméticas debido a rutas de transducción no deseadas. B Una
conversión cuantitativa óptima de la cadena de señales biomiméticas en una señal eléctrica implica la oxidación
de la glucosa en presencia de GOx y O2 fisiológico sin la interferencia de los grupos OsIII vecinos. Ésto se logra
usando capas bioensambladas de dextrano como barreras físicas que separan los centros redox de Os de los sitios
cofactores de FAD en la capa de GOx sin dificultar la difusión libre de H2O2 en las capas anteriores de HRP.
Las mediciones crono-ampreométricas previas evidenciaron que la presencia de
dextrano permite una respuesta a la glucosa mejor definida y más estable. Aunque el dextrano
no tenga asignado un rol activo en el ensamblado, su función como componente estructural es
decisiva para optimizar la respuesta eléctrica y la sensibilidad de la cadena de señales
biomiméticas. Esto implicaría que el ensamblado dirigido por reconocimiento de dextrano en
sitios expuestos de la capa de Os-Con A llenaría los espacios de la arquitectura HRP/Os-Con
A y consecuentemente ayudaría a separar les centros redox de Os de los sitos cofactores de la
coenzima FAD en la capa de GOx sin interponerse a la difusión libre de H2O2 en las capas
interiores de el ensamblado (Fig. 1.2 B).
1. Caracterización de un biosensor amperométrico-enzimático basado en reconocimiento molecular
93
1.3 Caracterización de la topografía de cada capa del ensamblado mediante Microscopía
de Fuerza Atómica
La Microscopía de Fuerza Atómica resulta para este sistema en estudio una técnica
ideal para complementar las técnicas de caracterización mencionadas, dado que nos permite
visualizar la topografía y la estructura de cada capa del ensamblado multiproteico. En este
sentido, se tomaron imágenes de la superficie del ensamblado en cada paso de modificación,
partiendo del sustrato de oro (en este caso utilizamos oro Robax). Las imágenes fueron
tomadas con el AFM Multimode descripto en la sección II.1, en modo de contacto
intermitenete (tapping mode) y en condiciones fisiológicas, utilizando como medio la
solución buffer PBS con CaCl2 (0.5 mM) y MgCl2 (0.5 mM).
Las características estructurales del ensamblado molecular se evidencian claramente
con esta técnica in situ. En la Figura 1.3 presento los resultados para una secuencia del
ensamblado multiproteico.
Figura 1.3 Imágenes AFM en 3 dimensiones (1 x 1 µm2, rotación: 45°) y secciones tomadas en la zona central
de cada una, tomadas in situ en cada paso del ensamblado multiproteico: oro desnudo (A), oro manosilado (B),
Au/Os-Con A (C), Au/Os-Con A/HRP (D), Au/Os-Con A/HRP/Con A (E), Au/Os-Con A/HRP/Con A/GOx (F).
Resulta claro en las imágenes que el ensamblado consecutivo de proteínas provoca
cambios en la topografía del bioconjugado. En la primera capa del ensamblado la superficie se
A B C
D E F
1. Caracterización de un biosensor amperométrico-enzimático basado en reconocimiento molecular
94
asemeja a la del oro desnudo, indicando que la adsorción de la manosa sigue la topografía del
oro, a nivel prácticamente atómico. Sin embargo, con el ensamblado de Con A y HRP la
topografía se nivela. Esto se evidencia también en la densidad de potencia espectral (Figura
1.4), en la que puede verse que la frecuencia espacial predominante del sustrato de oro
(relacionada al tamaño de los granos) se pierde en la primera capa proteica (Os-Con A).
Figura 1.4 Densidad de potencia espectral (PSD) de las imágenes de AFM, después de emplear un filtro pasa
altos. De arriba hacia abajo, desde el oro desnudo, cisteína-manosa, Os-Con A, HRP, Con A, GOx. En la primer
capa se mantiene la frecuencia espacial predominante del oro (de alrededor de 40 nm), mientras que a partir de la
primer capa de Con A las características del espectro cambian.
1. Caracterización de un biosensor amperométrico-enzimático basado en reconocimiento molecular
95
Exploramos también la hipótesis del uso de dextrano como bloque estructural
registrando mediante AFM in situ la topografía de un ensamblado multicapas intercalando la
capa de dextrano. En la Figura 1.5 presento las imágenes de las superficies de los
ensamblados a partir de la capa de dextrano: Os-Con A/HRP/dextrano, Os-Con
A/HRP/dextrano/Con A y Os-Con A/HRP/dextrano/Con A/GOx.
Figura 1.5 Imágenes de AFM en 3 dimensiones (1 x 1 µm2, rotación: 45°) y secciones tomadas en la
zona central de cada una, tomadas in situ en los capas del ensamblado multiproteico a partir de una
capa de dextrano: Au/Os-Con A/HRP/dextrano (A), Au/Os-Con A/HRP/dextrano/Con A (B), Au/Os-
Con A/HRP/dextrano/Con A/GOx (C).
Las imágenes topográficas del ensamblado biosupramolecular revelan también
cambios en la rugosidad durante el crecimiento de las capas. Así como la PSD presentó
cambios a partir de la primera capa proteica, la adición secuencial de Os-Con A y HRP se vio
también reflejada como una disminución en la rugosidad (RMS) del film (Tabla 1.1).
Es interesante notar además las diferencias en la segunda capa de Con A en films en
los que se intercaló el bloque estructural de dextrano. La primera, una proteína globular de
104 kDa, promueve un incremento en la rugosidad de la superficie; mientras que la adición de
dextrano, un polímero ramificado, no produce cambios apreciables. Este comportamiento
puede ser entendido considerando al dextrano como un componente de arquitectura
polimérica flexible que puede llenar los espacios libres que deja la peroxidasa. Trabajos
recientes de Venturoli y Rippe5 basados en un análisis comparativo entre dextrano y proteínas
globulares revelaron que, mientras las proteínas globulares parecen comportarse de manera
similar a esferas rígidas hidratadas, el dextrano se comporta como una hebra flexible. Las
mediciones de AFM in situ refuerzan la hipótesis de que la intercalación de dextrano optimiza
A B C
1. Caracterización de un biosensor amperométrico-enzimático basado en reconocimiento molecular
96
las características estructurales del complejo biosupramolecular. El ensamblado de dextrano
en sitios de reconocimiento expuestos de la bicapa inicial de Os-Con A/HRP llevaría
entonces, no sólo a una capa posterior de Con A más compacta y homogénea sino que
también facilitaría el llenado de los espacios propios de la bicapa Os-Con A/HRP. Como
resultado, la presencia de una intercapa de dextrano impide físicamente la comunicación
electrónica entre los centros redox y los sitios de FAD en la proteína GOx, sin dejar de ser
una barrera permeable que posibilita la difusión libre de H2O2 a las capas iniciales de Os-Con
A/HRP.
Capa
Rugosidad [nm]
superficie de Au evaporado 2.8 ± 0.1
electrodo de Au manosilado 2.9 ± 0.1
Au/Os-Con A 2.5 ± 0.1
Au/Os-Con A/ HRP 2.0 ± 0.1
Au/Os-Con A/HRP/Con A 2.5 ± 0.3
Au/Os-Con A/HRP/Con A/GOx 3.9 ± 1.4
Au/Os-Con A/HRP/dextrano 2.0 ± 0.7
Au/Os-Con A/HRP/dextrano/Con A 2.2 ± 1.0
Au/Os-Con A/HRP/dextrano/Con A/GOx. 3.4 ± 1.0
Tabla 1.1. Valores de la rugosidad (RMS) de capas proteicas ensambladas sobre un electrodo de oro
por AFM.
1.4 Conclusiones
En este experimento se estudió un biosensor de glucosa construido mediante el
ensamblado capa-por-capa de glicoenzimas sobre un electrodo de oro, ensamblado basado en
el reconocimiento molecular. El diseño de esta arquitectura interfacial multiproteica está
basado en las interacciones supramoleculares multivalentes carbohidratos-lectinas entre
glicoproteínas redox y derivados de la proteína Concanavalina A (Con A). Específicamente,
se utilizaron Con A nativa o marcada con el complejo [Os(bpy)2Clpy]2+ (Os-Con A) para
dirigir el ensamblado de la peroxidasa del rábano (HRP) y de la glucosa oxidasa (GOx), en un
proceso topológicamente controlado. En esta configuración, la GOx es el elemento de
1. Caracterización de un biosensor amperométrico-enzimático basado en reconocimiento molecular
97
bioreconocimiento al estímulo de glucosa, mientras que la HRP es el elemento transductor de
la señal.
Mediante Microscopía de Fuerza Atómica se estudió la topografía de la superficie de
cada capa del ensamblado, calculando su rugosidad (RMS) y haciendo un análisis espectral
(densidad de potencia espectral). A través de estos estudios pudimos inferir que la
incorporación de una capa de dextrano luego de la primera capa de Os-ConA/HRP produce
films menos rugosos, lo que implica un mejor cubrimiento de las capas posteriores. Esto
concuerda con los resultados previos obtenidos por microbalanza de cuarzo con disipación y
técnicas de electroquímica.
Estos resultados demuestran que la AFM es una herramienta versátil, que permite
caracterizar un sistema en condiciones fisiológicas. A través del estudio de la topografía y el
análisis espectral y de la rugosidad de cada capa, se obtuvo información sobre el
funcionamiento general de un biosensor y las interacciones biomoleculares entre las proteínas
que se ensamblaron cada a capa.
1.5 Referencias
1 Willner, I.; Rubin, S.; Cohen, Y. J. Am. Chem. Soc. 115: 4937 (1993). 2 Pallarola D., von Bildering C., Pietrasanta L. I., Queralto N., Knoll W., Battaglini F. and Azzaroni
O., Phys Chem Chem Phys, 14: 11027 (2012). 3 Corton, E.; Battaglini, F.; J. Electroanal. Chem., 511: 8 (2001); Maidan, R.; Heller, A. Anal.Chem.
64: 2889 (1992);) Ohara, T.J.; Vreeke, M.S., Battaglini, F.; Heller, A.; Electroanalysis, 5: 825
(1993). 4 Goldstein, I.J.; Hollerman, C.E.; Merrick, J.M., Biochim. Biophys. Acta, 97: 68 (1965); Ballerstadt,
R.; Schultz, J.S., Sensors Actuators B, 46: 50 (1998); Yin, R.; Han, J.; Zhang, J. ; Nie, J., Colloids
Surf. B: Biointerfaces 76: 483 (2010). 5 Venturoli, D.; Rippe, B., Am J Physiol Renal Physiol 288: F605 (2005).
Capítulo 2
Medición de fuerzas de interacción moleculares
mediante Microscopía de Fuerza Atómica
Dada su sensibilidad tanto en la localización (nm) como en la medición de fuerzas (pN),
el Microscopio de Fuerza Atómica resulta una herramienta muy poderosa para estudiar
las fuerzas y la dinámica de las interacciones entre ligandos y receptores individuales,
ya sea de moléculas aisladas o en la superficie de una célula. La Microscopía de
Reconocimiento Molecular permite medir fuerzas específicas de interacción entre
ligandos y receptores a nivel de moléculas individuales. Durante mi trabajo de Tesis,
puse a punto la técnica con sistemas ya estudiados en la literatura con el objetivo final
de medir la interacción entre el receptor de integrina y su ligando, la fibronectina,
relacionados con el proceso de mecanotransducción celular. En este capítulo presento
los resultados que permitieron validar la medición de fuerzas de interacción moleculares
utilizando el Microscopio de Fuerza Atómica. Se estudiaron las fuerzas de interacción
entre grupos funcionales químicos y entre el par ligando receptor biotina-estreptavidina,
sistemas muy bien caracterizados en la literatura. Se caracterizó en células vivas la
interacción RGD-integrina.
2. Medición de fuerzas de interacción moleculares mediante AFM
101
2.1 Introducción
Los estudios de reconocimiento molecular buscan entender las interacciones
específicas entre receptores y sus respectivos ligandos. Aunque en la actualidad se
conocen en general la estructura y función de los complejos ligando-receptor, todavía
no es posible predecir la cinética de la reacción o su correspondiente energía para todos
los complejos. Es necesario obtener información adicional, en particular sobre la
dinámica molecular (MD) del complejo durante los procesos de asociación y
disociación. El objetivo final es el de sensar el paisaje energético relativo a la
interacción entre las moléculas, cuya estructura se conoce con resolución atómica.
Los complejos ligando-receptor se forman en general por algunas pocas uniones
débiles no covalentes entre grupos químicos en contacto en determinadas regiones
complementarias de ambas moléculas, provistas por un entorno de residuos que proveen
un andamiaje estructuralmente conservado. Tanto estas regiones complementarias como
el entorno poseen una considerable plasticidad y flexibilidad, permitiendo movimientos
conformacionales durante la asociación y disociación. Además de la información sobre
la estructura, la energía y las constantes cinéticas, para entender el proceso de
reconocimiento se requiere también un entendimiento de estos movimientos. Un
profundo conocimiento de la naturaleza de estos movimientos, así como de la acción
espacio-temporal de muchas interacciones débiles, en particular la cooperatividad de la
formación de uniones, es la clave para entender el reconocimiento molecular entre
ligandos y receptores. Para ello, se requieren experimentos a nivel de moléculas
individuales, en las escalas de tiempo típicas de la formación y disociación de los
complejos. El potencial del AFM para medir fuerzas muy pequeñas con una alta
resolución lateral ha abierto la posibilidad de desarrollar una microscopía de fuerzas de
reconocimiento de moléculas individuales1.
La medición de fuerzas de interacción entre moléculas mediante AFM, como se
mencionó en la sección II.1, requiere no sólo de la modificación química de los sensores
de fuerza con el ligando de interés sino también de una muestra donde el receptor esté
unido al sustrato de manera que al realizar el ciclo de acercamiento-retracción se rompa
primero la unión molecular que se desea sensar. Si bien el Centro de Microscopías
Avanzadas es pionero en el país en la utilización de la Microscopía de Fuerza Atómica
para el estudio de las propiedades estructurales y funcionales de moléculas
individuales2, complejos de ADN y proteínas3 y biomateriales4, no se habían realizado
2. Medición de fuerzas de interacción moleculares mediante AFM
102
hasta esta Tesis mediciones de fuerzas de interacción, por lo que la técnica se puso a
punto utilizando sistemas ya caracterizados en la literatura.
Dado que este tipo de mediciones involucra una cantidad de pasos, tanto de
modificación del sustrato como de la punta sensora5, se comenzó estudiando la fuerza
de interacción entre grupos químicos utilizando la estrategia de modificación más
sencilla tanto para la punta como para los sustratos: el sistema oro-alcanotioles. Luego
se validó la medición de interacciones ligando-receptor a nivel de moléculas
individuales mediante el sistema modelo biotina-estreptavidina. Por último se estudió la
interacción fibronectina-integrina en células vivas modificando el sensor de fuerza con
el tripéptido RGD unido a una cisteína (cuyo terminal tiol se une al sensor recubierto de
oro). En las siguientes secciones describo los resultados obtenidos para los tres
sistemas.
2.2 Microscopía de Reconocimiento Químico: interacciones CH3-CH3 y COOH-
COOH
2.2.1 Antecedentes
A partir de la creación del Microscopio de Fuerza Atómica a finales de los '806,
no tardaron en realizarse las primeras mediciones de fuerzas de interacción moleculares.
Los primeros sistemas estudiados fueron grupos funcionales químicos7, siendo el grupo
del Dr. Lieber el pionero en este tipo de mediciones8. Se estudiaron a partir de los
primeros trabajos interacciones entre diversos grupos funcionales químicos, obteniendo
fuerzas de adhesión entre puntas puntas y sustratos funcionalizados con monocapas
autoensambladas (SAMs) de tioles terminados en los grupos funcionales CF3, CH3,
OCH3, CH2Br, OH, COOH, COCH3, CONH2 y NH2, tanto en solventes orgánicos9
como acuosos10 e incluso en una atmósfera de gas inerte11. En la tabla III.2 se presenta
un resumen de las fuerzas de interacción obtenidas en medios líquidos, donde se
observa que las interacciones son del orden de algunos nN.
2. Medición de fuerzas de interacción moleculares mediante AFM
103
Tabla 2.1. Resumen de las fuerzas de interacción entre grupos químicos. Tomado de 8
2.2.2 Modificación de sensores de fuerza y sustratos mediante alcanotioles
Para validar la medición de interacciones entre grupos funcionales químicos,
utilizamos como estrategia SAMs de alcanotioles en sustratos de oro y en las puntas
sensoras recubiertas de oro. Los tioles utilizados fueron dodecanotiol (DODE) en cuyo
extremo libre tiene un grupo metilo, y ácido 11-mercaptoundecanoico (MUA) cuyo
extremo libre cuenta con el grupo funcional carboxilo, dado que las interacciones
metilo-metilo y carboxilo-carboxilo están muy bien caracterizadas en la literatura9. En
la Figura 2.1 se presenta la fórmula química de ambas moléculas.
Como sustrato se utilizaron muestras comerciales de oro Robax (sustratos de
vidrio con una capa evaporada de cromo y otra sucesiva de oro). Como sensores de
fuerza se utilizó el modelo biolevers (Asylum Research, Santa Barbara, EEUU),
especialmente diseñados para este tipo de mediciones dada su baja constante elástica
(del orden de 0.0003 N/m) y su recubrimiento de oro en la parte posterior (es decir, en
la punta). Se utilizaron también sensores NP (Bruker, Santa Barbara, EEUU) de
constante elástica de aproximadamente 0.003 N/m, recubiertos con una capa de oro por
2. Medición de fuerzas de interacción moleculares mediante AFM
104
sputtering durante 50 segundos (utilizando la máquina de sputtering Kurt J. Lester 108,
sala de muestras del Departamento de Física-FCEN-UBA).
Dodecanotiol
Ácido 11-mercaptoundecanoico
Figura 2.1. Fórmula química de los alcanotioles utilizados para Microscopía de Reconocimiento
Químico. A. Dodecanotiol (DODE), es una cadena de doce carbonos que, además del grupo terminal tiol
(SH), en su otro extremo tiene un grupo funcional metilo (CH3). B. Ácido 11-mercaptoundecanoico
(MUA), tiene 11 carbonos, el extremo tiol (SH) y un grupo carboxilo en su otro terminal (COOH).
La modificación tanto de los sustratos como de las puntas se realizó por
inmersión durante 18 hs en una solución 1mM de cada uno de los tioles en etanol
(EtOH). Una vez pasado el tiempo de incubación, se les realizaron 5 enjuagues con
EtOH y se secaron con nitrógeno.
Las constantes elásticas de los sensores de fuerza fueron calibradas
inmediatamente antes de su modificación, asumiendo que no se producen cambios en la
misma luego de la modificación con la monocapa autoensamblada. En el caso de los
sensores que fueron recubiertos con oro para su funcionalización, la calibración se
realizó posteriormente a su recubrimiento y antes de la inmersión en la solución de
alcanotioles.
2.2.3 Visualización de patrones por fricción
Para analizar el ensamblado de las monocapas de tioles se realizaron, mediante
dos diferentes metodologías, patrones que fueron caracterizados por microscopía de
fuerza atómica. En la Figura 2.2 se presenta un esquema de las dos estrategias usadas
para generar patrones de tioles en oro: litografía por luz UV y litografía por haz de
electrones (EBL).
2. Medición de fuerzas de interacción moleculares mediante AFM
105
Figura 2.2. Esquemas de fabricación de patrones de monocapas autoensambladas de tioles. A.
Litografía por luz UV a través de una grilla TEM. B. Litografía por haz de electrones (EBL).
La primera estrategia consistió en una litografía con luz UV a través de una
grilla con estructuras hexagonales (grillas utilizadas para Microscopía Electrónica de
Transmisión)*. La luz UV desprendería los tioles de la superficie, por lo que quedaría
un patrón de tioles donde la muestra no fue expuesta a la radiación UV. En la Figura
2.3 presento imágenes de AFM en modo contacto, con la punta modificada con DODE
del patrón hexagonal de DODE sobre oro, realizado mediante litografía UV.
Figura 2.3. Patrones litografía UV. Imágenes de AFM en modo contacto, con punta modificada con
DODE, de altura (izquierda, rango 0-60 nm) y fricción (derecha, unidades arbitrarias) de patrón
hexagonal de DODE sobre oro, realizado mediante iluminación UV a través de una grilla TEM.
* Las muestras por litografía óptica fueron realizadas por la Dra. Cecilia dos
Santos Claro como parte de una colaboración con la Dra. María Elena Vela (INIFTA,
La Plata).
Au
Monocapa de alcanotioles
autoensamblados (SAM)
Radiación UV
Au
EBL SAM
2. Medición de fuerzas de interacción moleculares mediante AFM
106
En este caso la estructura del patrón puede verse en la imagen de fricción (o
deflexión lateral), lo cual indica que hay una interacción entra la punta y la muestra que
no es sensada en la topografía.
La segunda estrategia fue la litografía por haz de electrones, utilizando un
microscopio electrónico de barrido por emisión de campo (Carl Zeiss, modelo
SUPRA40 y sistema generador de patrones NPGS) del CMA†. La ventaja de esta
litografía respecto de la litografía óptica es que pueden realizarse patrones con
estructuras de tamaños del orden de los nanómetros. En este caso se dibujó un patrón
con estructuras geométricas de algunos micrones sobre un sustrato de oro modificado
con MUA. En las imágenes AFM (Figura 2.4) puede verse que en esta muestra se logra
ver la estructura en la topografía, además del contraste esperado en la señal de fricción.
Figura 2.4 Patrones EBL. Imágenes de AFM en contacto, punta modificada con MUA, correspondientes
a altura (izquierda, rango 0-30 nm) y fricción (derecha, unidades arbitrarias) de patrón de MUA sobre oro,
realizado mediante litografía electrónica.
2.2.4 Fuerzas de interacción
Utilizando las puntas y sustratos modificados con las monocapas
autoensambladas de DODE y MUA, caracterizamos entonces las fuerzas de interacción
entre los grupos funcionales metilo-metilo y carboxilo-carboxilo. Se realizaron cientos
de curvas de fuerza para cada sistema, y se obtuvo una distribución de fuerzas cuyo
† Las litografías por haz de electrones fueron realizadas por la Dra. Claudia
Marchi, en el Centro de Microscopías Avanzadas.
2. Medición de fuerzas de interacción moleculares mediante AFM
107
valor medio se encuentra en los valores reportados en la literatura para estos sistemas en
la solución utilizada (50% H2O, 50% EtOH). El estudio se realizó tanto con los sensores
de fuerza comerciales ya recubiertos de oro (biolevers), como con los sensores
tradicionales de nitruro de silicio (NP) recubiertos con oro por sputtering, obteniendo
resultados similares en ambos casos.
En la Figura 2.5 muestro algunas de las curvas de fuerza obtenidas y la
estadística para la interacción CH3-CH3 (DODE-DODE), con los dos tipos de sensores
utilizados. Se realizó además el control con el sensor modificado pero sobre un sustrato
de oro desnudo, observándose un valor medio de interacción diferente, debido a la
adhesión inespecífica entre la punta y el sustrato.
Figura 2.5. Interacción metilo-metilo. A. Curva de fuerza típica de la interacción metilo-metilo, medida
con sensor de fuerza y sustrato modificados con dodecanotiol (DODE). B. Histograma de fuerzas de
interacción DODE-DODE (en solución 50 % H20 y 50% EtOH, velocidad de la punta sensora 300
nm/seg) medida con un sensor de fuerza NP (Bruker) recubierto de oro por sputtering (constante elástica
k = 0.036 ± 0.006 N/m). C,D. Histogramas de fuerzas de interacción entre un sensor de fuerza biolever
(Asylum Research, constante elástica k = 0.0031 ± 0.0003 N/m) modificado con DODE y un sustrato
modificado con el mismo tiol (C) o un sustrato de oro desnudo (d), ambas medidas en solución 50 % H2O
y 50% EtOH, velocidad de retracción de 300 nm/seg. En todos los histogramas se presenta el valor medio
de la fuerza de interacción y su desviación estándar.
2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 3.00
20
40
60
80
DODE (biolever)F = (2.81 ±0.08) nN
Cue
ntas
Fuerza (nN)
1.5 2.0 2.5 3.0 3.50
20
40
60
80
100DODE (np tip)F = (2.79 ± 0.44) nN
Cue
ntas
Fuerza (nN)
0.3 0.4 0.5 0.6 0.70
20
40
60
80
100
Au (biolever)F = (0.58 ±0.04) nN
Cue
ntas
Fuerza (nN)
0 200 400 600 800 1000-4
-3
-2
-1
0
1
Fue
rza
(nN
)
extension (nm)
A B
C D
2. Medición de fuerzas de interacción moleculares mediante AFM
108
En la Figura 2.6 presento la comparación entre las fuerzas de interacción
metilo-metilo y carboxilo-carboxilo. Los valores medios de fuerzas de interacción
obtenidos fueron (2.81 ± 0.08 nN) para metilo-metilo y (0.28 ± 0.06) nN para carboxilo-
carboxilo en estas condiciones. Para los sensores NP se obtuvieron resultados similares.
Teniendo en cuenta el solvente en el que fueron realizadas las mediciones (50% H2O,
50% EtOH) la fuerza característica obtenida para estas interacciones está en el orden de
las informadas en la literatura6-8.
Figura 2.6 Interacción entre grupos funcionales químicos. a Histograma de fuerzas de interacción
CH3-CH3 (A, DODE-DODE) y COOH-COOH (B, MUA-MUA). Medidos con sensores de fuerza
biolevers, en solución 50 % H20 y 50% EtOH, velocidad de retracción de 300 nm/seg. Se muestra en
ambos casos el esquema de modificación química punta sensora-sustrato.
2.3 Microscopía de Reconocimiento Molecular: interacción del complejo biotina-
estreptavidina
2.3.1 Antecedentes
El sistema biotina-avidina es reconocido como el modelo por excelencia de
ligando-receptor dada su altísima afinidad (KD = 10-13
M) y su largo tiempo de vida de
unión (�(0) = 80 días). Es por eso que no es sorprendente que las primeras mediciones
de reconocimiento molecular a nivel de moléculas individuales se hayan realizado con
biotina y sus ligandos estreptavidina (StA, proveniente de Streptomyces Avidinii) y
avidina (presente en la clara del huevo). En el año 1994 se publicaron los primeros
trabajos realizados por el grupo del Dr. Gaub12 en los que, no obstante los métodos para
modificar la punta sensora y el sustrato eran muy sencillos, ya se podían detectar las
interacciones de moléculas individuales, y se empezaba a obtener información acerca de
A B
2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 3.00
20
40
60
80DODE-DODEF
max = 2.81 ±0.08 nN
cuen
tas
Fuerza (nN)0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
0
10
20
30
40
cuen
tas
Fuerza (nN)
MUA-MUAF=0.28 ± 0.06 nN
2. Medición de fuerzas de interacción moleculares mediante AFM
109
la cinética y el paisaje energético de la interacción de los complejos al nivel de la que se
obtiene actualmente. En todos estos años de desarrollo de la MRM, en lo que más se ha
puesto énfasis es en las metodologías para modificar la punta, de manera de aumentar la
probabilidad de interacción entre ligando y receptor en un ciclo de fuerza. En este
sentido, en los comienzos se modificaba la punta directamente con las moléculas, y para
aumentar la probabilidad de que se produzca la unión del complejo se utilizaba como
sustrato una perla de agarosa a la que se unían los receptores. La geometría y elasticidad
de la perla hacían que fuera más probable la unión. En la Figura 2.7.A se muestra el
esquema de este tipo de sistemas. Actualmente el aumento en la probabilidad de que se
produzca la interacción ligando receptor se logra modificando las puntas a través de
espaciadores flexibles (Figura 2.7.B), como se mencionó en la sección II.1.6. Más allá
de algunas características que ya suelen ser comunes, como el uso de espaciadores, el
sistema biotina-estreptavidina sigue siendo el modelo utilizado para probar cualquier
cambio sugerido en las estrategias de los experimentos de MRM. Es por eso de esencial
interés caracterizarlo, y en el caso particular de este trabajo de Tesis fue utilizado para
validar la medición de fuerzas de interacción ligando-receptor con el microscopio de
fuerza atómica disponible en el laboratorio.
En la Figura 2.7.C se muestran los histogramas de fuerzas de interacción entre
biotina-estreptavidina medida a diferentes tasas de carga. Puede verse que la fuerza de
media de ruptura aumenta con la tasa de carga, estando los valores característicos
obtenidos en un rango entre 100 y 200 pN.
Figura 2.7 Antecedentes en el estudio de la interacción biotina-estreptavidina. A,B Esquemas de
modificación de sensores de fuerza: estrategia de los trabajos pioneros del grupo del Dr. Gaub (A) y
estrategias de modificación actuales (B). C. Histogramas de fuerzas de interacción biotina-estreptavidina
para diferentes tasas de carga. Adaptados de la referencia1.
A B C
2. Medición de fuerzas de interacción moleculares mediante AFM
110
2.3.2 Modificación de sensores de fuerza y sustratos
Para medir la interacción entre estas moléculas, la punta del sensor de fuerza de
Si3N4 está funcionalizada con biotina, y se garantiza la máxima libertad de movimiento
posible del ligando (i.e. mayor probabilidad de interacción) si la funcionalización es a
través del adaptador flexible PEG13 (polietilenglicol). El sensor de fuerza modificado
utilizado en estos experimentos es comercial (NovaScan Techonologies, Ames, EEUU).
Para poder medir con precisión la fuerza de interacción entre las moléculas es
necesario que la StA esté unida al sustrato de tal forma que la interacción con el mismo
sea mayor a la interacción a medir. Además, debe estar orientada de manera de exponer
el sitio de unión para el ligando. En estos experimentos usamos como sustrato oro
Robax comercial, y para unir la StA seguimos dos estrategias:
1. Incubar el sustrato de oro 18 hs en solución de 1:9 de 11-mercapto-1-
undecanol (Sigma-Aldrich) y tiol biotinilado 14, enjuagar y secar con nitrógeno.
Incubar 1 h. en solución de StA.
2. Incubar el sustrato de oro 18 hs en solución de tiol DTSP (ácido 3,3�-
ditiodipropiónico di(N-hidroxisuccinimidil éster), de Sigma-Aldrich), enjuagar y
secar con nitrógeno. Incubar 1 h. en solución de StA.
Figura 2.8 Sistema biotina-estreptavidina: sustratos. A Esquema de modificación del sustrato con StA
mediada por una proporción 1:9 de tiol biotinilado y mercapto-undecanol. B Esquema de modificación
del sustrato con StA mediada por DTSP. Adaptadas de 11.
A B
2. Medición de fuerzas de interacción moleculares mediante AFM
111
En la Fig. 2.8 muestro un esquema de la funcionalización de sustratos mediante
estas dos estrategias. La primera fue realizada siguiendo exactamente el protocolo del
Dr. Azzaroni15 mientras que la segunda es una adaptación de la estrategia utilizada por
Casero et al. para modificar sustratos de oro con otra proteína (la lactato oxidasa)15.
2.3.3 Fuerzas de interacción
Utilizando los sensores de fuerza biotinilados a través de PEG (Novascan) y
sustratos de oro modificados con estreptavidina a través de dos tipos de tioles - tiol
biotinilado y DTSP- medimos entonces la interacción entre las moléculas biotina y
estreptavidina en el AFM en el modo de contacto en solución. En la Figura 2.9 A
presento curvas de fuerza características de eventos de interacción, obtenidas en
muestras modificadas a través del tiol DTSP. Se puede ver que las curvas en los valores
de posición anteriores a la ruptura (indicado con flechas) presentan la forma
característica del estiramiento del adaptador flexible PEG.
Figura 2.9. Interacción biotina-estreptavidina. A. Curvas de fuerza (se muestra sólo la parte de
retracción, y las curvas están corridas para su mejor visualización). B. Histograma de fuerzas obtenido de
la interacción biotina-StA obtenida sobre sustrato de oro modificado con StA a través de tiol biotinilado.
c. Histograma de fuerzas para la interacción biotina-StA obtenidas sobre sustrato de oro modificado con
StA mediante el tio DTSP. Se indica el error estándar y la desviación (SD) de cada uno de los valores
característicos de fuerza encontrados.
0 100 200 300 400 5000
50
100
150
cuen
tas
Fuerza (pN)
tiol biotiniladoF
max= (172 ± 2) pN
SD = 79 pN
0 100 200 300 400 5000
50
100
150
cuen
tas
Fuerza (pN)
tiol DTSP F
max= (152 ± 2) pN
SD = 70 pN
50 100 150 200 250 300-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
Fue
rza
(nN
)
Extension (nm)
A B
C
2. Medición de fuerzas de interacción moleculares mediante AFM
112
En la Figura 2.9 B y C muestro los histogramas de fuerza obtenidos para la
interacción biotina-StA mediante las dos estrategias de funcionalización de los
sustratos, medidos con sensores de constante elástica del orden de 0.05 N/m y a una
velocidad de retracción de 1µm/s. Las mediciones se realizaron en buffer PBS. Los
valores obtenidos concuerdan con los informados en la literatura a esta velocidad de
retracción, y demuestran que podemos medir interacciones del orden de los pN.
2.4 Interacción RGD-integrina
2.4.1 Antecedentes en el estudio de la interacción fibronectina-integrina
Aún después de todos estos años de desarrollo de la microscopía de
reconocimiento, todavía hay muy pocos trabajos en los que se aplica la microscopía de
reconocimiento molecular en células vivas. Sin embargo, el sistema fibronectina-
integrina fue uno de los primeros estudiados. En uno de los trabajos pioneros de la
técnica, Lehenkari y colaboradores16 , estudiaron las fuerzas de interacción entre los
receptores de integrina en osteoclastos y diversos ligandos que involucraban tres
residuos aminoacídicos, arginina-glicina-ácido aspártico (RGD), el sitio de unión a
integrina (Figura 2.10 B) En otro de los primeros estudios, Chen y colaboradores17
usaron AFM para medir la interacción entre Concanavalina A (Con A) unida a la punta
de un sensor de fuerza y receptores de Con A en la membrana de fibroblastos NIH3T3
(Figura 2.10 A).
La dificultad de este tipo de ensayos en células vivas radica en que al realizar un
ciclo de fuerza, la punta sensora indenta la célula, produciendo curvas no lineales con
una mayor dificultad en la interpretación. En general los trabajos que miden
interacciones en células estudian sistemas antígeno-anticuerpo18, de fuerzas de
interacción de mayor magnitud, que inclusive pueden sensarse en células fijadas
químicamente 19. El grupo del Dr. Dufrêne, también pionero en la MRM, ha publicado
recientemente varios trabajos de reconocimiento en bacterias20, cuyas propiedades
elásticas hacen más sencilla la interpretación de las curvas de fuerza.
2. Medición de fuerzas de interacción moleculares mediante AFM
113
Figura 2.10. Antecedentes de interacciones moleculares en células. A Curvas de fuerza obtenidas
mediante una punta modificada con Con A en células NIH3T3 vivas (1) o fijadas químicamente con
glutaraldehído (2) o DTSSP (3), o fijadas y tratadas con α-D-Manopiranósido para bloquear la
interacción (4). B Curva de fuerza característica para un sensor de fuerza modificado con GRGDSP
(conteniendo el sitio RGD) en osteoclastos, y distribución de fuerzas obtenida para un anticuerpo anti -
integrina �3 sobre las mismas células. Tomados de 13 y 14.
En cuanto a la interacción RGD-integrina, los resultados tempranos de
Lehenkari14, utilizando varias secuencias de aminoácidos conteniendo al sitio RGD y
distintas líneas celulares (osteoblastos y osteoclastos), indicaron que la interacción era
sensible al tipo celular y a la secuencia utilizada. Por ejemplo, encontraron que en
osteoclastos la fuerza de interacción característica con una punta sensora modificada
con GRGDSP fue de (42 ± 4) pN. En osteoblastos la interacción media resultó de (32 ±
2) pN mientras que para un anticuerpo específico anti - integrina �3 la fuerza es mayor:
(127 ± 16) pN.
En otro trabajo del grupo de V. Moy21, se caracterizó la interacción integrina
�5�1 -fibronectina mediante Single Cell Force Microscopy (SCFM). Para ello unieron al
sensor de fuerza células de la línea K562, que expresan únicamente integrinas del tipo
�5�1. Realizaron curvas de fuerza con estos sensores sobre cubreobjetos modificados
con distintos fragmentos de fibronectina, obteniendo fuerzas características de entre 40
y 100 pN.
Hay otro trabajo del año 2005 en el que se estudió la interacción fibronectina-
integrina en células musculares lisas de los vasos sanguíneos22 (VSMC). En este último
1
2
3
4
A B
2. Medición de fuerzas de interacción moleculares mediante AFM
114
se modificaron los sensores de fuerza con la proteína fibronectina completa, y se obtuvo
una fuerza de interacción con las células de (39 ± 8) pN. Mediante el análisis de la
probabilidad de interacción (la probabilidad de medir un evento de ruptura en una curva
de fuerza) ante el bloqueo con anticuerpos específicos para los distintos tipos de
integrinas, se concluyó que la interacción se da entre la fibronectina y las integrinas tipo
�5�1.
2.4.2 Preparación de células y funcionalización de los sensores de fuerza
Los experimentos de reconocimiento molecular entre fibronectina e integrina se
realizaron en células epiteliales mamarias de ratón, de la línea HC11. Para estos
experimentos, las células fueron cultivadas sobre cubreobjetos de 12 mm recubiertos
con fibronectina (5µg/ml) para aumentar la unión de las células al sustrato. En la Figura
2.11 presento un esquema del experimento en donde se representa el cubreobjetos de
muestra donde crecen las células. Las curvas de fuerza características sobre estas
células, presentan una gran diferencia en la forma respecto de las curvas obtenidas en
vidrio, debida a la indentación de la célula.
0 200 400 600
0.0
0.1
0.2
0.3
Fue
rza
(nN
)
Extension (nm)
0 200 400 600
0
2
4
6
Fue
rza
(nN
)
Extension (nm)
muestra
Figura 2.11. Esquema del experimento: curvas de fuerza características. En función del lugar de la
muestra de células en el que se haga la curva de fuerza, los ciclos de acercamiento (negro) y retracción
(rojo) tienen formas diferentes: mientras que sobre un sustrato rígido la deformación es lineal, sobre una
célula presenta la indentación característica.
2. Medición de fuerzas de interacción moleculares mediante AFM
115
Para este tipo de experimentos se calibra la sensibilidad del detector (i.e. la
deflexión del cantilever en nm respecto del voltaje medido) utilizando curvas de fuerza
en un sustrato rígido en el que la relación voltaje-deflexión es lineal. Esto se realiza o
bien en una zona de la muestra sin células, o en las mimas condiciones de alineación
sobre un sustrato rígido (generalmente una muestra de mica desnuda)
Se utilizaron sensores de fuerza OTR400-PG (Asylum Research, Santa Barbara,
EEUU), cuya punta tiene un recubrimiento de oro por fabricación. Los sensores se
modificaron con el péptido cíclico Arg-Gly-Asp-d-Phe-Cys (c(RGDfC), Peptides
International Inc., Louisville, EEUU), que contiene al sitio de unión a integrina RGD en
una disposición cíclica que favorece la interacción con el receptor integrina23. Dicho
péptido tiene además una cisteína, cuyo grupo tiol se une covalentemente al oro de la
punta sensora, como se esquematiza en la Figura 2.12.
Figura 2.12. Modificación de sensores de fuerza con RGD. Se utilizaron sensores de fuerza OTR400-
PG, cuya punta tiene un recubrimiento de oro. Los sensores se modificaron con RGD cíclico unido a una
cisteína, cuyo grupo tiol (círculo rojo) se une covalentemente al oro.
2.4.3 Fuerzas de interacción RGD-integrina en células vivas
Con la estrategia descripta en la sección anterior, se realizaron mediciones de
fuerza sobre células de la línea HC11 utilizando un sensor de fuerza modificado con
c(RGDfC).
punta AFM
Au
2. Medición de fuerzas de interacción moleculares mediante AFM
116
En el conjunto de curvas de fuerza obtenido, algunas curvas presentan eventos
de ruptura, los cuales fueron cuantificados en fuerza. En la Figura 2.13 A se ven
algunas de las curvas obtenidas, indicando los eventos de ruptura. En algunas curvas se
observaron hasta dos eventos. El análisis de la anatomía de la curva de retracción puede
ser usado para discriminar si estamos trabajando sobre la superficie de una célula o
sobre la superficie del vidrio. Como observamos en la figura, la presencia de
indentación nos asegura que estamos midiendo sobre una célula. El recuadro en la
figura muestra curvas representativas utilizando un sensor de fuerza no funcional, en las
que puede verse que no se presentan eventos de interacción.
Figura 2.13. Análisis de la interacción RGD-integrina en células vivas. A Curvas de fuerza obtenidas
con punta sensora modificada con el tripéptido RGD sobre células HC11 (se muestra sólo la parte de
retracción). Las flechas indican los eventos de ruptura. En el recuadro se presentan curvas sobre células
con una punta no funcional. B Histograma de fuerzas características, obtenido de 66 eventos en un total
de 300 curvas analizadas, sobre dos células de cultivos diferentes. La curva roja representa el ajuste con
una distribución gaussiana, cuyo valor característico resultó de (37.6 ± 0.7) pN, con un sigma de (17± 1)
pN.
Se realizó un análisis de un total de 300 curvas obtenidas en dos células de
cultivos diferentes, obteniendo un total de 66 eventos de ruptura. Las curvas fueron
realizadas a una velocidad de 1µm/seg (lo que correspondió a una tasa de carga de
aproximadamente 20 nN/seg). El valor de fuerza medio resultó de (45 ± 3) pN, con una
desviación estándar de 23 pN. Este valor de fuerza obtenido da cuenta de que las
100 nm
50 pN
50 pN
100 nm
0 20 40 60 80 100 120 140 1600
5
10
15
20
25cu
enta
s
Fuerza (pN)
A B
2. Medición de fuerzas de interacción moleculares mediante AFM
117
interacciones registradas son al nivel de moléculas individuales. Dado que se vieron
algunos valores de interacción más altos (posiblemente debidos a la ruptura de más de
un complejo), el histograma se ajustó con una función gaussiana, dando el ajuste un
valor central de la gaussiana de (37.6 ± 0.7) pN, con una desviación de (17± 1) pN.
Tanto el histograma como el ajuste se muestran en la Figura 2.13 B.
2.5 Conclusiones
Los resultados presentados en este capítulo muestran la evolución de este
trabajo de Tesis en cuanto a la medición de fuerzas de interacción moleculares mediante
Microscopía de Fuerza Atómica, desde un sistema sencillo como grupos funcionales
químicos hasta una célula viva. Dicha evolución también llevó aparejada el diseño de
estrategias para la modificación química de los sensores de fuerza.
Se midieron fuerzas de interacción entre los grupos funcionales químicos
metilo-metilo y carboxilo-carboxilo, obteniendo los valores de fuerzas esperados. Se
logró cuantificar también la interacción entre el par ligando-receptor biotina-
estreptavidina, a nivel de moléculas individuales y utilizando diferentes estrategias de
modificación de sustratos.
Por último, se caracterizó la interacción RGD-integrina en células HC11 vivas,
obteniendo un valor característico de (37.6 ± 0.7) pN para la ruptura de un complejo a
nivel de moléculas únicas.
2.6 Referenciass
1 Hinterdorfer P. in Springer Handbook of Nanotechnology 2010, pp 476-492. 2 Alvarez D. E., Lodeiro M. F., Ludueña S. J., Pietrasanta L. I., and Gamarnik A. V.. J. Virol., 79:
6631 (2005); Filomatori C, Lodeiro M. F., Alvarez D. E., Samsa M., Pietrasanta L. I., and
Gamarnik A. V. Genes & Development 20: 2238 (2006). 3 Sieira R, Comerci D. J., Pietrasanta L. I. and Ugalde R. A., Mol Microbiol, 54: 808 (2004);
Maskin L., Frankel N., Gudesblat G., Demergasso M. J., Pietrasanta L. I. and Iusem N. D.. BBRC,
352: 831 (2007). 4 Calvo E. J., Etchenique R., Pietrasanta L. I., Wolosiuk A. and Danilowicz C. Anal Chem, 73:
1161 (2001); Pelah A, Ludueña S., Jares-Erijman E., Szleifer I., Pietrasanta L., Jovin T. Langmuir
2. Medición de fuerzas de interacción moleculares mediante AFM
118
22:9682 (2006); Flexer V., Forzani E. S., Calvo E. J., Ludueña S. J. and Pietrasanta L. I. Anal
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Electroanalysis, 20: 739 (2008). 5 Ebner A., Wildling L., Zhu R., Rankl C., Haselgrübler T., Hinterdorfer P. and Gruber H. J.,
Top Curr Chem 285: 29 (2008). 6 Binnig G., Quate C. F., Gerber C., Phys Rev Lett 56: 930 (1986). 7 Frisbie C. D., Rozsnyai L.F., Noy A., Wrighton M.S., and Lieber C.M., Science, 265: 2071
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Biomaterials 23:585-596 (2002).
IV. Microscopía de fluorescencia
multidimensional: visualización,
localización y distribución de los
complejos adhesivos.
Análisis del estado mecánico de una
célula viva, determinación de las
constantes cinéticas, correlación entre
concentración y estado de agregación
de los complejos de adhesión.
Capítulo 3
Expresión y visualización de proteínas
de las adhesiones focales por
Microscopía Confocal de Fluorescencia
En este capítulo muestro la expresión y localización de las distintas proteínas de las
adhesiones focales estudiadas, visualizadas por microscopía confocal de fluorescencia.
Presento también la utilización del dispositivo estirador en células vivas y su
caracterización en términos de la variación del área de las células por microscopía de
transmisión y por fluorescencia.
3. Expresión y visualización de proteínas de las FA por Microscopía Confocal de Fluorescencia
123
3.1 Introducción
La microscopía de fluorescencia es una herramienta de inestimable valor ya que
permite alcanzar altos niveles de sensibilidad y resolución microscópica, permitiendo
una apreciación diferente de la información que se puede obtener de los especímenes y
que generalmente pasa desapercibida1. El microscopio de fluorescencia une la brecha
entre células y moléculas, aún debajo de la resolución espacial nominal dada por el
límite de difracción de la luz. Así, la luz puede ser aplicada no sólo como una sonda de
posición, sino también como una forma de establecer el estado de asociación, la
naturaleza del entorno y las propiedades dinámicas de las moléculas a través de una
variedad de fenómenos espectroscópicos.
La coincidencia de los desarrollos en microscopía de fluorescencia con el
crecimiento de la biotecnología ha resultado en un enorme beneficio para la biología y
la biofísica. La genética molecular, sumada al descubrimiento de la proteína verde
fluorescente (GFP) y el desarrollo de sus variantes mutantes espectrales en el visible
(VFPs), abrieron la puerta a las investigaciones multicolor no invasivas en localización
de proteínas, interacciones intermoleculares y tráfico en cultivos de células vivas2.
El primer paso en estudio del estado mecánico de las proteínas de las adhesiones
focales analizadas en este trabajo de Tesis a través de microscopía de fluorescencia, fue
el de poner a punto la expresión y visualización de dichas proteínas unidas a las VFPs.
En este capítulo muestro la localización de las proteínas estudiadas: zixina y vinculina
como potenciales moléculas sensoras de la tensión, además de integrina, paxilina, FAK
y actina, todas componentes de las FAs. Presento también el estudio del estiramiento
mecánico de las células vivas y la cuantificación del estiramiento en términos de área de
las células en función del número de vueltas dadas por el dispositivo estirador.
3.2 Células HC11 para las mediciones de fluorescencia
Para todos los experimentos realizados en microscopía de fluorescencia en este
trabajo de Tesis, las células de epitelio mamario de ratón HC11 fueron cultivadas en
cubreobjetos recubiertos con fibronectina o colágeno y transfectadas usando
lipofectamina con los plásmidos de fusión: zixina-EGFP, paxilina-EGFP, FAK-EGFP y
vinculina-EGFP. Luego de 36 hs se adquirieron las imágenes. Para Microscopía
3. Expresión y visualización de proteínas de las FA por Microscopía Confocal de Fluorescencia
124
confocal, se empleó el microscopio confocal espectral FV1000 Olympus, usando un
objetivo de inmersión en aceite 60X1.35 NA. Para mediciones en el estirador, las
células fueron cultivadas en membranas de silicona de 0.17 mm de espesor (Specialty
Manufacturing Inc., EEUU) y transfectadas usando lipofectamina según el protocolo
descripto, o bien cultivadas en placas de 6 pocillos, transfectadas y luego crecidas en las
membranas de silicona recubiertas con fibronectina. Las mediciones en membranas de
silicona se realizaron con un objetivo de aire 40X 0.75 NA (Zeiss) o bien con un
objetivo de aire 40X 0.95 NA (Olympus). Todos los experimentos se realizaron a 37°C
usando la cámara incubadora del microscopio.
3.3 Visualización de proteínas de las adhesiones focales en células HC11
Mediante microscopía confocal de fluorescencia observamos todas las
construcciones para expresar las proteínas de las adhesiones focales unidas a proteínas
fluorescentes. En la Figura 3.1 presento un resumen general de la expresión de zixina,
paxilina, FAK y vinculina , unidas a la proteína verde fluorescente EGFP.
Figura 3.1 Expresión de proteínas de las FA. Células HC11 transfectadas para la expresión de zixina-
EGFP, paxilina-EGFP, FAK-EGFP y vinculina-EGFP. Tomadas en el microscopio FV1000 con un
objetivo 60X de inmersión en aceite, apertura numérica 1.35. Se muestran secciones ampliadas de las
FAs.
5µµµµm FAK 5µµµµm
Vinculina
5µµµµm
Paxilina
2µµµµm
2µµµµm
60X/NA 1.35
5µµµµm Zixina
2µµµµm
3. Expresión y visualización de proteínas de las FA por Microscopía Confocal de Fluorescencia
125
Puede verse que las cuatro proteínas mencionadas se localizan en las adhesiones
focales. Se observa además que la zixina se localiza con menor intensidad (en menor
proporción) sobre los filamentos de actina, mientras que tanto la paxilina como la
vinculina, además de estar concentradas en las FA, se ven distribuidas también en el
citoplasma. Por otra parte, se observa que cada proteína se localiza como parte de la
adhesión focal en una morfología característica, formando algunas proteínas adhesiones
más redondeadas, mientras que otras se localizan formando adhesiones más alargadas.
Es decir, cada proteína se localiza en las FA como un “sello” característico.
En la Figura 3.2 se muestran células HC11 co-transfectadas para expresar las
proteínas de las FAs (zixina e integrina, ambas unidas a EGFP) y el péptido lifeACT
(que forma parte de la actina) marcado con mCherry, que se localiza en los filamentos
de actina. Puede observarse que las FAs se forman en las terminaciones de los
filamentos de actina, permitiendo la interacción de esta última con las proteínas de las
FAs.
Figura 3.2 Expresión de proteínas de las FAs. Células HC11 co-transfectadas con vectores de fusión
para la expresión de zixina-EGFP y lifeACT-mCherry, o integrina-EGFP y lifeACT-mCherry. Tomadas
en el microscopio FV1000 con un objetivo 60X de inmersión en aceite, apertura numérica 1.35. Se
muestra también una deconvolución 3D, realizada utilizando planos confocales tomados cada 100 nm de
profundidad, y utilizando un método estimación de máxima verosimilitud provista por el programa
Huygens Professional (Scientific Volume Imaging, Hilversum, Holanda).
EGFP-Zyxina mCherry-lifeAct
EGFP-Beta3-integrina mCherry-lifeAct
2µµµµm 2µµµµm 2µµµµm
60X/NA 1.35
3. Expresión y visualización de proteínas de las FA por Microscopía Confocal de Fluorescencia
126
Se presenta también una deconvolución tridimensional de una porción de la
célula en la que se ven tanto los filamentos de actina como las FAs. Mediante la
microscopía confocal de fluorescencia es posible lograr este tipo de deconvoluciones
tomando múltiples imágenes en planos en el eje vertical a una distancia menor a la
resolución del microscopio (específicamente menor a la mitad de la resolución, por el
teorema de Nyquist, en este caso se tomaron imágenes en planos cada 100 nm).
Realizamos un estudio morfométrico de las adhesiones focales marcadas con las
distintas proteínas utilizadas, y analizamos no sólo su área sino también otros dos
parámetros: la circularidad (C) y la relación de aspecto (AR), definidos por las
ecuaciones 3.1 y 3.2:
perímetro
áreaC
..4 π= 3.1
(un valor de C = 1 indica una esfera perfecta, mientras que a medida que C se acerca a
cero la forma es más elongada)
menor
MAYOR
R
RAR = 3.2
obtenida de ajustar el área de la FA por una elipse, donde RMAYOR y Rmenor son los radios
de la elipse (en este caso un valor de AR = 1 corresponde a una esfera perfecta, mientras
que cuanto más grande es el AR más alongada es la estructura).
En la Figura 3.3 se muestran los resultados del análisis, que fue realizado con el
programa FIJI.
Figura 3.3 Estudio morfométrico de las FAs. De las FAs marcadas con las 5 proteínas estudiadas: �3-
integrina, FAK, paxilina y vinculina, se realizó un estudio del área promedio (A), circularidad (B) y
relación de aspecto (C). En cada caso se analizaron aproximadamente 20 adhesiones focales.
Beta 3 integrina FAK Paxilina Vinculina Zixina0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
Are
a pr
omed
io (
µm
2 )
A
Beta 3 Integrina FAK Paxilina Vinculina Zixina0.45
0.50
0.55
0.60
0.65
0.70
0.75 B
C
Beta 3 Integrina FAK Paxilina Vinculina Zixina2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5 C
AR
3. Expresión y visualización de proteínas de las FA por Microscopía Confocal de Fluorescencia
127
Como puede verse, el área promedio de todas las FAs estudiadas es del orden de
1 µm2, y la �3-integrina es la proteína que forma adhesiones de mayor área y más
circulares. Respecto de las otras cuatro proteínas podemos decir que el área promedio de
las mismas es aproximadamente la misma, mientras que en cuanto a su circularidad o
relación de aspecto, FAK y vinculina se disponen en forma más elongadas en las FAs
que paxilina y zixina.
3.4 Estiramiento mecánico de células vivas en cultivo
El estiramiento de células cultivadas sobre membranas flexibles ha sido bastante
utilizado en la literatura3, y si bien casi la totalidad de los trabajos publicados no fueron
realizados in vivo, se han determinado cambios en la distribución, orientación y
morfología de las células en respuesta a este tipo de estímulos. En uno de los pocos
trabajos de la literatura en el que trabajan con células vivas, Spatz y colaboradores
mostraron que el estiramiento de las células induce la activación de las Rho GTPasas4,
asociadas también al proceso de mecanotransducción. En este trabajo sin embargo se
estudia una respuesta global de la célula, y no un fenómeno asociado a las FAs.
Las técnicas de microscopía de fluorescencia implementadas en este trabajo de
Tesis tienen como objetivo estudiar los cambios en la dinámica e interacción de las
proteínas de las adhesiones focales en respuesta al estiramiento mecánico. Como
mostramos en el capítulo anterior, la línea celular HC11 puede crecer normalmente en
membranas de silicona cubiertas con fibronectina, y el estirador mecánico puede ser
utilizado en células vivas expresando las proteínas de las FAs unidas a VFPs. Sin
embargo, dadas las características de las membranas y el hecho de que no permitan
trabajar con objetivos de inmersión (de alta apertura numérica) por su inestabilidad en el
foco, resulta un gran desafío implementar en el dispositivo estirador este tipo de
técnicas que requieren la adquisición de imágenes en el tiempo.
Por otro lado, el cultivo de las células en las membranas de silicona tuvo que
optimizarse, resultando bastante más sensible que el cultivo en cubreobjetos. En este
sentido, encontramos que las células no crecen en las membranas sin el recubrimiento
de fibronectina. En la Figura 3.4 se muestran el tipo de membranas utilizadas para
3. Expresión y visualización de proteínas de las FA por Microscopía Confocal de Fluorescencia
128
crecer las células, así como el dispositivo estirador con la membrana y ya dispuesto el
dispositivo en el microscopio confocal.
Figura 3.4 Dispositivo estirador de células vivas en cultivo. Membranas de silicona utilizadas para
cultivar las células y estirarlas mecánicamente, dispuestas en el estirador y este último en funcionamiento
en el microscopio confocal FV1000.
El primer paso en la utilización del dispositivo estirador con células vivas fue la
caracterización del estiramiento en términos del área de las células. Para ello, se
tomaron imágenes en transmisión y se midió el área total de las células con la tensión
inicial y para cada vuelta del estirador hasta un total de siete vueltas. En la Figura 3.5
se presentan imágenes de luz transmitida de las células en la tensión inicial y luego de
las siete vueltas de estiramiento. Las células se numeraron y de cada una de ellas se
midió el área para distintos estados de tensión utilizando el programa FIJI. Se espera
que, si el aumento en el área de las células sigue el estiramiento de la membrana (que
encontramos lineal con el número de vueltas en términos de distancia), la dependencia
con el número de vueltas sea cuadrática. En efecto, si bien a partir de la calibración
lineal el coeficiente cuadrático debería ser pequeño, encontrándose el área en un rango
en que la dependencia cuadrática podría considerarse lineal, el ajuste cuadrático del área
en función del número de vueltas se corresponde con la función esperada a partir de la
calibración del estiramiento por distancias (sección II.4). En números, el parámetro
3. Expresión y visualización de proteínas de las FA por Microscopía Confocal de Fluorescencia
129
cuadrático obtenido a partir de la calibración de estiramiento con las microesferas
debería ser (0.0032 ± 0.0001) µm2/vueltas2, y el lineal (0.113 ± 0.002) µm2/vueltas. El
ajuste cuadrático del área de las células en función del número de vueltas arrojó un
coeficiente lineal de (0.101 ± 0.016) µm2/vueltas2 y un coeficiente cuadrático de
(0.0027 ± 0.0023) µm2/vueltas2. Si bien el coeficiente cuadrático obtenido tiene mucho
error, podemos decir que presenta la concavidad esperada y que el coeficiente lineal
respeta el valor esperado. Es por esto que concluimos que el estiramiento en el área total
de las células sigue el estiramiento de la membrana a la que están adheridas. En algunos
casos (no tenidos en cuenta en este análisis) vimos que las células se empiezan a retraer
a partir de un umbral de estiramiento para luego despegarse.
Figura 3.5 Área de las células en función del estiramiento. Imágenes de transmisión de células HC11
cultivadas en membranas de silicona recubiertas con fibronectina, a tensión inicial (A) y después de 7
vueltas de estiramiento (B). Para 20 células analizadas, se estudió el aumento de área relativa al área a
tensión inicial en función del número de vueltas (C). En rojo se muestra el ajuste cuadrático.
Como paso siguiente expresamos en células crecidas en las membranas de
silicona, las proteínas de fusión para las proteínas de las FAs unidas a las VFPs. En la
Figura 3.6 se puede ver una célula HC11 que expresa la proteína quimera zixina-EGFP
a tensión inicial y luego de dos vueltas de estiramiento. Se observan nítidamente las
adhesiones en la periferia de la célula así también algunos cúmulos en el citoplasma.
Cabe mencionar que al trabajar con las membranas de silicona tenemos que sacrificar el
potencial tecnológico del confocal y emplear una lente objetivo de mayor distancia de
trabajo en aire, ya que hay que evitar tocar la membrana, y menor apertura numérica
comparada con lentes objetivo que usaríamos al trabajar con células cultivadas sobre
vidrio. Esto se debe a que la membrana es muy flexible y si el objetivo es de inmersión
se hace imposible enfocar por la deformación de la membrana. La mayoría de los
1
23
41
23
4
56
7
56
7
8 9
12138 9
1213
10
1110
1114
1516
141516
A 7 vueltasB0 vueltas
-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
Are
a pr
omed
io/A
rea
inic
ial
# vueltas
C
3. Expresión y visualización de proteínas de las FA por Microscopía Confocal de Fluorescencia
130
grupos que trabajan en el área emplean la estrategia de estirar la membrana con las
células y luego fijarlas químicamente para hacer la observación en el microscopio
confocal.
Figura 3.6 Estiramiento mecánico de células vivas en fluorescencia. Célula HC11, crecida sobre
membrana de silicona recubierta con fibronectina, transfectada para expresar la construcción zixina-
EGFP, antes (izquierda) y después (derecha) de realizar un estiramiento de una vuelta. Barra 10µm.
El desafío es mayor si deseamos expresar dos proteínas de adhesión. En la
Figura 3.7 se puede ver una célula co-transfectada con vectores de fusión para la
expresión de zixina-EGFP y lifeAct-mCherry, a tensión inicial y luego de 2, 4, 5 y 6
vueltas de estiramiento. Se puede ver que, en respuesta a la fuerza, la zixina se recluta
en las adhesiones focales y transloca también a los filamentos de actina lo que es
consistente con estudios previos5. En la secuencia de imágenes podemos ver cómo las
fibras de estrés de actina (flechas rojas), a medida que se incrementa el número de
vueltas, van siendo "decoradas" con la presencia de la proteína zixina (flechas verdes).
Esta observación refuerza la idea de que la proteína zixina se acumula en sitios donde
las fibras de actina puedan sufrir daño en su integridad, por ejemplo por el
estiramiento/perturbación mecánica, reclutando proteínas que estabilizan las fibras de
estrés. De esta manera contribuiría a mantener la homeostasis mecánica.
3. Expresión y visualización de proteínas de las FA por Microscopía Confocal de Fluorescencia
131
A B C
D E
A B C
D E
A B C
D E
A B C
D E
Figura 3.6. Estiramiento mecánico de células vivas en cultivo. Célula HC11, crecida sobre membrana
de silicona recubierta de fibronectina, co-transfectada para expresar zixina-EGFP y lifeAct- mCherry a
tensión inicial (A) y después de 2, 4, 5 y 6 vueltas (B, C, D y E, respectivamente) de estiramiento.
Escala= 10µm.
A partir de estos resultados, podemos decir que el dispositivo estirador mecánico
puede ser utilizado para trabajar en microscopía de fluorescencia in vivo de adhesiones
focales, lo que representa un avance en el estado del arte de este tipo de experimentos
dado que nos permite combinar el estímulo mecánico con técnicas dinámicas para
obtener información funcional de la célula.
3.5 Conclusiones
En este capítulo se mostró que la expresión de los plásmidos que codifican las
distintas proteínas de las FAs estudiadas unidas a las VFPs se localiza en las adhesiones
focales de células HC11, permitiendo establecer nuestro sistema biológico de estudio.
También se pudieron visualizar los filamentos de actina, componente del citoesqueleto
de la célula y partícipe de las FAs, a través de la expresión del vector de fusión para
lifeAct-mCherry. Se demostró que las células cultivadas sobre membranas de siliconas
expresan también las proteínas mencionadas.
Se logró caracterizar cuantitativamente el cambio en el área total de células
vivas en función del estiramiento mecánico producido por el dispositivo estirador,
3. Expresión y visualización de proteínas de las FA por Microscopía Confocal de Fluorescencia
132
obteniendo una función consistente con la caracterización de estiramiento lineal. Este
resultado nos permite inferir que el cambio en el área total de las células sigue el
estiramiento de la membrana a la que están adheridas.
Se observó que, en respuesta al estímulo mecánico, la proteína zixina se recluta
formando adhesiones focales de mayor área y transloca a los filamentos de actina.
Los resultados presentados en este capítulo sientan las bases para combinar el
estímulo mecánico global producido por el dispositivo estirador con técnicas de
fluorescencia in vivo para estudios en adhesiones focales en células HC11, nuestro
sistema de interés. Esta combinación representa un avance en el estado del arte para
experimentos de estiramiento, dado que nos permite obtener información dinámica y
funcional de la célula en respuesta al estímulo mecánico.
3.6 Referencias 1 Jovin, T. M. and Arndt-Jovin D. J., Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chern. 18:271-308 (1989). 2 Day R. N. and Schaufele F., Mol Endocrinol 19:1675-1686, (2005); Bastiaens P. I. H. and
Pepperkok R., Trends Biochem Sci 25: 631-637, (2002); Shaner N. C., Patterson G. H. and
Davidson M. W., J Cell Scie 120, 4247-4260, (2007). 3 Deibler M. et al., PLOS ONE 6: 22941, (2011); Na S. et al., Ann Biomed Eng 36: 369–380,
(2008). 4 Goldyn et al., J Cell Sci122: 3644-3651, (2009). 5 Smith M. A., Blankman E., Gardel M. L., Luettjohann L., Waterman C. M., Beckerle M. C.,
Dev Cell 19: 365-376, (2010).
Capítulo 4
Determinación de las constantes cinéticas de
disociación de proteínas de las adhesiones focales
mediante FRAP
En este capítulo describo la implementación de la técnica FRAP (recuperación de la
fluorescencia después del fotoblanqueo) para el estudio de las constantes cinéticas de
disociación de las proteínas de las adhesiones focales (FAs) zixina, paxilina, FAK y
vinculina en células vivas. Presento también el estudio de la respuesta de la cinética de
la proteína zixina a diferentes tipos de estímulos relacionados con la matriz extracelular:
por un lado a la variación en el sustrato de crecimiento de las células (vidrio desnudo,
colágeno sobre vidrio, fibronectina sobre vidrio y fibronectina sobre membranas de
silicona) y por el otro al estiramiento mecánico.
4. Determinación de constantes cinéticas de disociación de proteínas de las FA mediante FRAP
135
4.1 Introducción
La técnica de recuperación de la fluorescencia luego del fotoblanqueo (FRAP)1
permite obtener información acerca de la cinética de las proteínas dentro de la célula. A
través del análisis de las curvas de recuperación de la fluorescencia se pueden
determinar las constantes cinéticas de los fenómenos dinámicos involucrados en el
movimiento de las proteínas.
En adhesiones focales se han realizado numerosos estudios con esta técnica que
han permitido describir la cinética de las proteínas en diferentes tipos celulares, bajo
distintos estímulos, y para FAs en diferentes tiempos de maduración. Es importante
mencionar que no es directa la comparación de los valores de las constantes cinéticas en
las distintas líneas celulares dada la heterogeneidad no sólo en la composición de las
FAs sino en la naturaleza y el grado de las interacciones entre las proteínas que forman
las FAs. En la línea celular HC11 no hay en nuestro conocimiento trabajos con este tipo
de estudios.
En este capítulo se presenta la utilización de FRAP para el análisis de la cinética
de reclutamiento de cuatro proteínas (zixina, paxilina, FAK y vinculina) a las
adhesiones focales de células epiteliales mamarias de la línea HC11. Esta técnica nos
permitió obtener la constante cinética de disociación (kOFF) a las FAs de cada una de las
proteínas estudiadas, así como su fracción móvil. Para la proteína zixina, postulada
como una de las proteínas que sensan las fuerzas mecánicas, analizamos los cambios en
la cinética de reclutamiento para células cultivadas en diferentes sustratos: vidrio
desnudo, vidrio recubierto con colágeno o fibronectina, y membranas de silicona
recubiertas con fibronectina.
Implementamos también la técnica FRAP en células sometidas a un estiramiento
mecánico, presentando aquí los primeros resultados para estudiar la dinámica de la
proteína adhesiva zixina en células vivas, y su respuesta ante el estiramiento mecánico.
4.2 FRAP en adhesiones focales: experimento y modelos
El experimento de FRAP en adhesiones focales consiste en fotoblanquear una
pequeña región de interés (ROI) dentro de una adhesión focal y registrar la recuperación
4. Determinación de constantes cinéticas de disociación de proteínas de las FA mediante FRAP
136
de la fluorescencia en función del tiempo. Todos los experimentos se realizaron en el
microscopio FV1000 espectral de Olympus descrito en la sección II.2. Se utilizaron las
construcciones de proteínas de las FAs unidas a la EGFP.
Para realizar el experimento, antes del fotoblanqueo (etapa que denominamos
pre-bleach) se registran algunas imágenes de manera de cuantificar la intensidad inicial.
El fotoblanqueo (etapa bleach) se logra aplicando un pulso con la línea láser de 488 nm
a 100% de potencia de entre 40 y 200 ms de duración. El pulso debería durar el tiempo
suficiente para blanquear el fluoróforo en una buena proporción (idealmente > 90 %),
pero además ser lo suficientemente corto como para restringir el fotoblanqueo a una
zona dentro de la FA (con pulsos de larga duración el volumen efectivo de fotoblanqueo
es mayor, dado que se fotodestruye también proteína que va ingresando a la ROI).
Figura 4.1 Esquema del experimento de FRAP. A Protocolo de FRAP realizado sobre las células
HC11 transfectadas con la construcción zixina-EGFP: durante la etapa previa (pre-bleach) al
fotoblanqueo (bleach) se registraron imágenes de regiones de las células en las que se ven FAs; luego se
aplicó un pulso de fotoblanqueo con un láser de 488nm a 100% de potencia de entre 40 y 200 mseg de
duración en una región de tamaño inferior a una FA (entre 0,2 y 0,5 µm2). Se registraron imágenes
durante la recuperación de la fluorescencia (post-bleach) hasta alcanzar el estado estacionario. B
Secuencia temporal de fotos correspondiente a la detección de la proteína zixina en las células HC11
crecidas sobre colágeno. Secuencia superior: región de la célula que contiene 5 adhesiones focales (la
cabeza de flecha indica la zona del fotoblanqueo). Secuencia inferior: detalle de la adhesión focal sobre la
que se produjo el fotoblanqueo. Barra de escala: 1 µm. Pre y post se refiere a antes y después del
fotoblanqueo.
4. Determinación de constantes cinéticas de disociación de proteínas de las FA mediante FRAP
137
Para aumentar la proporción de fotoblanqueo sin necesidad de incrementar
demasiado el tiempo de blanqueo, en algunos casos se prendió también durante esta
etapa la línea de 458 nm al 100%. Una vez fotoblanqueada la ROI, se registran
imágenes durante la recuperación de la fluorescencia (etapa post-bleach) hasta ver que
la intensidad de la fluorescencia alcanza el estado estacionario. En la Figura 4.1 se
presenta el esquema de un experimento de FRAP y su aplicación en adhesiones focales
de células HC11 marcadas con zixina-EGFP.
Para obtener las curvas de recuperación, en primer lugar es necesario corregir
la señal de fondo en todas las imágenes (utilizando una región de la imagen en la que no
se ve fluorescencia). Por otra parte, se debe corregir el fotoblanqueo por adquisición.
Para ello, se elige una FA control (donde NO se realiza el fotoblanqueo para FRAP) y
se cuantifica la evolución de la intensidad que estará gobernada por el fotoblanqueo por
adquisición. La correción se realiza dividiendo la señal a analizar por la intensidad en la
FA control Estas dos correcciones requieren que las imágenes consideradas para el
análisis contengan no sólo la FA en la que se realiza el experimento sino también otras
adhesiones para ser usadas como control del fotoblanqueo por adquisición, y una región
donde no se observe fluorescencia para cuantificar el ruido de fondo.
0 50 100 1500
4000
8000
12000
Inte
nsid
ad
tiempo (s)
region de FRAP FA control background
Figura 4.2 Mediciones de FRAP no corregidas. Señales de FRAP para el ejemplo de un experimento
con zixina-GFP, necesarias para obtener la curva de recuperación: para corregir el fotoblanqueo por
adquisición la señal de intensidad en la región del experimento de FRAP (azul) se divide por la señal en
una adhesión control (negro). Previamente a ambas señales se les resta la señal de fondo tomada en una
región sin adhesiones focales (rojo).
4. Determinación de constantes cinéticas de disociación de proteínas de las FA mediante FRAP
138
En la Figura 4.2 se presenta un gráfico de los datos crudos de intensidad de la
fluorescencia analizados, en los que se puede ver la señal de intensidad en la región del
experimento de FRAP, la señal en una adhesión control para cuantificar el fotoblanqueo
por adquisición, y la señal de fondo tomada en una región sin adhesiones focales. En el
gráfico de la intensidad de la fluorescencia en función del tiempo en la región de FRAP,
la curva presenta una abrupta disminución de la intensidad luego del fotoblanqueo
seguido de un aumento que es indicativo de la recuperación, la cual puede ser total o
parcial. Por otro lado, a lo largo del tiempo se observa una disminución de la intensidad
de la fluorescencia para la región sobre la FA control debido al fotoblanqueo por
adquisición.
Es importante aclarar que la corrección por fotoblanqueo se suele hacer en
otros experimentos en función del tiempo con la fluorescencia de la célula completa,
dado que la cantidad total de proteína en la célula se mantiene constante
independientemente de la dinámica dentro de la célula. Sin embargo, en el caso de los
experimentos de FRAP, tomar en el tiempo imágenes de toda la célula (con la
resolución en píxeles necesaria para muestrear la adhesión focal de interés) demandaría
un tiempo que no nos permitiría registrar con suficiente resolución temporal la curva de
recuperación. Es por ello que se toman imágenes en un área más pequeña, considerando
para la corrección por fotoblanqueo una adhesión focal en donde no se haya producido
el fotoblanqueo para FRAP. Aún así, hemos tomado en cada experimento más de una
adhesión control, y corroborado que el fotoblanqueo por adquisición en todas las
adhesiones control tiene el mismo comportamiento. Esta observación nos confirma que
realizar la corrección con cualquiera de las adhesiones focales control resulta
equivalente.
Modelo de recuperación en adhesiones focales
Para ajustar los datos experimentales de recuperación de la fluorescencia se
utilizó el modelo propuesto por Lele y colaboradores2,3. Brevemente, se considera que
las proteínas en estado estacionario en las FAs pueden encontrarse en dos estados:
ligado ( C ) o libre (C), con tasas de intercambio entre uno y otro kON y kOFF (ecuación
4.1):
CC
OFF
ON
k
k
ˆ ←
→ 4.1
4. Determinación de constantes cinéticas de disociación de proteínas de las FA mediante FRAP
139
Para describir la cinética de las proteínas en las FAs deben resolverse entonces
las ecuaciones cinéticas que modelan el intercambio entre estos dos estados, sumado a
la difusión de las moléculas no ligadas (ecs. 4.2 y 4.3):
CkC
CCkCD
t
COFFON
ˆ)~ˆ
1(0
2 +−−∇=∂
∂ 4.2
4.3
Se pide además la condición 0=⋅∇ nC en el contorno celular, lo que significa
que no hay flujo de proteínas fuera de la célula. C es la concentración de proteína libre,
C la de proteína ligada, 0
~C es la concentración teórica de las moléculas si están ligadas
a todos los sitios disponibles (si puede ligarse una molécula por sitio de unión, 0
~C es
igual a la concentración de sitios de unión), y kON y kOFF son las tasas de asociación y
disociación respectivamente. 0
~ˆ
1C
CS −≡ es la fracción de sitios disponibles o la
probabilidad de unión.
Después del fotoblanqueo, se crean dos conjuntos de moléculas ópticamente
diferentes, moléculas fotoblanqueadas y moléculas fluorescentes, cuyas concentraciones
suman una cantidad constante: la concentración de equilibrio existente antes del
fotoblanqueo. Este vínculo se tiene que satisfacer en cada punto del dominio. Llamamos
a la concentración de especies libres fotoblanqueadas P
C y a la de moléculas libres
fluorescentesF
C ; y análogamente para las especies ligadas P
C y F
C . 0CCCFP
=+ y
0ˆˆˆ CCC
FP=+ son las ecuaciones de vínculo válidas en el dominio, i.e. no se crean
gradientes en la concentración total de moléculas. Sólo existirán gradientes en las
concentraciones de moléculas individuales fotoblanqueadas o fluorescentes. Cada uno
de estos conjuntos de moléculas obedecen las ecuaciones de conservación (4.2) y (4.3),
por lo que
4.4 FOFFFONF
F CkC
CCkCD
t
C ˆ)~ˆ
1(0
02 +−−∇=∂
∂
CkC
CCk
t
COFFON
ˆ)~ˆ
1(ˆ
0
−−=∂
∂
4. Determinación de constantes cinéticas de disociación de proteínas de las FA mediante FRAP
140
4.5
Así, las ecuaciones para moléculas fluorescentes y fotoblanqueadas están desacopladas
y pueden resolverse de manera independiente.
Sobre estas ecuaciones se realizan algunas hipótesis. En principio se asume que
la recuperación está dominada por la reacción de disociación de la proteína a la FA o
que la difusión es despreciable, lo cual es razonable teniendo en cuenta que el área del
fotoblanqueo es pequeña. En efecto, experimentalmente corroboramos que la difusión
en el citoplasma es despreciable (los experimentos realizados en el citoplasma
presentaron una recuperación más rápida que el tiempo transcurrido hasta tomar la
primer imagen post-bleach). Es válido entonces asumir que 0CC F = , es decir que la
concentración de proteína libre difundiendo es constante. Se considera además que kON
y S no cambian en la escala temporal de la recuperación de FRAP.
Este modelo es válido para proteínas en las que se da un único estado ligado/no
ligado, como por ejemplo la zixina. La solución de las ecuaciones mencionadas en este
tipo de proteínas (que denotaremos con el subíndice z por zixina) puede escribirse
mediante: 0, CCZF= , y
ZFOFF
Z
Z
ZON
ZFCk
C
CCk
dt
Cd,
,0
,0,0
, ˆ)~ˆ
1(ˆ
−−= . La solución a esta ecuación es
la ecuación 4.6:
)1(ˆ)1(~ˆ
1ˆ,0
,0
,0,0,
tk
Z
tk
Z
Z
Z
OFF
ON
ZFOFFOFF eCe
C
CC
k
kC
−− −=−��
�
�
��
�
�−= 4.6
que escrita en términos de la concentración normalizada a la concentración inicial da la
ecuación 4.7:
tk
Z
ZF OFFeC
C −−= 1ˆ
ˆ
,0
, 4.7
Por lo tanto, ajustando la curva de recuperación (intensidad normalizada a la intensidad
inicial) a la función de la ec. 4.7, se estima únicamente la constante kOFF. Una ventaja
clara de este análisis es que el cálculo es independiente de la concentración de proteína
libre o ligada, por lo que no se necesitan otras mediciones.
Puede suceder que la recuperación no responda a una única dinámica y que por
ejemplo, haya dos poblaciones de moléculas con cinéticas diferentes. Es el caso de la
FOFFFON
F CkC
CCk
t
C ˆ)~ˆ
1(ˆ
0
0 −−=∂
∂
4. Determinación de constantes cinéticas de disociación de proteínas de las FA mediante FRAP
141
vinculina, cuya recuperación no responde a una única curva exponencial, como
observaron en el trabajo de Lele3. Para la vinculina entonces se puede desarrollar un
modelo análogo al anterior pero considerando dos sub-poblaciones (V1 y V2) cuyos
comportamientos cinéticos son diferentes. En este caso, y haciendo las mismas
suposiciones que en el caso de zixina, la recuperación puede modelarse según la
ecuación 4.8:
)1)(1()1(ˆ
ˆˆ21
,0
2,1, tktk
V
VFVFOFFOFF ee
C
CC−− −−+−=
+αα 4.8
de la que se pueden extraer las constantes cinéticas kOFF1 y kOFF2 de ambas poblaciones,
y �, la fracción relativa de la población V1 (V
V
C
C
,0
1,0
ˆ
ˆ=α ).
Como se detalló en la sección II.2.5 b, se corrige el valor de intensidad
restando el valor medio de la etapa bleach, y luego se normaliza al valor medio de la
etapa pre-bleach (ec. II.7). Esto hace que la curva tome valores entre 0 y 1.
Una observación recurrente es que la intensidad, aún corregida por el
fotoblanqueo, suele no recuperar hasta alcanzar el valor inicial, o lo que es lo mismo, las
curvas de recuperación llegan a un valor estacionario distinto a la unidad. En términos
del modelo descripto, esto significa que hay una fracción de la proteína fluorescente
inmóvil, que no responde a la dinámica estudiada. Para tener en cuenta esta fracción
inmóvil de proteína, en lugar de la ecuación 4.7 se utiliza la 4.9:
)1.( .tkOFFemF−−= 4.9
en donde m representa la fracción móvil de la proteína en la adhesión focal. En forma
análoga se considera también una fracción móvil para cada una de las subpoblaciones
de la vinculina.
4. Determinación de constantes cinéticas de disociación de proteínas de las FA mediante FRAP
142
4.3 Parámetros de la cinética molecular de proteínas de las adhesiones focales
mediante FRAP
Estudiamos mediante FRAP las constantes de disociación y fracciones móviles
de cuatro proteínas de las adhesiones focales: paxilina, FAK, zixina y vinculina. Para
ello utilizamos las construcciones de las mismas unidas a la GFP, expresadas en células
HC11. Para estos experimentos, las células fueron cultivadas sobre cubreobjetos
recubiertos con colágeno (otro componente de la matriz extracelular). En la Figura 4.3
se presentan curvas de recuperación típicas para las proteínas zixina, paxilina, FAK y
vinculina.
Figura 4.3. Curvas de recuperación de la fluorescencia en la región fotoblanqueada. Curvas
representativas para las proteínas FAK (A), paxilina (B), zixina (C) y vinculina (D). Las curvas de
recuperación se ajustaron con el modelo monoexponencial para FAK, paxilina y zixina, y con el modelo
biexponencial para vinculina.
Las curvas fueron ajustadas por el modelo de Lele para obtener los parámetros
biológicos relevantes: la constante de disociación kOFF y la fracción móvil m. A partir de
0 20 40 60 800.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Rec
uper
ació
n flu
ores
cenc
ia
Tiempo (s)
FAK
0 20 40 60 800.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Paxilina
Rec
uper
ació
n flu
ores
cenc
ia
Tiempo (s)
0 20 40 60 80 100 120 140 1600.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Zixina
Rec
uper
ació
n flu
ores
cenc
ia
Tiempo (s)
0 20 40 60 800.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Vinculina
Rec
uper
ació
n flu
ores
cenc
ia
Tiempo (s)
A B
C D
4. Determinación de constantes cinéticas de disociación de proteínas de las FA mediante FRAP
143
la constante de disociación kOFF se obtienen los tiempos medios característicos y de
residencia de la proteína de interés en la FA. Para las proteínas paxilina, FAK y zixina
se utilizó el modelo monoexponencial, mientras que para vinculina se utilizó el modelo
de dos poblaciones con diferente cinética. Los datos fueron ajustados por el método de
cuadrados mínimos no lineales utilizando la función nlinfit de Matlab.
A simple vista puede decirse que las proteínas zixina y vinculina tienen una
recuperación más lenta que el resto de las proteínas estudiadas. Asimismo tanto zixina
como vinculina presentan una menor fracción móvil. En la tabla 4.1 se presentan los
resultados promedio para todas las células estudiadas.
kOFF (1/s) tr (s) t 1/2 (s) m N
Zixina 0,020 ± 0,002 57 ± 5 39 ± 4 0,51 ± 0,04 29
Paxilina 0,092 ± 0,013 13 ± 2 9 ± 1 0,61 ± 0,04 22
FAK 0,074 ± 0,009 16 ± 2 11 ± 1 0,88 ± 0,04 28
0.40 ± 0.08 3.6 ± 0.9 2.5 ± 0.6 0.08 ± 0.02 Vinculina
0.014 ± 0.002 82 ± 9 57 ± 6 0.69 ± 0.05 8
Tabla 4.1. Resultados de las constantes cinéticas de disociación de zixina, paxilina, FAK y vinculina
en FAs. kOFF refiere a la constante de disociación, mientras que tr y t1/2 son los tiempos característicos,
cuando la recuperación se produjo a 1/e del valor inicial o a 1/2 respectivamente. m es la fracción móvil.
N indica el número de experimentos realizados (en algunos casos se realizó más de un experimento por
célula). En el caso de vinculina se muestran los parámetros del ajuste biexponencial.
Los tiempos medios obtenidos se encuentran en el orden de magnitud de los
informados por el grupo de Lele para otros tipos celulares2. Nuestros resultados
permiten inferir que la zixina posee una disociación más lenta, que implica un mayor
tiempo de residencia de esa proteína en la adhesión. Este resultado estaría asociado a la
participación de la zixina en adhesiones focales maduras. La fracción de moléculas
móviles también resultó menor, lo cual refuerza la hipótesis de que la
asociación/disociación de zixina a las FAs podría ser, en comparación con las otras
proteínas estudiadas, un evento menos dinámico. La paxilina, proteína adaptadora con
sitios de unión para moléculas de señalización y proteínas estructurales de la FA, y la
proteína FAK presentan tiempos medios similares entre sí y menores a los de zixina,
mientras que la fracción móvil de FAK es mayor que la de la paxilina. Esto podría
responder al hecho de que FAK se asocia a intermediarios en la cascada de señalización
4. Determinación de constantes cinéticas de disociación de proteínas de las FA mediante FRAP
144
y a algunas proteínas adaptadoras4, mientras que paxilina5 interactúa con varios
componentes estructurales de las FAs (FAK, Src, talina, tubulina y actina) por lo cual es
de esperar que una parte de la población de paxilina no sea accesible al intercambio
(mayor fracción inmóvil). La vinculina por su parte tiene dos tiempos característicos
que se pueden asociar a la presencia de dos subpoblaciones: una rápida, con un tiempo
característico muy corto y una constante de disociación un orden de magnitud mayor
que el resto de las proteínas estudiadas; y otra subpoblación lenta, con una constante de
disociación del mismo orden que el de la zixina. Es interesante observar que según el
ajuste del modelo el 69% de la proteína vinculina pertenecería a la población lenta
mientras que solo el 8% a la rápida. Esto significa que, de la vinculina móvil en la FA,
el 90% conformaría la subpoblación que denominamos lenta, mientras que el 10%
restante sería parte de la subpoblación rápida.
4.4 Respuesta de la cinética de zixina ante estímulos mecánicos y diferencias en la
composición y rigidez de la matriz extracelular.
Para la proteína zixina estudiamos la respuesta de las constantes cinéticas en
función del estiramiento mecánico. Utilizamos el estirador mecánico y las células HC11
cultivadas en membranas de silicona recubiertas con fibronectina. Para el análisis de los
resultados en membranas, dado que se presentaron pequeños corrimientos laterales de
las adhesiones en las secuencias registradas, se utilizó el plugin template matching del
programa ImageJ, que permite corregir pequeños desplazamientos laterales de las
imágenes. Mediante este plugin se alinearon las imágenes antes de realizar el análisis de
FRAP. Dado que las secuencias presentan también fotoblanqueo por adquisición, la
corrección lateral se realizó con el algoritmo Normalized Correlation coefficient, que se
independiza de los valores de intensidad media en las imágenes.
En la Figura 4.4 se presentan imágenes de adhesiones focales que fueron
estudiadas por FRAP en dos estados de estiramiento diferentes: correspondientes a 3 y 7
vueltas del estirador. Analizamos las curvas de recuperación en dos regiones (marcadas
en la Figura 4.4 C) denominadas 1 y 2.
4. Determinación de constantes cinéticas de disociación de proteínas de las FA mediante FRAP
145
Figura 4.4. Estudio de la cinética de zixina en respuesta a la fuerza. FAs marcadas con zixina-EGFP
con 3 (A) y 7 (B) vueltas de estiramiento. Puede verse que la proteína se recluta con la fuerza resultando
en adhesiones más intensas y de mayor área. En C se muestra la célula completa en la que se realizó el
experimento de FRAP en dos regiones nomencladas 1 (región de las imágenes A y B) y 2. Barras 2µm (A
y B) y 10 µm (C).
Como puede apreciarse en la figura 4.4, en respuesta a mayor estiramiento, la
zixina parece reclutarse dando lugar a adhesiones más intensas y de mayor área. Se
realizó el experimento de FRAP para las dos condiciones de estiramiento (3 y 7
vueltas), en las dos regiones marcadas en la Figura 4.4 C. En la tabla 4.2 se presentan
los resultados obtenidos para ambas regiones en las dos condiciones de estiramiento.
Región 1 Región 2
3 vueltas 7 vueltas 3 vueltas 7 vueltas
Área (µm2) 3.0 ± 0.2 5.4 ± 0.1 5.8 ± 0.2 7.0 ± 0.1
m 0.28 ± 0.04 0.32 ± 0.06 0.34 ± 0.07 0.35 ± 0.05
kOFF (1/s) 0.022 ± 0.013 0.013 ± 0.008 0.016 ± 0.011 0.024 ± 0.014
Tabla 4.2. Estudio de la cinética de zixina en respuesta a la fuerza. Resultados de FRAP en células
HC11 expresando zixina-EGFP, en dos condiciones de fuerza: 3 y 7 vueltas. Las Regiones 1 y 2 son las
marcadas en la Figura 4.4 C. Además de los parámetros kOFF y m obtenidos del análisis de FRAP, se
cuantificó el área de las adhesiones.
De los resultados obtenidos puede inferirse que el estiramiento produce un
aumento en el área de las FAs, lo que sugiere el reclutamiento de zixina en las mismas.
Por otro lado, no observamos un cambio evidente en la constante de disociación ni
tampoco parece haber diferencias significativas en la fracción móvil teniendo en cuenta
las incertezas de las mediciones.
A B
3 vueltas 7 vueltas
C
1 2
4. Determinación de constantes cinéticas de disociación de proteínas de las FA mediante FRAP
146
Por último, se presenta una comparación en los parámetros cinéticos de la zixina
para FAs de células cultivadas en diferentes tipos de sustratos. Además de lo ya
presentado en cubreobjetos recubiertos con colágeno y membranas con fibronectina, se
realizaron experimentos en células cultivadas tanto en vidrio desnudo como en
cubreobjetos recubiertos con fibronectina. En la tabla 4.3 se muestra la comparación de
los resultados obtenidos en los diferentes sustratos. Dado que no se evidenciaron
cambios ni en kOFF ni en m en función de la fuerza, para los resultados en membrana se
promediaron las mediciones de los dos estados de tensión medidos. Las células crecidas
en cubreobjetos desnudos presentaron curvas de recuperación más ruidosas, por lo que
los resultados de estas mediciones presentan una mayor incerteza.
kOFF (1/s) tr (s) t 1/2 (s) m N
Vidrio 0,017 ± 0,006 93 ± 34 64 ± 24 0,52 ± 0,07 4
Colágeno 0,020 ± 0,002 57 ± 5 39 ± 4 0,51 ± 0,04 29
Fibronectina 0,021 ± 0,004 66 ± 9 46 ± 6 0,49 ± 0,04 15
FN –membrana 0,023 ± 0,003 48 ± 6 34 ± 4 0,34 ± 0,01 7
Tabla 4.3. Estudio de la cinética de zixina en respuesta a la fuerza. Resultados de FRAP en células
HC11 expresando zixina-GFP, crecidas en diferentes sustratos: vidrio desnudo, vidrio recubierto con
colágeno, vidrio recubierto con fibronectina y membranas de silicona recubiertas con fibronectina. kOFF
refiere a la constante de disociación, mientras que tr y t1/2 son los tiempos característicos, cuando la
recuperación se produjo a 1/e del valor inicial o a 1/2 respectivamente. m es la fracción móvil, y N indica
el número de experimentos promediados.
Según los resultados de la tabla 4.3, la constante de disociación de la zixina a las
adhesiones focales no parece modificarse en respuesta al tipo de sustrato en el que están
adheridas las células. Sí, resulta significativamente menor la fracción móvil en
membrana, respecto a las obtenidas en vidrio (cuyos recubrimientos no parecen afectar
los parámetros). Esto podría explicarse teniendo en cuenta un modelo propuesto por
Wolfenson et al.6, en el que se considera a las adhesiones focales como estructuras
elásticas multiproteicas sujetas a las fuerzas contráctiles de la célula (Figura 4.5) que
pueden deformar su estructura cambiando la distribución de los distintos sitios de unión
para las proteínas que las componen.
4. Determinación de constantes cinéticas de disociación de proteínas de las FA mediante FRAP
147
Figura 4.5. Modelo de sitios de unión en adhesiones focales. Las FAs se representan como estructuras
elásticas en las que las moléculas se ligan de manera transiente, intercambiándose con otras moléculas
fuera de las FAs (estructuras verdes y rojas en el esquema). Cuando la célula es sometida a una fuerza
(indicada por la flecha en A), la FA puede cambiar el número, la conformación y/u organización de los
sitios de unión y con respecto del estado en ausencia de fuerza (B) .
Mediante este modelo, el resultado de la acción de una fuerza sería la exposición
de nuevos sitios de unión anteriormente inaccesibles. En este sentido, la presencia de
nuevos sitios de unión con tiempos de residencia largos podría explicar los cambios en
la fracción móvil de la zixina.
4.5 Conclusiones
Como primera conclusión, pudimos registrar la recuperación de la fluorescencia
luego del fotoblanqueo, revelando el comportamiento dinámico de las proteínas de las
FAs estudiadas. Las curvas de recuperación de las cuatro proteínas estudiadas, zixina,
paxilina, FAK y vinculina se ajustaron adecuadamente al modelo propuesto por Lele,
avalando la hipótesis de que este proceso de recuperación depende sólo de las
constantes de disociación.
Los valores de kOFF obtenidos para las distintas proteínas en células HC11
cultivadas sobre colágeno indicarían que zixina y una población de vinculina poseen
una disociación más lenta, que implica un mayor tiempo de residencia de dichas
proteínas en la adhesión. Para la zixina, este resultado podría estar asociado a la
participación de la proteína en FAs maduras, lo cual se refuerza con el hecho de que la
fracción de moléculas móviles de zixina en las FAs es menor. Ambas observaciones
permiten postular que la asociación/disociación de zixina a las FAs podría ser, en
4. Determinación de constantes cinéticas de disociación de proteínas de las FA mediante FRAP
148
comparación con las otras proteínas estudiadas, un evento menos dinámico, tal vez
relacionado con su participación en FAs estables en el tiempo.
Con respecto a la vinculina, la población rápida presenta un kOFF un orden de
magnitud mayor que el resto de las proteínas. Este resultado podría estar relacionado
con el hecho de que la vinculina es una de las primeras proteínas en reclutarse en la
formación de nuevas adhesiones. Entonces es esperable que exista una fracción de la
vinculina que esté disponible para responder rápidamente a cambios fisicoquímicos en
la célula. Por otra parte, la población lenta de vinculina estaría asociada a un proceso
menos dinámico como es conformar una FA madura. En este sentido, los resultados de
FRAP aquí mostrados indicarían que la mayor proporción de esta proteína forma parte
de la población lenta, en concordancia con haber realizado los experimentos en FAs
maduras.
Utilizando el estirador mecánico y las células HC11 cultivadas en membranas de
silicona recubierta con fibronectina, y expresando la proteína zixina-EGFP, se mostró
que en respuesta a una fuerza mecánica externa se produce un aumento en el área de las
adhesiones, lo que sugiere el reclutamiento de la proteína zixina en las FAs. Estudios
previos muestran cómo las células cultivadas sobre un sustrato blando, a saber: a) un
sustrato de silicona elástica (PDMS) que es estirado cíclicamente en una dirección, o b)
sobre un sustrato de poliacrilamida que es deformado localmente con una aguja de
vidrio, presentan una acumulación de zixina en las FAs y una movilización de esta
proteína hacia las fibras de actina7. Cabe mencionar que en estos experimentos las
células son visualizadas por microscopía de fluorescencia luego de ser fijadas
químicamente, no son mediciones in situ. Nuestros resultados sumados al hecho de que
1) la proteína zixina está localizada principalmente en las adhesiones focales, el sitio
donde se piensa que reside el mecanosensor8, 2) sirve de andamiaje o plataforma en la
FA al unirse/reclutar a varias proteínas tales como �-actinina y miembros de la familia
Ena/VASP9; 3) interacciona directamente con la proteína p130Cas que es potencialmente
una molécula mecanosensora10; 4) su asociación con los extremos de las fibras de actina
y su capacidad de promover el ensamblado del filamento de actina son consistentes con
su participación en la remodelación del citoesqueleto en respuesta a una carga
mecánica11; 5) que el estiramiento cíclico y la relajación del sustrato promueven la
translocación de la zixina desde las FAs hacia los filamentos de actina4 y el núcleo12,
4. Determinación de constantes cinéticas de disociación de proteínas de las FA mediante FRAP
149
nos permiten definir a la proteína zixina como una molécula mecanosensitiva y sugerir
que es fundamental en la respuesta de la célula a una fuerza mecánica.
Para enmarcar nuestros experimentos dentro de los numerosos estudios cinéticos
por FRAP en adhesiones focales reportados en la literatura, confeccionamos la tabla
4.4, en la que se presentan los valores de tiempo medio medidos en este trabajo de tesis
para células HC11, y los informados en la literatura para diferentes tipos celulares, para
las cuatro proteínas adhesivas estudiadas: zixina, paxilina, FAK y vinculina.
Proteína
Células HC11
Publicado en la literatura
Tipo de célula
Zixina 39 ± 4 7.1 ± 0.4 células de endotelio capilar 13
2.8 células HeLa 4
Paxilina 9 ± 1 17.8 ± 1.3 células de endotelio capilar 2
15.3 fibroblastos de embrión de ratón14
41 carcinoma de ratón F9 15
9.1 células HeLa 4
11 fibroblastos NIH 3T3 16
7 células epiteliales LLC-PK1 17
FAK 11 ± 1 6.8 ± 0.7 células de endotelio capilar 2
16.3 ± 2.7 astrocitos humanos 18
17.0 ± 4.0 astrocitos humanos 19
5 células epiteliales LLC-PK1 6
Vinculina 85 ± 17 y 2.5 ± 0.5 11.6 ± 1.7 y 0.72 ± 0.01 células de endotelio capilar 2
8.8 fibroblastos de embrión de ratón2
83 carcinoma de ratón F9 6
8.9–36.2 células PtK1 20
40.1 células HeLa 4
13.0 ± 2 .0 osteoblastos primarios bovinos 21
17 fibroblastos de ratón NIH 3T3 7
20 fibroblastos de ratón NIH 3T3 22
Tabla 4.4. Cinética de disociación de las proteínas de adhesión focal, t1/2: comparación de los
resultados de este trabajo de tesis y la literatura. Tiempos de residencia medios obtenidos por FRAP
en células HC11 en este trabajo de tesis (columna 2) y en otros trabajos de la literatura (columnas 3 y 4).
Se indica en cada caso el tipo celular estudiado.
Es evidente que para las mismas proteínas de adhesión focal las diferencias en
escala de tiempo son grandes para los distintos tipos celulares. Esto podría ser
indicativo de la naturaleza de las interacciones moleculares presentes en las adhesiones
focales en cada tipo celular. Si repasamos los distintos tipos celulares en la tabla, vemos
por ejemplo que para la proteína FAK en astrocitos humanos, dos grupos de
4. Determinación de constantes cinéticas de disociación de proteínas de las FA mediante FRAP
150
investigación obtuvieron valores similares (de 16.3 y 17.0 s), mientras que para
vinculina expresada en fibroblastos de ratón también el t1/2 es equivalente (17 y 20 s).
En conclusión, en este capítulo fue posible determinar un parámetro cinético
molecular en células vivas, que es característico de cada proteína con el complejo
multiproteico presente en una AF. Esta unión podría estar mediada por la interacción
con varias proteínas diferentes, y por lo tanto los parámetros determinados podrían ser
una resultante de distintas afinidades de interacción, estequiometría, heterogeneidad
bioquímica, mecanismos alostéricos, entre otras variables. La utilización de esta
metodología en un contexto en donde se aplican estímulos mecánicos, nos permite
estudiar en células vivas cómo se modifican las propiedades cinéticas de las proteínas
pertenecientes a las AFs, aportando información esencial para la comprensión del
proceso de la mecanotransducción celular.
4.6 Referencias
1 Axelrod D, Koppel DE, Schlessinger J, Elson E, Webb W.W., Biophys J. 16:1055 (1976);
Butler P.J., Tsou T., Zi-Shuan Li J., Usami S., and Chien S., The FASEB Journal 10.1096/fj.01-
0434 (2001). 2 Lele T. P., Thodeti C. K., Pendse J., Ingber D. E., Biochemical and Biophysical Research
Communications 369: 929 (2008) 3 Lele T. P., Thodeti C. K. and Ingber D. E., J Cell Biochem 97:1175 (2006). 4 Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma’ayan, A., Iyengar, R. and Geiger, B., Nat. Cell Biol.
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121:2795 (2008). 8 Bershadsky, A.D., N.Q. Balaban, and B. Geiger, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 19:677 (2003). 9 Beckerle, M.C., Bioessays 1997, 19:949; Drees, B., Friederich, E., Fradelizi, J., Louvard, D.,
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4. Determinación de constantes cinéticas de disociación de proteínas de las FA mediante FRAP
151
Itzkovitz, Avi Ma’ayan, Ravi Iyengar and Benjamin Geiger, Nat. Cell Biol. 9: 858, (2007);
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Biol.Chem. 277:9580 (2002). 11 Fradelizi, J., V. Noireaux, J. Plastino, B. Menichi, D. Louvard, C. Sykes, R.M. Golsteyn, and E.
Friederich, Nat. Cell Biol. 2001, 3: 699; Masaaki Yoshigi, Laura M. Hoffman, Christopher C.
Jensen, H. Joseph Yost, and Mary C. Beckerle, J Cell Biol, 171: 209 (2005). 12 Cattaruzza, M., Lattrich, C. and Hecker, M., Hypertension 43, 726 (2004). 13 Lele T. P., Pendse J., Kumar S., Salanga M., Karavitis J., Ingber D. E., J Cell Physiol 207:187
(2006). 14 von Wichert G., Haimovich B., Feng G. S., Sheetz M. P., Embo J 22:5023 (2003). 15 Cohen D. M., Kutscher B., Chen H., Murphy D. B., Craig S. W., J Biol Chem 281:16006
(2006). 16 Deakin N. O., Ballestrem C., Turner C. E., PLoS ONE 7(5): e37990 (2012). 17 Le Dévédec S. E., Geverts B., de Bont H., Yan K., Verbeek F. J., Houtsmuller A. B., van de
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(2005). 19 Giannone G., Ronde P., Gaire M., Beaudouin J., Haiech J., Ellenberg J., Takeda K., J Biol
Chem 279:28715 (2004). 20 Gupton S.L. , Waterman-Storer C. M., Cell 125:1361 (2006). 21 Tan L., Meyer T., Pfau B., Hofmann T., Tan T.W., Jones D. J Musculoskelet Neuronal
Interact 10(1):92 (2010). 22 Humphries J. D., Wang P., Streuli C., Geiger B., Humphries M. J., and Ballestrem C., J Cell
Biol, 179: 1043 (2007).
Capítulo 5
Determinación del estado de agregación de
proteínas de adhesiones focales en
células vivas por Número y Brillo (N&B)
En este capítulo describo la utilización de la técnica Número y Brillo (N&B) para el
estudio del estado de agregación de proteínas que componen las adhesiones focales en
células HC11. Estudiamos el estado de agregación y concentración de las proteínas
zixina, paxilina, FAK y vinculina. Para la zixina, estudiamos la respuesta de su estado
de agregación ante un estímulo mecánico utilizando el estirador mecánico.
5. Determinación del estado de agregación de proteínas de FA en células vivas por N&B
155
5.1 Introducción
La técnica N&B1 se basa en el análisis de las fluctuaciones de la intensidad de la
fluorescencia en cada píxel de una secuencia de imágenes confocales. Como se
desarrolló en la sección II.2.5c, el grado de agregación de moléculas fluorescentes está
relacionado con la media y la varianza de la distribución de intensidades, por lo que el
análisis de N&B de una imagen permite distinguir píxeles con pocas moléculas muy
brillantes de píxeles con muchas moléculas de menor intensidad. Mediante esta técnica
es posible estudiar el estado de agregación de las proteínas y su concentración en células
vivas.
En nuestros experimentos hemos visto que, en respuesta al estiramiento
mecánico, las adhesiones focales de las células HC11 (marcadas con zixina-EGFP)
cambian su morfología y se reorientan. Se produce el ensamblado de nuevas FA,
mientras otras se desensamblan total o parcialmente en respuesta al estiramiento.
Resulta por lo tanto de gran interés analizar el estado de agregación de las proteínas en
respuesta a este tipo de estímulos, dado que se ha propuesto el reclutamiento y
agregación de proteínas de las FAs (en particular ha sido estudiado para las integrinas2)
durante la formación de las FAs. N&B aparece entonces como una técnica perfecta para
este tipo de experimentos.
5.2 N&B en adhesiones focales. Experimento y análisis.
Implementamos la técnica N&B en células HC11 transfectadas con las
construcciones de zixina, paxilina, FAK y vinculina unidas a la EGFP. El experimento
consiste en tomar una secuencia de imágenes y analizar para cada píxel de la imagen
tanto el valor medio de la intensidad como la varianza, y a partir de los mismos los
valores de número aparente N y brillo aparente B de las proteínas (o agregados de las
mismas) estudiadas. En la Figura 5.1 se presenta un esquema del experimento de N&B
en adhesiones focales: a partir de una secuencia de imágenes (A) de algunas FAs en el
borde de una célula HC11 (marcadas con zixina-EGFP) se analiza para cada píxel de la
secuencia la media y la varianza para calcular N y B. Se realiza un histograma
bidimensional de N vs. B (B) en el que se correlacionan los valores de N y B obtenidos
5. Determinación del estado de agregación de proteínas de FA en células vivas por N&B
156
para cada píxel de la imagen, asignando una escala de colores a los puntos del mapa en
el que el color representa la cantidad de píxeles cuyos valores de N y B coinciden en ese
lugar del histograma. En el mapa N vs. B se observa la presencia de diferentes
poblaciones (en el ejemplo son 3 poblaciones), las cuales se pueden corresponder en la
imagen seleccionando las tres regiones en el mapa y asignando colores en la imagen a
los píxeles que provienen de cada región seleccionada (C). En este caso se ve que las
tres regiones en las FAs corresponden al background (rojo), al citoplasma (verde) y a
las FAs (azul). Finalmente se analiza el valor de B de cada región haciendo un
histograma (D). Teniendo en cuenta que para las regiones donde no hay dinámica el
valor de B es de la unidad, se comparan las diferencias (o el brillo verdadero �) teniendo
en cuenta el valor calibrado para la proteína monomérica. La fracción entre el brillo
medido y el brillo de la proteína monomérica (�medido/ �mGFP) es justamente el número
de agregación.
Mapa N vs. B
t
B
Histograma de B
Mapa N vs. B
t
B
Histograma de B
A B
C D
Figura 5.1 Análisis de N&B en adhesiones focales de HC11 marcadas con zixina-EGFP. A Se
registra una secuencia de imágenes en función del tiempo. B A través del análisis de la media y la
desviación de la intensidad se obtienen N y B, y se confecciona el histograma 2D de N vs. B, en el que se
diferencian tres regiones bien marcadas. C Píxeles de la imagen correspondientes a cada región de B:
ruido de fondo (rojo), citoplasma (verde) y adhesiones focales (azul). D Histograma de B en cada una de
las regiones.
5. Determinación del estado de agregación de proteínas de FA en células vivas por N&B
157
Como se mencionó en la sección II.2.5c, el tiempo por píxel utilizado para tomar
las imágenes debe ser lo suficientemente corto para no promediar las fluctuaciones
debidas a la entrada y salida de las moléculas en el volumen confocal iluminado.
Además, el tiempo entre imágenes debe ser suficiente para que las mediciones de
intensidad en el tiempo sean independientes entre sí. En los experimentos presentados
en este capítulo tomamos secuencias de 100 imágenes de 256x256 píxeles, con un
tiempo por píxel de 10 µs y un tiempo por imagen de 0.98 s. El tamaño del píxel de los
datos medido fue de entre 20 y 100 nm.
Todos los datos fueron tomados en el microscopio confocal FV1000 espectral de
Olympus. Utilizamos un objetivo de inmersión en aceite 60X 1.35 NA (Olympus) en el
caso de los experimentos en cubreojetos, mientras que para los experimentos en
membrana utilizamos un objetivo de aire 40X 0.75 NA (Zeiss). Se trabajó en el modo
pseudo-conteo de fotones, para lo cual inmediatamente después de cada experimento se
adquirieron otras 100 imágenes con el láser obturado para estimar el factor de
calibración S. Se trabajó con la cámara ambiental a 37°C, luego de esperar
aproximadamente 120 minutos para que se estabilicen tanto la temperatura como los
detectores.
Dado que para N&B trabajamos únicamente con la GFP como fluoróforo, se
iluminó con la línea de 488 nm del láser de argón del microscopio. Las secuencias de
imágenes fueron totalmente analizadas mediante una rutina escrita en la plataforma
Matlab.
Se descartaron las mediciones que presentaron un fotoblanqueo mayor al 15%,
para no realizar correcciones por fotoblanqueo. Por otro lado, se corroboró en cada caso
que el histograma de intensidad no presente saturación (i.e. que las intensidades
medidas den cuenta de las fluctuaciones por la entrada y salida de moléculas del
volumen confocal).
Calibración del brillo molecular del monómero
Se calibró el brillo molecular del monómero de GFP utilizando como muestra
una gota de solución 50 nM de mGFP en buffer TRIS 10mM 1% BSA (se agrega al
buffer la proteína BSA para evitar que se formen agregados en la solución), sobre un
cubreobjetos. En la Figura 5.2 se presenta la calibración para diferentes potencias del
5. Determinación del estado de agregación de proteínas de FA en células vivas por N&B
158
láser de excitación, donde puede verse la relación lineal esperada del brillo molecular
con la potencia (lo que indica además que con los niveles de intensidad medidos
estamos por debajo del nivel de saturación).
3 4 5 6 7 8 90.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
Bril
lo m
olec
ular
mG
FP
Potencia (µ Watt) Figura 5.2 Calibración del brillo molecular (�mGFP) del monómero. Se presenta el brillo molecular
obtenido en una de las calibraciones, en función de la potencia láser utilizada. Se puede ver que la
dependencia del brillo con la potencia se corresponde con la relación lineal esperada.
La calibración del monómero se realizó en todas las condiciones de potencia y
tiempos utilizadas en los experimentos, y tanto en cubreobjetos como en membranas de
silicona. Es importante que la calibración se realice periódicamente, ya que aunque se
trabaje con los mismos niveles en porcentaje de potencia láser, ésta puede variar en el
transcurso de días/semanas. En el caso particular del microscopio utilizado en este
trabajo, el láser de argón con el que cuenta ya tiene varios años de funcionamiento y se
ha observado que su potencia en el último tiempo ha decaído notablemente. Por esta
causa, la calibración del monómero se realizó semanalmente.
5.3 Caracterización del estado de agregación de proteínas de las adhesiones focales
Mediante la técnica N&B se estudió el estado de agregación de las proteínas
FAK, paxilina, vinculina y zixina, en adhesiones focales de células HC11 cultivadas
sobre cubreobjetos recubiertos con fibronectina, y en estado de equilibrio (no sometidas
a estímulos mecánicos externos). En la Figura 5.3 presentamos resultados
representativos para las proteínas paxilina y vinculina. En el caso de paxilina, se puede
ver que el máximo del histograma en B correspondiente a la región del citoplasma y el
5. Determinación del estado de agregación de proteínas de FA en células vivas por N&B
159
de las FAs se encuentra en el mismo valor. Para el ejemplo de vinculina se puede
observar un corrimiento en el valor máximo de B en las FAs respecto del citoplasma, lo
que indicaría un estado de agregación mayor. Además de cuantificar el valor de B,
realizamos un mapa de N, que nos da idea de la distribución de proteína en las FAs en
términos de concentración.
1 2 30
100
200
300
400
500
600
1 µm
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
6
7
0 1 20
200
400
600
800
B
1 µm
Vinculina
Paxilina
A
D
B C
D E
1 2 30
100
200
300
400
500
600
1 µm
1
2
3
4
5
1 2 30
100
200
300
400
500
600
1 µm
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
6
7
0 1 20
200
400
600
800
B
1 µm
1
2
3
4
5
6
7
0 1 20
200
400
600
800
B
1 µm
Vinculina
Paxilina
A
D
B C
D E
Figura 5.3 N&B en adhesiones focales de HC11 marcadas con paxilina-GFP y vinculina-GFP. Mapa
de N, histogramas de B de las distintas regiones y regiones coloreadas en la imagen para paxilina (A-C) y
vinculina (D-F). Las regiones corresponden a ruido de fondo (azul), citoplasma (verde) y adhesiones
focales (rojo).
En la Tabla 5.1 se muestran los resultados generales para las cuatro proteínas
estudiadas, a partir de una estadística en diferentes células.
proteína
# células
# FA
%
�citoplasma/�mGFP
�FA/�mGFP
NFA/Ncitoplasma
50 % 4.0 ± 0.6 2.8 ± 0.4 5.5 ± 1.5
Vinculina
6
8 50 % 2.7 ± 0.4 2.3 ± 0.4 4.6 ± 1.1
Paxilina 4 6 100 % 3.2 ± 0.7 2.7 ± 0.9 4.3 ± 0.9
FAK 4 14 100 % 1.8 ± 0.4 1.8 ± 0.3 3.7 ± 1.1
Zixina 4 7 100 % 2.4 ± 0.2 2.2 ± 0.4 5.7 ± 1.3
Tabla 5.1. Resumen de estado de agregación de proteínas de las FA. Datos promediados de los brillos
moleculares relativos de la región de la FA y citoplasma con respecto al del monómero y su diferencia. Se
indican número de células analizadas y número de FA analizadas en cada caso. En la última columna se
presenta el promedio del cociente entre el número aparente de proteínas en la FA con respecto al del
citoplasma. Se consideró como error la desviación estándar de los datos.
5. Determinación del estado de agregación de proteínas de FA en células vivas por N&B
160
Para paxilina, FAK y zixina el comportamiento fue similar en todas las células
estudiadas, resultando en un estado de agregación de aproximadamente 2 (presencia de
dímeros) tanto en el citoplasma como en las adhesiones focales. Para vinculina sin
embargo, observamos dos comportamientos: en la mitad de los experimentos estaría
formando dímeros tanto en las FA como en el citoplasma, mientras que en la otra mitad
estaría agregada en tetrámeros en las FA.
vinculin 1 vinculina 2 Pax FAK Zyx1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
Est
ado
de A
greg
aci�
n
Estado de agregaci � n en la AF Estado de agregaci � n en el citoplasma
Figura 5.4. Análisis del estado de agregación de proteínas de las FAs. Datos promediados de los
brillos moleculares relativos de la región de la FA y citoplasma con respecto al del monómero. Las barras
de error representan la desviación estándar.
En la Figura 5.4 se presentan estos resultados de forma gráfica. Como puede
verse, salvo en el primer caso de la vinculina, las proteínas se encontrarían en general en
el mismo grado de agregación en el citoplasma que en la FA. Parecería que se trata de
un agregado dimérico, pudiendo ser un trímero en el caso de la paxilina. Vinculina 1 y
vinculina 2 se refieren en este gráfico a los dos comportamientos encontrados para la
vinculina, los cuales fueron analizados de manera separada. Se observa claramente que
una de las poblaciones de vinculina se encuentra en la adhesión focal en un estado de
agregación mayor que en el citoplasma. Este resultado podría estar relacionado con el
hecho de que la vinculina presentaría sitios de unión a vinculina3.
La concentración de las proteínas obtenida del análisis de los valores de N,
resultó ser entre 4 y 6 veces mayor en la FA que en el citoplasma.
5. Determinación del estado de agregación de proteínas de FA en células vivas por N&B
161
5.4 Estudio del estado de agregación de la proteína de adhesiones focales zixina en
respuesta a un estímulo mecánico
Para la proteína zixina, postulada como una de las sensoras de la fuerza,
estudiamos la respuesta en el estado de agregación antes y después de aplicar un
estiramiento mecánico. En la Figura 5.5 se muestra una célula HC11 marcada con
zixina-GFP antes y después de aplicársele una tensión correspondiente a una vuelta del
estirador (correspondiente a un estiramiento radial de aproximandamente el 4%). Se
puede observar que en respuesta al estiramiento algunas adhesiones focales se
desensamblan total (1) o parcialmente (2), otras aumentan su volumen e intensidad (3-
4), algunas mantienen su intensidad constante (5) mientras que también se forman
adhesiones nuevas (6). También se observa una orientación particular del general de las
adhesiones.
1
2 2
3 3
4 4
5 5
6
tensión inicial + tensión
Figura 5.5. Respuesta de la proteína zixina en adhesiones focales ante un estiramiento mecánico. Se
puede observar que en respuesta al estiramiento algunas adhesiones focales se desensamblan total (1) o
parcialmente (2), otras aumentan su volumen e intensidad (3-4), algunas mantienen su intensidad
constante (5) mientras que también se forman adhesiones nuevas (6). También se observa una orientación
particular del general de las adhesiones. Las tablas debajo de cada figura presentan los resultados sobre el
estado de agregación y número de moléculas de cada región marcada.
región εcitoplasma/εmGFP εFA/εmGFP NFA/Ncitoplasma
1 3.65 ± 0.26 10.96 ± 0.76 3.45 ± 0.20
2 3.27 ± 0.23 0.96 ± 0.07 2.56 ± 0.15
3 3.65 ± 0.26 5.38 ± 0.38 3.70 ± 0.22
4 2.88 ± 0.20 6.54 ± 0.46 2.78 ± 0.17
5 3.65 ± 0.26 2.88 ± 0.20 3.22 ± 0.19
región εcitoplasma/εmGFP εFA/εmGFP NFA/Ncitoplasma
3 1.34 ± 0.09 0.96 ± 0.07 3.70 ± 0.22
4 3.85 ± 0.27 3.65 ± 0.26 2.86 ± 0.17
5 4.2 ± 0.29 3.85 ± 0.27 2.86 ± 0.17
6 1.54 ± 0.11 1.15 ± 0.08 3.33 ± 0.20
5. Determinación del estado de agregación de proteínas de FA en células vivas por N&B
162
En la Figura 5.6 se presentan los resultados de número y brillo promedio para
las regiones indicadas en la Figura 5.5. Los datos corresponden al estado de agregación
en citoplasma y FA, antes y después del estiramiento, mientras que se comparó el
número de moléculas (o agregados) en las adhesiones respecto del citoplasma para las
dos situaciones de tensión. Observamos que la relación entre la concentración de zixina
en las FA respecto de la concentración en citoplasma permanece constante después del
estiramiento y es aproximadamente tres veces más concentrada en las adhesiones. El
estado de agregación tiende a mantenerse constante o bien decrecer en algunas de las
FA después de aplicarse la fuerza mecánica.
0
1
2
3
4
5
6
7
54
ε/ε m
GF
P
Citoplasma 0 vueltas FAs 0 vueltas Citoplasma 2 vueltas FAs 2 vueltas
Region3
Figura 5.6. Cuantificación del brillo de agregados de zixina ante un estiramiento mecánico. Se
analizaron las regiones 3, 4 y 5 marcadas en la Figura 5.4. Las barras en fondo blanco corresponden al
estado de agregación en citoplasma, mientras que en color se representa el estado de agregación en las
FAs para la tensión inicial (gris) y al aplicarse dos vueltas de estiramiento (rojo) para la tensión inicial. El
estado de agregación tiende a mantenerse constante o bien decrecer en algunas de las FA después de
aplicarse la fuerza mecánica.
5.5 Estado de agregación de la proteína zixina durante el desensamblado de una
adhesión focal
Después de aplicar el estímulo mecánico un pequeño conjunto de adhesiones
focales se desensambló. Pudimos medir la secuencia temporal de 100 imágenes durante
el desensamblado y aplicar el método de N&B separando las primeras 24 imágenes
5. Determinación del estado de agregación de proteínas de FA en células vivas por N&B
163
(antes del desensamblado) las últimas 63 (una vez desensambladas las FAs).
Analizamos el estado de agregación de zixina en las adhesiones y citoplasma antes de
desensamblarse las FAs y su estado de agregación en el citoplasma luego de
desensamblada la adhesión. En la Figura 5.7 se pueden ver algunas imágenes de la
secuencia de desensamblado, así como el análisis de N&B antes y después del mismo.
A
B C
B B
A
B C
B B
�/�mGFP
1.56 ± 0.02�/�mGFP
3.85 ± 0.02
Figura 5.7 Desensamblado de adhesiones focales marcadas con zixina-GFP. A Secuencia de
imágenes que muestra el desensamblado de un grupo de adhesions focales, separadas temporalmente 9.78
segundos. Del arreglo de 100 imágenes, analizamos mediante el método de N&B las primeras 24
imágenes (FAs formadas) y las últimas 63 (FAs ya desensambladas). Para antes (B) y después (C) del
desensamblado, presentamos las regiones analizadas y los histogramas de B en cada caso. Los valores de
brillo obtenidos (respecto del brillo de mGFP) sugieren que la zixina se agrega en la parte más interna de
la célula después del desensamblado de la adhesión focal.
En este caso se analizó el brillo promedio en la célula (tomando FAs y
citoplasma) respecto del valor del background. El estado de agregación promedio (valor
del brillo relativo al del monómero) pasó de un valor de (1.56 ± 0.02) antes del
desensamblado a ser (3.85 ± 0.02) cuando ya no hay adhesiones. Este resultado
indicaría que durante el desensamblado de las FAs, la proteína zixina se agrega en una
zona interior de la célula. Esto concuerda con un experimento realizado por Yoshigi y
colaboradores, quienes encontraron que la zixina transloca a los filamentos de actina4.
Los resultados aquí presentados demuestran que este tipo de experimentos nos permiten
investigar el estado de agregación de las proteínas de las FAs en células vivas, y su
respuesta ante un estímulo mecánico.
5. Determinación del estado de agregación de proteínas de FA en células vivas por N&B
164
5.6 Conclusiones
La técnica Número y Brillo fue implementada con éxito para determinar el
estado de agregación de las proteínas de las adhesiones focales zixina, paxilina, FAK y
vinculina, en células vivas de la línea HC11.
En el caso del estudio de las proteínas de adhesión paxilina, FAK y zixina, todas
las mediciones analizadas dan resultados similares entre sí, que indicarían que estas
proteínas se encuentran en el mismo grado de agregación en el citoplasma que en la FA
para esta línea celular. Parecería que se trata de un agregado dimérico, pudiendo ser un
trímero en el caso de la paxilina. La concentración de dichas proteínas resultó entre 4 y
6 veces mayor en la FA que en el citoplasma.
Con respecto a la vinculina, se encontraron dos tipos de casos con la misma
probabilidad: en el 50% de las mediciones analizadas el estado de agregación del
citoplasma y FA es el mismo, mientras que en el otro 50% de los casos se observa una
diferencia, indicando un estado de agregación mayor en la FA. Esto podría estar
relacionado con que la vinculina tiene sitios de unión para vinculina. En todos los casos
la concentración en la FA es 5 - 6 veces mayor que en el citoplasma.
En cuanto al estiramiento de las células, fue posible cultivar células HC11 en
membranas elásticas de silicona cubiertas con fibronectina y transfectarlas para la
expresión de zixina unida a EGFP. La técnica N&B fue exitosamente aplicada en estos
cultivos, y fuimos capaces de estudiar in vivo la misma célula antes y después de aplicar
el estiramiento. Observamos que en respuesta al estímulo mecánico las adhesiones
focales pueden remodelarse cambiando su morfología inicial, y también desensamblarse
total o parcialmente. También vimos una orientación determinada de las FA después del
estiramiento, así como la formación de adhesiones nuevas.
Analizamos el estado de agregación de la proteína zixina antes y después del
estiramiento, obtuvimos que en general en las adhesiones focales el estado de
agregación permanece constante o bien decrece luego del estímulo. Por otro lado,
nuestros resultados indicarían que, durante el desensamblado de las FA, la proteína
zixina se agrega en una zona interior de la célula. Esta observación estaría en
concordancia con resultados ya informados por otros grupos.
5. Determinación del estado de agregación de proteínas de FA en células vivas por N&B
165
5.7 Referencias
1 Digman, M. A., Dalal, R., Horowitz, A. F. and Gratton, E., Biophys. J. 94: 2320 (2008). Dalal
R. B., Digman M.A., Horwitz A. F., Vetri V., and Gratton E., Microscopy Res. And Tech. 71: 69
(2008). 2 Roca-Cusachs P., Gauthier N.C., del Rio A. and SheetzM.P., PNAS 106: 16245 (2009). 3 Humphries J. D., Wang P., Streuli C., Geiger B., Humphries M. J., and Ballestrem C., J. Cell
Biol. 179: 1043 (2007). 4 Yoshigi M. et al., J. Cell Biol. 171: 209 (2005).
Capítulo 6
Sensor de tensión de vinculina: caracterización de
fuerzas mecánicas en células vivas por FRET
En este capítulo describo la utilización de la técnica de transferencia de energía
resonante de Förster (FRET) para el sensado de fuerzas mecánicas en la célula a través
de la utilización de un sensor intramolecular para la proteína de adhesión vinculina.
Presento también el análisis del estado tensional de la vinculina en respuesta al
estiramiento mecánico de las células.
6. Sensor de tensión de vinculina: caracterización de fuerzas mecánicas por FRET
169
6.1 Introducción
La utilización de sensores de FRET intramoleculares ha resultado de gran interés
dado que permite medir cambios conformacionales per se de algunas proteínas, así
como también cambios conformacionales que pueden ser asociados a distintos tipos de
actividad biológica, como puede ser la activación de algunas enzimas. Por ejemplo,
existen numerosos sensores basados en FRET para determinar activación de GTPasas
de la familia Rho1.
En este capítulo describo la utilización de un biosensor molecular capaz de
sensar la tensión producida sobre una proteína específica en células vivas con
sensibilidad de pN. El biosensor se basa en la proteína vinculina, una de las proteínas de
adhesiones focales estudiadas en este trabajo, y a la cual se la considera como
responsable del acople mecánico entre las integrinas y los filamentos de actina del
citoesquleto. Además, se conoce que su reclutamiento en las FA depende de la fuerza2.
El sensor de tensión de vinculina
El grupo del Dr. Schwartz diseñó recientemente una técnica basada en
microscopía óptica que permite la medición de fuerzas en el orden de los pN a través de
distintas moléculas en una célula viva. Este método está basado en un efecto físico
como es la transferencia de energía resonante de Förster (FRET), la cual como tratamos
en la sección II.2.5a de este trabajo puede ocurrir entre dos fluoróforos adyacentes.
Basados en la dependencia de la eficiencia de FRET con la distancia, la estrategia
consistió en insertar entre los dos fluoróforos de la construcción un espaciador flexible.
Este espaciador peptídico deriva de la proteína de la seda de araña la cual puede ser
estirada por unos pocos pN. Así, las fuerzas en el sensor de tensión extenderían el
espaciador con lo que se separarían los fluoróforos, y la eficiencia de FRET se reduciría
(Figura 6.1 A-B). La insersión de este biosensor en proteínas de interés permite, como
se mencionó anteriormente, la visualización de la tensión a través de moléculas en
células vivas. Tanto el desarrollo como la caracterización del sensor de tensión
insertado en la proteína vinculina (Vin-TS) fueron realizados recientemente por el grupo
del Dr. Schwartz3. Sumado al sensor de tensión, diseñó también una molécula control
en la que la señal de FRET no respondería a la tensión (Figura 6.1 E) dado que no
posee la parte posterior de la vinculina (tail-less o Vin TL).
6. Sensor de tensión de vinculina: caracterización de fuerzas mecánicas por FRET
170
Figura 6.1 Construcciones del sensor de tensión de Vinculina (VinTS). A El módulo sensor de tensión
(TSMod) consiste en dos fluoróforos separados por una secuencia espaciadora flageliforme (GPGGA)8. B
Cuando la fuerza sobre el TSMod extiende al espaciador elástico, la eficiencia de FRET decrece (f =
fuerza). C El sensor de tensión de vinculina (VinTS) consiste en el TSMod insertado luego del
aminoácido 883 de la molécula de vinculina. D Control vinculina–Venus (VinV). E Control de vinculina
que no es sensible a la fuerza (si la parte posterior de la molécula, tail-less o VinTL).
En la Figura 6.2 se presentan imágenes de la expresión del sensor en células
HC11, en los canales de la proteína fluorescente Turquesa (mTFP, derivado de CFP) y
la proteína fluorescente Venus (derivado de YFP) de manera independiente (tomados en
forma secuencial). Como puede verse, el sensor se expresa con mayor intensidad en las
adhesiones focales, en forma análoga a como se expresa el vector que codifica
vinculina-EGFP (imagen de la derecha).
Figura 6.2 Expresión del sensor de tensión de vinculina en células HC11. Las imágenes fueron
tomadas en los canales de mTFP (izquierda) y Venus (centro) de manera independiente (modo
secuencial) en el microscopio confocal FV1000 espectral. Derecha: células que expresan Vin-EGFP.
Barra 5µm.
> FRET
< FRET
linker elástico
> FRET
< FRET
linker elástico
A
B
C
D
E
6. Sensor de tensión de vinculina: caracterización de fuerzas mecánicas por FRET
171
6.2 FRET por ratio-imaging
La técnica más simple de medir FRET se conoce como ratio-imaging, y refiere a
la medición del cociente entre imágenes. El experimento consiste en excitar con la
longitud de onda de excitación del dador, y registrar las imágenes tanto en el canal de
emisión del dador (ID) como en el del aceptor (IFRET, se denomina canal de FRET al
canal que resulta de iluminar con la longitud de onda de excitación del dador y adquirir
en la banda de emisión del aceptor). El cociente entre estas dos señales es lo que se
denomina FRET-ratio R (ecuación 6.1)
EI
IR
D
FRET ∝= 6.1
En el caso particular de los sensores intramoleculares, este cociente es
proporcional a la eficiencia de FRET (E) dado que la concentración relativa entre dador
y aceptor está fija. Esta medición no arroja un valor cuantitativo de la eficiencia de
FRET, ya que su valor absoluto no da información sobre la distancia a la que se
encuentran las moléculas. Sin embargo, resulta de mucha utilidad dado que dentro de la
misma célula se pueden cuantificar cambios relativos en la eficiencia de FRET. Por otro
lado, si las condiciones de expresión son las mismas y los parámetros de adquisición del
microscopio no se cambian, podemos cuantificar de forma relativa la eficiencia de
FRET entre células de distintos preparados.
Figura 6.3 Experimento de FRET por Ratio-imaging con el sensor de tensión vinculina en células
HC11. Iluminando con la línea de 458 nm (excitación de mTFP) se registran el canal de mTFP (A) y el
canal de FRET (o de emisión de Venus, B). Mediante la ecuación 5.1 se calcula el mapa del ratio R (C),
proporcional a la eficiencia de FRET. Barra 5 µm.
A B C
6. Sensor de tensión de vinculina: caracterización de fuerzas mecánicas por FRET
172
En la Figura 6.3 se puede ver un ejemplo de experimento: se toman
simultáneamente los dos canales (mTFP y Venus), iluminando sólo con el láser de
excitación de mTFP (458 nm). Una vez tomadas las imágenes, se calcula píxel a píxel el
valor del FRET-ratio según la ec. 5.1, obteniendo como resultado una imagen o mapa
proporcional a la eficiencia de FRET. Antes de hacer el cociente entre las imágenes, se
le resta a cada una su ruido de fondo promedio (calculado como la intensidad media en
una región en la que no se ve célula). Se aplica también una máscara definiendo un
umbral de intensidad, para evitar calcular el R en zonas donde la intensidad es del orden
del background (en donde los valores de R calculados carecen de sentido fotofísico).
Las imágenes de células cultivadas en cubreobjetos fueron tomadas con una
lente objetivo de magnificación 60X, NA 1.35 de inmersión en aceite, UPlanSApo
(Olympus). Las imágenes de células crecidas en membranas de silicona fueron tomadas
con una lente objetivo 40X, NA0.95 de aire UPlanSApo (Olympus).
6.3 Controles por sangrado espectral
En este tipo de experimentos en los que se adquieren simultáneamente imágenes
de más de un canal, es muy importante tener en cuenta lo que se conoce como sangrado
espectral. El sangrado espectral (del inglés spectral bleed through) refiere a la emisión
de un fluoróforo que se detecta en el canal del otro y contribuye así con una parte de la
intensidad registrada que no corresponde al fluoróforo que se pretende visualizar en ese
canal.
En el caso de los fluoróforos mTFP y Venus, observamos que se produce un
sangrado de la emisión de mTFP en el canal de Venus. Esto conduce a que, aún sin la
presencia del fluoróforo Venus, tengamos una señal basal de FRET-ratio debida
únicamente al sangrado de la emisión de mTFP en el canal de Venus. En este sentido,
uno de los controles que se realizaron fue el de caracterizar el sangrado y cuantificar el
valor basal de R que el mismo produce. En la Figura 6.4 se muestran los resultados de
dicho control, realizado en una célula HC11 expresando vinculina-mTFP. Puede verse
que en el canal de Venus excitando con 515 nm (IVenus, C) la señal obtenida es la señal
de fondo. Sin embargo, al excitar con 458nm vemos fluorescencia tanto en el canal de
mTFP (ImTFP, A) como en el canal de Venus (IFRET, B). La señal en el canal de FRET
corresponde únicamente al sangrado. Se cuantificó entonces el FRET-ratio por sangrado
6. Sensor de tensión de vinculina: caracterización de fuerzas mecánicas por FRET
173
(Fig. 6.4 C), obteniendo una valor medio de 0.9 (y una desviación de 0.7). Observamos
que el valor de R en las adhesiones focales resulta uniforme.
Figura 6.4 Señal de FRET-ratio basal por sangrado espectral. Estudio de una célula HC11 expresando
Vinculina-mTFP. Iluminando con la línea de 458 nm se registran el canal de mTFP (A) y el canal de
FRET (B). Mediante estas dos imágenes se obtiene el mapa de R (C). Mediante la ecuación 5.1 se calcula
el mapa del ratio R (C). Iluminando con el láser de 515nm en el canal de Venus no se obtiene señal (D).
Barra 5 µm.
Para corroborar independientemente que la señal de FRET-ratio medida a partir
de la construcción Vin-TS corresponde a la transferencia de energía entre los
fluoróforos que la componen, realizamos un control por fotoblanqueo del aceptor.
Dicho control consistió en hacer el experimento usual, fotoblanquear el aceptor con el
láser de 515 nm hasta que no sea más detectable, y repetir el experimento sin aceptor.
En la Figura 6.5 se presentan las imágenes de una región de una célula HC11
expresando en sensor Vin-TS, antes (A) y después (B) de fotoblanquear el aceptor. Para
corroborar que el aceptor se haya fotoblanqueado, se tomaron imágenes en el canal
Venus (IVenus, iluminando con 515nm) antes y después de fotoblanquearlo.
Podemos apreciar que la señal de R disminuye claramente al fotoblanquear por
lo que podemos decir que el R medido tiene una contribución en la transferencia de
A B
C D
ImTFP IFRET
IVenus R
6. Sensor de tensión de vinculina: caracterización de fuerzas mecánicas por FRET
174
energía real. Al destruir fotofísicamente al aceptor, el valor del FRET-ratio decae al
valor basal esperado debido al sangrado.
Figura 6.5 Control por fotoblanqueo del aceptor. Célula HC11 expresando la construcción Vin-TS
antes (A) y después (B) de fotoblanquear el aceptor. ImTFP corresponde al canal de mTFP e IFRET al canal
de Venus, ambos iluminados con 458nm. IVenus corresponde al canal de Venus iluminado con 515nm. R es
el mapa de FRET-ratio, el cual da un valor medio de 1.37 (desviación estándar 0.84) antes de
fotoblanquear el aceptor; mientras que en ausencia de aceptor da un valor medio de 1.19 (desviación
estándar 0.73). Barra 2 µm.
Cabe aclarar que, como puede verse, fue imposible no fotoblanquear también en
una proporción al dador (aproximadamente un 30% de la intensidad inicial). Este hecho
no interfiere con nuestro control dado que el sangrado es proporcional a la intensidad
del dador. Por lo tanto, el cociente entre los canales debido al sangrado se debería
mantener constante, lo que se corrobora al obtener luego de fotoblanquear el aceptor el
valor de R basal por sangrado.
6.4 Visualización del sensado de tensión in vivo
Nuestro primer estudio en cuanto al sensado de fuerzas con este biosensor
consistió en expresar, tanto el sensor Vin-TS como el control Vin-TL, en células HC11
cultivadas en cubreobjetos recubiertos con la proteína fibronectina. En la Figura 6.6 se
A
B
ImTFP
ImTFP
IFRET
IFRET
IVenus
IVenus
R
R
6. Sensor de tensión de vinculina: caracterización de fuerzas mecánicas por FRET
175
presentan mediciones representativas del cociente de FRET comparado para células
HC11 transfectadas con el sensor de tensión (Vin-TS) y con el control que no cambia su
conformación (Vin-TL).
Figura 6.6. FRET-ratio en células HC11 expresando Vin-TS y Vin-TL. El cociente de FRET es menor
en células expresando Vin-TS (A-D) respecto de las que expresan Vin-TL (E-H), representando la
tensión celular en ausencia de un estímulo mecánico externo. En los histogramas se nota también que el
ratio es menor para TS (media 1.54, desviación estándar 0.86) que para TL (media 2.23, desviación
estándar 1.42). Barras: 10 µm en A y E, 2 µm en B,C,F,G.
Como puede observarse, el ratio es mayor en las células transfectadas con Vin-
TL que en las transfectadas con Vin-TS. Dado que una menor señal de FRET se
corresponde con una mayor tensión, los resultados de la Figura 5.3 indicarían que las
células cultivadas sobre cubreobjetos cubiertos con fibronectina, están sometidas a
tensiones aún en ausencia de estímulos mecánicos externos. Esta situación es la que
consideraríamos como situación de reposo.
Como paso siguiente medimos la respuesta de la eficiencia de FRET (a través
del FRET-ratio) en células cultivadas sobre las membranas de silicona cubiertas de
fibronectina, y se utilizó el dispositivo estirador (sección II.4.5) para aplicar un estímulo
mecánico externo. En la Figura 6.7 muestro una célula HC11 cultivada sobre
membrana de silicona y expresando la construcción del sensor de tensión para
vinculina. Presento la imagen de superposición de los canales correspondientes a la
0 2 4 60
12000
FRET-ratio
cuen
tas
0 2 4 60
FRET-ratio
cue
ntas
A B C
D
E F G
H
Vin-TS
Vin-TL
6. Sensor de tensión de vinculina: caracterización de fuerzas mecánicas por FRET
176
detección de mTFP y Venus, y entre la imagen anterior y la de luz transmitida. En esta
última se puede apreciar la presencia de otras células no transfectadas en la muestra.
Figura 6.7. Células HC11 expresando Vin-TS cultivadas en membranas de silicona-fibronectina.
Imagen de superposición entre ambos canales de detección de la fluorescencia (izquierda) y superposición
de la señal de fluorescencia y luz transmitida (derecha).
Figura 6.8. Células HC11 expresando Vin-TS cultivadas en membranas de silicona-fibronectina y
estiradas con el dispositivo mecánico. Imágenes en superposición de los canales de detección, en
función del número de vueltas en el estirador, de una región de la célula que presenta varias adhesiones
focales. Imagen del cociente de FRET (abajo, derecha) y cálculo del valor promedio del ratio sobre las
regiones indicadas en la imagen de la derecha en función del número de vueltas. En el citoplasma
(regiones circulares) no se observó ninguna tendencia.
7V1V 5V3V 7V1V 5V3V 7V7V1V1V 5V5V3V3V
1 2 3 4 5 6 7
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
FR
ET
ra
tio
Numero de vueltas
AF A AF B AF C AF D
AB
C
D
Citoplasma
1 2 3 4 5 6 7
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
FR
ET
ra
tio
Numero de vueltas
AF A AF B AF C AF D
AB
C
D
CitoplasmaAB
C
D
Citoplasma
6. Sensor de tensión de vinculina: caracterización de fuerzas mecánicas por FRET
177
Ampliando la región indicada en la figura anterior (Fig. 6.7), podemos observar
en detalle qué pasa con las FAs en función del número de vueltas que damos con el
estirador (Figura 6.8). La Figura 6.8 ilustra la evolución de la proteína vinculina a
medida que se estira el sustrato de silicona. Observamos que las adhesiones se
mantienen en la misma región de la periferia de la célula, la intensidad disminuye, en
parte debido al fotoblanqueo de la fluorescencia, y algunas de las FAs aumentan de
tamaño, parecen elongarse. Se calculó el valor del coeficiente de FRET promedio en
cuatro FAs llamadas A, B, C y D. Graficando el FRET-ratio en función del número de
vueltas encontramos que en las cuatro adhesiones el valor aumenta lo que indicaría que
la tensión en la molécula de vinculina disminuye. Se cuantificó también el ratio en el
citoplasma, obteniendo que no presenta una tendencia determinada con el número de
vueltas.
6.5 Conclusiones
Utilizando el sensor de tensión codificado genéticamente para la proteína
vinculina se pudo observar, a través de la técnica FRET, que las células cultivadas sobre
fibronectina están sometidas a tensiones aún en ausencia de estímulos mecánicos
externos. El sensor de tensión permite la detección de fuerzas a nivel molecular dentro
de la célula viva, por lo que nos permite obtener información acerca del estado de
tensión intracelular.
Mediante la utilización de este biosensor, se logró estudiar la evolución de la
tensión en la proteína vinculina al aplicar un estiramiento a la célula, a través del
estirador mecánico. Nuestros resultados sugieren que la tensión en la molécula de
vinculina en las adhesiones focales disminuye como respuesta al estiramiento.
6.6 Referencias
1 Goldyn et al., J. Cell Sci 122: 3644-3651, 2009. 2 Bershadsky, A. D., Balaban, N. Q. & Geiger, B., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 19: 677–695,
2003) 3 C. Grashoff et al., Nature 466, 263-267, 2010.
V. Microscopía multi-análisis
AFM/fluorescencia:
visualización, detección,
integración y respuesta.
Reclutamiento de proteínas de las
adhesiones focales en respuesta a un
estímulo mecánico local y funcional.
Capítulo 7
Microscopía Combinada AFM/Fluorescencia
En este capítulo describo los resultados obtenidos en el microscopio combinado AFM-
óptico desarrollado en el Laboratorio de Electrónica Cuántica (FCEN-UBA), tanto para
la detección de fuerzas de interacción ligando-receptor a nivel de moléculas
individuales como para la visualización AFM/Fluorescencia. Presento resultados en el
estudio de la evolución temporal de las proteínas de las adhesiones focales en respuesta
al estímulo mecánico realizado con un sensor de fuerza de AFM.
7. Microscopía Combinada AFM/Fluorescencia
183
7.1 Introducción
Como se ha mencionado y mostrado con algunos ejemplos en los capítulos
anteriores de esta Tesis, la microscopía de fluorescencia se ha convertido en una
herramienta indispensable para la biología celular, ya que permite la visualización de
proteínas específicamente marcadas dentro de una célula viva1. La microscopía de
fuerza atómica, por su parte, ha sido también ampliamente utilizada en sistemas
biológicos2. Sin embargo, el desarrollo de ambas técnicas ha seguido caminos
independientes; mientras que su utilización ha sido en general con propósitos diferentes,
pero muchas veces complementarios.
Las dos microscopías pueden ser utilizadas en condiciones fisiológicas,
permitiendo el estudio de sistemas in vivo. El desarrollo de una microscopía combinada
AFM/Fluorescencia, como la puesta a punto en el Laboratorio de Electrónica Cuántica,
no sólo permite realizar los experimentos clave de las dos microscopías en forma
individual sino que abre la posibilidad de integrar ambas técnicas para encarar desafíos
centrales en la biofísica y la biología celular.
Los experimentos simultáneos de microscopía óptica y AFM a nivel de
moléculas individuales prometen descubrir nuevos horizontes tanto en la manipulación
a escala nanométrica como en el entendimiento de la interrelación entre una fuerza
mecánica aplicada y las propiedades ópticas de las moléculas3. Esta tecnología
combinada es clave para el estudio de la mecanotransducción celular, siendo nuestro
objetivo particular la interacción entre una punta sensora de AFM modificada
químicamente con un ligando y una célula, y la observación simultánea de su respuesta
bioquímica y funcional por fluorescencia. En este sentido, el microscopio híbrido
resulta una herramienta adecuada dado que permite la observación simultánea de la
generación y la dinámica de señales intracelulares en respuesta a la interacción del
sensor de fuerza funcionalizado.
7.2 Detección de fuerzas en el orden de los pN. Sistema ligando-receptor: biotina-
estreptavidina
Una vez adaptado el microscopio híbrido AFM/Fluorescencia para trabajar en
condiciones fisiológicas, se analizó la sensibilidad a nivel de fuerzas de la parte AFM,
7. Microscopía Combinada AFM/Fluorescencia
184
realizando experimentos de fuerzas de interacción ligando-receptor. Se estudió la
interacción entre biotina-estreptavidina, utilizando la estrategia descripta en el Capítulo
2 de este trabajo. Brevemente, se modificaron sustratos de oro Robax con StA a través
del tiol DTSP y se usaron los sensores de fuerza comerciales biotinilados (NovaScan
Techonologies, Ames, EEUU) a través de un espaciador flexible de PEG. Las curvas de
fuerza se adquirieron en el modo de contacto en solución. En la Figura 7.1A se muestra
una curva de fuerza típica obtenida para este sistema en el microscopio combinado. Se
puede ver que el salto correspondiente a la ruptura de la unión (flecha roja) está por
sobre el nivel de ruido de los datos, y que la curva presenta la forma característica
esperada para el estiramiento de la molécula espaciadora PEG (flecha azul). En la
Figura 7.1 B presento el histograma de fuerzas de interacción para el sistema biotina-
StA, medidas con el microscopio combinado. El valor medio obtenido (para 31 eventos
de interacción) de (209 ± 7) pN es consistente con el valor esperado4.
Figura 7.1. Interacción biotina-estreptavidina medida en el microscopio combinado. A Curva de
fuerza (retracción) correspondiente a la ruptura de la interacción biotina-estreptavidina, presentando la
forma característica esperada para el estiramiento de la molécula espaciadora. B Histograma de fuerzas, y
su correspondiente ajuste gaussiano que arrojó un valor medio de (209 ± 7) pN.
Con estos resultados estamos en condiciones de afirmar que el microscopio
combinado AFM/ Fluorescencia desarrollado en el Laboratorio de Electrónica Cuántica
no sólo es capaz de operar en condiciones fisiológicas sino que alcanza la resolución
necesaria para medir fuerzas de interacción entre moléculas individuales.
-20 0 20 40 60 80 100 120-200
-100
0
100
200
300
400
z [nm]
Fue
rza
[pN
]
-20 0 20 40 60 80 100 120-200
-100
0
100
200
300
400
z [nm]
Fue
rza
[pN
]
0 100 200 300 400 5000
0.05
0.1
0.15
0.2
Fuerza (pN)
Pro
babi
lidad
(%
)
A B
7. Microscopía Combinada AFM/Fluorescencia
185
7.3 Visualización de adhesiones focales en células vivas
El microscopio híbrido AFM/Fluorescencia también fue validado para la
visualización de proteínas de las adhesiones focales en células vivas. Se observaron por
epifluorescencia células HC11 transfectadas con proteínas de las adhesiones focales
unidas a las proteínas fluorescentes. En la Figura 7.2 presento una galería de imágenes
de células HC11 transfectadas para expresar proteínas de las adhesiones focales. Si bien
no son imágenes confocales, puede apreciarse muy bien la distribución de las
adhesiones focales en la periferia de la célula como estructuras planas (de
aproximadamente 1µm de altura) con una morfología característica. Para la proteína
zixina, en algunas imágenes es posible apreciar también en el interior de la célula
patrones de puntos que siguen "líneas" y están asociadas a las fibras de actina (flechas
blancas).
Figura 7.2. Proteínas de adhesiones focales en células HC11 observadas en el microscopio
combinado. Células vivas transfectadas para expresar las proteínas quimera zixina-EGFP (A,B),
vinculina-EGFP (C) y vinculina-Venus (D). La proteína zixina se localiza en las adhesiones focales, y en
algunos casos sobre los filamentos de actina (flechas blancas). La proteína vinculina se ubica en las
adhesiones focales y se observa también en el citoplasma. Barras de escala: 10 µm.
A
C D
B
7. Microscopía Combinada AFM/Fluorescencia
186
7.4 Combinación de topografía y fluorescencia para estudiar células vivas
Se obtuvieron también imágenes combinadas AFM y fluorescencia en células
vivas. Este microscopio presenta la ventaja de que la platina del AFM tiene un rango
vertical de movimiento de 20 µm, lo que hace que tomar imágenes AFM de células
vivas sea mucho más sencillo (el escáner del microscopio comercial utilizado en este
trabajo tiene un rango menor a los 5µm, por lo que resulta muy inestable para tomar
imágenes de células vivas). En la Figura 7.3 presento las imágenes in vivo de una célula
HC11 transfectada con la construcción vinculina-EGFP. Se obtuvieron las señales de
topografía y error (deflexión) mediante AFM y la imagen de fluorescencia, en la que
puede verse que la proteína no sólo se acumula en las adhesiones focales sino que
también está distribuida en el citoplasma. Se muestra también la superposición de la
imagen de fluorescencia y la de deflexión.
Figura 7.3. Imágenes AFM/fluoresencia de células vivas. Células HC11 transfectadas para expresar la
proteína quimera vinculina-EGFP. De izquierda a derecha, imágenes de: AFM-topografía (escala z
indicada), AFM-error (unidades arbitrarias), fluorescencia y superposición fluorescencia-error. Todas las
barras de escala de 10 µm.
Al observar las imágenes de AFM en sus distintas señales vemos que la imagen
de error provee información adicional a la topografía. Con flechas blancas se indica la
presencia, en el borde una célula que no expresa nuestra proteína de interés, de
estructuras delgadas dispuestas en forma paralela que corresponden a los filamentos de
actina, uno de los componentes del citoesqueleto de las células y que forma parte de las
FAs. En fluorescencia es simple decir qué células expresan la proteína vinculina-EGFP,
7. Microscopía Combinada AFM/Fluorescencia
187
así como también ver la localización y distribución de la misma. La zona del núcleo,
que en las imágenes de topografía corresponde a la parte más elevada en el centro de la
célula, en fluorescencia se presenta libre de señal.
7.5 Experimentos en respuesta a un estímulo mecánico local
En el marco de este trabajo de Tesis, el experimento para el que fue concebido el
uso del microscopio combinado AFM/Fluorescencia es el de ejercer una fuerza puntual
y cuantitativamente controlada sobre la célula, para desencadenar la formación de la
adhesión focal y, seguir en función del tiempo, la respuesta bioquímica mediante la
visualización y localización de proteínas componentes de la adhesión focal o de la
cascada de señalización fusionadas a VFPs.
El experimento a realizar consiste en utilizar las puntas modificadas con
fibronectina y aplicar una tensión sobre la célula. Dicha tensión, sumada a la interacción
específica fibronectina-integrina debería disparar la formación de una FA comenzando
por la agregación (clustering) de las integrinas a nivel de la membrana plasmática de la
célula, y siguiendo por el reclutamiento de las diferentes proteínas citoplasmáticas que
componen las FAs. Cada una de las proteínas está relacionada con distintos estadíos en
las FAs, por lo que resulta de gran interés conocer los tiempos involucrados en el
reclutamiento las diferentes proteínas.
Si bien hasta el momento no conocemos estudios previos de la formación de
FAs que combinen las dos microscopías con las que trabajamos (AFM y Fluorescencia),
hay en la literatura varios trabajos dedicados al estudio de la formación de FAs. En un
trabajo pionero del grupo del Dr. Sheetz5 se logró estudiar la formación de FAs en
fibroblastos utilizando microesferas funcionalizadas con fibronectina y visualizando por
epifluorescencia la proteína vinculina unida a la GFP. En dicho trabajo se mostró que la
formación de pequeños complejos focales en los alrededores de las microesferas no sólo
es específica en cuanto a la modificación de las esferas con fibronectina, sino que
depende también del área de las esferas (utilizaron esferas de entre 1 y 8 µm de
diámetro) y de la fuerza aplicada (mediante la utilización de pinzas ópticas). Mostraron
también que la vinculina tarda del orden de las decenas de segundos en reclutarse, y que
7. Microscopía Combinada AFM/Fluorescencia
188
en el mismo orden temporal se encuentra el reclutamiento de la talina, otra de las
proteínas que componen las FA.
En un trabajo más reciente del mismo grupo6, se estudió la formación de
agregados de integrinas al depositar las células sobre sustratos con arreglos de
nanopartículas funcionalizadas con el péptido RGD (el fragmento de la fibronectina de
unión a la integrina). En este estudio, en ausencia de fuerzas externas, observaron por
microscopía confocal el reclutamiento de las integrinas en tiempos del orden de 200
segundos. Mostraron también que el agregado de integrinas recluta también a las
proteínas talina, paxilina y FAK en tiempos similares, mientras que el reclutamiento de
vinculina comienza en un tiempo posterior (unos 100 segundos después de visualizado
el agregado de integrinas) asociado a la actividad mecánica de la célula, sugiriendo que
el agregado de vinculina requiere la contracción celular.
Mediante una estrategia similar a la nuestra, que combina microscopía confocal
con la utilización de un nanoelectrodo funcionalizado con fibronectina para microscopía
de barrido por conductancia iónica, en el trabajo de Fuentes et al.7 lograron inducir la
formación de una FA en la punta del nanoelectrodo. Con esa estrategia visualizaron el
agregado de la proteína talina unida a la proteína fluorescente roja (RFP) y obtuvieron
un tiempo de reclutamiento entre 60 y 80 segundos. Observaron también, a través de la
talina-RFP, el remodelado en términos de morfología de otras adhesiones focales ya
maduras en la célula en respuesta al estímulo mecánico.
Utilizando el microscopio combinado AFM/Fluorescencia nos propusimos
estudiar la evolución temporal de dos proteínas adhesivas, de gran interés ya que se
postulan como las proteínas mecanosensoras: zixina y vinculina. Cabe destacar que las
proteínas elegidas son indicadoras de distintos estadios en la formación de las FAs:
mientras vinculina se recluta en una primera etapa (decenas de segundos), zixina es
indicadora de la adhesión madura por lo que se postula que su reclutamiento tardaría del
orden de decenas de minutos hasta horas8. Mediante el estudio de la respuesta temporal
de la fluorescencia ante el estímulo mecánico-funcional que haremos con la punta AFM
modificada con fibronectina, esperamos ver el reclutamiento de la proteína vinculina en
los alrededores de la interacción punta-célula en tiempos del orden de las decenas de
segundos. Por otro lado, visualizando la zixina marcada queremos estudiar en tiempos
del mismo orden el remodelado de las FAs maduras.
7. Microscopía Combinada AFM/Fluorescencia
189
La estrategia de estos experimentos se basa en utilizar sensores de fuerza
funcionalizados con fibronectina para ejercer un estímulo mecánico local y funcional.
Como punto de partida, utilizamos sensores de fuerza cuyas puntas fueron limadas para
aumentar el área de contacto entre el sensor y la célula, y hacerla de un tamaño
comparable a los ya utilizados en los trabajos mencionados. El protocolo de limado
(desarrollado en el Laboratorio de Electrónica Cuántica) consiste en hacer barrer la
punta con el AFM en modo contacto sobre un sustrato de vidrio durante media hora (en
un área de 3µm x 3µm y a una velocidad de 30 µm/seg). En la Figura 7.4 A,B se
muestran imágenes de microscopía electrónica de las puntas limadas utilizadas, en las
que puede apreciarse que la zona de primer contacto con la célula tiene
aproximadamente un área de 0.2x1 µm2.
En cuanto a la funcionalización con fibronectina, se realizó por adsorción
pasiva incubando los sensores de fuerza en una solución de fibronectina 100 µg/ml (en
PBS) durante 20 minutos, enjuagando 5 veces con PBS antes de su utilización en los
experimentos. Para aumentar la adsorción, previo a la etapa de incubación con la
proteína se cubrieron los sensores con una delgada película de oro por sputtering
(utilizando el protocolo descripto en la sección 2.2.2). En la Figura 7.4 C presento un
esquema que resume el protocolo de funcionalización de los sensores de fuerza para los
experimentos en respuesta al estímulo mecánico.
Figura 7.4. Preparación de sensores de fuerza para los experimentos estímulo-respuesta. A
Micrografía electrónica de la punta de un sensor de fuerza limado para su utilización en experimentos en
función de la fuerza. B Detalle de la misma punta, en la que se observan las medidas características de la
superficie de contacto inicial con la célula. C Esquema de preparación de las puntas para dichos
experimentos, que consta de tres pasos: limado, recubrimiento con oro por sputtering y funcionalización
con fibronectina por adsorción pasiva. Las imágenes de microscopía electrónica de barrido fueron
tomadas en el Centro de Microscopías Avanzadas.
Si3N4
limado
sputtering
Au
20 min Fn 100µg/ml
Si3N4
limado
sputtering
Au
20 min Fn 100µg/ml
~ 1µm
~ 200 nm
A B C
7. Microscopía Combinada AFM/Fluorescencia
190
El experimento estímulo-respuesta consiste en posicionar la punta funcional sobre una
célula que exprese las proteínas fluorescentes quimeras, realizar un estímulo mecánico y
registrar la evolución temporal de la fluorescencia. Para ello, se busca en el modo
fluorescencia una célula de la muestra transfectada con alguna de las construcciones
proteína de FA-VFP en la que se visualicen las adhesiones, y por transmisión se ubica el
sensor de fuerza para que al hacer contacto se posicione sobre la región de interés de la
célula. En la Figura 7.5 se presenta un ejemplo de células transfectadas con la
construcción zixina-GFP visualizadas en transmisión (A) y en fluorescencia (B) donde
se puede observar claramente las células que expresan las proteínas en las FAs. Una vez
que el sensor de fuerza está en contacto con la célula, utilizando un setpoint mínimo,
realizamos una curva de fuerza (Figura 7.5 C). La curva de fuerza sobre la célula, que
presenta la indentación característica, nos permite definir el setpoint que determinará el
valor de fuerza en el que se realiza el experimento. Utilizamos en general fuerzas en el
orden de 5-10 nN.
Figura 7.5. Experimento estímulo-respuesta. A Imagen de transmisión óptica obtenida en el
microscopio combinado, en la que puede verse el sensor de fuerza posicionado sobre una muestra de
células HC11. B Imagen de la misma región en fluorescencia, en la que se pueden ver las células
transfectadas con la construcción zixina-GFP que expresan la proteína en las FAs. C Para asegurarnos
que efectivamente la punta está sobre la célula y definir los valores de setpoint a utilizar realizamos en
primer lugar una curva de fuerza, que presenta la indentación característica de la superficie de la célula.
Para seguir la evolución temporal de las proteínas marcadas, se registran
imágenes en función del tiempo tomando como tiempo inicial el instante en que se
cambia el valor del setpoint para hacer la fuerza determinada. Tanto el tiempo de
integración como el tiempo de espera entre imágenes se selecciona cuidadosamente
-2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5-5
0
5
10
15
Desplazamiento (um)
Fue
rza
(nN
)
A B C
7. Microscopía Combinada AFM/Fluorescencia
191
antes de comenzar el experimento de manera de optimizar las imágenes y teniendo en
cuenta minimizar el fotoblanqueo.
7.5.1 Evolución temporal de la proteína adhesiva zixina en respuesta a un estímulo
mecánico local
En primer lugar estudiamos la evolución temporal de la proteína zixina en
respuesta al estímulo mecánico funcional. Como se mencionó, la zixina es una proteína
relacionada a las adhesiones focales maduras, por lo que en la formación de nuevas
adhesiones focales no estaría involucrada. La zixina se reclutaría en tiempos del orden
de decenas de minutos y hasta horas una vez que las FAs maduran. En los tiempos de
nuestros experimentos no esperamos seguir con la visualización de esta proteína la
formación de nuevas adhesiones, sino que vamos a estudiar el remodelado de las
adhesiones ya maduras existentes en la célula como respuesta a la fuerza aplicada.
En la Figura 7.6 presento una secuencia de imágenes de una célula expresando
zixina-EGFP sometida a una fuerza de (2.7 ± 0.4) nN. Las imágenes a diferentes
tiempos a partir del estímulo no parecen presentar a simple vista cambios en la
morfología de las FAs. La superposición (Figura 7.6 G) entre la primera imagen
(coloreada en verde) y la útima (coloreada en rojo) da cuenta de que tampoco hubo
corrimientos ni en el plano ni en el foco a medida que se registró la secuencia.
Para analizar la dinámica de las proteínas a nivel de cuantificar la intensidad en
función del tiempo, es de crucial importancia tener en cuenta el fotoblanqueo propio de
la adquisición de las imágenes. En la Figura 7.6 H se puede ver la evolución temporal
de la intensidad media en la región de interés señalada en la Figura 7.6 A, en la cual se
aprecia el decaimiento propio del fotoblanqueo, del orden del 15% de la señal por sobre
el fondo. En este sentido, dado que los niveles de señal son bajos y el fotoblanqueo
apreciable, decidimos no corregirlo y estudiar los decaimientos de la intensidad tales
como fueron adquiridos. Por otra parte, y como se discutió en la sección II.3.4, la
sombra del cantilever es apreciable en las imágenes de fluorescencia por lo que la señal
de fondo debería considerarse de manera diferente debajo del cantilever respecto del
resto de la imagen. Resulta así complejo restar una señal de background, no pudiendo
hacerse una corrección general para toda la imagen como se hace usualmente y hemos
7. Microscopía Combinada AFM/Fluorescencia
192
hecho en todos los análisis cuantitativos de imágenes de fluorescencia en esta Tesis. Es
por esto que el análisis de las secuencias adquiridas con el microscopio combinado para
los experimentos estímulo-respuesta se realizó sobre los datos crudos sin ningún tipo de
normalización por fotoblanqueo ni corrección por background.
Figura 7.6. Respuesta temporal de la proteína zixina ante un estímulo mecánico puntual. A-F
Secuencia de imágenes de una célula expresando zixina-EGFP y sometida a una fuerza de (5.4 ± 0.9) nN
mediante un sensor de fuerza por AFM. En las imágenes puede notarse la sombra del cantilever (cuya
posición se indica con la línea de puntos en A), la cual proporciona niveles diferentes de background:
como ejemplo, en este caso la señal de fondo media por píxel debajo del cantilever es de (1828 ± 4)
mientras que en el resto de la imagen es de (1930 ± 10). G Superposición de la primera (coloreada en
rojo) y la última (coloreada en verde) de las imágenes de la secuencia. H Evolución temporal de la
intensidad media por píxel dentro de la ROI indicada en A. Se aprecia el decaimiento por fotoblanqueo,
del orden del 15% de la señal por sobre el ruido (decae ~200 sobre una señal de ~1400).
Basaremos el análisis cuantitativo de las imágenes tomadas en función del
tiempo en el estudio de los decaimientos de la señal en diferentes zonas de la célula.
Asumimos que si hay un reclutamiento de las proteínas estudiadas como respuesta a la
fuerza aplicada, entonces el tiempo de decaimiento de la fluorescencia debe ser mayor
que el tiempo que se da por el fotoblanqueo. En otras palabras, el reclutamiento de las
proteínas fluorescentes, en las zonas en que éste se produzca, compensa el decaimiento
de la fluorescencia por fotoblanqueo y hace que la intensidad en función del tiempo
decrezca más lentamente.
Una cuestión muy importante en este análisis es el efecto de la iluminación.
Como discutimos en la sección II.2.4, el fotoblanqueo depende directamente de la
0 25 50 75 100 125 1503100
3150
3200
3250
3300
3350
tiempo (s)
Inte
nsid
ad p
or p
ixel
A B D C
E F G H
t = 0 s
154 s merge
30 s 60 s 90 s
120 s
7. Microscopía Combinada AFM/Fluorescencia
193
intensidad de iluminación, por lo que una iluminación no homogénea afectaría
directamente nuestro análisis. Es por ello que para cada película analizamos la
iluminación en la zona en que fue registrada. En la Figura 7.7 presento un detalle de la
iluminación en la zona estudiada para zixina, utilizando la imagen de un portaobjetos
fluorescente de diagnóstico como se discutió previamente. Si bien la iluminación no es
uniforme, la desviación estándar en este caso resultó del 4%, mientras que la intensidad
media por píxel en las zonas de mayor variación difiere en un 7%. Para no introducir
correcciones que puedan afectar los datos se decidió no corregir los valores de
intensidad por la iluminación dado que las variaciones son pequeñas. Sin embargo, es
muy importante conocer la no uniformidad de la iluminación para tenerla en cuenta a la
hora de decidir si las diferencias en los tiempos de decaimiento son apreciables o
pueden ser un efecto de la iluminación.
Figura 7.7. Uniformidad de la iluminación en las imágenes analizadas. A Imagen del campo total
iluminado, en la que se recuadra la zona en la que se registra la secuencia temporal, barra 25µm. B-C
Iluminación en la zona recuadrada, obtenida de una imagen del portaobjetos fluorescente, visualizada en
tres (B, escalas x e y en píxeles) o dos dimensiones (C). Para cuantificar la no uniformidad se
seleccionaron 3 zonas, recuadradas en negro y numeradas. La intensidad media en las zonas más alejadas
en cuanto a la uniformidad de la iluminación difieren en un 7% (la zona 1 presenta una intensidad media
de (6200 ± 100), mientras que la zona 2 de (5800 ± 300)). La zona 3 se corresponde con una suciedad del
portaobjetos, por lo que no fue tenida en cuenta. D Histograma de intensidad de la zona estudiada, cuya
desviación estándar es del 4%.
Iluminación área estudiada
5000
5500
6000
6500
040
80120
0
40
80
1204000
5000
6000
7000
4500 5000 5500 6000 6500 70000
1000
2000
3000
4000
Intensidad por pixel
cuen
tas
1
2
3
A B
C D
7. Microscopía Combinada AFM/Fluorescencia
194
Teniendo en cuenta todos estos factores, nos proponemos estudiar la evolución
temporal de la intensidad en diferentes regiones de la célula y analizar el posible
reclutamiento de la proteína zixina en las adhesiones focales como respuesta al estímulo
mecánico. Para ello, se seleccionaron en las imágenes regiones circulares de 3 píxeles
(0.47 µm) de radio dentro de las adhesiones focales de la célula. Dado que no se vieron
corrimientos de la célula durante la adquisición de la película, las regiones se
seleccionaron sobre la imagen promedio de todas las registradas. El radio de las ROIs se
seleccionó de manera de que todas las regiones quedaran dentro de una adhesión focal.
En la Figura 7.8 puede verse la imagen promedio de la película de la Fig. 7.6, y los
puntos en donde se centraron las 20 regiones de análisis seleccionadas. En líneas
punteadas se marcó el sensor de fuerza, observándose que debajo del mismo se
encuentran las regiones a partir de la número 13.
Figura 7.8. Selección de regiones de interés para el análisis de la respuesta temporal de zixina. A
Imagen promedio de la secuencia de 120 imágenes registrada para la proteína zixina-EGFP en una célula
HC11 (barra 10 µm). En línea punteada se marca la posición del sensor de fuerza. B Sobre la misma
imagen se seleccionaron 20 regiones de interés circulares de 3 píxeles de radio, cuyos centros se indican
con puntos rojos. Las regiones fueron numeradas para el análisis, estando a partir de la región número 13
en la zona en que se aprecia la sombra del cantilever.
Una vez marcadas las regiones de interés, se analizaron los decaimientos de la
intensidad media de la fluorescencia de cada región en función del tiempo. Se observó
que no todas las curvas parecen presentar los mismos tiempos característicos, como se
aprecia en la Figura 7.9 A en la que se ven los decaimientos normalizados a la
1 2
3 4
5 6
7 8 9 10
11 12
13 14
15 16 17
18 19
20
A B
7. Microscopía Combinada AFM/Fluorescencia
195
intensidad inicial. Nuestro análisis consistió en ajustar las curvas de intensidad (I) en
función del tiempo (t) mediante una función exponencial decreciente del tipo de la
ecuación 7.1:
bkgt
ItI +��
���
� −=
τexp)( 0 7.1
donde I0 es la intensidad inicial, � el tiempo de decaimiento y bkg el valor de la señal de
fondo. Esta ecuación es análoga a la (II.4) pero tiene en cuenta que los datos de
intensidad no fueron corregidos por el background.
Figura 7.9. Respuesta temporal de la proteína zixina ante el estímulo mecánico en las regiones
estudiadas. A Intensidad normalizada (al promedio de los 5 primeros valores) en función del tiempo para
las regiones 5, 6, 7, 8 (rojo) y 14, 18, 19, 20 (azul), en la que puede apreciarse que los decaimientos tienen
tiempos característicos diferentes. B Intensidad en función del tiempo para las señales sin normalizar, y
sus correspondientes ajustes con la ecuación 7.1. C Tiempos de decaimiento obtenidos, en función del
número de ROI en el orden de la Figura 7.8 B. En negro se presentan los valores obtenidos utilizando el
bkg de cada región, mientras que para las ROIs debajo del cantilever se muestran en cian los valores de
ajustar usando el bkg general. La elipse roja engloba los puntos para los cuales no parece haber
reclutamiento. D Ubicación en la célula de las FAs en las que consideramos se da el reclutamiento de
zixina. La línea amarilla marca el filamento de actina que conecta las adhesiones 4 y 20.
0 50 100 1500.92
0.94
0.96
0.98
1
1.02
tiempo (s)
Inte
nsid
ad n
orm
aliz
ada
A
0 50 100 1502400
2600
2800
3000
3200
3400
tiempo (s)
Inte
nsid
adB
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
500
1000
1500
2000
# ROI
tiem
po d
e de
caim
ient
o (s
)
C D
4
20
18
19
14
7. Microscopía Combinada AFM/Fluorescencia
196
En la Figura 7.9 B se pueden ver las evoluciones temporales de las intensidades
de algunas de las regiones estudiadas, así como sus ajustes mediante la función de la
ecuación 7.1. Dependiendo de la ROI, se tomó como bkg el valor general del ruido de
fondo o el valor del fondo en la zona de la sombra del cantilever. En la Figura 7.9 C se
presentan los valores de � obtenidos para los ajustes de cada ROI. Para corroborar que el
hecho de tomar diferentes bkg en las distintas zonas no afecte los resultados, la
intensidad en las regiones debajo del cantilever se ajustó también utilizando el valor de
bkg general, observándose la misma tendencia (puntos coloreados en cian en la Fig. 7.9
C). Los ajustes se realizaron mediante la función nlinfit de Matlab, dejando fijo el valor
de bkg. Se corroboró también que los resultados obtenidos no dependan del punto
exacto en los que se marcaron las regiones de interés, obteniéndose los mismos
resultados en numerosas corridas con selecciones de los centros de las ROIs levemente
diferentes.
Se puede ver que la mayoría de los tiempos de decaimiento obtenidos tienen un
valor de entre 700 y 800 segundos (caen dentro de la elipse roja en la Fig. 7.9 C),
mientras que en las regiones 4, 14, 18, 19 y 20 la intensidad decae con un � claramente
mayor, lo que sugiere que en las FAs correspondientes a dichas regiones se estaría
reclutando zixina. Este resultado es interesante dado que las regiones 14, 18, 19 y 20
están en la zona de acción del sensor de fuerza, mientras que la región 4 está fuera de
dicha zona pero está conectada directamente con la FA 20 a través de un filamento de
actina (marcado con una línea amarilla). Esto concuerda con el modelo de tensegridad
en mecanotransducción9, en el cual se propone que los filamentos de actina como
componente del citoesqueleto son los responsables de transmitir las fuerzas dentro de la
célula.
Resulta razonable que en las FAs 14, 18 y 19 se haya obtenido un � mayor dado
que son las más cercanas a la punta del sensor de fuerza. Por otra parte, las regiones 18
y 19 parecen estar dispuestas sobre un filamento de actina, y en principio no es muy
claro si conforman la misma adhesión. Teniendo en cuenta estas dos regiones, se
observa un tiempo de decaimiento significativamente mayor en la región más interna,
dispuesta sobre el filamento, lo que sugiere un reclutamiento de proteína más
importante en la dirección del filamento. Dicha observación sería consistente con los
resultados previos de este trabajo (secciones 3.4 y 5.4) en los que obtuvimos, tanto en la
visualización como mediante el estudio por N&B, que ante el estiramiento mecánico la
7. Microscopía Combinada AFM/Fluorescencia
197
zixina transloca a los filamentos de actina. Las regiones 20 y 4, interconectadas por el
filamento de actina, presentan un valor de � similar.
Estudiamos también la respuesta de la zixina en función de la fuerza aplicada,
para lo cual variamos el setpoint al que se realizó el experimento. Se sometió a la célula
a fuerzas de (5.4 ± 0.9) nN, (6.8 ± 1.0) nN y (8.2 ± 1.2) nN. El experimento se realizó
cambiando el valor de setpoint y tomando una secuencia de 120 imágenes (en un total
de tiempo del orden de los 150 segundos) inmediatamente después de cambiar el valor.
En la Figura 7.10 presento los resultados en términos de tiempos de
decaimiento de las señales en cada FA, tomando las mismas regiones en las tres
películas registradas. Si bien no hay una tendencia determinada, es decir, no en todas las
FAs se observan cambios en el mismo sentido en cuanto a los tiempos de decaimiento,
se puede destacar de manera general que al aplicar una mayor fuerza se producen
cambios, y que éstos son notables en las regiones a partir de la número 11, que se
corresponden justamente con las FAs en la zona de acción de la punta funcionalizada.
Figura 7.10. Respuesta temporal de la proteína zixina en función de la fuerza aplicada. A Imagen
promedio de la segunda secuencia analizada de células HC11 expresando zixina-EGFP, sometida a una
fuerza externa. Se indica la numeración de las ROIs para el análisis (barra 10 µm). B Tiempo
característico obtenido del ajuste de los decaimientos de la intensidad de la fluorescencia, utilizando para
cada zona su respectivo bkg. Cada tipo de datos corresponde a un valor diferente de setpoint: 0.04V,
0.05V y 0.06V; correspondientes a valores de fuerza de: (5.4 ±0.9) nN, (6.8 ± 1.0) nN y (8.2 ± 1.2) nN
respectivamente. Los experimentos fueron realizados en orden de fuerza ascendente.
Es interesante notar que en las FAs de las regiones 11 y 12, cuya intensidad de la
fluorescencia en la primera secuencia no parecía evolucionar de manera diferente a la
dinámica del fotoblanqueo, se ven importantes cambios en el tiempo de decaimiento al
1 2
3 4
5 6
7 8 9 10
11 12
13 14
15 16 17
18 19
20
A B
7. Microscopía Combinada AFM/Fluorescencia
198
aumentar la fuerza. Esto indicaría que la acción del estímulo se propaga al aumentar el
valor de fuerza, a adhesiones que no están interactuando directamente con la punta, y
que no se veían afectadas a niveles bajos de fuerza.
Este experimento demuestra que mediante el uso del microscopio combinado se
pueden estudiar respuestas biológicas tan complejas como el reclutamiento de las
proteínas en las FAs en función de la fuerza aplicada. Utilizando un análisis simple, sin
realizar ningún tipo de corrección que pueda modificar los datos, mostramos que puede
detectarse el reclutamiento de la zixina en respuesta a la fuerza aplicada y que el análisis
de las señales de intensidad en función del tiempo permite, a través del estudio de los
tiempos característicos, cuantificar de manera relativa cómo se da el reclutamiento en
cada adhesión focal.
7.5.2 Evolución temporal de la proteína adhesiva vinculina en respuesta a un
estímulo mecánico local
Para la proteína vinculina en células HC11 registramos también secuencias de
imágenes utilizando el mismo protocolo estímulo-respuesta. En el caso de la vinculina,
como ya se ha observado en la literatura, esperamos que en respuesta al estímulo
mecánico y funcional realizado con la punta sensora modificada con fibronectina, la
proteína se reclute en el lugar en que se realiza el estímulo, dando lugar eventualmente a
la formación de una FA.
En la Figura 7.11 presento una secuencia obtenida para células HC11
transfectadas para expresar vinculina-EGFP. Se registraron 120 imágenes por un total
de 236 segundos. Observando con detenimiento las imágenes antes de hacer contacto
(Fig. 7.11 A) y la última de la secuencia (Fig. 7.11 D) puede apreciarse la aparición de
una región fluorescente tenue en el lugar donde se encuentra la punta. Se presenta
también la superposición (Fig. 7.11 E) de la primera y la última de las imágenes de la
secuencia, en la que nuevamente corroboramos que durante el transcurso del
experimento no hubo corrimientos. En el caso de la vinculina-EGFP, dado que por el
nivel de expresión las señales son menos intensas, es más notable el fotoblanqueo como
se aprecia en la evolución de la intensidad en una región de interés interior a una FA
7. Microscopía Combinada AFM/Fluorescencia
199
(Fig. 7.11 F). Analizaremos nuevamente los decaimientos de la intensidad en el tiempo
en diferentes regiones de la célula para estudiar el reclutamiento de esta proteína.
Figura 7.11. Respuesta temporal de la proteína vinculina ante un estímulo mecánico puntual. A
Imagen de las células HC11 expresando vinculina-EGFP a estudiar antes de hacer contacto por AFM. En
líneas de puntos se indica la posición final del sensor de fuerza. B-D Secuencia de imágenes de la célula
sometida a una fuerza de (13 ±2) nN. En este caso los niveles de background son de (1974 ± 7) debajo del
cantilever y de (2090 ± 10) en el resto de la imagen. E Superposición de la primera imagen de la
secuencia (coloreada en rojo) y la última (coloreada en verde). F Evolución temporal de la intensidad
media por píxel dentro de la región marcada en B. El decaimiento por fotoblanqueo es del orden del 50%.
Nuevamente analizamos las posibles desviaciones en la iluminación para la zona
registrada en esta película. En la Figura 7.12 se resume este análisis, en el que se
obtuvo una desviación estándar del 4.5% en el total de la zona, y una diferencia del 12%
entre zonas con máximo contraste en la iluminación.
Figura 7.12. Uniformidad de la iluminación en las imágenes analizadas para vinculina. A-B
Iluminación en la zona estudiada, obtenida de la imagen del portaobjetos fluorescente, visualizada en dos
(A) y tres (B, escalas x e y en pixeles) dimensiones. Se cuantificó la no uniformidad en las dos regiones
recuadradas en A, obteniendo una diferencia del 12%. D El histograma de intensidades presenta una
desviación estándar es del 4.5%.
050
100150
0
50
1004000
5000
6000
7000
Iluminación área estudiada
5000
5500
6000
6500
4500 5000 5500 6000 6500 70000
500
1000
1500
2000
2500
Intensidad por pixel
cuen
tas
A B C
0 50 100 150 200 2502300
2400
2500
2600
tiempo (s)
Inte
nsid
ad p
or p
ixel
no contacto t = 0 s 118 s
236 s merge
B C
E F
A
D
7. Microscopía Combinada AFM/Fluorescencia
200
En la Figura 7.13 A se presenta la imagen promedio de toda la secuencia, en la
que se observa debajo del cantilever una estructura fluorescente que tiene la posición y
la forma piramidal característica de la punta del sensor de fuerza (señalada en la figura
con un círculo punteado rojo). En esta secuencia se seleccionaron 13 regiones de interés
circulares de 3 píxeles de radio (Figura 7.13 B): 12 correspondientes a las adhesiones
focales ya maduras de las células, y la última en la región de contacto punta-célula en
que parece reclutarse la vinculina-EGFP.
Figura 7.13. Respuesta temporal de la proteína vinculina ante un estímulo mecánico puntual. A
Imagen promedio de la secuencia de 120 imágenes registrada para vinculina-EGFP en una célula HC11
(barra 10 µm). En línea punteada se marca la posición del sensor de fuerza, y el círculo rojo indica dónde
se ubica la punta. B Puntos centrales de las 13 ROIs circulares de 3 píxeles de radio seleccionadas para el
análisis. Las regiones 12 y 13 se sitúan en la zona de bkg correspondiente al cantilever. C Intensidad en
función del tiempo en las distintas regiones, con sus respectivos ajustes no lineales mediante la ec. 7.1.
(ROIs1-10 en azul, 11 y 12 en cian, 13 en rojo). D Tiempos de decaimiento característicos obtenidos para
cada ROI, en cian se presentan los que se obtendrías en las regiones 12 y 13 usando como valor de bkg el
general de la imagen.
El análisis se realizó también en este caso ajustando los decaimientos
observados en las curvas de intensidad de la fluorescencia en función del tiempo
(Figura 7.13 C) mediante la ecuación 7.1. Los tiempos de decaimiento obtenidos se
muestran en la Figura 7.13 D. En este caso también corroboramos que la tendencia de
1 2
3 4 5
6
7
8 9
10
11 12
13
A B
0 2 4 6 8 10 12 14
200
400
600
800
# ROI
tiem
po d
e de
caim
ient
o (s
)
0 60 120 180 240
2200
2400
2600
tiempo (s)
Inte
nsid
ad p
or p
ixel
C D
7. Microscopía Combinada AFM/Fluorescencia
201
reclutamiento obtenida en la región 13 no es producto de utilizar un valor de bkg
diferente para el ajuste.
Puede notarse que las regiones 1 a 10 presentan valores de � similares, todos por
debajo de los 300 segundos. Sin embargo, en las regiones 11 y 12 parece reclutarse la
vinculina haciendo que el decaimiento se produzca en tiempos característicos mayores,
del orden de los 450 segundos. Estas ROIs corresponden a las adhesiones focales más
cercanas a la zona de interacción y estarían reclutando la proteína en respuesta al
estímulo aplicado.
En la región correspondiente a la zona de contacto con la punta funcionalizada
se obtuvo un valor de � claramente mayor, lo que sugiere no sólo que se está reclutando
proteína en la zona de interacción específica, sino que este proceso se da a una tasa
mayor a la obtenida para el reclutamiento en FAs ya formadas. Estos resultados
sugieren entonces que como respuesta al estímulo mecánico-funcional, la vinculina se
recluta no sólo en adhesiones focales ya formadas sino también en la zona de la
interacción específica célula-fibronectina como una posible primera etapa en la
formación de nuevas FAs.
Por último, se estudió la dependencia del tiempo de decaimiento en la zona de
contacto, en función del radio de la región analizada. Con este análisis, que se muestra
en la Figura 7.14, pretendemos estimar el orden del tamaño de la zona en la que se está
produciendo el reclutamiento.
0 5 10 15 20
500
750
1000
1250
radio ROI (pixeles)
tiem
po d
e de
caim
ient
o (s
)
Figura 7.14. Estimación del tamaño de la zona de reclutamiento de vinculina. Tiempo de
decaimiento característico, en función del radio de la región utilizada para el análisis de la intensidad
media; donde el centro de cada región corresponde al punto de interacción punta-célula. En un radio de
entre 3 y 5 píxeles (~0.5-0.8 µm) el � obtenido no cambia significativamente, mientras que a partir de 6
píxeles de radio el valor decae probablemente por promediar zonas donde no se recluta proteína. Para una
región muy pequeña la intensidad media tiene mayores fluctuaciones por lo que los ajustes de los
primeros dos puntos tienen una incerteza considerable.
7. Microscopía Combinada AFM/Fluorescencia
202
Se puede ver que un radio de entre 3 y 5 píxeles (correspondientes a un intervalo
de aproximadamente 0.5-0.8 µm) el � obtenido no cambia significativamente, mientras
que a partir de 6 píxeles de radio el valor decae, probablemente debido a que el área
analizada es mayor y se promedia la intensidad en zonas donde ya no se recluta
proteína. Este resultado sugiere que el área aproximada de la zona de reclutamiento
tiene un radio del orden de 0.8 µm, lo cual sumado a la forma de la estructura que se
visualiza en las imágenes hace pensar que la zona de reclutamiento copia la forma de la
punta funcionalizada del sensor de fuerza.
7.6 Conclusiones
A partir de los resultados presentados en este capítulo, podemos afirmar que el
microscopio combinado AFM/Fluorescencia desarrollado en el Laboratorio de
Electrónica Cuántica no sólo es capaz de obtener imágenes combinadas en condiciones
fisiológicas sino que alcanza la resolución requerida para cuantificar fuerzas de
interacción entre moléculas individuales.
Se caracterizó con éxito la interacción biotina-estreptavidina en condiciones
fisiológicas, obteniendo un valor de fuerzas de (209 ± 7) pN, consistente con el valor
esperado.
Se obtuvieron imágenes de fluorescencia de adhesiones focales en células vivas,
marcadas con distintas proteínas de las FAs unidas a VFPs, con alta calidad óptica. Se
obtuvieron también imágenes combinadas de AFM y fluorescencia de células in vivo. El
microscopio combinado presenta la ventaja de que la platina del AFM tiene un rango
vertical de movimiento de 20 µm, lo que hace que tomar imágenes AFM de células
vivas sea de rutina.
Los experimentos estímulo-respuesta son el corolario de este trabajo de Tesis en
los que se ilustra el desafío que representó la integración del diseño, la implementación
y la optimización de las microscopías con el fin de entender cómo la fuerza gobierna la
morfodinámica de las adhesiones focales. Es así que los experimentos demostraron que
mediante el uso del microscopio combinado AFM/Fluorescencia se pueden estudiar
respuestas biológicas tan complejas como el reclutamiento de las proteínas en las FAs,
su remodelación y translocación en función de la fuerza externa aplicada. El análisis a
través de un método sencillo, sin ningún tipo de correcciones, nos permitió detectar la
7. Microscopía Combinada AFM/Fluorescencia
203
acumulación de la zixina en adhesiones focales maduras en respuesta a la interacción
específica célula-fibronectina sumada a una fuerza aplicada. Observamos también el
reclutamiento de la proteína vinculina para la formación de una nueva adhesión focal
como respuesta al estímulo mecánico-funcional.
7.7 Referencias 1 Bastiaens P. I.H. and Pepperkok R., Trends in Biochem Sci 25: 631 (2002). 2 Muller D. J., Biochemistry 47: 7986 (2008). 3 Dufrêne Y. F., Evans E., Engel A., Helenius J., Gaub H. E. & Müller D. J, Nat Methods 8: 123
(2011). 4 Hinterdorfer P. en Springer Handbook of Nanotechnology, Springer, p. 476 (2010). 5 Galbraith C. G., Yamada K. M., and Sheetz M. P., J Cell Biol, 159: 695 (2002). 6 Yu C., Law B. K., Suryana M., Low H. Y. and Sheetz M. P., PNAS, 108: 20585 (2011). 7 Fuentes D. E., Bae C. and Butler P. J., Cell Mol. Bioeng.,4: 616 (2011). 8 Zamir E., Katz M., Posen Y., Erez N., Yamada K.M., Katz B.Z., Lin S., Lin D.C., Bershadsky
A., Kam Z., and Geiger B., Nat. Cell Biol. 2:191 (2000). 9 Ingber D., J Cell Sci, 116: 1157 (2003). Ingber D., J Cell Sci, 116:1397 (2003).
VI. Conclusiones
generales
y perspectivas
VI. Conclusiones generales y perspectivas
207
En este trabajo de Tesis se pusieron a punto diferentes metodologías que
permitieron estudiar interacciones entre biomoléculas en distintos sistemas biológicos:
desde plataformas biomiméticas hasta células vivas. Se trata de un trabajo de carácter
interdisciplinario, en el que dada la complejidad del tipo de preguntas que queremos
contestar se desarrollaron y combinaron herramientas de nanotecnología, microscopías
y espectroscopías avanzadas, fisicoquímica de superficies y biología molecular y
celular. En particular se implementaron técnicas asociadas a dos tipos de microscopías:
Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) y Microscopía de Fluorescencia. Se colaboró
también en el desarrollo de un microscopio híbrido AFM/Fluorescencia en el que
pueden combinarse todas las técnicas desarrolladas independientemente para una u otra
microscopía.
Mediante un sistema biomimético basado en reconocimiento molecular, se
demostró que la AFM es una herramienta versátil, que permite caracterizar un sistema
en condiciones fisiológicas. Se realizó un análisis de la arquitectura controlada de un
biosensor amperométrico enzimático, ensamblado capa-por-capa basado en
reconocimiento molecular. A través del estudio de la topografía, el análisis espectral y
de la rugosidad de cada capa, se obtuvo información sobre el funcionamiento general
del biosensor y las interacciones biomoleculares entre las proteínas que se ensamblaron
en cada capa.
Se puso a punto la AFM para la medición de fuerzas de interacción
moleculares, empezando por la implementación de un método térmico para la
calibración precisa de las constantes elásticas de los sensores de fuerza. Se midieron
fuerzas de interacción moleculares, que van desde un sistema sencillo como son los
grupos químicos funcionales, hasta un complejo ligando-receptor en la membrana de
células vivas. La evolución en el desarrollo de la técnica también llevó aparejado el
diseño de estrategias para la modificación química de los sensores de fuerza. Se
midieron fuerzas de interacción entre los grupos funcionales químicos metilo-metilo y
VI. Conclusiones generales y perspectivas
208
carboxilo-carboxilo, obteniendo los valores de fuerzas esperados. Se cuantificó también,
en el rango de fuerzas esperado, la interacción entre el par ligando-receptor biotina-
estreptavidina, a nivel de moléculas únicas y utilizando diferentes estrategias de
modificación de sustratos. Por último, se caracterizó la interacción RGD-integrina en
células HC11 vivas, obteniendo un valor característico de (37.6 ± 0.7) pN para la
ruptura de un complejo a nivel de moléculas individuales.
Se optimizó la expresión de los plásmidos que codifican las distintas proteínas
de las adhesiones focales (FA): paxilina, zixina, vinculina, FAK, integrina y actina,
unidas a proteínas fluorescentes en el visible (VFPs) en la línea celular HC11. Se
visualizó la localización y la distribución de dichas proteínas en las adhesiones focales,
para células cultivadas tanto en cubreobjetos de vidrio como sobre membranas flexibles
de silicona. Se diseñó y caracterizó un dispositivo estirador para generar un estímulo
mecánico global sobre las células cultivadas en membranas de silicona. Se cuantificó el
estiramiento producido por dicho dispositivo en términos de área de las células,
obteniendo un incremento en el área celular de hasta un 80%. Se observó que, en
respuesta al estímulo mecánico, la proteína zixina se recluta formando adhesiones
focales de mayor área. También se pudo ver que como consecuencia del estiramiento,
dicha proteína transloca a los filamentos de actina.
Mediante la técnica de Recuperación de la Fluorescencia luego del
Fotoblanqueo (FRAP) se estudió la dinámica de las proteínas zixina, vinculina, paxilina
y FAK, obteniendo su constante de disociación a las FAs (kOFF), en células vivas HC11
in situ. Los valores de kOFF medidos indican que zixina posee una disociación más lenta,
que implica un mayor tiempo de residencia de esa proteína en la adhesión. Este
resultado estaría asociado a la participación de la zixina en FAs maduras, sugiriendo que
la asociación/disociación de zixina a las FAs podría ser, en comparación con las otras
proteínas estudiadas, un evento menos dinámico, tal vez relacionado con su
participación en FAs estables en el tiempo. Para la vinculina encontramos dos
subpoblaciones cinéticamente diferentes: una rápida asociada al reclutamiento para la
formación de nuevas adhesiones, y una lenta como proteína que conforma la FA
madura.
En respuesta al estiramiento mecánico, se observó para la proteína zixina un
aumento en el área de la FA indicativo de su reclutamiento en función de la fuerza. Si
VI. Conclusiones generales y perspectivas
209
bien no se evidenciaron cambios en los parámetros cinéticos de la zixina ante el
estiramiento, sí se obtuvo un cambio en la fracción móvil de esta proteína en relación a
la rigidez del sustrato.
Se estudiaron el estado de agregación y la concentración de las proteínas de las
FAs zixina, paxilina, FAK, y vinculina en células HC11 mediante la técnica Número y
Brillo (N&B). Los resultados indicarían que FAK, zixina y paxilina se encuentran en el
mismo grado de agregación en el citoplasma que en las FAs, mientras que la
concentración de las mismas resulta entre 4 y 6 veces mayor en las FAs que en el
citoplasma. La vinculina presentó dos comportamientos diferentes: en el 50% de las
mediciones analizadas el estado de agregación del citoplasma y la FA es el mismo,
mientras que en el otro 50% de los casos se observa un estado de agregación mayor en
la FA. En todos los casos la concentración de vinculina en las FA es de 5 a 6 veces
mayor que en el citoplasma.
La técnica N&B fue exitosamente aplicada en las mismas células cultivadas en
membranas de silicona, pudiendo correlacionarse estado de agregación y concentración
de la proteína zixina antes y después de aplicar un estiramiento global del sustrato. Se
observó que, en respuesta a dicho estiramiento, las FAs pueden desensamblarse total o
parcialmente y cambiar su morfología. Se mostró que el estado de agregación de la
zixina en las FAs se mantiene constante o bien decrece luego del estímulo. Por otro
lado, se encontró que durante el desensamblado de una FA, la zixina parece agregarse
en una zona interior de la célula, probablemente translocando a los filamentos de actina.
Para analizar el estado de tensión intracelular se utilizó el sensor
intramolecular de tensión basado en la proteína vinculina. Se encontró, a través de la
técnica FRET (transferencia de energía resonante de Förster), que las células cultivadas
sobre fibronectina están sometidas a tensiones aún en ausencia de estímulos mecánicos
externos. Este experimento, realizado en células cultivadas sobre membranas de
silicona, arrojó resultados que sugieren que la tensión a la que está sujeta la vinculina
decrece en respuesta al estiramiento mecánico.
Se trabajó en la adaptación de un microscopio combinado AFM/Fluorescencia
desarrollado en el Laboratorio de Electrónica Cuántica para su utilización en
condiciones fisiológicas y con células vivas. Se demostró que dicho microscopio es
VI. Conclusiones generales y perspectivas
210
capaz de obtener imágenes combinadas en condiciones fisiológicas, con alta calidad
óptica y con un rango vertical para AFM que permite que la visualización de células in
vivo sea de rutina. Mediante la medición de las fuerzas de interacción entre el par
ligando-receptor biotina-estreptavidina, se corroboró que el microscopio combinado
alcanza la resolución requerida para cuantificar fuerzas de interacción entre moléculas
individuales. Utilizando el microscopio combinado AFM/Fluorescencia, se estudió la
evolución temporal de las proteínas de las FAs, zixina y vinculina marcadas con la
proteína verde fluorescente, en respuesta a un estímulo mecánico local y funcional.
Dicha perturbación se realizó de manera controlada empleando la AFM con un sensor
de fuerza funcionalizado con fibronectina. En consecuencia, se observó el remodelado
de las FAs maduras y el reclutamiento de la proteína vinculina para la formación de
nuevas FAs en respuesta a la fuerza local aplicada.
Entender cómo interaccionan las moléculas dentro de un contexto tan complejo
como es una célula viva constituye un gran desafío, que conlleva describir cuáles son,
cómo se componen y cómo funcionan las distintas redes moleculares. Para ello se
requiere comprender cualitativa y cuantitativamente acerca de cómo los componentes
moleculares de las células interactúan unos con otros, y cómo se organizan en módulos
funcionales con tareas discretas específicas que una única clase de moléculas no podría
cumplir. Con las técnicas implementadas en este trabajo de Tesis se buscó correlacionar
la composición, localización, cinética e interacción de proteínas de las adhesiones
focales con el estado de tensión de la célula viva. De esta manera esperamos contribuir a
entender las leyes físicas que gobiernan el proceso de mecanotransducción celular, para
avanzar en una mejor descripción del mecanoma.
VII. Agradecimientos
213
En primer lugar quiero agradecer a CONICET, que me permitió realizar este
trabajo de Tesis mediante las becas Tipo I y Tipo II. Agradezco también a la FCEyN que
me dio el espacio para realizar este trabajo, y en particular al Departamento de Física,
al Centro de Microscopías Avanzadas, al Laboratorio de Electrónica Cuántica y al
Centro Multidisciplinario 1.
Quiero agradecer especialmente a Lía, por la oportunidad de trabajar en el
CMA, y por la confianza que me tuvo desde que empecé con la tesis. Por su
entusiasmo con los experimentos que hacen que uno se contagie tan fácilmente. Por
su infinita paciencia y sus charlas que nunca escatiman en tiempo. Por su apoyo de
siempre, no sólo científico sino también personal. A Andrea también quiero
agradecerle su paciencia que ya viene desde la tesis de grado! por su manera de
transmitir las ideas que hacen que todo parezca más fácil. A las dos las admiro como
científicas pero más por ser grandes mujeres.
A Eli Jares, por su generosidad científica y sus muchas ideas y pilas. A Omar
Azzaroni y Diego Pallarola por la colaboración con el trabajo de los biosensores, que
resultó muy fructífera para mis comienzos con el AFM. A Antonieta, Laura, Cecilia y
todo el grupo de María Elena Vela del INIFTA por todas las consultas acerca de los
tioles con los que supieron ayudarnos siempre.
Al grupo de Peter Hinterdorfer, el AFM-group del instituto de biofísica de Linz,
que supo recibirme y ayudarme con el mundo oculto de las interacciones moleculares
con el AFM. Por mostrarme que este tipo de experimentos son siempre difíciles, no
importa en qué lugar del mundo uno esté. A la Fundación Boehringer Ingelheim Fonds
por permitirme hacer esta estadía.
A Enrico Gratton por sus charlas esclarecedoras con el N&B, por la buena
predisposición.
A toda la gente que me acompañó en estos años por los varios laboratorios por
los que mis experimentos pasaron! y empiezo a nombrar...
A las chicas del CMA, Lore, Mica Caro y Lau, gracias por el aguante!! por la
amistad además de la ciencia. Por los infinitos mates, charlas, brownies y chocolates
214
inspiradores!!! A Lore gracias por toda la ayuda con la tesis y las infinitas horas de
discusión y corrección. A Mica por su ayuda con el análisis de las celulitas, a Caro con
la parte química y a Lau con la parte biológica. Hacemos un gran equipo las chicas! A
Silvio no lo voy a incluir entre las chicas, pero también gracias por su amistad y por
hacer del CMA un lugar donde da gusto permanecer! por los infinitos consejos con el
AFM no me va a alcanzar para agradecerle... A Claudia mil gracias por su
predisposición de siempre, su ayuda con la química y por las litografías! ya nos van a
salir las de las proteínas. A Natalio por aguantarnos a todas! (acá sí lo debería incluir a
Silvio).
A Esteban Hoijman por su paciencia total para enseñarnos a trabajar en el
cultivo, y a Martín Masip por compartir esas frustraciones, con ambos y las celulitas
nos divertimos mucho! A Jimena Giudice también le agradezco por darme su versión
de los hechos con el cultivo, que me aportó varias buenas costumbres actuales.
Bueno, al LEC que viene siendo como mi segundo hogar... empezando de
nuevo por Martin Masip y gracias por el Microscopio que nos dejó, y siguiendo por
Martin Caldarola y gracias por el Microscopio en el que se transformó! por la paciencia
con las células y el optimismo de siempre, y también por tooodas las consultas de
matlab-estadística-y miles de asuntos tecnológicos que siempre se entusiasma
respondiendo. A los dos Martines y al resto de los amigos lec de siempre: Gabi, Lau,
Edu, Maxi, Alberto, Pablo, Esteban, Darío y Francisco, porque hacen del trabajo una
alegría.
A Laura Estrada además por su ayuda con el N&B! y a Sofi que nos ayudaba
desde la panza. Gracias también por todos los envíos desde USA, cuánta paciencia!
A Hernán Grecco por la gran ayuda con el FRET y con las ideas para todos los
tipos de análisis, en especial para el análisis de los resultados del combinado. También
por todos los encargos. Y muchas gracias por la confianza para lo que vendrá!.
Todavía me queda el labo del Pabellón 2! A todos por el CM1 porque siempre
nos ayudan con los asuntos biológico-moleculares, y también por su amistad: A Lucía,
Amparo, Martín T., Jime, Yani, Joni, Fran, Jesi, Fede F. Y Fede Coluccio.
Y como si fuera poco, a los que siempre andan por ahí intercambiando asuntos
del confocal, cediendo ratitos de turnos, prendiendo la cámara y ayudando con los
problemas del equipo : Lucía, Estefi y Mariano y Vicky.
215
Por último dentro del ámbito académico quiero agradecer a todos, en todos
los niveles que hacen tan grato trabajar y ser docente en el Departamento de Física.
En especial de quienes aprendí mucho como docente por acá: Oscar Martínez, Diego
Grosz y Fernando Stefani. A Mariano y Marta, que desde la Subcomisión de
Doctorado me aconsejaron siempre y me ayudaron para poder llevar al día todos los
temas del doctorado.
Este año ha sido un año difícil en mi vida y creo que no hubiera podido seguir
adelante sin todo el amor de mi familia y de mis amigos, a los que ya se que no me van
a alcanzar las palabras para agradecer.
A mis amigas del alma, Pau, Lupe, Cari, July gracias por estar. A mi hermana de
la vida Meri gracias por el refugio! y qué divertido volver a la convivencia. En tu casa se
escribieron muchas de las páginas de esta tesis, gracias por las horas de charlas que se
seguirán suscitando sin encontrar soluciones de vida pero haciendo el camino tan
ameno!
A mis amigos de la carrera. Corina, Calvo y Curcio gracias por el apoyo en los
momentos difíciles y por no dejarme que me pierda lejos de la ciencia! Corinin gracias
por saber que podemos contar y seguir contando...
Y por último a la flía. A mis paternos por no dejar de cuidarme nunca, aunque a
veces no me deje, porque siempre los necesito. Esta tesis es en gran parte de ustedes.
A mis hermanos no les puedo agradecer sin emocionarme por el amor incondicional
que les tengo. Clari (o Martis) gracias por ser mi ejemplo en la vida y por todo lo que
me cuidás hermanita. Ha, gracia por estar por ahí en tu mundo tan cercano y tan
parecido al mío, gracias por la música :). Al futuro sobri!! que por suerte va a
encontrarse con una tía menos estresada... a Santiago gracias por el apoyo logistico,
sobre todo en las épocas en que necesitaba guardaespaldas! Al resto de mi gran
familia, tíos, primos y abuelas que siempre están, acompañando.
A mi prima Alber, por enseñarme todo lo fuerte que se puede ser. Y a los más
pequeños, porque un abrazo de ellos le cambia el día a cualquiera: Joaqui, Salvi, Emi y
Estani. A Francina por todo el amor que le correspondemos.