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FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ - FIOCRUZ
INSTITUTO AGGEU MAGALHÃES
MESTRADO ACADÊMICO EM BIOCIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA EM SAÚDE
DERCILIANO LOPES DA CRUZ
DETECÇÃO DE ALELOS ASSOCIADOS À RESISTÊNCIA AOS INSETICIDAS
QUÍMICOS NO VETOR DA MALÁRIA (ANOPHELES ARABIENSIS) EM
SANTIAGO, CABO VERDE
RECIFE
2018
DERCILIANO LOPES DA CRUZ
Detecção de alelos associados à resistência aos inseticidas químicos no vetor da malária
(Anopheles arabiensis) em Santiago, Cabo Verde
Dissertação apresentada ao curso de mestrado
em Biociências e Biotecnologia em Saúde do
Instituto Aggeu Magalhães, Fundação
Oswaldo Cruz, como requisito principal para
obtenção do título de Mestre em Ciências.
Área de Concentração: Biologia Celular e
Molecular Básica e Aplicada
Orientadora: Dra. Constância Flávia Junqueira Ayres
Coorientador: Dr. Marcelo Henrique Santos Paiva
RECIFE
2018
Catalogação na fonte: Biblioteca do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
C957c
Cruz, Derciliano Lopes da.
Detecção de alelos associados à resistência aos
inseticidas químicos no vetor da malária (Anopheles
arabiensis) em Santiago, Cabo Verde / Derciliano
Lopes da Cruz. - Recife: [s.n.], 2018.
84 p. : il., graf., tab. ; 30 cm.
Dissertação (Mestrado Acadêmico em Biociências e
Biotecnologia em Saúde) - Instituto Aggeu Magalhães,
Fundação Oswaldo Cruz, Recife, 2018.
Orientadora: Constância Flávia Junqueira Ayres.
Coorientador: Marcelo Henrique Santos Paiva.
1. Anopheles - genética. 2. Controle vetorial. 3.
Resistência a inseticidas. 4. Alelos. 5. Mutação. 6.
Reação em Cadeia da Polimerase – métodos. 7. Cabo
Verde. I. Ayres, Constância Flávia Junqueira. II. Paiva,
Marcelo Henrique Santo. III. Título.
CDU 616.92
DERCILIANO LOPES DA CRUZ
Detecção de alelos associados à resistência aos inseticidas químicos no vetor da malária
(Anopheles arabiensis) em Santiago, Cabo Verde
Dissertação apresentada ao curso de mestrado
em Biociências e Biotecnologia em Saúde do
Instituto Aggeu Magalhães, Fundação
Oswaldo Cruz, como requisito principal para
obtenção do título de Mestre em Ciências.
Área de Concentração: Biologia Celular e
Molecular Básica e Aplicada
Aprovada em: 27 / 02 / 2018
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________________________
Dra. Constância Flávia Junqueira Ayres (Orientadora)
Instituto Aggeu Magalhães – IAM/FIOCRUZ
_______________________________________________________________
Dra. Maria Helena Neves Lobo Silva Filha (examinadora interna)
Instituto Aggeu Magalhães – IAM/FIOCRUZ
_______________________________________________________________
Dr. Herbert Álvaro Abreu de Siqueira (examinador externo)
Universidade Federal Rural de Pernambuco - UFRPE
Dedico este trabalho aos que sempre me apoiaram no meu percurso acadêmico:
Aos meus queridos pais (Maria da Glória Lopes e Manuel António da Graça);
Aos meus irmãos!
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, agradeço à Deus por me conceder a sabedoria e me dar forças para seguir na
minha caminhada.
À minha Orientadora, Constância Ayres, pela paciência, compromisso e orientações durante
esses dois anos.
Ao meu Coorientador, Marcelo Paiva, pela dedicação, orientação e ensinamentos.
Aos meus pais Manuel da Graça e Maria da Glória Lopes, meus portos seguros, por
acreditarem em mim e sempre apostarem no meu crescimento acadêmico e profissional.
Aos meus irmãos Hélia da Graça e Romilton da Graça, por estarem sempre comigo me
apoiando, mesmo distantes.
Às “Pupas” que sempre estiveram do meu lado me proporcionando momentos de
descontração e partilha de conhecimentos.
À Daniele Mendes, pelos momentos de reflexão e incentivo.
À Dra. Duschinka Guedes, pelos ensinamentos e pela disponibilidade para esclarecimento de
dúvidas.
Ao Rodrigo Loyo, pela paciência e contribuição na elaboração dos mapas.
Aos meus amigos, Eduardo Silva, Fernando Freitas, Karine Carvalho, Marcela Melo e Yury
Yzabella, pela amizade, apoio e companheirismo durante esses dois anos.
À Elisama Helvécio, pelo conhecimento partilhado.
Um agradecimento especial à Dra. Lara Ferrero Gomez, por contribuir significativamente no
meu crescimento acadêmico.
Ao grupo de pesquisa em Doenças Tropicais da Universidade Jean Piaget de Cabo Verde
(GIDTPiaget), pela coleta das amostras em campo.
Ao NPT/FIOCRUZ-PE pelo sequenciamento das amostras de DNA.
Ao IAM, pela infra-estrutura que possibilitou a realização desse trabalho.
Ao CNPq, pelo apoio financeiro, permitindo assim a conclusão desse projeto.
Por fim, um obrigado a todos que direta e indiretamente contribuiram para a execução desse
trabalho.
“O conhecimento científico não é atraente por ter todas as respostas, mas sim por querer
decifrar um conjunto cada vez maior de perguntas”
Lázaro de Souza Gomes
CRUZ, D.L. Detecção de alelos associados à resistência aos inseticidas químicos no vetor
da malária (Anopheles arabiensis) em Santiago, Cabo Verde. 2017. Dissertação (Mestrado
Acadêmico em Biociências e Biotecnologia em Sáude) - Instituto Aggeu Magalhães,
Fundação Oswaldo Cruz, Recife, 2017.
RESUMO
Mosquitos do complexo Anopheles gambiae são os principais vetores de malária. Devido à
falta de vacinas para prevenir esta doença, a principal forma de reduzir seu impacto reside no
uso de inseticidas químicos para controlar seus vetores. No entanto, o uso intensivo destes
compostos tem levado ao surgimento de resistência aos inseticidas em várias populações de
mosquitos do gênero Anopheles na África. O objetivo deste estudo foi investigar a presença de
alelos de resistência na população de Anopheles arabiensis da cidade da Praia, capital de Cabo
Verde. Larvas de Anopheles spp. foram coletadas em três áreas da capital, e mantidas até a
emergência de adultos. Estes foram identificados morfologicamente e em seguida
armazenados a -20°C. O DNA foi extraído individualmente e submetido à identificação
molecular das espécies usando marcadores moleculares. Os indivíduos identificados como An.
arabiensis foram submetidos a PCR para pesquisar mutações específicas associadas à
resistência aos inseticidas nos genes que codificam para a acetilcolinesterase (Ace-1), canal de
sódio (Nav) e Glutationa s-transferase Epsilon 2 (GSTE2). Do total de 440 mosquitos obtidos,
análises morfológicas revelaram a presença de 52,3% de An. gambiae s.l e 47,7% de
Anopheles pretoriensis. A identificação molecular mostrou que 100% dos An. gambiae s.l
eram da espécie An. arabiensis. As mutações G119S no gene Ace-1 e L119F no gene GSTE2
não foram detectadas em nenhuma amostra. A análise de seqüenciamento do gene GSTE2
revelou a presença de 16 sítios polimórficos e uma diversidade genética (π) de 2,67. A análise
do gene Nav, revelou a presença da mutação L1014S com uma frequência de 7,3% na
população estudada. Os dados apresentados neste estudo apontam para a necessidade de
readequação das ações de controle do vetor atualmente adotadas em Cabo Verde. O
monitoramento molecular da resistência deve continuar a ser realizado a fim de orientar as
novas estratégias a serem empregadas na região de estudo.
Palavras-chave: Anopheles arabiensis. Controle vetorial. Resistência à inseticidas.
CRUZ, D.L. Detection of alleles associated with resistance to chemical insecticides in the
malaria vector (Anopheles arabiensis) in Santiago, Cabo Verde. 2017. Dissertação
(Mestrado Acadêmico em Biociências e Biotecnologia em Sáude) - Instituto Aggeu
Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz, Recife, 2017.
ABSTRACT
Mosquitoes of the Anopheles gambiae complex are the main malaria vectors. Due to the lack
of vaccines to prevent this disease, the main way to reduce its impact is the use of chemical
insecticides to control their vectors. However, the intensive use of these compounds has led
to the emergence of insecticide resistance in several Anopheles populations in Africa. The
goal of this study was to investigate the presence of resistance alleles in the Anopheles
arabiensis population from the city of Praia, capital of Cape Verde. Larvae of Anopheles spp.
were collected in three areas of the capital, and maintained until the emergence of adults.
These samples were morphologically identified and then stored at -20 °C. The DNA was
individually extracted and submitted to the species identification using molecular markers.
Individuals identified as An. arabiensis were subjected to PCR to screen for mutations
associated with insecticide resistance in the genes encoding acetylcholinesterase (Ace-1),
Sodium Channel (Nav) and Glutathione s-transferase Epsilon class (GSTE2). From the total
of 440 mosquitoes obtained, morphological analyzes revealed the presence of 52.3% of An.
gambiae s.l and 47.7% of Anopheles pretoriensis. Molecular identification showed that 100%
of An. gambiae s.l belonged to the species An. arabiensis. The mutations G119S in Ace-1 and
L119F in GSTE2 genes were not detected in the samples analysed. Sequencing analysis
revealed the presence of 16 polymorphic sites and a genetic diversity (π) of 2.67 for GSTE2.
Analysis of the Nav gene revealed the presence of the L1014S mutation with a frequency of
7.3% in the studied population. The data presented in this study point out the need to adjust
the vector control actions currently adopted in Cape Verde. Molecular resistance monitoring
should continue to be conducted in order to guide the new strategies to be employed in the
study region.
Keywords: Anopheles arabiensis. Vector control. Inseticide resistance.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Países endêmicos para a malária em 2000 e 2016. 24
Quadro 1 - Países com potencial para eliminar a transmissão local da malária
até 2020.
25
Figura 2 - Casos de malária confirmados por 1000 habitantes/prevalência de
parasita em países da África Ocidental, 2014.
25
Figura 3 - Número de casos de malária relatados em Cabo Verde entre os
anos 2000 a 2014.
27
Figura 4 - Esquema representando o sítio de ação das quatro classes de
inseticidas.
32
Figura 5 - Estrutura molecular do diclorodifeniltricloroetano (DDT). 33
Figura 6 - Estrutura molecular do temephos. 34
Figura 7 - Estrutura molecular do propoxur. 35
Figura 8 - Estrutura molecular da deltamentrina (A) e alfa-cipermetrina (B). 36
Figura 9 - Localização geográfica do arquipélago de Cabo Verde. 43
Quadro 2 - Primers usados na amplificação da região IGS do rDNA de
espécies do complexo Anopheles gambiae.
46
Figura 10 - Perfil eletroforético de fragmentos amplificados por PCR, da
região IGS de espécies do complexo Anopheles gambiae.
47
Figura 11 - Perfil eletroforético de fragmentos amplificados a partir do gene
IGS utilizado para identificação molecular de mosquitos do
complexo Anopheles gambiae: Gel de agarose 1,5% visualizado
em luz ultravioleta.
55
Figura 12 - Alinhamento múltiplo de sequências de aminoácidos do gene
GSTE2 de Anopheles arabiensis.
56
Figura 13 - Distribuição da frequência alélica de L1014S do gene Nav nas
localidades de coleta, na cidade da Praia, Cabo Verde.
59
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Composição do mix da PCR para amplificação da região IGS do
rDNA de Anopheles gambiae s.l.
47
Tabela 2 - Composição do mix PCR para a detecção da mutação L119F no
gene GSTE2 de Anopheles arabiensis.
49
Tabela 3 - Composição do mix PCR para a detecção da mutação G119S no
gene Ace-1 de Anopheles arabiensis.
50
Tabela 4 - Composição da mistura de reação da digestão enzimática para a
detecção da mutação G119S no gene Ace-1.
51
Tabela 5 - Composição do mix PCR para a detecção de mutações
L1014S/1014F no gene Nav de Anopheles arabiensis.
52
Tabela 6 - Mosquitos identificados de acordo com a chave de identificação
morfológica de Ribeiro et al. (1980) e os respectivos locais de
coleta na cidade da Praia, Cabo Verde.
54
Tabela 7 - Substituições não sinônimas de nucleotídeos na ORF de GSTE2 de
Anopheles arabiensis e distribuição dos indivíduos que apresentam
esses polimorfismos em três localidades da cidade da Praia, dentre
215 sequências analisadas.
57
Tabela 8 - Parâmetros genéticos e testes de neutralidade, de regiões codante e
não codante do gene GSTE2 de 215 indivíduos de Anopheles
arabiensis coletados em três localidades da cidade da Praia.
57
Tabela 9 - Genótipo do locus Ace-1 de Anopheles arabiensis nas diferentes
localidades de coleta da Praia, Cabo Verde.
58
Tabela 10 - Genótipo e frequência do alelo L1014S do gene Nav da população
de Anopheles arabiensis em localidades de coleta da cidade da
Praia, Cabo Verde.
58
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS
Ace-1 - Gene acetilcolinesterase
AChE - Enzima acetilcolinesterase
Ach - Acetilcolina
AchT - Trasportador de acetilcolina
AcOH - Ácido acético
AGT -Achada Grande Tras
An. arabiensis - Anopheles arabiensis
Anopheles gambiae s.l - Anopheles gambiae sensu lato
An. gambiae s.s - Anopheles gambiae sensu stricto
λ-cialotrina - Lambda-Cialometrina
AluI - Enzima de restrição Arthobacter luteus 1
CDS - Coding sequence (sequência codante)
CMs - Carbamatos
ChT - Transportador de colina
DDT - Diclorodifeniltricloroetano
DNA - Ácido desoxirribonucléico
ESTs - Esterases
GABA - Ácido gama-aminobutírico
GSTs - Glutationa S – trasferases
GSH - Glutationa reduzida
IGS - Intergenic Spacers (espaçadores intergênicos)
IPCC - Intergovernmental panel on climate change (Painel intergovernamental de mudanças
climáticas)
IRS - Indoor residual spraying (pulverização residual intradomiciliar)
Kdr - Knockdown Resistance (resistência do tipo nocaute)
LLINs - Long-lasting insecticidal nets (redes com inseticidas de longa duração)
MACE - Acetilcolinesterase modificada
Nav - Canal de sódio dependente de voltagem
NaCl - Cloreto de sódio
OCs - Organoclorados
OMS - Organização Mundial da Saúde
OPs - Organofosforados
ORF - Open reading frame – fase de leitura aberta
PYRs - Piretróides
PCR - Polymerase chain reaction (reação em cadeia da polimerase)
P450s - monooxigenases dependentes de citocromo P450
RFLP - Restriction fragment length polymorphism (polimorfismo no comprimento de
fragmentos de restrição)
SVIRE - Serviço de vigilância integrada e resposta a epidemias
SDS - Sodium Dodecil Sulfate (dodecilsulfato de sódio)
TE - TRIS-EDTA
ULV - Ultra Low Volume (ultra baixo volume)
U V- Ultravioleta
VGSC - Voltage-gated sodium channel (canal neuronal de sódio dependente de voltagem)
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 17
2 JUSTIFICATIVA 19
3 PERGUNTA CONDUTORA 20
4 HIPÓTESE 21
5 OBJETIVOS 22
5.1 Objetivo geral 22
5.2 Objetivos específicos 22
6 REFERENCIAL TEÓRICO 23
6.1 Malária como problema de saúde pública/abordagem mundial 23
6.2 Epidemiologia da malária no continente africano 24
6.3 Breve história da malária em Cabo Verde 26
6.4 Mosquito vetor da malária 28
6.4.1 Gênero Anopheles 28
6.4.2 Complexo Anopheles gambiae 28
6.5 Controle da malária/vetor 29
6.5.1 Controle químico 30
6.5.2 Inseticidas químicos usados para o controle do vetor 31
6.5.2.1 Organoclorados 32
6.5.2.2 Organofosforados 33
6.5.2.3 Carbamatos 34
6.5.2.4 Piretróides 35
6.6 Resistência aos inseticidas 36
6.6.1. Insensibilidade do sítio-alvo 37
6.6.2 Resistência metabólica 38
6.6.2.1 Esterases 39
6.6.2.2 monooxigenases dependentes de citocromo P450 (P450s) 39
6.6.2.3 Glutationa S-trasferases (GSTs) 40
7 MATERIAL E MÉTODOS 42
7.1 Tipo de estudo 42
7.2 Área de estudo 42
7.3 Amostragem 44
7.4 Identificação morfológica de mosquitos adultos 44
7.5 Processamento das amostras 45
7.5.1 Extração de DNA 45
7.5.2 Identificação molecular das espécies 45
7.5.3 Identificação molecular de genes de resistência 48
7.5.3.1 Detecção da mutação L119F no gene GSTE2 e análise de polimorfismos 48
7.5.3.2 Detecção da mutação G119S no gene Ace-1 50
7.5.3.3 Detecção de mutações do tipo Kdr no gene Nav 51
7.6 Sequenciamento de DNA, análise e deteção de mutações 52
8 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS 53
9 RESULTADOS 54
9.1 Identificação morfológica de mosquitos adultos 54
9.2 Identificação molecular das espécies 54
9.3 Detecção da mutação L119F no gene GSTE2 e análise de polimorfismos 55
9.4 Detecção da mutação no gene Ace-1 57
9.5 Detecção de mutações do tipo Kdr no gene Nav 58
10 DISCUSSÃO 60
11 CONCLUSÕES 65
12 RECOMENDAÇÕES 66
REFERÈNCIAS 67
APÊNDICE A – Alinhamento de sequências amplificadas dos genes GSTE2,
Ace-1 e Nav.
78
APÊNDICE B – Tabela 1 83
APÊNDICE C – Figura 1 84
17
1 INTRODUÇÃO
Apesar de ser prevenível e tratável, a malária ainda continua sendo um dos grandes
problemas de saúde pública no mundo, sobretudo no continente africano. Em Cabo Verde, a
malária ainda ocorre dada a alta vulnerabilidade do país, ostentando assim um alto potencial
epidêmico. Analisando a história da malária em Cabo Verde, é possível identificar vários
momentos: um momento que se estende até a década de 1940, em que a malária representava
um sério problema de saúde pública, com epidemias graves, chegando a situação de
hiperendemicidade com mais de dez mil casos e duzentas mortes anuais (ORGANIZAÇÃO
MUNDIAL DA SAÚDE, 2012a); um segundo momento em que os esforços no combate à
malária ganharam um peso importante no âmbito do programa global de eliminação da
malária implementado pela Organização Mundial da Saúde (OMS), através de campanhas
semestrais de pulverização intradomiciliar em todas as ilhas, que resultaram na interrupção da
transmissão da malária registradas em dois períodos (de 1967 a 1972 e de 1983 a 1985); um
terceiro momento, a partir das últimas epidemias de 1987 com 434 casos, 1988 com 814 casos
(12 óbitos na ilha de Santiago) e a partir de 2003 na ilha da Boa Vista com quatro casos
autóctones (CABO VERDE, 2009).
Atualmente, a ocorrência da malária em Cabo Verde é considerada instável, com uma
transmissão sazonal e esporádica, de baixa endemicidade e bastante variável de ano para ano,
responsável por uma flutuação da morbidade, dependendo muito da pluviometria (ALVES et
al., 2010; CABO VERDE, 2009). Este último fator, tem uma relação direta com o aumento da
densidade e longevidade do vetor.
Anopheles arabiensis Patton, 1905, membro do complexo Anopheles gambiae, é a
única espécie de ocorrência conhecida no arquipélago de Cabo Verde, que está associada à
transmissão dos parasitas causadores da malária. Atualmente é encontrada em todas as ilhas
do país, exceto em Sal e Brava (ALVES et al., 2006; CAMBOURNAC; PETRARCA;
COLUZZI, 1982; RIBEIRO et al., 1980). Esta espécie é caracterizada como antropofílica,
endo-exofágica e apresenta uma marcada exofilia (RIBEIRO et al., 1980). A sua distribuição
tem variado ao longo do tempo, sendo necessário realizar um levantamento entomológico para
conhecer a sua dispersão atual.
O controle deste vetor tem constituído uma importante estratégia no combate à malária.
O uso de redes impregnadas com inseticidas de longa duração (LLINs) e pulverização residual
intradomiciliar (IRS) são os principais componentes das estratégias de prevenção da málaria e
controle do vetor, pelo fato de serem eficazes e terem um custo relativamente baixo.
18
Atualmente quatro classes de inseticidas são aprovadas para IRS: piretróides (PYRs),
organoclorados (OCs), organofosforados (OPs) e carbamatos (CMs) (OCHOMO et al., 2015;
ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2012b).
Em Cabo Verde, as estratégias de controle são realizadas de forma integrada para as
principais espécies de vetores da malária e dengue, Anopheles arabiensis e Aedes aegypti,
respectivamente, através de IRS com os inseticidas químicos temephos e deltametrina
(GOMÉZ et al., 2013). Para além destes, o gasóleo adulterado e peixes Gambusia affinis são
também usados no controle vetorial, em criadouros de larvas (CABO VERDE, 2012).
Entretanto, o uso intensivo e indiscriminado de inseticidas contribui para o surgimento
de populações vetoras resistentes a estes compostos, dificultando os programas de controle,
que, por conseguinte, agrava os problemas de saúde pública (CORBEL; GUESSAN, 2013).
De acordo com a OMS, a resistência aos inseticidas é definida como a capacidade que uma
população de insetos tem de sobreviver a uma dose do produto que, normalmente, causaria
sua mortalidade e esta característica é conferida por meio de seleção de mutações em genes
que conferem resistência a esses compostos (RANSON et al., 2011).
Os principais mecanismos que conferem resistência aos inseticidas em mosquitos são
classificados em insensibilidade do sítio-alvo e a resistência metabólica (DJÈGBÈ et al.,
2014; PROTOPOPOFF et al., 2013). De uma maneira geral, para os carbamatos e
organofosforados a insensibilidade do sítio-alvo tem sido relacionada à alteração no gene da
acetilcolinesterase, para os piretróides e DDT, às mudanças no gene do canal neuronal de íons
de sódio dependentes de voltagem, e os ciclodienos aos genes que codificam os seus
respectivos receptores GABA (MARTINEZ-TORRES et al., 1998). A resistência metabólica
é baseada no aumento da capacidade de metabolização de compostos químicos por enzimas
detoxificadora e geralmente está associada a três grandes famílias: monooxigenases
dependentes de citocromo P450 (CYP450s), esterases, e glutationa-S-transferases (GSTs)
(SILVA; SANTOS; MARTINS, 2014).
Dada a importância do uso de inseticidas no controle do vetor da malária em Cabo
Verde, e o desenvolvimento de resistência aos inseticidas, o monitoramento da suscetibilidade
dos Anofelinos aos inseticidas piretróides e organofosforados, que vêm sendo usados no país
é essencial. Além disso, é necessário identificar os mecanismos de resistência envolvidos.
Neste sentido, o presente estudo teve como objetivo investigar a presença e frequência de
alguns genes de resistência selecionados em populações do vetor da malária (Anopheles
arabiensis) da cidade da Praia, Ilha de Santiago, Cabo Verde.
19
2 JUSTIFICATIVA
Cabo Verde está entre os 21 países no mundo que tem como objetivo erradicar a
malária até 2020, segundo o programa de eliminação da malária da OMS. No entanto, ainda
que em baixa frequência, casos autóctones da doença têm sido relatados no país e vários casos
importados têm sido registrados nos últimos 15 anos. Devido a inexistência de vacinas, o
método mais empregado para diminuir os impactos da doença, ainda é o controle do vetor, o
que vem sendo feito pelo uso de inseticidas. No continente africano, vários alelos de genes
que conferem resistência a inseticidas têm sido descritos em diversas populações de
mosquitos do complexo Anopheles gambiae e, em grande parte, com altas frequências nas
populações estudadas. Além disso, a resistência de Anopheles spp. em Cabo Verde não tem
sido monitorada. Neste contexto, faz-se necessário realizar estudos de resistência aos
inseticidas nas populações de anofelinos que ocorrem em Cabo Verde, uma vez que trabalhos
realizados anteriormente com populações de Aedes aegypti mostraram uma resistência inicial
a deltametrina e temephos, produtos que veêm sendo utilizados nos programas de controle de
ambas as espécies de vetores no país.
Um estudo prévio apontou que An. arabiensis de Cabo Verde é susceptível a
deltrametrina e a λ-cialotrina (PYRs), porém a pressão provocada pelo uso destes inseticidas
poderia ter mudado o status de suscetibilidade desta espécie, a exemplo do que foi observado
para Ae. aegypti submetido às mesmas intervenções no controle vetorial. A análise das
frequências de alelos que conferem resistência à inseticidas nas populações de An. arabiensis
deve ser realizada, já que o aumento brusco na frequência destes pode levar à sua fixação na
população, comprometendo, futuramente, os efeitos das ações de controle do vetor no
arquipélago. Neste sentido, diante da dificuldade no estabelecimento de colônias em
laboratório de algumas espécies de Anopheles, por não estarem totalmente adaptadas às
condições laboratoriais, torna-se difícil a realização de bioensaios e determinação da atividade
de enzimas envolvidas no metabolismo de inseticidas. Assim, o uso de técnicas moleculares
pode ser útil na detecção e monitoramento de alelos de resistência na população de Anopheles
em Cabo Verde no controle vectorial, permitindo uma detecção precose da resistência e
facilitando o seu manejo.
Os resultados obtidos neste estudo irão contribuir para estabelecer métodos de
monitoramento do status de suscetibilidade de An. gambiae aos inseticidas e podem orientar o
desenvolvimento de estratégias adequadas a serem empregadas no controle do vetor em Cabo
Verde, contribuindo para a erradicação da doença no país.
20
3 PERGUNTA CONDUTORA
O uso intensivo dos atuais inseticidas químicos empregados para controle de vetores da
malária na cidade da Praia em Cabo Verde levou à seleção de alelos de resistência na
população de An. arabiensis?
21
4 HIPÓTESE
O uso intensivo de inseticidas químicos empregados para controle de vetores da
malária na cidade da Praia, em Cabo Verde, levou à seleção de alelos de resistência na
população de An. arabiensis.
22
5 OBJETIVOS
5.1 Objetivo geral
Identificar a circulação de alelos nas populações de Anopheles arabiensis da cidade da
Praia, (ilha de Santiago – Cabo Verde) que conferem resistência aos inseticidas químicos das
classes de organofosforados e piretróides usados no controle vetorial.
5.2 Objetivos específicos
a) Identificar espécies do complexo Anopheles gambiae que ocorrem em Praia;
b) Avaliar nessas amostras a presença de mutações associadas à resistência nos genes do
canal de sódio (Nav), acetilcolinesterase (Ace-1) e Glutationa S-transferases Epsilon 2
(GSTE2);
c) Estimar as frequências alélicas dos genes de resistência nas populações avaliadas;
d) Determinar a diversidade genética do gene GSTE2 nessas amostras;
e) Avaliar a distribuição espacial destes alelos de resistência na área de estudo.
23
6 REFERENCIAL TEÓRICO
6.1 Malária como problema de saúde pública/abordagem mundial
As doenças vetoriais são as principais causas de morte em países tropicais e
subtropicais (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2004). A malária está entre as
infecções mais devastadoras na história humana e é a mais grave doença vetorial. Essa doença
tem sido um dos grandes problemas de saúde pública a nível mundial, e é endêmica em vários
países tropicais e subtropicais (Figura 1) (REID; MCKENZIE, 2016). Nas últimas décadas,
reduções significativas nos casos de malária foram registradas em muitos países (DADZIE et
al., 2016). O número de casos anuais, globalmente caiu de cerca de 262 milhões em 2000
(variação: 205-316 milhões), para 214 milhões em 2015 (variação: 149-303 milhões), um
declínio médio de 18%. A maioria dos casos em 2015 ocorreu na África (88%), seguida da
região do Sudeste Asiático (10%) e no Mediterrâneo oriental (2%). Além do número mundial
de casos, o número de mortes por malária diminuiu de cerca de 839.000 em 2000, para
43.8000 em 2015, representando um declínio de 48% (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA
SAÚDE, 2015a).
A transmissão da malária ocorre em todas as seis regiões da OMS1 e, mundialmente,
cerca de 3,2 bilhões de pessoas, em 97 países e territórios, correm o risco de serem infectadas
e desenvolverem a doença, estando 1,2 bilhões em condição de alto risco (mais de 1 caso de
malária/1000 habitantes/ano) (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2014).
Segundo a Organização Mundial da Saúde (2015b) a pobreza e a malária estão
intimamente ligadas, pois esta doença tem maior taxa de incidência nos países de níveis sócio-
econômicos mais baixos. Nesses países, as comunidades gravemente afetadas são as mais
pobres e marginalizadas, que têm os riscos mais elevados associados à malária e o pior acesso
aos serviços de prevenção, diagnóstico e tratamento da doença.
1 Com sede em Genebra, na Suiça, a OMS tem seis regiões: Africana, Américas, Mediterrâneo Ocidental,
Europeia, Pacífico Ocidental e Sudeste Asiático .
24
Figura 1 - Países endêmicos para a malária em 2000 e 2016.
Fonte: adaptado de Organização Mundial da Saúde (2016a)
6.2 Epidemiologia da malária no continente africano
Cerca de 90% da incidência anual de malária ocorre na África, onde os principais
vetores são espécies do complexo Anopheles gambiae Giles s.l. (sensu lato), que se
desenvolvem tanto em água estagnada temporária como também em recipientes de água
permanente (KAWADA et al., 2011a). Estima-se que aproximadamente 90% de todas as
mortes por malária ocorrem na região africana da OMS, e 78% das mortes ocorrem em
crianças menores de 5 anos (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2014). Na África
ocidental, cerca de 342 milhões de pessoas residentes nos 17 países dessa região estão sob
risco de contrairem malária, com 289 milhões sob condição de alto risco (incidência relatada
>1 caso/1.000 habitantes) (Figura 2). Os casos de malária são causados na sua maioria pelo
protozoário Plasmodium falciparum (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2015a).
Entre os países, naquela região, endêmicos para a malária, 15 deles estão na fase de controle
da doença, enquanto Cabo Verde está em fase de pré-eliminação e a Argélia na fase de
eliminação (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2015a). No contexto mundial 21
países têm a possibilidade de eliminar a malária até 2020 (Quadro 1).
25
Quadro 1 - Países com potencial para eliminar a transmissão local da malária até 2020.
Regiões Países
África Argélia, Botswana, Cabo Verde,
Comoros, África do Sul e Suazilândia
Américas Belize, Costa Rica, Equador, El Salvador
México, Paraguai, Suriname
Mediterrâneo Oriental Irã e Arábia Saudita
Sudeste Asiático Butão, Nepal e Timor-Leste
Pacífico Ocidental China, Malásia e República da Coreia
Fonte: Organização Mundial da Saúde (2016c).
Figura 2 - Casos de malária confirmados por 1000 habitantes/prevalência de parasita em países da África
Ocidental, 2014.
Fonte: Organização Mundial da Saúde (2015a).
Nota: Os dados só são apresentados para países e áreas que tinham transmissão de malária.
26
6.3 Breve história da malária em Cabo Verde
Acredita-se que a malária em Cabo Verde surgiu no século XV, no decorrer do
povoamento das ilhas em 1462, por emigrantes provenientes do continente africano e de
países europeus tais como Espanha, Itália e Portugal (CABO VERDE, 2009).
Antes da década de 1950, todas as ilhas foram afetadas e epidemias severas de malária
ocorreram nas ilhas mais densamente povoadas. A transmissão foi meso-endêmica com um
padrão sazonal instável e taxas de incidência anual acima de 100 casos por 1000 habitantes,
sendo Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax e Plasmodium malariae os agentes
etiológicos detectados (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2012a).
A primeira campanha de eliminação da malária foi iniciada em 1953, utilizando IRS
(Indoor Residual Spraying/ Pulverização residual intradomiciliar) com DDT
(diclorodifeniltricloroetano) como a principal estratégia de controle. Como resultado, a
transmissão da malária foi considerada interrompida em 1967 (RODRIGUEZ et al., 2012).
Com a interrupção das campanhas de IRS em 1969, a transmissão local reapareceu na ilha de
Santiago em 1973 e uma grande epidemia ocorreu em 1977-1978. Um total de 844 casos e 13
óbitos foram relatados no auge da epidemia em 1978. Consequentemente as ações de controle
foram retomadas nos focos conhecidos nessa ilha e a trasmissão local foi novamente
interrompida entre 1983 a 1985 (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2012a).
Três anos mais tarde, no ano de 1988, após as ações de IRS serem novamente
interrompidas, uma segunda epidemia ocorreu na ilha com cerca de 800 casos notificados e 12
mortes. Nessa epidemia apenas P. falciparum foi detectado como o agente etiológico da
doença (ALVES, 2010).
Desde 1990, o nível de trasmissão da malária em Cabo Verde permanece muito baixo,
com ocorrência de casos predominantemente na ilha de Santiago, seguido da ilha de Boa
Vista. De 1997 a 2006 foram registrados menos de 100 casos por ano, entre autóctones e
importados. As taxas de incidência variaram entre 0,1% em 1997 e 0,16% no ano de 2006,
com 8 mortes neste último ano (ALVES et al., 2006; CABO VERDE, 2007).
Segundo a Organização Mundial da Saúde (2015a), desde 2000 os casos de malária
registrados têm demonstrado variações ao longo dos anos (Figura 3). De 2013 a 2014, o país
registrou, 46 casos por ano (em 2013, 22 autóctones e 24 importados; em 2014, 26 autóctones
e 20 importados), afetando particularmente adultos. Desses casos, apenas duas mortes foram
relatadas em 2014, de pacientes que adquiriram a doença localmente (CABO VERDE, 2015b;
ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2016c). Embora o número de casos tenha
27
diminuido ao longo dos anos, a OMS aponta que de um total de 513.900 habitantes em Cabo
Verde, cerca de 483.000 pessoas vivem dentro de focos ativos de malária e apenas 30.900
pessoas residem em áreas livres de malária (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE,
2015a).
Figura 3 - Número de casos de malária relatados em Cabo Verde entre os anos 2000 a 2014.
Fonte: adaptado de Organização Mundial da Saúde (2015a)
Atualmente, a malária em Cabo Verde ainda é considerada endêmica nas ilhas de
Santiago e Boa Vista (menos de 100 casos por ano). O mosquito vetor An. arabiensis,
membro do complexo An. gambiae, está presente em sete das nove ilhas habitadas, à exceção
das ilhas do Sal e da Brava. P. falciparum é a única espécie do parasita descrita como
responsável pela doença no país segundo registros do período recente (CABO VERDE,
2015b). Em 2016, Cabo Verde registrou 47 casos de malária, sendo 19 deles autóctones, todos
na cidade da Praia, e 28 importados. Segundo o mais recente boletim informativo do Serviço
de Vigilância Integrada e Resposta a Epidemias de Cabo Verde (SVIRE), até novembro de
2017, foram registrados 430 casos de malária, 412 dos quais foram de trasmissão autóctone e
18 foram importados (BOLETIM INFORMATIVO DO MINISTÉRIO DA SAÚDE DE
CABO VERDE, 2017). A cidade da Praia, na ilha de Santiago apresentou o maior número de
registros com 421 casos (412 autóctones) e um óbito. Os outros casos estão distribuidos nas
ilhas de São Vicente (sete casos e um óbito), Sal (um caso) e Santo Antão (um caso). Os casos
importados são de países vizinhos como, Nigéria, Angola, Senegal, Guiné-Bissau, Guiné
Conacri e Costa do Marfim (BOLETIM INFORMATIVO DO MINISTÉRIO DA SAÚDE DE
CABO VERDE, 2017).
Cabo Verde entrou na fase de pré-eliminação da malária desde 2010
(ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2015a). Atendendo à dimensão atual da malária
28
no país e ao reduzido impacto nos níveis de saúde da população, as orientações específicas
devem ser no sentido da erradicação da doença entre a população cabo-verdiana, até o ano de
2020. Isto pressupõe que haja um reforço do envolvimento multisetorial e comunitário no
combate à malária, maior apoio à integração das atividades de luta contra a malária nas
Delegacias de Saúde, capacitação operacional dos quadros técnicos para uma intervenção
eficaz a nível da promoção da saúde e no manejo dos casos (CABO VERDE, 2007).
As abordagens atuais para eliminar a malária em Santiago incluem a detecção ativa de
casos, o uso de antimaláricos artemeter-lumefantrina para tratamento (desde 2008) e
mefloquina para profilaxia para viajantes, combate ao vetor através do uso de iseticidas
(temephos) e de IRS (com deltametrina) para controle dos mosquitos adultos (SNOW et al.,
2012).
6.4 Mosquito vetor da malária
6.4.1 Gênero Anopheles
Mais de 450 espécies do gênero Anopheles foram identificadas no mundo. Dentre
estes, pelo menos 20 taxa representam complexos de espécies, que compreendem cerca de
115 membros de espécies crípticas e pelo menos 60 são reconhecidas como vetores da malária
humana. Apenas as fêmeas dos mosquitos são capazes de transmitir o parasita Plasmodium
para humanos através da alimentação sanguínea devido ao seu hábito hematofágico
(COHUET et al., 2010; DOMINGOS et al., 2017; MANGUIN, 2013). Membros do complexo
Anopheles gambiae s.l. (sensu lato) são considerados os principais vetores de Plasmodium
spp. no mundo, sendo Anopheles gambiae s.s e Anopheles arabiensis os mais eficientes
(COETZEE, 2004; WHITE, 1974). A alta capacidade vetorial desse complexo se deve ao fato
de conter espécies com grande longividade, curto período de desenvolvimento larval e com
alta capacidade de adaptação ao ambiente artificial, sendo consideradas altamente
antropofílicas (COETZEE, 2004; LUC et al., 2016; WIEBE et al., 2017).
6.4.2 Complexo Anopheles gambiae
O complexo Anopheles gambiae compreende um grupo de sete espécies
morfologicamente idênticas: Anopheles quadriannulatus Theobald, 1911; Anopheles
quadriannulatus espécie B Hunt, 1998; Anopheles melas Theobald, 1903; Anopheles merus
29
Donitz, 1902; Anopheles bwambae White, 1985; An. gambiae s.s. (sensu stricto) Giles, 1902 e
An. arabiensis Patton, 1905 (HUNT et al., 1998). As duas últimas são os principais vetores
transmissores da malária na África e, de acordo com Muturi et al (2010), ambas as espécies
coexistem em todo o continente, mas An. arabiensis é mais adaptada aos ambientes áridos.
Além destes, três outros membros do complexo, An. melas, An. merus e An. bwambae, são
vetores importantes em áreas geográficas limitadas (COLLINS et al., 1987).
Segundo White (1974), apenas An. quadriannulatus Theobald, 1911, uma espécie
altamente zoofílica do complexo, não está envolvida no ciclo de trasmissão da malária.
Apesar de serem morfologicamente idênticas, todas as espécies do complexo apresentam
diferenças bio-ecológicas e comportamentais que influenciam o modo como transmitem o
patógeno (COLUZZI et al., 1979; DELLA TORRE et al., 2002).
Em Cabo Verde, a primeira espécie de mosquito, An. gambiae s.l., foi registrada na
ilha de Santiago em 1909 (RIBEIRO et al., 1980). An. arabiensis Paton, 1905, é considerado
o único vetor da malária em Cabo Verde (CAMBOURNAC; PETRARCA; COLUZZI, 1982).
A espécie An. pretoriensis tem sido encontrada regularmente em todas as ilhas do país mas, os
estudos realizados até o momento apontam que esta espécie não tem capacidade vetorial na
transmissão do Plasmodium (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2006a). Existe uma
carência de estudos sobre a bio-ecologia e comportamento de Anopheles arabiensis em Cabo
Verde. No entanto, em geral, os mosquitos Anopheles spp. são caracterizados por serem
antropofilicos, endo-exofílicos e endofágicos (AMENESHEWA; SERVICE; 1996;
TIRADOS, 2006). A atividade de picada é essencialmente noturna, com picos de atividade
que variam conforme a espécie (SERVICE, 1986). Os locais mais comuns para oviposição
destes mosquitos incluem criadouros naturais tais como poças temporárias pouco profundas,
lagos e pântanos; ou artificiais como tanques, canais de irrigação e valas (FILLINGER et al.,
2004; NDENGA et al., 2011).
6.5 Controle da malária/vetor
Com a inexistência de uma vacina contra a malária, a ferramenta mais eficaz para
combater a doença é o controle de vetores (REID; MCKENZIE, 2016). Este tem se mostrado
um componente importante nos programas de prevenção e eliminação da malária. No entanto,
apesar de vários esforços nesse sentido, a malária continua sendo uma grande ameaça à saúde
pública (CHEN et al., 2004; FENG et al., 2015).
Antes da descoberta do DDT, a principal abordagem para controlar os vetores
30
anofelinos era dirigida para a fase larvar, o que exigiu um conhecimento detalhado da
bionomia de vetores locais. Em alguns casos, um alto nível de participação comunitária e a
continuidade de esforços por décadas foram necessários para assegurar um progresso no
controle (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2006b). Atualmente, as medidas de
controle abrangem tanto as formas jovens (larvas e pupas) como também mosquitos adultos e
vários métodos são usados no controle vetorial: químico, biológico, comportamental,
mecânico e genético. O método mais usado é o controle químico, a base de inseticidas com
ação adulticida ou larvicida.
6.5.1 Controle químico
O uso de produtos químicos, sobretudo compostos inorgânicos como arsênico, para
controlar insetos remonta ao período clássico na Grécia e Roma. Já no século XVIII, o extrato
vegetal pyrethrum, e durante o século XIX outros compostos foram descobertos como agentes
inseticidas (RAGHAVENDRA et al., 2011). O primeiro registro de uso de um inseticida
orgânico sintético, o dinitro-o-cresol, ocorreu em 1892 e a partir da década de 1920, a
crescente potência dos inseticidas como ferramenta para o controle de insetos levou ao seu
predomínio como método preferido para o controle de insetos (BECKER et al., 2010).
Atualmente o IRS, método antigo, e uso de LLINs, método novo, são as principais
ferramentas para o controle do vetor da malária. Grande parte da recente diminuição da carga
global de malária foi conseguida empregando-se essas duas ferramentas de controle
(HAKIZIMANA et al., 2016; OCHOMO et al., 2015; PROTOPOPOFF et al., 2013). A OMS
recomenda, em países endêmicos, para pessoas em risco de malária, a proteção com LLINs,
ou quando apropriado, realizar as aplicações de IRS. As estratégias de controle vetorial devem
ser executadas através de uma abordagem integrada de gestão de vetores. Tal abordagem
procura melhorar a eficácia, a relação custo-benefício e a sustentabilidade de controle de
vetores de doenças (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2015c).
Em contextos específicos, as intervenções de controle vetorial usando LLINs e IRS
podem ser complementadas com outros métodos, tais como: manejo de criadouros de larvas
(incluindo modificação ou eliminação de habitat, tratamento com larvicidas e uso de agentes
de controle biológico) e a ampliação das medidas de proteção pessoal. Os habitats das larvas
variam acentuadamente entre as espécies de mosquitos Anopheles. Assim, as medidas de
controle direcionadas para as larvas são altamente específicas para uma determinada
localização e ambiente. Larvicidas são recomendados, por exemplo, somente para as áreas
31
onde os habitats de larvas do mosquito da malária podem ser identificados e tratados
(ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2012b, 2015d).
6.5.2 Inseticidas químicos usados para o controle do vetor
Quatro classes de inseticidas foram até agora recomendadas pela OMS para uso contra
mosquitos em programas de saúde pública, classificados de acordo com a sua natureza
química e modo de ação: os organoclorados (OCs), organofosforados (OPs), carbamatos
(CMs) e os piretróides (PYRs). Entre estes, os PYRs têm sido os mais utilizados nos
programas de controle vetorial (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2016b). De uma
maneira geral, os inseticidas químicos funcionam de forma semelhante, pois agem em
moléculas ou sítios-alvos do sistema nervoso dos insetos, interferindo na propagação do
impulso nervoso ao longo do axônio (Figura 4) (DADZIE et al., 2016; MONTELLA et al.,
2012). Os organoclorados e os piretróides atuam no sistema nervoso, ligando-se a proteína do
canal de sódio da membrana nervosa provocando um fluxo anormal de iões Na++
na
membrana do neurônio. Os ciclodienos da classe dos OCs atuam nos receptores do ácido
gama-aminobutírico (GABA). Já os organofosforados e os carbamatos atuam ligando-se à
enzima acetilcolinesterase (AChE) que ativa nas junções nervosas sinapases impedindo que
esta enzima catalize o neurotrasmissor acetilcolina em colina. A ausência da reação provoca
o acúmulo da acetilcolina, o que acarreta uma estimulação exacerbada e consequente morte
do inseto (HEMINGWAY; RANSON, 2000).
As quatro classes de inseticidas podem ser usadas para IRS, mas atualmente mas
somente PYRs são recomendados para uso em LLINs. Em 2009, estimou-se que os PYRs
representavam cerca de 75% da cobertura da IRS, enquanto que o DDT foi o segundo
inseticida mais utilizado para o controle do vetor da malária; CA e OP representaram apenas
pequenas percentagens de uso global (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2012b).
32
Figura 4 - Esquema representando o sítio de ação das quatro classes de inseticidas.
Fonte: David (2013).
Legenda: Ach, acetilcolina; AchT, transportador de Ach; AcOH, ácido acético; ChT, trasportador de colina;
MACE, acetilcolinesterase modificada; Canal Vg-Na+, canal de sódio dependente de voltagem; Kdr, knock-
down resistence.
6.5.2.1 Organoclorados
Os organoclorados (OCs) são o grupo mais antigo de pesticidas sintéticos
(LACARIN; REED, 1999). São compostos que contêm sobretudo carbono, hidrogênio e
cloro na sua constituição e são classificados em quatro grupos: difenil-alifáticos;
hexaclorociclohexanos; ciclodienos e policloroterpenos. O DDT (Figura 5), um dos mais
comuns e importantes produtos químicos, pertencente ao grupo difenil-alifáticos, foi
descoberto como um potente inseticida em 1939 por Paul Mueller (BRAGA; VALLE, 2007).
Posteriormente, em 1950, foi usado como o principal composto em grandes áreas do globo
terrestre no combate aos vetores da malária e da febre amarela entre outras doenças
(FLORES et al., 2004; KONRADSEN et al., 2004).
Estes compostos atuam no canal de sódio (Nav), mantendo-o aberto e causando
desequilíbrio no balanço de íons sódio e potássio dos axônios, impedindo, assim, a
transmissão normal de impulsos nervosos em insetos e mamíferos (BRAGA; VALLE,
2007). São caracterizados por terem uma estrutura química extremamente estável, baixa
hidrossolubilidade e eficácia residual longa, com duração superior a seis meses na maioria
dos locais (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2011).
33
Figura 5 - Estrutura molecular do diclorodifeniltricloroetano (DDT)
Fonte: Becker et al. (2010).
Embora o DDT continue sendo usado em IRS em alguns países em desenvolvimento,
em situações limitadas como controle do vetor da malária e pragas agrícolas, o seu uso foi
banido em muitos países devido aos seus efeitos colaterais (tal como bioacumulação e
bioconcentração) no ambiente e nos organimos vivos. Estes compostos são considerados
como poluentes químicos e constituem uma séria ameaça para a saúde humana e o ambiente
(MANSOURI et al., 2016; PIRSAHEB et al., 2015).
6.5.2.2 Organofosforados
Os organofosforados (OPs) são compostostos orgânicos que contêm fósforo e
derivados de ácido fosfórico (LACARIN; REED, 1999). Estes compostos foram descobertos
posteriormente aos organoclorados e têm sido utilizados desde então como inseticidas,
herbicidas e reguladores do crescimento de plantas (BECKER et al., 2003). São amplamente
utilizados em saúde pública por apresentarem vantagens sobre os organoclorados, como
sendo biodegradáveis e não se acumularem nos tecidos. Entretanto, a sua principal
desvantagem é a alta toxicidade para os vertebrados (SILVA; SANTOS; MARTINS, 2014;
CRINNION, 2000).
Essa classe de inseticida é classificada em três subgrupos: os derivados de fenil (etil e
metil paration, fenitrotion, etc.); os alifáticos (malation, vapona, vidrin, etc.); e os
heterocíclicos (temephos, clorpirifos, clorpirifos-metil, etc.). Estes compostos são
classificados com base em suas cadeias laterais e outros elementos ligados ao átomo de
fósforo (GUPTA, 2006). Atualmente o OP temephos (Figura 6) é o único composto larvicida
recomendado pela OMS para uso em água potável de acordo com doses especificamente
recomendadas para este fim (BRAGA; VALLE, 2007).
De forma geral os organofosforados atuam inibindo irreversivelmente a ação da
Acetilcolinesterase (AChE) através da fosforilação que é catalizar a degradação de
34
acetilcolina em colina. A inibição da AChE resulta no acúmulo de acetilcolina nas junções
nervosas, o que impede a interrupção da propagação do impulso elétrico. Conseqüentemente,
há um estímulo exacerbado do sistema nervoso central, desencadeando o processo de
paralisia que pode culminar com a morte do inseto (DAVID et al., 2013).
Figura 6 - Estrutura molecular do temephos
Fonte: Becker et al. (2010).
6.5.2.3 Carbamatos
Os carbamatos (CMs) são derivados do ácido carbâmico e foram introduzidos pela
primeira vez como inseticidas em 1951. Em comparação com os OPs e OCs, os CMs são
mais recentes e constituem outro importante grupo de inseticidas. Para além da sua utilização
como pesticidas, os CMs são utilizados como fármacos de escolha na medicina humana e
medicina veterinária contra várias doenças (BECKER et al., 2003; GUPTA, 2006).
O modo de ação dos CMs é basicamente o mesmo que o dos OPs. Eles afetam a
atividade de AChE, que catalisa a hidrólise de Ach, inibindo sua ação por carbamilação. No
caso destes compostos, a inibição da enzima é mais facilmente revertida do que com os OPs
(BECKER et al., 2010; BRAGA; VALLE, 2007).
Esses inseticidas possuem menor persistência ambiental e toxicidade para os
organismos vivos do que os organoclorados. Devido à sua ampla utilização na agricultura,
foram incriminados como agentes contaminantes de alimentos, água e ar, com efeitos
adversos em humanos e outros animais (GUPTA, 1994). Apresentam um amplo espectro de
atividade e geralmente agem por contato ou ação estomacal. São utilizados eficazmente
contra vetores que desenvolveram resistência aos OCs. Um dos produtos mais comumente
usados é o propoxur (Figura 7), conhecido genericamente pelo nome comercial de Baygon
(BECKER et al., 2010).
35
Figura 7 - Estrutura molecular do propoxur
Fonte: Becker et al. (2010).
6.5.2.4 Piretróides
Os piretróides (PYRs) são uma classe de inseticidas sintéticos altamente ativos
(BECKER et al., 2010), análogos às piretrinas naturais encontrados no gênero
Chrysanthemum (TAN; SODERLUND, 2010). Estes inseticidas oferecem várias vantagens
em relação às outras classes de inseticidas em termos de segurança humana (baixa toxicidade
para os mamíferos), duração da ação residual curta, com ação rápida e elevada atividade
inseticida (HAKIZIMANA et al., 2016).
Eles são amplamente utilizados na agricultura e como produtos para o controle de
insetos que são pragas urbanas. Contudo, a sua utilização como larvicidas é limitada devido à
sua elevada toxicidade para organismos aquáticos não alvos, incluindo peixes
(ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2016b).
Apresentam modo de ação similar ao DDT. Atuam ligando-se aos canais de sódio das
membranas dos neurônios fazendo com que estes permaneçam abertos. Como consequência,
ocorre um desequilibrio iônico na membrana que provoca uma propagação contínua de
estímulos nervosos, culminando com a paralisação do inseto (BECKER et al., 2010;
HEMINGWAY et al., 2004). A deltametrina e a cipermetrina (Figura 8) são dois inseticidas
pertencentes a esta classe que são frequentemente usados no controle de vetores, incluindo o
vetor da malária (BECKER et al., 2010).
Atualmente, o controle do vetor da malária é muito dependente dessa classe de
inseticidas, que são cada vez mais utilizados em programas de controle na África e em outros
continentes (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2015a; RANSON et al., 2011).
Estes compostos podem ser usados em LLINs para a prevenção de picadas de mosquitos em
áreas endêmicas de malária, sprays de ultra-baixo volume (ULV - Ultra Low Volume) e IRS
para controle de adultos (KAWADA et al., 2011a).
36
Figura 8 - Estrutura molecular da deltamentrina (A) e alfa-cipermetrina (B).
Fonte: Becker et al. (2010).
6.6 Resistência aos inseticidas
O uso de inseticidas químicos de síntese continua sendo o método de controle vetorial
mais importante. No entanto, a eficácia do controle de vetores com base em inseticidas está
ameaçada à medida que ocorre a pressão de seleção de alelos associados a resistência e os
mosquitos vetores da malária desenvolvem resistência aos inseticidas utilizados nos LLINs e
no IRS (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2014, 2015a). O desenvolvimento da
resistência em populações de anofelinos, constitui um importante obstáculo para o controle
efetivo da malária, já que é tida como uma séria ameaça, pois tem o potencial não apenas de
comprometer os ganhos obtidos através do controle do vetor, mas tmbém de limitar qualquer
sucesso adicional (DAI et al., 2015; DJÈGBÈ et al., 2014; KAWADA et al., 2011a). Segundo
Ranson e Lissenden (2016), a distribuição e a intensidade desta resistência têm aumentado
dramaticamente nos últimos anos.
Desde 2010, a resistência a pelo menos uma classe de inseticida tem sido relatada em
pelo menos uma espécie de vetor de malária em 60 dos 96 países endêmicos para a doença
onde o monitoramento foi realizado. Além disso, 49 países relataram resistência a pelo menos
duas classes de inseticidas (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2016b). Já foi
relatada resistência para todas as quatro classes disponíveis de inseticida, porém a resistência
aos piretróides foi mais comumente relatada (BAFFOUR-AWUAH et al., 2016; MNZAVA et
al., 2015; OLÉ SANGBA et al., 2017).
Na África, até 2011, as populações de Anopheles gambiae resistentes aos piretróides
eram prevalentes na África Ocidental, sendo mais raras nos países do sul e do leste da África.
Atualmente, essa resistência está amplamente difundida por quase todo o continente
(RANSON; LISSENDEN, 2016).
37
Adicionalmente, alguns estudos também demonstraram a presença de resistência
múltipla em vetores da malária, pertencente ao complexo An. gambiae, em vários países da
África (NAMOUNTOUGOU et al., 2012; NWANE et al., 2013; OLÉ SANGBA et al., 2017).
Segundo Ranson et al. (2011), a resistência múltipla ocorre quando os insetos desenvolvem
resistência a vários compostos expressando diferentes mecanismos de resistência em
simultâneo, que combinados conferem o fenótipo de multi-resistência.
Assim como outros vetores, mosquitos do complexo An. gambiae tem apresentado dois
principais mecanismos de resistência: insensibilidade do sítio-alvo e detoxificação enzimática
conhecida como resistência metabólica. Ambos os mecanismos já foram amplamente
documentados em An. arabiensis na África Ocidental e subsariana (RANSON et al., 2011). A
resistência também pode se desenvolver por alterações na absorção de inseticida no ponto de
contato cuticular, que leva a uma penetração reduzida do inseticida devido à modificações na
cutícula do inseto, ou ainda por mudanças no comportamento do mosquito, que impede ou
reduz o contato com o inseticida (REID; MCKENZIE, 2016), como já descrito para
Anopheles funestus (WOOD et al., 2010). Segundo a Organização Mundial da Saúde (2016b),
é provável que outros mecanismos de resistência, ainda desconhecidos, possam contribuir
para os fenótipos de resistência observados em algumas populações.
A insensibilidade do sítio-alvo tem sido facilmente avaliada por PCR
(ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2012b), já que existem poucos genes descritos
como moléculas alvos de interação com os inseticidas. Por outro lado, a resistência metabólica
é dificil de ser investigada através de uma abordagem molecular, pois envolve um conjunto de
enzimas metabólicas, que constituem famílias multigências, contendo inúmeros membros que
evoluem principalmente por duplicação gênica. Dentre as famílias de enzimas, o gene GSTE2
tem sido indentificado como um dos marcadores moleculares associados à resistência
metabólica nos mosquitos do gênero Anopheles (RIVERON et al., 2014).
6.6.1 Insensibilidade do sítio-alvo
A insensibilidade do sítio-alvo ocorre quando há uma alteração na molécula que atua
como receptor, ou o sítio-alvo de ligação do inseticida, resultante de mutações pontuais nos
genes que codificam estas proteínas. Essas mutações podem interferir na interação inseticida –
sítio-alvo, ou impedindo esta ligação. No caso de resistência aos OPs e CMs, as mutações
ocorrem no gene da acetilcolinesterase (Ace-1) (FENG et al., 2015), e a resistência a ambas as
classes de inseticidas devido a este mecanismo já foi documentada em populações naturais de
38
An. gambiae. Esta resistência aos OP e CMs é devido a uma mutação pontual única no gene
Ace-1 que consiste na substituição de uma glicina (GGC) por uma serina (AGC) na posição
1192 do exon 3 (Ace-1
R ou mutação Ace-1 G119S) (NAMOUNTOUGOU et al., 2012).
No caso do DDT e dos piretróides, a mutação pode ocorrer no gene que codifica o
receptor do canal neuronal de sódio dependente de voltagem (VGSC, voltage gate sodium
channel ou Nav) nos domínios II-IV, conferindo o que é descrito como resistência do tipo Kdr
(“knockdown resistance”) (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2016b). Duas
mutações pontuais do tipo Kdr têm sido detectadas no gene Nav (na posição 1014 da proteína
codificada) de An. gambiae: a substituição de uma leucina por uma fenilalanina (L1014F),
encontrada principalmente na África Ocidental, nomeada de “kdr-west” e uma leucina por
uma serina (L1014S), encontrada principalmente no leste da África (“Kdr-east”) (ABDALLA
et al., 2014; DJÈGBÈ et al., 2014; HAKIZIMANA et al., 2016; MARTINEZ-TORRES et al.,
1998).
Recentemente, o surgimento de uma nova mutação na posição 1575, entre os dois
domínios III-IV do VGSC foi descrito em An. gambiae e consiste na substituição de uma
asparagina por uma tirosina (N1575Y). Essa mutação pode aumentar o efeito da mutação
L1014F (DJÈGBÈ et al., 2014; YAHOUÉDO et al., 2016).
6.6.2 Resistência metabólica
A resistência bioquímica ou do tipo metabólica é conferida pelo aumento na
capacidade de eliminação dos inseticidas pelas enzimas específicas que metabolizam ou
sequestram o inseticida antes de terem efeitos tóxicos nos organismos. Isto pode ser causado
pela super expressão destas enzimas ou por uma mudança nas enzimas que aumentam de
forma qualitativa sua capacidade de metabolizar o inseticida, resultando numa detoxificação
mais eficiente. Três principais sistemas enzimáticos ou famílias de enzimas estão envolvidos
na resistência metabólica: Esterases (ESTs), monooxigenases dependentes de citocromo P450
(P450s) e Glutationa S-transferases (GSTs) (DADZIE et al., 2016; ORGANIZAÇÃO
MUNDIAL DA SAÚDE, 2016b).
O processo de detoxificação por essas enzimas compreende três fases. As fases I e II
envolvem a conversão de um xenobiótico lipofílico apolar num metabólito com mais
hidrossolubilidade, que pode então ser eliminado mais facilmente pela célula na fase III
(ENAYATI; RANSON; HEMINGWAY, 2005). A fase I é catalisada pelas esterases e
2 Refere-se a posição no exon 3 da sequência codante.
39
principalmente pelo sistema monooxigenases dependentes de citocromo. Esta última é
responsável por uma série de reações, das quais a oxidação parece ser a mais importante. As
enzimas de fase I reconhecem e atuam diretamente sobre o composto exógeno, o que dá
origem aos substratos para as enzimas de Fase II (BRAGA; VALLE, 2007). Estas, catalisam a
conjugação de um substrato endógeno solúvel em água aos xenobióticos previamente ativados
na fase I, tal como a glutationa reduzida (GSH), ácido UDP-glucurónico ou glicina.
Quantitativamente, a conjugação de GSH aos xenobióticos, catalisada pelas GSTs, é a
principal reação de fase II em muitas espécies (SHEEHAN et al., 2001).
6.6.2.1 Esterases
As esterases pertencem a um complexo de enzimas da família das carboxilesterases e
superfamília de alfa/beta hidrolases, que hidrolisam ésteres carboxílicos através da adição de
uma molécula de água (HEMINGWAY; KARUNARATNE, 1998; HOTELIER et al., 2004).
Para além das esterases, a família das carboxilesterases também inclui proteases, lipases,
desalogenases, peroxidases, entre outras (HOTELIER et al., 2004). São enzimas da fase I de
detoxificação e atuam sequestrando e metabolizando inseticidas (HEMINGWAY;
KARUNARATNE, 1998).
Esse complexo de enzimas tem um papel importante no metabolismo de várias classes
de compostos exógenos e endógenos. Adicionalmente, também desempenham uma série de
funções cruciais no desenvolvimento e comportamento dos insetos, tais como a degradação de
substâncias odoríferas e funções relacionadas com a reprodução e digestão (MONTELLA;
SCHAMA; VALLE, 2012). Em mosquitos, a atividade elevada das esterases está
frequentemente envolvida com a resistência aos organofosforados, carbamatos e, em menor
grau aos piretróides (HEMINGWAY; RANSON, 2000).
6.6.2.2 monooxigenases dependentes de citocromo P450 (P450s)
As monooxigenases dependente de citocromo P450, também designadas de
monoxigenases de função mista (MFOs) representam uma superfamília de enzimas
envolvidas no metabolismo de numerosos compostos endógenos e exógenos (MATOWO et
al., 2014). Estão envolvidas no metabolismo dos piretróides, na ativação e/ou detoxificação
dos inseticidas organofosforados e, em menor grau, na detoxificação de carbamatos, agindo na
fase I de detoxificação (HEMINGWAY; RANSON, 2000).
40
As P450s constituem a principal família de enzimas associadas à resistência à maioria
dos inseticidas, principalmente os piretróides. Níveis elevados de atividade destas enzimas são
frequentemente observados em anofelinos resistentes aos piretróides na África (DAVID et al.,
2013). Existem 111 enzimas P450s em An. gambiae, mas apenas um pequeno número dessas
enzimas são capazes de detoxificar inseticidas (RANSON, 2002). Abordagens baseadas no
método de microarray (micro-arranjos) têm identificado três genes "P450" que são super-
expressos em populações de An. gambiae resistentes a piretróide: CYP6M2, CYP6P3 e
CYP6Z2. Todos estes genes codificam para enzimas que são capazes de se ligar aos
inseticidas piretróides, mas apenas CYP6M2 e CYP6P3 podem metabolizar o inseticida
(DJOUAKA et al., 2008; MÜLLER et al., 2008).
6.6.2.3 Glutationa S-trasferases (GSTs)
As GSTs compreendem uma superfamília de proteínas encontradas na maioria dos
organismos e são associadas principalmente à detoxificação de compostos lipofílicos
endógenos e xenobióticos, através da conjugação de glutationa reduzida aos seus centros
eletrofílicos. São enzimas da fase II do processo de detoxificação. As GSTs também estão
envolvidas em muitos outros processos intracelulares, incluindo a proteção contra o estresse
oxidativo, o transporte de compostos intracelulares e a catalisação de etapas essenciais em
vias de biossíntese, agindo como moléculas sinalizadoras (DING et al., 2005). A atividade
elevada de GSTs tem sido associada à resistência aos inseticidas (organofosforados,
organoclorados e piretróides) em muitos insectos (CHE-MENDOZA; PENILLA;
RODRÍGUEZ, 2009).
Existem três famílias de GSTs, classificadas de acordo com sua localização na célula:
microssomal, citosólica e mitocondrial. A grande maioria das GSTs são proteínas diméricas
citosólicas e apenas esta família tem sido implicada em mecanismos de resistência aos
inseticidas químicos (HEMINGWAY et al., 2004). Desta família, pelo menos seis classes de
GSTs de insetos já foram identificadas em mosquitos, incluindo membros de An. gambiae s.l,
que são: Delta, Epsilon, Omega, Sigma, Teta e Zeta (RANSON et al.,2002). As classes Delta
e Epsilon, encontradas exclusivamente em artrópodes, são as maiores classes de GSTs e são
provavelmente as principais enzimas envolvidas na detoxificação de xenobióticos. Membros
de ambas as classes têm sido implicados na resistência aos principais grupos de inseticidas
químicos utilizados (HEMINGWAY et al., 2004; HEMINGWAY; RANSON, 2000;
RANSON et al., 2002).
41
A classe Epsilon é representada por um cluster de 8 genes nos mosquitos (GSTE1,
GSTE2, GSTE3, GSTE4, GSTE5, GSTE6, GSTE7 e GSTE8) localizado na posição 33B do
braço do cromossomo 3R do mosquito An. gambiae (DING et al., 2003; ORTELLI et al.,
2003). Nesta espécie, apenas o gene GSTE2 tem sido associado à resistência metabólica pois,
é super expresso em mosquitos resistentes ao DDT e codifica uma enzima que é muito
eficiente na catálise da desidrocloração deste inseticida (RANSON et al., 2001). Embora esta
classe de GST já foi implicada na resistência aos PYRs, pouco se sabe sobre os genes
responsáveis pelo aumento das taxas de detoxificação destes inseticidas que têm sido
relatados em várias populações de Anopheles (DAVID et al., 2005). Mutações no gene GSTE2
associadas à resistência aos inseticidas tem sido reportadas em populacões de An. gambiae s.l.
na África. Por exemplo, a mutação L119F neste gene, em An. gambiae s.l foi detectada em
Benin. Esta mutação pontual refere-se a substituição de uma leucina (CTT) por uma
fenilalanina (TTT) na posição 119 na proteína codificada (YAHOUÉDO et al., 2016). Além
de mosquitos do complexo Anopheles gambiae, essa mutação também tem sido encontrada
em populações de Anopheles funestus resistentes a DDT. (RIVERON et al., 2014).
42
7 MATERIAL E MÉTODOS
7.1 Tipo de estudo
Trata-se de um estudo do tipo descritivo e transversal baseado na coleta e análise de
dados primários, com o propósito de identificar genes associados à resistência à inseticidas
químicos nas populações naturais de Anopheles arabiensis da ilha de Santiago, Cabo Verde.
7.2 Área de estudo
Cabo Verde é um arquipélago de origem vulcânica situado no Oceano Atlântico a cerca
de 450 km da costa ocidental africana, a oeste de Dakar (Senegal) que ocupa uma superfície
de 4.033 km². É constituído por dez ilhas, das quais nove são habitadas além de vários ilhéus
(Figura 9). Estas ilhas estão divididas em dois grupos denominados de Barlavento, constituído
pelas ilhas de Santo Antão, São Vicente, Santa Luzia, São Nicolau, Sal e Boa Vista e
Sotavento, o qual contém as ilhas de Maio, Santiago, Fogo e Brava. O primeiro grupo está
situado ao norte e o segundo ao sul, de acordo com a posição que ocupam em relação ao vento
dominante do nordeste (ALBUQUERQUE; SANTOS, 1988; CABO VERDE, 2009). A
localização geográfica do arquipélago é favorável a migrações e trocas comerciais com a
África, Europa e as Américas.
A população residente em Cabo Verde é em torno de meio milhão de habitantes, com a
maioria (mais de 50% do total) situada na maior ilha do arquipélago, Santiago, que possui 991
km2. A cidade da Praia, situada ao sul desta ilha, é a capital do país e possui a maior
densidade demográfica (INSTITUTO NACIONAL DE ESTATÍSTICA DE CABO VERDE,
2010).
43
Figura 9 - Localização geográfica do arquipélago de Cabo Verde.
Fonte: editado no ArcGis (2018).
Climatologicamente o arquipélago é caracterizado como tropical seco, sem grandes
variações de temperatura (média anual de 25ºC) e com escassa pluviometria. A estação
chuvosa, de julho a outubro, é muito irregular e geralmente com poucas chuvas (média de 9
dias e 225 mm por ano) (BARROS, 2011). As modificações de temperatura e regime de
chuvas que vêm se verificando podem trazer maior abundância e disseminação de vetores e
patógenos.
De acordo com o IPCC (Painel Intergovernamental de Mudanças Climáticas), em 2080
a temperatura média em Cabo Verde poderá atingir os 28ºC, tendo em consideração a média
atual que é de 25ºC. A elevação da temperatura média poderá favorecer o incremento de
doenças de transmissão vetorial e as de veiculação hídrica tais como malária, dengue, febre-
amarela, doenças diarréicas, entre outras.
44
7.3 Amostragem
Amostras de larvas de Anopheles spp. foram coletadas em criadouros naturais e
artificiais como poças de água e tanques de armazenamento de água a céu aberto, usando
conchas adaptadas para a coleta de formas jovens.
As coletas foram realizadas em diferentes criadouros no peridomicilio, em três
loclidades na cidade da Praia (Figura 9): Caiada (W023˚33'33.40'', N14˚55'41.24''), Achada
Grande Tras (AGT) (W023˚29'13.53'', N14˚55'5.94'') e Fontom (W023˚31'16.64'',
N14˚54'22.61'') durante o mês de setembro de 2015. Caiada, situada a oeste da cidade, é uma
área semi-urbana e com uma ampla área agrícola. A densidade demográfica é menor,
comparada às localidades de Fontom e Achada Grande Trás. Fontom, por sua vez, situa-se a
sudeste, próxima a orla marinha, a aproximadamente 7 km de Caiada. É uma área urbana com
uma densidade populacional maior em comparação às outras duas localidades. Achada
Grande Trás, também considerada uma área urbana, encontra-se a leste da cidade da Praia, a
aproximadamente 4 km da localidade de Fontom. As larvas coletadas foram acondicionadas
em recipientes de plásticos, previamente identificados com o nome do local de coleta e data.
Este material foi levado ao laboratório de Entomologia da Universidade Jean Piaget de Cabo
Verde, onde as larvas dos mosquitos foram mantidas em bandejas plásticas contendo água e
ração de peixe Nutra Fish básica, rotuladas e separadas por localidade, sob condições padrão
(temperatura 25-28 ºC, umidade relativa 65-75% e com um ciclo de fotoperíodo de 12 h de
claro/escuro) para o desenvolvimento. Na fase de pupa as amostras foram transferidas para
gaiolas para posterior emergência dos adultos. Por sua vez, os mosquitos emergidos foram
alimentados com solução de sacarose (10%) e água (esterilizada) até no máximo três dias. Em
seguida, estes mosquitos foram mantidos a -20ºC por 30 a 40 min para que houvesse
imobilização e posterior identificação morfológica. Após a identificação morfológica, os
espécimes foram preservados em etanol a 70% e transportados para o Departamento de
Entomologia do Instituto Aggeu Magalhães (IAM), Fundação Oswaldo Cruz.
7.4 Identificação morfológica de mosquitos adultos
A chave de identificação morfológica, descrita por Ribeiro et al. (1980), foi usada para
diferenciar os mosquitos adultos do complexo An. gambiae de outros mosquitos do gênero
Anopheles.
45
7.5 Processamento das amostras
7.5.1 Extração de DNA
O DNA foi extraído de mosquitos individuais seguindo o protocolo usado
rotineiramente no Dept. de Entomologia do IAM descrito anteriormente por Ayres et al.
(2002).
Os mosquitos foram individualmente homogeneizados em 400 µl de tampão de lise
(NaCl 0,4 M, Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 e EDTA 2 mM, pH 8,0), 7 µl de proteinase K (10
mg/ml) e 72 µl de SDS 10% (Dodecil Sulfato de Sódio). O homogenato, foi incubado a 65ºC
por no mínimo 8 horas. Em seguida foram adicionados NaCl 5 M (420 µl) à suspensão, a
mistura foi homogeneizada (1 min) e centrifugada (9500 g, 20 min, 4ºC). O DNA foi
precipitado do sobrenadante pela adição de isopropanol (800 µl), após homogeneização em
vórtex. Em seguida, a mistura sobrenadante+isopropanol foi incubada (-20ºC, 1h) e
centrifugada (9500 g, 20 min, 4ºC). O sobrenadante foi descartado e o “pellet” foi lavado com
etanol 70% (500 µl) e ressuspendido em 100 µl de tampão TE (TRIS-EDTA, 10:1 mM). Após
serem ressuspendidas, as amostras de DNA foram quantificadas no Nanodrop 2000
(ThermoScientific) e em seguida armazenadas a -20 ºC até sua utilização nas reações de PCRs
(Polymerase Chain Reaction – Reação de polimerase em cadeia).
7.5.2 Identificação molecular das espécies
A identificação de espécies do complexo Anopheles gambiae foi feita por PCR, usando
primers específicos, que amplificam a região IGS3 (Intergenic spacers – espaçadores
intergênicos), já descritos anteriormente (COLLINS; PASKEWITZ, 1996; SCOTT;
BROGDON; COLLINS, 1993). O ensaio se baseia na utilização de cinco primers diferentes,
um primer de cadeia senso (forward) que anela com uma sequência na extremidade 5' do IGS,
a qual é idêntica em todas as espécies no complexo, e quatro primers de cadeia antisenso
(reverse), que são espécie-específicos. Os primers utilizados bem como os tamanhos dos
fragmentos específicos amplificados (amplicons esperados) para cada espécie estão descritos
no quadro 2.
3 Espaçadores intergênicos ou espaçadores de DNA são regiões de DNA não codificante entre genes. O termo é
usado particularmente para espaçadores de DNA entre as muitas cópias repetidas em tandem dos genes do RNA
ribossômico.
46
Quadro 2 - Primers usados na amplificação da região IGS do rDNA de espécies do complexo Anopheles
gambiae.
Primer Sequência (5’-3’) Tm (°C) Amplicom
(pb)
F UN GTGTGCCCCTTCCTCGATGT 58.3 -
R GA CTGGTTTGGTCGGCACGTTT 59.3 390
R ME TGA CCA ACC CAC TCC CTT GA 57.2 464-466
R AR AAG TGT CCT TCT CAA TCC TA 47.4 315
R QD CAG ACC AAG ATG GTT AGT AT 42.7 153
Fonte: o autor.
Legendas: UN = primer cadeia senso que se anela na mesma posição do DNAr de todas as espécies do complexo
An. ganbiae. GA, ME, AR, QD são primers reversos específicos respectivamente para as espécies: Anopheles
gambiae s.s, Anopheles merus e Anopheles meras, Anopheles arabiensis e Anopheles quadrianulatus. Tm =
tempratura média de anelamento.
Os comprimentos das sequências amplificadas entre o primer UN e cada um dos quatro
primers específicos são 153 pb para An. quadrianulatus, 315 pb para An. arabiensis, 390 pb
para An. gambiae s.s, 464 para An. melas e 466 pb para An. merus (Figura 10). A PCR foi
realizada com os reagentes descritos na Tabela 1. Alíquotas de DNA de Anopheles gambiae
s.s oriundo da plataforma CEPIA (Institute Pasteur, Paris) foram gentilmente cedidas pela
Dra. Maria Helena Silva do Departamento de Entomologia do IAM/FIOCRUZ-PE com o
propósito de mostrar um padrão de banda diferenciado no gel, entre as espécies.
47
Figura 10 – Perfil eletroforético de fragmentos amplificados por PCR, da região IGS de espécies do complexo
Anopheles gambiae.
Fonte: adaptado de Scott el al. (1993).
Legenda: 1 – Marcador molecular 1Kb plus DNA ladder; 2 – Anopheles arabiensis; 3 - Anopheles gambiae; 4 –
Anopheles merus; 5 – Anopheles meras; 6 – Anopheles quadriannulatus
Tabela 1 - Composição do mix da PCR para amplificação da região IGS do rDNA de Anopheles gambiae s.l.
Reagentes Volume de uso (µl) Concentração
final
H2O mili-Q autoclavada ---- Até perfazer 25µl
Tampão Green GoTaq® (Promega,
USA) 2,5
5X
dNTP (Promega, USA) 2,5 2 mM
primer QD 2,5 10 mM
primer UN 1,5 10 mM
primer ME 1,5 10 mM
primer GA 0,7 10 mM
primer AR 0,5 10 mM
MgCl2 (Promega, USA) 1,0 25 mM
TaqDNA polimerse (Promega, USA) 0,25 5 U/µl
DNA molde 2,0 10 ng/µl Fonte: o autor
A amplificação por PCR foi realizada em um termociclador programado para uma fase
inicial de desnaturação a 94°C durante 5 min, seguido de 30 ciclos, cada um com uma
temperatura de desnaturação a 94°C por 30 seg, anelamento a 60°C por 30 seg e uma extensão
a 72°C por 30 seg, seguido uma temperatura final de extensão a 72 °C durante 5 min. Para
48
conservação das amostras no termociclador após a reação, foi mantida uma temperatura de
10°C.
Após finalização da PCR, os produtos (8 µl) foram submetidos à separação em
eletroforese em gel de agarose 1,5% e visualizados em transiluminador de luz ultra-violeta
(UV). A distinção entre as espécies do complexo gambiae foi feita de acordo com o padrão de
bandas presente no gel, assim como descrito por Scott et al. (1993).
Adicionalmente, nove selecionadas aleatoriamente foram sequenciadas para confirmar
sua identidade. Após sequenciamento, a identidade das sequências das amostras foi
confirmada utilizando o nucleotide BLAST (BLASTn) a partir do banco de dados National
Center for Biotechnology Information (NCBI) (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
7.5.3 Identificação molecular de genes de resistência
Após a indentificação molecular das espécies, amostras selecionadas foram usadas para
investigação de alelos de resistência a inseticidas químicos através de PCR. Os genes
investigados foram: acetilcolinesterase (Ace-1), GSTE2, membro da família das Glutationa S-
transferases (GSTs) e canal de sódio (Nav). Mutações já descritas para estes genes foram
investigadas. Esses genes e suas respectivas mutações foram escolhidos para análise
molecular, por serem os principais genes associados à resistência aos inseticidas químicos em
populações de Anopheles spp., como já descrito na literatrura.
7.5.3.1 Detecção da mutação L119F no gene GSTE2 e análise de polimorfismos
Os primers forward (5’- AGTTCGCTGCGAAAATGTCC -3’) e reverse (5’-
CCAAATGCTTCCAAATTTAACTC-3’) foram usados para pesquisa do alelo de resistência
contendo a mutação L119F em um fragmento de 895 pb amplificado no gene GSTE2 que
inclui partes do exon I até parte do exon III e as sequências completas dos introns I e II
(Apêndice A) (MAIA, 2013). A PCR foi realizada usando o kit de PCR GoTaq® Flexi DNA
polymerase (Promega, USA) (a mistura da reação está descrita na Tabela 2), conforme as
instruções do fabricante, perfazendo um volume final de 25 µl. A amplificação seguiu a
seguinte programação: desnaturação a 94ºC por 2 min, 35 ciclos de desnaturação a 94ºC por 1
min, anelamento a 52ºC por 1 min, extensão a 72ºC por 1 min; e uma extensão final a 72ºC
por 5 min. Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1% e
49
visualizado em transiluminador UV. Todos os produtos de PCR foram enviados para
sequenciamento no equipamento ABI 3500xl (Applied Biosystems) do Núcleo de Plataformas
Tecnológicas do IAM e suas sequências foram analisadas no programa Bioedit (HALL,
1999).
Tabela 2 – Composição do mix PCR para a detecção da mutação L119F no gene GSTE2 de Anopheles
arabiensis.
Reagentes Volume de uso (µl) Concentração
final
H2O mili-Q autoclavada ------ Até perfazer 25µl
tampão Green GoTaq® (Promega, USA) 2,5 5X
dNTP (Promega, USA) 2,5 2 mM
Primer forward GSTE2-Ag 1,0 10 mM
Primer reverse GSTE2-Ag 1,0 10 mM
MgCl2 (Promega, USA) 1,0 25 mM
TaqDNA polimerase (Promega, USA) 0,25 5 U/µl
DNA molde 2,0 10 ng/µl Fonte : O autor
Uma análise adicional de polimorfismo no gene GSTE2, incluindo todos os introns e
exons, foi realizada em todos indivíduos usados para a detecção da mutação L119F. Os sítios
polimórficos foram detectados através de uma análise das sequências usando o BioEdit, no
qual foram feitos alinhamentos múltiplos das sequências usando o ClustalW. Todas as
sequências foram alinhadas com a sequência genômica completa de GSTE2 (código de
acesso: AARA008732) obtido a partir do VectorBase (http://www.vectorbase.org/) e os
polimorfismos não sinônimos foram identificados.
O DnaSP 5.10.01 foi usado para avaliar parâmetros genéticos tais como o número de
haplótipos, diversidade haplotípica e a diversidade nucleotídica (π), e testes de neutralidades
como Tajima’s D (D*) e Fu e Li's (D) (LIBRADO; ROZAS, 2009). Por se tratar de gene
nuclear, as sequências de GSTE2 que se apresentaram em heterozigose foram reconstruídas
com o algorítmo PHASE para fornecer a combinação de alelos mais provável de cada
sequência, ou seja, a sua fase gamética (STEPHENS et al., 2001).
50
7.5.3.2 Detecção da mutação G119S no gene Ace-1
O DNA genômico dos mosquitos foi amplificado usando os primers específicos
Ex3Agdir 5′GATCGTGGACACCGTGTTCG3′ e Ex3AGrev
5′AGGATGGCCCGCTGGAACAG3′ para pesquisa da mutação G119S no gene Ace-1,
seguindo o ensaio de PCR-RLFP (AÏZOUN et al., 2013; DABIRÉ et al., 2009;
NAMOUNTOUGOU et al., 2012; WEILL et al., 2004). O tamanho esperado do fragmento a
ser amplificado é de aproximadamente 541 pb e compreende uma região situada no éxon 3 do
gene (Apêndice B). A presença de G119S cria um sítio de restrição AluI nesta região dos
indivíduos resistentes, o qual é clivado por esta enzima e permite então, a distinção entre os
individuos susceptíveis e resistentes (WEILL et al., 2004). A PCR-RLFP foi realizada em um
volume final de 25 µl, como descrito na Tabela 3 e os produtos de PCR foram quantificados
no Nanodrop 2000.
Tabela 3 - Composição do mix PCR para a detecção da mutação G119S no gene Ace-1 de Anopheles arabiensis.
Reagentes Volume de uso (µl) Concentração
final
H2O mili-Q autoclavada ------ Até perfazer 25µl
tampão Green GoTaq® (Promega, USA) 2,5 5X
dNTP (Promega, USA) 2,5 2 mM
Primer ExAGdir 1,0 10 mM
Primer ExAGrev 1,0 10 mM
MgCl2 (Promega, USA) 1,0 25 mM
TaqDNA polimerase (Promega, USA) 0,25 5 U/µl
DNA molde 2,0 10 ng/µl Fonte: o autor
A amplificação por PCR foi realizada em um termociclador utilizando as seguintes
condições: um passo inicial de desnaturação a 95°C durante 5 min, seguido de 35 ciclos, cada
um com uma desnaturação de 30 seg a 94°C, anelamento 30 seg a 56°C e uma extenção de 30
seg a 72°C, seguido de uma temperatura final de extensão a 72°C por 5 min. Para conservação
no termociclador, foi mantida uma temperatura de 10°C. Os produtos de PCR foram
analisados por eletroforese em gel de agarose 1,5% e visualizado em transiluminador U.V.
A reação de digestão pela enzima de restrição AluI (New England Biolab) para detectar
a mutação G119S no gene Ace-1 foi feita seguindo as instruções do fabricante. A mistura da
reação está descrita na Tabela 4.
51
Tabela 4 - Composição da mistura de reação da digestão enzimática para a detecção da mutação G119S no gene
Ace-1.
Reagentes Volume de uso
(µl)
Concentração
final
H2O mili-Q autoclavada 16,0 Até perfazer
25µl
Tampão 10X CutSmartTM
Buffer (New england biolab) 1,0 (1X) 1X
Enzima AluI 0,5 5U/µl
Produto de PCR 7,5 ---- Fonte: o autor
A reação foi incubada a 37°C por 180 min para que ocorresse a clivagem do fragmento
e, por último, incubada a 80°C durante 20 min para interromper a atividade enzimática da
digestão. Após a clivagem enzimática, os produtos (5 µl) foram submetidos a eletroforese em
gel de agarose 2%. Esta digestão produz dois fragmentos nos mosquitos homozigotos
susceptíveis (SS): um de 403 pb e outro de 150 pb. Nos indivíduos homozigotos (RR)
resistentes, a digestão produz um fragmento de 253 pb e outro 150 pb. Os indivíduos
heterozigotos (RS) mostram uma combinação das três bandas relatadas a cima (BAFFOUR-
AWUAH et al., 2016). Amostras aleatórias (dez) do produto de PCR Ace-1 também foram
sequenciadas para confirmar os resultados obtidos a partir da digestão enzimática.
7.5.3.3 Detecção de mutações do tipo Kdr no gene Nav
Para pesquisa de mutação do tipo Kdr foi amplificado um fragmento de 458 pb usando
os primers Anarabkdr FW (5'-TTTACAATGCCAACGCAATC-3') e Anarabkdr REV (5'-
GATCTTGGTCCATGTTAATTTGC-3') desenhados por Paiva (dados não publicados) para
detecção de possíveis mutações pontuais: L1014F e/ou L1014S (Apêndice C).
A PCR foi realizada usando o kit de PCR GoTaq® Flexi DNA polymerase (Promega,
USA), conforme as instruções do fabricante (Tabela 5). A amplificação foi realizada sob as
seguintes condições: desnaturação inicial a 95°C por 2 min e 35 ciclos de 94°C por 30 seg,
55°C por 30 seg, 72°C durante 30 seg e 72°C por 5 min. Os produtos de PCR foram
analisados por electroforese em gel de agarose 1,5% e visualizado em transiluminador UV.
52
Tabela 5 - Composição do mix PCR para a detecção de mutações L1014S/1014F no gene Nav de Anopheles
arabiensis.
Reagentes Volume usado (µl) Concentração
final
H2O mili-Q autoclavada ------ Até perfazer 25µl
tampão Green GoTaq® (Promega, USA) 2,5 5X
dNTP (Promega, USA) 2,5 2 mM
Primer Anarabkdr FW 1,0 10 mM
Primer Anarabkdr REV 1,0 10 mM
MgCl2 (Promega, USA) 1,0 25 mM
TaqDNA polimerase (Promega, USA) 0,25 5U/µl
DNA molde 2,0 10 ng/µl Fonte: O autor
7.6 Sequenciamento de DNA, análise e deteção de mutações
Todos os produtos de PCR dos genes analisados foram enviados para sequenciamento
no Núcleo de Plataformas Tecnológicas (NPT) do IAM. Para os produtos de PCR para o gene
Ace-1 apenas 10 amostras aleatórias foram sequenciadas. O sequenciamento foi feito no
equipamento ABI 3500xl (Applied Biosystems) e a análise das sequências foi feita no Bioedit
(versão 7.2.6).
Todos os eletroferogramas gerados a partir do sequenciamento foram analisados no
Programa CodonCode Aligner (versão 4.7) para uma avaliação da qualidade das sequências,
edição e montagem dos contigs. Sequências com qualidade ≥ 20 foram utilizadas para gerar as
sequências consenso com base no programa PHRED. O alinhamento das sequências e
identificação das mutações foi feito no programa BioEdit (versão 7.2.6).
53
8 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
O trabalho não envolve aspectos éticos com procedimento envolvendo seres humanos
ou animais de laboratório. Sendo assim não se fez necessário obter o parecer do Comitê de
Ética em Pesquisa (CEP) e/ou da Comissão de ética no uso de Animais (CEUA).
54
9 RESULTADOS
9.1 Identificação morfológica de mosquitos adultos
Um total de 501 mosquitos do gênero Anopheles coletados nas três localidades da
cidade da Praia foram identificados morfologicamente. No entanto, houve uma perda de 61
amostras4, restando apenas 440 indivíduos que foram usados para análises posteriores.
Destes, 230 (52,3%) pertenciam ao complexo An. gambiae, coletados predominante na
localidade de Fontom, e o restante (47,7%) correspondeu a espécie Anopheles pretoriensis,
este com predominância nas localidades de Caiada e Achada Grande Trás. A Tabela 6 mostra
os dados de identificação morfológica dos indivíduos analisados e os respectivos locais de
coleta:
Tabela 6 - Mosquitos identificados de acordo com a chave de identificação morfológica de Ribeiro et al. (1980)
e os respectivos locais de coleta na cidade da Praia, Cabo Verde.
Locais de coleta Espécies
An. pretoriensis An. gambiae s.l
Caiada 112 35
AGT 98 11
Fontom 0 184
Total 210 (47,7%) 230 (52,3%)
Fonte: o autor
9.2 Identificação molecular das espécies
A análise dos 230 exemplares, para identificação de espécies por PCR, mostrou que
Anopheles arabiensis foi a única espécie do complexo An. gambiae presente nas áreas de
estudo, de acordo com o padrão de bandas apresentado no gel de agarose resultante da
amplificação do DNA (Figura 11).
Nove produtos de PCR identificadas como Anopheles arabiensis foram sequenciados
com sucesso e sua identidade confirmada (Apêndice D).
4 Tubos descartados por falhas na identificação das amostras.
55
Figura 11 – Perfil eletroforético de fragmentos amplificados a partir do gene IGS utilizado para identificação
molecular de mosquitos do complexo Anopheles gambiae: Gel de agarose 1,5% visualizado em luz ultravioleta.
Fonte: o autor.
Legenda: MM – Marcador molecular 1Kb plus DNA ladder em pares de bases (pb); CN – controle negativo da
reação; 1 a 3 – Anopheles arabiensis; 4 e 5 – Anopheles gambiae s.s; 6 e 7 – Amostras identificadas
morfologicamente como Anopheles pretoriensis, usadas como controle negativo.
9.3 Detecção da mutação L119F no gene GSTE2 e análise de polimorfismos
Do total de 230 indivíduos da espécie Anopheles arabiensis identificados por PCR e
sequenciados para o gene GSTE2, foram obtidas 215 sequências com qualidade satisfatória
para as análises. Para detectar a presença da mutação (L119F) neste gene, foi analisada a
sequência codante completa (600 pb) do fragmento amplificado. A mutação pontual L119F
não foi encontrada em nenhuma amostra das três localidades de coleta. No entanto, a análise
das ORF (Open Reading Frame – fase de leitura aberta) de todas as sequências revelou a
presença de seis sítios polimórficos, com duas mutações sinônimas e quatro não sinônimas
(V18A, E19Q, V131L, P181L) (Figura 12). As mutações não sinônimas foram detectadas em
72 indivíduos, sendo a maioria correspondente a V131L. A localidade que exibiu amostras
com maior número de mutação foi Fontom com 65 indivíduos (Tabela 7).
CN
56
Figura 12 – Alinhamento múltiplo de sequências de aminoácidos do gene GSTE2 de Anopheles arabiensis. 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
GSTE2 VB MSKLVLYTLH LSPPCRAVEL AAKALGLELE QKTINLLTGD HLKPEFVKLN PQHTIPVLDD NGTIITESHA IMIYLVTKYG KDDSLYPKDP VKQARVNSAL
452 GSTE2 ---------- -------... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
360 GSTE2 ---------- -------... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
371 GSTE2 ---------- -------A.. .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
417 GSTE2 ---------- -------.Q. .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
384 GSTE2 ---------- -------.Q. .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
153 GSTE2 ---------- -------... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
GSTE2 VB HFESGVLFAR MRFIFERILF FGKSDIPEDR VEYVQKSYEL LEDTLVDDFV AGPSMTIADF SCISTISSIM GVVPLEQSKH PRIYAWIDRL KQLPYYEEAN
452 GSTE2 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... L......... ..........
360 GSTE2 .......... .......... .......... L......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
371 GSTE2 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
417 GSTE2 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
384 GSTE2 .......... .......... .......... L......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
153 GSTE2 .......... .......... .......... L......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
210 220
....|....| ....|....| ..
GSTE2 VB GGGGTDLGKF VLAKKEENAK A*
452 GSTE2 .......... .......--- --
360 GSTE2 .......... .......--- --
371 GSTE2 .......... .......--- --
417 GSTE2 .......... .......--- --
384 GSTE2 .......... .......--- --
153 GSTE2 .......... .......--- --
Fonte: O autor.
Legenda: Os sítios conservados estão representados por pontos e os sítios variáveis por seus respectivos símbolos.
GSTE2 VB: Sequência codante de GSTE2 de Anopheles arabiensis retirado do vectorbase (identificação do gene: AARA008732. Acesso em http://www.vectorbase.com)
57
Tabela 7 - Substituições não sinônimas de nucleotídeos na ORF de GSTE2 de Anopheles arabiensis e
distribuição dos indivíduos que apresentam esses polimorfismos em três localidades da cidade da Praia, dentre
215 sequências analisadas.
Posição na ORF* Substituições não
sinónimas
Distribuição
Caiada AGT Fontom
18 T (Val) C (Ala) 0 0 5
19 G (Glu) C (Gln) 0 0 8
131 G (Val) C (Leu) 3 4 49
181 C (Pro) T (Leu) 0 0 3
Total - - 3 4 65 Fonte: o autor.
* - código de acesso (AARA008732) da sequência de GSTE2 de Anopheles arabiensis, no vector base.
A análise das sequências completas de GSTE2 com um comprimento total de 763 pb5
(600 pb para os 3 exons e 163 pb para os dois introns), de 215 mosquitos identificados como
An. arabiensis (das três localidades em estudo), revelou a presença de 37 haplótipos, 16 sítios
polimórficos (10 e 6 sítios polimórficos nos introns e exons, respectivamente) e uma
diversidade nucleotídica de 2,67 (Tabela 8). Em relação aos testes de neutralidade, o teste
Tajima’s D mostrou-se não significativo (P > 0,10) com um valor de D negativo. O teste de
Fu e Li's demonstrou ser positivo com um p estatístico significativo (p-value <0,05).
Tabela 8 - Parâmetros genéticos e testes de neutralidade, de regiões codante e não codante do gene GSTE2 de
215 indivíduos de Anopheles arabiensis coletaos em três localidades da cidade da Praia.
Tamanho do fragmento Parâmetros genéticos
s H hd Π D D* θ
Fragmento completo (763pb) 16 37 0,757 2,67 -0,605 ns 1,644 s 3,16
Região codante (600pb) 6 11 0,499 1,01 -0,830 ns 1,08 ns 1,51
Região não codante (163pb) 10 21 0,722 8,81 -0,292 ns 1,3 ns 9,24 Fonte: o autor.
Legenda: S, número de sítios polimórficos; h, número de haplótipos; hd, deviversidade haplotípica; π,
diversidade nucleotídica multiplicado por 103; D, teste de Tajima; D*, teste de Fu e Li's; ns, não significante; s,
estatisticamente significante. P < 0,05; θ, estimador de Watterson (por sítio) multiplicado por 103
9.4 Detecção da mutação no gene Ace-1
A mutação G119S no gene Ace-1, que confere resistência aos organofosforados e
carbamatos, não foi detectada em nenhuma amostra, de 230 indivíduos investigados. A
digestão com a enzima de restrição Alu1 revelou que todos os indivíduos são homozigotos
5 Tamanho das sequências, após edição no programa CodonCode Aligner (versão 4.7).
58
para o genótipo suscetível (SS) (Tabela 9). A análise de sequências, escolhidas
aleatoriamente, também confirmou a ausência da mutação G119S.
Tabela 9 – Genótipo do locus Ace-1 de Anopheles arabiensis nas diferentes localidades de coleta da Praia, Cabo
Verde.
Locais de coleta N Genótipos
SS RR RS
Caiada 35 35 0 0
AGT 11 11 0 0
Fontom 184 184 0 0
Total 230 230 0 0 Fonte: o autor.
Legenda: N- Número de Anopheles arabiensis analisados.
9.5 Detecção de mutações do tipo Kdr no gene Nav
Do total de 230 indivíduos da espécie Anopheles arabiensis, 201 foram sequenciados
para o gene Nav e 192 sequências tiveram qualidade satisfatória para as análises. Destes
mosquitos genotipados para as mutações kdr-east (L1014S) e kdr-west (L1014F), 26
apresentaram o genótipo de heterozigotos (RS) e um homozigoto (RR) para a mutação
L1014S, os demais (165) eram homozigotos para o genótipo susceptível (SS) (Apêndice E). A
frequência alélica de L1014S encontrada foi de 7,3% (Tabela 10). Essa mutação foi
encontrada com maior frequência em individuos coletados na localidade de Fontom (Figura
13). A mutação L1014F não foi detectada nessa população de Anopheles arabiensis analisada.
Tabela 10 – Genótipo e frequência do alelo L1014S do gene Nav da população de Anopheles arabiensis em
localidades de coleta da cidade da Praia, Cabo Verde.
Localidades Genótipos Frequência alélica
N RR RS SS
R S
Fontom 159 1 22 136 0,075 0,925
Caiada 22 0 3 19
0,068 0,932
AGT 11 0 1 10
0,045 0,955
Total 192 1 26 165
0,073 0,927 Fonte : O autor.
Legenda: R – alelo resistente L1014S. S – alelo selvagem. RR – individuos homozigotos resistentes. RS –
individuos heterozigotos. SS indivíduos homozigotos susceptiveis
59
Figura 13 - Distribuição da frequência alélica de L1014S do gene Nav nas localidades de coleta, na cidade da
Praia, Cabo Verde.
Fonte: O autor.
Legenda: n –número total de indivíduos usados para deteção das mutações L1014S/ L1014L no gene Nav.
60
10 DISCUSSÃO
No contexto mundial, Cabo Verde está na lista dos 21 países que estão em vias de
eliminação da malária até 2020 (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2016c).
Esforços têm sido feitos e o controle vetorial apresenta-se como uma importante estratégia no
contexto da eliminação da malária. Entretanto, um aumento brusco no número de casos
recentemente no ano de 2017 revela a possibilidade de novas epidemias da doença no país
(BOLETIM INFORMATIVO DO MINISTÉRIO DA SAÚDE DE CABO VERDE, 2017).
Além disso, o surgimento da resistência aos inseticidas nas populações de An. arabiensis de
Cabo Verde poderá comprometer as ações de controle da doença, dificultando a obtenção da
eliminação até o período previsto.
O presente trabalho avalia, pela primeira vez, a presença de alelos de resistência no
vetor da malária, An. arabiensis, em Cabo Verde. Até o momento, só existe um trabalho
publicado sobre resistência em populações de Ae. aegypti da ilha de Santiago, tendo esta
população mostrado uma resistência baixa a organofosforados (temephos) e piretróides
(deltametrina) (ROCHA et al., 2015).
Da análise total de amostras para identificação taxonômica molecular, foi possível
confirmar que a única espécie do complexo An. gambiae até o momento identificada em Cabo
Verde continua sendo An. arabiensis, como descrito por Cambournac et al. (1982) e Ribeiro
et al. (1980). No entanto, torna-se necessário a realização de um levantamento entomológico,
com uma maior cobertura espacial a fim de obter um panorama de distribuição mais preciso
de Anopheles arabiensis em Cabo Verde. Fontom foi a localidade que apresentou maior
número de Anopheles arabiensis coletados. Este fato pode estar relacionado a maior
densidade demográfica e um maior número de criadouros propícios para o desenvolvimento
de mosquitos desta espécie nesta localidade. Por outro lado, nas outras duas localidades,
Caiada e Achada Grande Trás, verificou-se uma predomiância de Anopheles pretoriensis
quando comparado ao número de Anopheles arabiensis coletado. Esses resultados sugerem
que essas duas espécies, embora coabitem num mesmo espaço, têm um padrão de distribuição
diferente. Isto na prática, tem uma implicação importante para o controle vetorial, pois os
agentes de saúde devem estar cientes das áreas com maior nível de infestação vetorial para
priorizar a aplicação de inseticidas nestas áreas com maior nível de infestação por An.
arabiensis possivelmente o único vetor da malária no país.
A não detecção, neste estudo, de duas principais mutações associadas à resistência
descritas para Anopheles sp: Ace-1R por insensibilidade do sitio alvo e L119F por resistência
61
metabólica aponta para a não seleção desses alelos que afetam a funcionalidade da
acetilcolinesterase e GSTE2, respectivamente, mas não descarta a possibilidade de perda de
suscetibilidade por alteração de outros sistemas de desintoxicação como a família
monooxigenases, esterases ou outras enzimas da família das GSTs (OLÉ SANGBA et al.,
2017). Sendo assim, testes bioquímicos a fim de avaliar a atividade dessas enzimas de
detoxificação devem ser realizados (SOUMAILA et al., 2017). Grande parte das pesquisas
com insetos, incluindo Anopheles spp., Ae. aegypti e Culex spp., tem demostrado elevada
atividade enzimática das monooxigenases. Esse aumento de atividade enzimática tem
resultado em mosquitos cada vez mais resistentes aos inseticidas. Análises de microarray e
transcriptoma em cada uma dessas espécies identificaram conjuntos variáveis de transcritos de
P450 nas familias CYP4, CYP6, CYP9, CYP12, CYP305, CYP307, CYP314 e CYP325,
cujos membros foram super expressos em diferentes populações resistentes a inseticidas (em
comparação com populações sensíveis a inseticidas) (DJOUAKA et al., 2008; HEMINGWAY
et al., 2004; MATOWO et al., 2014; MONTELLANO, 2015; MÜLLER et al., 2008). Além
disso, vários trabalhos têm relatado o aumento da atividade das enzimas esterases e GSTs em
insetos, incluindo mosquitos resistentes a inseticidas (DJADID et al., 2006; SAMRA et al.,
2012). Por exemplo, elevada atividade de esterase foi encontrada em Culex pipiens sensu lato
após exposição a piretrina, na Califórnia (KAMITA et al., 2016). Cisse et al. (2015) relataram
um aumento da atividade de α e β-esterases em mosquitos An. gambiae s.l resistentes a
piretróides, em Mali. Quanto às GSTs, associação entre a atividade elevada de GST e a
resistência a organofosforados, organoclorados e piretróides em muitas espécies de insetos
tem sido reportada (RANSON et al., 2001). YAHOUÉDO et al. (2016) observaram níveis
elevados de GST em populações de Anopheles resistentes a piretróides, em Benim. Já
Lumjuan et al. (2005) relataram atividade elevada de GSTE2 que confere resistência ao DDT
em Aedes aegypti, na Tailândia.
A análise das sequências de DNA de GSTE2 neste revelou a presença de mutações não
sinônimas na região codificante do gene e uma abundância de polimorfismos. Investigações
futuras, como expressão gênica e docking molecular, devem ser realizadas para verificar se
essas mutações encontradas na região codificante desempenham um papel importante na
resistência aos inseticidas (SAMRA et al., 2012). Estudos anteriores com AgGSTE2 e o DDT
demostraram que os resíduos, Glu116, Phe120, Arg112 e Leu36 são tidos como componentes
importantes do sítio-ativo de AgGSTE2 na interação direta com o DDT. Estes resíduos atuam
formando um “pocket” que interagem hidrofobicamente com o DDT (SETZER, 2011;
WANG et al., 2008). As mutações não sinônimas observadas no presente trabalho não
62
correspondem a nenhum destes sítios citados anteriormente. Por outro lado, duas substituições
de aminoácidos observadas aqui (V18A e E19Q) estão situadas em um domínio extremamente
conservado (entre a a posição 16 e 30 da proteína codificada) entre todos os membros de
GSTs da classe epsilon em várias espécies de Anopheles (AYRES et al., 2011), o que pode
indicar seleção positiva representando adaptações específicas para esta espécie.
Recentemente, Mitchell et al. (2014) descreveram uma variante GSTE2-I114T, com uma
frequência alélica de até 79% para a forma M de An. gambiae, que está significativamente
associada à resistência ao DDT em mosquitos fêmeas na África Ocidental. Pontes et al. (2016)
também demonstraram, num estudo de dinâmica molecular, que o polimorfismo F120L no
gene AgGSTE2 está associado a resistência ao DDT em An. gambiae.
A alta frequência de polimorfismos verificados no GSTE2 da população estudada, pode
estar associada a uma grande variabilidade de fenótipos. A grande diversidade genética para
este gene e valor positivo significativo para o teste de Fu e Li (Tabela 8) indicam que o gene
GSTE2 da população estudada pode estar sob seleção positiva. No entanto, o teste de Tajima
mostrou-se negativo não siginificante. Mirabello e Conn (2006) também encontraram D de
Tajima negativo, no entanto siginificativo, em populações de Anopheles darlingi na Amárica
do sul e descreveram esse resultado como expanção recente no tamanho da população, após
efeito gargalo. O fenômeno de seleção positiva pode ser devido ao uso intensivo de
inseticidas, na cidade da Praia, em particular nas localidades do estudo, entre as quais Fontom,
historicamente considerada como um dos pontos com maior número de casos de malária no
país, portanto, recebendo controle realizado pelo programa local e fortalecimento das
intervenções realizadas antes e depois da estação chuvosa por pulverização intra-domiciliar.
Por outro lado, a seleção positiva também pode estar associado a adaptação de estádios
larvares aos xenobióticos do ambiente ou outras condições adversas, como a temperatura,
seca, entre outros. Segundo Yan et al. (1998), a habilidade de adaptação de um organismo
depende de sua variabilidade genética. Assim, o estudo da estrutura genética da população é
essencial para o entendimento da dinâmica das populações do vetor e para a análise de fatores
responsáveis pela resistência e adaptação ecológica (MÜLLER; MARCONDES; NAVARRO-
SILVA, 2010). O estudo de diversidade genética com An. arabiensis relizado por Simard et
al. (2000) no Senegal, ao longo de vários meses, incluindo um período de seca, demostrou,
por exemplo, que durante a estação de seca, quando as populações desse vetor caíram
drasticamente, a diversidade genética continuou constante. O estudo também demonstrou uma
baixa diferenciação genética entre duas populações amostradas em locais distantes 250 km
entre si, sugerindo a possibilidade da existência de um contínuo fluxo gênico entre as mesmas.
63
Comparando os parâmetros genéticos de GSTE2 da população de Anopheles arabiensis
de Cabo Verde com os parâmetros de Anopheles funestus de outros países do continente
africano, se observam valores similares em países como Camarões (hd: 0,89; π: 2,9),
Moçambique (hd: 0,95; π: 3,6) e Malawi (hd: 0,78; π: 4,4). No entanto, esses parâmetros
genéticos são significativamente maiores quando comparados com os de Benin (hd: 0,088; π:
0,09) (RIVERON et al., 2014). Esta ampla gama de histórias evolutivas para o mesmo gene de
desintoxicação em populações de Anopheles do continente africano pode ser explicada pelas
diferenças geográficas que existem nos alelos de resistência descritos para Anopheles sp.
(DONNELLY; ISAACS; WEETMAN, 2016).
Em relação à busca de mutações em genes que codificam proteínas alvo de inseticidas,
foram investigadas uma importante mutação G119S no gene Ace-1 e duas mutações Kdr no
gene Nav. Estudos realizados em diferentes países da África, relataram a presença da mutação
G119S no gene Ace-1 em populações de An. gambiae s.l com variações de frequência alélica
de 1% a 75% (AIZOUN et al., 2013; DABIRÉ et al., 2014; DJOGBÉNOU et al., 2008; HIEN
et al., 2017; SADIA-KACOU et al., 2017; WEILL et al., 2004). Por outro lado, assim como
neste estudo, em alguns países da África Ocidental e Central como Gana, Burkina Faso e
Camarões, estudos realizados com mosquitos do complexo An. gambiae, também revelaram a
ausência da mutação G119S nas populações estudadas (ANTONIO-NKONDJIO et al., 2016;
BAFFOUR-AWUAH et al., 2016; NAMOUNTOUGOU et al., 2012).
A ausência da mutação G119S no presente estudo, pode indicar que o uso de
organofosforados, nomeadamente temephos, nos programas de controle vetorial em Cabo
Verde não está selecionando alelos associados à resistência do tipo sítio-alvo para aos
organofosforados.
Em relação ao gene Nav, este estudo relata, pela primeira vez, a presença do alelo
L1014S kdr em populações de An. arabiensis em Cabo Verde, com uma frequência alélica
relativamente baixa (0,073) e na maioria dos casos em heterozigose nos indivíduos avaliados.
Esse achado por si só não permite inferir que os mosquitos genotipados para o gene Nav de
An. arabiensis são resistentes, mas revela a presença deste alelo de resistência, o qual poderá
ser selecionado rapidamente, caso não seja feito nenhum manejo no uso de piretróides através
de IRS. Sendo assim, bioensaios (dose resposta com larvicida, testes de garrafa com
adulticida, etc) para avaliar a suscetibilidade in vivo são necessários para medir o fenótipo
desses mosquitos aos inseticidas da classe dos piretróides (deltametrina) empregados no
controle vetorial em Cabo Verde (KABULA et al., 2014). Torna-se também necessário uma
investigação mais aprofundada (maior número e distribuição amostral) para determinar a
64
distribuição geográfica do alelo L1014S kdr e avaliar a sua associação com o uso de
inseticidas químicos nas regiões onde é feito o controle vetorial com inseticidas químicos
(NAMOUNTOUGOU et al., 2013).
Em populações de mosquitos An. arabiensis, o alelo L1014S kdr tem sido encontrado
com maior frequência no leste da África, no entanto, assim como em Cabo Verde, o mesmo já
foi relatado em outros paises da África ocidental, com frequências diversas, tais como em
Benin (16% à 57%), Burkina Faso (16% à 40%) e Kenia (0,50% à 50%) (DJÈGBÈ et al.,
2011; JONES et al., 2012; KAWADA et al., 2011b; NAMOUNTOUGOU et al., 2013;
OCHOMO et al., 2015; WANJALA et al., 2015). Esses achados fornecem evidências da
disseminação da mutação L1014S no gene Nav em populações de An. gambiae s.l na África
Ocidental. Das regiões de estudo, Fontom foi a localidade que se apresentou com maior
frequência alélica, assim como foi observado para maior frequência de polimorfismos no gene
GSTE2. Este fato provavelmente pode estar relacionado ao uso, com mais frequência, de
inseticidas nesta localidade em relação as outras analisadas neste estudo.
O alelo L1014F kdr tem sido relatado em vários países da África em mosquitos do
complexo An. gambiae, principalmente na África ocidental com frequências alélicas variando
de 0.04% a 98% (ALEMAYEHU et al., 2017; KWIATKOWSKA et al., 2013; NIANG et al.,
2016; YEWHALAW et al., 2010). No entanto, neste estudo esse alelo não foi encontrado na
população de Anopheles arabiensis analisada. Do mesmo modo, em outros países da África
como Quênia e Burkina Faso o alelo L1014F também se mostrou ausente em mosquitos do
complexo Anopheles gambiae (JONES et al., 2012; KAWADA et al., 2011b).
Os resultados encontrados no presente estudo constituem um alerta para as autoridades
competentes de Cabo Verde já que, pela primeira vez no arquipélago, foi detectado o alelo
L1014S kdr, o qual está associado à resistência aos piretróides em An. arabiensis.
Principalmente no momento atual em que o Ministério de Saúde de Cabo Verde tem adotado
o uso de mosquiteiros impregnados para conter o surto de malária no país.
Por conseguinte, há necessidade de criar medidas que evitem a fixação do alelo na
população de mosquitos analisada. Sendo assim, a criação de um programa de monitoramento
da suscetibilidade de Anopheles arabiensis aos inseticidas, a detecção precoce da dispersão de
alelos de resistência, bem como o estabelecimento de estratégias de manejo de uso de
inseticidas e outras ações de controle (ambiental, proteção pessoal, etc) que previnam a
seleção de alelos podem constituir uma mais valia para o controle de vetores em Cabo Verde,
no contexto da erradicação da malária até 2020.
65
11 CONCLUSÕES
Dos mosquitos pertencentes ao complexo Anopheles gambiae, apenas Anopheles
arabiensis foi identificado nas amostras coletadas nas três localidades da cidade da Praia,
estando mais concentrada na lolalidade de Fontom.
Não foram identificadas mutações associadas à resistência previamente descritas para o
complexo Anopheles gambiae, nos genes Ace-1 e GSTE2, na população da cidade da Praia,
sugerindo que o uso de temephos nos programas de controle em Cabo Verde não está
selecionado alelos associados a resistência na popuação estudada.
Análises do gene GSTE2 revelaram alta frequência de polimorfismos, que geram uma
alta diversidade genética na população estudada. Sendo assim, estudos futuros deverão
investigar a associação dessas novas mutações com a resistência aos inseticidas.
A análise do gene Nav, demonstrou a ausência da mutação L1014F e presença da
mutação L1014S, em baixa frequência, nessas populações de Anopheles arabiensis da Cidade
da Praia.
Dentre as localidades, Fontom foi a que apresentou maior frequência do alelo L1014S
kdr no gene Nav. Esse resultado sugere que, as campanhas de controle realizadas em Cabo
Verde com piretróides através de IRS, podem estar exercendo uma pressão de seleção, embora
a frequencia alélica do alelo L1014S kdr encontrada nesse estudo foi baixa. Adicionalmente, o
uso de mosquiteiros impregnados com piretróides poderá selecionar rapidamente estes alelos
de resistência, compromentendo assim a campanha para a redução da transmissão da malária
em Cabo Verde.
Esses resultados servem de base e apontam a necessidade de realizar bioensaios
conforme as recomendações da OMS que avaliem a suscetibilidade das populações de An.
arabiensis em Cabo Verde para os inseticidas utilizados localmente, bem como o
desenvolvimento de estudos que elucidem quais são os mecanismos moleculares envolvidos
na resistência.
66
12 RECOMENDAÇÕES
Diante dos resultados encontrados neste estudo, recomenda-se:
Uma avaliação bio-ecológica de Anopheles arabiensis na Cidade da Praia e uma
investigação mais ampla com um maior número de amostras.
Vigilância entomológica com ênfase na infecção por Plasmodium spp., sazonalidade e
padrão de distribuição do vetor em Cabo Verde.
Monitoramento dos genes associados à resistência aos inseticidas químicos, com
atenção especial ao alelo L1014S kdr encontrado neste estudo.
Avaliação da suscetibilidade in vivo das populações de Anopheles arabiensis através de
bioensaios para determinar o fenótipo da população em relação aos inseticidas químicos
usados no controle em Cabo verde.
Priorizar áreas com maior infestação de Anopheles arabiensis racionalizando assim o
uso dos recursos em programas de controle vetorial no país, principalmente na cidade da Paia.
67
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78
APÊNDICE A – Alinhamento de sequências amplificadas dos genes GSTE2, Ace-1 e Nav.
A.1 - Alinhamento da sequência codificante do gene GSTE2 de Anopheles arabiensis amplificado e a proteina
resultante (vector base: AARA008732).
Legendas: Setas verticais – primeiro (74 pb) e segundo (89 pb) introns; triângulo – codon onde ocorre a mutação
L119F.
* - Codon de parada
Fonte: O autor
.
79
A.2 - Alinhamento da sequência codificante do gene Ace-1 de Anopheles arabiensis amplificado e a respetiva proteína resultante (vector base: AGAP001356). 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
ATGGAGATCCGAGGGCTGCTGATGGGTAGACTACGGTTAGGACGGCGGATGGTTCCGCTGGGTCTGCTCGGCGTGACCGCGCTGCTACTAATCCTGCCAC
M E I R G L L M G R L R L G R R M V P L G L L G V T A L L L I L P
110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CCTTCGCGCTGGTGCAGGGCCGGCACCACGAGCTCAACAATGGTGCCGCCATCGGATCGCATCAGCTGTCGGCTGCCGCCGGTGTTGGCCTTGCCTCCCA
P F A L V Q G R H H E L N N G A A I G S H Q L S A A A G V G L A S Q
210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
GTCCGCCCAGTCCGGATCGCTCGCATCCGGTGTGATGTCATCCGTTCCTGCTGCCGGAGCGTCATCCTCCTCCTCGTCGTCGCTGCTGTCATCGTCAGCC
S A Q S G S L A S G V M S S V P A A G A S S S S S S S L L S S S A
310 320 330 340 350 360 370 380 390 400
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
GAGGACGACGTGGCGCGCATTACTCTCAGCAAGGACGCAGACGCATTTTTTACACCATATATAGGTCACGGTGAGTCCGTACGAATTATAGATGCCGAGT
E D D V A R I T L S K D A D A F F T P Y I G H G E S V R I I D A E
410 420 430 440 450 460 470 480 490 500
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
TGGGCACGCTCGAGCATGTCCACAGTGGAGCAACGCCGCGGCGACGCGGCCTGACGAGGCGCGAGTCAAACTCGGACGCGAACGACAACGATCCGCTGGT
L G T L E H V H S G A T P R R R G L T R R E S N S D A N D N D P L V
510 520 530 540 550 560 570 580 590 600
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
GGTCAACACGGATAAGGGGCGCATCCGCGGCATTACGGTCGATGCGCCCAGCGGCAAGAAGGTGGACGTGTGGCTCGGCATTCCCTACGCCCAGCCGCCG
V N T D K G R I R G I T V D A P S G K K V D V W L G I P Y A Q P P
610 620 630 640 650 660 670 680 690 700
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
GTCGGGCCGCTACGGTTCCGTCATCCGCGGCCGGCCGAAAAGTGGACCGGCGTGCTGAACACGACCACACCGCCCAACAGCTGCGTGCAGATCGTGGACA
V G P L R F R H P R P A E K W T G V L N T T T P P N S C V Q I V D
Primer F
80
710 720 730 740 750 760 770 780 790 800
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CCGTGTTCGGCGACTTCCCGGGCGCGACCATGTGGAACCCGAACACGCCCCTGTCCGAGGACTGTCTGTACATTAACGTGGTGGCACCGCGACCCCGGCC
T V F G D F P G A T M W N P N T P L S E D C L Y I N V V A P R P R P
810 820 830 840 850 860 870 880 890 900
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CAAGAATGCGGCCGTCATGCTGTGGATCTTCGGCGGCGGCTTCTACTCCGGCACCGCCACCCTGGACGTGTACGACCACCGGGCGCTTGCGTCGGAGGAG
K N A A V M L W I F G G G F Y S G T A T L D V Y D H R A L A S E E
910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AACGTGATCGTGGTGTCGCTGCAGTACCGCGTGGCCAGTCTGGGCTTCCTGTTTCTCGGCACCCCGGAAGCGCCGGGCAATGCGGGACTGTTCGATCAGA
N V I V V S L Q Y R V A S L G F L F L G T P E A P G N A G L F D Q
1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 1100
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
ACCTTGCGCTACGCTGGGTGCGGGACAACATTCACCGGTTCGGTGGCGATCCGTCGCGTGTGACACTGTTCGGCGAGAGTGCCGGTGCCGTCTCGGTGTC
N L A L R W V R D N I H R F G G D P S R V T L F G E S A G A V S V S
1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
GCTGCATCTGCTGTCCGCCCTTTCCCGCGATCTGTTCCAGCGGGCCATCCTGCAGAGCGGCTCGCCGACGGCACCGTGGGCATTGGTATCGCGCGAGGAA
L H L L S A L S R D L F Q R A I L Q S G S P T A P W A L V S R E E
1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1300
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
GCCACACTAAGAGCACTGCGGTTGGCCGAGGCGGTCGGCTGCCCGCACGAACCGAGCAAGCTGAGCGATGCGGTCGAGTGCCTGCGCGGCAAGGACCCGC
A T L R A L R L A E A V G C P H E P S K L S D A V E C L R G K D P
1310 1320 1330 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
ACGTGCTGGTCAACAACGAGTGGGGCACGCTCGGCATTTGCGAGTTCCCGTTCGTGCCGGTGGTCGACGGTGCGTTCCTGGACGAGACGCCGCAGCGTTC
H V L V N N E W G T L G I C E F P F V P V V D G A F L D E T P Q R S
1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 1480 1490 1500
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
GCTCGCCAGCGGGCGCTTCAAGAAGACGGAGATCCTCACCGGCAGCAACACGGAGGAGGGCTACTACTTCATCATCTACTACCTGACCGAGCTGCTGCGC
L A S G R F K K T E I L T G S N T E E G Y Y F I I Y Y L T E L L R
A
Primer R
81
1510 1520 1530 1540 1550 1560 1570 1580 1590 1600
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AAGGAGGAGGGCGTGACCGTGACGCGCGAGGAGTTCCTGCAGGCGGTGCGCGAGCTCAACCCGTACGTGAACGGGGCGGCCCGGCAGGCGATCGTGTTCG
K E E G V T V T R E E F L Q A V R E L N P Y V N G A A R Q A I V F
1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 1690 1700
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AGTACACCGACTGGACCGAGCCGGACAACCCGAACAGCAACCGGGACGCGCTGGACAAGATGGTGGGCGACTATCACTTCACCTGCAACGTGAACGAGTT
E Y T D W T E P D N P N S N R D A L D K M V G D Y H F T C N V N E F
1710 1720 1730 1740 1750 1760 1770 1780 1790 1800
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CGCGCAGCGGTACGCCGAGGAGGGCAACAACGTCTACATGTATCTGTACACGCACCGCAGCAAAGGCAACCCGTGGCCGCGCTGGACGGGCGTGATGCAC
A Q R Y A E E G N N V Y M Y L Y T H R S K G N P W P R W T G V M H
1810 1820 1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890 1900
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
GGCGACGAGATCAACTACGTGTTCGGCGAACCGCTCAACCCCACCCTCGGCTACACCGAGGACGAGAAAGACTTTAGCCGGAAGATCATGCGATACTGGT
G D E I N Y V F G E P L N P T L G Y T E D E K D F S R K I M R Y W
1910 1920 1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CCAACTTTGCCAAAACCGGCAATCCAAATCCCAACACGGCCAGCAGCGAATTCCCCGAGTGGCCCAAGCACACCGCCCACGGACGGCACTATCTGGAGCT
S N F A K T G N P N P N T A S S E F P E W P K H T A H G R H Y L E L
2010 2020 2030 2040 2050 2060 2070 2080 2090 2100
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
GGGCCTCAACACGTCCTTCGTCGGTCGGGGCCCACGGTTGAGGCAGTGTGCCTTCTGGAAGAAGTACCTTCCCCAGCTAGTTGCAGCTACCTCGAACCTA
G L N T S F V G R G P R L R Q C A F W K K Y L P Q L V A A T S N L
2110 2120 2130 2140 2150 2160 2170 2180 2190 2200
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CCAGGGCCAGCACCGCCTAGTGAACCGTGCGAAAGCAGCGCATTTTTTTACCGACCTGATCTGATCGTGCTGCTGGTGTCGCTGCTTACGGCGACCGTCA
P G P A P P S E P C E S S A F F Y R P D L I V L L V S L L T A T V
2210
....|....|....
GATTCATACAATAA
R F I Q *
Legendas: Setas verticais – indicam a posição de cada intron; Setas pretas – indicam as posições de anelamento dos primers. Elipse - codon onde pode ocorrer a mutação
G119F; triângulo – posição onde ocorre a substituição de nucleotídeos. Fonte: O autor.
82
A.3 - Alinhamento da sequência de nucleotídeos amplificada do gene Nav de Anopheles arabiensis (GeneBank: KR867649.1).
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
TTATTTGCAATGTACATGCATTATGCTCTTTACAATGCCAACGCAATCCCTGTTAAAGAAAATGCATTAACGATAAGCTTTTAGAAAAAGGTTTAGAGAA
110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
ACAGCTTACAATGTCTTGATGATCAATTCAAGTAGTCTACTAGCTTATTCTCAATTATTATATATTCACAAACGCAAATTTAATGCTTTGTGACAGATTT
210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CATCAGAAAATCAGTGTTTTGCTAGCCTAATTGCTTTTTTCCTTTTCTTTAATATACTTTTTCCAGATAATGTGGATAGATTCCCCGACCATGATCTGCC
310 320 330 340 350 360 370 380 390 400
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AAGATGGAATTTTACAGATTTCATGCATTCCTTCATGATTGTGTTCCGTGTGCTATGCGGAGAATGGATTGAATCAATGTGGGATTGTATGCTTGTCGGT
410 420 430 440 450 460 470 480 490 500
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
GATGTATCCTGCATACCATTTTTCTTGGCCACTGTAGTGATAGGAAATTTAGTCGTAAGTAATGCAAATTAACATGGACCAAGATCGTTTTTACATGACA
..
TT
Legendas: em cinza – Sequência codante (exon 20); em verde –codon onde ocorre as mutações L1014S (TTA/TCA) e L1014F (TTA/TTT); Setas – região de anelamento dos
primers.
Fonte: O autor.
TCA
TTT
83
APÊNDICE B – Tabela 1
Tabela 1 - Amostras de Anopheles gambiae s.l submetidos à análise de PCR e identificados como Anopheles
arabiensis usando o marcador “intergenic spacers” (IGS).
Amostras
Species IDa Max
Score
Total
score
Query
Cover E value
b Identity
c Acession in
GenBankd
177_ An. arabienis An. arabienis 496 496 100% 2e-136 100% AF470110.1
178_ An. arabienis An. arabienis 496 496 100% 2e-135 100% AF470110.1
336_ An. arabienis An. arabienis 494 494 100% 6e-136 100% AF470110.1
337_ An. arabienis An. arabienis 494 494 100% 6e-136 100% AF470105.1
338_ An. arabienis An. arabienis 484 484 100% 3e-133 100% AF470110.1
339_ An. arabienis An. arabienis 481 481 100% 4e-132 100% AF470110.1
340_ An. arabienis An. arabienis 475 475 100% 2e-130 100% AF470110.1
341_ An. arabienis An. arabienis 486 486 100% 9e-134 100% AF470110.1
342_ An. arabienis An. arabienis 477 477 100% 5e-131 100% AF470110.1 a BLAST no GenBank;
b probabilidade de observar o resultado por acaso;
cPercentual de similaridade entre as
amostras Blastadas e a sequências do GeneBank; dcódigo de acesso no GeneBank.
Fonte: O autor
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APÊNDICE C - Figura 1
Figura 1 - Eletroferogramas gerados a partir do sequenciamento do exon 20 do gene Nav de Anopheles
arabiensis.
Fonte: O autor.
Legenda: Figura A – eletroferograma de mosquitos susceptível (sem alteração de nucletídeos na posição 1014 do
gene). Figura B – eletroferogrma de mosquitos heterozigotos para o genótipo L1014S (TTA/TYA). Figura C –
eletroferograma de mosquitos homozigotos para o genótipo L1014S (TTA/TCA).