desarrollo del inoculo y cultivo celular por lotes de kluyveromyces marxianus nrrl y

7/23/2019 Desarrollo Del Inoculo y Cultivo Celular Por Lotes de Kluyveromyces Marxianus Nrrl y

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DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES DE

Kluyveromyces Marxianus NRRL Y-7571

RESUMENEn el presente trabajo se ha desarrollado el cultivo celular de la cepa Kluyveromyces

Marxianus NRRL Y-7571 realizando su manipulación desde su estado inactiva en agar.

El cual ha seguido una serie de procedimientos secuenciales tales como activación en

estufa, inoculación en agar, dándole todas las condiciones y facilidades para que pueda

crecer, asimismo siguiendo con la secuencia se inoculo en un medio denominado rico

(3ml!, el cual tiene todos los nutrientes que esta levadura requiere para su óptimo

desarrollo.

"uego de un evidente crecimiento en el medio rico, la totalidad de este medio es diluido

dentro de otro medio al que se denomina m#nimo (3 ml! por sus limitaciones en cuanto a

nutrientes, ya que este contiene solo los componentes necesarios para que el

microorganismo pueda subsistir, tales como fuente de carbono que en nuestro caso fue

$ructosa.

%e trata entonces de observar y comparar como se va produciendo el crecimiento celular

con los nutrientes e&actamente necesarios para tal acción y al mismo tiempo como va

disminuyendo el sustrato en este caso principalmente la fructosa. ' esto es posible

determinar haciendo evaluaciones tales como crecimiento de biomasa mediante

absorbancia () nm en el espectrofotómetro! y el ensayo con reactivo *+% para el caso

del sustrato con una absorbancia de ) nm en el espectrofotómetro y la generación de

productos como el etanol el cual será medido mediante - (cromatograf#a de gases!

usando como factor e&terno n/propanol.

%e obtuvo un rendimiento promedio de0 biomasa de ,132 gg glucosa. 4 partir de la

biomasa obtenida se pudieron obtener los parámetros cin5ticos los cuales fueron un µma& 6

,11 hr /7, '8% 67,23 & 7/3 g de Etanolg de $ructosa, 9:% 6 , g de ;iomasahora.



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INTRODUCCION

En la actualidad muchos de los alimentos son obtenidos gracias al manejo yconocimiento del crecimiento de microorganismos. <esulta entonces importante el

conocimiento de las condiciones en que estos microorganismos puedan optimizar sus

productos. 8ara ello la preparación de medios de cultivo para estos microorganismos es un

buen punto de partida para conocer sobre su comportamiento as# como tambi5n el

seguimiento de la cin5tica nos proporciona datos mucho más prácticos y e&actos sobre la

velocidad y caracter#sticas del crecimiento del microorganismo tratado.

"a preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una etapa

fundamental para asegurar la productividad de los mismos. "os componentes de los medios

constituyen los efectores e&ternos de naturaleza qu#mica que desempe=an un rol esencial en

los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formación

de productos y además suministrar energ#a para la s#ntesis de metabolitos y para el

mantenimiento celular. +o obstante que los microorganismos var#an considerablemente

respecto de los nutrientes que pueden necesitar.

Es as# que para esta práctica hemos centrado nuestra atención en el tratamiento deun microorganismo ( Kluyveromyces Marxianus NRRL Y-7571!, iniciando desde su

siembra partiendo desde su estado en cepa congelada , para luego sembrarlo en medio rico,

empleando la glucosa como fuente de carbono, procurando su rápida activación, para que

luego de un determinado tiempo podamos sembrar la bacteria pero en un medio m#nimo>

es decir con los m#nimos requerimientos> en el cual es más factible determinar la cin5tica

de crecimiento.

*entro de su importancia en la agroindustria la Kluyveromyces Marxianus NRRL Y-

757 1es muy valiosa para la conversión de fructosa en etanol que puede mejorar la

econom#a de una planta transformadora de azucares naturales de frutas a etanol. -on la

conversión de la fructosa, la potencial reducción del precio está en función de tres

parámetros de fermentación0 el rendimiento, la tolerancia de etanol y la productividad.



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4sumiendo altos valores para estos parámetros, la reducción má&ima puede volverse de

)?. @oy en d#a es conocido que un nAmero de levaduras fermenta fructosa en etanol,

siendo Kluyveromyces Marxianus de las más eficientes, especialmente en relación con el

rendimiento y la proporción volum5trica. Empleando esta levadura para la fermentación de

la */&ilosa, la reducción en el precio del etanol alcanza el 2? del má&imo asequible.

Kluyveromyces Marxianus NRRL Y-7571es una de las mejores cepas de levadura

natural capaz de convertir el azAcar he&osa, fructosa, en etanol. 8ara desarrollar una más

eficiente pentosa en el proceso de fermentación, la nutrición se basa en estrategias para

mejorar la vitalidad de levadura y la fermentación se e&ploró la eficiencia mediante el

estudio de variadas culturas en nutrientes tales como0 aminoácidos, urea, vitaminas, y

minerales.

A. CULTIVO POR LOTES

"a fermentación por lotes se refiere a un sistema completamente cerrado donde todos

los materiales requeridos están cargados en el fermentador, previamente desinfectados

antes del proceso de fermentación y los residuos removidos al final. "os Anicos

materiales e&tra#dos y agregados durante el curso de una fermentación por lotes son el

intercambio de gases y las soluciones de control de p@, respectivamente. En este modo

de funcionamiento, las condiciones están cambiando continuamente con el tiempo, y el

fermentador es un sistema de estado inestable.

"a ventaja principal es el menor riesgo de contaminación con respecto a otros procesos

de fermentación (cultivo continuo y cultivo por lote alimentado.

"a desventaja principal del cultivo por lotes es el alto tiempo improductivo entre lotes,

comprendiendo la carga y descarga del fermentador, la limpieza, esterilización y

procesos de salida. Btra desventaja es la inhibición del crecimiento por metabolitos primarios, secundarios y por la ausencia de nutrientes.



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B. CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO LÍQUIDO

%i el microorganismo crece en un medio l#quido, en la mayor#a de los casos las

c5lulas que se producen en cada división continAan su vida independientemente

formándose una suspensin de c5lulas libres.

En un cultivo discontinuo de microorganismos en medio l#quido, se pueden

diferenciar cuatro fases en la evolución de los parámetros que miden el crecimiento

microbiano0

1.- !"se #"$en%i" & 'e "'"p$"%in durante la que los microorganismos adaptan su

metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y

condiciones de cultivo! para iniciar la fase de crecimiento e&ponencial.

(.- !"se e)p&nen%i"# & #&*"+,$i%" en ella la velocidad de crecimiento es má&ima y

el tiempo de generación es m#nimo. *urante esta fase las bacterias consumen a

velocidad má&ima los nutrientes del medio. "a evolución del nAmero de c5lulas

durante esta fase se e&plica con los modelos matemáticos que describiremos a

continuación.

/.- !"se es$"%i&n"+i" en ella no se incrementa el nAmero de bacterias (ni la masa u

otros parámetros del cultivo!. "as c5lulas en fase estacionaria desarrollan un



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metabolismo diferente al de la fase e&ponencial y durante ella se produce una

acumulación y liberación de metabolitos secundarios que pueden tener importancia

industrial.

"os microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algAn nutriente

esencial del medio o porque los productos de desecho que han liberado durante la

fase e&ponencial hacen que el medio sea inhóspito para el crecimiento microbiano.

"a fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente con

mayor fidelidad el estado metabólico real de los microorganismos en los ambientes

naturales.

0.- !"se 'e ue+$e se produce una reducción del nAmero de bacterias viables del

cultivo.

C. !ACTORES !ISICOQUÍMICOS QUE A!ECTAN LA RAPIDE DE

CRECIMIENTO.

E2e%$& 'e# p3 4 #" $epe+"$u+" s&+e e# %+e%iien$&

"os microorganismos pueden crecer en una variada gama de p@ que va desde

p@61 para los acidófilos hasta p@677 para alcalófilos. En general los

microorganismos que toleran p@ ácidos no toleran p@ alcalinos y viceversa.

Cndependientemente del p@ que pueda soportar un microorganismo, es importante

conocer cuál es el p@ óptimo para el crecimiento. En la fig. 77 está representada en

forma general la variación de un con el p@ para hongos y bacterias. *e la misma

surge claramente que en general los hongos tienen un p@ óptimo cercano a

mientras que para bacterias se da alrededor de p@ 6 2> además debido a la forma

DachatadaD de las curvas, variaciones de . unidades de p@ alrededor del óptimo

no tienen mayor influencia. *urante el crecimiento los microorganismos modifican

el p@ del medio de cultivo, normalmente haci5ndolo disminuir> por tal motivo es

frecuente incluir en las medias sustancias que actAen como tampón (buffer! a fin de

evitar que el p@ se aleje del óptimo.



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El efecto de la temperatura sobre el crecimiento es complejo. 8or un lado cada

reacción qu#mica individual, de todas las que conforman el metabolismo, es

afectada por la temperatura, por lo que un incremento de 5sta resulta en una mayor

velocidad de reacción. Esto se traduce en un aumento de p@ con la temperatura.

8or otra parte, aumentos

posteriores de temperatura inactivan las enzimas que catalizan las reacciones, con lo

que el valor de un decrece rápidamente. "a temperatura óptima resulta de la

interacción de estos dos efectos.

L" $epe+"$u+" "a temperatura ejerce una influencia determinante en el conjunto

de la actividad celular microbiana .4 temperaturas bajas esa actividad puede ser

bloqueada totalmente .*ado que es una propiedad comAn a todas las reacciones

qu#micas, el crecimiento microbiano es acelerado por un aumento de temperatura y

se puede considerar, globalmente, que la velocidad de crecimiento se duplica

cuando la temperatura se eleva en 7 -.

*e acuerdo a la temperatura en la cual se observa este fenómeno, las levaduras son

microorganismos mesófilos que prefieren temperaturas intermedias vecinas a

3- .%u crecimiento no se efectAa por debajo de 7- , ni por arriba de los )-

para la mayor parte de ellos. "a temperatura óptima para Kluyveromyces marxianus

var. se encuentra entre 3 F ) G -, Elsevier, 7HH.

E# p30 Es un parámetro cr#tico en el cultivo de microorganismos ya que estos sólo

pueden crecer en un rango estrecho de p@ fuera del cual mueren rápidamente. El



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p@ intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las c5lulas ya que,

en muchos casos, la obtención de energ#a metabólica depende de la e&istencia de

una diferencia en la concentración de protones a ambos lados de la membrana

citoplásmica. @ay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el p@

del medio de cultivo suele tender a bajar durante el cultivo. El decremento del p@

se puede deber a varios factores, uno de los cuales es la liberación de ácidos

orgánicos de cadena corta (fórmico, ac5tico, láctico!. 8or consiguiente, es necesario

controlar el p@ de los cultivos para evitar que un descenso e&cesivo pueda producir

la auto esterilización del cultivo

E# p&$en%i"# +e'&) 4 e# &),*en& %on factores determinantes del crecimiento y del

metabolismo del cultivo. El potencial redo& del medio de cultivo nos indica sucapacidad para aceptar o donar electrones, esto es0 sus caracter#sticas o&idantes o

reductoras. Ino de los factores que intervienen en el potencial redo&, aunque no el

Anico, es la concentración de o&#geno, B1. @ay microorganismos que requieren

ambientes o&idantes para crecer, mientras que otros necesitan ambientes

reductores. El requerimiento de condiciones o&idantes o reductoras no debe

confundirse con la necesidad de presencia o ausencia de o&#geno para que se

produzca el crecimiento.

In microorganismo es aerobio cuando necesita o&#geno para vivir y es anaerobio

cuando o bien no lo necesita (anaerobios facultativos! o anaerobios aerotolerantes

como las bacterias lácticas o cuando muere en presencia de o&#geno (anaerobios

estrictos como los clostridios!. El rendimiento '&sde los procesos fermentativos es

menor que el de los respiratorios0 las bacterias y las levaduras producen menos

biomasa cuando crecen fermentando que cuando lo hacen respirando.

L" %&n%en$+"%in 'e #&s %&pues$&s 6ue se ne%esi$"n p"+" e# %+e%iien$&

Es importante porque puede provocar una disminución de la tasa de crecimiento a

causa de la alta presión osmótica del medio. @emos visto que en el curso de la fase

e&ponencial del crecimiento , las tasas de crecimiento era independiente de la

concentración de los distintos componentes del medio de cultivo .8or debajo de



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cierto nivel de concentración esto ya no es verdad .%i se cultiva un microbio en un

medio sint5tico que tiene un e&ceso de todos los compuestos que necesita a

e&cepción de uno , el crecimiento no se puede efectuar .-uando se suministran los

compuestos en cantidades peque=as y variables de un ensayo a otro , la tasa de

crecimiento permanece inferior a tasa má&ima mientras la concentración no es

suficiente , y aumenta al incrementar esa concentración .

8ara todas las concentraciones superiores a %J, la tasa de crecimiento es igual a la de

crecimiento má&ima .Esto nos e&plica porque la tasa de crecimiento es constante en

la fase e&ponencial, aunque las concentraciones sean superiores a %J .Esto , nos

e&plica tambi5n , al menos en parte , lo que se produce en la fase de disminución de

velocidad. Kambi5n algunos alcoholes superiores pueden ser utilizados como fuente

de carbono y ser transformado en ácido láctico (Montaño Ortega. M, 1991)

CUADRO DE CLASI!ICACION

8ne+&

Espe%ies 9s 2+e%uen$es

C"+"%$e+,s$i%"s

LEVADURAS

Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyce unisporus

"evaduras no fermentadoras dela lactosa, que producen alcoholy -B1 a partir de glucosa.

Candida kefir

Kluyveromyces marxianus var.marxianus.

"evaduras fermentadoras de lalactosa.

<esponsables de formación de-B1 y contribuyendo al

caracter#stico sabor y aroma.

D. LEVADURA



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"as levaduras constituyen una rama menor de los hongos en cuanto a nAmero de

especies (3 especies reagrupadas en 3H g5neros! Kienen una importancia grande por

sus actividades bioqu#micas .4lgunas realizan fermentaciones que se utilizan desde los

or#genes de la civilización (fermentación alcohólica! Estas actividades tienen

aplicaciones industriales muy importantes.

%u carácter comAn es el estado unicelular permanente o predominante en ausencia de un

verdadero micelo cenoc#tico.

CONDICIONES NECESARIAS PARA LA !ERMENTACION

E" p3 para KluyveromycesMarxianus NRRL Y-7571 está en el rango de 0.: " 5.:

"as levaduras son microorganismos es2i#&s, esto hace que la fermentación pueda

tener lugar en un rango de temperaturas desde los 73/7)- hasta los 33/3-.

*entro de este intervalo, cuanto mayor sea la temperatura mayor será la velocidad

del proceso fermentativo siendo tambi5n mayor la proporción de productos

secundarios. %in embargo, a menor temperatura es más fácil conseguir un mayor

grado alcohólico, ya que parece que las altas temperaturas que hacen fermentar más

rápido a las levaduras.

*ebido a que las levaduras, cuando viven en condiciones aeróbicas, no utilizan los

azAcares por v#a fermentativa sino o&idativa, para obtener con ello mucha más

energ#a.

"as levaduras fermentativas necesitan los azAcares para su catabolismo, es decir

para obtener la energ#a necesaria para sus procesos vitales, pero además necesitan

otros substratos para su anabolismo como son nitrógeno, fósforo, carbono, azufre,

potasio, magnesio, calcio y vitaminas, especialmente tiamina (vitamina ;7!. 8or

ello es de vital importancia que el medio disponga de una base nutricional adecuada

para poder llevar a cabo la fermentación alcohólica.



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"as levaduras tienen necesidad de o&#geno para desarrollarse, pero ellas se adaptan

durante un cierto tiempo a la vida anaeróbica.

• "a levadura usada es la KluyveromycesMarxianusNRRL Y-7571 siendo el sustratola glucosa. "a fórmula qu#mica de KluyveromycesMarxianuses la siguiente0

• "a v#a metabólica que utiliza es0 las 8entosas.

• "a concentración má&ima celular es de 1 g".

• µmá&. 6 .1 h

/7

. referencial por el paper • Letabolismo celular 0 4utotrófico

• Lacronutrientes 0 -, +, Lg, %, M y 8

• Licronutrientes 0 -a, +a, $e, -u, Ln, Lo, -o y Nn

C1.;0 31.7; O:.<: N:.17



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A. Es$"'& Ledio l#quido

B. C&p&si%in0 Ledio sint5tico o qu#micamente definido

Re6ue+iien$&s nu$+i%i&n"#es 8ara ello utilizamos un Ledio de cultivo m#nimo.

$uente de carbono y energ#a 0 lucosa -@71B

$uente de + 0 %ulfato de amonio (+@)!1%B)

$uente de % 0 %ulfato de amonio (+@)!1%B)

$uente de 8 0 $osfato diácido de potasio M@18B)

$uente de M 0 $osfato diácido de potasio M@18B)

$uente de Lg 0 %ulfato de magnesio heptahidratado

Lg%B).2@1B

$uente de % 0 %ulfato de magnesio heptahidratadoLg%B).2@1B

OB=ETIVOS

1.1 OB=ETIVOS ENERALES

*ise=ar un medio de cultivo celular por lotes en matraces, usando como

fuente de carbono glucosa y empleando una cepa de Pichiastipitis +<<" '/

271)*eterminar los parámetros cin5ticos de la cepa Pichiastipitis +<<" '/271)

1.( OB=ETIVOS ESPECÍ!ICOS

*eterminar la cin5tica de crecimiento de Pichiastipitis +<<" '/271)*eterminar la cin5tica de consumo de la fuente de carbono glucosa.*eterminar la cin5tica de generación de etanol*eterminar el OL ,':%, '8%.

Evaluar el valor del p@ durante la cin5tica.

MATERIALES Y METODOS

M"$e+i"# Bi&#*i%& Cep" #i&2i#i>"'" 'e KluyveromycesMarxianusNRRL Y-7571

PREPARACI?N DE S?LIDO DE MANTENCI?N M"$e+i"#es 4 E6uip&s



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• ;alanza anal#tica

• Latraz Erlenmeyer de 1 ml.

• Lechero ;unsen

• radilla• Kubos de ensayo con tapas.

• 8ipeta de 7 ml.

• Paso de precipitado.

• -ocina a gas

• Blla a presión.

• Parilla de vidrio

• uantes.

• Espátula

Re"%$i@&s 4 nu$+ien$es

• 4gua destilada.

• E&tracto de levadura.

• 8eptona.

• E&tracto de malta

• 4gar.

PREPARACI?N DE MEDIO DE ACTIVACI?N M"$e+i"#es 4 E6uip&s


• 1 Latraz de 71 ml.

• Ina probeta de 7ml

• Licropipeta

• Estufa

• 4lgodón



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• asa


• Espátula

Re"%$i@&s 4 nu$+ien$es• lucosa

• E&tracto de levadura

• %olución de sales

• 4gua destilada

• 4lcohol

PREPARACI?N DE MEDIO DE !ERMENTACI?N M"$e+i"#es 4 E6uip&s

• Latraz de 7 "

• 1 Latraces de 71 ml.



• asa y algodón

• Blla a presión

Re"%$i@&s 4 nu$+ien$es

• lucosa

• (+@)!1%B)

• %olución de sales

• M@18B)

• Lg%B).2@1B

• E&tracto de "evadura

• 4gua destilada

• 4lcohol



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INOCULACI?N AL MEDIO DE ACTIVACI?N Lateriales y equipos

• Latraz de 71 ml.

• 4lgodón

• asa

• 4gua destilada

• 4za bacteriológica

• %haQer

• Lechero ;unsen, tr#pode y rejilla

Espectrofotómetro Balanza Analítica Centrífuga

Horno Esterilización Agitador Autoclave

Incubadora Shaker



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RESULTADOS Y DISCUSION

A. CINETICA

DE

CULTIVO CELULAR POR LOTES

4 continuación se darán a conocer los datos obtenidos en todo el desarrollo

fermentativo de la levadura Kluyveromyces Marxianus NRRL Y !"!1 para la

producción d EK4+B", utilizando como fuente de carbono a la $<I-KB%4.

N 3&+" Tiep& ABS <0:n *L 2'

1 H0 .1) .3)H1R37 7( 703 7. .))7 .2323 7/ 710 3 .2) 7.1)27311 70 70 ) .3) 7.HR11 35 10 .32 7.2)22)7H 3< 303 . .)77 7.H)311R 37 0 R .))R 1.73H1)237 3 03 H. .1 1.217) 3; R0 77 .)RR 1.3)37R 3

1: H03 71. .) 1.21H313 311 770 7) .3 1.221RR 31( 710 7 .2 1.211RR1 3



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El medio de cultivo debe aportar todos los elementos necesarios para las s#ntesis

celulares y para cubrir las necesidades energ5ticas de las levaduras.

"a presencia de una concentración elevada de e&tracto de levadura y la inclusión de

factores (temperatura y agitación! de crecimiento en el medio de cultivo

favorecieron el crecimiento de Kluyveromyces Marxianus NRRL Y !"!1.

8robablemente el incremento del crecimiento fue por la inclusión de estos factores

fue debido a que la fructosa es un monosacárido y es fácil para la levadura

aprovechar la fuente de carbono que esta mol5cula pose, lo cual favorece a la

producción de etanol como producto de la fermentación.

raficando los datos obtenidos, tendremos que0

0 2 4 6 8 10 12 14 160

0.5

1

1.5

2

2.5

3

CRECIMIENTO MICROBIANO

BIOMASA

TIEMPO hr.

CONCENTRACION g/l



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$igura +G7. -in5tica de -recimiento de la "evadura Kluyveromyces Marxianus

NRRL Y !"!1

En la figura se pueden distinguir tres zonas0

#ase $e latencia. En esta fase, el microorganismo, sometido a un crecimiento

previo en un inóculo, se adapta a las condiciones del caldo de fermentación.;ásicamente es un periodo de ajuste metabólico. El crecimiento es bajo, y prácticamente no se presenta producción de etanol. *ebido a la transferencia delmicroorganismo del inóculo al nuevo medio, 5ste puede verse afectado por cambios en el p@, aumento en el suministro de nutrientes y descenso en losinhibidores de crecimiento

#ase ex%onencial . Esta fase es la más importante para el proceso, ya que lamayor parte del etanol se produce en este periodo. *epende parcialmente de laconcentración inicial del sustrato, y la cantidad de etanol a producir estácondicionada por la duración de esta fase. El tiempo en esta fase duro H horas.

#ase estacionaria. En este punto se detiene el crecimiento, debido alagotamiento de los nutrientes en el caldo de fermentación, as# como al efectoinhibidor que provoca la concentración de etanol en el medio. "a masa de losmicroorganismos permanece constante en esta fase, por el equilibrio que se daentre los que permanecen vivos y los muertos. +o se pudo determinar #" 2"se 'e ue+$e & 'e%"iien$& ya que se paró lafermentación por motivos de tiempo.

En la tabla 7 se muestra los valores e&perimentales del crecimiento en función al

tiempo de fermentación y en la $ig. 7 se observó que el crecimiento celular se

realizó rápidamente, esto probablemente ocurrió por la fuente de carbono utilizada,

la $<I-KB%4, que como se recuerda en la ruta metabólica todo nace en la

"I-B%4, la cual todav#a tiene que e&istir una enzima isomerasa para formar la

$<I-KB%4, entonces todo estas reacciones bioqu#micas ya no ocurren, entonces



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e&iste un ahorro de energ#a, lo que demuestra que la levadura reconoció fácilmente

al medio.

El crecimiento microbiano de la Kluyveromyces Marxianus NRRL Y-7571 se dio

debido a que utilizamos fructosa como fuente de carbono y una alta concentración

de e&tracto de levadura, entre los demás nutrientes y sales. "os compuestos

carbonados son utilizados por las levaduras a la vez como fuente de energ#a y como

fuente de carbono.

E# ni$+*en& es cuantitativamente el segundo constituyente aportado por el medio

de cultivo. Es utilizado por las c5lulas en los aminoácidos, los nucleótidos y algunas

vitaminas. 8ueden ser utilizadas numerosas fuentes de nitrógeno. Kodas laslevaduras son capaces de utilizar el nitrógeno en forma de ion amonio. "os iones

amonio pueden ser aportados en el medio por el cloruro amoniaco, el nitrato

amónico, el fosfato amónico y sobre todo el sulfato amónico, mejor compuesto pues

aporta al mismo tiempo el azufre necesario para la s#ntesis de ciertos aminoácidos.

(KR&'&R N R*+, 19-).

L&s e)$+"%$&s 'e #e@"'u+" son e&celentes substratos para muchos

microorganismos. %on productos a partir de la levadura de panader#a mediante

autolisis a F -.

El e&tracto de levadura contiene aminoácidos, p5ptidos, vitaminas solubles en agua

y carbohidratos. (OL', 199)

L" $epe+"$u+" corriente de cultivo de las levaduras se sitAa entre 1 y 3- que

permite efectivamente el crecimiento de la mayor parte de las levaduras. %in

embargo estas temperaturas no son reguladas a las temperaturas óptimas de

crecimiento que las levaduras que se encuentran en su hábitat natural. %iendo la

membrana citoplasmática de las c5lulas cultivadas a temperatura elevada mas

resistente a las desnaturalizaciones t5rmicas que la de las c5lulas cultivadas a baja

temperatura. (L/ON y 0R*N'L& 19).



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*e acuerdo la composición del medio de cultivo se observa que el crecimiento de la

Kluyveromyces Marxianus NRRL Y-7571 es óptimo lo cual demuestra que el

medio es propicio para el desarrollo del cultivo y cumple con los requerimientos

m#nimos que necesita las c5lulas para crecer.

De$e+in"%in De# MF De# Mi%+&&+*"nis& Kluyveromyces Marxianus NRRL Y

!"!1 en un Cu#$i@& p&+ L&$e %&n !RUCTUOSA %&& !uen$e 'e C"+&n&

4justando nuestros puntos, reconocimos la zona de fase e&ponencial en el cual se tuvo unmá&imo crecimiento celular de las levaduras Kluyveromyces Marxianus NRRL Y !"!1.

Tiep& LN

G&H:

1.5 .HH72

/ 7.12127H32

0 7.77)21)

%abemos que la cin5tica de crecimiento microbiano, está dado matemáticamente por lasiguiente ecuación0

dx

dt =µ.x

dx

x =µ.dt

C+KE<4+*B0

ln ( xf

xo )=µ.t

raficando0



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0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.50

0.5

1

1.5

2

f(x) = 0.38x + 0.06R² = 0.99

LN(X/Xo) vs. TIEMPO

!("#"$)

in%a& (!("#"$))

Tiempo (h)

LN(X/Xo)

Entonces, tendremos que0

-C+SKC-4 *E -<E-CLCE+KB LC-<B;C4+Bdx

dt =µ.x

dx

x =µ.dt

C+KE<4+*B0

ln ( xf

xo)=µ.t y=0.3833 x+0.0567

'má&6.3R33 h/7



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Entonces0

td6 ln (1!.3R3367.Rh

En la tabla 1 y fig. 1 se observa que la cin5tica de consumo de la fructosa se

encuentra en función a la velocidad de crecimiento de la Kluyveromyces Marxianus

NRRL Y !"!1, probablemente debido a que la fuente de carbono es destinado a la

formación de productos y a la manutención de las c5lulas por esta razón el crecimiento

se ve afectado y solo se observa un crecimiento má&imo de 7.7 gl estando el medio

de cultivo dise=ado para 1 gl> esto se debió a la buena fuente de nutrientes. 4simismo,

se observó que el crecimiento celular aumento debido al e&tracto de levadura como

fuente de aminoácidos, favoreció a que no e&ista una fase de latencia tan prolongada yas# obtener una curva de crecimiento más notoria y pronunciada

Keóricamente, el kluyveromyces marxianus presenta un O 6.)R h/7 pero como se puede

notar el O calculado prácticamente, es mucho menor que el teórico, esto debido a que

inicialmente se tuvieron todas las condiciones favorables, para su crecimiento, motivo

por el cual, no se tuvo una fase de latencia prolongada, pero con el pasar de las horas,

posiblemente la levaduras haya comenzado a sintetizar el etanol, por lo que su

velocidad de crecimiento disminuyo, asimismo por la e&pulsión del -B 1, producto de la

fermentación el cual no es removido.

Kambi5n, mencionemos a cada uno de los nutrientes, como el fósforo se halla incluido

en los ácidos nucle#dos y los nucleótidos di y tri fosfato. %e encuentra tambi5n en forma

de pol#meros lineales de polifosfato que juegan un papel importante en la regulación del

metabolismo celular. (MI"4EP y P44;BP 7HR3!.

"a concentración en iones fosfatos ( ! regula la s#ntesis de los l#pidos y los

glAcidos. El fosforo es asimilado por la c5lula en forma de iones ortofosfato ( !

las fuentes de fosforo en el medio de cultivo deben estar constituidas por el

dihidrogenofosfato de potasio ( ! o por el hidrogenofosfato disódico (



Página 3

!. En condición limitante de fosforo en el medio, la c5lula sintetiza una

fosfatasa acida (fosfomonoesteresa!, localizada en la pared que libera fosforo a partir de

los esteres fosfóricos (%-@I<< y '4C", 7H27!.

E" ? del azufre está incorporado en las prote#nas. El ? está en forma de sulfato

inorgánico libre el resto está en forma de enlace disulfuro y en aminoácidos sulfurados

libres. El azufre esta igualmente presente en algunas vitaminas. "a fuente de azufre

más frecuentemente utilizada en los medios de cultivo es el sulfato amónico. (84<<' y

col, 7H2!.

El potasio es el elemento mineral cualitativamente más importante en la levadura. Kiene

papeles fisiológicos importantes0 -atión regulador0 por cada penetración de un catión metálico divalente, hay

e&creción de 1MT ($I@<L4++ y <BK@%KEC+, 7HR!.

4 8@ acido, el potasio estimula la fermentación y la respiración (8E+4,

7HR!.

4ctAa como efector de numerosas enzimas0 piruvato quinasa, aldolasa,

aldeh#do deshidrogenasa y permeasa (4K8asa! (L4CB<E""4 ' col. 7HR)!.

Cnterviene en la estructura de los 4<+.

El magnesio es necesario para el buen funcionamiento de un centenar de enzimas del

metabolismo> juega el papel0

*e activador de las enzimas glicoliticas.

*e estimador de la s#ntesis de los ácidos grasos.

*e regulador de las 4K8asas de las membranas.

8articipa con el potasio en la penetración del fosfato.

B. DETERMINACI?N DE ACARES REDUCTORES G!RUCTUOSAHMJTODO DEL DNS GFCIDO DINITROSALICÍLICOH



Página 3

4 continuación se darán a conocer los datos obtenidos en el consumo de sustrato por

parte de la levadura Kluyveromyces Marxianus NRRL Y !"!1 para la producción

d EK4+B", utilizando como fuente de carbono a la $<I-KB%4.

Tiep&

ABS 50:n S2 *L

: .H) 3.H)21.5 .)H 1.R)2233/ .)1 .1112R710 .7) .)2725 .) .177HH

<.5 .7R .171271)

.77 .11H)H)));.5 .71 .1)R32)1)11 .71 .1)27HH

1(.5 .713 .1))72R23

+"2i%"n'&

0 2 4 6 8 10 12 140

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.54

CONSUMO E SUSTRATO

SSRAO

TIEMPO hr.

CONCENTRACION g/l

!IURA / Cu+@" 'e C&nsu& 'e sus$+"$& 'e Kluyveromyces Marxianus NRRL Y !"!1



Página 3

En la figura 3, se puede ver el consumo de sustrato en el medio de fermentación quecomenzó rápidamente, motivo por el cual anteriormente se observó unainsignificante fase de latencia. Pemos que el microorganismo metabolizórápidamente al sustrato, esto en parte se debió a las buenas condiciones inicialesque se tuvo tales como el p@óptimo, temperatura, buena aireación y por su puesto

un rico medio de cultivo.%egAn Mosaric et al, 7HR2, H refiere En la fermentación por lotes, se cargan en elreactor el caldo de fermentación (sustrato! y una solución esterilizada previamenteinoculada con losmicroorganismos. 4 lo largo dela fermentación suele a=adirsealgo de o&#geno (en forma deaire!, agente antiespumante,ácidos o bases para controlar el p@, nutrientes (si se requieren!y antibióticos> asimismo sea=ade inóculo fresco si esnecesario."a conversión de azAcares enun sistema por lotes simple esde 2/H? del valor teórico, con una concentración final de etanol de 7/7? envolumen. "a productividad usual de procesos por lotes simples y convencionales esde 7.R/1. g de etanol por litro del volumen del fermentador por hora.

C. DESARROLLO DEL INOCULO EN EL TIEMPO DE !ERMENTACION

raficando0

n 3&+" Tiep& ABS

*# ABS S S2 *L

1 H0 .1) .3)H1R37 .H) 3.H)2( 703 7. .))7 .2323 .)H 1.R)2233/ 710 3 .2) 7.1)27311 .)1 .1112R710 70 ) .3) 7.HR11 .7) .)2725 10 .32 7.2)22)7H .) .177HH< 303 . .)77 7.H)311R .7R .171271)7 0 R .))R 1.73H1)237 .77 .11H)H))) 03 H. .1 1.217) .71 .1)R32)1)

; R0 77 .)RR 1.3)37R .71 .1)27HH1: H03 71. .) 1.21H313 .713 .1))72R2311 770 7) .3 1.221RR1( 710 7 .2 1.211RR1



Página 3

0 2 4 6 8 10 12 14 16

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

CRECIMIENTO E BIOMASA

BIOMASA

SSRAO

TIEMPO

CONCENTRACION

!IURA / Cu+@" 'e %+e%iien$& 'e Kluyveromyces Marxianus NRRL Y !"!1 4

%&nsu& 'e sus$+"$& en e# $iep& 'e 2e+en$"%in.

En la presente grafica se puede observar la relación que e&istes entre el crecimiento

microbiano y el consumo de sustrato podemos observar que el microorganismo cuando

consume más rápido el sustrato ah# se da el crecimiento e&ponencial.



Página 3

El crecimiento e&ponencial depende parcialmente de la concentración inicial del sustrato

limitante, esto implica que el cultivo pasa de un estado en el cual crece con e&ceso de

sustrato a otro de carencia de sustrato, de manera que los periodos a velocidades menores

que la má&ima no son suficientemente largos para permitir al organismo ajustar su

estructura interna a las nuevas condiciones.

4hora se observa un decaimiento en el consumo rápido del sustrato, en las ) primeras

horas, ahora pero se observa que el microorganismo sigue creciendo, esto se debe al

e&tracto de levadura, una fuente rica en aminoácidos, vitaminas, minerales. 4simismo,

vemos que se llevara a cabo a la producción de etanol la que tambi5n sirve de medio para

esta levadura para producir otros ácidos, en otro proceso fermentativo.

<E+*CLCE+KB *E $<I-KB%4 E+ ;CBL4%4

Yx /s=−∆ X

∆ S

<EEL8"4N4+*B

Yx /s=−(1.59086022−0.34928315)(0.04657017−3.69666457)

4hora, segAn la teor#a se tiene un rendimiento de 'G&s6.Rgg. 4hora vemos que

obtenemos un rendimiento menor, los motivos por lo cual suceda esto es porque la

fructosa aqu# tiene un doble papel de generar energ#a y material de construcción

celular.

8<B*I-KCPC*4* E+ ;CBL4%4

Productividad Máxima:

':% 6 .3)7)H3



Página 3

Qx=∆ X

∆ t

<EEL8"4N4+*B

Qx=(1.59086022−0.34928315)

(4−0)

Productividad Total :

Qx=∆ X

∆ t

<EEL8"4N4+*B

Qx=(2.72526882−0.34928315)

(15−0)

Entonces, se puede decir que se tiene una mayor productividad en la zona decrecimiento e&ponencial esto es debido, a que e&iste una mayor aumento dela biomasa celular.

Ai+e"%in Es un factor muy importante, ya que contribuye considerablemente aladecuado crecimiento de los microorganismos. El o&#geno es especialmente necesariocuando se lleva a cabo una fermentación por lotes con altos niveles de azAcares querequieran un crecimiento prolongado de la levadura, o en procesos continuos, ya que la

levadura es incapaz de crecer por más de cuatro o cinco generaciones en condicionestotalmente anaeróbicas (Mosaric et al, 7HR2, 3!. 8ara ello, es necesario disponer de unsistema adecuado de agitación, de tal forma que haya un contacto permanente entre lasc5lulas y el sustrato nutritivo> asimismo, es importante desalojar el dió&ido de carbonoque se va produciendo, ya que en concentraciones relativamente peque=as inhibe elcrecimiento celular. ANALISIS DEL p3

*x6.373H)12 gl.h

Q)K :.15/;;:0 *#.



Página 3

"a variación del p@ fue debido a la producción de metabolitos producto de la

fermentación la cual estuvo en mayor concentración que los iones @T que se

libera al consumir el cloruro de amonio, lo cual implica que en vez que el p@

baje este tienda a subir y se vuelva casi un p@ neutro. "as levaduras crecen bien

en medios con el p@ ajustado entre 3. y 3.R, el grado de tolerancia a los ácidos

var#a segAn la cepa y la especie, desde p@ 1.1 a R.. (8elczar U. Lichael, 7HR1!

En los medios de cultivo, los nitritos forman a p@ inferior a acido nitroso que

es to&ico para las c5lulas. "a mayor parte de los aminoácidos pueden ser

utilizados como fuente de nitrógeno. %in embargo, segAn los aminoácidos, latasa de crecimiento de la levadura var#a. "as mezclas de aminoácidos permiten

un mejor crecimiento que un solo aminoácido. %i están disponibles

simultáneamente varias fuentes de nitrógeno estas no van hacer utilizadas a la

misma velocidad sino que la levadura va a consumir preferencialmente la

VmejorW. (-BB8E< 7HR1! define una buena fuente de nitrógeno por tres

criterios0 penetración rápida, conversión rápida en la c5lula con el m#nimo de

tapas en amoniaco o acido glutámico o en los dos y sin efecto secundario to&ico .

P"+9e$+&s %in8$i%&s 'e$e+in"'&s en #" e)pe+ien%i" +e"#i>"'" 'e #" Kluyveromyces

Marxianus NRRL Y-7571 u$i#i>"n'& 2+u%$&s" %&& 2uen$e 'e %"+&n&.

8arámetro cin5tico Palor obtenido e&perimentalmente

G-1H :/

$' GH 11

Y)s G**H :/0

") G*#H (.7<

CONCLUSIONES



Página 3

• %e logró dise=ar el medio de cultivo con los componentes necesarios para lograr el

crecimiento de Kluyveromyces Marxianus NRRL Y-7571

• El medio adecuado para la mantención de un cultivo debe poseer una fuente de

carbono, nitrógeno y sales en cantidades adecuadas para as# satisfacer los

requerimientos nutricionales del microbio.

• "a activación celular permitió poner en funcionamiento nuevamente todas las

actividades metabólicas de la Kluyveromyces Marxianus NRRL Y-7571 con el

desarrollo del inóculo se alcanzó una cantidad inicial de biomasa para iniciar la

fermentación.

• En el desarrollo de la fermentación notamos que el consumo del nutriente es más

acelerado que el crecimiento de la biomasa.

• El dise=o de los diferentes medios tanto activación como fermentación debe tener la

adecuada cantidad de fuente de +, fuente de carbono, vitaminas (e&tracto de

levadura! y otros (las demás sales usadas! para que Kluyveromyces Marxianus

NRRL Y-7571 pueda desarrollarse.

• %e determinó el contenido de azAcares reductores mediante el m5todo del *+%,

para lo cual se realizaron diluciones 703 y 701, ya que el medio liquido de activación

se encontraba con valores muy elevados de concentración.

• %e determinó que para el medio de cultivo m#nimo utilizado de la

KluyveromycesMarxianusNRRL Y-7571 los valores cin5ticos e&perimentales de

Omá& 6 ,3R33 h/7 , un td6 7.R7 hr, ':% 6 ,3)g de ;iomasag de $ructosa.

RE!ERENCIAS BIBLIORA!ICAS



Página 3

• ;iotecnolog#a. Lanual de Licrobiolog#a Cndustrial. Xolf. rueguer.

4mmeliese-uerga. Editorial 4cribia %.4. Naragoza (Espa=a!. 7HRH. Kercera

Edición. 8ag 2 F 27.

• *.Puebel , 4 -ordenons , sobre V"a influencia de la tasa de transferencia de

o&igeno (BK<! y media composición sobre la fermentación de */&ilosa por

8ichiastipitis +<<" ' F 271) . 7HH

• Moch,4."(7H2!. VKhe Qinetics of mycelial groYnW.U.en.Licrobiol.RH,1H

• "eveau, U. '. y ;oui&, L. (1!. Licrobiolog#a Cndustrial. "os Licroorganismos

de Cnter5s Cndustrial. Editorial 4cribia %. 4. Naragoza. 8ag. 1/3

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Editorial LcraY/@ill de Le&ico, %. 4. *e -. P.

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• E. LercQ> Lanual de Ledios de -ultivo, "aboratorio. LC-<B;CB"BC4 F;CB9IZLC-4.

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• ;iotecnolog#a. Lanual de Licrobiologia Cndustrial. Xolf. rueguer. 4mmeliese-uerga. Editorial

• 8rinciples of Licrobe and -ell -ultivation. %.U. 8irt. ;lacQYel l %cientific8ublications, 7H2. -itado en http0mediosdefermentacion.pdf



Página 3

ANEOS

DISEO DEL MEDIO DE ACTIVACI?N Y DE !ERMENTACI?N



Página 3

... (1)

Para fuente de carbono, =0.5

Para otra fuente, =1

onde!

… (2)

… (3)

e "#$!

… (4)

e "%$!

Si . Entonces; … (5)

Para fuente de carbono, =1

Para otra fuente, =1.5

Ahora& g!

$IE+KE E"ELE+K

B

? -E"I"4 ? +IK<CE+KE '&s % ("! % G ("

!RUCTOSA - ) .) ).H 2.)1

M*SO0.73(O % .7 77. 77. .1 .

M*SO0.73(O Lg .7 7H.R 7HR. .7 .7

GN30H(SO0 + H 17.17 1.3 .R) 7.1



Página 3

GN30H(SO0 % .7 1).1) 1)1). .7 .

3(PO0 M 7 1R.R 1R.R .H .7

3(PO0 8 .1 11.2H H7.7 .11 .3

A. INOCULACI?N AL MEDIO DE ACTIVACI?N

8ara la inoculación partimos de la cepa incubada en medio sólido de mantención

( Pichia stipitis +<<" '/271)!

• Komar una azada e inocular en un matraz con 1 ml del medio de

activación, con la ayuda del mechero.

• Kapar el matraz que contiene el medio de activación con un tapón de gasa y

algodón.

• "levar al %haQer a 11 rpm, K 6 3- y un t671 horas hasta alcanzar un

desarrollo celular suficiente, evidenciado por el incremento en la turbidez del

medio.

B. DETERMINACI?N DE ACARES REDUCTORES MJTODO DEL DNS

GFCIDO DINITROSALICÍLICOH

"a preparación del reactivo *+% se requiere de lo siguiente0• 7 gl de ácido 3, dinitrosalic#lico (*+%!

• 1 mll de +aB@ 1+

• 3 gl de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado

8ara la preparación de este reactivo, se disuelve el tartrato en apro&imadamente o

ml de agua, paralelamente se disuelve el ácido *+%. 4mbas soluciones se mezclan

en un matraz aforado de 7 litro y se agita hasta la completa disolución de todos los

componentes, para posteriormente aforar hasta un litro.%e precisa realizar los siguientes pasos para el análisis de la muestra0

• Komar 7 ml de la solución resultante y aplicar 7 ml de *+%.

• %e mantiene la mezcla en un ba=o de agua a ebullición durante minutos para luego

dejar enfriar en agua con hielo por 3 minutos.



Página 3

• %e a=aden 7 ml de agua destilada.

%e deja reposar por 7 minutos y se agita en el agitador de tubos.

• %e lee la absorbancia a ) nm, utilizando tubo + 7 como blanco.

• "a concentración se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la curva decalibrado.

N # s&#. es$9n'"+ # "*u"'es$i#"'"

!RUCTUOSA

ABS 50:n

1 :.5 : ( :.;01

( :.0 :.1 1< :.775/ :./ :.( 1( :.550 :.( :./ :. :0(:5 :.1 :.0 :.0 :1;5< :.:5 :.05 :( ::<7 : :.5 : :



Página 3

0 0.5 1 1.5 2 2.5

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.

0.8

0.9

1

f(x) = 0.48x + 0.01

R² = 1

CUR!A E CALIBRACI"N E A#UCARES REUCTORES

a,-

in%a& (a,-)

CONCENTRACION E A#$CAR

ABSORBANCIA %&' NM

ECUACI?N ENERAL

LUCOSAK ABS. :.::<<

:.07<7

C. DETERMINACI?N DE LA CONCENTRACI?N CELULAR POR D.O



Página 3

El m5todo se basa en el aumento de la turbidez del medio, al incrementarse la

concentración de microorganismos, esto puede ser detectado fácilmente por

espectrofotometr#a a ) nm. 8ara 5sta determinación es necesario que previamente se

elabore una curva de calibrado, para lo cual las concentraciones de microorganismos en

el medio son determinadas por peso seco de acuerdo al siguiente procedimiento0

• %e toma una muestra de volumen conocido, y se centrifuga a 71 rpm. *urante 1

minutos.

• %e elimina el sobrenadante y se resuspende el centrifugado con agua destilada.

• %e vuelve a centrifugar en las mismas condiciones a fin de eliminar restos de

sustrato que pudieran alterar la determinación.

• %e elimina el sobrenadante, se redisuelve el precipitado y se seca en la estufa a R

- hasta peso constante.

CURVA DE CALIBRACION DE BIOMASA

NC"p"%&

#.%"#'&.&

#."*u

"

ABSG<0:nH

G*H P1Pes&

%"p"%&

G*H P(Pes&

%"p"%&W%8#u#"

G*H P1Pes&se%&

%8#u#"

G*LH

1 1. 1. .R3R .7R7 .7RRR .23 7.)

( 1 3 .23 .7HHR .1H .7 7.11

/ 7 ) .))) .1)2R .1 .1R .

0 . ). .132 .11HR .137 .7R .3

5 .3 ).2 .7)R .1113 .1133 .7 .1

< .7 ).R .R .1H .171 . .71



Página 3

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.60

0.2

0.4

0.6

0.8

1

f(x) = 0.56x + 0.05

R² = 0.98

/&a % ai,&ain % Bi$a-a

ABS

in%a& (ABS)

$n%n&ain % ,i$a-a g#

ABS 640 !M

ECUACI?N ENERAL

BIOMASAK ABS. :.:5:1:.55D. CRECIMIENTO CELULAR

• El medio rico se prepara y se esterilizara por separado

• 8ara nuestro inoculado al medio rico, se hará con cepas ya sembradas en el medio

de activación, se realizara una azada en el matraces de 7 ".

• El matraz preparado se llevara al shaQer a 1) rpm, temperatura de 3 - haciendo

un seguimiento por cada hora.

• %e toma datos por cada hora y se ira colocando en una tabla de datos.

E. ESTERILIACI?N DE PIPETAS

• "as pipetas, serán lavados y secados en la estufa

• "uego en cada pipeta se colocara un filtro de algodón para no contaminarlo al

momento de ser utilizada.



• "as pipetas serán forradas con papel aluminio y puestas a la estufa por un tiempo

1 minutos a temperatura de 7)/7 -.

!. TJCNICA DE ASEPSIA

%e usara en los d#as en que hay sembrado e inoculación de c5lulas.

• 8ara realizar la inoculación es necesario y muy importante tener el lugar bien

desinfectado, por lo que se limpiara con pa=os de algodón toda la zona de

trabajo hasta 3 veces, as# como tambi5n el total acomodo de las herramientas de

trabajo (tubos de ensayo y gradilla! a utilizar, etc.

• "os tubos de ensayo y los matraces que serán utilizados en el medio rico

primero serán lavados, secados y esterilizados en la estufa por un tiempo 1

minutos a temperatura de 7)/7 -.

desarrollo del inoculo y cultivo celular por lotes de kluyveromyces marxianus nrrl y

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