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DESARROLLO DE MTODOS POR HPLC
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INTRODUCCIN
Los problemas en Cromatografa Lquida se presentan en doscategoras. El primer tipo de problema esta asociado con lainstrumentacin. Problemas con las vlvulas checks, la lmpara deldetector, el inyector, las tuberas y otros elementos fsicos quepueden ser muy irritantes, pero la solucin usualmente es simpleuna vez la causa ha sido identificada. Muchos problemasinstrumentales pueden ser prevenidos por medio de una disciplinade mantenimientos preventivos. El segundo tipo de problemas estaasociado con la separacin en s, picos poco simtricos, inadecuadaseparacin, poca retencin son algunos ejemplos de los problemasde la separacin. Desafortunadamente, los sntomas en losproblemas de la separacin pueden ser obvios, pero identificar lafuente del problema es muy difcil y corregirlo es en algunoscasos imposibles.
LC-GC, 12, 1999.
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INTRODUCCIN
El desarrollo del mtodo se encara desde un punto de vista emprico?
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INTRODUCCIN
Se intenta la separacin para ver si sale algn pico Se cambia la columna, el pH, etc. Se agregan aditivos (ej. TEA) sin ninguna lgica Recurriendo as a interminables pruebas de ensayo-error
Por lo tanto no es extrao encontrarnos mtodos: Con el kprximo a t0 Con picos parcialmente solapados Con FMs muy agresivas para la columna Con coleo muy pronunciado
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INTRODUCCIN
LA FILOSOFIA DE REALIZAR UN COMPLETO DESARROLLO DEMETODOS TIENE VARIAS VENTAJAS:
Un buen desarrollo de mtodo puede no requerirmodificaciones o re-desarrollos durante su uso, obteniendoun gran ahorro. Un mtodo mal desarrollado genera un gastoadicional, perdida de productividad.
los Cromatografistas pueden determinar los parmetros dela separacin (porcentaje de modificador orgnico, pH,temperatura, reproducibilidad de la columna) asegurando larobustez y la reproducibilidad del mtodo
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INTRODUCCIN
Dado que el desarrollo es costoso y requiere de mucho tiempo,es preferible emplear caminos sistemticos efectuandoensayos con buenas probabilidades de xito, evitando ensayosinnecesarios y documentando los resultados
PRINCIPALES PASOS PARA EL DESARROLLO DEL MTODO
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PASOS PARA EL DESARROLLODE MTODOS POR HPLC
1. INFORMACIN DE LA MUESTRA, DEFINIR LAS METAS DE LA SEPARACIN
2. RECOLECCIN DE DATOS: NECESITA UN PROCEDIMIENTOESPECIAL DE HPLC, PRETRATAMIENTO DE LA MUESTRA
3. ELECCIN DEL DETECTOR
4. ELECCIN DEL MTODO LC: CORRIDO PREELIMINAR;ESTIMAR LA MEJOR CONDICIN DE SEPARACIN
5. OPTIMIZAR LAS CONDICIONES DE LA SEPARACIN
7b. MTODO CUANTITATIVO
6. CHEQUEO DE PROBLEMAS O REQUERIMIENTOSPARA PROCEDIMIENTOS ESPECIALES
7a. RECUPERACIN DEMATERIAL PURO
7b. MTODO CUALITATIVO
8. VALIDACIN DEL MTODO Y TRABAJO DE RUTINA
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BASES DE LA SEPARACIN
Separacin hipottica de los productos A, B y C, en equilibrio entre la fase mvil (m) y la estacionaria (e). S representa las molculas de fase mvil
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CONCEPTOS GENERALES
EL CROMATOGRAFO LQUIDO ESTAR CONSTITUIDO POR:
Un reservorio de solvente que alimenta el sistema con la fase mvil Un sistema que permite la introduccin de la muestra: inyector Un sistema para forzar el pasaje de la muestra a la fase mvil a travs de la
columna: la bomba Un sistema de monitoreo de la solucin que emerge de la columna: el
detector
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CONCEPTOS GENERALESNOMENCLATURA
Segn la ASTM y la IUPAC
CROMATOGRAMA:Un grafico u otra representacin de la respuesta del detector,concentracin del efluente u otra cantidad usada como una medida dela concentracin del efluente, versus el volumen de efluente o tiempo.Las abscisas corresponden al tiempo durante el cual se efectu elanlisis. las ordenadas corresponden a la seal analgica provenientedel detector. La altura de la seal indica en cada momento laintensidad de la respuesta, en general proporcional a laconcentracin del soluto (rea bajo la curva).
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CONCEPTOS GENERALESNOMENCLATURA
Volumen de Elucin (Ve):Es el volumen de fase mvil eluida entre la inyeccin y laelucin de la concentracin mxima del soluto. A flujoconstante, el tiempo transcurrido entre dichos puntos corresponde altiempo de elucin o tiempo de retencin.
Volumen Muerto (V0):Es el volumen total de solvente entre el punto de inyeccin y el dedeteccin. En RPLC se detecta empleando soluciones diluidas denitrato de sodio, dicromato de potasio o tiourea.
Lnea Base:Es la porcin del cromatograma donde slo se aprecia la elucin de lafase mvil, sin seal debida al soluto
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CONCEPTOS GENERALESNOMENCLATURATiempo de Retencin (tR): Tiempo medido entre la inyeccin y la elucin de la concentracinmxima del soluto ensimo (mxima seal). La distancia entre estemximo de la seal y la lnea de base es la altura del pico (hp) encuestin
Tiempo de Retencin Neto o Relativo (tR):Dado que el volumen extracolumnar depende de varios factores ajenosa la separacin misma, es frecuente expresar el tiempo de retencinneto de un pico determinado como diferencia entre su tiempo deretencin y el tiempo muerto en lugar del tiempo de retencinabsoluto.
Volumen de Retencin:0 ttt RR =
)min.((min). 1= mLFtV RR
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CONCEPTOS GENERALESNOMENCLATURA
Velocidad Lineal (u):Si L es la longitud de la columna expresada en cm y t0 el tiempomuerto medido en segundos, la velocidad lineal medido encentmetros por segundos puede calcularse como:
Factor de Capacidad (k):0tLu =
mvilfaselaensolutodemolesiaestacionarfaselaensolutodemolesk
____________=
( )0
0t
ttk R =
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CONCEPTOS GENERALESNOMENCLATURA
Factor de Capacidad (k):
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CONCEPTOS GENERALESNOMENCLATURA
Factor de Separacin ()Cociente entre los factores de capacidad (k) de un par de picos.
Resolucin ( R ):Expresin cuantitativa de la calidad de la separacin
Ancho de pico (w):Es utilizado para medir la eficiencia de la columna, la resolucin, etc.w0.5 (a mitad de la altura) y w0.1 (al 10% de su altura)
1
2
kk
=
( )( )1221
12ww
ttR+
=
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CONCEPTOS GENERALESNOMENCLATURA
Platos tericos:La eficiencia de una columna cromatogrfica y por lo tanto su poderseparativo se mide en funcin de su numero de platos tericos
El termino altura equivalente de platos terico se expresa con lasiguiente ecuacin: L es la longitud de la columna
H y N dependen de el dimetro, morfologa, calidad de las partculas,la calidad del empaquetamiento, el envejecimiento, deterioramiento dela columna. Pero adems de muchos factores instrumentales. N puedeexpresarse como platos/m de columna, platos/columna, etc.
216
=
wtN R
NLH =
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CONCEPTOS GENERALESNOMENCLATURA
Platos tericos:
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CONCEPTOS GENERALESNOMENCLATURA
Asimetra (As) o Factor de tailing (fT):Mide el grado de alejamiento a la forma gaussiana
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RECOLECCIN DE DATOS OREVISIN BIBLIOGRAFICA
Seria lamentable invertir semanas detrabajo para llegar a conclusiones quepodran obtenerse en minutos de consultaen una base de datos o en internet
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RECOLECCIN DE DATOS OREVISIN BIBLIOGRAFICA
ALGUNAS FUENTES DE CONSULTA
Bases de datos:ChromCircle MERCK
Paginas de internet de fabricantes de columnas:WatersSupelcoAgilentMachery NagelMerckShimadzu
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RECOLECCIN DE DATOS OREVISIN BIBLIOGRAFICA
ALGUNAS FUENTES DE CONSULTA
Revistas CientficasLC GC North AmericaLC GC EuropeJournal of Foods and Drug AnalysisJournals of Chromatography AJournals of Chromatography BJournal of AOACScience directSpringerotros
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QUE SE DEBE CONOCERANTES DE COMENZAR ?
Naturaleza de la muestra
Nmero de compuestos presentes (impurezas, pdtos de degradacin, etc)
Concentracin del analito en la muestra
forma en la que esta presente el analito en la muestra (bioanalisis)
Propiedades fsicas y qumicas del(os) analito(s): Estructuras qumicas, PM de los compuestos de inters, los valores de pKa, solubilidad, respuesta frente al detector utilizado (espectros UV)
Naturaleza de la matriz (jarabe, crema, suspensin, orina, plasma, etc)
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QUE SE DEBE CONOCERANTES DE COMENZAR ?
Objetivos de la separacin Mi objetivo principal es el anlisis cuantitativo, la deteccinde una sustancia (desconocida), la caracterizacin decompuestos desconocidos, o el aislamiento de materialpurificado?
Es necesario resolver todos los componentes de la muestra?
Si es un anlisis cuantitativo, que niveles de exactitud yprecisin se requiere?
Para cuantas matrices diferentes debe ser diseado elmtodo?
Cuantos compuestos se van a analizar a la vez?
Que equipo HPLC se requiere y que destreza se necesita?
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PREPARACIN DE LA MUESTRA
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PREPARACIN DE LA MUESTRA Requiere dilucin, adicin de un estndar interno u otramanipulacin volumtrica Solucin lista para inyeccin Slidos que deben ser disueltos o extrados Muestras que requieren pretratamiento para eliminarinterferencias y/o proteger la columna o el equipo de algnposible dao
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PREPARACIN DE LA MUESTRA
LOS OBJETIVOS DE LA PREPARACIN DE LA MUESTRA:
Minimizar la complejidad de la matriz que contiene los
analitos de inters, eliminando el mayor nmero posible de
sustancias que puedan interferir
Recuperar eficiente y reproduciblemente los componentes
que se desean analizar, permitiendo su concentracin o
disolucin en un solvente adecuado
Prevenir los posibles daos en cada uno de los
componentes del instrumento y especialmente de la columna.
Disminuir el tiempo de anlisis y de limpieza de la columna.
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PREPARACIN DE LA MUESTRATIPOS DE MUESTRAS
Orgnicas (incluye biolgicas) e Inorgnicas
Slidas
Semislidas (cremas, geles, suspensiones, emulsiones,
coloides),
Lquidas,
Gaseosas (GC).
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PREPARACIN DE LA MUESTRA
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PREPARACIN DE LA MUESTRAPRETRATAMIENTO DE MUESTRAS LQUIDAS
Extraccin Lquido-Lquido (LLE)Es una distribucin (particin) de un analito entre dos lquidosinmiscibles y est representada por el equilibrio.
El mejoramiento de la recuperacin del analito y laeliminacin de interferencias implican:Cambio de pHApareamiento inicoComplejacin, etc.Salting out, se utiliza para disminuir la concentracin delanalito en la fase acuosa por la adicin de una sal neutrainerte (ej. Sulfato de sodio) a la fase acuosa.
aqo CC
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PREPARACIN DE LA MUESTRAPRETRATAMIENTO DE MUESTRAS LQUIDAS
Extraccin Lquido-Lquido (LLE)Los solventes orgnicos utilizados en LLE deben cumplirlas siguientes caractersticas:Baja solubilidad en agua (< 10%)Volatilidad para fcil remocin y concentracin despus dela extraccinCompatibilidad con la tecnica de deteccin HPLC en caso deque se utilice en el anlisis (evitar solventes que absorben enel UV)Polaridad y propiedades de enlace de hidrogeno que mejoranla recuperacin de los analitos en la fase orgnicaAlta pureza para minimizar la contaminacin de la muestra
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PREPARACIN DE LA MUESTRAPRETRATAMIENTO DE MUESTRAS LQUIDAS
TEORIALey de distribucin de Nernst
KD= constante de distribucinCo= concentracin del analito en la fase orgnicaCaq= concentracin del analito en la fase acuosa
aqo
D CCK =
Otra expresin usada es la fraccin de analito extrado (E) en la fase orgnica:
Vo= volumen de la fase orgnicaVaq= volumen de la fase acuosaV= proporcin Vo/VaqVK
VKVCVC
VCED
Daqaqoo
oo+
=+
=1
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PREPARACIN DE LA MUESTRAPRETRATAMIENTO DE MUESTRAS LQUIDAS
PRACTICAEl KD aumenta cuando la polaridad (P) del solvente deextraccin coincide con la del analito.Una optima polaridad del solvente de extraccin se logracon la mezcla de dos solventes orgnicos con diferentepolaridad.Extraccin de analitos inicos, se utilizan los cambios depH utilizando el pKa del analito, estos principios son losmismos utilizados en HPLC.
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PREPARACIN DE LA MUESTRAPRETRATAMIENTO DE MUESTRAS LQUIDAS
PRACTICASi el KD del analito es desfavorable, pueden serrequeridas extracciones adicionales para mejorar larecuperacin. en algunos casos, la LLE puede aumentar laconcentracin del analito en la fraccin relativa extradacon pequeos volmenes? Microextraccin
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PREPARACIN DE LA MUESTRAPRETRATAMIENTO DE MUESTRAS LQUIDAS
PROBLEMASFormacin de emulsionesAnalitos adsorbidos fuertemente a partculasAnalitos enlazados a compuestos de alto peso molecular(ej. Frmacos a protenas)Solubilidad en las dos fases
DESVENTAJASOperacin lenta y tediosaMuy dependiente de la habilidad del operadorPresenta numerosos problemas (ver arriba)
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PREPARACIN DE LA MUESTRAPRETRATAMIENTO DE MUESTRAS LQUIDASPROBLEMASFormacin de emulsionesEste problema ocurre con cierto tipo de muestras (ej. Matricesgrasas, vegetales), la emulsin se puede romper por:
Adicin de una sal a la fase acuosaCalentamiento o enfriamiento del vaso de extraccinFiltracinAdicin de una pequea cantidad de un solvente orgnicodiferentecentrifugacin
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PREPARACIN DE LA MUESTRAPRETRATAMIENTO DE MUESTRAS LQUIDAS
PROBLEMASAnalitos adsorbidos a partculasUn lavado de las partculas despus de la filtracin con unsolvente fuerte (puede involucrar un cambio de pH, unincremento de la fuerza inica, o el uso de un solventeorgnico ms polar) puede recuperar el analito adsorbido
Solubilidad del analito en ambas fasesEs una buena practica saturar cada fase con la otra para queel volumen de la fase que contiene el analito sea conocido,permitiendo exactitud y una recuperacin optima.
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PREPARACIN DE LA MUESTRAPRETRATAMIENTO DE MUESTRAS LQUIDAS
PROBLEMASAnalitos enlazados a protenasTcnicas para el rompimiento del enlace a protenas en fluidosbiolgicos DESPROTEINIZACIN incluyen:
Adicin de un detergente, solvente orgnico (AcN, MeOH,Acetona), un agente chaotropico (cationes Hg2+, Cd2+, Fe3+, Cu2+, yZn2+ o mezclas de ellos con Ba2+) , o un cido fuerte entre el 10-20%(tgstico, tricloroactico TCA, perclrico, metafosfrico, o mezclasentre ellos, una sal neutra (salting in y salting out)Diluir con aguaDesplazamiento con un compuestos que genere enlaces ms fuertes.
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PREPARACIN DE LA MUESTRAPRETRATAMIENTO DE MUESTRAS LQUIDAS
Extraccin en Fase Slida (SPE)
Es la tcnica ms usada en los anlisis por HPLC y comparadacon la LLE tiene las siguientes ventajas:Mejor extraccin del analitoMayor eficiencia en la separacin de impurezasReduce el consumo de solventes orgnicosFcil recoleccin de la fraccin del analitoProcedimientos ms convenientesRemocin de partculasFcil automatizacin
Desventajas:Variabilidad entre cartuchosAdsorcin irreversible de algunos analitos en el cartucho
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PREPARACIN DE LA MUESTRAPRETRATAMIENTO DE MUESTRAS LQUIDAS
Extraccin en Fase Slida (SPE)Las fuerzas intermoleculares de retencin como las de elucinson del mismo tipo:
Fuerzas de atraccin inica:Son de tipo electrosttico generadas entre ines de cargasopuestas. Entre las fuerzas intermoleculares son las msfuertes.Fuerzas de atraccin dipolar:Se generan entre molculas con un momento dipolar neto.Fuerzas del tipo puente de hidrgeno:Se generan entre molculas que contienen tomos dehidrgeno ligados a heterotomos de electronegatividad altacomo el O, N, F, etc.
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PREPARACIN DE LA MUESTRAPRETRATAMIENTO DE MUESTRAS LQUIDAS
Extraccin en Fase Slida (SPE)
Fuerzas dispersivas de tipo Van der Waals:Estas fuerzas se generan entre molculas o partes de molculascuyo momento dipolar neto es cero.Tamao molecular:No es una fuerza; se incluye por tratarse de una de laspropiedades de los analitos que les permite migrardiferencialmente a travs de una fase estacionaria porosa.
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PREPARACIN DE LA MUESTRAPRETRATAMIENTO DE MUESTRAS LQUIDAS
Extraccin en Fase Slida (SPE)
TEORIALa SPE posee tres componentes:1. La muestra problema que contiene los analitos en una
matriz compleja2. La fase estacionaria o soporte slido (cartucho)3. Los solventes de acondicionamiento, lavado y elucin.
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PREPARACIN DE LA MUESTRAPRETRATAMIENTO DE MUESTRAS LQUIDAS
SPE de Fase ReversaInvolucra una matriz de la muestra polar o moderadamentepolar (fase mvil) y una fase estacionaria no polar. Laretencin de analtos orgnicos en soluciones polares dentro deeste material SPE debido principalmente a las fuerzasatractivas entre enlaces de hidrogeno-carbn entre el analito ylos grupos funcionales de la superficie de la slica. Estas fuerzasatractivas apolar-apolar son comnmente llamadas fuerzas devan der Waals o fuerzas de dispersin. Para eluir un compuestoadsorbido en SPE de fase reversa use un solvente apolar pararomper las fuerzas que unen el compuesto con el material deempaque.
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PREPARACIN DE LA MUESTRAPRETRATAMIENTO DE MUESTRAS LQUIDAS
SPE de Fase Normal
Analitos polares, matrices medianamente polares o nopolares (ej. Acetona, solventes clorinados, y hexano), y unafase estacionaria polar. La retencin de un analito bajocondiciones de fase normal es principalmente debido a lainteraccin entre grupos funcionales polares del analito ygrupos polares de la superficie adsorbentes. Estas incluyenenlaces de hidrogeno, interacciones pi-pi, interacciones dipolo-dipolo, e interacciones dipolo-dipolo inducidas, entre otras. Uncompuesto adsorbido por estos mecanismos es eluido por elpaso de un solvente que rompe el mecanismo de unin usualmente un compuesto que es ms polar que la matriz de lamuestra
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PREPARACIN DE LA MUESTRAPRETRATAMIENTO DE MUESTRAS LQUIDAS
SPE de Intercambio inico
Usado para compuestos que estn cargados en solucin(usualmente acuosas). Compuestos anonicos (carga negativa)pueden ser aislados con cartuchos de slica enlazada a LC-SAX oLC-NH2.. Compuestos catinicos (carga positiva) son aisladosusando cartuchos de slica enlazada a LC-SCX o LC-WCX. Elprincipal mecanismo de retencin se basa en atraccioneselectrostticas de los grupos funcionales cargados con losgrupos enlazados a la superficie de la slica
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PREPARACIN DE LA MUESTRAPRETRATAMIENTO DE MUESTRAS LQUIDAS
SPE de Intercambio inico
SPE de intercambio aninicoEl material LC-SAX (strong anion exchanger) consta de gruposalifticos cuaternarios enlazados a slica. Una aminacuaternaria es una base fuerte y se encuentra como un catinque atrae especies aninicas de la muestra. El pKa del aminocuaternario es mayor 14, lo cual hace que se enlace a todos losgrupos funcionales cargados a todos los pHs en solucin acuosa.
El LC-NH2 tambin es usado como un intercambiador aninicodbil WAX (weak anion exchanger). pKa es de 9.8
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PREPARACIN DE LA MUESTRAPRETRATAMIENTO DE MUESTRAS LQUIDAS
SPE de Intercambio inico
SPE de intercambio catinicoEl material LC-SCX (strong cation exchanger) consta de gruposalifticos de cido sulfonico. pKa < 1 y atrae especiescatinicas contenidas en una solucin.
El material SPE LC-WCX es un cido carboxlico aliftico. pKa 4.8
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PREPARACIN DE LA MUESTRA
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PREPARACIN DE LA MUESTRAPRETRATAMIENTO DE MUESTRAS LQUIDAS
Interacciones Secundarias en SPE
Slica enlazada a fase reversa Silanoles residuales Rompimiento de los puentes de hidrgeno entre el analito ylos grupos hidrxilo en la superficie de la slica (ej. Conmetanol)Slica enlazada a fase normal Intercambio catinico por los silanoles ionizados
Slica enlazada a intercambio inicoInteracciones no polares con la porcin de los gruposfuncionales
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PREPARACIN DE LA MUESTRAPRETRATAMIENTO DE MUESTRAS LQUIDAS
El Rol del pH en SPEDebido a que el cartucho de SPE se emplea slo una vez sepuede utilizar a pHs extremos para optimizar la retencin oelucin del analito.SPE de fase reversaSi el inters es retener el analito conviene tener la solucin deacondicionamiento y la muestra a un pH en el cual el analito noest ionizado y viceversa. Cptos neutros no son afectados por elpH.SPE de fase normalNo se utiliza el pHSPE de intercambio inicoPara retencin del analito se debe presentar que el grupofuncional del analito y la superficie de la slica tengan cargasopuestas
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PREPARACIN DE LA MUESTRACOMO USAR LA SPE
Existen tres vas para separar los compuestos de inters de lasimpurezas.
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PREPARACIN DE LA MUESTRADESARROLLO DE MTODOS DE SPE
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PREPARACIN DE LA MUESTRADESARROLLO DE MTODOS DE SPE
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PREPARACIN DE LA MUESTRAHARDWARE Y ACCESORIOS PARA EL PROCESAMIENTO DEMUESTRAS POR SPE
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PREPARACIN DE LA MUESTRAHARDWARE Y ACCESORIOS PARA EL PROCESAMIENTO DEMUESTRAS POR SPE
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PREPARACIN DE LA MUESTRAHARDWARE Y ACCESORIOS PARA EL PROCESAMIENTO DEMUESTRAS POR SPE
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PREPARACIN DE LA MUESTRAHARDWARE Y ACCESORIOS PARA EL PROCESAMIENTO DEMUESTRAS POR SPE
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PREPARACIN DE LA MUESTRAHARDWARE Y ACCESORIOS PARA EL PROCESAMIENTO DEMUESTRAS POR SPE
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PREPARACIN DE LA MUESTRAHARDWARE Y ACCESORIOS PARA EL PROCESAMIENTO DEMUESTRAS POR SPE
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PREPARACIN DE LA MUESTRAHARDWARE Y ACCESORIOS PARA EL PROCESAMIENTO DEMUESTRAS POR SPE
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PREPARACIN DE LA MUESTRAEJEMPLO DE SPE
AISLACIN DE TEOFILINA EN SUEROCartucho de extraccinC18 100 mgAjuste de la matriz de la muestraNingunaAcondicionamiento de la fase estacionaria1 mL de MeOH seguido por dos porciones de 1 mL de agua desionizadaAplicacin de la muestra100 L de suero se mezclan con 100 L de KH2PO4 0.1M (pH=4.5) quecontenga 2 g de estndar interno (b-hidroxietilteofilina)Lavado2 porciones de 1 mL cada una de agua desionizadaElucin2 alicuotas de 100 L de MeOH
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PREPARACIN DE LA MUESTRAPRETRATAMIENTO DE MUESTRAS LQUIDAS
Separacin por Membrana
Usualmente las membranas son hechas de polmeros orgnicossintticos (ej. PTFE, nylon, PVC), celulosas, o fibra de vidrio.La filtracin y la extraccin en fase slida por disco representan lasprincipales aplicaciones de preparacin de muestras por membrana.Otros ejemplos son: ultrafiltracin, smosis inversa, dilisis,microdialisis, electrodialisis, las cuales funcionan por difusin comoresultado de un gradiente qumico o electroqumico a travs de unamembrana semipermeable.
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PREPARACIN DE LA MUESTRAPRETRATAMIENTO DE MUESTRAS SLIDAS
Una muestra debe estar lquida antes de ser inyectada en elHPLC.El contacto de la muestra con un solvente permite laextraccin del analito, luego el solvente es separado delslido por decantacin, filtracin, o centrifugacin.
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PREPARACIN DE LA MUESTRAPRETRATAMIENTO DE MUESTRAS SLIDAS
Un mtodo simple es pulverizar el material y agitar lamuestra con un solvente en el cual el analito es soluble. Paraacelerar la extraccin se recomienda aumentar latemperatura y sonicacin.
La lixiviacin tambin es utilizada.
Extraccin por soxhlet es el mtodo ms ampliamenteutilizado
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PREPARACIN DE LA MUESTRAPRETRATAMIENTO DE MUESTRAS SLIDAS
Nuevos Mtodos de ExtraccinExtraccin por fluido supercrticoExtraccin asistida por microondasExtraccin acelerada con solventes
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PREPARACIN DE LA MUESTRAINTERCAMBIO DE COLUMNAS
En esta metodologa una porcin del cromatograma de lacolumna inicial Columna 1 es transferida selectivamente a lasegunda columna (columna 2) y luego se realiza la separacin.
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PREPARACIN DE LA MUESTRAINTERCAMBIO DE COLUMNAS
Esta metodologa se utiliza para:
Remover contaminantes de la columna antes de ingresar a lacolumna 2
Remover compuestos retrazados antes de ingresar a lacolumna 2
Remover interferencias que pueden solaparse con el analitoen la columna 2
Una elucin alternativa de gradiente Mejoramiento de la seal
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PREPARACIN DE LA MUESTRADERIVATIZACIN
Se realiza por medio de una reaccin qumica entre el analitoy un reactivo para cambiar las propiedades qumicas y fsicasdel analto.
Principales usos en HPLC:Mejorar la deteccinCambiar la estructura molecular o polaridad del analito paramejorar la cromatografaCambiar la matriz para que se genere una mejor separacinEstabilizar la sensibilidad del analito
La derivatizacin debe ser: rpida, cuantitativa, y producirpoco subproducto. El exceso de reactivo no debe interferircon el anlisis.
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PREPARACIN DE LA MUESTRADERIVATIZACIN
La derivatizacin es el ultimo recurso en el desarrollo de un mtodoDETECTABILIDADMuchas clases de compuestos pueden ser derivatizados
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PREPARACIN DE LA MUESTRADERIVATIZACIN
La derivatizacin es el ultimo recurso en el desarrollo de un mtodo
DETECTABILIDADLas derivatizaciones ms comunes son; adicin de un cromoforo yadicin de un fluoroforo.Las consideraciones generales a tener en cuenta en la eleccin de unreactivo de derivatizacin son:
El agente derivatizante debe ser estable El agente derivatizante y los subproductos formados durante laderivatizacin no deben ser detectables o deben ser separados delanalito El analito debe reaccionar con el reactivo derivatizante bajo lascondiciones establecidas Si es posible el reactivo no debe ser toxico el procedimiento debe ser adaptable a la automatizacin
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PREPARACIN DE LA MUESTRADERIVATIZACIN
La derivatizacin es el ultimo recurso en el desarrollo de un mtodo
DETECTABILIDADLas derivatizaciones ms comunes son; adicin de un cromoforo yadicin de un fluoroforo.Las consideraciones generales a tener en cuenta en la eleccin de unreactivo de derivatizacin son:
El agente derivatizante debe ser estable El agente derivatizante y los subproductos formados durante laderivatizacin no deben ser detectables o deben ser separados delanalito El analito debe reaccionar con el reactivo derivatizante bajo lascondiciones establecidas Si es posible el reactivo no debe ser toxico el procedimiento debe ser adaptable a la automatizacin
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PREPARACIN DE LA MUESTRADERIVATIZACIN
Derivatizacin Pre-columnaSu principal ventaja es que no existen limitacones en la cinetica de lareaccinSu principal desventaja es la posible aparicin de picos desubproductosDerivatizacin Post-columnaSu principal ventaja es minimizar la formacin de subproductos(artefactos) y que no requiere una completa reaccinSu principal desventaja es no poder aplicarse a reacciones lentas yotra es la falta de compatibilidad de las fases mviles con losreactivos.Analisis Quiral por DerivatizacinUtilizada para mejorar la separacin y no la detectibilidad
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PREPARACIN DE LA MUESTRAPREPARACIN DE LA MUESTRA vs INCERTIDUMBRE
La medicin de la incertidumbre depende de:La concentracin del analitoLas propiedades de la matrizLa tecnica de preparacin de la muestraEl principio de medicin
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LC-GC Europe julio 2002 2-5
PRETRATAMIENTO DE LA MUESTRASUGERENCIAS PARA MINIMIZAR EL ERROR EN ELTRATAMIENTO DE LA MUESTRA
1. Use una tcnica adecuada2. Usar grandes volmenes (ej. Es preferible pipetear 10 mL
en vez de 1 mL)3. Minimice el nmero de pasos4. Realizar la medicin de la muestra y el estandar en un
corto intervalo de tiempo, ademas usar el mismo equipo.5. Use un extndar interno6. Prepare un blanco (matriz sin analito)7. Realizar anlisis mltiple
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PRETRATAMIENTO DE LA MUESTRATENDENCIAS EN LA PREPARACIN DE MUESTRAS
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PRETRATAMIENTO DE LA MUESTRATENDENCIAS EN LA PREPARACIN DE MUESTRAS
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PRETRATAMIENTO DE LA MUESTRA
TENDENCIAS EN LA PREPARACIN DE
MUESTRAS
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DETECCIN Y SELECTIVIDADINTRODUCCINEn la mayora de los casos los detectores usados son UV y DAD.Por lo tanto se busca otra alternativa cuando:La muestra tiene baja absorbancia o no tieneLa concentracin del analito es demasiado baja para ladeteccinLa muestra presenta muchas interferenciasCuando se requiere informacin estructural
El tipo de detector esta relacionado con el anlisis por mediode la:SelectividadSensibilidadRuido de la lnea base
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DETECCIN Y SELECTIVIDADDETECCIN UV
Generalidades
Ley de Beer`s: se basa en la relacin entre cantidad de luzabsorbida y la cantidad de sustancia absorbente
I0: intensidad de la luz incidenteI: intensidad de la luz despus de pasara travs del espesor b de la solucin
A: absorbanciaC: concentracin: absorptividad molarLfc: longitud de la celda
IIA olog=
fcLCA =
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DETECCIN Y SELECTIVIDADDETECCIN UV
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DETECCIN Y SELECTIVIDADDETECCIN UV
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DETECCIN Y SELECTIVIDADDETECCIN UV
Eleccin de la longitud de ondaLa informacin de los espectros UV es muy importante en eldesarrollo de mtodos.
Los espectros UV se pueden encontrar:-En la literatura-Estimarse a partir de la estructura qumica de los componentes de la muestra.-Medirse directamente (si cuento con el compuesto puro) en un espectrofotmetro, uobtenerse durante la separacin por medio de un detector UV con DAD.-Cuando no se obtiene una buena respuesta con el detector UV otros detectores puedennecesitados o utilizar derivatizacin.
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DETECCIN Y SELECTIVIDADDETECCIN UV
Eleccin de la longitud de onda
Absorbancia de la muestra en funcin de su estructuramolecular
La siguiente figura muestra los espectros de una solucindiluida de dos compuestos.Si ambos compuestos son de inters 210 nm mejor opcinSi la muestra posee interferencias que complican laseparacin 240 250 nmSi IMI es el analto y AMI la interferencia (y no es un anlisis detrazas) 290 300 nm es preferida
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Figura 3.5
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DETECCIN Y SELECTIVIDADDETECCIN UV
Eleccin de la longitud de onda
Absorbancia de la muestra en funcin de su estructuramolecular
A es proporcional a la absorptividad molar del compuesto deinters. menores de 100 en anlisis de trazas posiblementeno se pueden analizar por UV.
Hidrocarburos saturados y sus derivados amino o nitrilo no sondetectables por UV
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DETECCIN Y SELECTIVIDADDETECCIN UV
Eleccin de la longitud de onda
Absorbancia de la fase mvil en funcin de su compocisin
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DETECCIN Y SELECTIVIDADDETECCIN UV
Seal, RuidoSeal (S) es la absorbancia corregida del pico del analto.Ruido (N)ancho de la lnea base
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DETECCIN Y SELECTIVIDADDETECCIN UV
La seal puede aumentarse:Incrementando la concentracin del analtoIncrementando el volumen de inyeccinIncrementando la eficiencia de la columnaDisminuyendo el factor de capacidad del analito
Linealidad del detectorLa ley de Beer se cumple para un amplio rango de medidas deabsorbancias, bsicamente para valores menores 1 UA, pero loideal es que la respuesta sea no mayor a 0.5 UA, para trabajaren un rango lineal, pero esto debe ser comprobado en lavalidacin. OJO con la concentracin y el volumen deinyeccin que mandan las Farmacopeas!!!
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DETECCIN Y SELECTIVIDADDETECCIN UV
Acercamiento Sistemtico para la Maximizacin de lasensibilidad de la deteccin UV (S/N)
1. Seleccin de la longitud de onda en el mximo de (S)2. Inyecte el mayor volumen de muestra posible (S).3. Concentre la muestra para incrementar la masa inyectada
(S)4. Reducir el K al mnimo posible (S)5. Considerar detectores alternativos (no UV) (S)6. Incrementar la constante de tiempo del detector (N)7. Reemplace la lmpara por una nueva (S, N)8. Usar un amortiguador de pulso para eliminar el ruido de la
bomba si es necesario (N)
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DETECCIN Y SELECTIVIDADDETECCIN UV
Detectores UV con Arreglo de Diodos
Permiten cromatografiar simultneamente a diferenteslongitudes de onda durante el mismo corrido.
Se obtiene el espectro UV de cada pico lo cual sirve paraseleccionar la longitud de onda optima para el corrido final.
La comparacin de los espectros permite evaluar la identidady la pureza del pico de interes.
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DETECCIN Y SELECTIVIDADDETECCIN UV
Detectores UV con Arreglo de DiodosEjemplo
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SELECCIN DEL SISTEMA PRELIMINAR
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INSTRUMENTACIN
AUTOINYECTOR
INTERFASE
DETECTOR
BOMBA
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INSTRUMENTACIN
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INSTRUMENTACIN
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PUNTO DE PARTIDAHPLC-RP o CROMATOGRAFIA LQUIDA DE FASE REVERSA
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
LA COLUMNA ES EL CORAZN DEL PROCESO DE SEPARACN
Para realizar esta seleccin es importante recolectarinformacin acerca de:
- Caracteristicas qumicas de la fase estacionaria
- Caracteristicas fisicas de la prticula
Cromatografistas deben conocer las caracteristicas qumicasde la muestra, esto representa una inversin de tiempoinicial, pero asi es ms probable obtener una columna optimapara el desarrollo del mtodo.
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Visin global de la seleccin de la columna
1. Conocer la estructura molecular de los componentes de lamuestra, para as seleccionar las caracteristicas qumicas dela fase estacionaria, tipo de enlace, endcapping y la cargade carbono.
2. Analisis del objetivo de la separacin para elegir la columnay las caracteristicas fisicas de la particula, dimensiones dela columna, la forma de la prticula, tamao de particula,area superficial, y tamao de poro.
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Visin global de la seleccin de la columna
Columnas modernas no basadas en silica (zirconio, carbongrafitizado, o polimericas) se pueden trabajar a pH de 1.0 10.0
pHs entre 2.0 7.5 son los recomendados para columnasenlazadasa silica, debido a que la expocisin a pHs extremoscidos produce la hidrlisis de la fase enlazada y a pHs basicosextremos se presenta degradacin de la silica.
EL PRECIO NO ES LO MS IMPORTANTE A LA HORA DE ELEGIR UNA COLUMNA, ES MEJOR CERSIORARNOS SI REALMENTE NOS
VA A SERVIR PARA EL TRABAJO PROPUESTO
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
PlanificacinCuantos componentes estan presentes en la muestra?Cual es la matriz de la muestra?Cuales son las estructuras de los componentes de la muestra?Cuales son los valores de pKa de los componentes de la muestra?Se tiene disponible la informacin espectral UV?Cual es el rango de concentracin de los componentes en la muestra?Cuales son los pesos moleculares?Cual es la solubilidad de la muestra y los componentes?Se necesita una completa resolucin de todos los componentes de lamuestra?Es necesario un analisis rapido?Es importante el uso de poco solvente?Es importante la estabilidad y la vida util de la columna?Es importante la maxima sensibilidad del detector?
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Eleccin de la Fase Enlazada
Fase 1Dibujar la estructura molecular detodos los componentes de lamuestra. Identificar las dosestructuras ms similares.
Fase 2Determinar las diferenciasestructurales para predecir que faseestacionaria puede separar las dosmoleculas. La retencin del analito se producepor la interaccin entre los grupos funcionales encuestin con la fase estacionaria y la fase mvil.La separacin se presenta por un proceso demigracin diferencial.
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Eleccin de la Fase Enlazada
Fase 3El uso de los resultados que arroja la comparacin de las estructurasbrinda la informacin necesaria para elegir la fase enlazada (o noenlazada).En este ejemplo un analista puede considerar la utilizacin decolumnas de silica (fase no enlazada) fase normal por la capacidadde retener y diferenciar la prednisolona y la prednisona a traves de lainteraccin con los puentes de hidrogeno.Una revisin de las fases enlazadas alternativas es indispensablepara la comprensin de las interacciones entre el soluto y la faseestacionaria.
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Eleccin de la Fase Enlazada
Fase 3
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Eleccin de la Fase Enlazada
Fase 3C18, C8, C4: Fases no polares, retencin basadas en interacciones vander Waals con los radicales hidrofobicos de las moleculas.
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Eleccin de la Fase Enlazada
Fase 3Fenilo: no polares, la retencin es una mezcla de mecanismos deinteracciones hidrofobicas y - . Su retencin es similar a la fase C8.
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Eleccin de la Fase Enlazada
Fase 3Ciano: poseen polaridad intermedia, la retencin es una mezcla demecanismos de interacciones hidrofobicas, dipolo dipolo y - . Estasfases son usadas en el analisis de compuestos organicos polares. Sepuede usar como fase normal o fase reversa.
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Eleccin de la Fase Enlazada
Fase 3Amino: es una fase polar que puede ser usada como fase normal o deintercambio, la retencin es debido a interacciones dipolo dipolo ocido base. Comunmente es usada para el analisis de carbohidratos,pero tambien a sido usada en el analisis de iones inorganicos yorganicos.
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Eleccin de la Fase Enlazada
Fase 3Silica: es una fase muy polar y es usada como cromatografia de fasenormal. Su retencin es un resultado de sus interacciones de puentesde hidrogeno con los solutos.
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Eleccin de las Caracteristicas Fsicas de la particula
La siguiente tabla (tabla 1)es usada para elegir el formato de lacolumna y las caracteristicas fsicas de la partcula. La cartapresenta una columna predeterminada para el punto departida.Perfil de una columna analitica buena para muchas aplicacines:150 mm x 4.6 mm, 5 m dp, 200 m2/g area superficial, 10% decarga de carbono, enlace monomerico, y particulas esfericas.Esto puede cambiar deacuerdo a los objetivos del metodo:
-Rapida equilibracin columnas cortas 30 50 mm-Alta resolucin menor tamao de particula, diametromenor, etc.
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Eleccin de las Caracteristicas Fsicas de la particula
Dimensiones de la columnaLongitud y diametro interno del material de relleno, rango delongitud 30 300 mm y rango de diametro 2.1 22 mm.
Forma de la partculaEsfericas (reduce la presin, alarga la vida de la columna) oirregulares (alta area superficial y alta carga de carbono, mejorresolucin)
Tamao de partcula dpEl rango es de 1.5 20 m, pequeas partculas ofrecen altaeficiencia
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Eleccin de las Caracteristicas Fsicas de la particula
Area superficialEs la suma de la superficie exterior partcular y la superficie deporo interna, en m2/g. Altas areas superficiales proveen mayorretencin, capacidad, y resolucin para separaconescomplejas.
Tamao de poroTamao promedio de las cavidades presentes entre partculas,rango entre 60 10000 . Su eleccin depende del MW delsluto.
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PUNTO DE PARTIDA
SELECCIN DE LA COLUMNAEleccin de las Caracteristicas Fsicas de la particulaTipo de enlacesEs el tipo de enlace entre la fase enlazada (radical) y la basede silicaMonomerico: un solo punto de enlace. provee rapida equilibracin y altaeficiencia.Polimerico: multiple puntos de enlace. Provee mayor estabilidad de lacolumna, aceptan altas cargas de muestra
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Eleccin de las Caracteristicas Fsicas de la particula
Carga de carbonoEs la cantidad de fase enlazada al material de base, expresadocomo porcentaje de carbono.Altas cargas de carbono mayor resolucin y largos tiempo decorrido en muestras hidrofobicasBajas cargas de carbono bajos tiempos de corrido y amenudo presenta diferente selectividad
endcappingEs una cubierta de cadenas cortas de hidrocarburos despues delenlace primario para inactivar los silanoles. Reduce el pico delos tailing de las bases con grupos nitrogenados.
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Un Ejemplo Real
En este ejemplo, el objetivo es obtener un analisis rapido conalta resolucin.Muestra: mezcla de flavonoides naturales
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Un Ejemplo Real
Basandonos en el analisis de los grupos funcionales elejimos lapareja de flavonoides estructuralmente ms parecidas.Estas estructuras sugieren que fasesenlazadas tales como fenil o ciano sonla mejor opcin, debido a que ofrecenuna mezcla de mecanismos deretencin (hidrofobico y - ). La nuve del grupo funcional de la fase enlazadainteractua de diferente grado entrenaringenina y apigenina.
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Un Ejemplo Real
Analisis rapido columnas cortas, baja area superficial, y bajacarga de carbono.
Alta resolucin columna larga, pequeo tamao de partcula,y alta carga de carbono.
Unificando criterios. Columna 53 mm x 7 mm, 3 m dp, 350m2/g, 16% de carga de carbono.
Se realizaron tres ensayos ver figura
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
La superficie de la silica puede contener muchas clases degrupos silanoles, los cuales pueden causar fuertes enlaces consolutos bsicos debido a sus caractersticas cidas.La pureza de la silica de soporte es de mucho interes en laseparacin de muchos compuestos polares. Algunas silicas estancontaminadas por diferentes metales M+ (Fe, Al, Ni, Zn, etc.).Estos metales se pueden complejar con solutos quelantes,provocando picos asimtricos, tailing o reteniendoirreversiblemente algunos compuestos
Si
OHSi
OHHO OH
Si
OH
SiM+
------- SiMOH
Silanol libre Metal interno(activa silanol)
Silanoles geminales Silanoles asociados Metal superficie
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
silica tipo A: menos pura y ms cida,puede ser usada para el anlisis decompuestos neutros y no ionizables
Silica tipo B: pura y menos cida,especial para el anlisis de compuestosionicos y principalmente bases aminas.
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Especificaciones:
Nmero de platos tericos Factor de asimetra del pico (As) Selectividad () entre dos solutos diferentes Presin de la columna Reproducibilidad de la retencin (k) Concentracin de la fase enlazada (si es aplicable) estabilidad de la columna
Los fabricantes suministran en el certificado de la columna lasprimeras cuatro especificaciones. Las ultimas a veces no seconsiguen pero pueden encontrarse en artculos cientficos.
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Especificaciones:
expresar la idea de inicializacin de columnas segn formatos
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LIMPIEZA Y REGENERACIN DE COLUMNAS HPLC DE FASE
REVERSA
LC/GC 21, 1, 19-26 (2003)
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RP-HPLC Tcnica ms usada en LC. Su popularidad se debe a que es aplicable a muchos analitos no polares, ionizables y polares neutros.
Como la F.E. de RP-HPLC es de naturalezahidrofbica la separacin ocurre por este tipo deinteraccin.
Ojo con los componentes hidrfobos de las matrices !
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Existen muchos tipos de F.E. en R.P.-HPLC, pero las ms populares son lasbasadas en silica Tabla I.Otros materiales utilizados diferentes a lasilica son:
Polmeros, silica y alumina con recubiertapolimrica, hbridos orgnico-inorgnico,zirconio, carbono grafitizado
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Las columnas RP-HPLC utilizan amplia variedad de F.M. Y aditivos,estos ltimos pueden modificar y contaminar la superficie del materialde empaque.
Silanoles residuales Figura 1, puedeninteractuar con sustancias de carcterbsico de la matriz. [ ] de iones metlicos (silica tipo A >100 ppm) dan mayor acidez a lasuperficie y tambin actan comoquelantes o scavenging
FJOR
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Los usuarios deben ser conocedoresde las caractersticas de la superficiede su fase estacionaria y de posiblesinteracciones analito-superficie.Despus que una columna estacontaminada su desempeocromatogrfico cambia
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Que Causa el Aumento de Contaminantes en Columnas RP
Matrices con:sales eluyen con el V0 pico, manchas o problema de lnea baseCptos hidrofbicos son absorbidos o adsorbidos acumulacin enla cabeza de la columnaCptos de retencin intermedia eluyen lentamente picos anchos,picos fantasmas, problemas de lnea base o deriva
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Lavado de Columnas Enlazadas a SilicaLa clave es conocer la naturaleza de los contaminantes y encontrar un solvente
apropiado que los remueva
Se deben tener en cuenta los volmenes de columna
Ej: los lpidos se pueden remover con 20 volmenes de columna de solvente orgnico
No pasar inmediatamente solvente orgnico si se esta usando FMbuffereada. En cambio pasar la FM reemplazando el buffer por agua,despus de 10 volmenes de columna se puede pasar el solvente fuerte
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Lavado de Columnas Enlazadas a SilicaA veces, los solventes fuertes no son suficiente pararemover los contaminantes. Visite sitios web de fabricantesde columnas para ver recomendaciones.
Importante: Cada solvente en la serie debe ser miscible con el siguiente y va desde el ms polar al menos polar o
ms apolar
Un sistema de lavado recomendado es:1100% MeOH1100% AcN775% AcN 25% IPA1100% IPA1100% CH3Cl1100% Hexano IPA buen solvente intermedio,
pero muy viscoso
Pasar 10 volmenes de columna de c/ solvente
FJOR
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Si se sospecha de fallas severas, se puede mezclar dimetil sulfoxido (DMSO) o dimetil formamida con agua 50:50 a un flujo de 0.5 mL/min.
Se puede invertir la columna?
Recomendaciones:PProgramar el lavado de las columnas en la noche
DDesconectar la columna del detector durante el lavado
Lavado de Columnas Enlazadas a Silica
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Lavado de Columnas Enlazadas a Silica Contaminadas de Residuos ProteicosInicialmente se debe pasar por la columna fase mvil con unporcentaje mayor de solvente fuerte.Gradientes de cido trifluoroacetico acuoso y cido trifluoroacetico propanol
Despus de limpiar la columna con guanidina o urea, usar un mnimo de 40 50 volmenes de columna de agua grado HPLC.
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Lavado de Columnas Enlazadas a Silica Contaminadas de Residuos Proteicos
Enjuague con 20 volmenes de la columna de fase mvil con buffer. Gradiente: A) 0.1% aqueous TFA in water B) 0.1% TFA in Acetonitrile/Isopropanol (1:2) 25% B 100% B for 30 minutes
No usar detergentes
Tambin se debe consultar las recomendaciones de los fabricantes
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Tecnicas Especiales para el Lavado de Columnas RP Enlazadas a Silica
Si iones metlicos son adsorbidos por la silica utilizar EDTA y luego pasar agua 20, pasar 50 volmenes de columna y luego 50 volmenes.
En caso de matrices bsicas, se remueven ajustando el pH a menos de 3 y matrices cidas con pH por encima del pKa 8 o 9.
En caso de crecimiento bacteriano; utilizar blanqueador casero diluido 1:10 o 1:de columna de agua HPLC.
Par inico, 20 volmenes de columna con la misma fase mvil cambiando el par inico por agua
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Retencin de Compuestos Polares:Cuando los tiempos de retencin se encuentran muy cercanos at0, k < 2, el proceso cromatogrfico se realiza en su mnimaexpresin. Para esto existen tcnicas para incrementar laretencin de los compuestos polares.
Ajustar el pHSuprimir la ionizacin de compuestos cidos con bajos pHs,una buena alternativa es buffer fosfato de 10 20 mM a pH de2.5.Compuestos bsicos requieren de pHs por encima de 8.0 parasuprimir la ionizacin. Para esto se requiere de columnasespeciales desarrolladas por diferentes firmas.
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Retencin de Compuestos Polares:
Columnas con mayor poder de retencinPreferir columnas C18 en cambio de C8Elegir columnas con alta carga de carbono especialmente enempaques basados en silica polimrica
Usar poca aguaSi el compuesto eluye a t0 con un 5% de fase orgnica, puedeser posible mejorar la retencin disminuyendo el % de faseorgnica, pero, esto puede colapsar la fase enlazadacambiando as la retencin de la columna. Por lo tanto esto sedebe hacer muy cuidadosamente.Existen columnas diseadas para este propsito (embeddedpolar phase), las cuales toleran hasta el 100 % de agua.
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Retencin de Compuestos Polares:
PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Retencin de Compuestos Polares:
Apareamiento inicoSi el problema contina utilicereactivos de par ionico en la fase mvil
Cromatografa de fase normalEs una herramienta que no podemosolvidar, pero debemos tener en cuentaque es muy fuerte la retencin de loscompuestos polares en este tipo decromatografa
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Caracterizacin de la Selectividad:
La selectividad vara entrediferentes columnas y entrediferentes lotes de la mismacolumna.
Columna A Columna B Columna C
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Problemas y Remedios: Retencin y Resolucin IrreproducibleSi la retencin de los analitos no se repite corrido ha corrido, esimposible obtener conclusiones exactas las cuales ayuden a realizarcambios para mejorar la separacin. Valores de K y no debencambiar ms de 2 a 3 %
TABLA 5.11
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Problemas y Remedios: Retencin y Resolucin Irreproducible
Solucin de problemas de irreproducibilidad ocasionadospor la columna en un desarrollo de mtodos.
1. Seleccionar una buena columna de soporte purificado y menos cidos ymantener la misma fase estacionaria, tamao de partcula y dimensionesde la columna a traves del desarrollo
2. Elimine efectos qumicos o silanoles usando condiciones favorablesde fase mvil (pH, tipo y concentracin de buffer, aditivos, etc.)
3. Asegurece que la columna esta totalmente equilibrada con la fase mvil.4. Use tcnicas apropiadas que aseguren operaciones reproducibles da
da.5. Use grficos de retencin para proveer una accin correctiva cuando es
requerida6. Califique las columnas.
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Problemas y Remedios: Tailing
Una columna defectuosa de fbrica (mal empacada) es unafuente de asimetra. Esto se puede evidenciar en la calificacincon un compuesto neutro, en caso que este compuestopresente tailing es mejor solicitar al proveedor un cambio decolumna.Luego de un uso inadecuado oprolongado de la columnapuede presentarsen picos pocossimtricos por taponamientode la frita, vacios internos dela columna o columnas mallavadas.
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Problemas y Remedios: Porque se Daan las Columnas?
Empaquetamiento o frita parcialmente bloqueadoImpurezas de la muestra parcialmente adsorbidasColumnas mal ampaquetadasCambios bruscos mecnicos o trmicos crean espacios vaciosCambios bruscos qumicos (solventes, buffers)Ataque qumico al soporte o a la fase estaconaria
SINTOMAS:Incremento de la presin de la columnaTailingPoca reproducibilidad corrido corridoPrdida de platos teoricosDisminucin de selectividadDisminucin de la retencin (k)
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Problemas y Remedios: Porque se Daan las Columnas?
Fig 5.13
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Problemas y Remedios: Porque se Daan las Columnas?
Problemas con la frita de la columna
Principalmente se debe al taponamiento de la frita, si se sospechaeste problema, lo puedes confirmar corriendo un estndar con unascondiciones de operacin conocidas.Solucin: cambie la frita, al cambiarla chequee si hay espaciosvacios, si los hay rellenarlos.
Si no podemos cambiar la frita, la columna puede ser invertida ylavada con un solvente fuerte para liberar el material que gener laobstruccin.
Ojo desconectarla del detector!
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Problemas y Remedios: Porque se Daan las Columnas?
Componentes de la muestra fuertemente unidos
Los compuestos no eluidos son un problema especialmente demuestras complejas tales como extractos de tejidos o fluidosbiologicos, formulaciones con compuestos grasos, etc. Seales deeste problema son picos anchos y con tailing.
Este problema puede ser prevenido usando precolumnas
Hacer un buen lavado de la columna
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Problemas y Remedios: Porque se Daan las Columnas?
Columnas mal empaquetadas
La compactacin de la columna a menudo puede ser poca, lo cual enmuy poco tiempo genera epacios vacios en la columna. Dificil dedetectar.
Efectos de la presin
Ojo con los cambios bruscos de presin y de temperatura
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Problemas y Remedios: Porque se Daan las Columnas?
Ataque qumico
Eliminar fases moviles que producen la perdida de la fase enlazada(seguir las recomendaciones del fabricante). Temperatura y pHs .
Otros factores
Contaminacin microbiana
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Problemas y Remedios: Porque se Daan las Columnas?
Problemas con la frita de la columnaPrincipalmente se debe al taponamiento de la frita, si se sospechaeste problema, lo puedes confirmar corriendo un estandar con unascondiciones de operacin conocidas.Solucin: cambie la frita, al cambiarla chequee si hay espaciosvacios, si los hay rellenarlos.
Si no podemos cambiar la frita, la columna puede ser invertida ylavada con un solvente fuerte para liberar el material que genero laobstruccin. Ojo desconectarla del detector!
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA COLUMNA
Como proteger la Columna y Prolongar su Vida
1. Use columnas bien enpacadas2. Evite cambios bruscos mecanicos y termicos3. Use guardacolumna y/o filtro en linea4. Lave la columna frecuantemente con solvente fuerte5. Realice un buen pretratamiento de la muestra para evitar
particulas y componentes fuertemente retenidos6. Use fases estacionarias estables7. Use buffers organicos a pHs de (6-8) ej: citrato8. Trabaje la columna a temperaturas < 40C9. Trabaje dentro del rango de pH recomendado por el fabricante10. Cambie el agua y los buffers diariamente o adicione 200 ppm de
azida11. Almacene las columnas en solvente organico 100 %12. Realice un seguimiento de las columnas (hoja de vida)
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DEL FLUJO
Para una columna de 125 o 250 mm x 4.6 mm, 5 m, C8 o C18,flujos de 0.5 a 2.0 mL/min (preferiblemente 1.0) sonrecomendados debido a:
Tiempos de corrido < 15 min para k < 20
Genera presiones < 2500 psi para cualquier fase mvilcompuestas por mezclas de agua, AcN y/o MeOH.
A estos flujos se presenta buen nmero de platos teoricos
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA TEMPERATURA
En el punto de partida la temperatura ideal de trabajo estaentre 30 40 C.
Algunos laboratorios poseen variaciones de 5C o ms, lo cualgenera problemas en la separacin.
Como regla general: la retencin varia de 1-3% por cada C
C
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA TEMPERATURA
Temperatura vs Tiempo de Retencin
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA TEMPERATURA
Temperatura vs Selectividad
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA TEMPERATURA
Temperatura vs Forma del Pico
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA TEMPERATURA
Temperatura vs Efectos Combinados
Precalentamiento de la FM a 56C
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA FASE MVIL
FASE MVIL
MEZCLAS AGUA:MODIFICADOR ORGNICO (MeOH, AcN O THF) + ADITIVOS SI ES NECESARIO.
SELECCIN DEL SOLVENTE ORGNICO
Muchos CROMATOGRAFISTAS descuidan la eleccin del solventeorgnico en el desarrollo del mtodo.Para obtener un buen resultado, debemos considerar lascaractersticas qumicas y fsicas, adems la pureza delsolvente. Por todo esto se debe tener en cuenta laspropiedades de estos solventes.
FM EL VERDADERO MOTOR DE LA SEPARACIN
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA FASE MVIL
SELECCIN DEL SOLVENTE ORGNICO
PODER SOLUBILIZANTE DE LA MUESTRALa muestra a inyectar debe ser completamente disuelta, serecomienda que el solvente diluyente sea la misma FM. Evitarla precipitacin de las muestras al entrar en contacto con la FM
REACTIVIDADEvitar toda reactividad entre la muestra y la fase mvil
UV CUTOFF Y COMPATIBILIDAD CON EL DETECTORDefine la longitud de onda en la cual la absorbancia delsolvente en una celda de 1 cm es igual a 1 UA, usando agua enla celda de referencia. ELEGIR SOLVENTES TRANSPARENTES ALUV.
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA FASE MVIL
SELECCIN DEL SOLVENTE ORGNICO
UV CUTOFF Y COMPATIBILIDAD CON EL DETECTOR
Figura 3 articulo seleccin de solventes parte 1
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA FASE MVIL
SELECCIN DEL SOLVENTE ORGNICO
PUNTO DE EBULLICINNo bajo punto de ebullicin por problemas de volatilidad yburbujas en la bomba. Si puntos de ebullicin intermedio. punto ebullicin : viscosidad.
VISCOSIDADRelacionada con la presin del sistema y con la separacin delsistema. Se desean solventes de baja viscosidad.
SEGURIDADSe debe evitar el empleo de solventes que, por suscaractersticas (inflamabilidad y toxicidad), representan unriesgo para el cromatografistas.
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA FASE MVIL
SELECCIN DEL SOLVENTE ORGNICO
PUREZATrabajar con solventes grado HPLC
PROPIEDADES QUMICASIndice de polaridad: fuerza de interaccin de solventes frente asolutos polaresFuerzas dispersivas: indican la polarizabilidad de una molcula yaumentan con el nmero de electrones de la misma y con la distanciade estos al ncleo.Capacidad aceptora y donadora de protones: medida de capacidadde las mleculas para intercambiar protonesMomento dipolar: se refiere a la capacidad de una molcula paraformar dipolos permanentes y est estrechamente relacionado con laconstante dielctrica del solvente
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Debido a su baja viscosidad, poca absorbancia al UV, poca reactividad es conveniente comenzar con AcN, pero tambien es vlido comenzar con MeOH.
PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA FASE MVIL
SELECCIN DEL SOLVENTE ORGNICO
En RP-HPLC poseemos tres opciones: THF, AcN y MeOH, cadasolvente tiene una selectividad diferente
SOLVENTE UV CUTOFF VISCOSIDAD (Cp)
PUNTO DE EBULLICIN (C)
POLARIDAD (P)
VALOR ELEUTROPICO
AcNMeOHTHF
190205212
0.380.550.55
81.6064.7066.00
5.85.14.0
3.11.03.7
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Compuestos neutros H2OCompuestos ionicos requiere control del pH para obtener mtodos reproducibles, por lo tanto se requiere que los compuestos esten totalmente protonados o totalmente ionizados. Esto se consigue si el pH de la fase mvil esta por lo menos 1.5 unidades por encima o por debajo del pKa
PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA FASE MVIL
SELECCIN DE LA FASE ACUOSAAGUA:Solvente ms utilizado en HPLC, el agua destilada no essuficiente debido a la presencia de sustancias orgnicasdisueltas (aftalotos, cloraminas, etc) pudiendo modificar laselectividad de la columna.Ojo con el crecimiento bacteriano. Cambiar diariamente elagua.
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA FASE MVIL
SELECCIN DEL BUFFERUn buffer es una solucin que resiste cambios de pH cuando haypequeos incrementos de acido o base.
Compuestos inicos requieren control de pH para:
-Lograr un grado determinado de ionizacin del compuesto y lacolumna
-Mejorar la forma del pico
-Controlar la selectividad
-Lograr reproducibilidad de la separacin
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA FASE MVIL
SELECCIN DEL BUFFERSe debe conocer el pKa de la muestra y del buffer. Ademas laestabilidad de la muestra y la columna con respecto al pH.El pH de la fase mvil debe controlarse por la adicin de buffer.La medicin del pH en una FM que contenga solvente orgnicoes imprecisa.
Consideraciones a tener en cuenta:
Capacidad bufferanteEs determinada por; el pH, el pKa y la concentracin delbuffer.Solo a un rango de pH de pKa 1.0 el buffer es efectivoLa concentracin de 10 a 50 mM es adecuada
-
ELECCIN DEL BUFFER
Buffer Pka Rango BufferanteFosfato
Citrato
2.17.212.33.14.75.4
1.1 3.16.2 8.2
11.3 13.32.1 4.13.7 5.74.4 6.4
FormatoAcetatoCarbonato
3.84.86.4
2.8 4.83.8 5.85.4 7.4
-
PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA FASE MVIL
SELECCIN DEL BUFFERPor qu el pH de la fase mvil cambia al adicionar metanol?
cul pH es el correcto?qu pH necesito usar?
Medicin del pH acuosopH=-log[H+] Sorensen 1909pH=-log aH nueva definicin (actividad de hidrogeno)
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA FASE MVIL
SELECCIN DEL BUFFER
Opciones para preparar un bufferPrograma buffer calculatorhttp://www.bi.umist.ac.uk/users/mjfrbn/buffers/Makebuf.aspAproximacin empiricaPor medio de la ecuacin de disociacin
Solubilidad de los buffer en los solventes organicos (MeOH,AcN, THF)
todos los buffers son ms solubles en MeOH y menos solublesen THF
la solubilidad de los cationes en agua se comporta NH4 > K >Na
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PUNTO DE PARTIDASELECCIN DE LA FASE MVIL
ADITIVOS
Sales de alkil amonio, sulfonatosEj: tetrabutilamonio, hexano sulfonato de sodio
alkilaminasEj: trietilamina, dietilamina
miscelaneosEj: compuestos para cambar la selectividad, para complejar(edta), etc
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PUNTO DE PARTIDAHPLC-RP o CROMATOGRAFIA LQUIDA DE FASE REVERSA
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OPTIMIZACIN DEL MTODO AJUSTE DE LOS PARMETROS CROMATOGRFICOS
Son herramientas cuantitativas que miden la calidad de la separacin
Tiempo de retencin tR
Factor de capacidad k
Asimetra o Factor de tailing As o fT
Platos tericos N
Selectividad
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OPTIMIZACIN DEL MTODO LA RETENCIN
tR : Medida del tiempo transcurrido entre la inyeccin y laparte ms alta del picoAyuda a caracterizar los compuestos.
EL FACTOR DE RETENCIN O DE CAPACIDAD
k: Este parmetro es ms usado que el tRSi k es pequeo; la retencin es muy poca y el pico tiende a tener problemas con interferencias en el frente del solvente.Si k es grande; el pico es ancho y difcil de detectar.
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OPTIMIZACIN DEL MTODO
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OPTIMIZACIN DEL MTODO
FACTOR DE RETENCIN O DE CAPACIDAD
El tR es afectado por los cambios de flujo y de tamao de lacolumna, mientras que k permanece constante. Pero el tR y kvarian con cambios en la fase mvil o de la temperatura.
H2O - k MeOH o AcN - k en el pH - k
T - k
Rangos Apropiados de k1 pico 2
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OPTIMIZACIN DEL MTODO ASIMETRIA O TAILING (COLA) DEL PICOForma Gaussiana ideal, pero en la prctica la gran mayorade los picos se presentan con tailing
El tailing se minimiza con columnas de slica tipo B, con fasesmviles con bajo pH y con aditivos tales como la TEA 30 mM
Relacin entre la Asimetra y el factor de tailing del pico
Factor de tailing10 %
Factor de asimetra
5 %1.01.31.61.92.22.5
1.01.21.41.61.82.0
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OPTIMIZACIN DEL MTODO ASIMETRIA O TAILING (COLA) DEL PICO
Picos con poca asimetra generan:
nmero de platos tericos y resolucin con poca exactitud
imprecisin en la cuantificacin
poca reproducibilidad en la retencin
pequeos picos solapados en la cola del pico anterior
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OPTIMIZACIN DEL MTODO ASIMETRIA O TAILING (COLA) DEL PICO
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OPTIMIZACIN DEL MTODO ASIMETRIA O TAILING (COLA) DEL PICO
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OPTIMIZACIN DEL MTODO PLATOS TERICOSLa eficiencia aumenta al aumentar el valor de N
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OPTIMIZACIN DEL MTODO PLATOS TEORICOSUna columna nueva que contenga partculas de 5 m generan80,000 platos tericos/m usando las condiciones de prueba delfabricante, aunque esto depende tambin de otros parmetros.sin embargo es ms conveniente probar la columna durantecada anlisis con el analito de inters usando el SST.Para este propsito, N puede ser estimado de la siguientemanera.
Donde L es la longitud de la columna en cm y dp es el dimetrode partcula en micrmetros.
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OPTIMIZACIN DEL MTODO PLATOS TERICOSAs, una columna de 150 mm con partculas de 5 m debe tenerun N de 9000 bajo condiciones prcticas
Como puede aumentar N:
disminuyendo el flujo empleando columnas largas usando partculas pequeas
acoplando columnasaaumentando la temperatura empleando columnas nuevas
optimizando el equipoMminimizando los efectos extracolumna
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OPTIMIZACIN DEL MTODO PLATOS TERICOS
Efectos Extracolumna
DetectorTamao de la celda, constante de tiempo () a menor mayor velocidad derespuesta pero aumenta el ruido.
TuberiasAcotarlas y disminuir el dimetro
Volumen de inyeccin
Disolver las muestras en fase mvil o en un solvente de menor fuerza
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OPTIMIZACIN DEL MTODO RESOLUCINMide la calidad de la separacin entre dos picos
Aunque estas ecuaciones son una buena herramienta laecuacin ms completa para medir la resolucin es:
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OPTIMIZACIN DEL MTODO REGULACIN DE LA SELECTIVIDAD
si no existe separacin es igual a 1 y su valor aumenta con elaumento de la separacin.
Habitualmente las modificaciones de se consiguen cambiandolas propiedades qumicas de los solventes de elucin.
AJUSTE DE LA FUERZA DEL SOLVENTEComenzar con 90% a 100% de solvente orgnico e irreducindolo en concentraciones del 10% hasta que los tiemposde retencin se encuentren entre un k de 1 a 20.
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OPTIMIZACIN DEL MTODO REGULACIN DE LA SELECTIVIDADAJUSTE DE LA FUERZA DEL SOLVENTE
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OPTIMIZACIN DEL MTODO REGULACIN DE LA SELECTIVIDAD TIPO DEL SOLVENTE
Pasos:Ajuste la concentracin de solvente orgnico hasta que los picos se encuentren en laregin de 1
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OPTIMIZACIN DEL MTODO REGULACIN DE LA SELECTIVIDAD
pH DE LA FASE MVILComo se dijo anteriormente el pH afecta solo a los compuestosinicos.Se recomienda trabajar a pH 2.5 inicialmente, teniendo encuenta trabajar a pH 1.5 unidades por encima o por debajodel pKa del compuesto de inters.Para ajustar el pH se recomienda hacer pequeos cambios de(0.5 unidades)
Se sugiere fases mviles de pH bajo (2.0-3.0) para as suprimirla ionizacin de los compuestos cidos y de los grupos silanolesresiduales implicados en el tailing de bases nitrogenadas.
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OPTIMIZACIN DEL MTODO REGULACIN DE LA SELECTIVIDADpH DE LA FASE MVIL
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OPTIMIZACIN DEL MTODO REGULACIN DE LA SELECTIVIDADpH DE LA FASE MVIL
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OPTIMIZACIN DEL MTODO REGULACIN DE LA SELECTIVIDADpH DE LA FASE MVIL
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OPTIMIZACIN DEL MTODO ELECCIN DEL BUFFER
Absorbancia en el UVSolubilidad, Estabilidad, interaccin con la muestra o columna,volatilidad, corrosin.
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OPTIMIZACIN DEL MTODO
REGULACIN DE LA SELECTIVIDAD
TEMPERATURA DE LA COLUMNAComo regla general en LC-RP se esperan cambios en laselectividad del 1-3% por cada C de temperatura que se cambie.
El control de la temperatura es importante para tener tiempos deretencin reproducibles.
SELECTIVIDAD DE LA COLUMNA
AMINAS
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OPTIMIZACIN DEL MTODO REGULACIN DE LA SELECTIVIDADTEMPERATURA DE LA COLUMNA
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CROMATOGRAFIA DE PAR IONICO Antes de explorar la cromatografa de par inico IPC debe
explorarse la cromatografa de fase reversa
BASES DE LA RETENCIN
El reactivo de par inico es atrado por la fase estacionariadebido a los grupos hidrofbicos.Utilizado para sustancias altamente hidroflicas, cidos o basesionizados
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CROMATOGRAFIA DE PAR IONICO pH y Apareamiento Inico
Figura 7.9 b y c
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CROMATOGRAFIA DE PAR IONICO Concentracin de Reactivo de Par Ionico
Nmero de diapositiva 1Nmero de diapositiva 2Nmero de diapositiva 3Nmero de diapositiva 4Nmero de diapositiva 5Nmero de diapositiva 6Nmero de diapositiva 7Nmero de diapositiva 8Nmero de diapositiva 9Nmero de diapositiva 10Nmero de diapositiva 11Nmero de diapositiva 12Nmero de diapositiva 13Nmero de diapositiva 14Nmero de diapositiva 15Nmero de diapositiva 16Nmero de diapositiva 17Nmero de diapositiva 18Nmero de diapositiva 19Nmero de diapositiva 20Nmero de diapositiva 21Nmero de diapositiva 22Nmero de diapositiva 23Nmero de diapositiva 24Nmero de diapositiva 25Nmero de diapositiva 26Nmero de diapositiva 27Nmero de diapositiva 28Nmero de diapositiva 29Nmero de diapositiva 30Nmero de diapositiva 31Nmero de diapositiva 32Nmero de diapositiva 33Nmero de diapositiva 34Nmero de diapositiva 35Nmero de diapositiva 36Nmero de diapositiva 37Nmero de diapositiva 38Nmero de diapositiva 39Nmero de diapositiva 40Nmero de diapositiva 41Nmero de diapositiva 42Nmero de diapositiva 43Nmero de diapositiva 44Nmero de diapositiva 45Nmero de diapositiva 46Nmero de diapositiva 47Nmero de diapositiva 48Nmero de diapositiva 49Nmero de diapositiva 50Nmero de diapositiva 51Nmero de diapositiva 52Nmero de diapositiva 53Nmero de diapositiva 54Nmero de diapositiva 55Nmero de diapositiva 56Nmero de diapositiva 57Nmero de diapositiva 58Nmero de diapositiva 59Nmero de diapositiva 60Nmero de diapositiva 61Nmero de diapositiva 62Nmero de diapositiva 63Nmero de diapositiva 64Nmero de diapositiva 65Nmero de diapositiva 66Nmero de diapositiva 67Nmero de diapositiva 68Nmero de diapositiva 69Nmero de diapositiva 70Nmero de diapositiva 71Nmero de diapositiva 72Nmero de diapositiva 73Nmero de diapositiva 74Nmero de diapositiva 75Nmero de diapositiva 76Nmero de diapositiva 77Nmero de diapositiva 78Nmero de diapositiva 79Nmero de diapositiva 80Nmero de diapositiva 81Nmero de diapositiva 82Nmero de diapositiva 83Nmero de diapositiva 84Nmero de diapositiva 85Nmero de diapositiva 86Nmero de diapositiva 87Nmero de diapositiva 88Nmero de diapositiva 89Nmero de diapositiva 90Nmero de diapositiva 91Nmero de diapositiva 92Nmero de diapositiva 93Nmero de diapositiva 94Nmero de diapositiva 95Nmero de diapositiva 96Nmero de diapositiva 97Nmero de diapositiva 98Nmero de diapositiva 99Nmero de diapositiva 100Nmero de diapositiva 101Nmero de diapositiva 102Nmero de diapositiva 103Nmero de diapositiva 104Nmero de diapositiva 105Nmero de diapositiva 106Nmero de diapositiva 107Nmero de diapositiva 108Nmero de diapositiva 109Nmero de diapositiva 110Nmero de diapositiva 111Nmero de diapositiva 112Nmero de diapositiva 113Nmero de diapositiva 114Nmero de diapositiva 115Nmero de diapositiva 116Nmero de diapositiva 117Nmero de diapositiva 118Nmero de diapositiva 119Nmero de diapositiva 120Nmero de diapositiva 121Nmero de diapositiva 122Nmero de diapositiva 123Nmero de diapositiva 124Nmero de diapositiva 125Nmero de diapositiva 126Nmero de diapositiva 127Nmero de diapositiva 128Nmero de diapositiva 129Nmero de diapositiva 130Nmero de diapositiva 131Nmero de diapositiva 132Nmero de diapositiva 133Nmero de diapositiva 134Nmero de diapositiva 135Nmero de diapositiva 136Nmero de diapositiva 137Nmero de diapositiva 138Nmero de diapositiva 139Nmero de diapositiva 140Nmero de diapositiva 141Nmero de diapositiva 142Nmero de diapositiva 143Nmero de diapositiva 144Nmero de diapositiva 145Nmero de diapositiva 146Nmero de diapositiva 147Nmero de diapositiva 148Nmero de diapositiva 149Nmero de diapositiva 150Nmero de diapositiva 151Nmero de diapositiva 152Nmero de diapositiva 153Nmero de diapositiva 154Nmero de diapositiva 155Nmero de diapositiva 156Nmero de diapositiva 157Nmero de diapositiva 158Nmero de diapositiva 159Nmero de diapositiva 160Nmero de diapositiva 161Nmero de diapositiva 162Nmero de diapositiva 163Nmero de diapositiva 164Nmero de diapositiva 165Nmero de diapositiva 166Nmero de diapositiva 167Nmero de diapositiva 168Nmero de diapositiva 169Nmero de diapositiva 170Nmero de diapositiva 171Nmero de diapositiva 172Nmero de diapositiva 173Nmero de diapositiva 174Nmero de diapositiva 175Nmero de diapositiva 176Nmero de diapositiva 177Nmero de diapositiva 178Nmero de diapositiva 179Nmero de diapositiva 180Nmero de diapositiva 181Nmero de diapositiva 182Nmero de diapositiva 183Nmero de diapositiva 184Nmero de diapositiva 185Nmero de diapositiva 186Nmero de diapositiva 187Nmero de diapositiva 188Nmero de diapositiva 189Nmero de diapositiva 190Nmero de diapositiva 191Nmero de diapositiva 192Nmero de diapositiva 193Nmero de diapositiva 194Nmero de diapositiva 195Nmero de diapositiva 196Nmero de diapositiva 197Nmero de diapositiva 198Nmero de diapositiva 199Nmero de diapositiva 200Nmero de diapositiva 201Nmero de diapositiva 202Nmero de diapositiva 203Nmero de diapositiva 204Nmero de diapositiva 205Nmero de diapositiva 206Nmero de diapositiva 207Nmero de diapositiva 208Nmero de diapositiva 209Nmero de diapositiva 210Nmero de diapositiva 211Nmero de diapositiva 212Nmero de diapositiva 213Nmero de diapositiva 214Nmero de diapositiva 215Nmero de diapositiva 216Nmero de diapositiva 217Nmero de diapositiva 218Nmero de diapositiva 219Nmero de diapositiva 220Nmero de diapositiva 221Nmero de diapositiva 222Nmero de diapositiva 223Nmero de diapositiva 224Nmero de diapositiva 225Nmero de diapositiva 226Nmero de diapositiva 227Nmero de diapositiva 228Nmero de diapositiva 229Nmero de diapositiva 230Nmero de diapositiva 231Nmero de diapositiva 232Nmero de diapositiva 233Nmero de diapositiva 234Nmero de diapositiva 235Nmero de diapositiva 236Nmero de diapositiva 237Nmero de diapositiva 238Nmero de diapositiva 239Nmero de diapositiva 240Nmero de diapositiva 241Nmero de diapositiva 242Nmero de diapositiva 243