detección del gen glta rickettsia
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Detección del gen gltA, conservado en el género Rickettsia, mediante PCR
convencional a partir de garrapatas (Ixodidae) recolectadas en equinos del
municipio de Villeta, Cundinamarca
Elkin Fabián Valbuena Mora
Dirigido por
Marylin Hidalgo Ph D
Co-director
Alvaro A. Faccini M, MD
Jurado
Dra. Rubiela Castañeda Salazar MV. M Sc.
Pontificia Universidad Javeriana
Facultad de Ciencias
Carrera de Microbiología Industrial
Bogotá
2012
Detección del gen gltA, conservado en el género Rickettsia, mediante PCR
convencional a partir de garrapatas (Ixodidae) recolectadas en equinos del
municipio de Villeta, Cundinamarca
Elkin Fabián Valbuena Mora
Aprobado
Decano Académico Facultad Ciencias Directora Carrera Microbiologia
Dra. Ingrid Schuler Garcia Dra. Janeth Arias Palacios
Ph D. Ph D.
Bogotá
2012
Detección del gen gltA, conservado en el género Rickettsia, mediante PCR
convencional a partir de garrapatas (Ixodidae) recolectadas en equinos del
municipio de Villeta, Cundinamarca
Elkin Fabián Valbuena Mora
Aprobado
Directora Jurado
Dra. Marylin Eliseyev Hidalgo Díaz Dra. Rubiela Castañeda Salazar
M Sc., Ph D. MV. M Sc.
Bogotá
2012
Artículo 23 de la Resolución No. 13 de Julio de 1946
“La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada
contrario al dogma y la moral católica y porque las tesis no contengan ataques
personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de
buscar la verdad y justicia”
Agradecimientos A Dios por haberme acompañado y guiado a lo largo de mi carrera, por ser mi
fortaleza y por brindarme una vida llena de aprendizajes.
Le doy gracias a mis padres Luis Antonio Valbuena y Gladys Mora, por ser el
pilar fundamental en todo lo que soy, por su apoyo incondicional y sobre todo
por su sacrificio para ser realidad este sueño.
A mi hermana Milena Valbuena Mora por sus consejos, por su inalcanzable
apoyo y por ser un ejemplo a seguir.
Gracias a mi novia Ana milena Barragán Sánchez por su apoyo, comprensión y
amor.
Le agradezco la confianza, el apoyo y dedicación de tiempo a mi directora
Marylin Hidalgo Díaz y mi codirector Álvaro Faccini Martinez quienes hicieron
posible este trabajo y que además de ser orientadores fueron grandes seres
humanos.
A todos los que conforman el laboratorio de Bacteriología especializada por el
apoyo durante el proceso y por ser un gran grupo de trabajo.
A mis amigos, Daniel Granados por enseñarme que la amistad sincera es
posible, a Diego Millán por ser mi compañero de momentos malos y buenos y
por hacer de este largo camino una gran etapa y a Diego Pedraza mi único y
gran amigo de la Universidad.
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN .............................................................................................................................. 1
1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 1
2. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................... 2
3. MARCO TEÓRICO .................................................................................................................. 3 3.1. Generalidades: Género Rickettsia ................................................................................. 3 3.2. Garrapatas (Ixodidae) como vectores de las rickettsias ............................................ 4 3.3. Biología molecular de las rickettsiosis ......................................................................... 5
4. OBJETIVOS ............................................................................................................................ 5
4.1. Objetivo general .............................................................................................................. 5 4.2. Objetivo específicos ....................................................................................................... 6 4.2.1. Recolección de garrapatas ......................................................................................... 6 4.2.2. Clasificación taxonómica de las garrapatas ............................................................. 6 4.2.3. Extracción de ADN a partir de los vectores recolectados ....................................... 6
5. METODOLOGÍA ...................................................................................................................... 6
5.1. Población de muestreo ................................................................................................... 6 5.2. Recolección de garrapatas ............................................................................................ 6 5.3. Clasificación taxonómica de las garrapatas ................................................................ 6 5.4. Detección de rickettsias en especímenes colectados ............................................... 7 5.5. Análisis estadístico ........................................................................................................ 8
6. RESULTADOS ......................................................................................................................... 8 6.1. Recolección de garrapatas ............................................................................................ 8 6.2. Clasificación de las garrapatas ..................................................................................... 9 6.3. Detección de rickettsias en especímenes colectados ................................................ 9 7. DISCUSIÓN ........................................................................................................................... 10 8. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ........................................................................ 13 9. BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................................... 13 10. ANEXOS ............................................................................................................................... 17 10.1 Anexo 1. Claves taxonómicas para estadío y género ............................................... 17 10.2 Anexo 2. Procedimiento de PCR para el gen 16S rRNA............................................ 19 10.3 Anexo 3. Procedimiento de PCR para el gen gltA ..................................................... 19 10.4 Anexo 4. Tabla de clasificación taxonómica y por estadío de las garrapatas........ 19
1
Detección del gen gltA, conservado en el género Rickettsia, mediante PCR
convencional a partir de garrapatas (Ixodidae) recolectadas en equinos del
municipio de Villeta, Cundinamarca
Resumen
Las rickettsiosis son enfermedades causadas por bacterias del género Rickettsia,
que se transmiten a humanos a través de artrópodos vectores, causando en
algunos casos brotes graves con tasas elevadas de mortalidad, lo que las
convierte en un problema importante de Salud Publica.
El presente estudio evaluó mediante la técnica de PCR convencional, la presencia
del gen gltA, conservado en todas las especies de Rickettsia, a partir de
garrapatas (Ixodidae) recolectadas en equinos en la zona rural del municipio de
Villeta, Cundinamarca. Un total de 45 equinos fueron muestreados recolectando
386 garrapatas, distribuidas en 3 especies diferentes: 86 (22,5%) Amblyomma
cajennense, 298 (77,2%) Dermacentor (Anocentor) nitens y 2 (0,51%)
Rhipicephalus (Boophilus) microplus. De 234 grupos obtenidos durante el estudio,
191 grupos fueron positivos para el gen 16S rRNA y 2 para el gen gltA
correspondientes a una A. cajennense y D. nitens. A través de algunos estudios se
ha observado la presencia de especies de rickettsias circulantes en zonas
endémicas para fiebre manchada de las montañas rocosas reportando altas tasas
de seropositividad de anticuerpos contra Rickettsia rickettsii en equinos.
Sin embargo, son necesarios más estudios para la detección de genes más
específicos para el género Rickettsia como rOmpA y rOmpB, además del uso de
técnicas de secuenciación con el fin de establecer las especies de Rickettsia
presentes en las garrapatas.
1. Introducción
Las Rickettsiosis son enfermedades causadas por bacterias del género Rickettsia,
transmitida a humanos y a animales por medio de artrópodos vectores como
pulgas, piojos y garrapatas (1). Estas últimas, en su mayoría, involucran más de un
hospedero en su ciclo de vida, los cuales pueden ser animales domésticos tales
como caninos y equinos (2). En Latinoamérica, Dermacentor (Anocentor) nitens
es la principal garrapata asociada a equinos, seguida por Amblyomma cajennense
(3). En los últimos años, estudios serológicos realizados en equinos, demuestran
importantes tasas de seropositividad para rickettsias del grupo de las fiebres
manchadas, sugiriendo la presencia de estas bacterias en las zonas de estudio
2
(4). Este hecho suele presentarse en zonas geográficas endémicas para fiebre
manchada de las montañas rocosas, cuyo agente etiológico es R. rickettsii (5).
En Colombia la primera descripción de enfermedad humana por R. rickettsii, fue
realizada en 1937 por el Doctor Luis Patiño en la región del “Valle de Tobia”,
denominándola como “Fiebre de Tobia”, presentando tasas de mortalidad del 90%
(6). Sin embargo, casi 70 años después, entre 2003 y 2004, se reportaron dos
nuevos casos de mortalidad causada por esta especie de Rickettsia en personas
procedentes de zona rural de Villeta y Tobia, Cundinamarca, sin determinarse el
vector implicado (7). En el año 2005 se realizó un estudio en el municipio de
Villeta, el cual arrojó una seroprevalencia de anticuerpos de la clase IgG contra
R. rickettsii en humanos del 43% de la población estudiada, así mismo en el año
2007 fueron reportados estudios de seropositividad en equinos muestreados en
Villeta, Cundinamarca los cuales reportaron una seroprevalencia del 16,3% para
anticuerpos de la clase IgG contra especies de rickettsias del grupo de las fiebre
manchadas (8). A pesar de estos antecedentes, no existen publicaciones que
demuestren cuál o cuáles especies de garrapatas actúan como vectores de las
rickettsiosis ni las especies de rickettsias que predominan en la región de Villeta
Cundinamarca.
El objetivo de este trabajo fue determinar la presencia del gen gltA, conservado del
género Rickettsia, en especies de garrapatas de equinos del municipio de Villeta,
Cundinamarca mediante PCR convencional, aportando información preliminar
para el proyecto dentro del cual se encuentra enmarcado “Caracterización de
factores climáticos y ecológicos de una especie de garrapata y su relación con la
epidemiología de la rickettsiosis en un área endémica”.
2. Justificación y planteamiento del problema
Las Rickettsias son microorganismos que infectan a humanos, transmitidos a
través de artrópodos vectores, causando cuadros febriles agudos y en algunos
casos brotes graves con tasas elevadas de mortalidad, siendo consideradas como
un problema de Salud Pública (9). Es importante destacar que la eco-
epidemiologia de las rickettsiosis depende de la distribución de sus vectores; es
así como algunas especies de Rickettsia se delimitan a determinadas aéreas
geográficas como R. massiliae en Buenos Aires, Argentina, R.rickettsii en zonas
tropicales (Colombia, Brasil entre otras), R. helvética en Isla Madeira en Portugal y
R.slovaca en España, entre otras. (10).
En Centro y Suramérica la documentación sobre estas enfermedades ha ido en
progreso desde la última década con la descripción de nuevas especies como
R. amblyommii, R. rhipicephali, R. parkery, R. massiliae, R. akari, R. candidatus
entre otras y con casos clínicos relacionados (1, 10,11). La importancia de
3
documentar datos epidemiológicos sobre las rickettsiosis reside en que la
incidencia en países tropicales no sigue patrones temporales claros, lo que se
suma a su dificultad de diagnóstico por la semejanza a otras enfermedades
febriles agudas como el dengue y la malaria, presentando manifestaciones clínicas
similares (12).
En el caso de las rickettsiosis del grupo de las fiebres manchadas, la transmisión ocurre entre la garrapata (vector) y una especie animal, pasando por diferentes hospederos dependiendo de la especie de garrapata implicada, en donde los humanos pueden verse afectados, por lo que son consideradas como enfermedades zoonóticas (13). Uno de los factores que más se relaciona con este tipo de enfermedades zoonoticas, es la frecuencia con la cual los humanos se exponen a potenciales artrópodos vectores, especialmente relacionados a animales domésticos como caninos y equinos (14). Dermacentor (Anocentor) nitens y Amblyomma cajennense, son las principales garrapatas relacionadas con equinos en Suramérica, adicionalmente se han encontrado infectadas con especies de rickettsias como R. rickettsii, R. amblyommii, así mismo se destaca el papel de A. cajennense como principal vector de R. rickettsii en esta región geográfica (11,15). A su vez, algunos estudios, demuestran tasas considerables de seropositividad para R. rickettsii en equinos en zonas endémicas para fiebre manchada de las montañas rocosas, sugiriendo la circulación de bacterias del género Rickettsia (4,8). Teniendo en cuenta los reportes existentes en Colombia se considera a Villeta
como una zona endémica para las rickettsiosis (6,8). A pesar de esta clasificación
no se ha logrado establecer cual o cuales especies de garrapatas son las que
pueden actuar como vectores de la Rickettsia. Por esta razón este estudio, tuvo
como objetivo determinar la presencia del gen gltA, conservado en el género
Rickettsia, en especies de garrapatas recolectadas en equinos del municipio de
Villeta, Cundinamarca.
3. Marco teórico:
3.1 Generalidades: Género Rickettsia
El género Rickettsia pertenece al orden de los Rickettsiales y a la
familia Rickettsiaceae, son bacterias intracelulares obligadas, Gram negativas, con
capacidad de reproducirse tanto en el núcleo como en el citoplasma de la célula
infectada (13). Son transmitidas por artrópodos vectores, por lo cual, la
epidemiologia de las enfermedades causadas por estas bacterias, depende de la
distribución de sus vectores (2).
Los miembros de este género bacteriano se clasifican actualmente en cuatro
grupos, dadas sus características genéticas: Grupo de las fiebres manchadas
4
(R. rickettsii, R. conorii, R. parkeri, entre otras), Grupo del tifus (R. prowazekii y R.
typhi), Grupo transicional (R. felis, R. akari y R. australis) y el Grupo ancestral (R.
bellii y R. canadensis); este último sin patogenicidad conocida (16).
Una vez están en el hospedero vertebrado, las Rickettsias invaden las células
endoteliales induciendo su propia fagocitosis y una vez dentro del citosol, escapan
del fagosoma y proliferan por fisión binaria simple, siendo finalmente expulsadas
por exocitosis para seguir infectando células contiguas (13). La lesión vascular se
ve reflejada en el aumento de la permeabilidad vascular y hemorragia (16). En
relación a las garrapatas, las rickettsias se multiplican en casi todos los órganos y
fluidos, principalmente en glándulas salivales y ovarios, lo que facilita la
transmisión durante la alimentación y de manera transestadial (17).
Respecto a los humanos, la diseminación dentro del organismo se da por vasos
linfáticos seguido de los vasos sanguíneos hacia todos los órganos, la invasión de
las células endoteliales, produce un aumento en la permeabilidad vascular
causando un edema e hipovolemia (9).
3.2 Garrapatas Ixodidae como vectores de Rickettsias
Los vectores, ya sean artrópodos o mamíferos, son aquellos que intervienen en la
transmisión de virus, parásitos o bacterias, causando consigo una infección. Entre
los artrópodos con capacidad vectorial respecto a las rickettsiosis, se destacan las
garrapatas, los ácaros, las pulgas y los piojos (2).
Las garrapatas se clasifican en 3 familias Ixodidae (duras), Argasidae (blandas) y
Nuttalliellidae. Son arácnidos hematófagos obligados que tienen gran importancia
médica y veterinaria debido a las múltiples enfermedades que pueden transmitir
entre las que se encuentran involucrados diferentes organismos patógenos como
virus, bacterias, protozoos y nemátodos (18).
Las rickettsias del grupo de las fiebres manchadas, son transmitidas por
garrapatas pertenecientes a la familia Ixodidae principalmente, que se caracterizan
por un tamaño que varia entre los 2mm y 30mm dependiendo de la especie,
estadio y sexo (18); las etapas de desarrollo se dividen en 4 estadios, que incluyen
huevo, larva (hexápoda), ninfa y estadio adulto (octápodas) (18). En su mayoría,
respecto al ciclo de vida, las garrapatas de la familia Ixodidae, tienen un
hospedero por cada estadío de desarrollo (garrapatas de tres estadíos), en donde
la variedad de vertebrados tanto silvestres (zarigüeyas y roedores) como
domésticos (equinos, caninos y bovinos) actúan como hospederos (18).
5
Dentro del grupo de las fiebres manchadas, Rickettsia rickettsii, es la especie más
patógena (5). Ha sido encontrada en garrapatas de diferentes géneros como
Amblyomma, Dermacentor y Rhipicephalus recolectadas de animales domésticos
como caninos y equinos en México, Costa Rica, Panamá, Colombia, Brasil y
Argentina (11).
Dermacentor (Anocentor) nitens es la principal garrapata asociada a equinos,
clasificada como de un solo hospedero (19). Sin embargo se ha observado que
otras especies de garrapatas también tienen una relación directa con los equinos
en sus ciclos de vida, como es el caso de Amblyoma cajennense y en menor
frecuencia Rhipicephalus (boophilus) microplus (20). Amblyoma cajennense ha
sido reportada en varios países de Sur América como vector de R. rickettsii y
R. amblyommii (11,18). En relación a Rhipicephalus (boophilus) microplus, si bien
es conocida como la garrapata de los bovinos en algunos casos puede
encontrarse parasitando equinos, teniendo en cuenta que en algunos episodios
comparten zonas de pastoreo (15).
3.3 Biología molecular de la rickettsiosis
El diagnóstico clínico en humanos de las enfermedades rickettsiales es de gran
complejidad por la semejanza clínica respecto a otras enfermedades febriles
agudas (12). Es por esa razón que los métodos de diagnóstico en los últimos
años, se han enfocado en la identificación de genes específicos del género
Rickettsia mediante pruebas de biología molecular como la PCR (13).
El gen comúnmente analizado para la identificación de rickettsias es gltA (codifica
para la citrato sintasa), el cual se encuentra conservado en todas las especies del
género Rickettsia (20) así mismo es frecuentemente utilizado en la determinación
de la presencia de este género bacteriano en artrópodos vectores como pulgas y
garrapatas (21).
A su vez, existen otros genes (rOmpA y rOpmB), también utilizados para la
identificación de rickettsias. Estos son los que codifican para dos proteínas de la
membrana externa, rOmpA y rOmpB (20).
4. Objetivos
4.1 Objetivo general
Detectar mediante PCR convencional la presencia del gen gltA del género
Rickettsia en especies de garrapatas recolectadas en equinos en Villeta,
Cundinamarca.
6
4.2 Objetivos específicos
4.2.1. Recolección de las garrapatas de equinos en la zona rural del municipio de
Villeta, Cundinamarca.
4.2.2. Clasificar taxonómicamente y determinar el estadio de desarrollo de las
garrapatas de los equinos de la zona rural del municipio de Villeta, Cundinamarca
4.2.3. Evaluar la presencia de tickettsias en las especies de garrapatas colectadas
en equinos mediante la detección del gen gltA usando PCR convencional.
5. Metodología
5.1 Población de muestreo Se realizó el muestreo de los equinos pertenecientes a 23 veredas del municipio
de Villeta Cundinamarca incluyendo cabecera municipal.
5.2 Recolección de las garrapatas Dichos equinos fueron inmovilizados y las garrapatas fueron desprendidas
manualmente siguiendo la metodologia descrita por Alvarez y Bonilla (22). Para
lograr obtener una mayor cantidad de equinos se realizó una jornada de
desparasitación por cada vereda que se visitó.
Se realizó exámen físico para cada animal, de esta manera se inició por la región
de la cabeza y el cuello incluyendo el interior de las orejas (área 1), posteriormente
se siguió con la región pectoral y axial (área 2), luego la región abdominal (área 3)
finalizando con la región inguinal y perineal (área 4), las garrapatas recolectadas
fueron puestas en un recipiente con etanol al 70% para preservarlas. Por medio de
una encuesta se registaron datos de cada animal correspondientes a la especie,
raza, sexo, edad, áreas corporales infestadas, zona geográfica y fecha de colecta .
Despues de recolectadas las garrapatas fueron transportadas al laboratorio de
parasitologia veterinaria de la FMVZ de la Universidad Nacional de Colombia.
5.3 Clasificación taxonómica
Las garrapatas recolectadas fueron identificadas en el Laboratorio de parasitología
Veterinaria de la Universidad Nacional de Colombia clasificandolas por medio de
claves taxonómicas para llegar a género y especie (23) (anexo 1). Poteriormente
fueron separadas primero por estadío de desarrollo, animal al que pertenece y
vereda.
7
Las garrapatas identificadas hasta el taxón más específico se conservaron en
alcohol etílico al 70% en recipientes individuales para cada hospedero, región
muestreada (vereda) y estadío de desarrollo en caso de las hembras.
5.4 Detección de rickettsias en especímenes colectados.
La identificación molecular se realizó reuniendo las garrapatas recolectadas por
animal y zona geografica en grupos de 5 a 6 en caso de los machos, en grupos de
7 u 8 en caso de ser ninfas o larvas y en las hembras una por recipiente, esto se
hizo ya que el tamaño de los machos, ninfas y larvas, es menor que el de las
hembras .
Cada garrapata se lavó con agua destilada estéril y fue cortada por la mitad. Una
mitad se guardó debidamente identificada a -80º C en caso de problemas de
contaminacion y la otra mitad fue utilizada para la extracción de ADN y posterior
análisis por PCR.
Para la extracción de ADN los grupos fueron puestos en baño termostatado a
78ºC por 20 minutos con el fin de evaporar el etanol ya que este compuesto es
inhibidor de la PCR. Posteriormente las garrapatas fueron sacadas de cada grupo
y puestas en un tubo eppendorf estéril al cual se le agregó 400 µl de PBS 1X para
luego ser maceradas. La extracción de ADN se realizó utilizando el estuche
comercial de Quiagen siguiendo el procedimiento descrito, con una modificacion,
la adición de 400 uL de DNAzol, con el fin de obtener el ADN mas puro ya que el
DNAzol es un detergente que hidroliza al ARN y es selectivo para la obtención de
ADN. Posteriormente se hizo la cuantificacion del ADN extraido por medio del
nanodrop determinando cantidad y calidad del mismo.
El ADN extraido de cada grupo fue congelado a -20ºC y utilizado para la
amplificación del gen 16s rRNA mitocondrial descrita por Mangold y colaboradores
(24) (Anexo 2) como control de inhbidores de la PCR, asi como para la
amplificación de un fragmento de 401 pb del gen gltA descrita por Labruna y
colaboradores (25) (Anexo 3) el cual corresponde a un gen presente en todas las
especies de Rickettsia (21).
La amplificación de la citrato sintasa se llevó acabo por PCR convencional
utilizando los primers 78 ( sentido) y 323 (anti sentido) (25). En cada una de las
PCR realizadas se incluyeron tanto un control positivo de DNA puro de Rickettsia
rickettsii como un control negativo el cual contenia solo agua. Cinco micro litros del
marcador de peso molecular de 100 pb de la casa comercial ZYMMO y diez
microlitros del producto de PCR fueron sometidos a la electrofresis en gel de de
agarosa al 2,0%, teñido con Sybr Safe y examinado bajo transiluminacion UV.
8
5.5 Análisis estadístico.
En el presente trabajo se realizó un muestreo por conveniencia en donde se
usaron los equinos que se encontraban disponibles el dia en que se realizó la
jornada de desparasitación. Así mismo para el análisis estadísticos de los
resultados, se utilizaron herramientas de estadistica descriptiva, tomando como
base medidas de frecuencia y realizando cálculos de proporciones.
6. Resultados
6.1 Recolección de garrapatas
En 19 veredas incluyendo la cabecera municipal de las 23 incluidas en la
investigación, se encontró un total de 76 equinos, de los cuales 45 presentaron
infestación por garrapatas, en las 5 veredas restantes no hubo equinos.
Un total de 386 garrapatas fueron recolectadas las cuales estuvieron distribuidas
en 13 veredas, en las 6 veredas restantes no hubo equinos infestados (Figura 1).
Figura 1: Número de garrapatas distribuidos en las 13 veredas.
127
21
22
38
22
62
27 18
127
127
5
127
15
5
127
26
10
15
9
6.2 Clasificación taxonómica Teniendo en cuenta la zona geográfica y el equino muestreado, a las garrapatas
obtenidas se les asignó un código único, posteriormente las 386 garrapatas
recolectadas se clasificaron por género, especie y estadío, obteniendo como
resultados: Amblyomma cajennense 22,3% (n=86), Dermacentor (anocentor)
nitens 77,2% (n=298) y Rhipicephalus (boophilus) microplus 0,51% (n=2)
(Figura 2) (Anexo 4).
A B C
Figura 2: Especies de garrapatas recolectadas. A: Amblyomma cajennense. B: Dermacentor
(Anocentor) nitens. C: Rhipicephalus (Boophilus) microplus.
6.3 Detección de rickettsias en especímenes colectados
A partir de las 386 garrapatas recolectadas de los equinos, se obtuvieron 234
pools a los cuales se les realizó PCR convencional para el gen 16S rRNA
mitocondrial de garrapata como control de inhibidores, teniendo como resultado
191 grupos positivos (81,6%) y 43 grupos negativos (18.3%) para el gen 16S
rRNA (figura 3).
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 C13 C14 C15 C16 C17 C18 C19 C20
Figura 3. Gel de agarosa de la PCR para el gen 16S rRNA mitocondrial de garrapata. En el carril 1
(C1) se observa el marcador de peso molecular, en los carriles 19 y 20 (C19 y C20) se sembró el
control negativo de extracción de ADN y el control negativo respectivamente. La muestra del carril
11 (C11) es negativa, las demás muestras son positivas.
A los 191 pools positivos obtenidos en la PCR convencional para el gen 16S
rRNA mitocondrial de garrapata, se les realizó PCR para el gen gltA presente en
15
127
127 10 26
10
todas las especies de Rickettsia, obteniendo como resultado 2 grupos positivos
(1,0 %) y 189 grupos negativo (99%) (Figura 4), los cuales correspondían a una
hembra A. cajennense y una hembra D. nitens
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 C13 C14 C15
Figura 4. Gel de agarosa de la PCR para el gen gltA. En el carril 1 (C1) se observa el marcador de
peso molecular, en el carril 2 (C2) el control positivo, en el carril 15 (C15) se sembró el control
negativo. La muestra del carril 14 (C14) es positiva.
7. Discusión
Tres especies de garrapatas, D. nitens, A. cajennense y R. microplus fueron
encontradas parasitando equinos en la zona donde se llevó a cabo la recolección
(Villeta, Cundinamarca), esto concuerda con estudios previos en Brasil y Panamá
que reportan dichas garrapatas infestando equinos, en zonas donde la fiebre de
las montañas rocosas ha estado presente (3,5,26).
D. nitens fue la especie más encontrada, seguida por A. cajennense y en menor
proporción R. microplus; resultados similares fueron obtenidos en 6 granjas del
estado de Sao Paulo por Heuchert et al. (1999) (27), y concuerda con lo reportado
por Labruna et al. (2001) (3) quien indica que los equinos son considerados
hospederos primarios para las especies A. cajennense y D. nitens. Cabe resaltar
que los equinos han sido utilizados en zonas endémicas de la fiebre manchada de
las montañas rocosas indicando la presencia de bacterias de género Rickettsia en
dichas zonas, estudios previos de ensayos de inmunofloresencia indirecta lo
corroboran con datos altos de seropositividad en equinos en zonas endémicas
para fiebre manchada (4,8,28). Por otro lado, R. microplus ha estado asociada a
bovinos como su huésped principal, sin embargo se ha observado en estudios
anteriores la posibilidad de que los equinos actúen como hospederos accidentales
para esta especie de garrapata cuando comparten zonas de pastoreo con los
bovinos (15), fundamentando la razón por la cual esta especie de garrapata se
encontró durante el estudio.
D. nitens y A. cajennense estuvieron presentes en los tres estadíos (larva, ninfa,
adulto) por el contrario R. microplus solo se presentó en estadío adulto. Cabe
resaltar que durante el estudio se obtuvieron más garrapatas en estadío adulto,
11
debido a que el periodo de colecta fue entre Julio y Diciembre, el cual se presentó
como época de sequia; esto concuerda con estudios realizados en Brasil por
Oliveira et al (2000), donde la mayor cantidad de especímenes (adultos) fueron
recolectados entre los meses de Septiembre y Diciembre (29). Este fenómeno se
debe a que cuando las temperaturas son mayores, los niveles de infestación son
mas altos, por lo que la abundancia larval y de adultos es superior, principalmente
porque las garrapatas evitan recibir directamente luz solar para impedir su
desecación, lo que genera un tropismo hacia las zonas sombreadas del caballo,
entre las que se destacan las orejas, el perine, la cola y la ingle (19, 29,30).
De las tres especies de garrapatas recolectadas en el estudio, solo en dos
(hembras de D. nitens y A. cajennense) se logró detectar el gen gltA, datos
semejante fueron reportados en un estudio realizado en Panamá por Bermúdez et
al (2010) (5). Así mismo hay que tener en cuenta que la detección de ADN de
Rickettsia en sangre de garrapatas no es frecuente, se ha reportado que sólo el
4% de las garrapatas del género Dermacentor están infectadas con Rickettsia y
menos del 0.1% con especies patógenas (31), de igual forma Labruna et al (2001)
(3) reportan infección de bacterias del género Rickettsia en garrapatas de la
especie A. cajennense en menos del 1%, datos que coincide con lo obtenido en el
presente estudio donde se obtuvo el 1% de grupos positivos para el gen gltA .
Éste fenómeno también se presenta en humanos, generalmente el número de
rickettsias en la sangre es bajo, a excepción de una enfermedad avanzada o una
infección severa. Así, la detección para el diagnóstico de fiebre manchada de las
montañas rocosas es limitada, debido a la baja prevalencia de la enfermedad. Sin
embargo, han surgido nuevos métodos basados en PCR, los cuales presentan
ventajas como mayor velocidad, sensibilidad y reproducibilidad, respecto a la PCR
convencional. Éstas técnicas, en caso de poder ser implementadas y
adicionalmente ser complementadas con métodos inmunológicos, pueden ayudar
al diagnóstico oportuno de esta enfermedad (32).
A pesar de haber logrado detectar el gen gltA, en el estudio no se realizó la
identificación de la especie implicada en cada espécimen, sin embargo estudios
anteriores por Labruna et al (2001) demuestran que la especie que comúnmente
infecta a Amblyomma cajennense es Rickettsia rickettsii agente etiológico de la
fiebre manchada de las montañas rocosas (3). Así mismo estudios previos
demuestran la posibilidad que Rickettsia rickettsii infecte a D. nitens (5), lo que
nos podría sugerir la presencia de esta especie de Rickettsia en lo grupos
positivos para el gen gltA teniendo en cuenta que la especie de garrapata fue
recolectada y que además Rickettsia rickettsii ha sido reportada en Villeta,
Cundinamarca lugar donde se llevó a cabo el presente estudio (6,7).
12
No obstante estudios previos demuestran que Rickettsia Amblyommii es capaz de
infectar especies como A. cajennense y D. nitens (33) las cuales fueron las
mismas especies que se obtuvieron en el presente estudio como positivas para el
en gltA. R. amblyommii se ha reportado como un patógeno humano potencial,
pero esto no se ha comprobado con su aislamiento en muestras de pacientes que
presenten la enfermedad; adicionalmente se ha demostrado su circulación entre
garrapatas y animales domésticos en Panamá, por lo que debe ser considerado
como un posible patógeno humano en este país. Hay que tener en cuenta que
hallazgos similares han sido reportados en la frontera entre Colombia y Panamá,
por lo que R. amblyommi debería ser considerado un patógeno humano potencial
también en nuestro país (5).
Partiendo de lo anterior se podría sugerir la presencia de esta especie de
Rickettsia en el presente estudio, teniendo en cuenta que si bien se ha reportado
casos letales por R. rickettsii, además de estudios serología tanto en animales
como en humanos reportando altas tasas de seropositividad, en los últimos años
no se han registrado nuevos casos, lo que podría sugerirnos que estamos frente a
una especie de Rickettsia menos patógena, sin embargo cabe aclarar que en el
presente estudio no se realizo la secuenciación de las muestras positivas para el
gen gltA.
Al igual que con otras enfermedades transmitidas por vectores, las rickettsiosis
son de difícil control debido a su epidemiología compleja que involucra diferentes
garrapatas como vectores, así como numerosos animales hospederos y sus
dinámicas de población; el ser humano es un hospedero accidental en el caso de
D. nitens a diferencia de A. cajennense, la cual se alimenta de varios hospederos
dentro de los cuales algunas veces al hombre (5,32). Sin embargo, el ser humano
no es responsable del mantenimiento de la infección en la naturaleza, de esto se
encargan los vectores, como las garrapatas, las cuales transmiten las rickettsias
durante varias generaciones transováricamente (34). No obstante las rickettsias
pueden llegar a ser patógenas para las garrapatas después de varias
generaciones, por lo que para mantenerse en el ambiente, las rickettsias deben
ser transmitidas horizontalmente a hospederos vertebrados que desarrollen
rickettsemia en una magnitud suficiente para infectar otras garrapatas, y así
empezar nuevas líneas de rickettsias mantenidas transováricamente (34).
Sin embargo, este proceso puede verse afectado por la infección transovárica de
las garrapatas por otras especies no patógenas de Rickettsia, impidiendo la
distribución de R. rickettsii; además de esto, el éxito de la transmisión transovárica
depende principalmente del grado de desarrollo de Rickettsia en el tejido ovárico
de la garrapata (35). Con lo anteriormente mencionado se hace evidente la
13
importancia de los caballos, entre otros mamíferos, en el ciclo de vida de especies
del género Rickettsia como R. rickettsii y en su transmisión a humanos. Por esto,
se hace necesario un conocimiento preventivo en zonas endémicas para la fiebre
de las montañas rocosas así como la unificación de las ramas de la medicina que
involucran animales y humanos, los cuales se ven afectados por este grupo de
enfermedades, con el fin de lograr un incremento en el nivel de comunicación
entre médicos y médicos veterinarios y así lograr la aplicación de medidas
preventivas efectivas para evitar el desarrollo de brotes y en tal caso, lograr un
diagnóstico más eficiente y un tratamiento apropiado tanto para los mamíferos
como para los humanos (36).
8. Conclusiones y recomendaciones
Los equinos muestreados en la zona rural del municipio de Villeta,
Cundinamarca se encontraban infestados con garrapatas de las especies
D. nitens, A. cajennense y R. microplus.
Se logró detectar el gen gltA en dos especimenes (D. nitens, A.
cajennense) correspondiente al 1%, sugiriendo la presencia del género
Rickettsia en la zona de estudio.
Es necesario la secuenciación para las muestras positivas del gen gltA
obtenidas en el estudio con el fin de corroborar la especie presente en cada
espécimen, además de la amplificación de genes más específicos para
especies de Rickettsia como ompA y ompB (20).
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17
10. Anexos
10.1. Anexo 1: Claves taxonómicas para estadío y género.
18
19
10.2. Anexo 2: Procedimiento de PCR para el gen 16S rRNA
Las condiciones de la PCR incluyen una denaturación inicial a 94°C durante 2
minutos, seguida por 35 ciclos de 30 segundos a 94°C, 30 segundos para la
hibridación de los iniciadores y 45 segundos para la extensión de los mismos a
72°C. La temperatura de anillamiento de los 7 primeros ciclos se incrementa a
razón de 0,3°C cada segundo ciclo de 47 a 48,8°C, seguido por 28 ciclos usando
una temperatura de anillamiento de 50°C. Se lleva a cabo un paso final de
extensión durante 7 minutos a 72°C. Los iniciadores utilizados para la
amplificación de un fragmento de 460 pb del gen 16S rRNA son: Forward: 5’-CCG
GTC TGA ACT CAG ATC AAG T-3’ y Reverse: 5’-GCT CAA TGA TTT TTT AAA
TTG CTG T-3’
10.3. Anexo 3: Procedimiento de PCR para gltA
Las condiciones de la PCR incluyen un ciclo inicial a 95°C durante 3 minutos, 40
ciclos por 15 segundos a 95°C, 30 segundos a 48°C, 30 segundos a 72°C y un
ciclo final a 72°C durante 7 minutos. Los iniciadores utilizados fueron CS-78: 5’-
GCA AGT ATC GGT GAG GAT GTA AT-3’ y CS-323: 5’-GCT TCC TTA AAA TTC
AAT AAA TCA GGA T-3’
10.4 Anexo 4. Clasificación taxonómica de género y especie y por estadio de
las garrapatas, y distribución por veredas.
Vereda Género y especie ( garrapata)
Estadio
Larva Ninfa Adulto
Hembra Macho
Alto de paja A. cajennense 0 0 2 1
D. nitens 0 0 0 2
Balsal A. cajennense 0 0 0 3
D. nitens 0 0 2 10
Cabecera Municipal A. cajennense 0 4 5 22
D. nitens 2 22 45 27
Chapaima A. cajennense 0 0 5 1
D. nitens 3 16 9 4
Chorrilo R.microplus 0 0 0 2
D. nitens 0 8 1 4
Cune A. cajennense 0 1 3 2
D. nitens 0 0 9 6
La bolsa A. cajennense 0 0 0 1
20
Anexo 4. Clasificación taxonómica de género y especie y por estadio de las garrapatas, y
distribución por veredas.
D. nitens 0 0 9 0
llo grande D. nitens 0 4 1 0
Mave D. nitens 0 6 15 1
Naranjal A. cajennense 1 3 12 6
Payande A. cajennense 0 0 0 1
D. nitens 14 11 0 0
Salitre negro A. cajennense 0 1 9 3
D. nitens 0 0 4 1
San isidro D. nitens 0 1 51 10
TOTAL
13 3 20 77 182 107
386 Garrapatas