PRODUCCIÓN DE UN INOCULO ACELERADOR DE COMPOST A PARTIR DE

BACTERIAS TERMOFILAS

ADRIANA PAEZ MORALES

DIEGO CASTRO GUERRERO

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

SANTAFÉ DE BOGOTA, D.C.

2000.

PRODUCCION DE UN INOCULO ACELERADOR DE COMPOST A PARTIR DE

BACTERIAS TERMOFILAS

ADRIANA PAEZ MORALES

DIEGO CASTRO GUERRERO

Directora Codirectora

Dr. Aura Marina Pedroza Dr. María Mercedes Martínez

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

Facultad de Ciencias

Departamento de Microbiologia

Carrera de Microbiología Industrial

Santafé de Bogotá ,D.C. Agosto, 2000

AGRADECIMIENTOS

A la Doctora Aura Marina Pedroza, directora del presente trabajo, por sus

valiosos conocimientos, dedicación, paciencia, confianza y amistad.

A la Doctora María Mercedes Martínez, por toda la asesoría prestada, y por su

gran colaboración.

Al Doctor Raúl Potou, Director del Laboratorio de Biotecnología Aplicada, por

permitirnos el desarrollo de este trabajo y por su apoyo.

A la Doctora Ana Karina Carrascal, por la colaboración prestada.

NOTA DE ADVERTENCIA

Los criterios expuestos, las opiniones expresadas y las conclusiones

anotadas, son responsabilidad de los autores y no comprometen a la

Pontificia Universidad Javeriana.

Art. 23 de la resolución Número 13 de 1946.

TABLA DE CONTENIDO

1 INTRODUCCION 2 MARCO TEORICO 2.1 Desechos vegetales 2.2 Compostaje 2.2.1 Requerimientos del compost 2.2.1.1 Relación carbóno nitrógeno 2.2.1.2 Oxígeno 2.2.1.3 Humedad 2.2.1.4 Temperatura 2.2.1.5 Tamaño de la partícula 2.2.2 Beneficios del compost 2.3 ENZIMAS MICROBIANAS 2.3.1 Enzimas celulolíticas 2.3.2 Enzimas proteolíticas 2.3.3 Enzimas amilolíticas 2.3.4 Enzimas termoestables 2.4 BACTERIAS TERMÓFILAS 2.4.1 Clasificación 2.4.2 Hábitat 2.4.3 Adaptaciones bioquímicas a la temperatura 2.4.4 Género Thermus sp. 2.4.5 Género Bacillus sp, 3 JUSTIFICACION 4 OBJETIVO GENERAL 4.1 OBJETIVOS ESPECIFICOS 5 MATERIALES Y METODOS 5.1 Recolección de las muestras 5.1.1 Sitio de muestreo 5.1.2 Toma de muestra 5.2 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS 5.2.1 Enriquecimiento 5.2.2 Aislamiento primario 5.2.3 Aislamiento secundario 5.2.4 Conservación de las cepas BCP 5.2.5 Identificación bioquímica de losmicroorganismos aislados 5.2.6 Actividad Enzímatica semicuantitativa 5.2.6.1 Actividad amilolítica 5.2.6.2 Actividad proteolítica 5.2.7 Pruebas cuantitativas preliminares de actividad celulolítica 5.2.71 Fermentación discontinua en caldo celulosa 5.2.7.2 Actividad celulolítica 5.2.8 Pruebas de antagonismo 5.2.9 Perfil cinético de las cepas con mayor actividad celulolitica 5.2.9.1 Preparación del inóculo 5.2.9.2 Fermentación discontinua

5.2.9.3 Parámetros cinéticos 5.3 PRUEBAS DE ESTABILIDAD 5.3.1 Estabilidad térmica 5.3.2 Estabilidad a pH 5.4 PRUEBA PRELIMINAR EN CAMPO 5.4.1 Producción del inóculo 5.4.2 Aplicación del inóculo 5.4.3 Evaluación de la efectividad del inóculo 5.4.3.1 Temperatura 5.4.3.2 pH 5.4.3.3 Recuento de bacterias amilolíticas, proteolíticas y celulolíticas 5.4.4 Determinación y análisis de los mejores tratamientos 5.5 PRUEBA FINAL IN VITRO 5.6 PRUEBA FINAL EN CAMPO 5.6.1 Producción del inóculo 5.6.1.2 Determinación de azúcares reductores 5.6.2 Evaluación estadística del mejor tratamiento 5.6.3 Evaluación de NPK del compost final 6 RESULTADOS Y DISCUSION 6.1 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS 6.1.1 Enriquecimiento 6.1.2 Aislamiento primario 6.1.3 Aislamiento secundario 6.1.4 Identificaión bioquímica 6.1.5 Actividad amilolítica semicuantitativa 6.1.6 Actividad proteolítica semicuantitativa 6.1.7 Pruebas cuantitativas preliminares de actividad celulolítica 6.1.7.1 Actividad celulolítica semicuantitativa 6.1.7.2 Actividad celulolítica cuantitativa 6.1.8 Pruebas de antagonismo 6.1.9 Perfil cinético de las cepas con mayor actividad celulolítica 6.1.9.1 Formación de biomasa 6.1.9.2 Perfil cinético de las cepas con aireación 6.1.9.3 Perfil cinético de las cepas sin aireación 6.1.9.4 Actividad celulolítica en función del tiempo para cepas con aire. 6.1.9.5 Actividad celulolítica en función del tiempo para cepas sin airea. 6.1.9.6 Pruebas de estabilidad 6.1.9.6.1 Prueba de estabilidad térmica 6.1.9.6.2 Prueba de estabilidad a diferentes pH 6.2 RESULTADOS DE LA PRUEBA PRELIMINAR EN CAMPO 6.2.1 Evaluación de la temperatura 6.2.2 Evaluación de pH 6.2.3 Recuentos de micro. amilolíticos, proteolíticos y celulolíticos 6.2.4 Análisis de los resultados preliminares 6.3 PRUEBA FINAL IN VITRO 6.4 PRUEBA FINAL EN CAMPO 6.4.1 Evaluación de temperatura 6.4.2 Evaluación de pH 6.4.3 Recuento en placa de micro. Amilolíticos, proteolíticos y celulolíti.

6.4.4 Cuantificación de actividad celulolítica 6.5 ANALISIS ESTADISTICO DE LA PRUEBA FINAL EN CAMPO 6.6 RESULTADOS DE NPK 7 CONCLUSIONES 8 RECOMENDACIONES 9 BIBLIOGRAFIA 10 ANEXOS

LISTA DE ANEXOS

Número de TITULO Anexo 1 Medios de cultivo y reactivos 2 Determinación de azúcares reductores mediante el

método de ácido dinitrosalicílico 3 Prueba de DNS para cuantificar unidades

celulolíticas/minuto. 4 Curva de peso seco. 5 Tablas 6 Fotografías

LISTA DE TABLAS

Número Tabla TITULO Pag. 1 Desechos vegetales para varios tipos de flor 5 2 Composición de los sustratos celulósicos 22 3 Características de especies representativas del género Bacillus 31 4 Identificación microscópica y bioquímica 54 5 Diámetros de hidrólisis en agar leche 1% y agar

Almidón 1%. 55

6 Actividad celulolítica de los microorganismos aislados 57 7 Resultados de las pruebas de efecto antagónico 58 8 Velocidad específica de crecimiento de las cinco cepas aireadas 60 9 Velocidad específica de crecimiento de las cinco cepas aireadas 63 10 Resultados pruebas de estabilidad a diferentes

Temperaturas 67

11 Resultados de estabilidad a diferentes pH 69 12 Resultados análisis de covarianza 83 13 Determinación de NPK para cultivo total 10% 84 14 NPK de compost para otros residuos 85

LISTA DE FIGURAS

Número de Figura TITULO Pag. 1 Distribución de desechos sólidos 3 1´ Forma de las pilas de compost 11 2 Mecanismo de degradación de la celulosa 21 3 Sitio de muestreo 35 4 Inoculación de las pilas de compost 46 5 Toma de la temperatura 47 6 Coloración de Gram cepa 4´B 53 7 Cinética de crecimiento aireada Vs tiempo 61 8 Cinética de crecimiento no aireada Vs tiempo 62 9 Actividad celulolítica VS tiempo aireada 64 10 Actividad celulolítica VS tiempo no aireadas 65 11 Estabilidad térmica UC/min 66 12 Estabilidad a pH 68 13 Seguimiento de la temperatura 71 14 Seguimiento de pH 72 15 UFC/g agar celulosa 1% VS tiempo 73 16 UFC/g agar almidón 1% VS tiempo 74 17 UFC/g agar leche 1% VS tiempo 75 18 Evaluación UC/min. VS tiempo. Prueba in vitro 76

19 Seguimiento de la temperatura semanal de los mejores tratamientos 77 20 Seguimiento del pH semanal mejores tratamientos 78 21 Recuento UFC/g agar celulosa 1% VS tiempo 79 22 Recuento UFC/g agar almidón 1% VS tiempo 80 23 Recuento UFC/g agar leche 1% VS tiempo 80 24 UC/min VS semanas prueba final en campo 81

1. INTRODUCCIÓN

Entre todos los productos que forman parte del grupo de abonos orgánicos

empleados en la agricultura, se incluye el "compost", un producto que se obtiene a

partir de los restos de materia orgánica y demás componentes biodegradables que

se eliminan con los residuos sólidos orgánicos urbanos y subproductos de

algunos procesos agroindustriales. (Novo, R., 1994).

La ventaja principal que debe apreciarse en todo compost, además del aporte de

materia orgánica y humus a suelos, es la recuperación de estructura y

mejoramiento biológico del suelo y su contribución al mantenimiento y

recuperación del creciente deterioro ecológico y del medio ambiente.

En este proceso de fermentación aeróbico, la descomposición de la materia

orgánica es más rápida y dependiente de la cantidad de oxígeno presente. En este

tipo de fermentación se produce una elevación de la temperatura hasta 70-72ºC,

rango de crecimiento de bacterias termófilas que producen enzimas termoestables

capaces de catalizar reacciones bioquímicas con mayor eficiencia a altas

temperaturas. Por lo tanto la producción de un inoculo acelerador de compost a

partir de bacterias termófilas permite reducir el tiempo de degradación de la

materia orgánica con mayor efectividad y disminuir los volúmenes de residuos

orgánicos, que para este caso provienen de la actividad floricultora. (Brock, T.,

1.993).

La legislación Colombiana en el decreto 2104 de 1.984 del Ministerio de Salud, en

su articulo 11, indica que el tratamiento de las basuras fuera del perímetro urbano

de los municipios, debe estar a cargo de sus productores (Ministerio de Salud,

1.984). Para los cultivos de flores, el grueso de los desechos, es de tipo vegetal,

lo que promueve el uso de técnicas como la del compostaje para su manejo y

cumplimiento de la norma.

2. MARCO TEORICO

2.1 DESECHOS VEGETALES

Entre los residuos sólidos que se generan de la actividad floricultora, los desechos

orgánicos son la mayor parte, con una participación cercana al 90%. Se estima

que se trata de volúmenes cercanos a los 700 Kg/Ha/ semana, lo que equivale a

unas 3.150 toneladas semanales para el total de floricultura Colombiana de

exportación. (Asocolflores., 1.996). (Figura1).

Figura 1. Distribución de deschos sólidos (Asocolflores, 1.996)

El área sembrada se localiza principalmente en la Sabana de Bogotá, donde se

desarrolla cerca del 92% de la producción; y el 8% restante corresponde a otros

departamentos. Se cultivan más de 50 tipos diferentes de flor, entre los cuales se

destaca el clavel, el pompón, la rosa, el clavel miniatura, y el crisantemo. Otros

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Vegetales Plástico Cartón Otros

tipos fruto de la política de diversificación del sector incluyen gypsophilia, lirios y

gérberas. (Asocolflores., 1.996).

El residuo vegetal puede generar efectos negativos sobre el medio ambiente

cuando se maneja inadecuadamente. Estos efectos incluyen la contaminación de

aguas superficiales y subterráneas a partir de residuos de plaguicidas que puedan

estar presentes en los desechos y por los lixiviados producidos durante la

degradación de la materia orgánica. Otro efecto negativo es que este material rico

en nutrientes al contacto con sistemas acuáticos, aumenta la población vegetal

fomentando el fenómeno de eutroficación. (Espinosa, J., 1.994).

Un tercer efecto es la contaminación de aire por emisiones de las quemas, la cual

tiene repercuciones en la salud de las personas vecinas y potencia el efecto

invernadero. Para este caso, el decreto 2107 de 1.995 sobre calidad de aire, limita

las quemas abiertas en áreas rurales (Art 30). (Ministerio del Medio Ambiente.,

1.995). Por último el efécto más directo en relación con el ser humano es que

algunos desechos vegetales pueden ser destinados a la alimentación animal lo

cual es un peligro potencial ya que los productos agroquímicos se bioacumularán

en el tejido graso del animal por lipoafinidad. (Miller, T., 1.994).

El marco legal en Colombia para manejo de desechos sólidos lo establece el

decreto 2104 de 1.984 del Ministerio de Salud, el cual en su artículo 11, indica

que el manejo de las basuras fuera del perímetro urbano de los municipios estará

a cargo de sus productores (Ministerio de Salud., 1.984). La mayoría de las

empresas floriculturas se encuentran en las zonas aleñadas a la Sabana de

Bogotá, lo que indica zonas rurales que deben cumplir con la norma

Para el caso de la gypsophila; los desechos vegetales generados por su

renovación son menores que las de otras flores como las del clavel, solo que su

periodicidad es mucho más corta (22 semanas) lo que indica un constante flujo de

desechos que deben ser evacuados y manejados apropiadamente. (Tabla 1)

Tabla1. Desechos vegetales para varios tipos de flor

Tipo de flor TONS/Ha Periodicidad Ton/Ha/año

Clavel 25 Cada 2 años 12.5

Pompón 9 Cada 14 semanas 33

Rosa 30 Cada 8-10 años 3-3.8

Gypsophila 5 Cada 22semanas 11.8

Fuente: Asolcolflores, 1.996.

2.2 COMPOST

Compost es el producto final resultado de la descomposición de la materia

orgánica, en la forma de residuos de cosecha, estiercoles de animales, o residuos

de cocina. (Miller, T., 1.994).

El composta je es un proceso natural en el que los agentes activos son los

microorganismos , es decir bacterias, hongos y algunos protozoos. La buena

descomposición de la materia organica dependerá de la actividad microbiana al

igual que las condiciones óptimas ambientales (Mayeas, S., et al, 1.991).

Cuando se habla de compost se hace alusión a la mezcla de materias vegetales y

animales que sufren un proceso de descomposición gracias a microorganismos

que allí habitan y ayudan a transformar estos materiales. Se hace compost

simulando los procesos de descomposición que se efectúan en la naturaleza, que

acompañan la formación y mantenimiento del suelo. Deben determinarse sus

condiciones particulares, materiales utilizados y proporciones, para aportarlo como

un proceso vivo donde se controlan las variables para la existencia y reproducción

de los microorganismos presentes, enriqueciéndo el suelo a partir del aporte de

nutrientes y un conjunto biótico incomparable. (Novo, R., et al, 1.988).

El compost debe su calidad más que por sus nutrientes, a su biomasa activa la

cual comprende bacterias, hongos, raíces de plantas y fauna edáfica, la cual

constituye una reserva de nutrientes para el desarrollo vegetal. De este modo al

agregar compost al suelo, se estan reincorporando los nutrientes que las plantas

extrajeron y se está activando biológicamente el suelo, mejorando las propiedades

físicas como su textura, olor, pH y color (Novo, R., 1.996).

La utilización del compost como acondicionador orgánico recupera aquellos suelos

utilizados constantemente para la agricultura logrando de esta manera un aumento

en la productividad a largo plazo. Los componentes son degradados y

mineralizados lo que facilita que las plantas los utilizen más facilmente.

Los fertilizantes orgánicos, al igual que los inorgánicos comerciales, pueden

aplicarse al suelo para restablecer y mantener de manera parcial los nutrientes

vegetales perdidos por erosión, lavado y cosecha así como para aumentar la

productividad de los cultivos. Los fertilizantes inorgánicos comerciales no agregan

humus al suelo; disminuyen el contenido de materia orgánica y con ello su

capacidad de retención de agua. Si no se complementan con fertilizantes

orgánicos, los inorgánicos pueden hacer que el suelo se compacte y sea menos

adecuado para el desarrollo del cultivo. Al disminuir su porosidad, los fertilizantes

inorgánicos también reducen el contenido de oxígeno del suelo, e impiden que el

fertilizante aplicado sea captado de manera eficiente. Además, la mayor parte de

los fertilizantes comerciales no contienen muchos de los micronutrientes que las

plantas necesitan. (Miller, T., 1.994).

De otra parte, los fertilizantes químicos que generalmente contienen sales de

amonio, amoniaco anhidro o urea se nitrifican con rapidez, mientras que el

nitrógeno orgánico de desechos carbonados se convierte en nitrito más

lentamente. (Martin, A.,1.980).

La contaminación del agua es otro problema debido al uso generalizado de

fertilizantes inórgánicos comerciales, en especial en terrenos con pendiente

próximos a corrientes y lagos. (Miller. T., 1.994).

2.2.1 Requerimientos del compost

Los requerimientos básicos para el proceso de compostaje incluyen la relación

carbono:nitrógeno, aireación, volteo, tamaño y tipo de material, temperatura y pH.

2.2.1.1 Relación carbono:nitrógeno

Debido a que el carbono y el nitrógeno son requeridos en grandes cantidades,

serán los elementos que garanticen la velocidad de desarrollo de los

microorganismos degradadores al igual que la velocidad de degradación y

obtención del compost. Un factor importante a considerar es la escasez de

nutrientes que limita la degradación de la pila de compostaje aun más que las

condiciones climáticas. (Fundases., 1.994).

Es importante iniciar con una proporción adecuada de estos dos elementos para el

desarrollo de los microorganismos descomponedores. Se debe contar con una

proporción entre 30/1 es decir treinta veces el contenido de carbono con relación a

nitrogeno. La razón de la diferencia radica en que el carbono se utiliza para la

formación de nuevos materiales celulares formando carbono protoplásmico, lo cual

constituye el proceso de asimilación, de igual forma bajo condiciones aerobicas

se libera en forma de CO2. (Martin, A., 1.980).

Si la cantidad de nitrógeno es muy alta, las bacterias agotarán el carbono y

dejarán el nitrógeno no utilizado en la forma de amonio, el cual es fitotóxico si se

incorpora al suelo. (Martin, A., 1.980).

2.2.1.2 Oxígeno

Siendo el compostaje un proceso aeróbico, es importante que la pila reciba

suficiente oxigenación, además de una distribución uniforme de humedad

nutrientes y microorganismos.

Para la descomposición de la materia orgánica en el suelo es muy importante el

suministro de oxígeno. Una buena oxigenación proporciona mayor nivel de

descomposición, que si la degradación ocurriera en ambientes anaeróbicos.

También serán diferentes los productos finales, ya que en condiciones aeróbias el

producto final del metabolismo microbiano en el suelo, será predominantemente

CO2, en tanto que en ambientes escasos de oxígeno, abundarán los ácidos

orgánicos como propiónico, acético, butírico como resultado de la descomposición

microbiana.

La presión parcial de un microambiente determinado del suelo, desempeñará un

importante papel en la selección de los microorganismos que cumplirán la función

descomponedora. Los ambientes de buena oxigenación serán favorables a una

carga aeróbica activa incluyendo bacterias, hongos y actinomicetos, en tanto que

en condiciones reducidas de oxígeno conllevan a la proliferación de

microorganismos anaerobios. (Novo, R., 1.988).

Así mismo si el suelo está bien oxigenado, la celulosa será más rápidamente

destruida que en condiciones ambientales escasas de oxígeno. (Novo, R., 1.998)

La aireación esta directamente relacionada con la forma de la pila de compost la

cual permite un flujo de oxígeno al interior de la masa. Otro factor importante en

la forma de la pila es la conservación de la temperatura ya que en zonas con

mucha pluviosidad se busca en forma de piramide dejando que el agua drene

rápidamente y no se acumule, impidiendo así un decenso en la temperatura.

(Figura 1´)

Figura 1´. Forma de las pilas de compost

Por el contrario en zonas de baja pluviosidad se usan pilas con su parte superior

plana a fin de aprovechar el agua, para mojar la materia orgánica. (Gouin, H.,

1.994).

La forma más utilizada son las pilas largas y angostas y de volteo manual para

conseguir aireación para la pila. A si mismo dicho volteo facilita el contacto entre

microorganismos, sustrato y oxígeno logrando reactivar el metabolismo.

2.2.1.3. Humedad

Es necesario controlar la humedad ya que un exceso de agua puede ocasionar

condiciones anaeróbicas al dezplazar el aire, produciendo CH4 y CO2 al igual que

subproductos como ácidos orgánicos. Así mismo habrá una baja en la temperatura

debido a la baja actividad microbiana. (Martin, A.,1.980).

El suministro de humedad en condiciones que permitan un buen funcionamiento

celular es importante para el desarrollo del proceso de hidrólisis. En condiciones

de desecación, a pesar de tener buena aireación los microorganismos no

metabolizan bien el sustrato, debido a que la carencia de agua dificulta la difución

de las enzimas hacia el sustrato y de los nutrientes hacia el interior de la célula,

además de alterar el equilibrio osmótico dentro de la misma (Novo. R., 1.988).

Para el cálculo de la humedad apropiada se utiliza el método de exprimir un

puñado de material y que este no presente goteo. (Ramírez, J., 1.996). Esta

humedad corresponde al 45 y 60% conocida como capacidad de campo, la cual

puede ser corregida adicionando agua.

2.2.1.4 Temperatura

El rango de temperatura ideal para los microorganismos del compostaje esta entre

los 43° y 71° C, ya que el acenso de la temperatura durante el proceso produce

reacciones exotérmicas que indican el metabolismo respiratorio de los

microorganismos; sin embargo la baja de temperatura constituye también una

limitante metabolica. Respecto al comportamiento de la temperatura se presentan

cuatro fases: mesofílica, termofílica, de enfriamiento y maduración.

♦ Fase Mesofílica

Comprende temperaturas menores de 40°C . Se inicia la fase de degradación de

la materia orgánica por una flora relativamente diversa que es la correspondiente

a la que habita la superficies de los tejidos vegetales apilados, la propia de los

estiercoles, y la que viene en el agua y en el aire. Los microorganismos

enzimáticamente compatibles con el sustrato seran capaces de consumir las

materias disponibles y ganar espacio en ese habitad. La carga microbiológica de

esta etapa esta representada por Bacillus sp., Enterobacter sp., Flavobacterium

balustinum, Pseudomonas spp., Streptomyces sp. , Trichoderma sp. y Gliocladium

spp. y otros (Hoitink, I., 1.991).

Fase termofílica

La respiración aeróbica eleva la temperatura por encima del rango mesófilo,

selecionandose el desarrollo de los microorganismos termófilos moderados (40°-

60°C) y causando una disminución de la diversidad microbiana. Las bacterias

dominantes son esporógenas y pertenecen al género Bacillus sp, también se

pueden recuperar bacterias termófilas del género Thermus.

En este fase (40 ° y 50°C) se consumen los azúcares disponibles y todos los

materiales facilmente biodegradables; imediatamente después se consiguen

temperaturas entre 40° - 65°C durante las cuales se degradan sustancias más

complejas como la celulosa y algo de la lignina, ya que a altas temperaturas estos

polímeros son mas fácilmente degradables y la actividad de las enzimas

termofílicas alcanzan su actividad óptima. A estas temperaturas se pueden

destruir los patógenos al igual que se consigue la disminución de poblaciones de

microorganismos moderadamente termofilos responsables de la actividad

degradadora entre los 40° -60°C.

Fogarty y Tuovinen (1.991) sostienen que la fase termofílica se debe de sostener

por más tiempo a 40°C y menos, pues se consigue mejor actividad microbiana,

mayor cantidad de biomasa y mayor biodiversidad de especies.

En esta fase se pueden encontrar especies como el hongo Rhizomucor pucillus y

bacterias extremas como Bacillus stearothermophilus, Thermus sp., Bacillus

caldoteenax, y Bacillus sp.

♦ Fase de Enfriamiento

Al terminarse la reserva de carbono orgánico, este se convierte en un factor

limitante que frena la actividad microbiana y por lo tanto la liberación de calor. De

nuevo la población de mesófilos recupera la predominancia provenientes de las

partes expuestas y con menor temperatura .

♦ Fase de maduración

Durante esta fase y finalizando la anterior, se comienzan a concentrar sustancias

húmicas y el pH se encuentra entre 5.5 y 8.0. Las bacterias prefieren un pH

cercano al neutro. Inicialmente el pH disminuye 5.0-6.0 como resultado de la

liberación de ácidos orgánicos en la fermentación y adicionalmente de la presencia

de bacterias acidogénicas. Posteriormente el pH se eleva 7.0 - 8.0 y finalmente se

neutraliza por el poder amortiguador de las sustancias húmicas.

( Ramirez, J., 1.996).

2.2.1.5 Tamaño de la partícula

El tamaño de la partícula utilizada en la preparación de la pila de compost influye

sobre la velocidad del proceso. Para el caso de residuos vegetales por su forma

irregular es necesario reducir su tamaño, triturando o picando los materiales a 5-

10 cm, antes de la elaboración de las pilas.

2.2.2 Beneficios del compost

La fertilización limitada al uso de abonos no recupera la

estructura, ni favorece la proliferación de microorganismos benéficos en el suelo

(Peixoto, C., 1.988). La incorporación de compost a un suelo durante períodos

largos de tiempo aumenta los niveles de carbono orgánico y la población de

microorganismos, ya sea en suelos fertilizados con sustancias orgánicas o en

suelos con larga trayectoria de fertilización química (Goyal. F., 1.993).

Experimentos realizados en cultivos de lechuga a campo abierto, se consiguió el

control del hongo Pythium ultimum solarizando suelo solo o con incorporación de

compost de gallinaza. De igual modo se observó un control efectivo contra el

nemátodo Meloidogyne incognita. Sin embargo el control del nemátodo fue mejor

cuando se solarizó suelo enmendado con compost que el solarizado sin enmienda

de compost. La explicación radica en que la temperatura que se alcanza es mayor

cuando el suelo tiene compost y se solariza. El suelo con enmienda de compost al

ser solarizado aumenta la temperatura debido probablemente a la mayor retención

de humedad, mejorando la conductividad térmica. (Asocolflores. 1.994).

Otros beneficios de la producción de compost son:

♦ Reducción de material de desecho orgánico y una alternativa de su manejo.

♦ Provee un acondicionador de suelos de fácil producción y manejo.

♦ Aumento en la capacidad de retención de agua y por lo mismo menores

requerimientos de riegos.

♦ Provee sustrato de poblaciones microbianas diversas que presentan

actividades antagónistas contra enfermedades del suelo.

♦ Se reducen los olores desagradables durante el proceso (Fundases., 1.994)

2.3 ENZIMAS MICROBIANAS

La enzimas son catalizadores de la naturaleza que exhiben una gran especificidad

y un enorme poder catalítico. Las enzimas se han utilizado durante siglos en

especial para la producción de alimentos. Más recientemente ha surgido un gran

interés en el uso de enzimas (purificados o en células muertas o parcialmente

vivas) en el tratamiento de alimentos, producción de sustancias químicas,

sistemas análiticos y de diagnóstico y en el tratamiento de enfermedades.

(Gacesa, P.,1.990)

La principal ventaja de las enzimas microbianas es su producción a gran escala,

pues la cantidad de producto que se puede obtener en una superficie pequeña en

poco tiempo, supera a la que se puede conseguir de enzimas animales o

vegetales. (Trevan, M., 1.991).

Una ventaja técnica de la utilización de enzimas bacterianas es la enorme

variedad de vias metabólicas ( y por tanto de enzimas) que existe incluso entre

organismos de una misma especie. La segunda ventaja de los microorganismos

es que crecen en un amplio rango de condiciones ambientales; lo que hace más

probable encontrar enzimas estables en condiciones extremas en

microorganismos adaptados para crecer en ambientes hostiles. Un ejemplo son

los microorganismos termófilos, que a menudo poseen enzimas que son, por si

solas, estables a elevadas temperaturas.

En términos estructurales las diferencias entre las enzimas extraídas de

organismos mesófilos y termófilos son normalmente muy pequeñas. Sin embargo

proporcionan a la enzima termofílica considerables ventajas aparte de la de

poderse usar a altas temperaturas. Por ejemplo el rendimiento de enzima es a

menudo mayor a partir de organismos termófilos por ser la enzima más resistente

a las condiciones de extracción y purificación o porque soporta mejor el uso de

disolventes orgánicos o por detergentes. La duración de la vida de la enzima suele

ser también más larga.(Crueger. W., 1989).

En general, es deseable trabajar a altas temperaturas, porque los procesos son

así menos vulnerables frente a la contaminación microbiana y porque las

velocidades de reacción se doblan por cada 10°C que se aumenta la temperatura,

acelerandose así el proceso. La estabilidad térmica de la enzima que interese, es

un atributo útil para la propia obtención de la enzima, ya que ello permite la

destrucción por calentamiento de otras actividades enzimáticas contaminantes.

(Trevan. M., 1991).

2.3.1 Enzimas Celulolíticas

Las bacterias aerobias generalmente convierten la celulosa en dos productos

principales: CO2 y sustancia celular. La hidrólisis inicial de la celulosa se realiza

por medio de un sistema enzimático que comprende varias enzimas llamadas

celulasas las cuales catalizan la conversión de la celulosa insoluble a

monosacáridos o disacáridos solubles en agua. Siendo la molécula de la celulosa

impermeable el microorganismo excreta enzimas extracelulares que actúan

hidrolíticamente, convirtiendo el material insoluble en azúcares solubles que

penetran la membrana, luego los azúcares simples son oxidados. (Alexander,M et,

al,1.980).

El sistema enzimático celulolítico cataliza la hidrólisis de cualquier compuesto en

los que las unidades de glucosa están unidas entre el carbono número 1 de una

unidad de azúcar y el carbono 4 del azúcar adyacente, siendo esto una unión tipo

β. (Martin, A.,1.980).

El sistema catalítico que requiere un microorganismo para convertir la celulosa a

azúcares simples que penetren la célula incluye tres tipos de enzimas:

a. Endo ß-(1-4) glucanasa: también denominada celobiohidrolasa, avicelasa, o C1

celulasa. La cual comprende el 80% del complejo de celulasas durante la

fermentación.

b. Endo ß-(1-4) glucanasa: también denominada endo celulasa, carboximetil

celulasa.

c. ß-1-4 glucosidasa o celobiasa.

La estructura cristalina de la celulosa es debilitada por lo que se denomina

fragmento C1 de la celulasa; los productos de esta acción son posteriormente

acortados en cuanto a la longitud de la cadena por los componentes Cx del

complejo de la celulasa, para dar como resultado el disacáridocelobiosa y

celobiosa del que se libera la glucosa por la acción de la ß-1-4 glucosidasa. La

enzima relacionada con el primer paso de la degradación de la celulosa actúa

hidrolizando los enlaces covalentes de los puentes glicosídicos, a fin de exponer a

las exo y endo glucanasas del complejo Cx los grupos reductores y no reductores

de las moléculas desacopladas de celulosa. Las otras enzimas, incapaces por si

mismas de desorganizar la celulosa cristalina actúan sobre los oligómeros y

acortan las cadenas de ß-1-4 glucano a partir de las moléculas dispersas de

celulosa, mejorando el acceso de la enzima C1 a los polisacáridos intactos en los

cristales desorganizados. ( Grant, W., 1.989)(Figura 2).

Para el rompimiento del polímero se requiere de la acción conjunta de las tres

enzimas.

El complejo celulolítico es inducible en la mayoría de los microorganismos y se

sintetiza en presencia de celulosa o carbohidratos estructuralmente similares.

1

C1 R Oligomeros

NR 2 Celobiosa

3

Celulosa cristalina Complejo Cx

R: Extremo reductor, NR: Extremo no reductor 1:β1-4 glucano glucanohidrolasa

2 :β1-4 glucano celobiohidrolasa

3. :β1-4 glucano glucohidrolasa

Figura. 2 Mecanismo de degradación de la celulosa (Grant, W., 1.989)

CH2

OH

HO OH

GLUCOSA

Los organismos pueden regular la cantidad del sistema enzimático que producen

ya que, a una alta producción, los catalizadores liberarían muchos azúcares que

estimularían heterótrofos cercanos, compitiendo con la población celulolítica. En

este caso se dará una represión catabólica en el que los productos de la reacción

inhiben la síntesis de más enzimas. (Alexander,M et, al,1.980).

Algunos productores de celulasas son Trichoderma reesei, Clostridium

celulolíticum, y termófilos como Rhodothermus marinus, Thermotoga neapolitana,

Anaerocellum thermophilum, Bacillus stearothermophilus, Thermus sp. (Bertoldo,

C., et al, 1.999)

TABLA 2. Composición de los substratos celulósicos

CELULOSA

%

HEMICELULOS

A%

LIGNINA

%

MADERA 45-50 25-35 25-35

HIERBAS 25-40 25-50 10-30

HOJAS 15-20 80-85

PERIODICO

S

40-55 25-40 18-30

Fuente: (Crueger, W., 1.989)

2.3.2 Enzimas proteolíticas

La molécula de la proteína esta compuesta por una larga cadena de aminoácidos,

en la que se encuentran cerca de veinte aminoácidos diferentes unidos por

enlaces peptídicos. Las enzimas que hidrolizan los enlaces peptídicos de las

proteínas y péptidos se conocen como proteasas, las cuales se clasifican en

exopeptidasas, que hidrolizan los enlaces peptídicos cercanos al extremo de la

cadena de aminoácidos y endopeptinasas. (Gacesa. P., 1.990)

Para la asimilación, el microorganismo debe excretar una proteasa extracelular y

los aminoácidos liberados servirán como suministro de carbono y nitrógeno para

organismos heterótrofos.

Las proteasas termoestables son utilizadas como aditivos para detergentes, ya

que resisten denaturación en condiciones alcalinas, también son usadas como

catalizadores para la síntesis de péptidos. (Bertoldo, C., et al, 1.999).

2.3.3 Enzimas Amilolíticas

El almidón después de la celulosa, es el polímero de hexosas más común en el

reino vegetal. Las amilasas son las enzimas que hidrolizan el almidón, usualmente

extracelulares. Tres amilasas estan relacionadas con la ruptura del almidón: ∝-

amilasa, β- amilasa y glucoamilasas. La β- amilasa actúa tanto en la amilosa

como en la amilopectina rompiendo cada segundo enlace glucosa-glucosa; esta

exoenzima no es capaz de romper los puntos de ramificación de la amilopectina.

Por último, la ∝-amilasa, una endoenzima, hidroliza el polisacarido en uniones 1-

4 al azar a lo largo de las moléculas de amilosa y amilopectina.(Crueger, W.,

1.989).

2.3.4 Enzimas termoestables

La clasificación de las enzimas de microorganismos termófilos se refiere a la

estabilidad relativa de las proteínas cuando se compara con la temperatura de

crecimiento de los microorganismos. De este modo la enzima termoestable es

aquella que tiene una temperatura máxima de reacción por encima de la

temperatura óptima de los microorganismos. (Fogarty, S., 1.998).

Las características que le confieren estabilidad a la enzima son los puentes de

hidrógeno, interaciones hidrofóbicas, interacciones iónicas, unión a metales y

puentes disulfuro. En ausencia de alguna de ellas, puede perder la estructura

terciaria, llevando a la desnaturalización de la enzima.

Las termoenzimas son enzimas que se producen a temperaturas alrededor de

60°C para termófilos y 80°C para hipertermófilos. Estas son resistentes a la

denaturación irreversible y óptimamente activas a altas temperaturas desde 60° C

a 120°C. Estas enzimas pueden ser usadas en diversos procesos industriales.

(Zeikus, G., et al.,, 1.998).

2.4 BACTERIAS TERMOFILAS

El crecimiento y la multiplicación son parámetros decisivos en la competencia de

ambientes, por lo tanto, en los ambientes extremos existen organismos que

sobreviven a estas condiciones.

2.4.1 Clasificación

Los organismos termófilos se clasifican como tales, con base en que su

temperatura óptima de crecimiento excede al límite superior del rango mesofílico

(40°C). En esta definición se encuentran los termófilos que son incapaces de

crecer en rango mesófilo y se denominan termófilos obligados, los termófilos

capaces de desarrollarse a temperatura mesofílica se denominan facultativos y por

último los que crecen a más de 65°C denominados termófilos extremos. (Grant,

W., 1.989)

Otros autores clasifican las bacterias termófilas entre los 55 - 60°C teniendo en

cuenta que temperaturas por debajo de este rango son frecuentes en la

naturaleza, mientras que valores superiores, se asocian con actividad geotermal

(Brock, M, D., 1.967). Por último se pueden dividir en tres grupos de acuerdo al

rango de temperatura; termófilos entre 55 y 60 °C, termófilos extremos entre 80-

85°C y el grupo de los hipertermófilos o extremotermófilos que crecen a una

temperatura mayor de 80°C. (Brock, T., 1.986).

2.4.2 Hábitat

El hábitat de los microorganismos termófilos incluyen fuentes termales, áreas de

sobrecalentamiento por radiaciones solares de gran intensidad desiertos,

chimeneas subterranéas y montones de material orgánico. En los cereales

almacenados aparecen hongos termofílicos que contribuyen al calentamiento

como Mucor pusillus y Humicola lanuginosa (50°-60°C). Los ambientes

geotérmicos muestran termófilos como Pirococcus furiosus, Thermotoga maritima,

Thermococcus profundus, Thermus aquaticus, Bacillus sp. Y Methanobacterium

thermoautotrophicum. (Grant, W., 1.989).

2.4.3 Adaptaciones bioquímicas a la temperatura

Se sugiere que el mantenimiento de la estabilidad de la membrana es un aspecto

importante de sobrevivencia. Una característica de esta adaptación son lípidos de

membrana, de elevado punto de fusión y mayor porcentaje de ácidos saturados

que permiten que la membrana sea más flexible, en comparación a los lípidos

insaturados de microorganismos mesofílicos. Las bacterias ajustan la composición

de ácidos grasos y lípidos dependiendo de la temperatura de crecimiento. Al

aumentar la temperatura incrementa la proporción de ácidos grasos insaturados y

saturados. ( Bodman, H., & Welker, N.E., 1.969). Esta característica general le

proporciona a la membrana celular gran flexibilidad y estabilidad térmica. De otro

modo es necesaria la síntesis rápida de las proteinas desnaturalizadas por el calor

lo que indica una regeneración de aminoácidos rápida y estable, lo mismo que

velocidades rápidas de crecimiento que garantizan la regeneración de la

población; además las proteínas como tal tienen configuraciones especiales,

plegamientos, uniones o puentes disulfuro que estabilizan las proteínas (Zeikus,

G., et al.,1.998) .

2.4.4 Género Thermus spp.

Bacilos de 0.5 a 0.8 µm de diámetro y entre 5.0 y 10µm de largo, los cuáles

pueden variar de longitud según las condiciones de cultivo, entre 20 y 200 µm. La

asociación de varias células genera la formación de cuerpos redondos de 10 a

20µm de diámetro. Muchas cepas del género Thermus forman largos filamentos,

pero durante los continuos pases celulares crecen formando bastones

pleomórficos cortos. Sin embargo la morfología de estos organismos está

influenciada por la temperatura de crecimiento y por el estadío del cultivo. A

temperaturas que sobrepasan los 75°C, el crecimiento es filamentoso, mientras

que a temperaturas de 65 a 70°C, los filamentos son comunes en la fase

estacionaria (Kristanjansson, J., & Gudni, A., 1.983).

Los glicolípidos del género Thermus pueden presentarse en cantidades que

oscilan entre el 50 y el 70% del total de los lípidos en algunas especies (Oshima,

M., & Friedman, M., 1.978)

Las bacterias del género Thermus sp se colorean como bacilos Gram negativos

aunque la presencia de ornitina, glicina, y glucosamina como componentes del

peptidoglucano, permiten que se coloreen como bacilos Gram positivos, a esto se

puede añadir la ausencia de ácido diaminopimélico, que es sustituído por ácido

murámico (Quintela, C., et al., 1.995).

Los representantes de este género son inmóviles y no forman esporas. Sin

embargo la formación de esporas es muchas veces influenciada por las

condiciones del cultivo. ( Michael, J., et a l., 1.986).

Las colonias de la mayoría de las cepas de Thermus sp son amarillas o naranja,

debido a la presencia de pigmentos carotenoides (Brock, T. D., & Hunson, F.,

1.969) se considera que los pigmentos carotenoides podrían conferir cierta

protección cuando las bacterias deben crecer expuestas a luz solar, mientras que

los que crecen en medio ambientes artificiales, al perder la iluminación pierden la

pigmentación (Pask - Huges, R., Williams, R., 1.977).

Los microorganismos del género Thermus son aeróbios estrictos y la

concentración de oxígeno disuelto es uno de los factores críticos para el cultivo de

estos microorganismos ya que a altas temperaturas la difusión del oxígeno es

pobre y se debe prestar especial atención al suministro de oxígeno con una

adecuada aireación (Pask - Huges, R., & Williams, R., 1.977).

2.4.5 Género Bacillus sp.

Incluye bacterias de 5.5 - 2.5 x 1.2 - 10 µm y a menudo se disponen en pares o

cadenas. Las células son móviles por flagelos perítricos, forman endosporas. En la

Tabla 3, se presentan características principales de este género (Brock, T., 1.993).

Son aeróbicos, anaeróbicos o facultativos, con amplia diversidad de habilidades

fisiológicas con respecto a la temperatura, pH y salinidad, son quimiorganotróficos,

tienen metabolismo fermentativo o respiratorio, usualmente catalasa positivos.

El aislamiento de Bacillus sp es una tarea fácil puesto que la pasteurización de

suspensiones de suelo a 80°C de 10 a 20 minutos destruye las células

vegetativas, pero no las endosporas y la subsecuente incubación, aeróbica,

elimina al otro unico formador de esporas: los clostridios. El número de Bacillus sp

es bastante elevado 106 y 107 o más por gramo, pero el tamaño de la población es

variable, ya que un conteo viable no indica si la colonia se desarrolla a partir de

una espora o unidad vegetativa. (Martin, Alexander., 1.980)

Tabla 3. Características de especies representativas del género Bacillus.

Caracteristicas generales Especies Posición de las esporas DNA (mol gc%)

1. Esporas ovales o

cilindricas, aerobios

facultativos, hidrolizan la

caseina y el almidón , los

esporangios no estan

hinchados, la pared de la

espora es delgada.

Termofílos y acidófilos

Mesófilos

Hidrólisis de almidón ,

depuración de aguas

reiduales.

Hidrólisis de almidón

Patógeno de insectos

2. esporangios

claramente hinchados,

pared de la espora

gruesa.

Termófilo

Mesófilo

Patógeno de insectos

B. coagulans

B. acidocaldarius

B. liqueniformis

B. cereus

B. anthracis

B. megaterium

B. subtillis

B. thuringiensis

B. stearothermophilus

B. polymyxa

B. macerans

B. circulans

B. larvae

B. popilliae

Centra/l terminal

Terminal

Central

Central

Central

Central

Central

Central

Central

Terminal

Terminal

Terminal

Terminal/ central

Terminal/central

Central

47

60

46

35

33

37

43

34

52

44

52

35

41

3. esporas esféricas,

aerobios obligados,

caseina y almidón no son

hidrolizados.

B. sphaericus

B. pasteurii

Terminal

Terminal

37

38

3.JUSTIFICACION

La actividad floricultora la cual dentro de la distribución de los desechos sólidos

de la floricultura produce el volumen más importante y el principal problema, sin

embargo presenta además un alto potencial de alternativa agroecológica a través

del compostaje, y así lo sugiere el Plan de Manejo de Desechos Sólidos del

Código de Conducta Florverde 1998.

El proceso de compostaje se realiza en dos grandes etapas: la fase mesofílica que

comprende temperaturas menores de 40°C donde se inicia la fase de la

degradación de materia orgánica y la flora microbiana es seleccionada por el

sustrato presente y sus herramientas enzimáticas. La segunda fase es la termófila

donde las temperaturas están entre 40°C y 70°C, en la cual se degradan las

sustancias más complejas como la celulosa, material predominante en los

residuos orgánicos provenientes de la actividad floricultora.

Gran parte de la actividad microbiana y de la degradación de la materia orgánica

se realiza durante la fase termófila ya que las temperaturas mayores de 60°C

promueven la actividad microbiana y pueden inactivar patógenos.

Por estas características la producción de un inóculo acelerador de compost a

partir de bacterias termófilas es una herramienta de gran utilidad en la disminución

de tiempo de degradación y en el aumento de la velocidad de degradación de

materia orgánica, lo que proporciona disminución de residuos sólidos y mayor

rapidez en la producción de abono orgánico para los cultivos.

4. OBJETIVO GENERAL

Producir un inóculo acelerador de compost a partir de bacterias termófilas

aisladas de pilas de compost de desechos vegetales de gypshofila, en fase

termofílica.

4.1 OBJETIVOS ESPECIFICOS

- Aislar, y caracterizar bacterias termofílicas obtenidas a partir de pilas de

compost en fase termofílica.

- Establecer las posibles relaciones ecológicas entre los microorganismos

aislados.

- Evaluar cualitativamente la actividad enzimática, celulolítica, proteolítica,

y amilolítica de cada cepa.

- Evaluar cuantitativamente la actividad celulolítica, para las cepas

aisladas.

- Determinar parámetros cinéticos como formación de biomasa, velocidad

específica de crecimiento y actividad enzimática de las cepas que

presenten mayor actividad.

- Determinar estabilidad térmica y a pH.

- Producir un inóculo de bacterias termófilas y evaluar en campo su

efecto en la reducción del tiempo de compostaje.

5. MATERIALES Y METODOS

La investigación se realizó en su primera fase en los Laboratorios de

Biotecnología Aplicada y Microbiología Industrial de la Pontificia Universidad

Javeriana, y en su fase de campo en Cultivos del Norte, Tocancipá-

Cundinamarca.

5.1 RECOLECCION DE LAS MUESTRAS

5.1.1 Sitio de Muestreo

El área de estudio comprende una zona de compostaje constituida por 5

pilas de compost, zona de picado y zona de recolección de desechos

vegetales ubicados en el área norte de la finca. (Figura 3).

Figura 3. Sitio de muestreo

5.1.2 Toma de muestra

De tres pilas de compost de 9m de largo por 1m de ancho y 1m de alto, en

fase termófila (56, 69, 67°C respectivamente) se tomaron muestras de 100 gr,

del interior de las pilas en la parte baja, media y superior, cada una por

triplicado. Inmediatamente las muestras se introdujeron en frascos de vidrio

con caldo Brain Heart Infusion (BHI). (Anexo 1) y se transportaron en

neveras de icopor con agua caliente a 50°C hasta el laboratorio.

5.2 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS

5.2.1 Enriquecimiento

Las muestras en caldo BHI fueron incubadas a 65°C con agitación constante

a una velocidad de 150 r.p.m. durante 24 horas.

5.2.2 Aislamiento primario

Este aislamiento se realizó por triplicado en agar BHI (Anexo 1) al 3% p/v,

cultivado a 65°C por 12 horas. A partir de las colonias aisladas con

características morfológicas similares, se realizaron siembras sucesivas

mediante la técnica de parcheo para purificar cada colonia. (Koneman, E. W.,

1.992).

5.2.3 Aislamiento secundario

La selección se efectuó mediante análisis microscópico realizando

coloración de Gram para evidenciar morfología celular (Brock, T., 1.994) y

macroscópico de cada una de las colonias evaluando, color, textura, forma,

diámetro de las colonias.

Posteriormente para la última selección se escogieron las colonias de mayor

velocidad de crecimiento, referido al tiempo de aparición de las colonias en

agar Celulosa 1% p/v (Anexo 1) y a la formación de halos a 70°C.

5.2.4 Conservación de las cepas BCP: (Banco de Células Primario)

Para la conservación de las cepas se utilizó la técnica de criopreservación

en glicerol al 30%. Se preparó un inóculo de cada cepa en medio BHI, y se

dejó en agitación por 12 horas a 65°C. Posteriormente se adicionó 25 ml del

caldo BHI más glicerol al 60 % v/v . Luego se tomó una alícuota de 1 ml en

tubos eppendorf estériles y se congelaron a -70°C. (Poutou, R., et al, 1.994).

La pureza y viabilidad se evaluó mediante coloración de Gram , siembras en

agar BHI 3% p/v y pruebas bioquímicas en las que se analizaron las

características microscópicas, macroscópicas y bioquímicas de cada cepa.

La conservación de las cepas fué dividida en bancos de células primario y

banco de células de trabajo (Pedroza, A., & Poutou, R.,1.999).

5.2.5 Identificación Bioquímica de los microorganismos aislados

Para la identificación bioquímica se utilizó kit de prueba rápida para Gram

positivos y Gram negativos Crystal BBL.

5.2.6 Actividad Enzimática Semicuantitativa

5.2.6.1 Actividad Amilolítica

Se determinó utilizando agar almidón 1% p/v (Anexo 1), la prueba se reveló

utilizando lugol sobre la caja según el método de Brock (1.994). Los

aislamientos que presentaron zonas claras alrededor de la colonia fueron

consideradas como cepas con actividad amilolítica; además se midió el

diametro de los halos para establecer semicuantitativamente la mayor

actividad (Koch, R., 1.997).

5.2.6.2 Actividad Proteolítica

Se determinó utilizando agar leche 1% p/v (Anexo 1); los aislamientos que

presentaron zonas claras alrededor de la colonia fueron consideradas con

actividad proteolítica , valorando a su vez el diámetro en proporción a la

actividad (Koch, R., 1.997).

5.2.7 Pruebas cuantitativas preliminares de actividad celulolítica

5.2.7.1 Fermentación discontinua en caldo celulosa

Se realizó en cinco erlenmeyers de 250 ml con 50 ml de caldo celulosa 1%

p/v (Anexo 1), se inocularon cada una de las cepas aisladas que presentaron

crecimiento en agar celulosa y se incubaron durante 12 horas a 65 °C y150

r.p.m. Transcurrido este tiempo el cultivo se centrifugó durante 10 minutos a

10.000 r.p.m. a 4°C. Al extracto crudo (sobrenadante) y a las celulas se les

determinó la actividad celulolítica, previendo enzimas de tipo intra -

extracelular (Wind, R.,et al, 1.994).

5.2.7.2 Actividad celulolítica

Se preparó una solución de celulosa al 1% p/v en buffer fosfato 0.1M

(Na2HPO4 + NaH2PO4 pH 7.2).(Anexo1). Se tomó 0.5 ml del extracto crudo y

0.5 ml de las células resuspendidas en el buffer y se adicionó a 0.5 ml de la

solución de celulosa. La mezcla final se incubó a 65°C por 30 minutos;

finalizado el tiempo la reacción se detuvo refrigerando a 4°C durante 15

minutos. Posteriormente la muestra se centrifugó por 10 minutos a 10.000

r.p.m., y a partir del sobrenadante se tomaron 250 µµl adicionando 250 µµl de

DNS (Anexo 1), se colocaron a ebullición por 5 minutos, posteriormente

fueron pasados a hielo por 10 minutos y finalmente se adicionó 2.5 ml de

agua destilada realizando las lecturas en Multiskan MCC/340 a 540 nm. Se

determinó la cantidad de azúcares reductores por triplicado de cada cepa,

tanto para células como para extracto crudo (Miller, G., 1.959). (Anexo 2)

La determinación final se corrigió mediante la realización de un análisis en

paralelo en el cual la enzima se inactivó por 30 minutos a 100°C y luego se

le determinó la concentración de azúcares reductores. La actividad final es la

resultante de la diferencia entre la actividad de la enzima sin inactivar,

menos la actividad de la enzima inactiva .

La unidad celulolítica equivale a la cantidad de enzima necesaria para

hidrolizar 1µµmol de glucosa por minuto UC/minuto, bajo las condiciones de

ensayo . (Bernfield, P., 1.955).

5.2.8 Pruebas de antagonismo

Todas las cepas fueron previamente cultivadas en caldo BHI durante 12

horas, 150 r.p.m, 65°C y la concentración celular final se obtuvo mediante la

comparación con el tubo número 1 del Nefelómetro de Mac Farland,

diluyendo los cultivos en solución salina al 0.85% p/v.

Se realizaron pruebas de antagonismo por triplicado, sembrando

masivamente cada una de las cepas en agar BHI 3% p/v enfrentándolas

entre sí. (Gauze, G., 1.965). El efecto antagónico se evaluó midiendo el

diámetro de los halos de inhibición (mm).

5.2.9 Perfil cinético de las cepas con mayor actividad celulolítica

5.2.9.1 Preparación del inóculo

A partir de los BCT (Bancos de Células de Trabajo) se realizó un aislamiento

en agar celulosa, durante 12 horas a 65°C. A partir de una colonia aislada se

inoculó 50 ml de Caldo compost 10% p/v suplementado con celulosa,

extracto de levadura y peptona, (Anexo 1) en el cual se dejó crecer por 12

horas , 65°C ,150 r.p.m, en erlenmeyer de 250 ml. Para la determinación del

efecto de la transferencia de oxígeno sobre formación de biomasa y

producción de la enzima se ensayó la aireación a razón de 0.2 v.v.m. y

agitación 150 r.p.m. para un ensayo, mientras que el segundo sólo se manejo

con agitación 150 r.p.m.

5.2.9.2 Fermentación Discontinua

Se realizó en erlenmeyer de 500 ml con un volumen de trabajo de 200 ml y

un inóculo del 10% (20 ml), los cuales se adicionaron a 180 ml de caldo

compost al 10 % p/v suplementado, para obtener un volumen efectivo de

trabajo equivalente a 200 ml. Las condiciones de la fermentación fueron

65°C, 150 r.p.m. y 0.2 vvm para el ensayo con aireación, las condiciones del

segundo ensayo se mantuvieron con la diferencia que en este no se

suministró inyección de aire en profundidad. A partir de la hora 0 hasta la

hora 22 se tomaron muestras por triplicado de 2 ml con intervalos de 2

horas las cuales se llevaron a refrigeración a 4°C hasta el momento de la

lectura.

5.2.9.3 Parámetros cinéticos

La formación de biomasa se determinó mediante curvas de peso seco vs

tiempo. El peso de la biomasa presente en cada vial se determinó por

diferencia de pesos, al peso promedio se le restó el peso del vial blanco

que contenia el caldo celulosa al 10% p/v suplementado y sin inocular.

La concentración se expresó en gramos de biomasa seca por litro de

solución (g biomasa seca/L). (Anexo 4).

Para determinar la actividad celulolítica en función del tiempo se realizó la

técnica de ácido 3,5 - dinitrosalicílico DNS (Miller, G., 1.959) para todos los

muestreos de la curva de crecimiento.

5.3 PRUEBAS DE ESTABILIDAD

5.3.1 Estabilidad térmica

El efecto de la temperatura sobre la actividad celulolítica se determinó mediante el

método de ácido 3,5 - dinitrosalicílico DNS (Miller, G., 1.959). Las muestras fueron

preparadas según el protocolo referido en el numeral (5.2.7.2). Los diferentes

ensayos se incubaron a temperaturas de 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100°C. A partir de

las actividades obtenidas en cada temperatura se grafico actividad celulolítica

(UC/minuto) vs temperatura, y se determinó el porcentaje de la actividad residual.

Para determinar la temperatura óptima se seleccionó el rango de temperatura en

el cual la actividad enzimática fuera mayor del 90%. (Yoshinobu, T., et al, 1.999).

5.3.2 Estabilidad a pH

El efecto del pH sobre la actividad celulolítica de cada una de las cepas se

determinó mediante el método de ácido 3,5 - dinitrosalicílico DNS (Miller, G.,

1.959) . Los buffer con diferentes valores de pH se prepararon a partir del buffer

fosfato 0.1 M pH 7.0 +/-2, para obtener valores de pH entre 4.0 - 7.0 se utilizó HCl

1N y para los buffer de 7.0- 12 se utilizó NaOH 1N. Los diferentes ensayos se

realizaron siguiendo el protocolo del numeral (5.2.7.2), con la diferencia que la

solución de celulosa al 1% p/v, se modifico para obtener los diferentes valores de

pH.

A partir de los resultados obtenidos, en cada valor de pH, se graficó la actividad

celulolítica (UC/minuto) VS pH. Para determinar el pH óptimo se seleccionó el

rango de valores de pH en los cuales la actividad enzimática fué superior al 90%.

%. (Yoshinobu, T., et al, 1.999).

5.4 PRUEBA PRELIMINAR EN CAMPO

5.4.1 Producción del inóculo

Para la preparación del inóculo más efectivo en la aceleración de las pilas de

compost se utilizaron tres tratamientos: celulas, extracto crudo (sobrenadante) y

cultivo total (celula + sobrenadante) , las cuales a su vez se ensayaron con dos

diferentes concentraciones de sustrato 10% y 5%.

Para la producción del inóculo se utilizó un sustrato económico que en este caso

fué caldo compost (Anexo 1). Este caldo se inoculó con las cinco cepas que

anteriormente habían crecido en agar compost al 5% y 10% p/v (Anexo 1),

induciendo de esta manera su actividad enzimática para la degradación de la

celulosa. Se dejó durante 12 horas a 65°C y 3 v.v.m. Para el inóculo a partir de

células, una vez que este cumplio las 12 horas de fermentación, se centrifugó por

15 minutos a 10.000 r.p.m. con una temperatura de 4°C; las células se

resuspendieron en solución salina al 0.85% y se mantuvieron en refrigeración

hasta el momento de la inoculación. Para preparar el inóculo a partir de

sobrenadante se utilizó la misma metodología anteriormente descrita, sólo que en

este caso se recuperó el sobrenadante.

La cantidad de inóculo preparado se calculó por metro cúbico de la pila, es decir

un litro para cada metro cúbico. (Fundases., 1994).

5.4.2 Aplicación del inóculo

Las pilas de 1m de ancho, 1m de alto por 3 m de largo, fueron inoculadas cuando

se encontraron en fase termofílica es decir 55-65°C. El inóculo se agregó

uniformemente a lo largo y ancho de las pilas, tratando de mantener un volumen

de salida constante. (figura 4).

Figura 4. Inoculación de las pilas de compost

5.4.3 Evaluación de la efectividad del inóculo

La evaluación de la actividad del inóculo se realizó midiendo semanalmente,

temperatura, pH y recuentos de bacterias amilolíticas, proteolíticas y celulolíticas,

además de una observación física del estado del compost.

5.4.3.1 Temperatura

La toma de la temperatura se llevó a cabo utilizando un termómetro de punzón

para pruebas de campo, el cual se introdujo en diferentes puntos de la pila ,

haciendo varias lecturas y promediandolas para encontrar la temperatura media

de la pila, en cada muestreo semanal. (Figura 5).

Figura 5. Toma de la temperatura.

5.4.3.2 pH

El pH se determinó utilizando potenciómetro y manteniendo una proporción 1:1

entre agua y muestra de varios lugares de la pila de compost. El agua utilizada

para la medición presentó un pH 7.0 +/- 2.

5.4.3.3 Recuentos de Bacterias amilolíticas, proteolíticas y celulolíticas

El recuento se realizó en placa utilizando agar celulosa 1% p/v, agar almidón 1%

p/v y agar leche 1% p/v, para cada muestreo semanal. Las placas se revelaron

con lugol en el caso de las amilolíticas y para celulolíticas rojo congo. Los halos de

proteólisis se evidenciarón por aclaramiento de las zonas alrededor de la colonia.

5.4.4 Determinación y análisis de los mejores tratamientos

Para determinar el tratamiento más efectivo en la degradación de pilas de compost

se tomaron todas las variables medibles y se escogió el tratamiento que presentó

menor tiempo de degradación. Este proceso se evidenció por una reducción y

estabilización de la temperatura, un pH estable y una disminución en el recuento

de bacterias termófilas amilolíticas, proteolíticas y celulolíticas. Se cuantificó

actividad celulolítica como método de análisis de la relación C/N. Otro parámetro

análizado fué la observación de las caracteristicas físicas del compost final, como

su olor, estructura y humedad.

5.5 PRUEBA FINAL IN VITRO

Con los mejores tratamientos escogidos mediante la prueba preliminar se realizó

un ensayo a escala de laboratorio bajo condiciones controladas, con el fin de

determinar azúcares reductores provenientes de la actividad celulolítica de

nuestros inóculos selecionados y verificar la degradación de la celulosa en cada

semana de muestreo.

Se tomaron 10 g de compost de los mejores tratamientos de cada semana de

muestreo y se autoclavaron por 30 minutos, 121 °C, 15 lbs de presión.

Posteriormente se inocularon con las cinco cepas, utilizando el tratamiento

escogido (célula, sobrenadante,cultivo total). Ver numeral 5.4.1

Las muestras inoculadas se dejaron por 12 horas a 65°C, y posteriormente se

resuspendieron en 90 ml de agua estéril, este volumen se filtró para eliminar

sólidos suspendidos y se diluyó 1:20. Se tomaron 250 µl del filtrado y 250 µl de

DNS, se llevó a ebullición por 5 minutos y se frenó la reacción a 4°C por 10

minutos, se adicionó 2.5 ml de agua destilada y se realizó la lectura por triplicado

en Multiskan a 540 nm (Miller, G., 1.959). A los valores de los tratamientos les

fué restado el valor del control debido a que los valores de este pueden deberse a

la hidrólisis de la glucosa por el tratamiento de autoclavado, además que el control

puede tener azúcares reductores provenientes de otras actividades como la

amilolítica.

5.6 PRUEBA FINAL EN CAMPO

5.6.1 Producción del inóculo

Para la producción del inóculo se siguió la misma metodología descrita en el

numeral 5.4.1. pero utilizando los dos mejores tratamientos obtenidos. La

evaluación de la actividad del inóculo se realizó con la misma metodología

utilizada en el numeral 5.4.3.

5.6.1.2 Determinación de Azúcares reductores

Las muestras de los tratamientos escogidos, fueron evaluadas mediante la técnica

de ácido 3,5 - dinitrosalicílico (Miller, G., 1.959) DNS , de la siguiente manera; se

tomó 1g de cada muestra y se diluyó en 9 ml de agua estéril. Esta dilución se filtró

para eliminar sólidos suspendidos que pudiesen interferir en la lectura del

Multiskan. Posteriormente se tomaron 250 µl del filtrado y 250µl de DNS, se llevó

a ebullición por 5 minutos y se frenó la reacción a 4°C por 10 minutos, se adicionó

2.5 ml de agua destilada y se realizó la lectura por triplicado en Multiskan a 540

nm (Miller, G.,1.959). El tubo blanco se preparó con 250 µl de agua destilada, 250

µl de DNS y 2.5 ml de agua destilada. (Anexo 2)

5.6.2 Evaluación estadística del mejor tratamiento

Para la evaluación estadistica se empleó un analisis de covarianza para pruebas

de pendiente.

Las curvas se linealizaron siguiendo un modelo log normal, valido para las tres

evaluaciones que describe apropiadamente lla curva (DNS, temperatura y

recuentos amilolíticos, proteolíticos y celulolíticos) con un 95% nivel de confianza,

luego se aplicó un análisis lineal con regresión y por último un análisis de

covarianza para pruebas de pendiente.

5.6.3. Evaluación de NPK del compost final del mejor tratamiento

Para esta evaluación se tomaron muestras de compost final del mejor tratamiento

y de la pila control con el fín de evaluar su composición química en relación con

NPK. Las muestras fueron procesadas por el Laboratorio Nacional de Insumos

Agricolas LANIA-ICA.

5.5 PRUEBAS DE ESTABILIDAD

5.3.1 Estabilidad térmica

El efecto de la temperatura sobre la actividad celulolítica se determinó mediante el

método de ácido 3,5 - dinitrosalicílico DNS (Miller, G., 1.959). Las muestras fueron

preparadas según el protocolo referido en el numeral (5.2.7.2). Los diferentes

ensayos se incubaron a temperaturas de 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100°C. A partir de

las actividades obtenidas en cada temperatura se grafico actividad celulolítica

(UC/minuto) vs temperatura, y se determinó el porcentaje de la actividad residual.

Para determinar la temperatura óptima se seleccionó el rango de temperatura en

el cual la actividad enzimática fuera mayor del 90%. (Yoshinobu, T., et al, 1.999).

5.3.2 Estabilidad a pH

El efecto del pH sobre la actividad celulolítica de cada una de las cepas se

determinó mediante el método de ácido 3,5 - dinitrosalicílico DNS (Miller, G.,

1.959) . Los buffer con diferentes valores de pH se prepararon a partir del buffer

fosfato 0.1 M pH 7.0 +/-2, para obtener valores de pH entre 4.0 - 7.0 se utilizó HCl

1N y para los buffer de 7.0- 12 se utilizó NaOH 1N. Los diferentes ensayos se

realizaron siguiendo el protocolo del numeral (5.2.7.2), con la diferencia que la

solución de celulosa al 1% p/v, se modifico para obtener los diferentes valores de

pH.

A partir de los resultados obtenidos, en cada valor de pH, se graficó la actividad

celulolítica (UC/minuto) VS pH. Para determinar el pH óptimo se seleccionó el

rango de valores de pH en los cuales la actividad enzimática fué superior al 90%.

%. (Yoshinobu, T., et al, 1.999).

5.6 PRUEBA PRELIMINAR EN CAMPO

5.6.2 Producción del inóculo

Para la preparación del inóculo más efectivo en la aceleración de las pilas de

compost se utilizaron tres tratamientos: celulas, extracto crudo (sobrenadante) y

cultivo total (celula + sobrenadante) , las cuales a su vez se ensayaron con dos

diferentes concentraciones de sustrato 10% y 5%.

Para la producción del inóculo se utilizó un sustrato económico que en este caso

fué caldo compost (Anexo 1). Este caldo se inoculó con las cinco cepas que

anteriormente habían crecido en agar compost al 5% y 10% p/v (Anexo 1),

induciendo de esta manera su actividad enzimática para la degradación de la

celulosa. Se dejó durante 12 horas a 65°C y 3 v.v.m. Para el inóculo a partir de

células, una vez que este cumplio las 12 horas de fermentación, se centrifugó por

15 minutos a 10.000 r.p.m. con una temperatura de 4°C; las células se

resuspendieron en solución salina al 0.85% y se mantuvieron en refrigeración

hasta el momento de la inoculación. Para preparar el inóculo a partir de

sobrenadante se utilizó la misma metodología anteriormente descrita, sólo que en

este caso se recuperó el sobrenadante.

La cantidad de inóculo preparado se calculó por metro cúbico de la pila, es decir

un litro para cada metro cúbico. (Fundases., 1994).

5.6.3 Aplicación del inóculo

Las pilas de 1m de ancho, 1m de alto por 3 m de largo, fueron inoculadas cuando

se encontraron en fase termofílica es decir 55-65°C. El inóculo se agregó

uniformemente a lo largo y ancho de las pilas, tratando de mantener un volumen

de salida constante. (figura 4).

Figura 4. Inoculación de las pilas de compost

5.6.4 Evaluación de la efectividad del inóculo

La evaluación de la actividad del inóculo se realizó midiendo semanalmente,

temperatura, pH y recuentos de bacterias amilolíticas, proteolíticas y celulolíticas,

además de una observación física del estado del compost.

5.6.4.1 Temperatura

La toma de la temperatura se llevó a cabo utilizando un termómetro de punzón

para pruebas de campo, el cual se introdujo en diferentes puntos de la pila ,

haciendo varias lecturas y promediandolas para encontrar la temperatura media

de la pila, en cada muestreo semanal. (Figura 5).

Figura 5. Toma de la temperatura.

5.6.4.2 pH

El pH se determinó utilizando potenciómetro y manteniendo una proporción 1:1

entre agua y muestra de varios lugares de la pila de compost. El agua utilizada

para la medición presentó un pH 7.0 +/- 2.

5.4.3.3 Recuentos de Bacterias amilolíticas, proteolíticas y celulolíticas

El recuento se realizó en placa utilizando agar celulosa 1% p/v, agar almidón 1%

p/v y agar leche 1% p/v, para cada muestreo semanal. Las placas se revelaron

con lugol en el caso de las amilolíticas y para celulolíticas rojo congo. Los halos de

proteólisis se evidenciarón por aclaramiento de las zonas alrededor de la colonia.

5.6.5 Determinación y análisis de los mejores tratamientos

Para determinar el tratamiento más efectivo en la degradación de pilas de compost

se tomaron todas las variables medibles y se escogió el tratamiento que presentó

menor tiempo de degradación. Este proceso se evidenció por una reducción y

estabilización de la temperatura, un pH estable y una disminución en el recuento

de bacterias termófilas amilolíticas, proteolíticas y celulolíticas. Se cuantificó

actividad celulolítica como método de análisis de la relación C/N. Otro parámetro

análizado fué la observación de las caracteristicas físicas del compost final, como

su olor, estructura y humedad.

5.7 PRUEBA FINAL IN VITRO

Con los mejores tratamientos escogidos mediante la prueba preliminar se realizó

un ensayo a escala de laboratorio bajo condiciones controladas, con el fin de

determinar azúcares reductores provenientes de la actividad celulolítica de

nuestros inóculos selecionados y verificar la degradación de la celulosa en cada

semana de muestreo.

Se tomaron 10 g de compost de los mejores tratamientos de cada semana de

muestreo y se autoclavaron por 30 minutos, 121 °C, 15 lbs de presión.

Posteriormente se inocularon con las cinco cepas, utilizando el tratamiento

escogido (célula, sobrenadante,cultivo total). Ver numeral 5.4.1

Las muestras inoculadas se dejaron por 12 horas a 65°C, y posteriormente se

resuspendieron en 90 ml de agua estéril, este volumen se filtró para eliminar

sólidos suspendidos y se diluyó 1:20. Se tomaron 250 µl del filtrado y 250 µl de

DNS, se llevó a ebullición por 5 minutos y se frenó la reacción a 4°C por 10

minutos, se adicionó 2.5 ml de agua destilada y se realizó la lectura por triplicado

en Multiskan a 540 nm (Miller, G., 1.959). A los valores de los tratamientos les

fué restado el valor del control debido a que los valores de este pueden deberse a

la hidrólisis de la glucosa por el tratamiento de autoclavado, además que el control

puede tener azúcares reductores provenientes de otras actividades como la

amilolítica.

5.8 PRUEBA FINAL EN CAMPO

5.8.1 Producción del inóculo

Para la producción del inóculo se siguió la misma metodología descrita en el

numeral 5.4.1. pero utilizando los dos mejores tratamientos obtenidos. La

evaluación de la actividad del inóculo se realizó con la misma metodología

utilizada en el numeral 5.4.3.

5.6.2.2 Determinación de Azúcares reductores

Las muestras de los tratamientos escogidos, fueron evaluadas mediante la técnica

de ácido 3,5 - dinitrosalicílico (Miller, G., 1.959) DNS , de la siguiente manera; se

tomó 1g de cada muestra y se diluyó en 9 ml de agua estéril. Esta dilución se filtró

para eliminar sólidos suspendidos que pudiesen interferir en la lectura del

Multiskan. Posteriormente se tomaron 250 µl del filtrado y 250µl de DNS, se llevó

a ebullición por 5 minutos y se frenó la reacción a 4°C por 10 minutos, se adicionó

2.5 ml de agua destilada y se realizó la lectura por triplicado en Multiskan a 540

nm (Miller, G.,1.959). El tubo blanco se preparó con 250 µl de agua destilada, 250

µl de DNS y 2.5 ml de agua destilada. (Anexo 2)

5.6.3 Evaluación estadística del mejor tratamiento

Para la evaluación estadistica se empleó un analisis de covarianza para pruebas

de pendiente.

Las curvas se linealizaron siguiendo un modelo log normal, valido para las tres

evaluaciones que describe apropiadamente lla curva (DNS, temperatura y

recuentos amilolíticos, proteolíticos y celulolíticos) con un 95% nivel de confianza,

luego se aplicó un análisis lineal con regresión y por último un análisis de

covarianza para pruebas de pendiente.

5.6.4. Evaluación de NPK del compost final del mejor tratamiento

Para esta evaluación se tomaron muestras de compost final del mejor tratamiento

y de la pila control con el fín de evaluar su composición química en relación con

NPK. Las muestras fueron procesadas por el Laboratorio Nacional de Insumos

Agricolas LANIA-ICA.

ANEXOS

ANEXO 1. MEDIOS DE CULTIVO - Caldo compost 10% suplementado

Elemento g/l Compost 100 g/l Extracto de levadura 10g/l Peptona de caseína 10g/l Celulosa 10g/l pH 7.0

- Caldo compost 10%

Elemento g/l Compost 100 g/l

- Agar compost 5% y 10%

Elemento

g/l

Compost 100 g/l Agar agar 30g/l pH 7.0

- Caldo BHI

Elemento g/l Caldo BHI 37g/l

- Agar BHI

Elemento g/l Caldo BHI 37g/l Agar agar 30g/l

- Agar celulosa

Elemento g/l Celulosa 10g/l Agar agar 30g/l Extracto de levadura 3g/l NaCl 5g/l Peptona 3g/l

- Agar almidón

Elemento g/l Almidón 10g/l Agar agar 30g/l Extracto de levadura 3g/l NaCl 5g/l Peptona 3g/l

- Agar leche

Elemento g/l Leche en polvo 10g/l Agar agar 30g/l Extracto de levadura 3g/l NaCl 5g/l Peptona 3g/l

- Caldo celulosa

Elemento g/l Celulosa 10g/l Agar agar 30g/l Extracto de levadura 3g/l NaCl 5g/l Peptona 3g/l

♦ Buffer fosfato Acido tricoloroacético (TCA) 15% p/v Na2HPO4, pesar 71 g y disolver en 500 ml de agua destilada Disolver 15 g de TCA en 100 ml de agua destilada NaH2PO4,, pesar 69 g y disolver en 500 ml de agua destilada Mezclar 38.4 ml de Na2 HPO4 con 15,8 ml de NaH2PO4 y ajustar pH 7.2 - DNS En un vaso de precipitado de 200 ml disolver 1.6 g de NaOH, con 50 ml de agua

destilada. A la solución anterior adicionar 43.8 g de tartrato de sódio y potasio,

disolver lentamente con agitación. Adicionar un gramo de DNS lentamente hasta

la disolución total.Completar volumen con 100 ml de agua destilada, proteger de la

luz en frasco ambar y usar despúes de 24 horas.

ANEXO 2

Determinación de azúcares reductores mediante el método del ácido

dinitrosalicilico (DNS) (Miller 1951).

Curva patrón

La concentración de azúcares reductores se determinó usando la curva patron

hecha con soluciones de glucosa anhidra de calidad estándar (MERCK).

Esta gráfica tiene un comportamiento lineal en el intervalo de concentración de

glucosa entre 0.2mg/l - 5mg/l.

- Valor intercepto: 0.121

- Valor pendiente: 0.022

CONCENTRACION g/l Absorbancia 550 nm

0.2 0.170

0.5 0.230

1 0.340

1.5 0.450

2.0 0.560

2.5 0.630

3.0 0.780

3.5 0.890

4.0 1

4.5 1.11

5.0 1.22

Curva patrón para la cuantificación de azúcares reductores por el método de ácido

3,5 - Dinitrosalicílico (Miller, G,. 1959).

Procedimiento

Para determinar los azúcares reducidos se toman 0.5 ml de la solución a analizar,

se colocan en un tubo de vidrio con 0.5 ml de DNS. Esta mezcla se pone a baño

de maría a 100°C durante 5 minutos, después se enfría en un baño con hielo por

10 minutos y se adicionan 5 ml de agua destilada. La absorvancia se mide 550

nm, utilizando como blanco una solución de 0.5 ml de agua destilada más 0.5 ml

de DNS tratada de la misma forma que las muestras.

Curva patrón (Cuantificación de azúcares)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0,2 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5

Concentración g/l

Ab

sorb

anci

a 54

0 n

m.

ANEXO 3

Prueba de DNS para cuantificar unidades celulolíticas por minuto (Miller, G.,

1959).

Reactivos

- Solución de celulosa 1% p/v

- Buffer fosfato 0.1M pH 7.2

- Acido dinitro salicílico

- Agua destilada

Procedimiento

Tomar 0.5 ml de extracto crudo de la enzima y 0.5 ml de células resuspendidas

en buffer fosfato, mezclar cada una de ellas con 0.5 ml de solución de celulosa

preparada en el buffer 0.1M pH 7.2. la mezcla se incuba por 30 minutos a 37°C, la

reacción se frena mediante enfriamento. Luego se centrifuga a 10.000 r.p.m. por

cinco minutos, a partir del sobrenadante se determinan los azúcares reductores

con DNS, la actividad se reporta en Unidades Celulolíticas. Una unidad de

actividad celulolítica es igual a la cantidad de la enzima capaz de hidrolizar una µ

mol de glucosa por minuto bajo las condicones de la prueba.

ANEXO 4

Curva de peso seco

Marcar y secar durante treinta horas a 80°C, previamente, viales de vidrio de boca

angosta con una capacidad de 25 ml, al finalizar el tiempo de secado los viales se

deben pasar a un desecador y después de 3 horas (Cuando estén fríos) deben

pesarse en una balanza analítica, teniendo siempre la precausión de manipularlos

con pinzas limpias no con las manos. Transferir de la solución concentrada, 1ml

por vial a los viales secos, llevar todos los viales a la estufa a 80°C

aproximadamente por 20 horas, hasta que el líquido de halla evaporado y no

hayan restos de humedad, pasar los viales al desecador, esperar a que se enfrien

, para luego pesarlos.

Determinar el peso de la biomasa presente en cada vial por diferencia de pesos.

Expresar la concentración en gramos de biomasa seca por litro de solución (g

biomasa seca/l).

ANEXO 5

Perfil cinético de la cepa 4B2 en caldo compost 10% suplementado

Tiempo g/l

Aireado

UC/min

Aireado

g/l

Sin airear

UC/min

Sin airear

0 18 4.123 11 425

2 32 6.541 14 859

4 34 6.854 15 1.852

6 35 7.014 18 2.904

8 38 8.654 20 3.819

10 39 9.898 22 4.582

12 45 11.155 22 5.398

14 49 12.661 15 4.987

16 37 11.123 14 4.856

18 23 9.214 10 3.925

20 20 8.951 8 3541

22 14 7.128 4 2.132

Perfil cinético de la cepa 4´C1 en caldo compost 10% suplementado

Tiempo g/l

Aireado

UC/min

Aireado

g/l

Sin airear

UC/min

Sin airear

0 16 6.251 1 953

2 18 6.398 3 1.891

4 21 6.454 4 2.015

6 22 6.813 5 2.245

8 24 7.111 8 2.487

10 29 7.895 11 2.815

12 39 9.541 12 2.945

14 37 9.123 10 2.741

16 32 8.845 9 2.654

18 27 7.654 7 2.217

20 16 6.298 5 2.287

22 11 5.147 2 1.722

Perfil cinético de la cepa GC2 en caldo compost 10% suplementado

Tiempo g/l

Airea

do

UC/min

Aireado

g/l

Sin airear

UC/min

Sin airear

0 14 3.063 0.2 42

2 16 3.458 0.6 96

4 19 4.151 0.8 117

6 20 4.311 1 218

8 25 5.423 3 657

10 32 7.031 8 1.762

12 36 7.928 10 2.223

14 49 10.706 15 3.611

16 50 11.156 18 4.225

18 52 13.730 25 5.311

20 42 9.306 20 4.256

22 35 7.682 17 3.762

Perfil cinético de la cepa 4´B en caldo compost 10% suplementado

Tiempo g/l

Aireado

UC/min

Aireado

g/l

Sin airear

UC/min

Sin airear

0 16 3.289 1 195

2 19 4.026 3 626

4 20 4.411 5 1.122

6 21 4.586 8 1.619

8 22 4.922 10 2.323

10 23 5.041 13 2.847

12 29 6.333 15 3.114

14 32 7.121 18 4.219

16 39 8.626 21 4.526

18 23 5.110 16 3.115

20 18 4.356 12 2.645

22 15 3.591 10 2.216

Perfil cinético de la cepa 4´B2 en caldo compost 10% suplementado

Tiempo g/l

Aireado

UC/min

Aireado

g/l

Sin airear

UC/min

Sin airear

0 14 3. 354 1 235

2 17 4.159 3 589

4 20 4.487 4 1.239

6 21 4.586 7 1.645

8 22 4.826 10 2.412

10 24 5.147 11 2.764

12 28 6.589 14 3.208

14 33 7.621 18 4.258

16 34 8.753 20 4.352

18 27 5.369 18 3.124

20 17 4.245 11 2.781

22 15 3.440 8 2.218

PRUEBA PRELIMINAR

Valores de pH para todos los tratamientos y control, del muestreo semanal.

Semana Celula 5%

Celula 10%

Cult. Total 5%

Cult. Total 10%

Ext. Crudo 5%

Ext.crudo 10%

Control

1 8,2 8,4 8,5 8,2 8,4 8,6 8,5

2 8,2 8,1 8,2 8 8,3 8,4 8,2

3 8 8 7,5 7,1 8 8,2 8,1

4 7,2 7,7 7,2 7 7,5 7,9 7,6

5 7,6 7,6 7,9 7,5 7,2 7,5 8

6 8 8 *

*

7,7 7,8 8,1

7 8,2 8,1 *

*

8 8,1 8,1

*No existen datos pues la pila terminó su degradación

Valores de temperatura para todos los tratamientos y control, del muestreo

semanal.

Semana Celula 5%

Celula 10%

Cult. Total 5%

Cult. Total 10%

Ext. Crudo 5%

Ext.crudo 10%

Control

1 63 61 60 58 62 59 60

2 58 59 55 52 55 54 54

3 50 52 45 46 48 49 48

4 47 49 30 31 33 35 35

5 39 37 19 20 29 30 32

6 28 26 * * 25 21 29

7 20 21 * * 20 19 18

*No existen datos pues la pila terminó su degradacion

PRUEBA PRELIMINAR

Recuento en placa de bacterias con actividad celulolíticas, amilolíticas y

proteolíticas.

Primera semana

Tratamiento Agar

Celulosa

Agar almidón Agar leche

Total 10% 40x103 ufc/gr 40x10 3ufc/gr 60x10 3 ufc/gr

Total 5% 50x103 ufc/gr 38x10 3 ufc/gr 64x10 3 ufc/gr

Extracto 10% 32x103 ufc/gr 41x10 3 ufc/gr 41x10 3 ufc/gr

Extracto 5% 51x103 ufc/gr 41x10 3 ufc/gr 45x10 3 ufc/gr

Celula 10% 40x103 ufc/gr 20x10 3 ufc/gr 12x10 3 ufc/gr

Celula 5% 45x10 3 ufc/gr 56x10 3 ufc/gr 23x10 3 ufc/gr

Control 31x10 3 ufc/gr 15x10 3 ufc/gr 14x10 3 ufc/gr

Segunda semana

Tratamiento Agar Celulosa Agar almidon Agar leche

Total 10% 65x10 3 ufc/gr 70x10 3ufc/gr 68x10 3 ufc/gr

Total 5% 70x10 4 ufc/gr 66x10 3 ufc/gr 64x10 3 ufc/gr

Extracto 10% 46x10 3 ufc/gr 64x10 3 ufc/gr 40x10 3 ufc/gr

Extracto 5% 60x10 3 ufc/gr 35x10 3 ufc/gr 25x10 3 ufc/gr

Celula 10% 45x10 3 ufc/gr 54x10 3 ufc/gr 47x10 3 ufc/gr

Celula 5% 48x10 3 ufc/gr 41x10 3 ufc/gr 51x10 3 ufc/gr

Control 38x10 3 ufc/gr 32x10 3 ufc/gr 41x10 3 ufc/gr

Tercera semana

Tratamiento Agar

Celulosa

Agar almidon Agar leche

Mixto 10% 85x10 3 ufc/gr 70x10 3ufc/gr 45x10 3 ufc/gr

Mixto 5% 66x10 3 ufc/gr 65x10 3 ufc/gr 23x10 3 ufc/gr

Extracto 10% 32x10 3 ufc/gr 52x10 3 ufc/gr 32x10 3 ufc/gr

Extracto 5% 28x10 3 ufc/gr 35x10 3 ufc/gr 25x10 3 ufc/gr

Celula 10% 34x10 3 ufc/gr 54x10 3 ufc/gr 17x10 3 ufc/gr

Celula 5% 20x10 3 ufc/gr 41x10 3 ufc/gr 10x10 3 ufc/gr

Control 15x10 3 ufc/gr 32x10 3 ufc/gr 90x10 2 ufc/gr

Cuarta semana

Tratamiento Agar

Celulosa

Agar almidon Agar leche

Mixto 10% 20x10 3 ufc/gr 15x10 3ufc/gr 16x10 3 ufc/gr

Mixto 5% 17x10 3 ufc/gr 12x10 3 ufc/gr 23x10 3 ufc/gr

Extracto 10% 12x10 3 ufc/gr 11x10 3 ufc/gr 32x10 3 ufc/gr

Extracto 5% 21x10 3 ufc/gr 23x10 4 ufc/gr 25x10 3 ufc/gr

Celula 10% 14x10 3ufc/gr 22x10 3 ufc/gr 17x10 3 ufc/gr

Celula 5% 10x10 3 ufc/gr 80x10 2 ufc/gr 10x10 3 ufc/gr

Control 50x10 2 ufc/gr 50x10 2 ufc/gr 90x10 2 ufc/gr

Quinta semana

Tratamiento Agar

Celulosa

Agar almidon Agar leche

Mixto 10% 19x10 3 ufc/gr 11x10 3ufc/gr 13x10 3 ufc/gr

Mixto 5% 15x10 3 ufc/gr 10x10 3 ufc/gr 14x10 3 ufc/gr

Extracto 10% 11x10 3 ufc/gr 9x10 3 ufc/gr 20x10 3 ufc/gr

Extracto 5% 12x10 3 ufc/gr 15x10 4 ufc/gr 15x10 3 ufc/gr

Celula 10% 11x10 3ufc/gr 12x10 3 ufc/gr 13x10 3 ufc/gr

Celula 5% 80x10 2 ufc/gr 70x10 2 ufc/gr 90x10 2 ufc/gr

Control 20x10 2 ufc/gr 60x10 2 ufc/gr 50x10 2 ufc/gr

Datos de X temperatura°C para los mejores tratamientos del muestro

semanal.

Semanas Cultivo Total 10% Cultivo total 5% Control natural

1 53 61 60

2 56 51 32

3 31 33 37

4 23 27 32

5 20 21 27

6 * * 25

7 * * 19

• los datos no se tienen porque la pila termino su maduración y se recogio

Datos de X pH para los mejores tratamientos del muestro semanal.

Semanas Cultivo Total 10% Cultivo total 5% Control natural

1 8.5 8.4 8.0

2 8.1 8.2 7.9

3 8.9 9.0 8.9

4 8.4 8.3 8.6

5 8.1 8.2 7.9

6 * * 8.1

7 * * 8.2

• los datos no se tienen porque la pila termino su maduración y se recogio

Los valores del pH y temperatura es la media de las tres repeticiones para cada

tratamiento.

PRUEBA FINAL

Recuento en placa de bacterias con actividad celulolíticas, amilolíticas y

proteolíticas.

Primera semana.

Tratamien

to

Agar

Celulosa

Agar

almidon

Agar leche

Mixto 10% 40x103

ufc/gr

30x103ufc/

gr

60x103

ufc/gr

Mixto 5% 55x103

ufc/gr

28x103

ufc/gr

64x103

ufc/gr

control 32x103

ufc/gr

20x103

ufc/gr

41x103

ufc/gr

Segunda semana

Tratamien

to

Agar

Celulosa

Agar

almidon

Agar leche

Mixto 10% 65x103

ufc/gr

40x103ufc/

gr

68x103

ufc/gr

Mixto 5% 60x103

ufc/gr

32x103

ufc/gr

64x103

ufc/gr

Control 46x103

ufc/gr

27x103

ufc/gr

40x103

ufc/gr

Tercera semana

Tratamient

o

Agar

Celulosa

Agar

almidon

Agar leche

Mixto 10% 30x103

ufc/gr

50x103ufc/

gr

11x103

ufc/gr

Mixto 5% 28x103

ufc/gr

34x103

ufc/gr

23x103

ufc/gr

Control 12x103

ufc/gr

29x103

ufc/gr

32x103

ufc/gr

Cuarta semana

Tratamien

to

Agar

Celulosa

Agar

almidon

Agar leche

Mixto 10% 20x103

ufc/gr

15x103ufc/

gr

11x103

ufc/gr

Mixto 5% 17x103

ufc/gr

12x103

ufc/gr

23x103

ufc/gr

control 12x103

ufc/gr

11x103

ufc/gr

32x103

ufc/gr

Quinta semana

Tratamien

to

Agar

Celulosa

Agar

almidon

Agar leche

Mixto 10% 15x103

ufc/gr

10x103ufc/

gr

8x103

ufc/gr

Mixto 5% 12x103

ufc/gr

19x103

ufc/gr

13x103

ufc/gr

control 11x103

ufc/gr

6x103

ufc/gr

12x103

ufc/gr