departamento de quÍmica analÍtica

DEPARTAMENTO DE QUIacuteMICA ANALIacuteTICA

FACULTAD DE CIENCIAS

UNIVERSIDAD DE EXTREMADURA

TESIS DOCTORAL

MENCIOacuteN DOCTOR EUROPEO

UTILIZACIOacuteN DE SENtildeALES FLUORESCENTES PARA EL

ANAacuteLISIS Y CARACTERIZACIOacuteN DE VINOS MEJORA DE LA

SENSIBILIDAD Y SELECTIVIDAD MEDIANTE

DERIVATIZACIOacuteN FOTOQUIacuteMICA

USEFULNESS OF FLUORESCENCE SIGNALS FOR ANALYSIS

AND CLASSIFICATION OF WINES IMPROVEMENT OF

SENSITIVITY AND SELECTIVITY BY MEANS OF

PHOTOCHEMICAL DERIVATIZATION

Diego Airado RodriacuteguezBadajoz 2008

Edita Universidad de Extremadura Servicio de Publicaciones Caldereros 2 Planta 3ordf Caacuteceres 10071 Correo e publicacunexes httpwwwunexespublicaciones









por

Diego Airado Rodriacuteguez

VISADO en Badajoz a 30 de Abril de 2008

Dra Dordf Teresa Galeano DiacuteazProfesora TitularDpto de Quiacutemica AnaliacuteticaFacultad de CienciasUniversidad de Extremadura

Dra Dordf Isabel Duraacuten Martiacuten-MeraacutesProfesora TitularDpto de Quiacutemica AnaliacuteticaFacultad de CienciasUniversidad de Extremadura

Memoria de Investigacioacuten presentada para optar al Grado de Doctor Europeodentro del Programa de Doctorado ldquoCiencias Quiacutemicasrdquo Bienio 2004-2006 yrealizada en el Departamento de Quiacutemica Analiacutetica de la Universidad deExtremadura

Fdo Diego Airado Rodriacuteguez


Campus UniversitarioAvda de Elvas sn06071-BADAJOZ (ESPANtildeA)Teleacutefono (+34 924) 289300 y 289375FAX (+34 924) 289375

ARSENIO MUNtildeOZ DE LA PENtildeA CASTRILLO Catedraacutetico y Director del

Departamento de Quiacutemica Analiacutetica de la Facultad de Ciencias de la Universidad

de Extremadura

I N F O R M A

Que el trabajo que se presenta en esta TESIS DOCTORAL con el tiacutetulo de

UTILIZACIOacuteN DE SENtildeALES FLUORESCENTES PARA EL ANAacuteLISIS Y

CARACTERIZACIOacuteN DE VINOS MEJORA DE LA SENSIBILIDAD Y

SELECTIVIDAD MEDIANTE DERIVATIZACIOacuteN FOTOQUIacuteMICA ha sido

realizado bajo la direccioacuten de las Dras Dordf Teresa Galeano Diacuteaz y Dordf Isabel Duraacuten

Martiacuten-Meraacutes en el Departamento de Quiacutemica Analiacutetica de la Facultad de Ciencias

de la Universidad de Extremadura y reuacutene todos los requisitos para poder optar al

Grado de Doctor Europeo en Ciencias Quiacutemicas

Badajoz 30 de Abril de 2008

OBJETO DE LA TESIS DOCTORAL

El objeto de esta Memoria de Investigacioacuten es doble - Por una parte se centra en el desarrollo de nuevos meacutetodos

analiacuteticos para la determinacioacuten en vino de resveratrol y sus derivados compuestos con importantes implicaciones en la salud humana y que han despertado un gran intereacutes en la sociedad en los uacuteltimos antildeos Se pretende mejorar los meacutetodos anteriormente propuestos para la determinacioacuten de estos compuestos fundamentalmente en lo referido a su sensibilidad rapidez y sencillez Para ello nos basaremos en la fotorreaccioacuten que sufren estos compuestos estilbenoides la cual probablemente es una reaccioacuten de ciclacioacuten en la cual se originan derivados del fenantreno moleacutecula altamente fluorescente

- Otro objetivo de este trabajo es aportar nuevas metodologiacuteas para facilitar la tipificacioacuten de muestras de vino y la deteccioacuten de fraude en la industria del vino para lo que se pretende hacer uso de sentildeales fluorescentes de tres viacuteas en combinacioacuten con herramientas quimiomeacutetricas

DOCTORAL THESIS OBJECTIVE The purposes of this Report of Investigation are

- On the one hand the development of new analytical

methods for the determination of resveratrol derivatives in wine samples It has been demonstrated that these compounds have beneficial effects on human health and a great interest has been aroused in society in recent years The main objective is improving the previously proposed methods for the analysis of these compounds in terms of sensitivity speed and simplicity For that we will use the photoreaction that stilbenoids compounds suffer which is probably a cyclation reaction in which phenanthrene derivatives are originated

- On the other hand new methodologies for wine

classifications and fraud detection will be developed Three-way fluorescence signals will be used in combination with chemometric tools

IacuteNDICE CAPIacuteTULO I Introduccioacuten Parte I Resveratrol El Compuestohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip3 Resveratrol en vinohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10 Efectos bioloacutegicos de resveratrolhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14 Los compuestos fenoacutelicos de la uvahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18 Parte II Antecedentes bibliograacuteficos para el anaacutelisis de resveratrol28 Aparatos reactivos y software utilizados en este trabajo de investigacioacutenhelliphelliphellip55 Capiacutetulo II Determinacioacuten de resveratrol en vino mediante fluorescencia fotoinducida de segunda derivada y extraccioacuten liacutequido-liacutequido ANTECEDENTEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip73 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN Estudio baacutesico sobre las propiedades de intereacutes analiacutetico de trans-resveratrolhellip76 Efecto de la irradiacioacuten ultravioleta externa sobre las propiedades absorbentes y fluorescentes de trans-resveratrolhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip87 Estudio extracto-espectrofluorimeacutetrico de trans-resveratrol Aplicacioacuten al anaacutelisis de muestras de vinohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip98 Perspectivas de futurohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip109

Capiacutetulo III Anaacutelisis de piceido en vinos mediante fluorescencia fotoinducida aplicando segunda-derivada a los espectros de emisioacuten ANTECEDENTEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip113 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN Estudio baacutesico sobre las propiedades de intereacutes analiacutetico de trans-piceidohelliphellip115 Efecto de la irradiacioacuten ultravioleta externa sobre las propiedades absorbentes y fluorescentes de trans-piceidohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip124 Estudio extracto-espectrofluorimeacutetrico de trans-piceido Aplicacioacuten al anaacutelisis de muestras de vinohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip135 Perspectivas de futurohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip149 Capiacutetulo IV Determinacioacuten de resveratrol y piceido totales en vino sin tratamiento previo mediante derivatizacioacuten fotoquiacutemica off line-HPLC ANTECEDENTEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip153 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN Estudios fluorescentes previoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip156 Estudios cromatograacuteficos previoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip158 Optimizacioacuten quimiomeacutetrica de la composicioacuten de la fase moacutevil para el anaacutelisis de vinohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip165 Determinacioacuten de las cantidades totales de resveratrol y piceido en muestras de vinohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip171 Perspectivas de futurohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip177

Capiacutetulo V Anaacutelisis de los isoacutemeros de resveratrol y piceido en vinos mediante HPLC isocraacutetica con deteccioacuten fluorescente previa derivatizacioacuten post-columna en liacutenea ANTECEDENTEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip181 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN Estudios fluorescentes previoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip186 Estudios cromatograacuteficos previoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip187 Optimizacioacuten quimiomeacutetrica de las condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis isocraacutetico de trans-resveratrol y trans-piceido en muestras de vinohelliphelliphelliphelliphelliphellip190 Foto-isomeriacutea cis-trans Evidencia de la presencia de cis-isoacutemeros de resveratrol y piceido en vinoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip205 Aplicacioacuten Anaacutelisis de los isoacutemeros de resveratrol y piceido en vinoshelliphelliphelliphellip219 Capiacutetulo VI Utilizacioacuten de sentildeales fluorescentes de tres viacuteas (matrices de excitacioacuten-emisioacuten) para caracterizacioacuten de vinos ANTECEDENTEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip229 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN Muestras de vino incluidas en el modelohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip235 Matrices de excitacioacuten-emisioacuten de fluorescenciahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip237 Construccioacuten del modelo PARAFAChelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip242 Anaacutelisis de componentes principales de los valores de PARAFAC-scorehelliphelliphellip249 Identificacioacuten de los fluoroacuteforos presentes en vinohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip258 Utilizacioacuten de las sentildeales de autofluorescencia total del vino en combinacioacuten con herramientas quimiomeacutetricas para asegurar la pertenencia del vino a una DOhellip267 Perspectivas de futurohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip273

Capiacutetulo VII Anaacutelisis de resveratrol en vinos tintos mediante voltamperometriacutea de redisolucioacuten adsortiva de onda cuadrada ANTECEDENTEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip277 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN Puesta a punto del procedimientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip281 Paraacutemetros analiacuteticos de calidadhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip304 Anaacutelisis de trans-resveratrol en muestras de vinohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip306 Seguimiento cromatograacutefico de las etapas de limpiezahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip311 Perspectivas de futurohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip312

CAPIacuteTULO I

INTRODUCCIOacuteN

CAPIacuteTULO I Introduccioacuten

2


3

PARTE I RESVERATOL EL COMPUESTO

Se conocen hasta 30 estilbenoides y estilben-glucoacutesidos que se encuentran naturalmente en diversas especies del reino vegetal dentro de las espermatofitas1 Como su propio nombre indica el esqueleto estructural de todos ellos consta de un puente viniacutelico que sirve de unioacuten a dos anillos aromaacuteticos (esqueleto estilbenoide) A partir de esta estructura quiacutemica relativamente sencilla la naturaleza ha sido capaz de crear una gran variedad de compuestos variando entre ellos tanto el nuacutemero como la posicioacuten de grupos hidroxilos la extensioacuten en que dichos grupos hidroxilos se encuentran a su vez sustituidos por azuacutecares por grupos metilo metoxi u otros residuos y la configuracioacuten esteacuterica de moleacuteculas quiacutemicamente ideacutenticas Otra causa de variacioacuten que aumenta mucho maacutes el nuacutemero de sustancias integrantes de esta familia es su habilidad para existir como diacutemeros triacutemeros o poliacutemeros mayores

Uno de los compuestos maacutes conocidos dentro de este grupo de

estilbenoides es la moleacutecula en la que se centra gran parte del trabajo que se describe en esta memoria el resveratrol 34rsquo5-trihidroxiestilbeno cuya foacutermula estructural es la siguiente

Figura 1- Foacutermula estructural de trans-resveratrol

HO

OH

OH

4 3

5


4

Respecto al origen del nombre resveratrol el profesor Yutaka Ebizuka de la Universidad de Tokio propone lo siguiente2

bull res puede estar relacionado con la clase de moleacuteculas a las que pertenece el resveratrol los resorcinoles

bull veratr abreviatura del nombre de la planta Veratrum grandiflorum en la que se encontroacute resveratrol por primera vez en 1940

bull ol indicativo de la presencia de grupos hidroxilo

La siacutentesis de resveratrol en el laboratorio puede llevarse a cabo a traveacutes de una reaccioacuten de Witting uniendo dos anillos fenoacutelicos apropiadamente sustituidos a traveacutes de un doble enlace de estireno como describen inicialmente Moreno-Mantildeas y Pleixats3 Cuando la siacutentesis se lleva a cabo mediante esta ruta se parte de precursores metilados para proteger los grupos hidroxilos los cuales son posteriormente liberados mediante tribromuro de boro El producto final de esta ruta sinteacutetica es el trans-resveratrol que es el uacutenico isoacutemero del resveratrol que existe en la naturaleza y el uacutenico que se comercializa (Sigma-Aldrich)

Como ocurre con otros estilbenoides el trans-resveratrol se produce de forma natural en un amplio nuacutemero de familias vegetales encontraacutendose en 72 especies vegetales (distribuidas en 31 geacuteneros y 12 familias) y estaacute ampliamente distribuido tanto en gimnospermas como en dicotiledoacuteneas1 algunas de las cuales constituyen productos empleados en la dieta humana como los cacahuetes o las moras

El resveratrol es identificado en 1940 por primera vez en la raiacutez del eleacuteboro

blanco (Veratrum Grandiflurum O Loes) y despueacutes en las raiacuteces secas de la planta Poligonum Cuspidatum llamada Ko-jo-kon en japoneacutes siendo eacutesta una de las fuentes maacutes ricas de resveratrol La planta es ampliamente empleada en la


5

medicina tradicional china y japonesa en el tratamiento de enfermedades tales como dermatitis supurativa gonorrea tintildea favosa pie de atleta ehiperlipidemia4-7 En 19768 se descubrioacute la existencia de este compuesto en la vid Vitis vinifera

El trans-resveratrol es una fitoalexina producida en las plantas a nivel celular y para tratar de ubicar dicha moleacutecula debe considerarse en primer lugar coacutemo y por queacute se genera

El metabolismo celular de las plantas puede definirse a traveacutes de la suma

de todas las reacciones enzimaacuteticas que tienen lugar en la ceacutelula pudieacutendose diferenciar dos fases claramente diferenciadas

la fase en la que intervienen todos los procesos degradativos y que es conocida como catabolismo y

la fase constructiva o biosinteacutetica del metabolismo conocida como anabolismo

Bajo este punto de vista puede decirse que el trans-resveratrol es un

anabolito ya que esta moleacutecula se genera en las ceacutelulas de las plantas con el objetivo de cumplir una misioacuten especiacutefica ser un pesticida natural a traveacutes del cual y junto con otros anabolitos la plata se defiende de agresiones externas

Cuando una planta es infectada por un agente patoacutegeno la primera

respuesta estaacute localizada en las ceacutelulas con las que dicho agente entra en contacto directo Estas ceacutelulas reconocen la estructura del patoacutegeno o alguna de las moleacuteculas fundamentales para el desarrollo de su actividad siendo la respuesta primaria maacutes frecuente de la planta la reaccioacuten por necrosis en la que las ceacutelulas infectadas por el agente patoacutegeno mueren fenoacutemeno conocido como muerte celular programada (PCD) Ademaacutes estas ceacutelulas directamente afectadas por el


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patoacutegeno producen una serie de moleacuteculas que alertan a las ceacutelulas adyacentes de la infeccioacuten y que reciben el nombre de moleacuteculas elicitadoras9 desarrollaacutendose en dichas ceacutelulas adyacentes la conocida como respuesta secundaria al reconocer a las moleacuteculas elicitadoras producidas en la interaccioacuten primaria Estas viacuteas de defensa implican que las ceacutelulas de las plantas poseen sistemas permanentes de vigilancia capaces de detectar los estiacutemulos generados por el agente patoacutegeno elicitando de este modo la respuesta defensiva en la planta10 El tercer tipo de respuesta defensiva es inducida hormonalmente en la planta11 y es a traveacutes de la cual la planta forma compuestos conocidos como fitoalexinas que trataraacuten de frenar la actividad patoacutegena

Muchas plantas producen metabolitos secundarios (no implicados en las reacciones metaboacutelicas vitales para la planta) con funciones antifuacutengicas Estos compuestos antifuacutengicos pueden encontrarse en plantas saludables que no han sufrido infeccioacuten patoacutegena alguna actuando como mecanismo de barrera frente a las mismas y recibiendo en este caso el nombre de fitoancipinas Se reserva la denominacioacuten de fitoalexinas para los metabolitos secundarios antifuacutengicos que son sintetizados en respuesta al ataque patoacutegeno con el fin de cesar su invasioacuten12 En general las fitoalexinas pueden definirse como moleacuteculas antimicrobianas de bajo peso molecular acumuladas en las plantas como resultado de una infeccioacuten patoacutegena o tras haber sido sometidas a condiciones de estreacutes13

Entre los efectos desencadenantes de la produccioacuten de trans-resveratrol en plantas se pueden citar los siguientes

Infecciones fuacutengicas como la Botrytis Cinerea14 la Plasmopara Vitiacutecola15 la Phomopsis Vitiacutecola16 o la Rhizopus Stonifer17

Dantildeo de la planta Tratamiento con sales como tricloruro de aluminio18


7

Tratamiento con ozono19 Radiacioacuten Ultravioleta

Como se ve en la Figura 2 los precursores inmediatos de resveratrol son el

p-cumaril-CoA y el malonil-CoA en una relacioacuten molar de 13

Figura 2- Ruta biosinteacutetica desde p-cumaril-CoA hasta resveratrol

El p-cumaril-CoA se genera a partir de la fenilalanina la cual en las plantas es sintetizada a partir de azuacutecares mediante la ruta del aacutecido shikiacutemico20 en primer lugar se produce la peacuterdida del grupo amino de la fenilalanina mediante deaminacioacuten oxidativa catalizada por la enzima especiacutefica fenilalanina-amonio-liasa dando lugar a aacutecido cinaacutemico el cual es hidroxilado a aacutecido p-cumaacuterico por


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accioacuten de la enzima cinamato-4-hidroxilasa y finalmente transformado en p-cumaril-CoA por accioacuten de una CoA-ligasa Sobre este sustrato pueden entrar en accioacuten dos enzimas clave la calcona-sintasa (CHS) o la estilbeno-sintasa (STS) En ambos casos tal y como se indica en la ruta biosinteacutetica representada en la Figura 2 (las tres condensaciones son las marcadas en color) se produce la condensacioacuten de p-cumaril-CoA con tres moleacuteculas de malonil-CoA dando lugar a una tetracetona Hasta este punto ambas enzimas actuacutean de manera ideacutentica

A continuacioacuten se produce la ciclacioacuten de la tetracetona lineal y es

precisamente la manera en la que esta ciclacioacuten se lleva a cabo la principal diferencia entre ambas enzimas En el caso de la CHS se liberan 3 moleacuteculas de CO2 en el proceso y el producto final de esta ruta es la calcona el cual es el precursor comuacuten de la familia de los flavonoides familia a la que pertenece la quercetina Cuando la enzima que actuacutea es la STS el producto final de la reaccioacuten es el trans-resveratrol liberaacutendose cuatro moles de CO2 por mol de resveratrol formado

La mayoriacutea de las especies de la familia Vitaceae poseen ambos enzimas

Como dato curioso puede citarse el siguiente Hain et al21 aiacuteslan el gen de la STS de la vid y lo transfirieron al tabaco encontrando que las plantas de tabaco transgeacutenicas resultantes son mucho maacutes resistentes a la infeccioacuten por Botrytis

cinerea Las fitoalexinas dado su caraacutecter antifuacutengico son candidatos idoacuteneos para ser utilizados como pesticidas naturales Dichos pesticidas naturales se plantean como una buena alternativa a los sinteacuteticos teniendo en cuenta la inmunidad desarrollada por ciertas especies patoacutegenas la toxicidad y los grandes tiempos necesarios para la degradacioacuten de estos uacuteltimos


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El tratamiento post-cosecha de la uva con luz ultravioleta (concretamente UVC) produce un estreacutes en la uva que hace que eacutesta en respuesta a dicho dantildeo induzca la siacutentesis de resveratrol Esta misma tecnologiacutea se estaacute aplicando actualmente a uvas de mesa y a uvas de vinificacioacuten para obtener nuevas frutas ldquofuncionalesrdquo22 23 y vinos enriquecidos en resveratrol24

Las fuentes de resveratrol en la naturaleza no son muchas y menos auacuten

las plantas y vegetales de consumo humano conteniendo este compuesto En la Figura 3 se representan las fuentes naturales maacutes importantes de aporte de resveratrol y no existe duda acerca de que las fuentes que maacutes aportan a la dieta humana son los productos derivados de la vid esto es la uva y el vino25 Figura 3- Fuentes de resveratrol en la naturaleza


10

En la uva los mayores niveles de resveratrol se encuentran en las pieles estando praacutecticamente ausente en la pulpa y en las pepitas del fruto26 Otras fuentes de resveratrol son el cacahuete27 28 los araacutendanos29 la Reynoutria

Japonica las moras y en especies herbaacuteceas (Poaceae incluyendo Festuca

Hordeum Poa Stipa y Lolium spp)

Respecto a la existencia de este compuesto en aacuterboles merece la pena destacar su presencia en eucalipto piacutecea y pino asiacute como en el aacuterbol tropical de hoja caduca Bauhinia racemosa

Son pocas las plantas florales en las que se encuentra resveratrol Las dos

uacutenicas que se conocen son la ya mencionada Veratrum Grandiflurum en la que se encuentran altas concentraciones de resveratrol en las hojas cuando la planta es dantildeada por tratamiento con agentes quiacutemicos30 y la Veratrum formosanum cuya raiacutez y rizomas son relativamente ricos en resveratrol tanto que ha sido empleada en Oriente como tratamiento alternativo para la hipertensioacuten31 Tambieacuten estaacute descrita la presencia de resveratrol en Pterolobium hexapetallum una legumbre no comestible32

Recientemente Counet et al33 describen la presencia de trans-resveratrol y

trans-piceido por primera vez en chocolate negro (al menos 04 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y 10 μgmiddotmL-1 de trans-piceido) y licor de cacao (al menos 05 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y 12 μgmiddotmL-1 de trans-piceido) Resveratrol en vino

La identificacioacuten de resveratol en vinos es relativamente reciente y data de 1992 antildeo en que el isoacutemero trans es identificado por Siemman y Creasy34 Estos


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autores llevan a cabo la cuantificacioacuten de este compuesto en vinos tintos y blancos encontrando que las concentraciones variacutean entre 066 μgmiddotmLminus1 y 068 ngmiddotmLminus1 en vinos tintos y desde 100 ngmiddotmLminus1 a menos de 023 ngmiddotmLminus1 para vinos blancos Justifican los menores niveles encontrados en vinos blancos en base al hecho de que en la uva el resveratrol se encuentra en las pieles y no en la pulpa y el proceso de elaboracioacuten del vino blanco implica un prensado maacutes ligero del fruto y un menor tiempo de contacto entre el mosto y los hollejos Se pone de manifiesto en este primer trabajo una gran variabilidad en el contenido de resveratrol en vino y su dependencia de factores tales como la casta de la uva el origen geograacutefico la cosecha y las teacutecnicas de vinificacioacuten Entre las variables que maacutes influyen en el contenido de los cuatro compuestos en vino ademaacutes de las ya mencionadas se ha encontrado que son muy importantes ciertos aspectos de las teacutecnicas de vinificacioacuten como por ejemplo la maceracioacuten con hollejos35

Un antildeo maacutes tarde Jeandet et al36 describen la presencia del isoacutemero cis

en vino En 1994 Waterhouse y Lamuela-Raventoacutes37 publican la existencia de

resveratrol-3-β-D-glucoacutesido (piceido) en uvas Ese mismo antildeo Roggero y Archier38

basaacutendose en su espectro de absorcioacuten en el ultravioleta describen la existencia de un glucoacutesido indefinido del resveratrol en vino Posteriormente en el antildeo 1995 Lamuela-Raventoacutes et al39 identifican este glucoacutesido en vino tinto como piceido utilizando un estaacutendar de piceido extraiacutedo de la raiacutez del Poligonum Cuspidatum y proponen un meacutetodo para el anaacutelisis de los isoacutemeros trans y cis del glucoacutesido y la aglicona (Figura 4) en vino


12

Figura 4- Estructuras quiacutemicas de las formas de resveratrol objeto de esta tesis

Los mismos autores40 proponen en 1996 un meacutetodo para la cuantificacioacuten

de los cuatro analitos en vinos blancos y rosados siendo en este caso necesario una etapa de preconcentracioacuten dados los menores niveles encontrados en estos vinos

Fremot en el antildeo 2000 publica un trabajo de recopilacioacuten donde se

recogen las cantidades de resveratol yo piceido encontradas en vinos de diferentes paiacuteses y en distintos tipos de vino Los resultados se muestran en la Tabla 1

OH

HO

HO

OH

HOOH OH

HO

OHOH

O

HHO

H

HO

H

H

HO

H

O

OH

O

H

OHH OH

H

H HO

H

O

OH

trans - Resveratrolcis -Resveratrol

trans-Piceido cis-Piceido


13

Tabla 1- Concentraciones de resveratrol yo piceido en vinos tinto41

Origen Concentracioacuten de Resveratrol (μgmL-1) (1) Ref

USA Chardonnay hasta 01

Los vinos de California presentan concentraciones maacutes bajas que los de New York

Francia Burdeaux entre 03 - 06

34

Francia (Burgundy) Pinot noir entre 04 - 2 36

USA (California)

Pinot noir entre 02 - 07 Cabernet Sauvignon lt 009

42 Comparacioacuten entre vinos de Norte Ameacuterica

Australia y Europa

Todos contienen entre 01 - 12 Los procedentes de California Australia e Italia

presentan concentraciones maacutes bajas que los de Oregoacuten Canadaacute y Francia

43

USA (California) lt 002-17 (maacuteximas concentraciones en Pinot noir 5)

Francia Beaujolais (Gamay) entre 32 - 36 44

Francia

Resveratrol 05 - 5 piceido 0 - 145 Vinos procedentes de uvas Cabernet franc Gamay y

Grenache presentan concentraciones menores que los procedentes de Pinot noir Mourvegravedre y Cabernet

Sauvignon

44

USA (California) Isoacutemeros del resveratrol entre 03 ndash 3 38

Espantildea

Resveratrol total (aglicona+glucoacutesido) entre 25 - 138 (transgtcis)

Cantidades totales seguacuten el tipo de uva Pinot noir 51 Merlot 4 Grenache 24 Cabernet

Sauvignon 14 Tempranillo 13

39

Europa Isoacutemeros de la aglicona (transgtcis)

Contenido medio seguacuten paiacutes Francia 37 - 71 Italia 12 Espantildea Portugal 28 Europa central 31

Suiza 69

45 (1) concentracioacuten de trans-resveratrol donde no se indique otra cosa


14

Tabla 1- Concentraciones de resveratrol yo piceido en vinos tinto (continuacioacuten) Origen Concentracioacuten de Resveratrol (μgmL-1) (1) Ref

Ameacuterica Contenido medio seguacuten el origen Ameacuterica del Sur 18 lt California 3 lt Oregon 63 45

Comparacioacuten entre vinos de

Italia Reccioto y Amarone (area de Verona) entre 005 - 08 25

USA (Sureste) Isoacutemeros de la aglicona 01-42 concentraciones maacute-ximas en Muscadine trans hasta 134 cis hasta 319

Presencia de Tetrahidroxiestilbeno 46

Japoacuten Estilbenos totales 08-134 aglicona (media 18 trans gt cis) piceido (media 25 cis gt trans) concentraciones

maacuteximas en los tipos de uva Pinot Noir y Merlot 47

USA (California)

Contenido seguacuten el tipo de uva Cabernet Sauvignon 04-2

Pinot noir 12 Merlot 35


Debido a la generalmente alta razoacuten entre las concentraciones de trans a

cis isoacutemeros encontradas en vino se sugiere que el uacutenico isoacutemero sintetizado en la uva es el trans proviniendo el cis de la exposicioacuten a la luz del mosto durante el proceso de elaboracioacuten del vino o del vino durante el almacenamiento39 Efectos bioloacutegicos de resveratrol

Ya se ha comentado el caraacutecter antifuacutengico de las fitoalexinas No obstante debe tenerse en cuenta que un compuesto natural no tiene por que estar exento de riesgos toxicoloacutegicos para el ser humano ya que los mayores venenos son productos naturales producidos por plantas o animales Sin embargo en el caso concreto de algunas fitoalexinas como el trans-resveratrol no soacutelo se ha demostrado la ausencia de dicho caraacutecter toacutexico sino que ademaacutes presenta grandes beneficios para la salud


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Este compuesto como otros polifenoles es un antioxidante muy efectivo por derecho propio por lo que ha atraiacutedo la atencioacuten particular como solucioacuten potencial a la denominada ldquoparadoja francesardquo Este es el teacutermino usado para describir el fenoacutemeno que ha sido por mucho tiempo un rompecabezas para la ciencia meacutedica de que los iacutendices de la enfermedad cardiovascular en Francia son muy bajos con respecto al resto del mundo desarrollado a pesar del elevado consumo de grasa animal y colesterol y un haacutebito firmemente atrincherado del tabaco Por supuesto Francia tambieacuten goza de muchas de las ventajas de la dieta mediterraacutenea pero hay buenas razones para pensar que es el consumo de vino tinto y en gran medida el resveratrol contenido en eacuteste el que puede ser la explicacioacuten verdadera de la paradoja evidente

La paradoja francesa y el resveratrol han abierto las puertas a nuevas

investigaciones pero no se puede olvidar que las bondades del vino ya las prescribioacute Hipoacutecrates padre de la medicina moderna quien afirmaba que el vino

es cosa admirablemente apropiada al hombre tanto en el estado de salud como en

el de enfermedad si se le administra oportunamente y con justa medida seguacuten la

constitucioacuten individual

El resveratrol contribuye al efecto cardioprotectivo del vino tinto ya que este compuesto ha demostrado inhibir la oxidacioacuten del LDL la peroxidacioacuten de liacutepidos la agregacioacuten plaquetaria y la siacutentesis de eicosanoides49 etapa inicial de la patogeacutenesis de la arteriosclerosis

Actualmente se estaacuten realizando numerosos estudios sobre las propiedades

del resveratrol de los cuales se le han atribuido diversas propiedades ldquoin vitrordquo e ldquoin

vivordquo como son


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Proteccioacuten de las lipoproteiacutenas de baja densidad (LDL) frente a la oxidacioacuten50-52

Inhibicioacuten de la agregacioacuten plaquetaria y la siacutentesis de eicosanoides31 53 Proteccioacuten del hiacutegado de peroxidacioacuten de liacutepidos54 Estudios recientes en ratones han demostrado que ratones obesos cuya

dieta estaba suplementada con resveratrol no soacutelo son maacutes longevos sino ademaacutes maacutes activos presentando en menor medida los efectos negativos de una dieta hipercaloacuterica55

Reduccioacuten de la muerte celular por estreacutes oxidativo56 Propiedades antiinflamatorias debido a su efecto inhibidor sobre la

ciclooxigenasa57 Regulacioacuten del metabolismo de los liacutepidos34 Proteccioacuten cardiovascular como fitoestroacutegeno Efectos citoprotectores sobre el rintildeoacuten58 Propiedades anticanceriacutegenas puesto que inhibe la actividad de la enzima

protein-tirosina kinasa enzima implicada en la alteracioacuten de las ceacutelulas tumorales59 60

Previene enfermedades como el Parkinson y el Alzheimer

Auacuten no se han estudiado con profundidad las acciones beneacuteficas del resveratrol en funcioacuten de la dosis y no se sabe si los efectos observados ldquoin vitrordquo e ldquoin vivordquo se pueden extrapolar al ser humano En los estudios en animales y en los limitados estudios en humanos se ha observado que el resveratrol se absorbe en el aparato gastrointestinal Sin embargo la eficacia de su absorcioacuten asiacute como su distribucioacuten metabolismo y excrecioacuten no estaacute bien definida Hasta la fecha son escasos los estudios que se han realizado sobre el metabolismo del resveratrol en humanos si bien se ha puesto de manifiesto recientemente que el resveratrol se


17

metaboliza en el hiacutegado para producir metabolitos resveratrol-glucuroacutenido y resveratrol-sulfato52

Actualmente el resveratrol se comercializa para la investigacioacuten meacutedica ademaacutes tambieacuten estaacute disponible como complemento nutricional (no como un agente terapeacuteutico) en forma de extracto seco purificado cuya fuente principal son las uvas tintas En cuanto a las precauciones de uso se desaconseja para las personas que padecen trastornos mentales y hepaacuteticos graves y en mujeres embarazadas y en periodo de lactancia ademaacutes es un producto reservado a los adultos El isoacutemero cis y los isoacutemeros trans y cis del piceido son fisioloacutegicamente tan importantes como el trans-resveratrol cis-Resveratrol posee una actividad similar a la del isoacutemero trans inhibiendo a la enzima protein-tirosina kinasa61 y la agregacioacuten plaquetaria62 Los isoacutemeros de piceido tienen propiedades similares a los de resveratrol inhibiendo la agregacioacuten plaquetaria31 y la oxidacioacuten del LDL en humanos63 Por otra parte de una manera menos activa que el trans-resveratrol el trans-piceido reduce la elevacioacuten de los niveles lipiacutedicos64 e inhibe la siacutentesis de eicosanoides53

En los estudios llevados a cabo con Poligonum Cuspidatum se ha comprobado que la actividad bioloacutegica de piceido es bastante diferente que la de la aglicona no obstante el tracto digestivo humano tiene actividad glucosidasa65 de manera que es probable la liberacioacuten de la aglicona a partir del glucoacutesido durante la digestioacuten


18

Los compuestos fenoacutelicos de la uva

Dado que la gran mayoriacutea de los meacutetodos que se ponen a punto en este trabajo estaacuten basados en fluorescencia molecular y muchos de los integrantes de este grupo de sustancias presentan fluorescencia nativa o fotoinducida el uacuteltimo apartado de esta introduccioacuten general se dedica a la descripcioacuten del grupo de los compuestos fenoacutelicos en vino en el cual se engloba el resveratrol No obstante aparte de los compuestos fenoacutelicos merece la pena nombrar tambieacuten como potenciales fluoroacuteforos del vino los aminoaacutecidos fluorescentes triptoacutefano tirosina y fenilalanina asiacute como algunas vitaminas

Los constituyentes fenoacutelicos revisten una gran importancia en enologiacutea

debido al papel que juegan directa o indirectamente sobre la calidad de los vinos En efecto son el origen del color y de la astringencia siendo atribuida esta uacuteltima en particular a la presencia de taninos Ademaacutes seguacuten su naturaleza pueden tener un intereacutes nutricional y farmacoloacutegico

Desde el punto de vista quiacutemico los compuestos fenoacutelicos estaacuten

caracterizados por un nuacutecleo benceacutenico que lleva uno o varios grupos hidroxilos Los compuestos fenoacutelicos se clasifican en no flavonoides y flavonoides Estos uacuteltimos tienen un esqueleto en C6-C3-C6 Los polifenoles incluyen tambieacuten a los derivados (eacutesteres metil eacutesteres glucoacutesidos etc) que resultan de las sustituciones de la estructura base La reactividad de este tipo de moleacutecula es debida tanto a la presencia de la funcioacuten fenol que presenta un caraacutecter aacutecido como al nuacutecleo benceacutenico que puede sufrir sustituciones electrofiacutelicas

Los compuestos polifenoacutelicos estaacuten distribuidos en las distintas partes de la

uva pulpa hollejos pepitas y raspones De esta manera la transformacioacuten


19

tecnoloacutegica adoptada condiciona la extraccioacuten de los polifenoles a partir de las diferentes partes del racimo contribuyendo asiacute de manera esencial a la composicioacuten polifenoacutelica de los vinos Un conocimiento profundo de las diversas estructuras polifenoacutelicas presentes en la uva y de los mecanismos de su evolucioacuten durante el transcurso de la vinificacioacuten es una base indispensable en la evaluacioacuten de su papel en enologiacutea y en el desarrollo de los procesos tecnoloacutegicos adaptados a la vez a la materia prima y al tipo de producto deseado

Compuestos no flavonoides Esta denominacioacuten abarca a los aacutecidos fenoacutelicos divididos en aacutecidos

benzoacuteicos (C6-C1) y aacutecidos cinaacutemicos portadores de una cadena lateral insaturada (C6-C3) pero tambieacuten a otros derivados fenoacutelicos como los estilbenos

Aacutecidos fenoacutelicos

En la uva los aacutecidos fenoacutelicos son principalmente aacutecidos hidroxicinaacutemicos

que se encuentran en las vacuolas de las ceacutelulas del hollejo y de la pulpa bajo la forma de eacutesteres tartaacutericos En el vino se pueden encontrar en forma libre procediendo de la hidroacutelisis de otros polifenoles especialmente de los antocianos que se degradan en presencia de oxiacutegeno y calor lo que supone un mecanismo de la destruccioacuten del color o bien en forma combinada parcialmente esterificados especialmente con el aacutecido tartaacuterico o con aacutecidos hidroxicinaacutemicos destacando entre ellos los aacutecidos cafeoil tartaacuterico (aacutecido caftaacuterico) p-cumaroil tartaacuterico (aacutecido cutaacuterico) y feruloil tartaacuterico (aacutecido fertaacuterico) Figura 5 La forma natural es la trans pero los isoacutemeros cis largo tiempo confundidos con los derivados glucosilados tambieacuten existen aunque en deacutebil cantidad Soacutelo el derivado glucosilado del aacutecido trans-cutaacuterico ha podido ser identificado


20

Figura 5- Eacutesteres hidroxicinaacutemicos aacutecido trans-cafeoil tartaacuterico (R = OH) trans- p-cumaroil tartaacuterico (R = H) y trans-feruloil tartaacuterico (R = OCH3)

En lo que concierne a los aacutecidos benzoacuteicos la uva contiene principalmente aacutecido gaacutelico (Figura 6)

Figura 6- Aacutecido gaacutelico Estilbenos Es de destacar la presencia en la uva de otros compuestos fenoacutelicos como

el isoacutemero trans del resveratrol como aglicona o 3-β-D-glucoacutesido (piceido)

Compuestos Flavonoides Los flavonoides estaacuten caracterizados por un esqueleto de base de 15 aacutetomos de carbono (C6-C3-C6) de tipo 2-fenil benzopirona (Figura 7)

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H

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21

Figura 7- 2-Fenil benzopirona

Esta gran familia se divide en varias subclases que se distinguen por el

grado de oxidacioacuten de su nuacutecleo pirano Los flavonoides en sentido estricto basados en su estructura fenil-2-benzopirona estaacuten principalmente representados en la uva por los flavonoles mientras que los flavonoides en sentido amplio comprenden igualmente los flavanos 3-ol (3-flavanoles) y los antocianos Las estructuras generales de las subclases maacutes frecuentes en el vino se encuentran en la Figura 8

Figura 8- Estructuras quiacutemicas de las subclases de flavonoides maacutes usuales en el vino

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22

Flavonoles

Estos flavonoides ldquoen sentido estrictordquo estaacuten uacutenicamente presentes en los hollejos bajo forma de glicoacutesidos en posicioacuten 3 En la Figura 9 se representan los cuatro flavonoles principales de la uva bajo su forma aglicona

Figura 9- Flavonoles de la uva kaempferol (R = H Rrsquo = H) quercetol (R = OH Rrsquo = H) miricetol (R = OH Rrsquo = H) e isoramnetol (R = OCH3 Rrsquo = H)

Las formas glucosiladas son las maacutes abundantes pero se encuentran

igualmente cantidades importantes de glucuroacutenidos

Flavanos 3-oles (3-Flavanoles)

Los flavanos 3-oles (3-flavanoles) estaacuten presentes en la uva en estado de monoacutemeros y bajo formas maacutes o menos polimerizadas que constituyen los taninos cateacutequicos En el seno de la baya de uva se localizan principalmente en las semillas aunque se han detectado tambieacuten trazas de monoacutemeros y diacutemeros en la pulpa

Los principales 3-flavonoles monoacutemeros de la uva son la (+)-catequina y su isoacutemero la (-)-epicatequina pudiendo ser encontrado este uacuteltimo bajo forma de

O

OH

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OH

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23

eacutester gaacutelico (3-galato de epicatequina) Las estructuras de los flavanoles monoacutemeros de la uva estaacuten representadas en la Figura 10

Figura 10- Estructura de los flavanoles monoacutemeros de la uva catequina (R1= H R2= OH R3= H) galocatequina (R1= H R2= OH R3= OH) epicatequina (R1= OH R2= H R3= H) y epigalocatequina (R1= OH R2= H R3= OH)

Flavanonoles y flavonas

Los compuestos pertenecientes a esta familia han sido identificados en el

hollejo de uva blanca Estos son la astilbina (3-ramnoacutesido del dihidroquercetol) y la engelatina (3-ramnoacutesido del dihidrokaempferol) cuyas estructuras se recogen en la Figura 11

Figura 11- Flavanonoles de la uva engeletina (R = H) y astilbina (R = OH)

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24

En cuanto a las flavonas se han identificado hasta 7-glucoacutesidos de apigenol y luteolina en las hojas de Vitis vinifera Antocianos

Los antocianos representan una parte importante tanto a nivel cualitativo como cuantitativo de los flavonoides de la baya de uva tinta Contribuyen de manera preponderante al color de las especies tintas Desde un punto de vista general los antocianos se corresponden con unos glicoacutesidos de nuacutecleo flavilium polihidroxilado yo metoxilado Las formas agliconas que responden a la foacutermula general son denominados antocianidinas (o antocianidoles) Figura 12 y las formas heterosiacutedicas se denominan antocianinos siendo estas uacuteltimas maacutes estables

Figura 12- Estructura de los antocianidinas (forma flavilium)

Los antocianos se diferencian por sus niveles de hidroxilacioacuten y de

metilacioacuten por la naturaleza el nuacutemero y la posicioacuten de las osas unidas a la moleacutecula y tambieacuten por la naturaleza y el nuacutemero de los aacutecidos que esterifican los azuacutecares Los antocianos del geacutenero Vitis son cianidol peonidol delfinidol y malvidol (Figura 13) pero el contenido y la composicioacuten en antocianos en la uva variacutea enormemente en funcioacuten de la especie y de la variedad

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25

Figura 13- Antocianidinas de la uva en forma de catioacuten flavilium cianidol (R = OH Rrsquo = H) peonidol (R = OCH3 Rrsquo = H) delfinidol (R = OH Rrsquo = OH) petunidol (R = OCH3 Rrsquo = OH) y malvidol (R = OCH3 Rrsquo = OCH3)

La V vinifera presenta la particularidad de contener uacutenicamente 3-

glucoacutesidos de antocianidoles mientras que otras especies del geacutenero Vitis contienen 35 diglucoacutesidos Las numerosas posibilidades de sustitucioacuten del nuacutecleo B y las funciones hidroxilo confieren a los antocianos propiedades especiacuteficas concretamente color y estabilidad que estaacuten directamente ligadas a la estructura Asiacute el aumento del nuacutemero de hidroxilos sobre el nuacutecleo B conduce al desplazamiento del maacuteximo de absorcioacuten hacia longitudes de onda maacutes altas (efecto batocroacutemico) lo que se traduce en una modificacioacuten del color de la moleacutecula Por otra parte la presencia de sustituyentes osiacutedicos se traduce en un ligero efecto hipsocroacutemico y aumenta la estabilidad de las moleacuteculas antociaacutenicas Por uacuteltimo la esterificacioacuten de los azuacutecares concretamente por aacutecidos hidroxicinaacutemicos estabiliza la moleacutecula y sus capacidades colorantes debido al establecimiento de interacciones hidroacutefobas intramoleculares (copigmentacioacuten intramolecular)

El color de los antocianos en solucioacuten depende del medio En efecto los antocianos existen en solucioacuten bajo diversas formas en equilibrio de colores diferentes Estos equilibrios estaacuten regidos por el pH de la solucioacuten A pH inferior a

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26

2 la forma flavilium coloreada en rojo estabilizada por resonancia domina ampliamente Ademaacutes las interacciones de los antocianos entre ellos y con los otros constituyentes del medio (copigmentacioacuten) y la formacioacuten de complejos con los iones metaacutelicos se traducen en modificaciones del color

Taninos Bajo el nombre geneacuterico de taninos se agrupan una serie de sustancias

fenoacutelicas que pueden contener los vinos se clasifican en hidrolizables y condensados Los primeros se basan en fenoles no flavonoides y generalmente se encuentran en forma de eacutesteres y los taninos condensados son poliacutemeros maacutes o menos complejos derivados de los 3-flavanoles especialmente de la (+)-catequina y de la (-)-epicatequina Estas moleacuteculas presentan la propiedad de liberar antocianidinas en medio aacutecido y en caliente de donde toman el nombre de procianidinas o proantocinidinas

Los taninos condensados maacutes sencillos son las procianidinas diacutemeras que

se agrupan en dos categoriacuteas procianidinas tipo A (C30H26O12) y las procianidinas tipo B (C30H24O12) Figura 14 Del mismo modo tambieacuten existen procianidinas triacutemeras agrupadas en los tipos C y D

Figura 14- Estructuras de procianidinas diacutemeras


27

Otros taninos maacutes complejos son las procianidinas oligoacutemeros formados por 3 a 10 unidades de flavanoles asiacute como las procianidinas condensadas formadas por maacutes de 10 unidades de flavanoles alcanzando un peso molecular superior a 3000 o proantocianidoles

En definitiva las formas poliacutemeras cuya estructura general viene dada en la Figura 15 representan la mayor parte de los 3-flavanoles tanto de la uva como de los otros vegetales

Figura 15- Proantocianidoles de tipo B

Se localizan en el hollejo especialmente en las capas externas de la

hipodermis en forma libre dentro de las vacuolas de las ceacutelulas o en forma combinada estando ligados a los polisacaacuteridos de las paredes celulares Se encuentran tambieacuten de forma abundante en las pepitas localizados en la envoltura externa situada inmediatamente por debajo de la epidermis y tambieacuten en la envoltura interna que rodea al albumen La pulpa no contiene apenas taninos mientras que el raspoacuten posee una buena cantidad de estas sustancias

En general los contenidos en flavanoles de las semillas son siempre

superiores a los de los hollejos ya se trate de monoacutemeros oligoacutemeros o de poliacutemeros

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28

PARTE II ANTECEDENTES BIBLIOGRAacuteFICOS PARA EL ANAacuteLISIS DE RESVERATROL

La praacutectica totalidad de los meacutetodos encontrados en la bibliografiacutea para el anaacutelisis de resveratrol y compuestos relacionados hacen uso de teacutecnicas separativas fundamentalmente cromatografiacutea de liacutequidos de alta eficacia (LC) cromatografiacutea de gases (GC) y electroforesis capilar (CE)

Asiacute estas teacutecnicas se han utilizado para analizar dichos compuestos en

muestras muy diversas tales como alimentos entre ellos fundamentalmente uvas2166-71 cacahuetes79 72 araacutendanos73 o chocolate32 o bien en hojas de parra74 graacutenulos de luacutepulo75 76 y plantas77-80 usadas con fines medicinales

En general en las etapas previas de aislamiento y limpieza se utilizan

diferentes teacutecnicas separativas tales como extraccioacuten soacutelido-liacutequido (SPE) extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE) y extraccioacuten con fluidos supercriacuteticos (SFE) para obtener finalmente una disolucioacuten de resveratrol y los restantes compuestos de intereacutes que se analiza mediante cromatografiacutea

En cuanto a los meacutetodos encontrados para anaacutelisis de estos compuestos

en vino en la Tablas 2 3 y 4 se recogen los antecedentes encontrados acerca de los meacutetodos mediante cromatografiacutea liacutequida electroforesis capilar y cromatografiacutea de gases respectivamente En este uacuteltimo caso la separacioacuten se acopla generalmente a la espectrometriacutea de masas

En cromatografiacutea de liacutequidos se utiliza maacutes frecuentemente cromatografiacutea

en fase inversa y los detectores usuales son el detector de serie de diodos (DAD) el detector fluorescente (FLD) o el espectroacutemetro de masas (MS) Tambieacuten se han usado en algunos casos detectores electroquiacutemicos (ECD)


29

Tambieacuten se encuentran algunos meacutetodos de cromatografiacutea en capa fina en concreto el desarrollado por Chen et al81 que muestran la utilidad del anaacutelisis de resveratrol y piceido para distinguir raacutepidamente entre vinos naturales y falseados y el de Kiraly-Veghely et al82 que utilizan cromatografiacutea en placa a elevada presioacuten y encuentran mayores contenidos de piceido que de aglicona

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Comp

uesto

sfen

oacutelico

s en

tre

ellos

tran

s y ci

s-re

sver

atrol

C18

Grad

iente

de aacutec

ido foacute

rmico

en ag

ua

pH 3

(A) y

aacutecido

foacuterm

ico en

ac

etonit

rilo p

H 3 (

B) a

02 m

Lmiddotmi

n-17

DAD

(200

- 600

nm 3

05 y

285 n

m pa

ra

trans

- y ci

s-res

vera

trol

resp

ectiv

amen

te)MS

(ESI

SCA

N m

z 50

-700

mod

o SIM

LOD

(SN

= 3)

1 y 4

ng

middotmL-1

para

tran

s- y c

is-re

sver

atrol

resp

ectiv

amen

te

Vino

s alm

acen

ados

a 4ordm

C en

la

oscu

ridad

Bote

llas a

bierta

s inm

ediat

amen

te an

tes de

l anaacute

lisis

Fil

trado

e iny

eccioacute

n dire

cta de

las

mues

tras

89

trans

-resv

eratr

ol C1

8 (40

ordmC)

Grad

iente

de ag

uam

etano

l 55

a ag

uaac

etonit

rilo 7

3 0

6 mLmiddot

min-1

DAD

(308

y 28

8 nm)

Recta

de C

alibr

ado e

ntre

05 y

16 μ

gmiddotmL

-1Ca

ntida

des e

ncon

trada

s en v

inos

tintos

(035

2-19

9 μgmiddot

mL-1

) may

ores

qu

e en b

lanco

s (5-

570 n

gmiddotmL

-1)

Anaacuteli

sis cu

alitat

ivo de

cis-r

esve

ratro

l

90

trans

-resv

eratr

olFa

se in

versa

colum

nas m

onoliacute

ticas

El

ucioacuten

isoc

raacutetic

a 30

(aacutecid

o aceacute

tico

01

en m

etano

l) ndash 70

(aacute

cido

aceacuteti

co 0

1 en

agua

) 5 m

Lmiddotmi

n-1

FLD

exem

3104

03 nm

DAD

310 n

m

Rang

o line

al 01

1-27

5 μg

middotmL-1

LOD

3 ngmiddot

mL-1

LOQc 4

ngmiddotm

L-1

Uvas

Acop

lamien

to en

tre S

PE co

n sis

temas

de ex

tracc

ioacuten co

n liacutequ

idos

a pre

sioacuten (

PLE)

66

trans

- y ci

s-res

ve-

ratro

lC1

8Gr

adien

te de

aacutecido

aceacuteti

co p

H 24

a aacutec

ido ac

eacutetico

aceto

nitrilo

208

0 15

mL

middotmin-1

DAD

(285

y 30

6 nm

para

cis y

tran

s)

trans

-resv

eratr

ol 03

2 ndash 4

44 y

012 ndash

28

0 μgmiddot

mL-1

en tin

tos y

rosa

dos

resp

ectiv

amen

tecis

-resv

eratr

ol 02

0 ndash 5

84 y

002 ndash

317

μgmiddot

mL-1

en

tintos

y ro

sado

s re

spec

tivam

ente

91

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

33

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)

Anali

to(s

)Si

stem

a cr

omat

ograacute

fico

Col

umna

F

Moacutev

il S

istem

a de D

etec

cioacuten

Paraacute

met

ros a

naliacutet

icos

de ca

lidad

Obse

rvac

ione

s Mu

estra

Tra

tam

iento

Refe

renc

ia

Estilb

enos

-

vinife

rina

trans

-as

tringin

atra

ns-

piceid

ocis

- y

trans

-resv

eratr

ol y

-vini

ferina

C18

Grad

iente

de aacutec

ido ac

eacutetico

en ag

ua

pH 2

4 a aacutec

ido ac

eacutetico

en ag

ua p

H 24

ace

tonitri

lo 20

80 0

5 mL

middotmin-1

UV (2

80 2

86 3

06 y

321 n

m)

LOD

02 μ

gmiddotmL

-1 0

2 μg

middotmL-1

y 03

2 μgmiddot

mL-1

para

trans

-pice

idotr

ans-

ycis-

resv

eratr

olre

spec

tivam

ente

Extra

ccioacuten

con a

cetat

o de e

tilo

limpie

za co

n res

ina in

terca

mbiad

ora

de ca

tione

s y m

edian

te cro

matog

rafiacutea

de pa

rticioacuten

(ce

ntrif

ugal

parti

tion

chro

mat

o-gr

aphy

) y H

PLC

semi

prep

arati

va

92

20 co

mpue

stos

fenoacuteli

cos

entre

ell

ostra

ns-

resv

eratr

ol

XDB-

C8Gr

adien

te de

meta

nol y

aacutecido

aceacuteti

co 1

D

AD (3

06 nm

para

tran

s-res

vera

trol)

CLD

(Ce(

IV) ndash

roda

mina

6G ndash

comp

uesto

fenoacute

lico e

n med

io aacutec

ido

sulfuacute

rico)

trans

-Res

vera

trol

Rang

o line

al 00

3- 15

0 μg

middotmL-1

LOD

(SN

=3) 8

47 y

66

ngmiddotm

L-1 en

DAD

y CL

D

resp

ectiv

amen

te

Inyec

cioacuten d

irecta

de m

uestr

as

filtra

das

Detec

cioacuten C

L alta

mente

sens

ible

(LOD

de 1

a 2 oacuter

dene

s de m

agnit

ud

meno

res q

ue lo

s liacutem

ites e

n DAD

)

93

Isoacuteme

ros c

is y

trans

de

resv

eratr

ol y

piceid

o

C18 m

onoliacute

tica (

Chro

moli

thPe

rform

ance

RP-

18e)

Grad

iente

de ag

uaaacutec

ido ac

eacutetico

946

a a

guaa

ceton

itrilo

aacutecido

aceacuteti

co

6530

5 7

mLmiddotm

in-1

DAD

(285

y 30

6 nm

para

cis-

y tra

ns-

resv

eratr

ol re

spec

tivam

ente)

LOD

32 y

34 ng

middotmL-1

y LO

Q 01

0 y 0

11 μ

gmiddotmL

-1

para

tran-

y cis

-re

sver

atrol

resp

ectiv

amen

te

El em

pleo d

e una

colum

na

mono

liacutetica

impli

ca ba

jas pr

esion

es y

corto

s tiem

pos d

e anaacute

lisis

94

trans

- y ci

s- re

sve-

ratro

l y pi

ceido

Fa

se in

versa

Estud

ia la

influe

ncia

de la

varie

dad

del la

leva

dura

en la

conc

entra

cioacuten

de lo

s cua

tro co

mpue

stos e

n vino

95

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

34Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

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adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Aacutecido

s hidr

oxibe

n-zo

icos

aacutecido

s hid

roxic

inaacutemi

cos y

de

rivad

os e

stilbe

-no

s (isoacute

mero

sde

resv

eratr

ol y

piceid

o) a

lcoho

les

fenoacuteli

cos y

com

-pu

estos

relac

io-na

dos

flava

noles

y f

lavon

oles

Se si

gue e

l patr

oacuten de

evolu

cioacuten d

e es

tos co

mpue

stos e

n el v

ino du

rante

el

enve

jecim

iento

en bo

tella

96

trans

-resv

eratr

ol y

trans

-pice

ido97

cis- y

tran

s- re

sve-

ratro

l y pi

ceido

Hype

rsil C

18Gr

adien

te lin

eal a

ceton

itrilo-

agua

DA

D (2

88 y

306 n

m pa

ra ci

s- y t

rans

-isoacute

mero

s

SP

E 98

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

35

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

trans

-resv

eratr

olC8 El

ucioacuten

isoc

raacutetic

a con

meth

anol

agua

35

65 1

mLmiddot

min-1

DAD

(306

nm)

CLD

(Elua

to +

lumino

l + K

3Fe(

CN) 6)

Linea

lidad

007

5-10

μg

middotmL-1

y 05

-750

ngmiddotm

L-1 en

DAD

y CL

D

resp

ectiv

amen

teLO

D(S

N=3)

25 y

0166

ng

middotmL-1

en D

AD y

CLD

re

spec

tivam

ente

Inyec

cioacuten d

irecta

de m

uestr

as

filtra

das

Conti

ene u

na re

visioacuten

impo

rtante

de

meacutetod

os en

tre 19

96 y

2002

En

cuen

tra en

tre 0

y 160

7 μgmiddot

mL-1

en vi

nos t

intos

chino

s

99

cis- y

tran

s-res

ve-

ratro

lC1

8El

ucioacuten

isoc

raacutetic

a con

25

ac

etonit

rilo 0

1

de H

3PO 4

y Na

Cl (5

mm

olmiddotL-1

) 1 m

Lmiddotmi

n-1

DAD

(306

nm pa

ra am

bos i

soacuteme

ros)

ECD

(elec

trodo

de ca

rboacuten

vitrif

icado

a+0

75 V

)

Linea

lidad

001

-10

μgmiddotm

L-1tra

ns-re

sver

atrol

LOD

(SN

=3) m

enor

es de

30

y 10

0 ngmiddot

mL-1

(306

nm

) y 3

y 15 n

gmiddotmL

-1

(075

V) p

ara t

rans

- y ci

s-re

sver

atrol

resp

ectiv

amen

te

Vino

Filtr

ado e

inye

ccioacuten

dire

cta

Uvas

y ho

jas M

acer

acioacuten

con e

tanol

al 80

Equil

ibrio

entre

los d

os is

oacutemer

os tr

as

5 hor

as de

expo

sicioacuten

a la

luz de

l diacutea

Equ

ilibrio

no in

fluen

ciado

por la

tem

pera

tura

100

Resv

eratr

ol tot

alDA

D (2

87 y

307 n

m pa

ra ci

s- y t

rans

-isoacute

mero

s)

Hidr

oacutelisis

enzim

aacutetica

(-g

lucos

idasa

)de

resv

eratr

ol-glu

coacutesid

osSP

E10

1

cis- y

tran

s- re

sve-

ratro

l y pi

ceido

Fa

se in

versa

DA

D

Se en

cuen

tra de

l 82 a

l 91

de

resv

eratr

ol co

mo gl

ucoacutes

ido en

estos

vin

os es

pantildeo

les de

uvas

Mon

astre

ll10

2

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

36Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Scre

ening

de

polife

noles

entr

e ell

ostra

ns-

resv

eratr

ol

Fase

inve

rsaDA

D - M

SMS

Piele

s y pe

pitas

de uv

as bl

anca

s y

tintas

Se en

cuen

tran h

asta

13 an

tocian

os

11 aacutec

idos h

idrox

ibenz

oicos

e hid

roxic

inaacutemi

cos y

13 ca

tequin

as y

flava

noles

asiacute

como

2 es

tilben

os en

pie

les y

pepit

as

103

Aacutecido

s org

aacutenico

s y

polife

noles

((-)-

epi-

cateq

uina

quer

cetin

a y

resv

eratr

ol)

Fase

inve

rsa (e

n sil

ica m

odific

ada

con

grup

os fe

nilo)

Grad

iente

de aacutec

ido tr

ifluoa

ceacutetic

o al 0

2

en ag

ua y

aceto

nitrilo

15

mLmiddotm

in-1

DAD

a 210

y 28

0 nm

Linea

lidad

resv

eratr

ol 00

25-0

4 mg

middotmL-1

104

Flavo

noles

an

tocian

inas

aacutecido

s fen

oacutelico

s y

trans

-resv

eratr

ol

C18

Grad

iente

de aacutec

ido ac

eacutetico

al 5

en

ag

ua y

aceto

nitrilo

1 m

Lmiddotmi

n-1

DAD

(313

nm pa

ra tr

ans-r

esve

ratro

l y

aacutecido

s fen

oacutelico

s)

105

cis- y

tran

s- re

sve-

ratro

l y pi

ceido

Es

tudian

el ef

ecto

de di

stinto

s meacute

todos

de m

acer

acioacuten

sobr

e la

conc

entra

cioacuten d

e esto

s cua

tro

estilb

enos

106

Polife

noles

ECD

(dete

ccioacuten

coulo

meacutetric

a mu

ltielec

trodo

) 10

7

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

37

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Resv

eratr

olpic

eido y

fla

vono

ides

Vino

s exp

erim

ental

es de

uvas

so

metid

as a

difer

entes

trata

mien

tos

con p

estic

idas

Conte

nido f

enoacuteli

co to

tal po

r el

meacutetod

o de F

olin-

Cioc

alteu

108

27 co

mpue

stos

fenoacuteli

cos

inclu-

yend

o der

ivado

s de

los aacute

cidos

ben-

zoico

y cin

aacutemico

fla

vona

s y n

uevo

s glu

coacutesid

os

relac

ionad

os

Detec

cioacuten e

lectro

quiacutem

ica m

ultica

nal

con d

etecto

r cou

lomeacutetr

ico

Cerve

za

109

cis- y

tran

s- re

sve-

ratro

l y pi

ceido

C1

8El

ucioacuten

isoc

raacutetic

a etan

olaacutec

ido ac

eacutetico

al

005

237

7 1 m

Lmiddotmi

n-1

DAD

a 306

nm

Linea

lidad

para

los c

uatro

isoacute

mero

s 02-

50 μ

gmiddotmL

-1

LOD

081

120

040 y

04

6 ng p

ara c

is- y

trans

-re

sver

atrol

y cis-

y tra

ns-

piceid

o re

spec

tivam

ente

Hidr

oacutelisis

con

-gluc

osida

sa pa

ra

liber

acioacuten

de ag

licon

as

conte

nidos

de ci

s- y t

rans

- res

ve-

ratro

l ante

s y de

spueacute

s de l

a hidr

oacutelisis

Resv

eratr

ol tot

al 08

4-73

3 y 0

12-6

μg

middotmL-1

en vi

nos t

intos

y zu

mos

resp

ectiv

amen

te

110

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

38Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Comp

uesto

sar

omaacuteti

cos

entre

ell

ostra

ns-

resv

eratr

ol

NMR

NMR

MS

Vino

pre

para

cioacuten d

e extr

acto

fenoacuteli

co co

n ace

tato d

e etilo

Ce

rveza

deg

asific

acioacuten

y co

ncen

tracioacute

n a 2

3 del

volum

en

inicia

l Zu

mo de

uva

diluc

ioacuten co

n agu

a

111

Antoc

ianina

syes

tilben

os (c

is- y

trans

- res

vera

trol y

pic

eido)

Fase

inve

rsaAn

tocian

os D

AD (5

20 nm

) Es

tilben

os F

LD (

exem

3303

74 nm

) 11

2

32 P

olifen

oles d

e ba

jo pe

so

molec

ular

entre

ell

oscis

- y tr

ans-

resv

eratr

ol y

piceid

o

C18

Grad

iente

de ag

ua y

aceto

nitrilo

co

ntenie

ndo a

mbos

1 de

aacutecido

ac

eacutetico

06

mLmiddotm

in-1

PDAD

API

-MS

113

Estilb

enos

(resv

eratr

ol)Inf

luenc

ia de

difer

entes

teacutecn

icas d

e ma

cera

cioacuten e

n el c

onten

ido en

es

tilben

os11

4

Estilb

enos

(res

ve-

ratro

l pice

ido

picea

tanno

l)

DAD-

MSM

SInd

uccioacute

n de e

stilbe

nos m

edian

te irr

adiac

ioacuten U

V po

st-co

sech

a 11

5

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

39

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Flava

noles

an

tocian

inas

y 6

deriv

ados

de

resv

eratr

oltra

ns-

astrin

gina

trans

- y

cis-p

iceido

tran

s-yc

is-re

sver

atrol

y pa

llidol

(diacutem

ero d

e re

sver

atrol)

C18

Grad

iente

de 1

aacutec

ido tr

ifluor

oaceacute

tico

a ace

tonitri

lo1

aacutecid

o trifl

uoro

aceacuteti

-co

802

0 1 m

Lmiddotmi

n-1

DAD

(290

nm)

FLD

( exe

m 290

390

2903

90 2

6040

0 30

0390

260

400 y

2604

00 nm

para

tra

ns-a

string

inatr

ans-p

iceido

cis-

piceid

otra

ns-re

sver

atrol

cis-

resv

eratr

ol y p

allido

l

Linea

lidad

05-

10 0

1-10

1-

10 0

5-10

1-1

0 y 0

5-10

μgmiddot

mL-1

y LO

D (F

LD) 0

01 0

01

003

001

002

y 00

2 μg

middotmL-1

par

a tra

ns-

astrin

gina

trans

-pice

ido

cis-p

iceido

tran

s-re

sver

atrol

cis-

resv

eratr

ol y p

allido

l

Filtra

do e

inyec

cioacuten d

irecta

de la

s mu

estra

sSe

apor

tan po

r prim

era v

ez da

tos

sobr

e con

tenido

de pa

llidol

en vi

nos

tintos

y no

se en

cuen

tra en

vino

s bla

ncos

Conte

nidos

de lo

s isoacute

mero

s de

resv

eratr

ol maacute

s elev

ados

en vi

nos

tintos

116

trans

-resv

eratr

olC1

8Gr

adien

te de

meta

nol

aacutecido

aceacuteti

co

agua

102

88 a

metan

olaacutec

ido ac

eacutetico

ag

ua 90

28

1 mLmiddot

min-1

DAD

(280

nm)

FLD

exem

3603

74 nm

LOD

en m

uestr

as re

ales

20 y

3 ngmiddot

mL-1

en D

AD y

FLD

resp

ectiv

amen

te

SPE-

C18

Nive

l med

io en

contr

ado e

n vino

s tin

tos em

botel

lados

289

μgmiddot

mL-1

117

cis- y

tran

s-re

sver

atrol

y pic

eido

ODS

Hype

rsil

Eluc

ioacuten is

ocraacute

tica

aceto

nitrilo

aacutecido

foacuter

mico

acuo

so 0

5 1

mLmiddot

min-1

25

75DA

D (3

07 nm

)

Vi

nos

uvas

cac

ahue

tes m

antec

a de

caca

huete

y teacute

Uvas

cac

ahue

tes y

teacute co

ntien

en

funda

menta

lmen

tetra

ns-p

iceido

Vi

nos t

intos

son f

uente

de ag

licon

as

29

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

40Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Oligoacute

mero

s de e

s-tilb

enos

(vini

ferina

y p

allido

l) y

estilb

ina

DAD

Pr

imer

infor

me so

bre c

onten

idos d

e vin

iferin

a y pa

llidol

en di

feren

tes

tipos

de vi

no

118

Resv

eratr

ol tot

al Hy

persi

l ODS

Gr

adien

te de

meta

nol c

on aacutec

ido foacute

r-mi

co al

05

en ag

ua0

25 m

Lmiddotmi

n-1

APCI

-MS

(SIM

mz

229)

Linea

lidad

en el

rang

o 05

2-22

60 pm

ol de

tran

s-re

sver

atrol

Vino

jugo

de uv

a y ju

go de

ar

aacutenda

nos

Hidr

oacutelisis

de vi

no co

n -D

-glu

cosid

asa

extra

ccioacuten

con a

cetat

o de

etilo

eva

pora

cioacuten y

redis

olucioacute

n co

n meta

nol

agua

119

Polife

noles

inc

luyen

do es

tilbe-

nos c

omo t

rans

- y

cis-re

sver

atrol

Colum

na m

onoliacute

tica C

18

Grad

iente

de m

etano

lagu

a 25

975

a 50

50 p

H 3 c

on H

3PO 4

21

mLmiddotm

in-1

DAD

(256

324

y 36

5 nm)

LOD

(SN

=3) 1

0 y 30

ng

middotmL-1

par

a tra

ns- y

cis-

resv

eratr

olre

spec

tivam

ente

Filtra

cioacuten e

inye

ccioacuten

dire

cta de

la

mues

tra12

0

Resv

eratr

ol y

piceid

o

La

conc

entra

cioacuten d

e pice

ido y

resv

eratr

ol en

el vi

no y

zumo

de uv

a de

pend

e del

tiemp

o de e

xtrac

cioacuten d

e la

piel L

os ni

veles

may

ores

se

encu

entra

n en v

inos t

intos

por e

star

maacutes t

iempo

en co

ntacto

con l

a piel

du

rante

la fe

rmen

tacioacuten

79

trans

- y ci

s-re

sver

atrol

y

Mo

sto V

ariab

ilidad

en el

conte

nido

de re

sver

atrol

seguacute

n el p

roce

so de

12

1

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

41

piceid

o fer

menta

cioacuten

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Resv

eratr

olCo

mbina

cioacuten d

e NP-

HPLC

y RP

-HPL

C

Efec

to de

las c

ondic

iones

me

teoro

loacutegica

s y de

mad

urac

ioacuten en

la

conc

entra

cioacuten d

e res

vera

trol e

n vin

os tin

tos

122

trans

-resv

eratr

ol y

otros

polife

noles

C1

8Gr

adien

te de

meta

nol

aacutecido

aceacuteti

co

agua

102

88 a

902

8 1 m

Lmiddotmi

n-1

DAD

280 n

m

Linea

lidad

trans

-re

sver

atrol

002-

40

μgmiddotm

L-1

Prep

arac

ioacuten de

mue

stra

mejor

es

resu

ltado

s extr

ayen

do co

n eacuteter

etiacute

lico a

pH 2

Valor

es m

edios

de 2

26 3

10 y

380

μgmiddotm

L-1de

trans

-resv

eratr

ol en

vin

os de

Gra

n Can

aria

Lanz

arote

y Te

nerife

res

pecti

vame

nte

123

trans

-resv

eratr

olOD

S-Hy

persy

lGr

adien

te de

aacutecido

percl

oacuterico

(06

mLmiddotL

-1) e

n agu

a y ac

etonit

rilo 1

mL

middotmin-1

DAD

a 310

nm

Linea

lidad

072

-18

μgmiddotm

L-1

LOD

2 ngmiddot

mL-1

SPE-

C18

lavad

o a pH

8 e

lucioacuten

de

trans

-resv

eratr

ol co

n ace

tato d

e etilo

ev

apor

acioacuten

y re

cons

titucioacute

n en

metan

olNi

veles

entre

055

y 25

34 μ

gmiddotmL

-1

124

Polife

noles

entr

e ell

ostr

ans-

y cis-

resv

eratr

ol y

piceid

o

RP-1

8Gr

adien

te de

aacutecido

aceacuteti

co al

1 y 6

en ag

ua y

aacutecido

aceacuteti

co a

gua

ac

etonit

rilo 5

6530

05

mLmiddotm

in-1

DAD

280

y 313

nm

Un

pool

de 14

polife

noles

y 25

vino

s se

some

ten a

un te

st en

fluido

s gaacute

strico

s e in

testin

ales

Se de

termi

-na

la co

ncen

tracioacute

n de p

olifen

oles

antes

y de

spueacute

s del

tratam

iento

125

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

42Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Flavo

noide

s y

estilb

enos

(tra

ns- y

cis

-resv

eratr

ol)

Fase

inve

rsaES

I-MS

MSDA

D (3

20 y

377 n

m pa

ra es

tilben

os y

flavo

noide

s re

spec

tivam

ente)

FL

D

Linea

lidad

50 ng

middotmL-1

ndash50

μgmiddot

mL-1

Detec

cioacuten f

luore

scen

te alt

amen

te se

nsibl

e par

a res

vera

trol

126

Aacutecido

gaacutelic

o tra

ns-re

sver

atrol

quer

cetin

a y ru

tina

ODS

Hype

rsyl

Grad

iente

entre

aacutecido

aceacuteti

co m

etano

l y a

gua

DAD

(306

nm pa

ra tr

ans-r

esve

ratro

l)

01 a

15 μ

gmiddotmL

-1Fil

trado

e iny

eccioacute

n dire

cta de

la

mues

tra12

7

trans

- y ci

s-re

sver

atrol

y pic

eido

C18

grad

iente

de ag

ua a

pH 2

5 con

aacutecido

su

lfuacuteric

o y ac

etonit

rilo 0

2 mL

middotmin-1

DAD

(280

y 30

5 nm

para

cis y

tran

sre

spec

tivam

ente)

SIM

a mz

228

LOD

1202

094

8 25

58

y 083

4 μgmiddot

mL-1

para

trans

- y ci

s-res

vera

trol e

n MS

y DA

D 12

8

Cateq

uina

aacutecido

va

niacutellic

o aacutec

ido

siriacuteng

ico

epica

tequin

a y

trans

-resv

eratr

ol

C18

Grad

iente

de m

etano

l aacutec

ido ac

eacutetico

ag

ua 1

0288

a 90

28

1 mLmiddot

min-1

DAD

280 n

m FL

D

LOD

20 y

3 ngmiddot

mL-1

enDA

D y F

LD

resp

ectiv

amen

te

Extra

ccioacuten

con eacute

ter et

iacutelico a

pH 2

129

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

43

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

trans

-resv

eratr

ol C1

8 El

ucioacuten

isoc

raacutetic

a agu

aace

tonitri

lo 75

25 D

AD a

306 n

m

Co

mpar

acioacuten

RP-

HPLC

-MS

y CE

-MS

Nive

les en

tre 0

82 y

575 μ

gmiddotmL

-113

0

Polife

noles

Extra

ctos e

teacutereo

s Ma

yor e

ficac

ia de

la se

para

cioacuten e

n CE

per

o may

or po

der d

e eluc

idacioacute

n es

tructu

ral e

n LC

22 co

mpue

stos

identi

ficad

os m

edian

te LC

-MC

y solo

13

med

iante

CE-M

S

131

Comp

uesto

sfen

oacutelico

s con

pr

opied

ades

antio

xidan

tes

entre

ellos

tran

s-re

sver

atrol

C18 (

40 ordmC

) Gr

adien

te de

agua

aceto

nitrilo

955

a 50

50 a

pH 1

8 de

955

a 554

5 DA

D (2

80 3

50 y

520 n

m)

Vi

no y

Uva

Inyec

cioacuten d

irecta

de

vinos

y ex

tracto

s de u

va

Dado

el ba

jo pH

de la

fase

moacutev

il los

an

tocian

os so

n dete

ctado

s en f

orma

de

catioacute

n flav

ilium

y ello

no re

fleja

su si

tuacioacute

n en l

a mue

stra r

eal

132

Resv

eratr

ol FL

D ex

cem 2

7037

2 nm

Tr

ansfo

rmac

ioacuten de

resv

eratr

ol en

un

comp

uesto

altam

ente

fluor

esce

nte

con i

rradia

cioacuten u

ltravio

leta i

ntens

a co

n luz

En vi

no g

ener

acioacuten

de un

com-

pues

to sim

ilar p

rove

niente

de pi

cei-

do a

siacute co

mo un

o des

cono

cido

F-3

133

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

44Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

trans

- y ci

s-re

sver

atrol

cateq

uina

epica

tequin

aqu

erce

tina y

rutin

a

ODS-

2Gr

adien

te de

aceto

nitrilo

aacutecido

aceacuteti

co

al 5

de 9

91 a

7030

DA

D (2

80 3

00 y

360 n

m)FL

D ( e

xcem

2803

15 pa

ra ca

tequin

a y

epica

tequin

a 32

4370

para

tran

s-re

sver

atrol

y 260

370 p

ara c

is-re

sver

atrol)

300 n

m LO

D 00

6 y 0

21

gmiddotmL

-1 pa

ra tr

ans-

y cis

-re

sver

atrol

FLD

Ran

go de

linea

lidad

de

001

ndash 1 y

001

ndash 01

gmiddot

mL-1

y LO

D de

3 y 1

ngmiddotm

L-1 p

ara t

rans

- y ci

s-re

sver

atrol

Obten

cioacuten d

e cis-

resv

eratr

ol po

r irr

adiac

ioacuten a

254 n

m du

rante

20 m

in de

trans

-resv

eratr

ol Iny

eccioacute

n dire

cta de

las m

uestr

as

Cateq

uina y

epica

tequin

a pre

sente

s en

todo

s los

vino

s ana

lizad

os

nivele

s de l

a prim

era

cons

idera

bleme

nte su

perio

res

Altos

nive

les de

quer

cetin

a en

much

as m

uestr

as r

utina

se de

tecta

soacutelo

en m

osto

Nive

les de

resv

eratr

ol me

nore

s que

los

del re

sto de

polife

noles

pre

do-

mina

ndo s

iempr

e su f

orma

tran

s

134

Estilb

enoid

es(tr

ans-p

iceido

tra

ns-re

sver

atrol

trans

-astr

ingina

cis

-pice

idoc

is-re

sver

atrol)

C18 (

30 ordmC

) Gr

adien

te de

100

A (aacute

cido a

ceacutetic

o en

agua

a pH

240

) has

ta 10

0 B

(A

meta

nol 2

080)

DA

D 28

6 nm

LOD

(25

L) 8

8 5

5 y

8 ng

para

tran

s-as

tringin

acis

-resv

eratr

ol

trans

-resv

eratr

oltra

ns-

piceid

o y ci

s-pice

ido

resp

ectiv

amen

te

Extra

ccioacuten

con a

cetat

o de e

tilo

evap

orac

ioacuten a

sequ

edad

y re

disolu

cioacuten e

n meta

nol-a

gua

Limpie

za en

resin

a inte

rcamb

iador

a de

catio

nes

135

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

45

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

trans

- y ci

s-re

sver

atrol

y pic

eido

C18 (

40 ordmC

) Gr

adien

te de

aacutecido

aceacuteti

co en

agua

y ac

etonit

rilo

Mu

estra

s de j

ugo d

e uva

blan

ca y

tinta

Inye

ccioacuten

dire

cta de

la m

uestr

a sin

trata

rOb

tencioacute

n de c

is- is

oacutemer

os po

r ex

posic

ioacuten de

los t

rans

- a la

luz

solar

90

de co

nver

sioacuten e

n 10 m

in y c

uanti

ficac

ioacuten de

cis-i

soacuteme

ros

Nive

les en

jugo

s de u

va tin

ta 10

ve-

ces s

uper

iores

a los

de uv

a blan

ca

Canti

dade

s de r

esve

ratro

l com

o glu

coacutesid

o sup

erior

es a

las de

ag

licon

a

136

trans

-resv

eratr

ol C1

8 (40

ordmC)

Grad

iente

linea

l de aacute

cido f

oacutermi

co 50

mM

meta

nol 8

020

a aacutecid

o foacuter

mico

50

mMm

etano

l 208

0 FL

D ( e

xcem

3303

74 nm

)

Pi

eles d

e uva

jugo

de uv

a y vi

no

Vino

SPE

-C18

Co

ncen

tracio

nes d

e tra

ns-re

sver

atrol

en vi

nos j

apon

eses

blan

cos

(Cha

rdon

nay)

y tint

os (C

aber

net

Sauv

ignon

) baja

s de

l ord

en de

las

enco

ntrad

as en

vino

s de l

as m

ismas

va

rieda

des

de C

alifor

nia S

uiza

Fran

cia y

Nuev

a Yor

k

137

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

46Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Dive

rsas

fitoale

xinas

de la

vid

C18

Eluc

ioacuten en

grad

iente

con a

ceton

itrilo

y ag

ua d

esde

el 10

al 85

de

ac

etonit

rilo

FLD

a ex

cem 3

3037

4 nm

para

tran

s-re

sver

atrol

trans

-pter

ostilb

eno y

tran

s--vi

nifer

ina

DAD

a 285

nm pa

ra ci

s-res

vera

trol

Cu

antifi

cacioacute

n de t

rans

-pice

ido a

traveacute

s de l

a rec

ta de

calib

rado

de

trans

-resv

eratr

ol ya

que a

mbos

co

mpue

stos p

rese

ntan s

emeja

ntes

prop

iedad

es flu

ores

cente

s Cu

antifi

cacioacute

n de c

is-pic

eido

utiliz

ando

la re

cta de

calib

rado

de

cis-re

sver

atrol

a 285

nm

138

trans

- y ci

s-re

sver

atrol

y pic

eido

cateq

uina

epica

tequin

aqu

erce

tina y

ru

tina

ODS

Hipe

rsil

Eluc

ioacuten en

grad

iente

entre

aceacuteti

co

metan

ol y a

gua

desd

e 515

80 ha

sta

5455

0DA

D 26

5 28

0 30

6 31

7 y 36

9 nm

LOD

oscil

ando

entre

30

ngmiddotm

L-1 pa

ra tr

ans-

resv

eratr

ol y 1

5 gmiddot

mL-1

para

cateq

uina (

48 7

5 y

135 n

gmiddotmL

-1pa

ratra

ns-

piceid

ocis

-pice

ido y

cis-

resv

eratr

olre

spec

tivam

ente)

40 m

inutos

por c

roma

togra

ma

Recu

pera

cione

s en t

orno

al 10

0

para

todo

s los

anali

tos en

vino

s bla

nco

tinto

y ros

ado

Nive

les es

tables

una v

ez ab

ierta

la bo

tella

dura

nte un

a sem

ana

pero

peacute

rdida

s que

oscil

an en

tre el

10 y

el 40

a

las se

is se

mana

s

139

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

47

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

trans

- y ci

s-re

sver

atrol

como

ag

licon

a y

glucoacute

sido

C18

Grad

iente

entre

aacutecido

aceacuteti

co en

agua

(p

H 24

0)ac

etonit

rilo

Ob

tencioacute

n de c

is-isoacute

mero

s por

ex

posic

ioacuten a

la luz

del s

ol de

los

trans

Cua

ntific

acioacuten

de lo

s isoacute

mero

s de

pice

ido as

umien

do id

eacutentic

os

que p

ara t

rans

- y ci

s-re

sver

atrol

a 30

6 y 28

5 nm

resp

ectiv

amen

teAn

aacutelisis

de vi

nos t

intos

y ro

sado

s sin

tratam

iento

prev

io C

once

ntrac

ioacuten

por e

vapo

racioacute

n de v

inos b

lanco

s pa

ra la

cuan

tifica

cioacuten d

e los

cis-

isoacuteme

ros

140

Isoacuteme

ros d

e re

sver

atrol

ODS

Hipe

rsil (4

0ordm C

)Gr

adien

te de

agua

meta

nol 1

000

a 01

00 en

15 m

inutos

DA

D (3

06 y

286 n

m m

aacutexim

os de

ab

sorci

oacuten de

tran

s- y

cis-re

sver

atrol

re

spec

tivam

ente)

LOD

(SN

= 3)

de 0

6 mo

lmiddotL-1

para

ambo

s an

alitos

a 28

6 nm

Se co

mpru

eba l

a tra

nsfor

macioacute

n de

trans

en ci

s-res

vera

trol p

or

irrad

iacioacuten

con l

uz U

V a 2

54 nm

Se ap

ortan

valor

es de

288

nm y

308

nm de

cis y

tran

sIso

meriz

acioacuten

de ci

s a la

form

a tra

ns- m

aacutes es

table

en m

edio

aacutecido

141

Isoacuteme

ros d

e re

sver

atrol

y pic

eido

Al ig

ual q

ue ot

ros p

olifen

oles

son

buen

os m

arca

dore

s quim

iotax

a-noacute

mico

s del

vino

perm

itiend

o la

distin

cioacuten e

ntre v

aried

ades

de vi

no

blanc

o de d

ifere

ntes D

Oy

bode

gas

142

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

48Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

trans

-resv

eratr

ol C1

8 El

ucioacuten

isoc

raacutetic

a con

ag

uaac

eacutetico

aceto

nitrilo

755

20

DAD

(306

nm)

Se

conc

luye q

ue el

seca

do de

las

uvas

no es

una p

raacutecti

ca qu

e ind

uzca

la

siacutentes

is de

resv

eratr

olNi

veles

en vi

nos d

e uva

s sec

as

(Rec

ioto y

Ama

rone

) entr

e 005

y 08

mg

middotL-1

25

Resv

eratr

ol C1

8 El

ucioacuten

isoc

raacutetic

a con

agua

aceto

nitrilo

55

45

DAD

(307

nm tr

ans-r

esve

ratro

l) 28

0 nm

cis-

resv

eratr

ol)

Se

estud

ia la

influe

ncia

del p

roce

so

de vi

nifica

cioacuten y

el ni

vel d

e po

dred

umbr

e por

Bot

ritis

en la

uva

sobr

e el c

onten

ido en

resv

eratr

ol Vi

nos m

acer

ados

pres

entan

ca

ntida

des1

0 sup

erior

es

143

Isoacuteme

ros d

e re

sver

atrol

y pic

eido

C18 (

40 ordmC

) Gr

adien

te de

aacutecido

aceacuteti

co en

agua

(p

H 24

0) y

aceto

nitrilo

DAD

(306

nm tr

ans

y 285

nm c

is)

LOD

y LOQ

par

a tra

ns-

resv

eratr

ol 3 y

10 ng

middotmL-1

Obten

cioacuten d

e cis

isoacuteme

ros p

or

expo

sicioacuten

de lo

s tra

ns a

la luz

solar

Pr

oduc

cioacuten d

e esti

lbeno

ides e

n uva

pa

rece

depe

nder

de la

varie

dad

posib

le co

ntrol

geneacute

tico d

e su

biosiacuten

tesis

Elev

ados

valor

es de

la re

lacioacuten

tra

nsci

s qu

e apo

yan a

l tran

s com

o uacuten

ico is

oacutemer

o natu

ral n

atura

lmen

te es

el o

riginaacute

ndos

e el c

ispo

rex

posic

ioacuten a

la luz

del m

osto

o vino

39

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

49

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Resv

eratr

ol

C18

Eluc

ioacuten en

grad

iente

desd

e ac

eacutetico

agua

199

a ac

eacutetico

agua

694

y a

ceacutetic

oagu

aace

tonitri

lo 56

530

DAD

(306

y 26

2 nm)

FL

D ( e

xcem

2703

72 nm

)

Es

tudian

los e

fectos

de la

irrad

iacioacuten

de

resv

eratr

ol y s

us de

rivad

os en

pie

les de

uva

En pr

imer

luga

r se p

rodu

ce la

iso

meriz

acioacuten

de tr

ans a

cis

gene

raacutend

ose a

conti

nuac

ioacuten

deriv

ados

altam

ente

fluor

esce

ntes

144

Isoacuteme

ros d

e re

sver

atrol

y pic

eido

Lichr

osph

ere 1

00 C

N

Eluc

ioacuten is

ocraacute

tica c

on

agua

acton

itrilo

metan

ol 9

055

UVD

(306

nm)

LOD

011 y

016

molmiddot

L-1

para

trans

-resv

eratr

ol y

piceid

o re

spec

tivam

ente

02

0 y 0

30 m

olmiddotL-1

para

cis

-resv

eratr

ol y p

iceido

re

spec

tivam

ente

Gene

racioacute

n de c

is-re

sver

atrol

por

irrad

iacioacuten

de tr

ans-r

esve

ratro

l a 25

4 nm

dura

nte 5-

10 m

inutos

Cu

antifi

cacioacute

n de c

is-re

sver

atrol

basa

da en

la ca

iacuteda de

l tran

sTr

ansfo

rmac

ioacuten de

cis e

n tra

ns-

resv

eratr

ol a 7

0 ordmC

dura

nte 30

mi

nutos

Identi

ficac

ioacuten de

gluc

osido

s me

diante

hidr

oacutelisis

enzim

aacutetica

con

-glu

cosid

asa

145

Resv

eratr

ol y

piceid

oC1

8Gr

adien

te de

aacutecido

aceacuteti

coag

ua 1

99

a aacutecid

o aceacute

ticoa

gua 6

94 y

aacutecid

o ac

eacutetico

agua

aceto

nitrilo

565

30

DAD

(entr

e 230

y 45

0 nm

)

Iny

eccioacute

n dire

cta de

la m

uestr

a sin

tratam

iento

prev

io38

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

50Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

trans

-resv

eratr

ol y

trans

-pter

ostilb

eno

C18

Grad

iente

de m

etano

laacutecid

o foacuter

mico

DA

D (3

056

y 306

4 nm

para

re

sver

atrol

y pter

ostilb

eno)

FL

D ( e

xcem

3303

74 nm

para

ambo

s)

No

es ne

cesa

rio tr

atami

ento

prev

io de

la m

uestr

a de v

ino g

racia

s a la

es

pecif

icida

d de l

a FLD

14

6

Pice

ido

Desc

riben

el pr

imer

proc

edim

iento

de ex

tracc

ioacuten de

pice

ido de

P

Cusp

idatu

m37

trans

-resv

eratr

ol C1

8 El

ucioacuten

con

A (aacute

cido f

osfoacuter

ico 0

2 M a

pH 1

5 por

adici

oacuten de

amon

iaco)

y B

(Aac

etonit

rilo 20

80)

al 23

5

B

DAD

a 306

316

280

y 25

0 nm

trans

-resv

eratr

ol sin

tetiza

doVi

no p

reco

ncen

tracioacute

n en e

l ro

tavap

or li

mpiez

a con

clor

oform

o ex

tracc

ioacuten co

n ace

tato d

e etilo

lav

ado c

on ag

ua sa

turad

a en c

lorur

o soacute

dico

La fa

se or

gaacutenic

a es

evap

orad

a a se

qued

ad y

se

redis

uelve

en ag

uaac

etonit

rilo 1

1

42

Resv

eratr

ol Co

lumna

de siacute

lice L

ichro

sorb

El

ucioacuten

isoc

raacutetic

a con

meta

nolc

lorur

o de

meti

leno 3

97

Vi

no E

xtrac

cioacuten c

on ac

etato

de et

ilo

se re

uacutenen

los e

xtrac

tos or

gaacutenic

os y

se la

vado

con a

gua d

estila

da

Evap

orac

ioacuten a

sequ

edad

se

redis

uelve

en m

etano

l

34

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

51

Tabla

3- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol me

diante

elec

trofor

esis

capil

ar

Anali

to(s

)Si

stem

a elec

trofo

reacutetic

o M

odali

dad

In

yecc

ioacuten

Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

trans

- y ci

s-re

sver

atrol

Crom

atogr

afiacutea e

lectro

cineacuteti

ca m

icelar

Iny

eccioacute

n elec

trocin

eacutetica

(2 kV

5s)

306 n

m14

7

Resv

eratr

olCZ

EIny

eccioacute

n hidr

odinaacute

mica

(4 s

50 m

bar)

305 n

m

Optim

izacioacute

n del

proc

eso S

PE

media

nte re

des n

euro

nales

ar

tificia

les y

disentilde

o de e

xper

imen

tos14

8

trans

-resv

eratr

ol(-)

-epic

atequ

ina y

(+)-c

atequ

ina

Detec

cioacuten e

lectro

quiacutem

ica

Elec

trodo

de di

sco d

e car

boacuten a

+08

5 V

149

Resv

eratr

ol y

piceid

oCZ

E15

0

Polife

noles

entr

e ell

os r

esve

ratro

l NA

CE

Capil

ares

recu

bierto

s a el

evad

o pH

y me

tanol

UV (2

14 y

223 n

m)

LOD

25 μ

molmiddotL

-1

resv

eratr

olSP

EVa

lores

de pK

ade r

esve

ratro

l 922

10

55 1

116

151

Polife

noles

entr

e ell

ostra

ns- y

cis-

resv

eratr

ol

CZE

DAD

LOD

18 y

50 ng

middotmL-1

pa-

racis

- y tr

ans-r

esve

ratro

l15

2

a Des

viac

ioacuten

estaacute

ndar

rela

tiva

bLiacute

mite

de

dete

ccioacute

n c

Liacutem

ite d

e cu

antif

icac

ioacuten

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

52Tabla

3- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol me

diante

elec

trofor

esis

capil

ar (c

ontin

uacioacute

n)

Anali

to(s

)Si

stem

a elec

trofo

reacutetic

o M

odali

dad

In

yecc

ioacuten

Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

trans

-resv

eratr

ol y aacute

cido s

oacuterbic

o CZ

EDA

D a 3

05 nm

LO

D 00

4 μgmiddot

mL-1

trans

-re

sver

atrol

SPE-

C18

para

resv

eratr

ol e i

nyec

-cioacute

n dire

cta pa

ra aacutec

ido soacute

rbico

Ut

iliza l

a mism

a rec

ta de

calib

rado

de

trans

-resv

eratr

ol pa

ra ci

s-re

sver

atrol

divid

iendo

la pe

ndien

te en

tre la

razoacute

n de l

os co

eficie

ntes d

e ab

sorci

oacutentra

nsci

s a 30

5 nm

(269

)

153

trans

-resv

eratr

olIny

eccioacute

n elec

trocin

eacutetica

(10 k

V 6s

) De

teccioacute

n elec

troqu

iacutemica

Elec

trodo

de

disco

de ca

rboacuten

a +0

85 V

Rang

o line

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55

APARATOS REACTIVOS Y SOFTWARE UTILIZADOS EN ESTE TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteN

Se recoge a continuacioacuten el instrumental asiacute como los reactivos disoluciones y los programas informaacuteticos utilizados para la realizacioacuten de esta memoria a) Aparatos

diams Espectrofluoriacutemetro Perkin Elmer LS-50B equipado con una

laacutempara de descarga de Xenon equivalente a 20 KW durante 8 s de duracioacuten y conectado a traveacutes de una interfase RS-232 a un PC IBM PS2 La adquisicioacuten de datos se lleva a cabo con el software de Perkin-Elmer Fluorescence Data Manager versioacuten 270

diams Espectrofluoriacutemetro Varian Modelo Cary Elipse equipado con

una laacutempara continuacutea de Xenon Estaacute conectado a un PC viacutea una interfase IEE El paquete de sofware Cary Eclipse Versioacuten 10 se utilizoacute para la adquisicioacuten e interpretacioacuten de datos

diams Espectrofotoacutemetro UV-Visible Varian modelo Cary 50 Bio con

laacutempara de Xenon ordenador DELL Optiplex GX 280 Intel Pentium 4 incorporado y software propio de Varian

diams Cromatoacutegrafo Agilent 1100 Series (Agilent Technologies Inc

Palo Alto CA USA) compuesto por una bomba cuaternaria Agilent un desgasificador de disolventes G1322A Agilent un detector de fotodiodos G1315B Agilent UV-Vis y un detector fluorescente


56

G1321A Agilent El sistema cromatograacutefico estaacute controlado por el HP ChemStation para LC 3D software (Agilent Technologies Inc)

diams Cromatoacutegrafo Agilent 1100 Series (Agilent Technologies

Waldbronn Alemania) equipado con un inyector automaacutetico termostatizado a 6 ordmC y un espectromeacutetro de masas de trampa ioacutenica (MSD XCT) conectados a traveacutes de una interfase de ionizacioacuten mediante electrospray (ESI) Se realiza un barrido desde mz 100 hasta 2200 con una velocidad de 27000 amus

diams Potenciostato Autolab PSTAT 10 y stand Metrohm 663VA

dotado de una celda con tres electrodos uno de AgAgCl (electrodo de referencia) otro de platino (electrodo auxiliar) y el tercero de carboacuten vitrificado (electrodo de trabajo Metrohm 61204040) estando controlado todo el sistema por un PC 48666 MHz equipado con el paquete de software GPES 34

diams Espectroacutemetro de resonancia magneacutetica nuclear Broker AM 400

(400 MHz para protones y 100 MHz para 13C)

diams pH-metro Crison 2001 con electrodo combinado de vidrio-

calomelanos saturado

diams Laacutempara de mercurio HBO Osram de 200 W con una fuente de

energiacutea Oriel modelo 8500 protegida con una carcasa metaacutelica


57

diams Fotoreactor (Softron Gynkotek HPLC Alemania) equipado con

una laacutempara de Xenon de 4 W y un tubo de tefloacuten enrollado alrededor

diams Bantildeo termostaacutetico Frigiterm 6000382 marca p-Selecta

diams Balanza analiacutetica ER-60A marca AND con una sensibilidad de

plusmn 01 mg

diams Sistema de obtencioacuten de agua ultrapura Milli-Q equipado con un

moacutedulo RIOsElix y un A-10 b) Reactivos

diams trans-Resveratrol (34 5-trihidroxi-trans-estilbeno) suministrado

por Sigma-Aldrich nuacutemero CAS 501-36-0

diams trans-Piceido (345-trihidroxiestilbeno-3-β-D-glucopiranosa)

suministrado por Aldrich Chem Co nuacutemero CAS 65914-17-2

diams Fenantreno 98 suministrado por Aldrich Chem

diams trans-Estilbeno suministrado por Aldrich Chem

diams cis-Estilbeno suministrado por Aldrich Chem

diams Aacutecido gaacutelico suministrado por Sigma-Aldrich

diams Aacutecido p-cumaacuterico suministrado por Sigma-Aldrich

diams Aacutecido egaacutelico suministrado por Sigma-Aldrich

diams Aacutecido feruacutelico suministrado por Sigma-Aldrich

diams Quercetina suministrado por Sigma-Aldrich

diams Rutina suministrado por Sigma-Aldrich


58

diams Catequina suministrado por Sigma-Aldrich

diams Epicatequina suministrado por Sigma-Aldrich

diams Aacutecido vanillico sumistrado por Fluka

diams Aacutecido cafeiacuteco sumistrado por Fluka

diams Aacutecido sinaacutepico sumistrado por Fluka

diams Tartrato disoacutedico dihidratado suministrado por Scharlau

diams Perclorato soacutedico monohidratado suministrado por Merck

diams Aacutecido percloacuterico 70 suministrado por Merck

diams Aacutecido fosfoacuterico suministrado por Panreac

diams Aacutecido clorhiacutedrico suministrado por Panreac

diams Reactivo de Folin-Ciocalteu suministrado por Panreac

c) Disoluciones

diams Disolucioacuten etaacutenolica de trans-resveratrol de 100 μgmL-1

conservada en la obscuridad y a 4 ordmC

diams Disolucioacuten etaacutenolica de trans-piceido de 100 μgmL-1


diams Disolucioacuten reguladora tartrato monosoacutedico tartrato disoacutedico de

pH 50 preparada a partir de la sal disoacutedica dihidratada (026 M) y antildeadiendo HCl hasta conseguir el pH deseado

d) Disolventes

diams Etanol suministrado por Panreac (Espantildea)

diams NN-Dimetilformamida suministrado por Panreac (Espantildea)

diams Dimetilsulfoacutexido suministrado por Panreac (Espantildea)


59

diams Cloroformo suministrado por Panreac (Espantildea)

diams Metanol suministrado por Panreac (Espantildea)

diams Acetonitrilo grado HPLC suministrado por Merck (Alemania)

diams Eacuteter dietiacutelico grado HPLC suministrado por Merck (Alemania)

diams Acetato de etilo suministrado por Panreac (Espantildea)

diams Hexano grado HPLC suministrado por Merck (Alemania)

e) Programas informaacuteticos

diams Grapher 30 2-D Graphing System Golden Software Inc

Colorado Usa 2001

diams PLS Toolbox (Eigenvector Research Inc WA USA)

diams MATLAB ver 710 The MathWorks Inc MA USA

diams Software THE UNSCRAMBLER Versioacuten 611 (Camo AS Olav

Tryggvasonsgt N-7011 Trondheim Norway) utilizado tanto para el disentildeo de experimentos permitiendo la optimizacioacuten a traveacutes de las superficies de respuesta como para el tratamiento de datos multivariantes permitiendo entre otros meacutetodos aplicar Anaacutelisis de Componentes Principales (PCA) con fines clasificatorios

diams ACOC V 20 163 Herramienta estadiacutestica para Quiacutemica Analiacutetica

en entorno MATLAB 53 programa realizado en el Departamento de Quiacutemica Analiacutetica de la UEX que permite realizar todos los caacutelculos de la calibracioacuten univariante calcular los distintos


60

paraacutemetros estadiacutesticos y de calidad de las rectas de calibrado asiacute como para aplicar diversos test de comparacioacuten

diams HyperChem trade versioacuten 75 para Windows Molecular modeling

system 2002 Hypercube inc


61

Bibliografiacutea 1 J Gorham ldquoThe Stilbenoidsrdquo en ldquoProgress in Phytochemistryrdquo L Reinhold JB Harborne T Swain Eds Pergamon Press Oxford UK 203 (1980) 2 wwwbiologieuni-freiburgdedatabio2schoroederResveratrol 3 Moreno-Mantildeas M Pleixats R Anal Quim 1985 81157-161 4 Takaoka M J J Faculty Sci Hokkaido Imperial U 1940 31-16 5 Vastano BC Chen Y Zhu N Ho CT Zhou Z Rosen RT J Agric Food Chem 2000 48253-256 6 Lee SK Mbwambo ZH Chung H Luyengi L Gamez EJ Mehta RG Kinghorn A D Pezzuto JM Comb Chem HighThroughput Screen 1998 135-46 7 Cichewicz RH Kouzi SA J Nat Prod Chem 2002 26507-579 8 Langcake P Price RJ Physiol Plant Pathol 1976 977-86 9 Hahn MG Ann Rev Phytopathol 1996 34387-412 10 Keen NT Plant Mol Biol 1992 1909-122 11 Sticher L Mauch-Mani B Meacutetraux J P Annu Rev Phytopathol 1997 35325-370 12 Osbourn AE Fungal Genet Biol 1999 26163-168 13 Kuc J Ann Rev Phytopathol 1995 33275-297 14 Stein U Hoos G Vitis 1984 23179-194 15 Dercks W Creasy LL Physiol Mol Plant Pathol 1989 34189-202 16 Hoos G Blaich R J Phytopathol 1990 129102-110 17 Sarig P Zutkhi Y Monjauze A Lisker N Ben-Arie R Physamp Mol Plant Pathol 1997 50337-347 18 Adrian M Jeandet P Bessis R Joubert J M J Agric Food Chem 1996 441979-1981 19 Schubert R Fischer R Hain R Schreier R Bahnweg G Ernst D Sandermann H Plant Mol Biol 1997 34417-426 20 Hrazdina G Parsons GF Mattick LR Am J Enol Vitic 1985 35220-227 21 Hain R Reif HJ Krause E Langebartels R Kindl H Vornam B Wiese W Schmelzer E Schreier H Stocker R H Nature 1993 361153-156 22 Cantos E Espiacuten JC Tomaacutes-Barberaacuten A J Agric Food Chem 2001 495052-5058


62

23 Cantos E Espiacuten JC Tomaacutes-Barberaacuten A J Agric Food Chem 2002 506322-6329 24 Cantos E Espiacuten JC Fernaacutendez MJ Oliva J Tomaacutes-Barberaacuten F J AgricFood

Chem 2003 511208ndash1214 25 Celotti E Ferrarini R Zironi R Conte L S J Chromatogr A 1996 73047-52 26 Creasy LL Coffee M J Am Soc Hortic Sci 1988 113230-234 27 Chen RS Wu PL Chiou R Y J Agric Food Chem 2002 501665-1667 28 Sobolev VS Cole RJ J Agric Food Chem 1999 471435-1439 29 Burns J Yokota T Ashihara H Lean ME Crozier A J Agric Food Chem 2002 503337-3340 30 Hanawa F Tahara S Mizutani J Phytochemistry 1992 313005-3007 31 Chung MI Teng CM Cheng KL Ko FN Lin CN Planta Med 1992 58274-276 32 Kumar RJ Jyostna D Krupadanam GL Srimannarayana G Phytochemistry 1988 273625-3626 33 Counet C Callemien D Collin S Food Chem 2006 98649-657 34 Siemann EH Creasy LL Am J Enol Vitic 1992 4349-52 35 Jaendet P Bessis R Maume BF Meunier P Trollat P J Agric Food Chem 1995 43316-319 36 Jeandet P Bessis R Maume BF Sbagui M J Wine Res 1993 479-85 37 Waterhouse AL Lamuela-Raventoacutes RM Phytochemistry 1994 37571-573 38 Roggero JP Archier P Sciences des Aliments 1994 1499-107 39 Lamuela Raventoacutes RM Romero Peacuterez AI Waterhouse AL de la Torre Boronat MC J Agric Food Chem 1995 43281-283 40 Romero Peacuterez AI Lamuela Raventoacutes RM Waterhouse AL de la Torre Boronat MC J Agric Food Chem 1996 44 2124-2128 41 Freacutemont L Life Sciences 2000 66663-673 42 Lamuela-Raventoacutes RM Waterhouse AL J Agric Food Chem 1993 41521-523 43 Goldberg DM Yan J Diamandis EP Karumanchiri A Soleas G Waterhouse AL Anal Chem 1994 663959-3963 44 McMurtrey KD Minn J Pobanz K Schultz TP J Agric Food Chem 1994 422077-2080


63

45 Goldberg DM Karumanchiri A Ng E Yan J Diamandis EP Soleas GJ J Agric

Food Chem 1995 431245-1250 46 Lamikanra O Grimm CC Rodin JB Inyang ID J Agric Food Chem 1996 441111-1115 47 Sato M Suzuki Y Okuda T Yokotsuka K Biosci Biotech Biochem 1997 611800-1805 48 Chu QY Dwyer MO Zeece MG J Agric Food Chem 1998 46509-513 49 Pervaiz S FASEB J 2003 171975-1985 50 Frankel EN Waterhouse AL Kinsella JE Lancet 1993 3411103-1104 51 Belguendouz L Fremont L Linard A Biochem Pharmacol 1997 531346-1355 52 Urpiacute Sardaacute M Jaacuteuregui O Lamuela Raventoacutes RM Jaeger W Miksits M Cobas MI Andreacutes Lacueva C Anal Chem 2005 773149-3155 53 Kimura Y Okuda H Arichi S Biochim Biophys Acta 1985 834275-278 54 Kimura Y Ohminami H Okuda H Baba K Kozawa M Planta Med 1983 4951-54 55 Baur JA Pearson KJ Price NL Jamieson HA Lerin C Kalra A Prabhu VV Allard JS Loacutepez-Lluch G Lewis K Pistell PJ Poosala S Becker KG Boss O Gwinn D Wang M Ramaswamy S Fishbein KW Spencer RG Lakatta EG Le Couteur D Shaw R J Navas P Puigserver P Ingram DK de Cabo R Sinclair DA Nature 2006 444337-342 56 Chantavitayapongs S Draczynska Lusiak B Sun AY Neuroreport 1997 81499-1502 57 Shin NH Ryu SY Lee H Min KR Kim Y Planta Medica 1998 64283-284 58 Giovannini L Migliori M Longoni BM Das DK Bertelli AA Panichi V Filippi C Bertelli A J Cardiovascular Pharm 2001 37262-270 59 Jang M Cai L Udeani GO Slowing KV Thomas CF Beecher CWW Fong HHS Farnsworth NR Kinghorn AD Mehta RG Moon RC Pezzuto JM Science 1997 275218-220 60 Mgbonyebi OP Russo J Russo IH Int J Oncol 1998 12865-869 61 Jayatilake GS Jayasuriya H Lee ES Koonchanok NM Geahlen RL Ashendel CL McLaughlin JL Chang CJ J Nat Prod 1993 561805-1810


64

62 Bertelli AAE Giovannini L De Caterina F Miglioni M Bernini W Fregoni M Bavaresco J Trevisan M Antiplatelet Activity of cis-resveratrol Feuillet Bleu 25 Office International de la Vigne et du Vin Paris France 1996 63 Meacuterillon JM Fauconneau B Waffo P Barrier L Decendit A Huguet F Antioxidant

activity of wine phenolic compounds in hinhibiting oxidation of human low-density

lipoproteins Presented at the 18th International Conference on Polyphenols Polyphenols Communications 96 Bordeaux (France) July 1996

64 Arichi H Kimura Y Okuda H Baba K Kozawa M Arichi S Chem Pharm Bull 1982 301766-1770 65 Hackett AM The metabolism of flavonoid compounds in mammals En Plant Flavonoids

in Biology and Medicine Cody V Middleton E Harborne J B Eds Liss New York 1986 pp 177-194 66 Pintildeeiro Z Palma M Barroso CG J Chromatogr A 2006 111061-65 67 Chafer A Pascual-Marti MC Salvador A Berna A J Sep Sci 2005 282050-2056 68 Roldaacuten A Palacios V Caro I Peacuterez L J Agric Food Chem 2003 511464-1468 69 Cantos E Espiacuten JC Tomaacutes-Barberaacuten FA Agric Food Chem 2002 505691-5696 70 Schmandke H Ernaumlhrungs-Umschau 2002 49349-352 71 Romero-Peacuterez AI Lamuela-Raventoacutes RM Andreacutes-Lacueva C de la Torre-Boronat MC J Agric Food Chem 2001 49210-215 72 Rudolf JL Resurreccion AVA Food Chem 2005 89623-638 73 Lyons M Chongwoo Y Toma R Cho S Reiboldt W Lee J van Breemen R J Agric

Food Chem 2003 515867-5870 74 Jimeacutenez Saacutenchez JB Crespo Corral E Santos Delgado MJ Orea JM Gonzaacutelez Urentildea A J Chromatogr A 2005 1074 133-138 75 Jerkovik V Callemien D Collin S J Agric Food Chem 2005 534202-4206 76 Callemien D Jerkovic V Rozenberg R Collin S J Agric Food Chem 2005 53424-429 77 Jandera P Škeřiacutekovaacute V Řehovaacute L Haacutejek T Baldriaacutenovaacute L Škopovaacute G Kellner V Horna A J Sep Sci 2005 28 1005-1022 78 Zhao RZ Shaojun L Zhou Li-Lin Chromatographia 2005 61 311-314


65

79 Yang F Zhang T Ito Y J Chromatogr A 2001 919443-448 80 Chen L Han Y Yang F Zhang T J Chromatogr A 2001 907343-346 81 Chen M Shu YQ He JG Chinese J Anal Chem 2005 33635-638 82 Kiraly-Veghely Z Katay G Tyihak E Merillon JM J Planar Chromatogr 2004 174-8 83 Loacutepez-Hernaacutendez J Paseiro-Losada P Sanches-Silva A Lage-Yusty MA Eur Food

Res Technol 2008 DOI 101007s00217-006-0483-x 84 Gurbuz O Goccedilmen D Dagdelen F Gursoy M Aydin S Sahin I Buyukuysal L Usta M Food Chem 2007 100518-525 85 Rodriacuteguez-Bernaldo de Quiroacutes A Loacutepez-Hernaacutendez J Feraces-Casais P Lage-Yusty MA J Sep Sci 2007 301262-1266 86 Bravo MN Silva S Coelho AV Vilas Bolas L Bronze MR Anal Chim Acta 2006 56384-92 87 Nikfardjam MSP Mark L Avar P Figler M Ohmacht R Food Chem 2006 98453-462 88 Nikfardjam MSP Laszlo G Dietrich H Food Chem 2006 9674-79 89 Loredana La Torre G Saitta M Vilasi F Pellicano T Dugo G Food Chem 2006 94640-650 90 Gerogiannaki-Christopoulou M Athanasopoulo P Kyriakidis N Gerogiannaki IA Spanos M Food Control 2006 17700-706 91 Abril M Negueruela A I Peacuterez C Juan T Estopantildeaacuten G Food Chem 2005 92729-736 92 Vitrac X Bornet A Vanderlinde R Valls J Richard T Delaunay JC Meacuterillon JM Teisseacutedre PL J Agric Food Chem 2005 53 5664-5669 93 Zhang Q Cui H Aung M Lian M Liu L J Chromatogr A 2005 1095 94-101 94 Abert Vian M Tomao V Gallet S Coulomb PO Lacombe JM J Chromatogr A 2005 1085 224-229 95 Clare SS Skurray GR Shalliker RA Australian J Grape and Wine Res 200 119-14 96 Monagas M Bartolome B Goacutemez-Cordoves C European Food Res Tech 2004 220331-340


66

97 Mark L Nikfardjam MSP Avar P Ohmacht R J Chromatogr Sci 2005 43445-449 98 Qin S Min C Yun DQ Feng L Chinese J Chromatog 2005 2388-91 99 Zhou J Cui H Wan G Xu H Pang Y Duan C Food Chem 2004 88613-620 100 Kolouchovaacute Hanzliacutekovaacute I Melzoch K Filip V Smidrkal J Food Chem 2004 87151-158 101 Loredana La Torre G Laganagrave G Bellocco E Vilasi F Salvo F Dugo G Food

Chem 2004 85259-266 102 Moreno Labanda JF Mallavia R Perez-Fons L Lizama V Saura D Micol V J

Agric Food Chem 2004 525396-5403 103 Kammerer D Claus A Carle R Scheiber A J Agric Food Chem 2004 524360-4367 104 Kerem Z Bravdo B Shoseyov O Tugendhaft Y J Chromatogr A 2004 1052211-215 105 Gambelli L Santaroni GP J Food Comp Anal 2004 17613-618 106 Clare SS Skurray G Shalliker RA Am J Enol Vitic 2004 55401-406 107 Skerikova V Grynova L landera P Chem List 2004 98343-348 108 Dugo G Saitta M Giuffrida D Vilasi F La Torre GL Italian J Food Sci 2004 16305-321 109 Rehova L Skerkova V Jandera P J Sep Sci 2004 271345-1359 110 Xiaoging Z Jiang Y Zhiuru X Chinese J Chromatog 2004 22424-427 111 Gil AM Duarte IF Godejohann M Braumann U Maraschin M Sprau M Anal

Chim Acta 2003 48835-51 112 Ali A Strommer JN J Agric Food Chem 2003 517246-7251 113 Pozo Bayoacuten M Hernaacutendez M Martiacuten-Aacutelvarez P Polo MC J Agric Food Chem 2003 512089-2095 114 Poussier M Guilloux-Benatier M Torres M Heras E Adrian M Am J Enol Vitic 2003 54 261-266 115 Cantos E Tomaacutes-Barberaacuten FA Martiacutenez A Espiacuten JC Europ Food ResTech 2003 217253-258


67

116 Vitrac X Monti JP Vercauteren J Deffieux G Meacuterillon JM Anal Chim Acta 2002 458103-110 117 Rodriacuteguez Delgado MA Gonzaacutelez G Peacuterez-Trujillo JP Garciacutea-Montelongo FJ Food Chem 2002 76371-375 118 Landrault N Larronde F Delaunay JC Castagnino C Vercauteren J Merillon JM Gasc F Cros G Teissedre PL J Agric Food Chem 2002 502046-2052 119 Wang Y Catana F Yang Y Roderick R van Breeman R J Agric Food Chem 2002 50431-435 120 Castellari M Sartini E Fabiani A Arfelli G Amati A J Chromatogr A 2002 973221-227 121 Franco M Coloru GC Del Caro A Emonti G Farris G Manca G Massa TG Pinna G Europ Food Res Technol 2002 214221-225 122 Yoshihiro Y Keita Y Akihiko N Masanori K Masao O J Japanese Soc Food

Sci Technol 2002 49220-227 123 Malovanaacute S Garciacutea Montelongo FJ Peacuterez JP Rodriacuteguez-Delgado MA Anal Chim

Acta 2001 428245-253 124 Kallithraka S Arvanitoyannis I El-Zajouli A Kefalas P Food Chem 2001 75 355-363 125 Martiacutenez-Ortega MV Garciacutea-Parrilla MC Troncoso AM Food Chem 2001 73 11-16 126 Stecher G Huck CW Popp M Bonn GK Fresenius J Anal Chem 2001 37173-80 127 Loacutepez M Martiacutenez F Del Valle C Orte C Miroacute M J Chromatogr A 2001 922359-363 128 Domiacutenguez C Guilleacuten DA Barroso CG J Chromatogr A 2001 918303-310 129 Rodriacuteguez Delgado MA Malovanaacute S Peacuterez JP Borges T Garciacutea Montelongo FJ J Chromatogr A 2001 912249-257 130 Souto AA Carneiro MC Seferin M Senna MJH Conz A Gobbi KJ Food Comp

Anal 2001 14441-445 131 Vanhoenacker G De Villiers A Chromatographia 2001 54309-315 132 Revilla E Ryan J M J Chromatogr A 2000 881461-469


68

133 Roggero JP J Food Comp Anal 2000 1393-97 134 Vintildeas P Loacutepez-Erroz C Mariacuten-Hernaacutendez JJ Hernaacutendez-Coacuterdoba M J

Chromatogr A 2000 87185-93 135 Ribeiro de Lima MT Waffo Teacuteguo P Teissedre PL Pujolas A Vercauteren J Cabanis JC Meacuterillon JM J Agric Food Chem 1999 472666-2670 136 Romero Peacuterez AI Ibern Goacutemez M Lamuela Raventoacutes RM de la Torre Boronat MC J Agric Food Chem 1999 471533-1536 137 Okuda T Yokotsuka K Am J Enol Vitic 1996 4793-99 138 Jeandet P Breuil AC Adrian M Weston LA Debord S Meunier P Maume G Bessis R Anal Chem 1997 695172-5177 139 Goldberg DM Tsang E Karumanchiri A Diamandis EP Soleas G Ng E Anal

Chem 1996 681688-1694 140 Romero Peacuterez AI Lamuela Raventoacutes RM Waterhouse AL de la Torre Boronat M C J Agric Food Chem 1996 442124-2128 141 Trela BC Waterhouse AL J Agric Food Chem 1996 441253-1257 142 Romero Peacuterez AI Lamuela Raventoacutes RM Buxaderas S de la Torre Boronat MC J

Agric Food Chem 1996 441975-1978 143 Jeandet P Bessis R Maume B F Meunier P Peyron D Trollat P J Agric Food

Chem 1995 43316-319 144 Roggero JP Garciacutea Parrilla C Sci Aliments 1995 15411-422 145 Goldberg DM Ng E Karumanchiri A Yan J Diamandis EP Soleas GJ J

Chromatogr A 1995 70889-98 146 Pezet R Pont V Cuenat P J Chromatogr A 1994 663191-197 147 Fan E Zhang K Chromatographia 2005 62289-294 148 Spanilaacute M Pazourek J Farkovaacute M Havel J J Chromatogr A 2005 1084180-185 149 Peng Y Chu Q Liu F Ye J J Agric Food Chem 2004 52153-156 150 Peng YY Chu QC Ye JN Am Lab 2004 3640-44 151 Demianovaacute Z Siren H Kuldvee R Riekkola ML Electrophoresis 2003 244264-4271


69

152 Minussi R Rossi M Bologna L Cordi L Rotilio D Pastore GM Duran N Food

Chem 2003 82409-416 153 Dobiaacutesovaacute Z Pazourek J Havel J Electrophoresis 2002 23263-267 154 Gao L Chu Q Ye J Food Chem 2002 78255-260 155 Brandolini V Maietti A Tedeschi P Durini E Vertuani S Manfredini S J Agric

Food Chem 2002 507407-7411 156 Chen YH Chung YL Lin CH J Chromatogr A 2002 943287-294 157 Lin CH Chen YH Electrophoresis 2001 222574-2579 158 Flamini R Dall Vedova A Rapid Commun Mass Spectrom 2004 181925-1931 159 Shao Y Marriot P Huumlgel H Chromatographia 2003 57S349-S353 160 Luan T Li G Zhang Z Anal Chim Acta 2000 42419-25 161 Soleas GJ Goldberg DM Diamandis EP Karumanchiri A Yan J Ng E Am J

Enol Vitic 1995 46346-352 162 Goldberg DM Yan J Ng E Diamandis EP Karumanchiri A Soleas GJ Waterhouse AL Am J Enol Vitic 1995 46159-165 163 Espinosa-Mansilla A Muntildeoz de la Pentildea A Gonzaacutelez Goacutemez D Chem Educator 2005 101-9

CAPIacuteTULO II

DETERMINACIOacuteN DE RESVERATROL EN VINO MEDIANTE FLUORESCENCIA FOTOINDUCIDA

DE SEGUNDA DERIVADA Y EXTRACCIOacuteN LIacuteQUIDO-LIacuteQUIDO

CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino

72


73

ANTECEDENTES Como ya se explicado en la introduccioacuten general de esta memoria el resveratrol (34acute5-trihidroxiestilbeno) es un estilbenoide producido por ciertas plantas como respuesta a infecciones fuacutengicas o a un estreacutes abioacutetico producido por ejemplo por iones metaacutelicos Aparece en moras cacahuetes y uvas Concretamente en uvas forma parte del amplio grupo de compuestos polifenoacutelicos presentes en la piel pulpa y semilla que se extraen parcialmente en la elaboracioacuten del vino y son responsables de caracteriacutesticas sensoriales de eacutestos como color sabor astringencia o dureza El rango en que se puede encontrar la concentracioacuten del resveratrol en los vinos es muy amplio Asiacute en la bibliografiacutea se encuentran valores comprendidos entre 066 μgmiddotmLminus1 a menos de 068 ngmiddotmLminus1 para vinos tintos y desde 100 a menos de 023 ngmiddotmLminus1 para vinos blancos1 y seguacuten los datos maacutes recientes2 el vino tinto contiene una media de 19 plusmn 17 μg trans-resveratrolmL siendo no detectable esta compuesto en algunos vinos y el comportamiento es similar respecto a los niveles de cis No se puede decir que exista una regioacuten o variedad que produzca vinos con contenidos significativamente diferentes del resto

La diferente concentracioacuten en vinos estaacute motivada tanto por factores relacionados con el cultivo variedad de uva factores ambientales en la vintildea tiempo de vendimia como por factores relacionados con la elaboracioacuten del vino3

Tambieacuten se ha explicado en la introduccioacuten que el resveratrol presenta un

equilibrio cis-trans y que cuando el trans-resveratrol en disolucioacuten alcohoacutelica se

1 Siemann EH Creasy LL Am J Enol Vitic 19924349ndash52 2 Stervbo U Vang O Bonnesen C Food Chem 2007 101449 ndash457 3 Kallithraka S Arvanitoyannis I El-Zajouli A Kefalas P Food Chem 2001 75355ndash363


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somete a irradiacioacuten con luz UV intensa se induce primero la isomerizacioacuten a cis-resveratrol y posteriormente la formacioacuten de un compuesto muy fluorescente4 5 El cis-resveratrol no estaacute presente en las uvas pero siacute lo estaacute en los vinos6

En cuanto a los meacutetodos de anaacutelisis de resveratrol encontrados en la bibliografiacutea se han utilizado ampliamente las teacutecnicas de separacioacuten como cromatografiacutea de liacutequidos o gases y electroforesis capilar78 en diferentes alimentos

Asiacute en los uacuteltimos antildeos la mayoriacutea de los meacutetodos publicados para el anaacutelisis de trans-resveratrol en vinos son meacutetodos de cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia (HPLC) y muchos de ellos se recogen en un artiacuteculo publicado en el antildeo 20059 que realiza una extensa revisioacuten de los meacutetodos de HPLC para el anaacutelisis de este compuesto en diferentes producto alimenticios En esta revisioacuten se pone de manifiesto que la mayoriacutea son meacutetodos de fase inversa (RP) utilizando metanol o acetonitrilo como disolventes orgaacutenicos y aacutecido aceacutetico para modificar la acidez de la fase acuosa En muchos casos se hace uso de una elucioacuten en gradiente y en lo referente a la deteccioacuten se utilizan sobre todo detectores de serie de diodos y las longitudes de onda seleccionadas son 300-308 nm para trans-resveratrol y 285-286 nm para cis-resveratrol En algunos casos tambieacuten se utilizan otros detectores que proporcionan mejor sensibilidad como detectores fluorescentes o electroquiacutemicos En el caso de la deteccioacuten fluorescente las longitudes de ondas utilizadas son 324-330370 y 260370 nm para trans- y cis-resveratrol respectivamente Maacutes

4 Roggero JP Garcia-Parrilla C Sci Aliments 1995 15411ndash422 5 Roggero JP J Food Comp and Anal 200 1393-97 6 Trela BC Waterhouse AL J Agric Food Chem 1996 441253-1257 7 Orea JM Montero C Jimeacutenez JB Gonzaacutelez Urentildea A Anal Chem 2001 735921ndash5929 8 Gu X Chu Q OrsquoDwyer M Zeece M J Chromatogr A 2000 881471ndash481 9 Rudolf JL Resurreccion VA Saalia FK Phillips RD Food Chem 2005 89623-638


75

recientemente X Vitrac et al10 utilizan los pares 300390 para el trans y 260400 nm para el cis y Z Pintildeeiro et al11 llevan a cabo la deteccioacuten de trans-resveratrol a 310403 nm en un medio aacutecido aceacutetico al 01 en 7030 aguametanol aportando los espectros fluorescentes de ambos compuestos en dicho medio

Seguacuten los resultados anteriormente expuestos las caracteriacutesticas

fotomeacutetricas y fluorimeacutetricas de estos compuestos se recogen en diferentes artiacuteculos Podemos mencionar el publicado por Trela y Waterhouse6 que comparan los espectros UV y los valores de absortividad molar que obtienen para ambos isoacutemeros en etanol con los resultados reportados por otros autores y hacen un estudio del proceso de isomerizacioacuten inducido fotoquiacutemicamente Seguacuten estos autores las disoluciones de trans-resveratrol en etanolagua 5050 son estables al menos 28 diacuteas (CV lt 47 ) a pH entre 1 y 7 si se protegen de la luz pero si se irradian se degradan a cis en un 906 en dos horas si bien valores bajos de pH causan de nuevo la isomerizacioacuten del cis a trans esteacutericamente maacutes estable Estos autores sin embargo no hacen referencia alguna al comportamiento fluorescente de trans-resveratrol que siacute es descrito anteriormente por Roggero y Garciacutea Parrilla4 Seguacuten sus resultados mientras que tanto trans como cis-resveratrol son deacutebilmente fluorescentes pero al irradiarlos con luz UV intensa no soacutelo se isomeriza el trans a cis sino que aparece un compuesto muy fluorescente en cuyo espectro UV la λ de maacutexima absorcioacuten 260 nm coincidiendo dicho espectro con el atribuido por Siemann y Creasy1 al cis-resveratrol

A pesar de los datos existentes acerca de las propiedades

espectroscoacutepicas del trans-resveratrol y de la influencia de la irradiacioacuten sobre este compuesto no se han encontrado antecedentes acerca de la determinacioacuten

10 Vitrac X Monti JP Vercauteren J Deffieux G Meacuterillon JM Anal Chim Acta 2002 458103ndash110 11 Pintildeeiro Z Palma M Barroso CG J Chromatogr A 2006 111061ndash65


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fotomeacutetrica o fluorimeacutetrica de este compuesto en vino Ello unido al hecho de que auacuten existen en los artiacuteculos citados resultados discrepantes o no totalmente explicados nos animoacute a realizar estudios sobre las propiedades espectrales de trans-resveratrol y su modificacioacuten mediante irradiacioacuten UV con el objetivo uacuteltimo de llegar a proponer un meacutetodo fluorimeacutetrico de determinacioacuten de este compuesto en vino RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN Estudio baacutesico sobre las propiedades de intereacutes analiacutetico de trans-resveratrol

Caracterizacioacuten absorbente y luminiscente en distintos disolventes

Los estudios baacutesicos se han iniciado con el estudio del comportamiento absorbente y luminiscente del trans-resveratrol en distintos disolventes Para ello en matraces de 100 mL se preparan disoluciones que contienen 102 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol (020 mL de la disolucioacuten etanoacutelica de trans-resveratrol de 510 microgmL-1) Los disolventes ensayados son agua y disolventes orgaacutenicos de distintas polaridades como metanol etanol acetonitrilo dimetilsulfoacutexido NN-dimetilformamida 14-dioxano ciclohexano y hexano asiacute como mezclas hidroetanoacutelicas de diferente composicioacuten En la Figura 1 se representa el espectro de absorcioacuten de una disolucioacuten acuosa de trans-resveratrol Presenta una banda de absorcioacuten centrada a 310 nm con un ancho de banda de 20 nm en la que se distinguen dos maacuteximos centrados a 306 y 319 nm respectivamente La forma del espectro la situacioacuten de los maacuteximos y la absortividad molar no se ven afectados por la naturaleza del


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disolvente

Figura 1- Espectro de absorcioacuten de una disolucioacuten acuosa (20 vv etanol) conteniendo 102 microgmiddotmL-1 de trans-resveratrol

Este compuesto presenta una deacutebil fluorescencia nativa y los espectros de excitacioacuten y emisioacuten de fluorescencia registrados en algunos de los disolventes ensayados se recogen en la Figura 2 En la mayoriacutea de los disolventes ensayados (acetonitrilo etanol agua o mezclas hidroetanoacutelicas) los espectros de excitacioacuten presentan dos maacuteximos centrados a 225 y 318 nm y un uacutenico maacuteximo de emisioacuten centrado a 390 nm En dimetilformamida se observa un aumento del rendimiento cuaacutentico de fluorescencia del analito asiacute como la desaparicioacuten del primer maacuteximo de excitacioacuten En hexano ciclohexano y 14-dioxano el espectro de emisioacuten se desplaza hipsocroacutemicamente hasta 373 nm

240 280 320 360 400λ (nm)

0

004

008

012

Abso

rban

cia


78

Figura 2-Espectros de excitacioacuten y emisioacuten de disoluciones conteniendo 102 microgmL-1 de trans-resveratrol en distintos disolventes (mdashmdash) etanolagua 4060 vv (λexcem 318390 nm) (mdashmdash) dimetilformamida (20 etanol) (λexcem 318390 nm) (mdashmdash) hexano (20 etanol) (λexcem 310373 nm)

Influencia de la acidez del medio Caacutelculo de constantes de ionizacioacuten de trans-resveratrol Una vez estudiado el efecto que ejerce el disolvente sobre las propiedades absorbentes y fluorescentes del analito se procede a estudiar la influencia de la acidez del medio Dicho estudio se ha llevado a cabo tanto en medio acuoso como en medio hidroetanoacutelico conteniendo el 40 (vv) de etanol Se preparan disoluciones que en un volumen final de 1000 mL contienen 228 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol fijaacutendose la fuerza ioacutenica del medio con KCl 010 M La variacioacuten del pH se efectuacutea por adicioacuten de pequentildeos voluacutemenes de disoluciones diluidas de HCl y NaOH Dado que en principio no se sabe nada acerca de la reversibilidad de los equilibrios en

200 250 300 350 400 450λ (nm)

0

40

80

120In

teni

sidad

de

Fluo

resc

encia


79

los que el analito participa se toma la precaucioacuten de utilizar aliacutecuotas independientes de la disolucioacuten una para acidular y otra para alcalinizar En las Figuras 3 y 4 se recogen los espectros de absorcioacuten maacutes representativos en ambos medios registrados a distintos valores de pH asiacute como la variacioacuten de la absorbancia a las longitudes de onda de maacutexima variacioacuten

Figura 3- (A) Espectros de absorcioacuten correspondientes a trans-resveratrol (228 microgmiddotmL-1) en medio etanolagua 4060 vv a distintos valores de pH (B) Variacioacuten de la absorbancia medida a 306 y 343 nm con el pH

Figura 4- (A) Influencia del pH sobre los espectros de absorcioacuten de trans-resveratrol (152 microgmiddotmL-1) en medio acuoso (B) Variacioacuten de la absorbancia medida a 306 y 343 nm con el pH

0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

01

02

03

Abso

rban

cia

306 nm

343 nm

B

250 300 350 400λ (nm)

0

005

01

015

02

025

Abso

rban

cia

10 - 70

92

100

122A

2 4 6 8 10 12 14pH

0

005

01

015

02

025

Abso

rban

cia

343 nm

306 nmB

102

20 - 60121

250 300 350 400λ (nm)

0

01

02

03

Abso

rban

cia

A


80

En los dos medios de trabajo se observa un comportamiento similar no producieacutendose cambios en el espectro de absorcioacuten para pH inferiores a 70 Para pH superiores se observa una disminucioacuten en la absorbancia a 306 nm a medida que la banda de absorcioacuten sufre un desplazamiento batocroacutemico centraacutendose a 343 nm en medio fuertemente alcalino (pH gt 12)

En la Figura 3B se detecta un cambio brusco de la sentildeal en el intervalo de pH 90-120 correspondiente a la ionizacioacuten del analito El valor de pKa de este equilibrio se ha calculado mediante los meacutetodos de Stenstroumlm y Goldsmith12 y de Wilson y Lester13 Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 1

El caso del estudio en medio acuoso es algo maacutes complejo porque como se aprecia en la Figura 4B en la variacioacuten de la absorbancia medida a 343 nm se pueden observar dos tramos diferentes correspondientes a dos disociaciones muy cercanas entre si uno en el intervalo de pH 80-90 y otro en el intervalo 100-120 con una pequentildea meseta intermedia en el intervalo de pH 90-100 Debido a la proximidad de ambos equilibrios los meacutetodos de caacutelculo anteriores no pueden ser aplicados para el caacutelculo de los valores de pKa ya que no existe una meseta claramente definida entre ambos equilibrios no pudiendo relacionar los valores de absorbancia correspondientes a la regioacuten de pH 90-100 con la concentracioacuten de la especie intermedia

En este caso los valores de pKa se han calculado mediante el uso de

diagramas de absorbancia (diagramas-A) Un diagrama-A es una representacioacuten de la absorbancia a una longitud de onda frente a la absorbancia a una segunda longitud de onda de manera que el diagrama refleja los cambios relativos de

12 Stenstroumlm W Goldsmith N J Phys Chem 1926 301683-1687 13 Wilson RF Lester GW Talanta 1963 10319-322


81

absorbancia a ambas longitudes de onda en funcioacuten del pH Para un sistema en el que esteacute implicado un uacutenico equilibrio la absorbancia a cualquier longitud de onda debe ser proporcional a la absorbancia a cualquier otra longitud de onda de manera que los diagramas seraacuten lineales No obstante cuando un sistema esteacute gobernado por dos o maacutes equilibrios los diagramas de absorbancia cambiaraacuten de direccioacuten cada vez que un nuevo equilibrio domine el sistema14 Estos diagramas son particularmente uacutetiles para sistemas en los que los espectros no revelan claramente el nuacutemero de equilibrios implicados

Figura 5- Diagrama de absorbancia A306 nm vs A343 nm de trans-resveratrol en medio acuoso Rango de pH 75-115

En este caso se han empleado los valores de absorbancia a 306 y 343 nm como longitudes de onda caracteriacutesticas de sus formas aacutecida y baacutesica respectivamente para construir el diagrama-A representado en la Figura 5 En dicho diagrama se pueden distinguir dos tramos rectos lo que sugiere la presencia de dos equilibrios La primera ionizacioacuten predomina en el rango de pH 75-89 (primer tramo lineal) y la segunda en el rango 100-115 (segundo tramo lineal) El 14 Polster J Lachmann H ldquoSpectrometric Titration Analysis of Chemical Equilibriardquo VCH Weinheim 1989

004

008

012

016

02

024

Abso

rban

cia (3

06 n

m)

004 008 012 016 02 024Absorbancia (343 nm)

H3ReHRe2-

H2Re-


82

punto del diagrama correspondiente a pH 75 se encuentra sentildealado como H3Re (resveratrol en forma neutra como especie predominante) y el correspondiente a pH 115 como HRe2- (resveratrol-difenoacutexido como especie predominante) En el punto de interseccioacuten entre los dos tramos lineales la especie resveratrol-monofenoacutexido coexiste en equilibrio por ello este punto se ha etiquetado como H2Re- Los valores de pKa calculados son 82 y 97 respectivamente

El estudio de la influencia de la acidez del medio sobre la fluorescencia del

trans-resveratrol se ha llevado a cabo igualmente en medio acuoso y en medio hidroetanoacutelico 6040 (aguaetanol) preparando disoluciones que en un volumen final de 250 mL contienen 098 μgmiddotmL-1 de analito y KCl 01 M

En las Figuras 6 y 7 se recogen los espectros de excitacioacuten y emisioacuten a

distintos valores de pH en cada uno de los medios de trabajo ensayados asiacute como la variacioacuten de la sentildeal de fluorescencia a las longitudes de onda correspondientes a las formas aacutecida y baacutesica con el pH

Figura 6- (A) Espectros de excitacioacuten y emisioacuten correspondientes a una disolucioacuten conteniendo 098 microgmiddotmL-1 de trans-resveratrol en etanolagua 4060 vv en medio aacutecido (λexcem = 318385 nm) y baacutesico (λ excem = 342459 nm) (B) Variacioacuten de las sentildeales de fluorescencia a λ excem = 318385 nm y 342459 nm con el pH

200 300 400 500 600λ (nm)

0

200

400

600

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia

gt 100

lt 60A

0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

200

400

600

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia

IF(λexc 342 nm) (459 nm)

IF(λexc 318 nm) (385 nm) B


83

Figura 7- (A) Espectros de excitacioacuten y emisioacuten correspondientes a una disolucioacuten conteniendo 098 microgmiddotmL-1 de trans-resveratrol en agua a pH aacutecido (λexcem = 318404 nm) y baacutesico (λexcem = 341460 nm) (B) Variacioacuten de las sentildeales de fluorescencia a λexcem = 318404 nm y 341460 nm con el pH

Al disminuir la acidez se produce un desplazamiento batocroacutemico en los espectros de excitacioacuten de 318 a 342 nm y de 318 a 341 nm y de emisioacuten de 385 a 459 nm y de 404 a 460 nm en medio hidroetanoacutelico y acuoso respectivamente ademaacutes de una disminucioacuten del rendimiento cuaacutentico de fluorescencia en ambos casos En base a las curvas de variacioacuten de la sentildeal de fluorescencia con el pH se han calculado valores de pKa cuyos resultados se encuentran en la Tabla 1

Los valores de las constantes de ionizacioacuten del trans-resveratrol se

encuentran recogidos en dos artiacuteculos En el primero de ellos15 se describen valores de pKa de pKa1= 801 pKa2= 986 y pKa3= 105 en medio acuoso obtenidos fotomeacutetricamente por extrapolacioacuten de los valores obtenidos en distintos medios hidrometanoacutelicos Estos valores de pKa1 y pKa2 son bastante coincidentes con los calculados fotomeacutetricamente en nuestro caso mediante el meacutetodo del diagrama-

15 Takagai Y Kubota T Kobayashi H Tashiro T Takahashi A Igarashi S Anal Sci 2005 21183-186

200 300 400 500 600λ (nm)

0

50

100

150

200

250

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia

gt 100

lt 60A

0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

50

100

150

200

250

Inte

nsid

ad d

e Fl

uore

scen

cia



B


84

A14 para trans-resveratrol en medio acuoso En el segundo trabajo16 se describe la obtencioacuten de las constantes de disociacioacuten de primer orden de trans-resveratrol y trans-piceido en medio acuoso mediante datos electroforeacuteticos proporcionando valores de pKa1= 949 y 940 respectivamente El valor de pKa1 calculado en este trabajo para trans-resveratrol es bastante cercano al valor de pKa2 calculado por nosotros fotomeacutetricamente mediante el meacutetodo del diagrama-A

Tabla 1- Valores de pKa calculados para el trans-resveratrol en diferentes medios mediante fotometriacutea y fluorescencia utilizando diferentes meacutetodos de caacutelculo

Meacutetodo de Caacutelculo pKa trans-resveratrol

Stenstroumlm y Goldsmith 104 plusmn 01 EtanolAgua 4060 vv Wilson y Lester 104

FOTO

METR

IacuteA

Agua Diagrama-A pKa1= 82

pKa2= 97


Stenstroumlm y Goldsmith 85 plusmn 01

FLUO

RESC

ENCI

A

Agua Wilson y Lester 85

Valor medio plusmn Desviacioacuten Estaacutendar

Para estudiar la reversibilidad de los equilibrios en que se encuentra

involucrado el trans-resveratrol al variar el pH se alcaliniza una muestra en las mismas condiciones en las que se ha llevado a cabo el estudio de la influencia del pH hasta un pH en torno a 12 y se acidula a continuacioacuten hasta un pH proacuteximo al inicial Se encuentra que el espectro correspondiente a la muestra original y el

16 Cao J Chen GH Du YS Hou FF Tian YL J Liquid Chromatogr and Rel Technol 2006 291457-1463


85

registrado una vez que se alcaliniza y acidula posteriormente son ideacutenticos de donde se deduce que se trata de un equilibrio aacutecido-base reversible

Rectas de calibrado y paraacutemetros analiacuteticos de calidad

Se procede a estudiar la relacioacuten entre la concentracioacuten de trans-resveratrol y las sentildeales fotomeacutetrica y fluorescente y al establecimiento de las correspondientes rectas de calibrado Para obtener las sentildeales fotomeacutetricas se procede antildeadiendo directamente en la cubeta de medida 200 mL de agua ultrapura y voluacutemenes crecientes comprendidos entre 0020 y 025 mL de una disolucioacuten etanoacutelica de trans-resveratrol de 49 microgmiddotmL-1 Los espectros de absorcioacuten se registran en un rango de longitudes de onda comprendido entre 240 y 360 nm Las medidas de fluorescencia se realizan antildeadiendo directamente en la cubeta de medida 180 mL de agua y 120 mL de etanol absoluto con el objetivo de mantener la composicioacuten oacuteptima del medio de trabajo ya que la emisioacuten fluorescente depende del de etanol en el medio Sobre esta mezcla hidroetanoacutelica una vez desgasificada por ultrasonidos se antildeaden voluacutemenes sucesivos de una disolucioacuten etanoacutelica de trans-resveratrol de 49 microgmiddotmL-1 en incrementos de 50 microL hasta llegar a 0050 mL Tras cada nueva adicioacuten se registran los espectros de emisioacuten (λexc = 318 nm) en las siguientes condiciones instrumentales 20ordmC rendijas de excitacioacuten y emisioacuten 5 nm respectivamente voltaje del tubo fotomultiplicador 800 V


86

Las ecuaciones de las rectas obtenidas mediante ambas teacutecnicas asiacute como los paraacutemetros analiacuteticos de calidad se encuentran recogidos en la Tabla 2

Tabla 2- Paraacutemetros analiacuteticos de calidad para la determinacioacuten fotomeacutetrica y fluorimeacutetrica de trans-resveratrol

trans-resveratrol

Fotometriacutea Fluorescencia

Sentildeal Analiacutetica A306 nm IF318385 nm

Rango Lineal (μgmiddotmL-1) 050 ndash 500 0080 ndash 080

Ordenada en el Origen (a plusmn sa) -00037 plusmn 00025 128 plusmn 55

Pendiente (b plusmn sb) (mLmiddotμg-1) 0127 plusmn 0001 938 plusmn 13

Desviacioacuten Estaacutendar de la Regresioacuten (syx) 00077 131

Coeficiente de Correlacioacuten (r) 0999 0999

Coeficiente de Determinacioacuten (r2) 0999 0997

Linealidad 993 986

Resolucioacuten Analiacutetica (γ-1) (μgmiddotmL-1) 00604 00140

LOD Long y Winefordner17 (μgmiddotmL-1) 00583 00179

LOD Clayton18 (α=β=005) (μgmiddotmL-1) 0135 00345

17 Long GL Winefordner JD Anal Chem 1983 55712ndash724 18 Clayton CA Hines JW Elkins PD Anal Chem 1987 592506ndash2514


87

Repetitividad de los meacutetodos

Para llevar a cabo este estudio se siguen los procedimientos que se describen a continuacioacuten

Meacutetodo fotomeacutetrico Para realizar el estudio de la repetitividad se preparan

seguacuten el meacutetodo anteriormente descrito 11 reacuteplicas de una muestra que contiene 143 microgmiddotmL-1 de trans-reveratrol y se miden las absorbancias correspondientes a 306 nm Aplicando el caacutelculo estadiacutestico a los datos obtenidos la desviacioacuten estaacutendar relativa resulta ser del 22

Meacutetodo fluorimeacutetrico Mediante fluorescencia el estudio de la repetitividad del meacutetodo se lleva a cabo con 11 reacuteplicas de una muestra que en este caso contiene 032 microgmiddotmL-1 de trans-reveratrol Las sentildeales obtenidas a 385 nm (λexc = 318 nm) se tratan estadiacutesticamente obtenieacutendose un valor para la desviacioacuten estaacutendar relativa del 47 Efecto de la irradiacioacuten ultravioleta externa sobre las propiedades absorbentes y fluorescentes de trans-resveratrol En esta seccioacuten se describe el estudio realizado sobre la fotorreaccioacuten que sufre el analito en distintos disolventes Se ha investigado el efecto de diversas variables como la composicioacuten y la acidez del medio tanto sobre el proceso de fotodescomposicioacuten como sobre las propiedades del fotoproducto


88

Influencia del disolvente En primer lugar se procede a estudiar la influencia de la composicioacuten del medio en el desarrollo de la fotorreaccioacuten que tiene lugar cuando las disoluciones de trans-resveratrol son irradiadas bajo una laacutempara de mercurio de alta presioacuten Para ello se preparan disoluciones de trans-resveratrol por dilucioacuten de una disolucioacuten madre concentrada con disolventes orgaacutenicos de diferentes polaridades asiacute como agua y mezclas hidroetanoacutelicas Se examinan las propiedades absorbentes y fluorescentes de estas disoluciones previa irradiacioacuten de las mismas durante distintos intervalos de tiempo en diferentes medios de trabajo

Absorcioacuten molecular- Se comprueba que el porcentaje de etanol en el medio no influye sobre el espectro de absorcioacuten de trans-resveratrol como se explicoacute anteriormente siendo eacuteste exactamente igual en intensidad y fisonomiacutea en etanol en agua y en mezclas hidroetanoacutelicas de diferente composicioacuten Sin embargo siacute lo hace sobre los espectros de absorcioacuten de los fotoproductos que se van generando durante la irradiacioacuten de las respectivas disoluciones bajo una laacutempara de mercurio de alta presioacuten asiacute como sobre la cineacutetica de la fotorreaccioacuten

Para realizar este estudio se preparan disoluciones conteniendo todas

ellas 204 microgmiddotmL-1 de trans-resveratrol en etanol absoluto y en mezclas hidroetanoacutelicas de composicioacuten variable En la Figura 8 se recoge la evolucioacuten de los espectros de absorcioacuten de cuatro de estas disoluciones con el tiempo de irradiacioacuten bajo una laacutempara de mercurio de alta presioacuten


89

Figura 8- Influencia del tiempo de irradiacioacuten sobre disoluciones de trans-resveratrol en etanol absoluto (A) y en etanolagua 6040 vv (B) 4060 vv (C) y 496 vv (D) sin irradiar (mdashmdash) e irradiadas durante 5 segundos (mdashmdash) 30 segundos (mdashmdash) 60 segundos (mdashmdash) 120 segundos (mdashmdash) y 300 segundos (mdashmdash) [trans-resveratrol] = 204 microgmiddotmL-1

Como se observa al irradiar las disoluciones de resveratrol en etanol agua o en cualquier medio hidroetanoacutelico la fisonomiacutea del espectro cambia totalmente desapareciendo en todos los casos la banda ancha de absorcioacuten caracteriacutestica del trans-resveratrol y observaacutendose un nuevo maacuteximo de absorcioacuten centrado a 290 nm correspondiente seguacuten aparece descrito en la bibliografiacutea a cis-resveratrol6 La intensidad de este maacuteximo praacutecticamente no variacutea con el tiempo de irradiacioacuten

240 280 320 360λ (nm)

0

01

02

03

Abso

rban

cia

A

240 280 320 360λ (nm)

0

01

02

03

Abso

rban

cia

B

240 280 320 360λ (nm)

0

01

02

03

Abso

rban

cia

C

240 280 320 360λ (nm)

0

01

02

03

Abso

rban

cia

D


90

Cuando el porcentaje de etanol estaacute comprendido entre 40 y 60 y las disoluciones son irradiadas durante 120 segundos se observa la aparicioacuten de un segundo maacuteximo de absorcioacuten centrado a 260 nm tanto o maacutes importante que el anterior que sin embargo a penas se aprecia en etanol puro o con elevados contenidos de agua En etanol absoluto dicho maacuteximo se observa de una forma muy tenue para tiempos de irradiacioacuten en torno a 60 segundos En cualquier caso la irradiacioacuten de las disoluciones durante tiempos mayores implica la destruccioacuten de este uacuteltimo fotoproducto como puede observarse en los espectros registrados para las disoluciones irradiadas durante cinco minutos

Por uacuteltimo es importante destacar que se ha comprobado que el tiempo de

irradiacioacuten necesario para la obtencioacuten de los fotoproductos estaacute directamente relacionado con el rango de concentraciones de la disolucioacuten inicial del analito en su forma trans original Fluorescencia molecular- Con el objetivo de evaluar la influencia de la irradiacioacuten ultravioleta externa sobre las propiedades fluorescentes de los fotoproductos en diferentes disolventes se prepara en primer lugar una disolucioacuten conteniendo 57 ngmiddotmL-1 de trans-resveratrol en etanolagua 4060 vv y se registran los espectros de excitacioacuten y emisioacuten de la disolucioacuten recieacuten preparada y tras ser irradiada durante 60 segundos bajo una laacutempara de mercurio de alta presioacuten Dichos espectros se recogen en la Figura 9 y como puede observarse se comprueba que la irradiacioacuten ultravioleta externa de disoluciones hidroetanoacutelicas de trans-resveratrol tiene como consecuencia la generacioacuten de fotoproductos altamente fluorescentes Los espectros de estos fotoproductos se caracterizan por presentar un intenso y agudo maacuteximo de excitacioacuten centrado a 260 nm y dos maacuteximos de emisioacuten en torno a 364 y 382 nm respectivamente


91

Se han ensayado otros disolventes concretamente metanol etanol acetonitrilo dimetilsulfoacutexido NN-dimetilformamida 14-dioxano ciclohexano y hexano encontraacutendose que la naturaleza del fotoproducto es independiente del disolvente como puede deducirse de los espectros praacutecticamente ideacutenticos obtenidos en todos disolventes ensayados De dicho estudio se deduce tambieacuten que la velocidad de las fotorreacciones estaacute altamente influida por el disolvente siendo mayor en medios puramente orgaacutenicos que en medios hidroorgaacutenicos Por otra parte se encuentra que el rendimiento cuaacutentico de fluorescencia de los fotoproductos es maacuteximo en medios hidroetanoacutelicos en los que las proporciones de etanol y agua son similares por lo que elegimos este medio para posteriores estudios

Figura 9- Espectros de excitacioacuten y emisioacuten correspondientes a una disolucioacuten conteniendo 57 ngmiddotmL-1 de trans-resveratrol en etanolagua 4060 vv aislada de la luz (mdashmdash) (λexcem 318390 nm) e irradiada durante 60 segundos (mdashmdash) bajo una laacutempara de mercurio de alta presioacuten (λexcem 260364 nm)

200 300 400 500λ (nm)

0

100

200

300

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia


92

Con el objetivo de encontrar la composicioacuten del disolvente en el que se obtengan las mayores sentildeales en pro de la sensibilidad de los meacutetodos se preparan una serie de disoluciones conteniendo todas ellas 228 microgmiddotmL-1 de trans-resveratrol en etanol en agua y en diferentes proporciones de ambos disolventes En cada caso se lleva a cabo el estudio de la fotorreaccioacuten por irradiaciones acumulativas de la misma disolucioacuten bajo la laacutempara de mercurio de alta presioacuten registrando los espectros de excitacioacuten y emisioacuten de la disolucioacuten que estaacute siendo irradiada a las longitudes de onda de maacutexima sentildeal de los fotoproductos En la Figura 10A se encuentra representada la evolucioacuten de la sentildeal de fluorescencia fotoinducida con el tiempo de irradiacioacuten de las disoluciones de trans-resveratrol en los distintos medios de trabajo ensayados En todos los casos se observa un aumento de la sentildeal de fluorescencia fotoinducida con el tiempo de irradiacioacuten hasta alcanzar un maacuteximo seguido por un decaimiento de la sentildeal probablemente debido a la destruccioacuten de los fotoproductos y a la generacioacuten de otros fragmentos no fluorescentes

Figura 10- (A) Evolucioacuten de la intensidad de fluorescencia a 364 nm (λexc= 260 nm) con el tiempo de irradiacioacuten de disoluciones conteniendo 228 microgmiddotmL-1 de trans-resveratrol en etanol absoluto (mdashmdash) agua (mdashmdash) y etanolagua 8020 vv (mdashmdash) 6040 vv (mdashmdash) 4060 vv (mdashmdash) y 2080 vv (mdashmdash) (B) Influencia del porcentaje de etanol en el medio sobre la sentildeal de fluorescencia a 364 nm (λexc= 260 nm) para un tiempo de irradiacioacuten de 120 segundos

0 50 100 150 200 250 300Tiempo de Irradiacioacuten (s)

0

100

200

300

400

500

I F (

364 n

m) (λ

exc =

260 n

m)

A

0 20 40 60 80 100 v Etanol

0

100

200

300

400

500

I F (

364 n

m) (λ

exc =

260 n

m)

B


93

En disoluciones puramente etanoacutelicas el tiempo de irradiacioacuten oacuteptimo estaacute

en torno a 25 segundos y la fluorescencia de los fotoproductos es muy deacutebil A medida que disminuye el porcentaje de etanol en el medio aumenta el tiempo de irradiacioacuten necesario para lograr la maacutexima sentildeal asiacute como las sentildeales de fluorescencia fotoinducida En la Figura 10B se representa la intensidad de fluorescencia obtenida para cada una de las disoluciones al irradiarlas durante 120 segundos Se observa que en este caso la maacutexima sentildeal se obtiene en medios con un porcentaje de etanol comprendido entre el 30 y el 50 Por ello para futuras experiencias se elige como medio de trabajo oacuteptimo una mezcla etanolagua 4060 vv

No obstante se encuentra que el tiempo de irradiacioacuten oacuteptimo es

dependiente de la concentracioacuten de trans-resveratrol inicial siendo necesario optimizar dicho paraacutemetro una vez establecido el rango de concentraciones de trabajo

Influencia de la acidez del medio sobre las propiedades absorbentes y fluorescentes del fotoproducto de resveratrol

Una vez establecidas las condiciones oacuteptimas para la obtencioacuten del fotoproducto fluorescente de resveratrol y caracterizado el mismo fotomeacutetrica y fluorimeacutetricamente se procede a estudiar la influencia de la acidez del medio sobre sus propiedades espectroscoacutepicas En todos los casos se fija la fuerza ioacutenica del medio por adicioacuten de KCl en una concentracioacuten final de 010 M Se obtiene el fotoproducto y estas disoluciones se dividen en dos porciones de las cuales una seraacute alcalinizada y la otra acidulada


94

mediante la adicioacuten de pequentildeos voluacutemenes de disoluciones diluidas de NaOH y HCl respectivamente ya que inicialmente no se tienen datos acerca de la reversibilidad de los procesos que ocurren

El estudio fotomeacutetrico se lleva a cabo sobre una disolucioacuten conteniendo 120 microgmiddotmL-1 de trans-resveratrol en etanolagua 4060 vv irradiada durante 60 segundos En la Figura 11 se han recogido los espectros maacutes significativos a distintos valores de pH asiacute como la variacioacuten de la sentildeal fotomeacutetrica a las longitudes de onda caracteriacutesticas de las formas aacutecida y baacutesica

Figura 11- (A) Influencia del pH sobre los espectros de absorcioacuten del fotoproducto del trans-resveratrol en medio etanolagua 4060 vv (B) Variacioacuten de la absorbancia a 261 y 303 nm con el pH [trans-resveratrol ]inicial = 120 microgmiddotmL-1

El espectro de absorcioacuten del fotoproducto en medio neutro y aacutecido estaacute caracterizado por un maacuteximo centrado a 261 nm y otro de menor importancia centrado a 287 nm Para valores de pH superiores a 10 el primer maacuteximo desaparece y el segundo se desplaza batocroacutemicamente hasta 303 nm

240 260 280 300 320 340 360λ (nm)

0

004

008

012

Abs

orba

ncia

35

84

98

107

110

A

0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

004

008

012

Abso

rban

cia

261 nm

303 nm

B


95

El estudio de la influencia del pH sobre la fluorescencia del fotoproducto se

lleva a cabo sobre una disolucioacuten conteniendo 98 ngmiddotmL-1 de trans-resveratrol en

etanolagua 4060 vv irradiada durante 60 segundos En la Figura 12A se representan los espectros de excitacioacuten y emisioacuten a diferentes valores de pH La curva de variacioacuten de la sentildeal de fluorescencia con el pH Figura 12B muestra una meseta para valores de pH inferiores a 70 y un decaimiento draacutestico de la sentildeal para valores de pH superiores a 70 obtenieacutendose una sentildeal inapreciable para pH superiores a 110 Se comprueba que el producto resultante de la degradacioacuten alcalina del fotoproducto de resveratrol no es fluorescente

Figura 12- (A) Espectros de excitacioacuten y emisioacuten del fotoproducto de trans-resveratrol a distintos valores de pH (B) Variacioacuten de la intensidad de fluorescencia con el pH [trans-resveratrol] = 98 ngmiddotmL-1 λexc= 260 nm λem= 364 nm

Adicionalmente se estudia fotomeacutetrica y fluorimeacutetricamente la reversibilidad de los equilibrios en que se encuentra involucrado el fotoproducto de resveratrol al alcalinizar Para ello se alcalinizan muestras en las mismas condiciones en las que se ha llevado a cabo el estudio de la influencia del pH hasta un pH en torno a 12 y se acidulan a continuacioacuten hasta un pH proacuteximo al inicial Por comparacioacuten de los espectros correspondientes a las muestras neutras originales y los registrados tras la variacioacuten del pH se deduce que la

200 250 300 350 400 450λ (nm)

0

200

400

600

800

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia

lt 70

gt 120

99

0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

200

400

600

800

I F (

364

nm) (

λ exc=

260

nm

)

A B


96

transformacioacuten que sufre el fotoproducto del resveratrol en medio alcalino no es reversible Por ello no ha sido posible calcular el valor de pKa correspondiente al fotoproducto de resveratrol por no tratarse de un equilibrio aacutecido-base sino de una hidroacutelisis alcalina irreversible

Rectas de calibrado y paraacutemetros analiacuteticos de calidad Una vez establecida la influencia de las variables quiacutemicas y determinados

sus valores oacuteptimos y dada la mejora de sensibilidad y selectividad que supone en general utilizar sentildeales fluorimeacutetricas se procede a estudiar la relacioacuten entre la concentracioacuten de trans-resveratrol puesta y la sentildeal de fluorescencia fotoinducida asiacute como al establecimiento de la correspondiente recta de calibrado

Para ello se preparan muestras conteniendo entre 66 y 66 ngmiddotmL-1 de analito en etanolagua 4060 vv y se irradian durante 60 segundos A continuacioacuten se registran los espectros de emisioacuten de las disoluciones irradiadas en las siguientes condiciones experimentales 20ordmC rendija de excitacioacuten 5 nm rendija de emisioacuten 5 nm voltaje del tubo fotomultiplicador 750 V y λexc = 260 nm

En la Tabla 3 se recogen los paraacutemetros analiacuteticos de calidad correspondientes a la determinacioacuten de resveratrol mediante fluorescencia fotoinducida utilizaacutendose como sentildeal analiacutetica la intensidad de fluorescencia a 365 nm


97

Tabla 3- Paraacutemetros analiacuteticos para la determinacioacuten de trans-resveratrol mediante fluorescencia fotoinducida (λexcλem = 260365 nm)

Rango Lineal (ngmiddotmL-1) 66 ndash 66

Ordenada en el Origen (a plusmn sa) 211 plusmn 35

Pendiente (b plusmn sb) (mLmiddot ng -1) 777 plusmn 012

Desviacioacuten Estaacutendar de la Regresioacuten (syx) 105

Coeficiente de Correlacioacuten (r) 0998

Coeficiente de Determinacioacuten (r2) 0996

Linealidad 985

Resolucioacuten Analiacutetica (γ-1) (ngmiddotmL-1) 135

LOD Long y Winefordner (ngmiddotmL-1) 156

LOD Clayton (α=β=005) (ngmiddotmL-1) 308

Repetitividad del meacutetodo

Para determinar la repetitividad del meacutetodo se prepara una serie de once disoluciones independientes conteniendo 192 ngmiddotmL-1 de trans-resveratrol se irradian en las mismas condiciones utilizadas para el establecimiento de las rectas de calibrado y se registran sus espectros de emisioacuten manteniendo igualmente las condiciones instrumentales empleadas en dicha experiencia La desviacioacuten estaacutendar relativa calculada sobre las sentildeales medidas resulta ser 36


98

Estudio extracto-espectrofluorimeacutetrico de trans-resveratrol Aplicacioacuten al anaacutelisis de muestras de vino

Los meacutetodos de anaacutelisis de resveratrol en muestras de vino descritos en la bibliografiacutea siempre hacen uso de teacutecnicas separativas bien cromatograacuteficas o bien electroforeacuteticas pero no se han encontrado antecedentes sobre meacutetodos espectroscoacutepicos de anaacutelisis de este analito en muestras de vino Por ello en este apartado se describen los estudios encaminados a proponer un nuevo meacutetodo de anaacutelisis de resveratrol en vino en presencia de su principal interferencia su glucoacutesido mediante fluorescencia fotoinducida Como paso previo a la determinacioacuten mediante fluorescencia fotoinducida es necesaria una etapa de limpieza de la muestra para reducir la sentildeal de fondo de la matriz Con este objetivo se lleva a cabo el estudio extracto-espectrofluorimeacutetrico del analito con objeto de optimizar las condiciones para la extraccioacuten liacutequido-liacutequido que se usaraacute en dicha etapa

Influencia de la naturaleza del disolvente orgaacutenico en la extraccioacuten

En primer lugar se realizan ensayos mediante absorcioacuten molecular con diferentes disolventes y se comprueba que los mayores rendimientos de extraccioacuten se obtienen empleando eacuteter etiacutelico o acetato de etilo y que sin embargo al emplear cloroformo praacutecticamente el 100 del analito permanece en fase acuosa Por otra parte el rendimiento cuaacutentico de fluorescencia del fotoproducto de resveratrol en eacuteter etiacutelico o en acetato de etilo estaacute muy por debajo del observado en el medio hidroetanoacutelico anteriormente optimizado por lo que seraacute necesario


99

evaporar a sequedad los extractos orgaacutenicos y reconstituir el residuo con la mezcla hidroalcohoacutelica En base a estos estudios previos se elige eacuteter etiacutelico como agente extractante por dos motivos fundamentales las recuperaciones del analito estaacuten en torno al 100 y la elevada volatilidad del disolvente facilita su eliminacioacuten lo que acortaraacute sustancialmente el tiempo de anaacutelisis

Antes de optimizar las variables que influyen en la extraccioacuten se realizan pruebas de extraccioacuten en la matriz del vino ya que eacuteste va a ser el objeto final de nuestro anaacutelisis Se aprecia una importante contribucioacuten de la matriz en la sentildeal de fluorescencia en las condiciones necesarias para la obtencioacuten del espectro de emisioacuten del fotoproducto del trans-resveratrol Sin embargo se ha comprobado que esta contribucioacuten se reduce en gran medida por obtencioacuten de las sentildeales derivadas fundamentalmente de la segunda derivada

Por ello a partir de estos resultados previos para evaluar la recuperacioacuten del trans-resveratrol en eacuteter se sigue el siguiente procedimiento se preparan 100 mL de disolucioacuten acuosa de trans-resveratrol conteniendo 57 ngmiddotmL-1 y se extraen con 100 mL de eacuteter etiacutelico agitando vigorosamente durante dos minutos Se recoge el extracto orgaacutenico que se evapora a sequedad por paso de una corriente de nitroacutegeno a temperatura ambiente El residuo se redisuelve en 40 mL de etanol y se antildeade agua ultrapura hasta completar un volumen final de 100 mL Se registran los espectros de fluorescencia y se obtiene la segunda derivada

mediante el algoritmo de Savitzky-Golay19 (Δλ = 5 nm) Los espectros sin derivar y

derivados correspondientes a la disolucioacuten reconstituida sin irradiar e irradiada durante 60 segundos en la laacutempara de mercurio de alta presioacuten se recogen en la Figura 13 Por comparacioacuten del espectro segunda derivada de fluorescencia fotoinducida correspondiente al extracto evaporado y reconstituido con el espectro

19 Savitzky A Golay MJE Anal Chem 1964 361627ndash1639


100

segunda derivada correspondiente a un patroacuten de la misma concentracioacuten en etanolagua 4060 (vv) e irradiado durante 60 s se comprueba que la recuperacioacuten es praacutecticamente del 100 Por otra parte como puede observarse en la misma figura la sentildeal procedente de las muestras sin irradiar praacutecticamente se hace cero en todo el intervalo de longitudes de onda al emplear la segunda derivada

Figura 13- A) Espectros de fluorescencia (λexc= 261 nm) correspondientes al extracto eteacutereo evaporado y reconstituido con etanolagua 4060 (vv) (mdashmdash) y a un patroacuten de ideacutentica concentracioacuten en el mismo medio disolvente (mdashmdash) sin irradiar (middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot) e irradiadas (mdashmdash) durante 60 s B) Segunda derivada de los espectros de fluorescencia

Se procede a continuacioacuten a estudiar la influencia de distintas variables

experimentales sobre la extraccioacuten de resveratrol con eacuteter etiacutelico

Influencia del pH en la extraccioacuten

Para fijar el pH de la fase acuosa se ensayan diversos tampones y finalmente se decide utilizar tampones aacutecido tartaacutericotartrato monoaacutecido de sodio o tartrato monoaacutecido de sodiotartrato disoacutedico ya que no producen quenching de la sentildeal de fluorescencia y ademaacutes son tampones presentes en el vino de forma natural

330 360 390 420 450λem (nm)

0

200

400

600

800

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia

A

330 360 390 420 450λem (nm)

-8

-4

0

4

8

2 D

B


101

Se preparan una serie de muestras conteniendo 57 ngmiddotmL-1 de resveratrol

y una concentracioacuten 010 M de tampones aacutecido tartaacutericotartrato monoaacutecido de sodio o tartrato monoaacutecido de sodiotartrato disoacutedico de distintos valores de pH en un volumen final de 100 mL de fase acuosa Las muestras se extraen con 100 mL de eacuteter etiacutelico agitando durante dos minutos y dejando decantar las fases Se recoge la fase orgaacutenica y se evapora a sequedad por paso de una corriente de nitroacutegeno a temperatura ambiente el residuo se redisuelve en 40 mL de etanol y se antildeade agua ultrapura hasta completar un volumen final de 100 mL Se registran los espectros de fluorescencia de estas muestras tras irradiarlas durante 60 segundos y se calculan los espectros segunda derivada mediante el algoritmo de

Savitzky-Golay (Δλ = 5 nm) Tambieacuten se registran los espectros de fluorescencia y

se calculan los espectros segunda derivada en ideacutenticas condiciones de disolucioacutenes patroacuten conteniendo la misma concentracioacuten de resveratrol en etanolagua 4060 (vv) a los distintos valores de pH e irradiadas durante 60 segundos

La recuperacioacuten se calcula por comparacioacuten de la amplitud de los espectros segunda derivada de fluorescencia fotoinducida entre 364 y 374 nm (2D364-374) con la sentildeal correspondiente al patroacuten En la Figura 14 se muestra el porcentaje de recuperacioacuten para cada uno de los valores de pH ensayados y se observa que las recuperaciones son maacuteximas y proacuteximas al 100 para valores de pH comprendidos entre 45 y 60


102

Figura 14- Influencia del pH de la fase acuosa sobre el porcentaje de recuperacioacuten en la extraccioacuten

Para posteriores experiencias se fija el pH por adicioacuten de tampoacuten tartrato monoaacutecido de sodiotartrato disoacutedico de pH 50 Se procede a continuacioacuten a optimizar la concentracioacuten de la disolucioacuten reguladora de pH en la fase acuosa

Para establecer la influencia de la concentracioacuten de disolucioacuten reguladora se preparan disoluciones conteniendo 57 ngmiddotmL-1 de resveratrol voluacutemenes variables de tampoacuten tartrato monoaacutecido de sodiotartrato disoacutedico 026 M de pH 50 y agua desionizada hasta 100 mL Estas disoluciones se extraen con 100 mL de eacuteter etiacutelico agitando durante dos minutos Cuando la separacioacuten de fases es completa se recogen los extractos orgaacutenicos y se opera como en el caso anterior La recuperacioacuten estaacute proacutexima al 100 cuando la concentracioacuten de tampoacuten en fase acuosa es de 015 M que se selecciona como concentracioacuten de tampoacuten oacuteptima para futuras experiencias

2 3 4 5 6 7pH

0

20

40

60

80

100

120

R

ecup

erac

ioacuten


103

Influencia del tiempo de agitacioacuten

Para este estudio se preparan cuatro muestras acuosas conteniendo 57 ngmiddotmL-1 de resveratrol cuyo pH se fija por adicioacuten de 50 mL de tampoacuten tartrato monoaacutecido de sodiotartrato disoacutedico 030 M de pH 50 en un volumen final de 100 mL Dichas muestras tras la adicioacuten de 100 mL de eacuteter etiacutelico se agitan durante tiempos variables comprendidos entre 30 y 120 segundos Una vez separadas las fases se recoge en cada caso la fase orgaacutenica y se procede como en experiencias anteriores

El tiempo de agitacioacuten no influye apreciablemente en la extraccioacuten del

analito y para posteriores experiencias se fija un minuto como tiempo de agitacioacuten adecuado

Influencia de la relacioacuten de fases

Para establecer la influencia de la relacioacuten de fases se opera sobre

disoluciones acuosas conteniendo 057 μg de resveratrol el volumen necesario de etanol absoluto para que el porcentaje de etanol en la fase acuosa sea del 3 voluacutemenes variables de disolucioacuten reguladora tartrato monoaacutecido de sodiotartrato disoacutedico 030 M de pH 50 tales que la concentracioacuten final de tampoacuten sea 015 M y voluacutemenes variables de agua desionizada Todas ellas se extraen con 100 mL de eacuteter etiacutelico agitando durante un minuto Se dejan en contacto ambas fases hasta su completa separacioacuten y se toma la fase orgaacutenica sobre la que se aplica el tratamiento anteriormente descrito

La relacioacuten de fases no afecta praacutecticamente a la extraccioacuten del analito al

menos hasta un valor 41 (fase acuosafase orgaacutenica) ya que en todos los casos la


104

recuperacioacuten estaacute en torno al 100 Para posteriores experiencias se fija como relacioacuten de fases 21 ya que para mayores valores de dicha relacioacuten se dificulta mucho la recogida cuantitativa del extracto eteacutereo

Rectas de calibrado y paraacutemetros analiacuteticos de calidad Dada la necesidad de recurrir a la teacutecnica de derivadas para minimizar la sentildeal de la matriz del vino se procede a comprobar la linealidad entre la concentracioacuten de trans-resveratrol en la muestra original y la amplitud del espectro segunda derivada

Para ello se preparan disoluciones conteniendo entre 66 y 66 ngmiddotmL-1 de trans-resveratrol en etanolagua 4060 vv y se irradian durante 60 segundos Se registran los espectros de fluorescencia de las disoluciones irradiadas en las siguientes condiciones experimentales 20ordmC rendija de excitacioacuten 5 nm rendija de emisioacuten 5 nm voltaje del tubo fotomultiplicador 750 V y λexc= 260 nm Por uacuteltimo se obtienen los correspondientes espectros segunda derivada mediante el algoritmo

de Savitzky-Golay (Δλ = 5 nm)

La maacutexima sensibilidad se obtiene al emplear como sentildeal analiacutetica la amplitud de la derivada entre 356 y 364 nm (2D356-364 nm) En la Tabla 4 se recogen los paraacutemetros analiacuteticos de calidad para la determinacioacuten de resveratrol mediante fluorescencia fotoinducida ndash segunda derivada


105

Tabla 4- Paraacutemetros analiacuteticos para la determinacioacuten de trans-resveratrol mediante fluorescencia fotoinducida ndash segunda derivada


Ordenada en el Origen (a plusmn sa) -00904 plusmn 01310





Linealidad 976





Se preparan once disoluciones conteniendo 192 ngmiddotmL-1 de trans-

resveratrol en etanolagua 4060 vv y se irradian durante 60 segundos Se registran sus espectros de emisioacuten de fluorescencia manteniendo las condiciones experimentales empleadas en el establecimiento de la recta de calibrado y se obtienen los espectros segunda derivada mediante el algoritmo de Savitzky-Golay

(Δλ = 5 nm) La desviacioacuten estaacutendar relativa (n = 11) calculada sobre 2D356-364nm

es 48


106

Determinacioacuten de resveratrol en vino mediante fluorescencia fotoinducida de segunda derivada

El procedimiento de extraccioacuten y posterior medida de la fluorescencia fotoinducida anteriormente optimizado se aplica al anaacutelisis de trans-resveratrol en muestras de vino Dicho procedimiento se puede enunciar como sigue en un embudo de decantacioacuten se antildeaden 010 mL de vino tinto oacute 05 mL de vino blanco 50 mL de disolucioacuten reguladora tartrato monoaacutecido de sodiotartrato disoacutedico 030 M de pH 50 y se diluye hasta un volumen final de 100 mL con agua ultrapura La solucioacuten acuosa resultante se extrae con 50 mL de eacuteter etiacutelico agitando durante 1 minuto Se aiacutesla la fase eteacuterea y se evapora a sequedad por paso de una corriente de nitroacutegeno a temperatura ambiente El residuo se redisuelve con 40 mL de etanol absoluto y se antildeade agua ultrapura hasta completar 100 mL Esta disolucioacuten es irradiada durante 60 segundos bajo una laacutempara de mercurio de alta presioacuten Se registra el espectro de fluorescencia (λexc= 260 nm) del fotoproducto generado y se calcula su espectro segunda derivada mediante el algoritmo de

Savytzki-Golay (Δλ = 5 nm) Se toma como sentildeal analiacutetica la amplitud de dicho

espectro derivado entre 356 y 364 nm (2D356-364 nm)

En la Figura 15 se recogen los espectros de fluorescencia fotoinducida asiacute como los espectros de primera y segunda derivada correspondientes a una muestra de vino tinto sin resveratrol antildeadido y a otra a la que se le ha antildeadido trans-resveratrol sometidas al procedimiento de extraccioacuten anteriormente optimizado Puede observarse coacutemo la sentildeal fluorescente correspondiente a la matriz del vino queda totalmente atenuada en el espectro segunda derivada


107

Figura 15-Espectros de fluorescencia (λexc = 260 nm) y espectros primera y segunda derivada correspondientes a una mezcla de vinos tintos de crianza sin resveratrol antildeadido (-----) y con 157 microgmiddotmL-1 de trans-resveratrol (mdashmdash) extraiacutedas con eacuteter etiacutelico y sometidas a una dilucioacuten final de 100 veces

320 360 400 440λem (nm) (λexc= 260 nm)

0

200

400

600

800

Inten

sidad

de

Fluo

resc

encia

-10

0

10

201D

320 360 400 440λ

em (nm) (λexc= 260 nm)

-1

-05

0

05

1

152D

320 360 400 440λem (nm) (λexc= 260 nm)


108

El meacutetodo propuesto se aplica entonces al anaacutelisis de distintas muestras de vino de la regioacuten Las muestras de que se dispone se dividen en tres grandes grupos -Vinos tintos joacutevenes -Vinos tintos de crianza -Vinos blancos y se prepara dentro de cada grupo una mezcla conteniendo voluacutemenes ideacutenticos de todos lo vinos que integran ese grupo con el objetivo de que esteacuten representadas las interferencias maacutes comunes en el anaacutelisis de cualquier muestra de vino Se aplica el meacutetodo de adicioacuten patroacuten por triplicado en cada mezcla de vinos y se construyen las correspondientes curvas sentildeal medida vs concentracioacuten de trans-resveratrol antildeadida Se aplica el test de comparacioacuten de pendientes entre las rectas obtenidas y la de calibrado comprobaacutendose que no existen diferencias significativas entre las pendientes de ninguna de las rectas de adicioacuten patroacuten y la recta de calibrado pudieacutendose concluir por tanto que no existe efecto de matriz Se comproboacute mediante cromatografiacutea de liacutequidos de alta resolucioacuten (HPLC)20 que las concentraciones de resveratrol en las muestras analizadas estaacuten por debajo de los liacutemites de deteccioacuten de la teacutecnica Los porcentajes medios de recuperacioacuten para cada mezcla de vinos y para cada nivel de concentracioacuten se han resumido en la Tabla 5 observaacutendose que son muy satisfactorios en todos los casos

20 Galeano Diacuteaz T Duraacuten Meraacutes I Airado Rodriacuteguez D J Sep Sci 2007 303110-3119


109

Tabla 5- Resultados obtenidos en la determinacioacuten de trans-resveratrol en mezclas de vinos tintos joacutevenes y de crianza y blancos

Recuperacioacuten ( RSD) VINO Antildeadido (μgmiddotmL-1)

Tinto Joven Tinto Crianza

063 107 (5) 109 (4)

094 110 (4) 108 (8)

16 104 (2) 111 (3)

31 98 (4) 105 (3)

Tinto

47 104 (3) 101 (3)

013 100 (8)

019 94 (7)

031 102 (4)

063 96 (5)

Blanco

094 102 (3) Se ha analizado tambieacuten un vino tinto comercial (vino tinto de mesa

Carrefour) conteniendo una cantidad mayor de resveratrol y el resultado obtenido (112 μgmiddotmL-1 (8 RSD)) ha sido tambieacuten satisfactoriamente validado mediante HPLC

Perspectivas de futuro Se ha comprobado la retencioacuten de trans-resveratrol sobre membranas de nylon de manera que las principales perspectivas de futuro pasariacutean por el desarrollo de meacutetodos de determinacioacuten sobre soporte soacutelido

CAPIacuteTULO III

ANAacuteLISIS DE PICEIDO EN VINOS MEDIANTE FLUORESCENCIA FOTOINDUCIDA

APLICANDO SEGUNDA-DERIVADA A LOS ESPECTROS DE EMISIOacuteN

CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino

112


113

ANTECEDENTES El piceido es el principal derivado glucosilado del resveratrol e igual que eacutel

presenta los isoacutemeros trans y cis Este compuesto ha recibido la misma atencioacuten que el resveratrol porque en los productos derivados de la uva la concentracioacuten de la forma glucosada es significativamente mayor que la de la forma aglicona1 2 y la relacioacuten entre las dos formas depende entre otros factores de la fermentacioacuten y de las condiciones ecoloacutegicas2

La teacutecnica maacutes utilizada para su determinacioacuten en vinos es mediante HPLC efectuando en casi todos los casos una elucioacuten en gradiente utilizando como disolvente menos activo una disolucioacuten reguladora de caraacutecter aacutecido y llevando a cabo la deteccioacuten mediante sistema de diodos3-6 fluorescencia7 combinacioacuten en liacutenea de diodos y fluorescencia8 y mediante acoplamiento con

1 Lamuela Raventoacutes RM Romero Peacuterez AI Waterhouse AL de la Torre Boronat MC J Agric Food Chem 1995 43281-283 2 Moreno-Labanda JF Mallavia R Peacuterez-Fons L Lizama V Saura D Mico V J Agric Food Chem 2004 525396-5403 3 Ribeiro de Lima MT Waffo-Teacuteguo P Teissedre PL Pujolas A Vercauteren J Cabanis JC Meacuterillon JM J Agric Food Chem 1999 472666-2670 4 Burns J Yokota T Ashihara H Jean MEJ Crozier A J Agric Food Chem 2002 503337-3340 5 Vitrac X Bornet AVanderline R Valls J Richard T Delaunay JC Meacuterillon JM Teisseacutedre PL J Agric Food Chem 2005 535664-5669 6 Abert Vian M Tomao V Gallet S Coulomb PO Lacombe JM J Chromatogr A 2005 1085224-229 7 Vitrac X Monti JP Vercauteren J Deffieux G Meacuterillon JM Anal Chim Acta 2002 458103-110 8 Jeandet P Breuil AC Adrian M Weston LA Debord S Meunier P Maume G Bessis R Anal Chem1997 695172-5177


114

espectrometriacutea de masas9-11 La electroforesis capilar con deteccioacuten de diodos tambieacuten ha sido empleada para su anaacutelisis12

Con respecto a las etapas previas de tratamiento las muestras de vino para

su posterior anaacutelisis lo mas usual es realizar una extraccioacuten liacutequido-liacutequido con acetato de etilo seguida de una evaporacioacuten y redisolucioacuten del residuo en la fase moacutevil utilizada9 11 Tambieacuten se han propuesto realizar una etapa de limpieza a traveacutes de una columna de intercambio ioacutenico3 La extraccioacuten en fase soacutelida es otra posibilidad muy utilizada tanto en cromatografiacutea como en electroforesis10 12 En algunos casos las muestras de vino son introducidas directamente en el sistema cromatograacutefico previa filtracioacuten a traveacutes de un filtro de celulosa 4 6 7 En cuanto a sus propiedades espectroscoacutepicas este compuesto no presenta fluorescencia nativa pero se ha comprobado que la irradiacioacuten con luz UV provoca la conversioacuten del trans al cis-isoacutemero13 14 el cual raacutepidamente evoluciona hasta formar un compuesto que presenta elevada fluorescencia Este hecho es lo que nos ha permitido explorar la posible determinacioacuten mediante fluorescencia fotoinducida del piceido en muestras de vino

9 Bravo MN Silva S Coelho AV Vilas Boas L Bronze MR Anal Chim Acta 2006 563 84-92 10 Domiacutenguez C Guilleacuten DA Barroso CG J Chromatogr A 2001 918303-310 11 Pozo-Bayoacuten MA Hernaacutendez MT Martiacuten-Aacutelvarez PJ Polo MC J Agric Food Chem 2003 51 2089-2095 12 Brandoline V Maietti A Tedeschi P Durini E Vertuani S Manfredini S J Agric Food Chem 2002 507407-7411 13 Roggero JP J Food Comp Anal 2000 1393-97 14 Roggero JP Garciacutea-Parrilla C Sci Aliments 1995 15 411-422


115

RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN Estudio baacutesico sobre las propiedades de intereacutes analiacutetico de trans-pieido


Con el objetivo de caracterizar fotomeacutetricamente y fluorimeacutetricamente el trans-piceido se preparan disoluciones de dicho analito por dilucioacuten de aliacutecuotas de 050 mL de una disolucioacuten de 57 microgmiddotmL-1 de analito en etanol con distintos disolventes hasta un volumen final de 250 mL El porcentaje de etanol (2 ) en estas disoluciones es suficientemente pequentildeo para no modificar las propiedades de los mismos Los disolventes empleados son agua y disolventes orgaacutenicos de distintas polaridades como metanol etanol acetonitrilo dimetilsulfoacutexido NN-dimetilformamida 14-dioxano ciclohexano y hexano asiacute como mezclas hidroetanoacutelicas de diferente composicioacuten

En todos los casos se registran los espectros de absorcioacuten utilizando como blanco el correspondiente disolvente igualmente con un 2 de etanol En la Figura 1 se recoge el espectro en medio acuoso observaacutendose una banda de absorcioacuten centrada a 312 nm con un ancho de banda de 20 nm en la que se distinguen dos maacuteximos centrados a 306 y 318 nm respectivamente La fisonomiacutea del espectro no se ve afectada por la naturaleza del disolvente


116

Figura 1- Espectro de absorcioacuten correspondiente a una disolucioacuten acuosa (20 vv etanol) conteniendo 114 microgmiddotmL-1 de trans-piceido

Los espectros fluorescentes de excitacioacuten y emisioacuten en algunos de los disolventes utilizados se recogen en la Figura 2 Se observa que en todos los medios ensayados este compuesto es deacutebilmente fluorescente y que en acetonitrilo etanol agua o mezclas hidroetanoacutelicas presenta dos maacuteximos de excitacioacuten centrados a 225 y 318 nm y un uacutenico maacuteximo de emisioacuten centrado a 390 nm En dimetilformamida se observa un aumento de su rendimiento cuaacutentico de fluorescencia asiacute como la desaparicioacuten del primer maacuteximo de excitacioacuten Por otra parte el espectro de emisioacuten se desplaza hipsocroacutemicamente hasta 373 nm en hexano ciclohexano y 14-dioxano

240 280 320 360 400λ (nm)

0

002

004

006

008Ab

sorb

ancia


117

Figura 2- Espectros de excitacioacuten y emisioacuten de disoluciones de trans-piceido en diferentes medios etanolagua 4060 vv (λexcem 318390 nm) (mdashmdash) dimetilformamida (20 etanol) (λexcem 323390 nm) (mdashmdash) y hexano (20 etanol) (λexcem 315373 nm) (mdashmdash) [trans-piceido] = 114 microgmiddotmL-1

Influencia de la acidez del medio y caacutelculo de contantes de ionizacioacuten de trans-piceido Una vez caracterizado el analito espectroscoacutepicamente en distintos disolventes se procede al estudio de la influencia de la acidez del medio sobre sus propiedades absorbentes y fluorescentes El estudio se lleva a cabo en medio acuoso y en medio hidroetanoacutelico conteniendo un 40 (vv) de etanol La fuerza ioacutenica se fija en todos los casos por adicioacuten de KCl en una concentracioacuten final de 010 molmiddotL-1 La variacioacuten del pH se efectuacutea por adicioacuten de pequentildeos voluacutemenes de disoluciones diluidas de HCl y NaOH La acidulacioacuten y la alcalinizacioacuten de la disolucioacuten se llevan a cabo sobre aliacutecuotas independientes de la misma puesto que no se dispone de datos acerca de la reversibilidad de los equilibrios en que este compuesto participa

0

4

8

12

16

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia

200 300 400 500λ (nm)


118

Los espectros maacutes representativos registrados en todo el rango de pH asiacute como la variacioacuten de las sentildeales fotomeacutetricas a distintas longitudes de onda con el pH en los dos medios de trabajo ensayados se recogen en las Figuras 3 y 4

Tanto en medio hidroetanoacutelico como acuoso a medida que disminuye la

acidez se produce un desplazamiento batocroacutemico del maacuteximo de absorcioacuten desde 306 a 344 nm Los datos derivados de estas experiencias nos han permitido cal-cular los valores de pKa en ambos medios y los resultados obtenidos mediante los meacutetodos de Stenstroumlm y Goldsmith15 y Wilson y Lester16 se resumen en la Tabla 1

Figura 3- Influencia del pH sobre (A) los espectros de absorcioacuten de disoluciones hidroetanoacutelicas de trans-piceido y (B) sobre la absorbancia a 306 y 344 nm [trans-piceido] = 228 microgmiddotmL-1 etanolagua 4060 vv


240 280 320 360 400λ (nm)

0

004

008

012

016

02

Abso

rban

cia

lt 70 gt 120

105

A

0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

004

008

012

016

02

Abso

rban

cia

344 nm

306 nm

B


119

Figura 4- Influencia del pH sobre (A) los espectros de absorcioacuten de disoluciones acuosas de trans-piceido y (B) sobre la absorbancia a 306 y 344 nm [trans-piceido] = 200 microgmiddotmL-1

El comportamiento aacutecido-base de este analito tambieacuten se ha estudiado mediante fluorescencia siguiendo el mismo meacutetodo operatorio que en absorcioacuten molecular y trabajando con disoluciones que contienen 097 microgmiddotmL-1 de trans-piceido

En las Figuras 5 y 6 se recogen los espectros de excitacioacuten y emisioacuten del analito en medio aacutecido y baacutesico en cada uno de dos medios de trabajo ensayados asiacute como la variacioacuten de la sentildeal de fluorescencia medida a las longitudes de onda correspondientes a los maacuteximos de fluorescencia de las formas aacutecida y baacutesica con el pH

Como se observa en la Figura 5 los espectros de excitacioacuten y emisioacuten

fluorescente de trans-piceido en etanolagua 4060 vv se desplazan batocroacutemicamente de 292 a 344 nm y de 392 a 447 nm respectivamente como consecuencia del aumento del pH

240 280 320 360 400λ (nm)

0

004

008

012

016

02

Abso

rban

cia

lt 70 gt 110

98

A

0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

004

008

012

016

02

Abso

rban

cia

306 nm

344 nm

B


120

Figura 5- Influencia del pH sobre (A) los espectros de excitacioacuten y emisioacuten de disoluciones hidroetanoacutelicas de trans-piceido y (B) sobre la intensidad de fluorescencia [trans-piceido] = 097 microgmiddotmL-1 etanolagua 4060 vv Figura 6- Influencia del pH sobre (A) los espectros de absorcioacuten de disoluciones acuosas de trans-piceido y (B) sobre la intensidad de fluorescencia [trans-piceido] = 114 microgmiddotmL-1

200 300 400 500 600λ (nm)

0

200

400

600

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia

gt 110

gt 60

A

0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

200

400

600

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia

λexcem= 344457 nm

λexcem= 318405 nm

B

200 300 400 500λ (nm)

0

20

40

60

80

100

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia

lt 70gt 115

A

0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

20

40

60

80

100

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia

λexcem= 292392 nm

λexcem= 344447 nm

B


121

En medio acuoso ademaacutes del desplazamiento batocroacutemico de los maacuteximos de excitacioacuten y emisioacuten de 318 a 344 nm y de 405 a 457 nm respectivamente se observa un aumento del rendimiento cuaacutentico de fluorescencia en medio baacutesico En ambos casos se observa un punto isoemisivo lo que indica la presencia de dos especies en equilibrio es decir la existencia de un equilibrio de disociacioacuten aacutecido-base Para dichos equilibrios se han calculado valores de pKa en medio hidroetanoacutelico y en medio acuoso Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 1 Tabla 1- Valores de pKa calculados para el trans-piceido en distintos medios mediante fotometriacutea y fluorescencia

Meacutetodo de Caacutelculo pKa trans-piceido



FOTO

METR

IacuteA




FLUO

RESC

ENCI

A




122

Solamente se ha encontrado un artiacuteculo17 en el cual se describe el caacutelculo de la constante de disociacioacuten de primer orden de trans-piceido en medio acuoso mediante electroforesis obtenieacutendose un valor de pKa1 = 940 valor bastante en consonancia con el calculado por nosotros mediante fotometriacutea en medio acuoso empleando el meacutetodo de Wilson y Lester


Se procede a estudiar la relacioacuten entre la concentracioacuten de trans-piceido

puesta y la sentildeal fotomeacutetrica o fluorescente medida y al establecimiento de las correspondientes rectas de calibrado

Para obtener las sentildeales fotomeacutetricas se procede antildeadiendo en la cubeta de medida 200 mL de agua ultrapura y voluacutemenes crecientes comprendidos entre 0020 y 025 mL de la disolucioacuten de 57 microgmiddotmL-1 de trans-piceido en etanol y registrando los espectros de absorcioacuten en el rango de longitudes de onda comprendido entre 240 y 360 nm Las medidas de fluorescencia se realizan antildeadiendo directamente en la cubeta de medida 180 mL de agua y 120 mL de etanol absoluto con el objetivo de mantener la composicioacuten oacuteptima del medio de trabajo porque la emisioacuten fluorescente depende del de etanol en el medio Sobre esta mezcla hidroetanoacutelica una vez desgasificada por ultrasonidos se antildeaden voluacutemenes sucesivos de una disolucioacuten etanoacutelica de trans-resveratrol conteniendo 19 microgmiddotmL-1 en incrementos de 10 microL hasta llegar a 010 mL Tras cada nueva adicioacuten se registran los espectros de emisioacuten de fluorescencia en las siguientes condiciones

17 Cao J Chen GH Du YS Hou FF Tian YL J Liquid Chromatogr amp Rel Technol 2006 291457-1463


123

instrumentales 20ordm C rendija de excitacioacuten 5 nm rendija de emisioacuten 5 nm voltaje del tubo fotomultiplicador 800 V y λexc = 318 nm Las ecuaciones de las rectas obtenidas mediante ambas teacutecnicas asiacute como los paraacutemetros analiacuteticos de calidad se encuentran recogidos en la Tabla 2

Tabla 2- Paraacutemetros analiacuteticos de calidad para la determinacioacuten fotomeacutetrica y fluorimeacutetrica de trans-piceido



Rango Lineal (microgmiddotmL-1) 060 ndash 600 0060 ndash 060


Pendiente (b plusmn sb) (mLmiddotmicrog-1) 00727 plusmn 00003 687 plusmn 11




Linealidad 996 984

Resolucioacuten Analiacutetica (γ-1) (microgmiddotmL-1) 00450 00147

LOD Long y Winefordner18 (microgmiddotmL-1) 00433 00326

LOD Clayton19 (α=β=005) (microgmiddotmL-1) 0101 00352



124


Este estudio se realiza siguiendo los procedimientos que se describen Meacutetodo fotomeacutetrico En la cubeta de medida se depositan 20 mL de agua

ultrapura y 50 microL de disolucioacuten etanoacutelica de trans-piceido conteniendo 57 microgmiddotmL-1 y se mide su absorbancia a 306 nm El proceso se repite once veces Se calcula la media y la desviacioacuten estaacutendar de las mediciones realizadas asiacute como la desviacioacuten estaacutendar relativa como la razoacuten entre ambas

Meacutetodo fluorimeacutetrico En la cubeta de medida de fluorescencia se depositan 120 mL de etanol absoluto y 180 mL de agua ultrapura la mezcla hidroetanoacutelica se pasa por un bantildeo de ultrasonidos para ser desgasificada y sobre ella se antildeaden 50 microL de disolucioacuten etanoacutelica diluida de trans-piceido conteniendo 19 microgmiddotmL-1 Se registra su espectro de emisioacuten de fluorescencia en condiciones ideacutenticas a las empleadas en el establecimiento de la recta de calibrado El proceso se repite once veces Se calcula la media y la desviacioacuten estaacutendar de las sentildeales medidas a 385 nm asiacute como la desviacioacuten estaacutendar relativa del conjunto de mediciones Las desviaciones estaacutendar relativas calculadas en cada caso sobre las sentildeales medidas resultan ser 19 y 58 respectivamente

Efecto de la irradiacioacuten ultravioleta externa sobre las propiedades absorbentes y fluorescentes de trans-piceido

Se lleva a cabo un estudio sobre la fotorreaccioacuten que sufre el trans-piceido

al exponerlo a radiacioacuten UV intensa mediante fotometriacutea y fluorescencia molecular estudiaacutendose como influye el disolvente y la acidez del medio


125

Influencia del disolvente

Se lleva a cabo el estudio de la fotorreaccioacuten que sufre el trans-piceido en distintos medios de trabajo mediante fotometriacutea y fluorescencia molecular Para ello se preparan disoluciones del analito con disolventes orgaacutenicos de diferentes polaridades asiacute como en agua y en mezclas hidroetanoacutelicas y en cada uno de los casos se realiza una influencia del tiempo de irradiacioacuten bajo una laacutempara de mercurio de alta presioacuten Cronoloacutegicamente los ensayos mediante fluorescencia se realizaron previamente a los de fotometriacutea de manera que mediante fotometriacutea soacutelo se estudioacute la fotorreaccioacuten en medios hidroetanoacutelicos por los motivos que maacutes adelante se exponen

Absorcioacuten molecular- Como ya se ha comentado el espectro de absorcioacuten de trans-piceido no se ve afectado por el disolvente siendo ideacutentico en etanol en agua y en medios hidroetanoacutelicos de diferente composicioacuten No ocurre lo mismo con los fotoproductos que se obtienen como consecuencia de la irradiacioacuten de sus disoluciones bajo una laacutempara de mercurio de alta presioacuten La cineacutetica de los foto-procesos tambieacuten se ve influenciada por la composicioacuten del medio de trabajo Para estudiar la influencia del disolvente sobre las fotorreacciones que sufre este analito se preparan disoluciones en presencia de porcentajes crecientes de etanol conteniendo todas ellas 114 microgmiddotmL-1 de trans-piceido Cada una de estas disoluciones se irradia durante intervalos de tiempo acumulativos y se registran los correspondientes espectros de absorcioacuten entre 240 y 360 nm Figura 7


126

Como puede observarse la irradiacioacuten ultravioleta de las disoluciones

acuosas etanoacutelicas o hidroetanoacutelicas de trans-piceido provoca la desaparicioacuten inmediata de la banda de absorcioacuten centrada a 312 nm en favor de un nuevo maacuteximo de absorcioacuten centrado a 290 nm correspondiente a cis-piceido seguacuten se encuentra descrito en la bibliografiacutea13 14 Para tiempos de irradiacioacuten superiores a 60 segundos se observa la aparicioacuten de un nuevo maacuteximo centrado a 261 nm que alcanza su maacutexima intensidad para disoluciones conteniendo un 40 de etanol e irradiadas durante 180 segundos y que es insignificante en disoluciones puramente etanoacutelicas y muy deacutebil en disoluciones con porcentajes acuosos superiores al 60 Cuando las disoluciones de trans-piceido son irradiadas durante un tiempo de 10 minutos tiene lugar la destruccioacuten de este uacuteltimo fotoproducto

Para concluir merece la pena destacar que se ha comprobado a traveacutes de

los estudios llevados a cabo mediante absorcioacuten molecular que el tiempo de irradiacioacuten necesario para la obtencioacuten de los fotoproductos es mayor cuanto mayor es la concentracioacuten de trans-piceido en la disolucioacuten original


127

Figura 7- Influencia del tiempo de irradiacioacuten sobre los espectros de absorcioacuten de disoluciones conteniendo 114 microgmiddotmL-1 de trans-piceido en etanol absoluto (A) y etanolagua 6040 vv (B) 4060 vv (C) y 496 vv (D) sin irradiar (mdashmdash) e irradiadas durante 5 segundos (mdashmdash) 30 segundos (mdashmdash) 60 segundos (mdashmdash) 120 segundos (mdashmdash) 180 segundos (mdashmdash) y 600 segundos (mdashmdash)

240 280 320 360λ (nm)

0

003

006

009

Abso

rban

cia

D

A

0

003

006

009

Abso

rban

cia

240 280 320 360λ (nm)

B

240 280 320 360λ (nm)

0

003

006

009

Abso

rban

cia

C

240 280 320 360λ (nm)

0

003

006

009

Abso

rban

cia


128

Fluorescencia molecular- Para examinar los efectos de la irradiacioacuten ultravioleta externa sobre el comportamiento fluorescente de trans-piceido se prepara una disolucioacuten conteniendo 030 microgmiddotmL-1 de analito en etanolagua 4060 vv y se registran los espectros de excitacioacuten y emisioacuten de fluorescencia de dicha disolucioacuten recieacuten preparada y tras ser irradiada durante un tiempo bajo una laacutempara de mercurio de alta presioacuten

Se comprueba que la irradiacioacuten ultravioleta externa de disoluciones

hidroetanoacutelicas de trans-piceido tiene como consecuencia la generacioacuten de fotoproductos altamente fluorescentes como puede observarse en la Figura 8

Los espectros de estos fotoproductos se caracterizan por presentar un

intenso y agudo maacuteximo de excitacioacuten centrado a 261 nm y dos maacuteximos de emisioacuten no menos agudos a 361 y 379 nm respectivamente

Figura 8- Espectros de excitacioacuten y emisioacuten correspondientes a una disolucioacuten conteniendo 120 microgmiddotmL-1 de trans-piceido en etanolagua 4060 vv aislada de la luz (mdashmdash) (λexcem 318390 nm) e irradiada durante 180 segundos (mdashmdash) (λexcem 261361 nm )

200 300 400 500λ (nm)

0

400

800

1200

1600

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia


129

El estudio de la influencia del tiempo de irradiacioacuten se lleva a cabo en disolventes orgaacutenicos de distintas polaridades Se ensayan concretamente metanol etanol acetonitrilo dimetilsulfoacutexido NN-dimetilformamida 14-dioxano ciclohexano y hexano Se observa que la naturaleza del fotoproducto es independiente del disolvente sin embargo la velocidad de las fotorreacciones siacute estaacute influida por el disolvente siendo mayor en medios puramente orgaacutenicos que en medios hidroorgaacutenicos Por otro lado tambieacuten depende del disolvente el rendimiento cuaacutentico de fluorescencia de los fotoproductos que es maacuteximo en medios hidroetanoacutelicos con proporciones similares de etanol y agua Se selecciona por tanto el medio hidroetanoacutelico como oacuteptimo para el desarrollo de la fotorreaccioacuten procedieacutendose a continuacioacuten a la optimizacioacuten de las proporciones relativas de etanol y agua en el medio de trabajo Para ello se preparan una serie de disoluciones en mezclas de etanol y agua con distintas proporciones de ambos disolventes conteniendo todas ellas 060 microgmiddotmL-1 de trans-

piceido y se irradian durante diferentes tiempos Las sentildeales obtenidas se representan en la Figura 9A

El comportamiento general en todas las mezclas ensayadas consiste en un aumento de la sentildeal de fluorescencia fotoinducida con el tiempo de irradiacioacuten hasta alcanzar un maacuteximo seguido por un decaimiento de la sentildeal probablemente debido a la destruccioacuten de los fotoproductos y a la generacioacuten de otros compuestos no fluorescentes En disoluciones puramente etanoacutelicas el tiempo de irradiacioacuten oacuteptimo estaacute en torno a 50 segundos pero el rendimiento cuaacutentico de fluorescencia de los fotoproductos es muy pequentildeo A medida que disminuye el porcentaje de etanol aumentan tanto el tiempo de irradiacioacuten oacuteptimo como las sentildeales de fluorescencia fotoinducida Las maacuteximas sentildeales se obtienen en medios con un porcentaje de etanol comprendido entre el 30 y el 50 con un tiempo de


130

irradiacioacuten de 180 segundos Por ello para las siguientes experiencias se elige como medio de trabajo oacuteptimo una mezcla etanolagua 4060 vv

Figura 9- (A) Influencia del tiempo de irradiacioacuten sobre disoluciones de trans-piceido en etanol absoluto (mdashmdash) y etanolagua 8020 vv (mdashmdash) 4060 vv (mdashmdash) y 1080 vv (mdashmdash) (B) Influencia del porcentaje de etanol sobre la intensidad de fluorescencia irradiando durante 180 segundos [trans-piceido] = 060 microgmiddotmL-1 λexc = 261 nm λem = 361 nm

Adicionalmente se estudia por separado coacutemo afecta la presencia de etanol a la fotorreaccioacuten y al rendimiento cuaacutentico de fluorescencia de los fotoproductos encontraacutendose que en el caso del piceido se obtienen mayores sentildeales irradiando muestras 100 acuosas y antildeadiendo etanol hasta completar el 40 vv previamente a la medida de la fluorescencia

Influencia de la acidez del medio sobre las propiedades absorbentes y

fluorescentes de los fotoproductos de piceido

Para llevar a cabo el estudio de la influencia de la acidez del medio sobre las propiedades espectroscoacutepicas de los fotoproductos de piceido se procede irradiando disoluciones puramente acuosas de trans-piceido y antildeadiendo posteriormente etanol absoluto hasta completar el 40 vv Se preparan de esta manera dos disoluciones conteniendo 37 y 057 microgmiddotmL-1 para ser estudiadas

0 100 200 300Tiempo de Irradiacioacuten (s)

0

200

400

600

I F (

361 n

m) (λ

exc =

261 n

m)

A

0 20 40 60 80 100 v Etanol

0

200

400

600

I F (

361 n

m) (λ

exc =

261 n

m)

B


131

mediante fotometriacutea y fluorescencia respectivamente Los espectros de absorcioacuten y los espectros fluorescentes de excitacioacuten y emisioacuten a distintos valores de pH se encuentran recogidos en las Figuras 10 y 11 respectivamente asiacute como la variacioacuten de las sentildeales fotomeacutetrica y fluorescente con el pH Figura 10- Influencia del pH sobre (A) Espectros de absorcioacuten de los fotoproductos del trans-piceido (37 microgmiddotmL-1) en etanolagua 4060 vv y (B) sobre la absorbancia medida a 261 y 282 nm

El espectro de absorcioacuten de disoluciones aacutecidas neutras y ligeramente baacutesicas de los fotoproductos de piceido muestra un soacutelo maacuteximo centrado a 261 nm como puede observarse en la Figura 10A cuya posicioacuten e intensidad permanecen constantes a pH inferiores a 80 Para valores superiores de pH se observa un decaimiento de la sentildeal y la aparicioacuten de un nuevo maacuteximo centrado a 271 nm que existe soacutelo en el intervalo de pH 105-110 En medios maacutes baacutesicos se observa un desplazamiento batocroacutemico y un efecto hipercroacutemico apareciendo un nuevo maacuteximo centrado a 282 nm cuya posicioacuten e intensidad se mantiene praacutecticamente constante a partir de pH 120

240 260 280 300 320 340 360λ (nm)

0

01

02

03Ab

sorb

ancia

0 2 4 6 8 10 12 14pH

008

012

016

02

024

028

Abso

rban

cia

261 nm

282 nm

80

100104

108111

gt 12


132

Figura 11- Influencia del pH sobre (A) Los espectros de excitacioacuten y emisioacuten de los fotoproductos de trans-piceido (057 microgmiddotmL-1) y (B) sobre la intensidad de fluorescencia (λexcem = 261361 nm)

Los espectros de excitacioacuten y emisioacuten de los fotoproductos de piceido en medio aacutecido y neutro estaacuten caracterizados por maacuteximos centrados a 261 nm y 361 y 379 nm respectivamente Figura 11A Los fotoproductos son muy poco fluorescentes a pH superiores a 110 no obstante puede observarse un desplazamiento batocroacutemico del maacuteximo de emisioacuten hasta 271 nm asiacute como la aparicioacuten de un uacutenico maacuteximo de emisioacuten centrado a 420 nm La variacioacuten de la sentildeal fluorescente (λexcem = 261361 nm) con el pH Figura 11B muestra un draacutestico decaimiento a partir de pH 80 obtenieacutendose una sentildeal praacutecticamente nula para pH superiores a 110

Finalmente se ha estudiado fotomeacutetrica y fluorimeacutetricamente la reversibilidad de los equilibrios aacutecido-base de los fotoproductos de piceido Para ello se alcalinizan las muestras hasta un pH en torno a 12 y se acidulan a continuacioacuten hasta un pH proacuteximo al inicial Por comparacioacuten de los espectros correspondientes a las muestras neutras originales y los registrados tras la variacioacuten del pH se deduce que en el caso de trans-piceido el proceso aacutecido base es totalmente reversible trataacutendose pues de un auteacutentico equilibrio aacutecido-base

0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

200

400

600

I F (3

61 n

m) (λ

exc=

261 n

m)

200 250 300 350 400 450λ (nm)

0

200

400

600Int

ensid

ad de

Fluo

resc

encia

lt 80

gt 115

99


133

No obstante no se ha calculado el valor de la constante de ionizacioacuten porque cromatograacuteficamente se ha comprobado la formacioacuten de dos fotoproductos fluorescentes


Establecida la influencia de las variables quiacutemicas anteriormente detalladas se procede a continuacioacuten a estudiar la relacioacuten entre la concentracioacuten de piceido puesta y la sentildeal de fluorescencia fotoinducida medida y al establecimiento de la correspondiente recta de calibrado

Para ello se preparan disoluciones en el rango de concentraciones entre

60 y 30 ngmiddotmL-1 de trans-piceido La irradiacioacuten se lleva a cabo en medio acuoso durante 180 segundos con la posterior adicioacuten de etanol absoluto hasta completar el 40 vv Se registran los espectros de emisioacuten de fluorescencia de las disoluciones irradiadas en las siguientes condiciones experimentales 20ordm C rendija de excitacioacuten 5 nm rendija de emisioacuten 5 nm voltaje del tubo fotomultiplicador 750 V y λexc = 261 nm Los paraacutemetros analiacuteticos se resumen en la Tabla 3


134

Tabla 3- Paraacutemetros analiacuteticos para la determinacioacuten mediante fluorescencia fotoinducida de trans-piceido

Sentildeal Analiacutetica IF 261361 nm







Linealidad 984





Se preparan once disoluciones independientes conteniendo 143 ngmiddotmL-1 de trans-piceido previamente irradiadas en las mismas condiciones que en el la recta de calibrado y se registran sus espectros de emisioacuten manteniendo las condiciones experimentales empleadas en el establecimiento de la recta de calibrado La desviacioacuten estaacutendar relativa resulta ser del 23


135

Estudio extracto-espectrofluorimeacutetrico del trans-piceido Aplicacioacuten al anaacutelisis de muestras de vino

Los meacutetodos descritos en la bibliografiacutea para el anaacutelisis de piceido en diversas muestras complejas siempre hacen uso de teacutecnicas separativas bien cromatograacuteficas o electroforeacuteticas pero actualmente no existen propuestos meacutetodos espectroscoacutepicos de anaacutelisis de este compuesto Se pretende desarrollar un nuevo meacutetodo de anaacutelisis de piceido en vino en presencia de su principal interferencia su aglicona mediante fluorescencia fotoinducida Como paso previo a la determinacioacuten mediante fluorescencia fotoinducida es necesario una etapa de limpieza de la muestra que se llevaraacute a cabo mediante una extraccioacuten liacutequido-liacutequido de las muestras de vino para reducir la sentildeal de fondo de la matriz Por ello se lleva a cabo un estudio extracto-espectrofluorimeacutetrico del analito con objeto de optimizar las condiciones para la extraccioacuten

Estudios previos

La extraccioacuten de piceido de la matriz acuosa con disolventes orgaacutenicos es maacutes problemaacutetica que la extraccioacuten de resveratrol Al emplear eacuteter etiacutelico como disolvente praacutecticamente el 100 del analito permanece en la fase acuosa probablemente debido a la elevada polaridad del residuo de glucosa presente en la moleacutecula de piceido Se ha comprobado que las mejores recuperaciones se obtienen al extraer con acetato de etilo no el trans-piceido sino sus fotoproductos Asiacute se consiguen los mejores resultados extrayendo disoluciones acuosas de


136

piceido irradiadas durante 180 segundos El pH de estas disoluciones se fija a 50 tras la irradiacioacuten por adicioacuten de tampoacuten tartrato monoaacutecido de sodiotartrato disoacutedico ya que se comprueba tambieacuten que la presencia de tampoacuten en el proceso de irradiacioacuten supone una disminucioacuten draacutestica en la sentildeal de fluorescencia fotoinducida debido posiblemente a que el ioacuten tartrato impide de alguna manera que se complete la reaccioacuten fotoquiacutemica

Dado que la recuperacioacuten no es total y se observa una acusada influencia

de diversas variables sobre la extraccioacuten de los fotoproductos de piceido se ha utilizado en este caso el Disentildeo de Experimentos y la Metodologiacutea de Superficie de

Respuesta para la optimizacioacuten del proceso

Disentildeo de experimentos y metodologiacutea de la superficie de respuesta La metodologiacutea de superficie de respuesta es un conjunto de teacutecnicas

estadiacutesticas y matemaacuteticas para el descubrimiento del mejor valor de una variable de respuesta (variable de salida) y los valores de los factores (variables de entrada) que producen dicho valor oacuteptimo

En este meacutetodo el sistema se representa por una ecuacioacuten empiacuterica

basada en ecuaciones preseleccionadas usando los datos experimentales obtenidos del sistema para el ajuste de los correspondientes coeficientes Normalmente se usan modelos polinoacutemicos de segundo orden con teacuterminos cruzados que permiten describir concavidades o convexidades de la superficie La superficie representada por dicho modelo polinoacutemico se denomina Superficie de

Respuesta Asiacute para el estudio de dos variables se puede considerar que la superficie de respuesta se ajusta al modelo


137

Respuesta = b0 + b1A + b2B + b12AB + b11A2 + b22B2

y en general

Respuesta = b0 + sumbiXi + sumbijXiXj + sumbiiXi2

El ajuste de esta ecuacioacuten implica la realizacioacuten de experiencias a maacutes de dos niveles para cada factor llevaacutendose a cabo la seleccioacuten de las experiencias por medio del uso de alguacuten Disentildeo Experimental apropiado

El fin de un disentildeo experimental consiste fundamentalmente en obtener la

maacutexima informacioacuten posible con el menor nuacutemero de experimentos y centrarse uacutenicamente en la recogida de la informacioacuten estrictamente necesaria Se disentildean o seleccionan un pequentildeo nuacutemero de experimentos que se realizan en unas condiciones controladas Existen diferentes tipos de disentildeo en funcioacuten de las caracteriacutesticas del sistema y el objetivo que se pretende conseguir En el presente caso dado que lo que se persiguen son los valores oacuteptimos de las variables significativas implicadas en la extraccioacuten se utiliza un Disentildeo Central Compuesto En este disentildeo cada factor tiene cinco niveles En el caso de tres factores Figura 12 estos seraacuten estrella bajo cubo bajo central cubo alto y estrella alto Cubo alto y bajo son los niveles superior e inferior que se especifican al definir las variables del disentildeo Las muestras estrellas estaacuten localizadas fuera del cubo Como consecuencia todas las muestras excepto la central estaacuten localizadas en la misma esfera si se dispone de tres factores o en una hiperesfera en los demaacutes casos y por consiguiente la informacioacuten que llevan tendraacute el mismo peso en los anaacutelisis (rotatividad) La dificultad de ajustar estos niveles es la principal desventaja de este tipo de disentildeo que por otra parte posee muy buenas propiedades estadiacutesticas


138

Una vez realizados los experimentos determinados por el tipo de disentildeo elegido se procede a la determinacioacuten de los coeficientes polinoacutemicos del modelo experimental Del estudio del mismo puede deducirse no soacutelo la forma de dependencia de la respuesta con las variables consideradas sino tambieacuten las condiciones oacuteptimas buscadas

Figura 12- Disentildeo Central Compuesto para tres factores

Habitualmente se realiza un Anaacutelisis de la Varianza (ANOVA) con el que se comprobaraacute la significancia del modelo la utilidad de las interacciones y los teacuterminos cuadrados la calidad del ajuste del modelo y en uacuteltimo teacutermino la bondad de la superficie de respuesta Para ello se utiliza el software informaacutetico THE UNSCRAMBLER20 que permite realizar entre otros el ANOVA estudio de residuos anaacutelisis de efectos representacioacuten graacutefica de la superficie de respuesta en el espacio tridimensional asiacute como mapas de contorno para cada dos variables

La bondad de la superficie de respuesta la indica el ANOVA a traveacutes de los

paraacutemetros coeficiente de determinacioacuten (R2) falta de ajuste del modelo cuadraacutetico (ldquoLack of Fitrdquo) y chequeo del modelo cuadraacutetico (ldquoModel Check 20 Unscrambler v 611 CAMO AS Olav Tryggvasonsgt N-7011 Trondheim Norway


139

Cuadraticrdquo) Estos dos uacuteltimos paraacutemetros tienen unos determinados palores ldquoprdquo (nivel de significacioacuten) de tal forma que para un nivel de confianza del 95 un valor de ldquoprdquo inferior a 005 para Model Check Cuadratic indica que la parte cuadraacutetica del modelo es significativa es decir que las interacciones y teacuterminos cuadrados incluidos en el modelo son uacutetiles un valor de ldquoprdquo superior a 005 para Lack of Fit indica que la peacuterdida o falta de ajuste del modelo no es significativa Por otra parte R2 interesa que sea proacuteximo a 09 El ANOVA que presenta un buen valor de R2 lleva asociado un buen valor de Model Check Cuadratic y Lack of Fit y en definitiva se concluye que la superficie de respuesta es vaacutelida para elegir el punto oacuteptimo que generalmente son las condiciones de las variables que maximizan la respuesta elegida Dicho punto tambieacuten lo presenta el ANOVA aunque se puede deducir analizando la superficie de respuesta en su forma tridimensional o como mapas de contorno En el caso del mapa de contorno se puede deducir una zona alrededor del punto oacuteptimo donde la respuesta no presenta una diferencia significativa respecto a la respuesta maacutexima Dicha zona seraacute interesante puesto que describe unos valores de las variables que pueden ser considerados tambieacuten como oacuteptimos

Ademaacutes el ANOVA presenta los valores de ldquoprdquo para cada uno de los

factores y las interacciones entre ellos de forma que un valor de ldquoprdquo inferior a 005 indica que ese factor o interaccioacuten influye de forma significativa con un 95 de probabilidad

El estudio de los residuos permite la deteccioacuten de posibles outliers

(muestras que no se ajustan al modelo) y por uacuteltimo la visualizacioacuten de las superficies o de las graacuteficas de contorno posibilita una interpretacioacuten final


140

Planificacioacuten y realizacioacuten de las experiencias

Las variables quiacutemicas implicadas en el proceso de extraccioacuten de los fotoproductos fluorescentes del trans-piceido con acetato de etilo y los niveles considerados para cada una de ellas son las siguientes

- concentracioacuten de disolucioacuten reguladora tartaacuterico monoaacutecido de

sodiotartrato disoacutedico (NaHTrNa2Tr) de pH 50 0026 ndash 019 M

- relacioacuten de fases (mL F Acuosa mL F Orgaacutenica) 099 ndash 34 - tiempo de agitacioacuten 12 ndash 298 s

Con el disentildeo central compuesto se genera un total de 17 experimentos

Tabla 4 Las muestras se preparan de manera que el volumen final de la fase

acuosa sea siempre igual a 100 mL conteniendo 020 mL de disolucioacuten etanoacutelica 286 microgmiddotmL-1 de trans-piceido y voluacutemenes variables de agua ultrapura y disolucioacuten reguladora tartrato monoaacutecido de sodiotartrato disoacutedico 030 M de pH 50 irradiaacutendolas durante 180 segundos previamente a la adicioacuten del tampoacuten La fase acuosa se extrae con el volumen de acetato de etilo que marque la relacioacuten de fases agitando durante el tiempo correspondiente en cada caso Se registra el espectro de emisioacuten de fluorescencia de la fase acuosa antes y despueacutes de ser extraiacuteda en las siguientes condiciones instrumentales 20ordmC rendija de excitacioacuten 5

nm rendija de emisioacuten 5 nm voltaje del tubo fotomultiplicador 800 V y λexc = 261

nm


141

Tabla 4- Disentildeo Central Compuesto para tres variables

Posicioacuten en el disentildeo

Experiencia Nordm

[NaHTrNa2Tr] M pH 50

Relacioacuten de fases

Tiempo de agitacioacuten (s)

Low A 1 0026 25 155

High A 2 019 25 155

Low B 3 011 25 12

High B 4 011 25 298

Low C 5 011 099 155

High C 6 011 40 155

Cube 1 7 006 16 70

Cube 2 8 016 16 70

Cube 3 9 006 16 240

Cube 4 10 016 16 240

Cube 5 11 006 34 70

Cube 6 12 016 34 70

Cube 7 13 006 34 240

Cube 8 14 016 34 240

Central a 15 011 25 155

Central b 16 011 25 155

Central c 17 011 25 155


142

Anaacutelisis de la superficie de respuesta

La sentildeal empleada para construir la superficie de respuesta es la diferencia entre las intensidades de fluorescencia medidas a 361 nm sobre los espectros de emisioacuten registrados a la fase acuosa antes y despueacutes de ser extraiacuteda Las caracteriacutesticas de la superficie de respuesta son

-R2 = 0862 -Multiple Correlation 0928 -Model Check Cuadratic (p lt 005) p = 07170 -Lack of Fit (p gt 005) p = 05182

El valor de ldquoprdquo para Lack of Fit indica que la peacuterdida de ajuste no es significativa ademaacutes el valor de R2 indica la bondad del modelo No obstante el valor de ldquoprdquo para Model Check Cuadratic es superior a 005 lo que indica que la parte cuadraacutetica del modelo no es significativa es decir que las interacciones y teacuterminos cuadrados incluidos en el modelo no son del todo uacutetiles

Aplicando el ANOVA al anaacutelisis de los ldquovalores prdquo para la superficie de

respuesta (Tabla 5) se deducen queacute variables influyen de forma significativa (p lt 005) En este caso dichas variables son la concentracioacuten de tampoacuten y la relacioacuten de fases mientras que el tiempo de agitacioacuten las interacciones entre las variables y los teacuterminos cuadraacuteticos no son significativas

En la Figura 13 se recogen las superficies de respuesta para las tres

combinaciones de las tres variables estudiadas El oacuteptimo estaraacute en la zona de maacutexima respuesta que es la zona de color negro En esta zona existe un punto que presenta el valor maacuteximo de respuesta que seraacute tomado como oacuteptimo Este punto corresponde a los siguientes valores para las variables


143

-[ NaHTrNa2Tr] = 016 M -Tiempo de agitacioacuten = 150 s -Relacioacuten de fases = 07

Tabla 5- Anaacutelisis de los ldquovalores prdquo para las variables estudiadas

Variable Valor p

A [Tampoacuten] (M) 00422

B Tiempo de agitacioacuten (s) 06673

C Relacioacuten de fases 00020

AB 04561

AC 09239

BC 07689

AA 02931

BB 01602

CC 03235

El valor de relacioacuten de fases predicho como oacuteptimo se encuentra fuera de los liacutemites ensayados para esta variable No obstante se comproboacute que el porcentaje de recuperacioacuten obtenido al emplear como relacioacuten de fases 1 oacute 07 es el mismo fijando por tanto 1 como relacioacuten de fases oacuteptima

El rendimiento de la extraccioacuten calculado por comparacioacuten de la pendiente

de la recta de calibrado recogida en la Tabla 6 y una recta (r = 0995) construida extrayendo patrones en el mismo rango de concentraciones y en las condiciones determinadas como oacuteptimas resulta ser del 61


144

Figura 13- Superficies de respuesta para cada par de variables instrumentales


145

Determinacioacuten de piceido en vino mediante fluorescencia fotoinducida de segunda derivada

A pesar del paso de extraccioacuten liacutequido-liacutequido de las muestras de vino la sentildeal fluorescente procedente de la matriz en las condiciones necesarias para la obtencioacuten de los espectros de fluorescencia fotoinducida de piceido no puede ser despreciada No obstante al igual que en caso de resveratrol dicha sentildeal se atenuacutea en gran medida por obtencioacuten de los espectros segunda derivada Los espectros segunda derivada se obtienen en todos los casos mediante el algoritmo

de Savitzsky-Golay21 empleando Δλ = 5 nm

Se comprueba la linealidad entre la amplitud del espectro segunda derivada entre 353 y 361 nm (2D353-361) y la concentracioacuten de trans-piceido en la muestra original como queda reflejado en la Tabla 6 por lo que se propone utilizar eacutesta como sentildeal analiacutetica para el anaacutelisis de piceido en vino

El tratamiento al que se someten las muestras de vino objeto del anaacutelisis es el siguiente en una celda de cuarzo se antildeaden 010 mL de vino tinto o 050 mL de vino blanco que se diluyen con agua ultrapura hasta un volumen final de 50 mL en presencia de un 20 v de etanol La disolucioacuten resultante se irradia durante 180 segundos bajo una laacutempara de mercurio de alta presioacuten y a continuacioacuten se transfiere a un embudo de decantacioacuten Se fija el pH a 50 por adicioacuten de 50 mL de disolucioacuten reguladora tartrato monoaacutecido de sodiotartrato disoacutedico 030 M y se extrae con 100 mL de acetato de etilo agitando vigorosamente durante 150 segundos Se aiacutesla la fase orgaacutenica y se evapora a sequedad en un rotavapor a temperatura ambiente El residuo resultante se



146

redisuelve con 40 mL de etanol absoluto y se antildeade agua ultrapura hasta completar 100 mL

Tabla 6- Paraacutemetros analiacuteticos de calidad para la determinacioacuten de piceido mediante fluorescencia fotoinducida ndash segunda derivada

Sentildeal Analiacutetica 2D353-361 nm

(λexc = 261 nm) Rango Lineal (ngmiddotmL-1) 60 ndash 30






Linealidad 980




Repetitividad (143 ngmiddotmL-1)

RSD (n = 11) 59

El meacutetodo se aplica al anaacutelisis de distintas muestras de vino de la regioacuten

Las muestras de que se dispone se dividen en tres grandes grupos

-Vinos tintos joacutevenes -Vinos tintos de crianza -Vinos blancos


147

Se prepara dentro de cada grupo una mezcla conteniendo voluacutemenes ideacutenticos de todos lo vinos que integran ese grupo con el objetivo de que esteacuten representadas las interferencias maacutes comunes en el anaacutelisis de cualquier muestra de vino Se aplica el meacutetodo de adicioacuten patroacuten por triplicado sobre cada mezcla de vinos y se construyen las correspondientes curvas 2D353-361 nm vs concentracioacuten de trans-piceido puesta Se aplica el test de comparacioacuten de pendientes entre las rectas obtenidas y una recta de calibrado construida sometiendo a los patrones al mismo tratamiento que al vino comprobaacutendose que existen diferencias significativas entre las pendientes de las tres rectas de adicioacuten patroacuten y la recta de calibrado concluyendo por tanto que existe efecto de matriz Se elige el meacutetodo de la adicioacuten patroacuten como meacutetodo de calibracioacuten para el anaacutelisis de piceido

Las concentraciones de piceido calculadas en cada mezcla de vinos teniendo en cuenta que el rendimiento de la extraccioacuten es 61 en comparacioacuten con las calculadas mediante el meacutetodo cromatograacutefico de validacioacuten22 se encuentran recogidas en la Tabla 7 observaacutendose que los resultados son muy aceptables



148

Tabla 7- Concentraciones de piceido encontradas en las muestras de vino calculadas mediante el meacutetodo extracto-fluorimeacutetrico de derivadas y mediante HPLC

a Adicioacuten Patroacuten (tres adiciones por triplicado)

En uacuteltimo lugar para mejorar el meacutetodo en teacuterminos de simplicidad y

rapidez se examinan los resultados obtenidos llevando a cabo la adicioacuten patroacuten en la etapa de medida Asiacute se comparan los resultados resumidos en la Tabla anterior obtenidos dopando muestras de vino diluidas individuales antes de ser extraiacutedas con los obtenidos realizando la adicioacuten patroacuten sobre la disolucioacuten hidroetanoacutelica resultante de la irradiacioacuten extraccioacuten evaporacioacuten y reconstitucioacuten de la muestra de vino diluida sin dopar por adicioacuten sucesiva en la cubeta de medida de fluorescencia de pequentildeos voluacutemenes de disolucioacuten patroacuten de piceido irradiada en ideacutenticas condiciones que la muestra de vino diluida Se comprueba que los resultados del anaacutelisis no son afectados al llevar a cabo de esta manera la adicioacuten estaacutendar lo que supone un recorte sustancial en el tiempo de anaacutelisis ya que habraacute que realizar una sola vez el proceso de extraccioacuten y evaporacioacuten por muestra de vino analizada

microgmiddotmL-1 de piceido Meacutetodo Vinos Tintos

Joacutevenes Vinos Tintos de

Crianza Vinos Blancos

Extracto-fluorimeacutetrico de

derivadasa 075 plusmn 011 084 plusmn 014 017 plusmn 003

HPLC 072 plusmn 005 076 plusmn 008 020 plusmn 001


149

Interferencias

Los espectros de fluorescencia de los fotoproductos de resveratrol y piceido son praacutecticamente iguales lo que significa que un analito es la principal interferencia del otro Con los meacutetodos propuestos para el anaacutelisis de cada uno de ellos se consigue evitar dicha interferencia mediante distintos mecanismos

- el piceido no se extrae en eacuteter etiacutelico lo que permite la determinacioacuten de

resveratrol en presencia de su glucoacutesido - la irradiacioacuten durante 180 segundos de las muestras en el proceso de

determinacioacuten de piceido supone la destruccioacuten y la peacuterdida total de la fluorescencia del fotoproducto de resveratrol en los intervalos de concentraciones normales en los que se trabaja en el anaacutelisis de vino Perspectivas de futuro Al igual que en el caso de la aglicona el piceido tambieacuten es retenido en membranas de nylon de manera que se estaacute trabajando en el desarrollo de meacutetodos de determinacioacuten en soporte soacutelido Se estudiaraacute tambieacuten la posible resolucioacuten de la mezcla aglicona-glucoacutesido por aplicacioacuten de quimiometriacutea (meacutetodos de calibracioacuten multivariantes) sobre sentildeales de fluorescencia

CAPIacuteTULO IV

DETERMINACIOacuteN DE RESVERATROL Y PICEIDO TOTALES EN VINO SIN

TRATAMIENTO PREVIO MEDIANTE DERIVATIZACIOacuteN FOTOQUIacuteMICA OFF LINE-

HPLC

CAPIacuteTULO IV Resveratrol y piceido mediante derivatizacioacuten-fotoquiacutemica ldquooff linerdquo ndashHPLC

152


153

ANTECEDENTES

Los compuestos fenoacutelicos se encuentran entre los compuestos quiacutemicos no nutrientes presentes en la dieta y que podriacutean contribuir a los efectos beneficiosos de la misma Histoacutericamente cuando se habla de vino su compuesto fenoacutelico prototiacutepico seriacutea el resveratrol En las uvas y en compuestos derivados el resveratrol se encuentra en forma libre o como piceido (resveratrol-3-O-glucoacutesido) en sus respectivas formas isomeacutericas trans y cis Los glucuroacutenidos y sulfatos conjugados del trans y cis-resveratrol se forman en las posiciones 3 y 4rsquo Otros metabolitos del resveratrol descritos son el producto hidroxilado en posicioacuten 3 tambieacuten conocido como piceatannol y el dihidroresveratrol que ha perdido el doble enlace que conecta ambos anillos benceacutenicos No obstante eacutestos se encuentran en proporciones inferiores al trans-resveratrol y trans-piceido que son los que centran la mayor parte de los estudios

El piceido glucoacutesido del resveratrol recibe tanta atencioacuten como la aglicona

(resveratrol) ya que en derivados de las uvas su concentracioacuten es significativamente mayor1 La proporcioacuten relativa entre ambas formas depende de una serie de factores tales como las condiciones de fermentacioacuten2 En un reciente artiacuteculo de revisioacuten3 se comparan los niveles de resveratrol y piceido en vinos tintos de diferentes regiones y se encuentra que eacutestos pueden llegar a contener hasta 143 microgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y 292 microgmiddotmL-1 de trans-piceido es decir que el nivel de trans-piceido puede llegar a ser tres veces superior al del trans-resveratrol En cuanto a los vinos blancos el resveratrol en todas sus formas se encuentra en eacutestos en una concentracioacuten bastante inferior a la encontrada en vinos tintos Los

1 Lamuela Raventos R M Waterhouse A L Methods Enzymol 1999 299184-190 2 Moreno-Labanda J F Mallavia R Peacuterez-Fons L Lizama V Saura D Micol V J Agric Food Chem 2004 525396-5403 3 Stervbo U Vang O Bonnesen C Food Chem 2007 101449-457


154

niveles maacutes elevados de trans-resveratrol que aparecen en la bibliografiacutea4 son del orden de 01 microgmiddotmL-1 Por otro lado debido a la elevada proporcioacuten entre los isoacutemeros trans y los cis se sugiere que estos uacuteltimos pueden aparecer como consecuencia de la exposicioacuten de los vinos a la luz durante su elaboracioacuten o incluso en el almacenamiento5 En cuanto al anaacutelisis de resveratrol y piceido en vino si bien existen meacutetodos de cromatografiacutea de gases que requieren generalmente un paso de derivatizacioacuten pre-columna6 7 o de electroforesis capilar8 9 fundamentalmente se efectuacutea por cromatografiacutea de liacutequidos y como ya se ha mencionado anteriormente en esta memoria la mayoriacutea de los meacutetodos utilizan cromatografiacutea en fase inversa con fases moacuteviles aguametanol o aguaacetonitrilo conteniendo aacutecido aceacutetico o aacutecido foacutermico para fijar la acidez En casi todos los casos se utiliza una elucioacuten en gradiente incluso utilizando dos columnas monoliacuteticas en serie10 y los tiempos de anaacutelisis son elevados Sin embargo cuando se utilizan detectores electroquiacutemicos es maacutes frecuente el uso de la elucioacuten isocraacutetica como en los meacutetodos desarrollados por McMurtrey et al11 y por Kolouchova-Hanzliacutekovaacute et al12 Los sistemas de deteccioacuten maacutes utilizados son los detectores UV de serie de diodos en

4 Siemann EH Creasy LL Am J Enol Vitic 19924349ndash52 5 Lamuela Raventoacutes R M Romero Peacuterez A I Waterhouse A L de la Torre Boronat M C J Agric Food Chem 1995 43281ndash283 6 Goldberg DM Yan J Ng E Diamandis EP Karumanchiri A Soleas GJ Anal Chem 1994 663959-3963 7 Flamini R Dalla Vedona A Rapid Commun Mass Spectrom 2004 181925-1931 8 Brandolini V Maietti A Tedeschi P Durini E Vertuani SManfredini S J Agric Food Chem 2002 507407-7411 9 Demianovaacute Z Sireacuten H Kuldvee R Riekkola ML Electrophoresis 2003 244264ndash4271 10 Abert Vian M Tomao V Gallet S Coulomb PO Lacombe JM J of Chromatogr A 2005 1085224-229 11 Mc Murtrey KD Minn J Pobanz K Schultz TP J Agric Food Chem 1994 422077-2080 12 Kolouchova-Hanzliacutekovaacute I Melzoch K Filip V Šmidrkal J Analytical Nutritional and Clinical Methods 2004 87151-158


155

fila13-17 pero tambieacuten se han usado otros maacutes sensibles y selectivos como los fluorescentes18-20 los ya mencionados electroquiacutemicos21 quimiluminiscentes22 23 o de espectrometriacutea de masas24 a veces acoplados entre siacute25 26 Los meacutetodos de HPLC maacutes sensibles de los encontrados10 16 18 19 23 25 presentan liacutemites de deteccioacuten en el orden de los ngmiddotmL-1 y soacutelo en un caso se reporta un valor de menor orden de magnitud en concreto 02 ngmiddotmL-1 obtenido utilizando deteccioacuten quimiluminiscente22 El objetivo del trabajo de investigacioacuten descrito en este capiacutetulo es el desarrollo de un meacutetodo de cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten fluorescente raacutepido y sencillo que permita analizar el total (trans + cis) de resveratrol y el total de piceido con una mayor sensibilidad que los meacutetodos similares descritos hasta el momento Para ello se planea hacer uso de la transformacioacuten que sufren estos compuestos al irradiarlos con luz UV intensa cuyo resultado son compuestos de eficacia cuaacutentica de fluorescencia muy superior a la de los compuestos de partida

13 Rudolf JL Resurreccion VA Saalia FK Phillips RD Food Chem 2005 89623-638 14 Abert Vian M Tomao V Gallet S Coulomb P O Lacombe JM J Chromatogr A 2005 1085224-229 15 Abril M Negueruela A I Peacuterez C Juan T Estopantildeaacuten G Food Chem 2005 92729ndash736 16 Nikfardjam MSP Laacuteszloacute G Dietrich H Food Chem 20069674ndash79 17 Vitrac X Bornet A Vanderline R Valls J Richard T Delaunay J C Meacuterillon J M Teisseacutedre P L J Agric Food Chem 2005 535664ndash5669 18 Vitrac X Monti JP Vercauteren J Deffieux G Meacuterillon JM Anal Chim Acta 2002 458103-110 19 Pintildeeiro Z Palma M Barroso CG J Chromatogr A 2006 111061ndash65 20 Rodriguez-Delgado MA Gonzaacutelez G Peacuterez-Trujillo JP Garciacutea-Montelongo FJ Food Chem 2002 76371-375 21 Bocchi C Careri M Groppi F Mangia A Manini P Mori G JChromatogr A 1996 753157-170 22 Zhou J Cui H Wan G Xu H Pang Y Duan C Food Chem 2004 88613ndash620 23 Zhang Q Cui H Myint A Lian M Liu L J Chromatogr A 2005 109594ndash101 24 Wang Y Catana F Yang Y Roderick R Van Breemen RB J Agric Food Chem 2002 50431-435 25 Loredana La Torre G Saitta M Vilasi F Pellicanograve T Dugo G Food Chem 2006 94 640ndash650 26 Bravo MN Silva S Coelho AV Vilas Boas L Bronze MR Anal Chim Acta 2006 56384-92


156

Para la optimizacioacuten de las variables cromatograacuteficas se haraacute uso de herramientas quimiomeacutetricas con el objetivo de reducir en lo posible el trabajo experimental RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN Estudios fluorescentes previos Como se ha descrito en los capiacutetulos II y III de esta memoria trans-resveratrol y trans-piceido al igual que sus isoacutemeros cis presentes los cuatro analitos en el vino de forma natural son deacutebilmente fluorescentes En resumen las disoluciones hidroetanoacutelicas de trans-resveratrol y trans-piceido presentan deacutebiles sentildeales de fluorescencia nativa con maacuteximos de excitacioacuten centrados a 225 y 318 nm y 230 y 300 nm respectivamente y maacuteximos de emisioacuten en torno a 385 y 395 nm respectivamente Sin embargo la irradiacioacuten con luz ultravioleta intensa de sus disoluciones hidroalcohoacutelicas tiene como consecuencia primeramente el desplazamiento del equilibrio cisndashtrans totalmente hacia las formas cis de ambos analitos que raacutepidamente desaparecen en favor de nuevos fotoproductos altamente fluorescentes cuyos espectros de fluorescencia estaacuten caracterizados por agudos maacuteximos de excitacioacuten a 260 nm y dos maacuteximos en los espectros de emisioacuten a 364 y 382 nm en el caso de resveratrol y 361 y 380 nm en el caso de piceido Tambieacuten se ha comprobado que las sentildeales de fluorescencia proporcionadas por estos fotoproductos son lineales con la concentracioacuten de resveratrol en las disoluciones originales siendo posible por tanto el anaacutelisis de las cantidades totales (trans- maacutes cis-isoacutemeros) de resveratrol y piceido en las muestras originales a traveacutes de estas sentildeales de fluorescencia fotoinducida


157

En esta memoria se describen distintas estrategias para explotar este comportamiento fotoquiacutemico en favor de la sensibilidad y la selectividad de los meacutetodos para el anaacutelisis de resveratrol y piceido en muestras de vino En este capiacutetulo se persigue el desarrollo de un meacutetodo de cromatografiacutea de liacutequidos con deteccioacuten fluorescente para el anaacutelisis de las cantidades totales de resveratrol y piceido en vino previa irradiacioacuten off-line de las muestras en una laacutempara de mercurio de alta presioacuten En los capiacutetulos anteriores de esta memoria tambieacuten se describe el estudio del efecto de variables tales como la composicioacuten del medio de trabajo en la etapa de irradiacioacuten y medida de fluorescencia y el tiempo de irradiacioacuten de las muestras deducieacutendose que los valores oacuteptimos de ambos paraacutemetros son distintos para ambos analitos Concretamente se dedujo que el rendimiento de las fotorreacciones depende en gran medida del porcentaje de etanol en el medio siendo la composicioacuten oacuteptima del mismo etanolagua 4060 vv agua 100 para resveratrol y piceido respectivamente

Por su parte el tiempo de irradiacioacuten oacuteptimo teniendo en cuenta el rango de concentraciones de trabajo resultoacute ser de 60 y 180 segundos para resveratrol y piceido respectivamente Esto no supone un problema cuando se determinan individualmente sino que en este caso en particular la utilizacioacuten de un tiempo de irradiacioacuten maacutes alto en el caso de piceido supone la eliminacioacuten de la interferencia de resveratrol en su anaacutelisis como ya se ha explicado anteriormente constituyendo esto una gran ventaja

Sin embargo para realizar la determinacioacuten cromatograacutefica simultaacutenea de

resveratrol y piceido en forma de sus fotoproductos en una solo inyeccioacuten es necesario llegar a alcanzar una situacioacuten de compromiso en lo que a estas


158

variables se refiere Teniendo en cuenta por una parte que los niveles de aglicona en vino son menores que los de glucoacutesido y por otra parte la menor polaridad de la moleacutecula de resveratrol y de su fotoproducto y por tanto la mayor retencioacuten en la columna cromatograacutefica (C18) lo que provocaraacute que el efecto de la dispersioacuten sea maacutes notable en este caso se seleccionan unos valores de compromiso para el porcentaje de etanol en el medio de irradiacioacuten y el tiempo de irradiacioacuten maacutes favorables para la formacioacuten del fotoproducto del resveratrol que para la del piceido Se fija un medio de irradiacioacuten etanolagua 4060 vv y un tiempo de irradiacioacuten de 90 segundos para posteriores experimentos La seleccioacuten de un tiempo de irradiacioacuten lejos del oacuteptimo para ambos analitos supone peacuterdida de sensibilidad tanto si es menor que el oacuteptimo caso del piceido ya que el rendimiento de la fotorreaccioacuten es inferior al 100 como si es mayor caso del resveratrol por destruccioacuten del fotoproducto Sin embargo se hace factible la determinacioacuten de ambos conjuntamente Estudios cromatograacuteficos previos Con el objetivo de estudiar los respectivos procesos de transformacioacuten fotoquiacutemica de resveratrol y piceido se prepara en un matraz de 100 mL una disolucioacuten conteniendo 010 mL de sendas disoluciones madre de trans-resveratrol y trans-piceido de 98 y 114 μgmiddotmL-1 39 mL de etanol absoluto y agua ultrapura hasta enrase Se inyectan en el cromatoacutegrafo dos aliacutecuotas de esta disolucioacuten una sin irradiar y una irradiada en la laacutempara de mercurio de alta presioacuten durante 90 segundos Ambas muestras son eluiacutedas isocraacuteticamente con una mezcla acetonitriloaacutecido aceacutetico (32 ) 2278 vv y el eluato se monitoriza fotomeacutetricamente a 306 nm y fluorimeacutetricamente a λexcem 260364 nm longitudes de onda correspondientes respectivamente a los maacuteximos de absorcioacuten de los isoacutemeros trans deacutebilmente fluorescentes y a los maacuteximos de los espectros de


159

fluorescencia de sus respectivos fotoproductos altamente fluorescentes Los cromatogramas correspondientes a esta disolucioacuten patroacuten antes y despueacutes de ser irradiada se recogen en la Figuras 1A y 1B respectivamente

En el perfil fotomeacutetrico obtenido a 306 nm correspondiente a la muestra sin irradiar se observan dos picos cromatograacuteficos a 24 y 61 minutos correspondientes a trans-piceido y trans-resveratrol respectivamente En el perfil fluorimeacutetrico tambieacuten se observan ambos compuestos pero en este caso los picos cromatograacuteficos son muy pequentildeos debido a la deacutebil fluorescencia nativa de los analitos Al irradiar esta disolucioacuten durante 90 segundos en la laacutempara de mercurio de alta presioacuten se observan cambios en los cromatogramas obtenidos tanto fotomeacutetrica como fluorimeacutetricamente En el perfil fotomeacutetrico a 306 nm se produce un decaimiento importante en los picos cromatograacuteficos correspondientes a los isoacutemeros trans asiacute como la aparicioacuten de nuevos picos correspondientes a las formas fluorescentes generadas como consecuencia de la fotorreaccioacuten y a los restos de cis-isoacutemeros Existen dos picos que podriacutean atribuirse al cis-piceido y otros dos para cis-resveratrol tal y como se indica en la Figura 1A Se ha comprobado que cuando la isomerizacioacuten de trans a cis se lleva a cabo en condiciones menos energeacuteticas que las que proporciona esta laacutempara de alta presioacuten se genera un uacutenico compuesto cis a partir de cada trans como se discute en el siguiente capiacutetulo En este caso dada la existencia de maacutes de un pico cuyo espectro de absorcioacuten presenta un maacuteximo a 290 nm tiacutepico de las formas cis puede indicar la formacioacuten de fotoproductos secundarios de la reaccioacuten y que no son necesariamente los cis-isoacutemeros Por comparacioacuten con los resultados obtenidos posteriormente en el capiacutetulo V se postula que trans-piceido y trans-resveratrol son los picos a 39 y 113 minutos respectivamente correspondiendo los picos a 29 y 106 a otros productos de fotodescomposicioacuten de piceido y resveratrol respectivamente Es de destacar que cis-piceido coeluye con FP1 Los


160

resultados maacutes interesantes producidos como consecuencia de la irradiacioacuten se observan en el perfil obtenido al monitorizar fluorimeacutetricamente el eluato a λexcem 260364 nm En dicho perfil se observan tres nuevos picos cromatograacuteficos a 36 49 y 126 minutos

Figura 1- Cromatogramas correspondientes a una muestra conteniendo 098 y 114 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente sin irradiar (mdash) e irradiada durante 90 segundos (mdash) Fase moacutevil acetonitriloaacutecido aceacutetico (32 ) 2278 vv 08 mLmiddotmin-1 UVD a 306 nm (A) y FLD a λexcem 260364 nm (B)

Se comprueba la formacioacuten de un uacutenico fotoproducto fluorescente a partir

de resveratrol en adelante FR responsable del pico cromatograacutefico a 126 minutos de la Figura 1B lo cual estaacute de acuerdo con los resultados previamente publicados por Roggero et al27 Por otra parte los picos cromatograacuteficos a 36 y 49 minutos

27 Roggero JP Garciacutea-Parrilla C Sci Aliments 1995 15411-422

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14t (min)

0

3

6

9

12

15

18

A (3

06 nm

)

0

1

2

3

4

5

F I (λ e

xcem

260

364

)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14t (min)

0

10

20

30

40

F I (λ e

xcem

260

364

)

0

3

6

9

A (30

6 nm

)

A

B

FP1

FP2

FR

trans-piceidotrans-resveratrol

FR

cis-resveratrol

FP2

cis-piceido


161

corresponden a los dos fotoproductos originados a partir de piceido en adelante FP1 y FP2 respectivamente Los espectros de fluorescencia obtenidos en el aacutepice de ambos picos son ideacutenticos y en base a los datos encontrados en la literatura28 que nos permiten asumir que los fotoproductos de la reaccioacuten son derivados del fenantreno es totalmente loacutegica la formacioacuten de dos fotoproductos a partir de

piceido (26-dihidroxifenantreno-4-β-D-glucopiranoacutesido y 46-dihidroxifenantreno-2-

β-D-glucopiranoacutesido) y un uacutenico fotoproducto a partir de resveratrol (246-

trihidroxifenantreno) de acuerdo con los esquemas de reaccioacuten representados en la Figura 2

En la Figura 1B se observa tambieacuten que el pico cromatograacutefico

correspondiente a FP1 es mucho menos intenso que el correspondiente a FP2 Teniendo en cuenta que los espectros de emisioacuten de fluorescencia en el aacutepice de ambos picos son ideacutenticos parece bastante loacutegica la hipoacutetesis de que ambos compuestos son isoacutemeros entre los que la uacutenica diferencia consiste en la distribucioacuten relativa de los grupos hidroxilo y el residuo de glucosa (Figura 2) conservando en ambos casos el esqueleto fenantrenoide responsable maacuteximo del comportamiento fluorescente Partiendo de esta base puede afirmarse que la diferencia entre la intensidad de ambos picos se debe uacutenicamente a que uno de los fotoproductos es maacutes abundante que el otro estando maacutes favorecido en este caso concreto el camino de reaccioacuten que conduce a FP2 que el que desemboca en FP1

Con el objetivo de asignar las estructuras correctas a FP1 y FP2 se llevan

a cabo caacutelculos teoacutericos de energiacutea de enlace y momento dipolar utilizando le meacutetodo semiempiacuterico AM1 mediante el paquete de software HyperChem Los resultados obtenidos de estos caacutelculos se resumen en la Tabla 1 28 Chen YH Chen YL Lin CH J Chromatogr A 2002 943287-294


162

Figura 2- Esquemas sugeridos para las fotorreacciones

Tabla 1- Resultados de los caacutelculos teoacutericos y asignacioacuten de picos

Estructura Energiacutea de enlace (Kcalmiddotmol-1)

Momento dipolar (Debye) Asignacioacuten

OH

OHGlc

O

-524401 1194 FP2

HO

OH

GlcO

-524298 4524 FP1

Para asignar las estructuras presentadas en la Tabla a los picos

correspondientes se ha tenido en cuenta que se estaacute trabajando en fase inversa y por tanto el orden de elucioacuten de los compuestos en principio debe ser inverso a su

HO

OH

OH

OH

OH

HO

OH

OHHO

hν hν

hν hν

OH

OHGlc

O

OH

OHGlc O

OH

OHGlc

O

HO

OH

GlcO


163

orden de polaridad es decir de entre los dos isoacutemeros FP1 y FP2 eluiriacutea en primer lugar el maacutes polar Asiacute a la vista de los valores de momento dipolar calculado se observa que la estructura de FP1 es la que presenta mayor valor de momento dipolar concretamente 4524 D siendo la estructura de FP2 la que presenta menor valor de esta propiedad (1194 D) Ademaacutes los datos de energiacutea de enlace tambieacuten estaacuten de acuerdo con esta asignacioacuten de estructuras ya que la energiacutea de enlace correspondiente a la estructura maacutes polar revela que este compuesto es ligeramente maacutes inestable que su isoacutemero lo que concuerda con las abundancias relativas de ambos compuestos

Dada la mayor intensidad del pico correspondiente a FP2 seraacute este

compuesto el que sea utilizado para la cuantificacioacuten de la cantidad total de piceido a favor de la sensibilidad del meacutetodo En el caso de resveratrol no existen dudas y su cuantificacioacuten en la muestra inicial se llevaraacute a cabo a traveacutes de su uacutenico fotoproducto FR una vez comprobada en ambos casos la linealidad entre las sentildeales obtenidas de estos picos y la concentracioacuten de piceido y resveratrol en la muestra inicial

Antes de proceder a la optimizacioacuten de la composicioacuten de la fase moacutevil para el anaacutelisis de ambos compuestos en vino se lleva a cabo el mismo estudio que se ha descrito hasta ahora en presencia de vino con el objetivo de comprobar la formacioacuten de los mismos fotoproductos en presencia de la matriz Para ello se deposita en un matraz de 100 mL 20 mL de vino tinto fortificado con 98 y 114 μg de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente etanol hasta completar el 40 y agua ultrapura hasta enrase Se inyectan en el sistema cromatograacutefico aliacutecuotas de esta disolucioacuten antes y despueacutes de ser irradiada durante 90 s en la laacutempara de mercurio de alta presioacuten y se procede a su elucioacuten y monitorizacioacuten en ideacutenticas condiciones a las empleadas anteriormente con los patrones Los


164

cromatogramas registrados en los detectores fotomeacutetrico y fluorimeacutetrico en serie se recogen en la Figura 3

Figura 3- Cromatogramas correspondientes a una muestra conteniendo una aliacutecuota de 2 mL de un vino tinto comercial fortificado con 98 y 114 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente en etanol al 40 sin irradiar (mdash) e irradiadas durante 90 segundos (mdash) Fase moacutevil acetonitriloaacutecido aceacutetico (32 ) 2278 vv 08 mLmiddotmin-1 UVD a 306 nm y FLD a λexcem 260364 nm

En las condiciones en las que la separacioacuten se ha llevado a cabo soacutelo el trans-resveratrol es fotomeacutetricamente detectado a 306 nm como un pico totalmente resuelto mientras que trans-piceido coeluye con otros componentes del vino (Figura 3A) Por lo demaacutes se comprueba como la fotorreaccioacuten se da exactamente igual en presencia del vino comprobaacutendose en el perfil de fluorescencia la formacioacuten de FP1 FP2 y FR

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14t (min)

0

20

40

60

80

100

A (3

06 n

m)

0

20

40

60

80

F I (λ e

xcem

260

364

)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14t (min)

2 3 4 5 6 7

07

14212835 trans-piceido

trans-resveratrol

B

A


165

Optimizacioacuten quimiomeacutetrica de la composicioacuten de la fase moacutevil para el anaacutelisis de vino Como se ha descrito en la introduccioacuten de este capiacutetulo en los meacutetodos de cromatografiacutea de liacutequidos previamente propuestos para el anaacutelisis de resveratrol y piceido se lleva a cabo la elucioacuten en gradiente Los disolventes orgaacutenicos maacutes comuacutenmente empleados en estas fases moacuteviles son metanol y acetonitrilo y los aacutecidos aceacutetico y foacutermico son los maacutes empleados para fijar la acidez siendo este uacuteltimo comuacuten a todos los meacutetodos en los que la deteccioacuten se lleva a cabo mediante espectrometriacutea de masas En nuestro caso concreto se ha seleccionado acetonitrilo como componente orgaacutenico de la fase moacutevil debido principalmente a su menor viscosidad menor solubilidad de aire y mayor transparencia en el ultravioleta y aacutecido aceacutetico para fijar la acidez de la fase moacutevil En estas condiciones se procede a la optimizacioacuten de la composicioacuten de una fase moacutevil isocraacutetica acetonitriloaacutecido aceacuteticoagua que proporcione una adecuada resolucioacuten de FR y FP2 del resto de componentes fluorescentes del vino en un tiempo razonable Tambieacuten se ha contemplado como objetivo que la fase moacutevil escogida fuese uacutetil para futuros estudios acerca del proceso de fotodescomposicioacuten en vino y para el desarrollo de un meacutetodo en el que la irradiacioacuten tenga lugar detraacutes de la separacioacuten lo que implica tener en cuenta la resolucioacuten de los picos correspondientes a los isoacutemeros trans del resto de picos debidos a los restantes componentes del vino en el proceso de optimizacioacuten

Se utiliza el disentildeo de experimentos para la optimizacioacuten del porcentaje de aacutecido aceacutetico y disolvente orgaacutenico en la fase moacutevil isocraacutetica Concretamente se emplea un disentildeo central compuesto con el objetivo de calcular simultaacuteneamente el efecto de cada variable asiacute como sus posibles interacciones sobre la funcioacuten de


166

respuesta Este tipo de disentildeo trabaja con cinco niveles para cada variable Tambieacuten incluye tres reacuteplicas de una muestra central lo que da lugar a un total de 11 experimentos (Figura 4) Dicho disentildeo es posee rotatividad lo que implica que la precisioacuten en el caacutelculo de la respuesta es uniforme en todo el rango ensayado de cada variable

Figura 4- Disentildeo central compuesto Niveles ensayados para las variables v Acetonitrilo 1492 17 22 27 2907 v Aacutecido aceacutetico 024 09 25 41 476

Se selecciona la siguiente funcioacuten de respuesta (FR)

donde ΣRs es la suma de los valores de resolucioacuten (Rs) correspondientes a los

picos de FP1 y FP2 (obtenidos en los cromatogramas proporcionados por el detector de fluorescencia FLD) y de trans-resveratrol (obtenidos en los cromatogramas proporcionados por el detector de serie de diodos UVD) respecto a los picos correspondientes a sustancias interferentes del vino krsquo es el factor de capacidad para trans-piceido (UVD) ya que este compuesto es el menos retenido en la columna eluyendo siempre muy cerca del frente y de las interferencias

16 20 24 28 v Acetonitrilo

12

24

36

v

Aacutecid

o Aceacute

tico

16 20 24 28

12

24

36

tRkRF ssum

=middot


167

menos retenidas del vino y t es el tiempo de retencioacuten de uacuteltimo pico FR el cual siempre estaacute resuelto de las interferencias del vino pero cuyo tiempo de retencioacuten es demasiado alto con alguna de las fases moacuteviles ensayadas En el caacutelculo de los valores de funcioacuten de respuesta en los distintos puntos del disentildeo se ha asignado un valor maacuteximo de 15 a Rs para evitar asiacute que este paraacutemetro tenga demasiado peso frente al resto de los incluidos en dicha funcioacuten Es decir si en uno de los puntos del disentildeo alguno de los picos correspondientes a los compuestos FP1 FP2 o trans-resveratrol presentara un valor muy alto de la resolucioacuten mientras que los otros no estuvieran resueltos y se incluyera el valor obtenido para ese pico en la funcioacuten de respuesta se obtendriacutea un valor elevado para la funcioacuten en esas condiciones experimentales lo que conduciriacutea a la eleccioacuten de unas condiciones oacuteptimas que no suponen una solucioacuten real al problema Se prepara en un matraz de 250 mL una disolucioacuten conteniendo 50 mL de vino tinto (12 etanol) voluacutemenes de sendas disoluciones madre conteniendo 98 y 114 μg de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente etanol hasta completar 100 mL y agua ultrapura hasta enrase En cada una de las condiciones cromatograacuteficas marcadas por el disentildeo se inyectan en el sistema cromatograacutefico sendas aliacutecuotas de dicha disolucioacuten una sin irradiar y otra irradiada durante 90 segundos en la laacutempara de mercurio de alta presioacuten y se procede a su elucioacuten El flujo se mantiene en todo momento constante a 08 mLmiddotmin-1 y el eluato se monitoriza fotomeacutetrica y fluorimeacutetricamente a 306 nm y λexcem 260364 nm respectivamente Los valores de factor de capacidad del pico de trans-piceido y resolucioacuten del pico de trans-resveratrol se calculan sobre el cromatograma obtenido fotomeacutetricamente a 306 nm de la muestra sin irradiar y los paraacutemetros correspondientes a las formas fluorescentes sobre el cromatograma de la muestra irradiada obtenido mediante deteccioacuten fluorimeacutetrica


168

Los resultados se interpretan con la Metodologiacutea de la Superficie de Respuesta y la optimizacioacuten del modelo se lleva a cabo con el paquete de software THE UNSCRAMBLER (Unscrambler v 611 CAMO AS Olav Tryggvasonsgt N-7011 Trondheim Norway) En el correspondiente anaacutelisis de la varianza (ANOVA) se asume un modelo cuadraacutetico de segundo grado (Model Check Quadratic valor p (95 ) = 00004) El valor de p calculado (95 ) para la falta de ajuste (Lack of Fit) 00760 indica que eacutesta no es significativa a un nivel de confianza del 95 y que por tanto el modelo describe adecuadamente la forma real de la superficie de respuesta Por otra parte aplicando el ANOVA al anaacutelisis de los valores p para las variables estudiadas se deduce que el porcentaje de acetonitrilo (p-value = 00002) asiacute como el teacutermino cuadraacutetico ACN - ACN (p-value = 00002) y la interaccioacuten ACN - aceacutetico (p-value = 00010) contribuyen significativamente al modelo para un nivel de confianza del 95 Sin embargo el efecto aceacutetico (p-value = 00639) y el teacutermino cuadraacutetico aceacutetico - aceacutetico (p-value = 00539) no son significativas para el modelo al nivel de confianza considerado

Figura 5- Superficie de respuesta estimada para el par de efectos estudiados


169

En la Figura 5 se muestra la superficie de respuesta estimada por el modelo para el par de variables consideradas Las variables estudiadas toman en el maacuteximo de esta superficie valores de 19 de acetonitrilo y 33 de aacutecido aceacutetico Una vez deducida la composicioacuten oacuteptima de la fase moacutevil se ensayan distintos caudales comprendidos entre 06 y 12 mLmiddotmin-1 Se aprecia que caudales inferiores a 08 mLmiddotmin-1 suponen un aumento del tiempo de anaacutelisis sin que se consiga aumentar la eficacia de la separacioacuten mientras que caudales por encima de este valor implican peacuterdida de la eficacia y unas presiones demasiado elevadas seleccionaacutendose finalmente un valor de 08 mLmiddotmin-1 para esta variable Por tanto se fijan las siguientes condiciones para futuras experiencias

Fase moacutevil acetonitriloaacutecido aceacutetico (41 ) 1981 vv Flujo = 080 mLmin Deteccioacuten fluorimeacutetrica λexcem 260364 nm

En estas condiciones como se muestra en la Figura 6 los tres fotoproductos

fluorescentes son eluidos resueltos a liacutenea base en menos de 20 minutos Siendo los tiempos de retencioacuten y factores de capacidad para FP1 FP2 y FR 51 73 y 179 minutos y 27 44 y 122 respectivamente

Figura 6- Cromatograma (FLD λexcem 260364 nm) correspondiente a una muestra patroacuten conteniendo 290 y 340 ngmiddotmL-1 de resveratrol y piceido respectivamente irradiada durante 90 segundos en la laacutempara de mercurio de alta presioacuten y eluiacuteda en las condiciones determinadas como oacuteptimas

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20t (min)

0

4

8

12

16

F I

(λex

cem 2

6036

4)

FP1

FP2

FR


170

Validacioacuten del meacutetodo Paraacutemetros analiacuteticos de calidad Una vez optimizadas las variables implicadas en la separacioacuten cromatograacutefica se procede a estudiar la linealidad entre las aacutereas de los picos correspondientes a FP2 y FR y la concentracioacuten de piceido y resveratrol respectivamente en la muestra original

Para evaluar la linealidad del meacutetodo se prepara una serie de disoluciones estaacutendar conteniendo entre 100 y 1000 ngmiddotmL-1 de cada analito Cada una de estas mezclas patroacuten se irradia durante 90 segundos en la laacutempara de mercurio de alta presioacuten se introduce por triplicado en el sistema cromatograacutefico y se eluye en las condiciones previamente determinadas como oacuteptimas La cuantificacioacuten de resveratrol y piceido totales en las muestras originales en teacuterminos de trans-resveratrol y trans-piceido se lleva a cabo a traveacutes de los picos cromatograacuteficos correspondientes a FR y FP2 respectivamente Los paraacutemetros analiacuteticos de calidad correspondientes a la determinacioacuten cromatograacutefica de ambos analitos utilizando en aacuterea de los picos como sentildeal analiacutetica se recogen en la Tabla 2 Los liacutemites de deteccioacuten (LOD) y cuantificacioacuten (LOQ) se obtienen como 3 y 10 veces respectivamente la relacioacuten sentildealruido Para ello se mide la amplitud de la liacutenea base en los cromatogramas correspondientes a los patrones empleados en el establecimiento de la recta de calibrado en varias zonas en intervalos de aproximadamente dos minutos Dicha amplitud se multiplica por 3 o por 10 y se transforma en unidades de concentracioacuten de trans-resveratrol o trans-piceido a traveacutes de rectas de calibrado construidas para cada analito empleando en este caso como sentildeal analiacutetica la altura de pico


171

Para evaluar la repetitividad del meacutetodo se realizan once inyecciones sucesivas de una disolucioacuten conteniendo 490 y 570 ngmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente irradiada durante 90 segundos

Tabla 2- Paraacutemetros analiacuteticos de calidad para la determinacioacuten cromatograacutefica de resveratrol y piceido

Resveratrol Piceido

Rango de concentracioacuten examinado(ngmiddotmL-1) 1-1000 1-1000

Ordenada en el Origen (a plusmn sa) 125 plusmn 25 736 plusmn 156

Pendiente (b plusmn sb) (mLmiddotng-1) 122 plusmn 001 0732 plusmn 0004



Resolucioacuten Analiacutetica (γ-1) (ngmiddotmL-1) 1009 1054

LOD (SN=3) (ngmiddotmL-1) 029 028

LOQ (SN=10) (ngmiddotmL-1) 097 095

Repetitividad ( RSD)a 95 46 a n=11 490 y 570 ngmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente

Determinacioacuten de las cantidades totales de resveratrol y piceido en muestras de vino El meacutetodo previamente optimizado y validado en teacuterminos de linealidad liacutemites de deteccioacuten y repetitividad se aplica al anaacutelisis de las cantidades totales de resveratrol y piceido (trans + cis) en muestras de vino En primer lugar se realiza una adicioacuten patroacuten sobre una muestra de vino tinto comercial con el objetivo de determinar si existe o no efecto de matriz y calcular las recuperaciones de cada analito a los distintos niveles de concentracioacuten


172

En la Figura 7 se representan las rectas de calibrado y adicioacuten patroacuten para resveratrol y piceido (noacutetese que las concentraciones que figuran en el eje de las abscisas no son concentraciones en vino sino en las disoluciones inyectadas en el cromatoacutegrafo) Como puede apreciarse en dicha Figura y se ratifica por aplicacioacuten de los tests estadiacutesticos de comparacioacuten de pendientes se deduce que las pendientes de cada par de rectas son indistinguibles a un nivel de confianza del 95

Figura 7- Rectas de patrones externos (mdashmdash) y adicioacuten patroacuten (mdashmdash) para resveratrol (izquierda) y piceido (derecha)

Las pendientes de las rectas de calibrado y adicioacuten patroacuten no presentan

diferencias significativas a un nivel de confianza del 95 deducieacutendose por tanto que no existe efecto de matriz y que la determinacioacuten de las cantidades totales de resveratrol y piceido en muestras de vino puede hacerse mediante calibracioacuten por patrones externos Efectivamente si se calculan los valores de recuperacioacuten para las muestras fortificadas usando para ello las rectas de calibrado de patrones externos (Tabla 3) se obtienen resultados muy satisfactorios estando en todos los casos los valores de recuperacioacuten en torno al 100

0 04 08 12[trans-resveratrol] (μgmiddotmL-1)

0

500

1000

1500

2000

2500

Aacuterea

FR

0 04 08 12[trans-piceido] (μgmiddotmL-1)

0

500

1000

1500

2000

2500

Aacuterea

FP2


173

Tabla 3- Resultados del procedimiento cromatograacutefico para la determinacioacuten de las cantidades totales de resveratrol y piceido en vino tinto utilizando la calibracioacuten por adicioacuten patroacuten

amedia plusmn SD (n=2)

Por tanto el procedimiento cromatograacutefico que se propone para determinar el resveratrol y el piceido totales en vino a traveacutes de la medida de sus fotoproductos es En un matraz de 100 mL se antildeaden 200 mL de vino (12 v etanol) 375 mL de etanol absoluto y agua ultrapura hasta enrase Se transfiere una aliacutecuota de la disolucioacuten resultante a una cubeta de cuarzo y se irradia durante 90 s en una laacutempara de mercurio de alta presioacuten Se inyectan 20 μL de la disolucioacuten irradiada en el sistema cromatograacutefico previa filtracioacuten a traveacutes de una membrana de nylon de 022 μm y se procede a su elucioacuten isocraacuteticamente con acetonitriloaacutecido aceacutetico (41 ) 1981 vv con un flujo de 080 mLmiddotmin-1 El eluato se monitoriza fluorimeacutetricamente a λexcem 260 364 nm La cuantificacioacuten de resveratrol y piceido se hace mediante patroacuten externo a traveacutes de los picos cromatograacuteficos de FR (179 minutos) y FP2 (73 minutos) respectivamente

RESVERATROL PICEIDO Puesto en vino

(μgmL-1)

Encontrado en vino

(μgmL-1)a Recuperacioacuten

()a Puesto en vino

(μgmL-1)

Encontrado en vino


()a

000 212plusmn004 mdashmdash 000 3154plusmn039 mdashmdash

102 374plusmn011 119plusmn4 111 3498plusmn019 107plusmn1





174

El meacutetodo propuesto se aplica entonces al anaacutelisis de distintas muestras de vino comerciales La totalidad de las muestras de las que se dispone se divide en tres grandes grupos

-Vinos tintos joacutevenes -Vinos tintos de crianza -Vinos blancos y se prepara dentro de cada grupo una mezcla conteniendo voluacutemenes ideacutenticos de todos lo vinos que integran ese grupo Se toman 20 mL de cada una de las mezclas y se llevan a un volumen final de 100 mL con agua ultrapura y etanol en una proporcioacuten final del 40 Se preparan tres reacuteplicas por pool que se irradian durante 90 segundos y se analizan en las condiciones previamente optimizadas Los cromatogramas correspondientes a cada uno de estas mezclas obtenidos monitorizando fluorimeacutetricamente (λexcem = 260364 nm) el eluato se recogen en la Figura 8 en comparacioacuten con el correspondiente a una disolucioacuten patroacuten conteniendo 290 y 340 ngmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente Los resultados obtenidos en el anaacutelisis de cada uno de estas mezclas se resumen en la Tabla 4 en unidades de trans-resveratrol y trans-piceido

Tabla 4- Resultados obtenidos en el anaacutelisis de las cantidades totales de resveratrol y piceido en distintas muestras de vino expresados como concentracioacuten de los trans-isoacutemeros

Tinto Joven Tinto Crianza Blanco

Resveratrol Total en vino (ngmiddotmL-1 de trans-resveratrol)a 028 plusmn 001 027 plusmn 002 015 plusmn 001

Piceido Total en vino (ngmiddotmL-1 de trans-piceido)a 072 plusmn 005 076 plusmn 008 020 plusmn 001



175

Figura 8- Cromatogramas (FLD λexcem 260364 nm) correspondientes a un patroacuten conteniendo 290 y 340 ngmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente (mdashmdash) y a un pool de vino tinto joven (A mdashmdash) tinto de crianza (B mdashmdash) y blanco (C mdashmdash) oportunamente diluidos irradiados durante 90 segundos y eluidos en las condiciones oacuteptimas

Se observa que ademaacutes de los picos debidos a los compuestos de intereacutes aparece un pico de gran magnitud a un tiempo de retencioacuten cercano a los 8 min No hemos encontrado datos bibliograacuteficos que orienten acerca de la naturaleza del

0 4 8 12 16 20t (min)

0

20

40

60

80

I F (λ e

xcem

2603

64)

0 4 8 12 16 20t (min)

0

20

40

60

80

I F (λ e

xcem

2603

64)

0 4 8 12 16 20t (min)

0

20

40

60

80

I F (λ e

xcem

2603

64)

A

B

C

16 20

1

6 8 10

0

5

FP1FP2

FR


176

compuesto responsable de este pico y tampoco corresponde a ninguno de los compuestos fluorescentes el vino de los que se disponiacutea de patrones

Por otro lado en ciertas muestras de vino se encuentra que aparece otro pico cromatograacutefico muy cercano al pico de FP2 como se aprecia en el ejemplo mostrado en la Figura 9A Figura 9- (A) Porcioacuten de los cromatogramas (FLD λexcem 260364 nm) correspondientes a una muestra patroacuten conteniendo 290 y 340 ngmiddotmL-1 de resveratrol y piceido respectivamente (mdash) y de los obtenidos a λem 348 (mdash) y 369 nm (mdash) (λexc 260 nm) para un vino tinto comercial asiacute como el cromatograma diferencia entre ellos (mdash) (B) Espectros de emisioacuten (λexc 260 nm) obtenidos on-line en los puntos marcados en el cromatograma Sin embargo los espectros de emisioacuten de fluorescencia del compuesto interferente y de FP2 se encuentran ligeramente desplazados entre ellos como se muestra en la Figura 9B lo que hace posible eliminar la contribucioacuten de este interferente tomando como sentildeal analiacutetica la diferencia entre las aacutereas de los picos obtenidos empleando como longitudes de onda de emisioacuten 369 y 348 nm (λexc = 260 nm) que se corresponden con puntos isoemisivos en el espectro de emisioacuten del interferente pero no en el de FP2 De manera que como se ve en la Figura 9A el cromatograma diferencia estaacute totalmente limpio de interferencia

65 7 75 8t (min)

0

20

40

60

80

I F (λ e

xcem

2603

64)

280 320 360 400 440λ (nm)

0

4

8

12

16

20

I F

A B


177

Asiacute para la construccioacuten de la recta de calibrado en estas condiciones se ha de hacer uso de la opcioacuten de multiemisioacuten en la configuracioacuten del detector de fluorescencia y monitorizar el eluato a una longitud de onda de excitacioacuten constante de 260 nm y a longitudes de onda de emisioacuten de 369 y 348 nm Una vez obtenido el conjunto de cromatogramas de las disoluciones patroacuten se construye la recta de calibrado tomando como sentildeal analiacutetica la diferencia de aacutereas del pico FP2 obtenido en ambos canales de emisioacuten De esta manera se obtiene una buena relacioacuten lineal entre sentildeal analiacutetica medida y concentracioacuten de analito en el mismo rango de concentraciones indicado en la Tabla 2

Perspectivas de futuro Para la identificacioacuten inequiacutevoca de los fotoproductos seriacutea conveniente el uso de teacutecnicas acopladas LC-MS a las que auacuten no tenemos acceso pero con las que se planea contar en el futuro Otro reto es la identificacioacuten del compuesto fluorescente responsable del pico maacutes intenso que aparece en los cromatogramas del vino en las condiciones de excitacioacuten y emisioacuten de los fotoproductos de resveratrol y piceido

CAPIacuteTULO V

ANAacuteLISIS DE LOS ISOacuteMEROS DE RESVERATROL Y PICEIDO EN VINOS MEDIANTE HPLC ISOCRAacuteTICA CON

DETECCIOacuteN FLUORESCENTE PREVIA DERIVATIZACIOacuteN POST-COLUMNA EN LIacuteNEA

CAPIacuteTULO V Isoacutemeros de resveratrol y piceido mediante HPLC y derivatizacioacuten on-line

180


181

ANTECEDENTES

Las dos metas generales de cualquier teacutecnica de derivatizacioacuten son 1- incrementar la sensibilidad den la deteccioacuten normalmente introduciendo

los cromoacuteforos o fluoroacuteforos adecuados o generando compuestos derivados de los originales maacutes faacutecilmente detectables

2- incrementar la selectividad aplicando una reaccioacuten de derivatizacioacuten especiacutefica de los compuestos de intereacutes en la matriz compleja

En muchos casos las reacciones de derivatizacioacuten llevan consigo la adicioacuten

de reactivos a la disolucioacuten conteniendo el analito con el objetivo de transformar eacuteste en una forma maacutes faacutecil de detectar Las reacciones que se llevan a cabo entre el analito y el agente derivatizante son normalmente de esterificacioacuten acilacioacuten silanizacioacuten dansilacioacuten etc

Cuando el reactivo es la luz el procedimiento se llama derivatizacioacuten

fotoquiacutemica La luz se considera uno de los agentes derivatizantes maacutes baratos y normalmente las reacciones fotoquiacutemicas son reacciones simples requiriendo de instrumentacioacuten muy sencilla muy limpias y en las que no se da dilucioacuten del analito ya que este reactivo derivatizante no implica la adicioacuten de disolventes Con respecto al tipo de reacciones que pueden ser iniciadas por activacioacuten fotoquiacutemica se pueden citar reacciones de oxidacioacuten reduccioacuten fotolisis fotohidrolisis fotoionizacioacuten reordenamientos moleculares adicioacuten eliminacioacuten isomeriacutea ciclacioacuten polimerizacioacuten etc

Inicialmente los meacutetodos basados en reacciones fotoquiacutemicas como

sistemas de derivatizacioacuten se llevaban a cabo siempre en reacutegimen estacionario y los primeros intentos de combinar los procesos fotoquiacutemicos con sistemas


182

dinaacutemicos continuos como son los meacutetodos cromatograacuteficos fueron realizados en 1976 por Iwaoka y Tannenbaum1 Estos autores realizan un acoplamiento en liacutenea de un fotorreactor con un sistema de cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten situando el fotorreactor detraacutes de la columna analiacutetica y llevan a cabo la determinacioacuten de derivados N-nitrosos mediante hidroacutelisis a nitritos por irradiacioacuten con luz ultravioleta de longitud de onda larga El tiempo de irradiacioacuten era excesivamente largo y la sensibilidad no se mejoraba en exceso Twitchett et al2 obtienen en 1978 resultados maacutes alentadores determinando cannabinol en fluidos corporales sin necesidad de realizar un tratamiento previo de la muestra y con un liacutemite de deteccioacuten de aproximadamente 05 ng

A partir de aquiacute se han ampliado en gran medida las aplicaciones de este

tipo de sistemas para la mejora de la deteccioacuten En 1999 Lores et al3 publican un artiacuteculo de revisioacuten donde se recogen varias aplicaciones en anaacutelisis por inyeccioacuten en flujo (FIA) y HPLC asiacute como las principales tendencias en instrumentacioacuten y aspectos teacutecnicos Respecto a los compuestos analizados merece la pena resaltar diversos principios farmacoloacutegicos marcadores bioloacutegicos pesticidas componentes naturales en alimentos e incluso trazas de metales en matrices cada vez maacutes complejas

Como ya se ha descrito en capiacutetulos anteriores los trans-isoacutemeros de resveratrol y piceido apenas presentan fluorescencia nativa Cuando sus disoluciones son irradiadas con radiacioacuten UV los trans-isoacutemeros se transforman en los respectivos isoacutemeros cis tambieacuten poco fluorescentes que raacutepidamente evolucionan hacia compuestos altamente fluorescentes En concreto FP1 y FP2

1 Iwaoka W Tannenbaum S R IARC Sci Publ 1976 1451-56 2 Twitchett PJ Williams PL Moffat AC J Chromatogr A 1978 149683-691 3 Lores M Cabaleiro O Cela R Trends in Anal Chem 1999 18392-400


183

son generados a partir de piceido siendo FR el fotoproducto fluorescente de resveratrol

Este tipo de fotoreaccioacuten es idoacutenea para ser acoplada en liacutenea en un

sistema cromatograacutefico y asiacute poder llevar a cabo el anaacutelisis de los isoacutemeros trans y cis presentes inicialmente en la muestra de manera sensible con un meacutetodo en el que la manipulacioacuten de la muestra es miacutenima Asiacute pues el objetivo de este capiacutetulo es aprovechar este comportamiento fotoquiacutemico y disentildear un sistema de irradiacioacuten post-columna en liacutenea para proponer un meacutetodo isocraacutetico sencillo que permita la determinacioacuten de trans y cis resveratrol y piceido en muestras de vino de diferente naturaleza

En el Esquema 1 se muestra la disposicioacuten del sistema cromatograacutefico con

el fotorreactor acoplado Como puede observarse eacuteste se situacutea detraacutes de la columna concretamente entre los detectores fotomeacutetrico y fluorimeacutetrico de manera que las fotorreacciones tendraacuten lugar despueacutes de la separacioacuten cromatograacutefica La principal ventaja de esta disposicioacuten frente al meacutetodo cromatograacutefico descrito en el capiacutetulo anterior es la posibilidad de determinar las concentraciones relativas para cada par de isoacutemeros trans y cis en la muestra original

Una vez que se ha decidido el esquema de la fotoderivatizacioacuten el

siguiente paso es la construccioacuten del fotorreactor propiamente dicho Comercialmente estaacuten disponibles algunos modelos pero normalmente se suele hacer uso de fotorreactores de fabricacioacuten casera Por otra parte cuando se disentildea alguacuten aparato para acoplarlo a un sistema cromatograacutefico debe prestarse particular atencioacuten a su posible efecto sobre la integridad de dicho sistema Asiacute reactores con un excesivo volumen muerto y caracteriacutesticas de flujo muy pobres pueden causar peacuterdida en la eficacia de la separacioacuten


184

En la construccioacuten de un reactor fotoquiacutemico estaacuten implicados dos componentes fundamentales

bull El primero es el reactor para el cual se han descrito dos disentildeos fundamentales de paso de flujo y envolvente En el primero el eluato pasa a traveacutes de una ceacutelula de flujo de volumen interno pequentildeo la cual se irradia externamente mientras que en el segundo un tubo de tefloacuten se enrolla helicoidalmente sobre la fuente de irradiacioacuten de manera que la fotorreaccioacuten se estaraacute dando mientras que el analito de intereacutes circule por este tubo La principal desventaja de los sistemas envolventes es que los voluacutemenes muertos suelen ser mayores que en los sistemas de paso de flujo No obstante la experiencia demuestra que el enrollado helicoidal del tubo es la mejor solucioacuten para los efectos de dispersioacuten y engrosamiento de bandas de manera que este sistema es el maacutes utilizado

bull El segundo componente del fotorreactor es la fuente de luz la cual estaacute caracterizada por una longitud de onda de radiacioacuten intensidad tamantildeo y geometriacutea de la laacutempara como caracteriacutesticas maacutes importantes a tener en cuenta Tradicionalmente se han venido utilizando muchos tipos de laacutemparas como son las laacutemparas de arco de alta media y baja presioacuten conteniendo normalmente mercurio xenon o una mezcla de ambos las laacutemparas de deuterio y de hidroacutegeno asiacute como laacutemparas fluorescentes germicidas o incluso laacuteseres


185

En nuestro caso el fotorreactor se ha construido enrollando helicoidalmente 3 m de tubo de tefloacuten de 03 mm de diaacutemetro interno sobre una laacutempara de xenon de 4 W El conjunto se guarda dentro de una caja metaacutelica recubierta interiormente de papel de aluminio como sistema reflectante para aumentar asiacute la efectividad de la laacutempara (Figura 1)

Esquema 1- Esquema del instrumento de LC con derivatizacioacuten fotoquiacutemica post-columna

Figura 1- Fotorreactor utilizado


186

RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN Estudios Fluorescentes Previos La gran mayoriacutea de los meacutetodos propuestos para el anaacutelisis de resveratrol y piceido en vino mediante LC trabajan en fase inversa y llevan a cabo la elucioacuten en gradiente mediante la introduccioacuten progresiva de metanol o acetonitrilo sobre disoluciones diluidas de aacutecido aceacutetico (o foacutermico cuando se emplea la espectrometriacutea de masas como sistema de deteccioacuten)

En nuestro caso ya que se va a desarrollar una fotorreaccioacuten on-line es muy importante la eleccioacuten tanto del aacutecido empleado para fijar el pH de la fase moacutevil como del disolvente orgaacutenico Se trataraacute de encontrar unas condiciones que favorezcan tanto la formacioacuten de los fotoproductos como el rendimiento cuaacutentico de fluorescencia de los mismos Por ello inicialmente se llevaraacuten a cabo una serie de estudios previos mediante espectroscopia de fluorescencia

Con respecto a la acidez del medio ya se ha puesto de manifiesto en los

capiacutetulos anteriores que la fotorreaccioacuten transcurre en medio aacutecido y ademaacutes el rendimiento cuaacutentico de fluorescencia de los fotoproductos no se ve alterado como consecuencia de la presencia de una alta concentracioacuten de protones en el medio Se ha comprobado que la presencia de los aacutecidos orgaacutenicos tales como aceacutetico y foacutermico afecta negativamente al proceso por lo que se elige el H3PO4 como aacutecido para controlar el pH de la fase moacutevil

Con respecto al disolvente orgaacutenico a utilizar para preparar la fase moacutevil

teniendo en cuenta los antecedentes bibliograacuteficos se plantean dos posibilidades metanol o acetonitrilo Mediante espectroscopiacutea de fluorescencia se comprueba el


187

efecto de ambos modificadores sobre la fotorreaccioacuten Para ello se prepara una serie de disoluciones conteniendo 034 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol en presencia de distintas proporciones de acetonitrilo o metanol y se registran sus espectros de emisioacuten (λexc = 260 nm) tras ser irradiadas de manera acumulativa 30 60 y 90 segundos bajo una laacutempara de mercurio de alta presioacuten Las sentildeales obtenidas se representan en la Figura 2 observaacutendose que tanto la velocidad de la fotorreaccioacuten como la maacutexima sentildeal de fluorescencia fotoinducida alcanzada son ligeramente superiores en presencia de acetonitrilo por lo que se elige este disolvente como modificador de la fase moacutevil

Figura 2- Influencia del tiempo de irradiacioacuten para disoluciones conteniendo 034 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol en presencia de distintas proporciones de metanol o acetonitrilo

Estudios Cromatograacuteficos Previos

Una vez seleccionado el aacutecido para fijar el pH de la fase moacutevil y el modificador orgaacutenico se comienza con los estudios cromatograacuteficos Se prepara una disolucioacuten que en un volumen final de 250 mL contiene 102 y 111 μgmiddotmL-1

0 20 40 60 80 100Tiempo de Irradiacioacuten (s)

0

20

40

60

80

I F (

λ exce

m 260

364 n

m)

10 ACN20 ACN40 ACN10 MeOH20 MeOH40 MeOH


188

de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente y agua ultrapura hasta enrase Se inyecta en el sistema cromatograacutefico una aliacutecuota de esta disolucioacuten y se eluye isocraacuteticamente con una mezcla acetonitriloagua 1981 vv y una velocidad de flujo de 080 mLmiddotmin-1 Se realizan dos inyecciones de la misma una con el fotorreactor apagado y otra con eacutel encendido para comprobar la eficacia de la fotorreaccioacuten El eluato se monitoriza fotomeacutetricamente a 306 nm y fluorimeacutetricamente a λexcem = 260364 nm y los cromatogramas registrados con ambos detectores se recogen en la Figura 3

Figura 3- Cromatogramas correspondientes a una mezcla conteniendo 102 y 111 μgmiddotmL-

1 de trans-resveratrol y trans-piceido (A) Perfil DAD a 306 nm y (B) FLD a λexcem 260364 nm con el fotorreactor encendido (mdashmdash) y apagado (mdashmdash)

En ausencia de fotorreaccioacuten en ambos detectores se observan dos picos cromatograacuteficos correspondientes a trans-piceido y trans-resveratrol respectivamente Los tiempos de retencioacuten son 44 y 149 minutos en el detector de

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18tiempo (min)

0

2

4

6

8

I F (

λ exce

m 260

364 n

m)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18tiempo (min)

0

4

8

12

A (3

06 nm

)

trans-Piceido

trans-Resveratrol

A

B

trans-Piceido trans-Resveratrol

(trans-Piceido)hν

(trans-Resveratrol)hν


189

diodos y aumentan ligeramente en el detector fluorescente 49 y 154 min debido al fotorreactor que separa ambas ceacutelulas de deteccioacuten cuya longitud es de tres metros que produce un retardo de 045 minutos entre ambos perfiles Cuando se lleva a cabo una segunda inyeccioacuten con el fotorreactor encendido se produce una ganancia sustancial en la intensidad de los picos observados fluorimeacutetricamente lo que indica que los fotoproductos originados a partir de ambos analitos han sido satisfactoriamente obtenidos al menos en cierta extensioacuten

Para estudiar el efecto de la presencia de H3PO4 tanto en el rendimiento

de la fotorreaccioacuten que ambos compuestos sufren en liacutenea como en el rendimiento cuaacutentico de fluorescencia de los fotoproductos generados se prepara una disolucioacuten acuosa conteniendo 102 y 111 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente Esta disolucioacuten se conserva en la oscuridad hasta el momento de ser inyectada en el cromatoacutegrafo y se eluye isocraacuteticamente con distintas fases moacuteviles conteniendo todas ellas un 190 de acetonitrilo y porcentajes variables de H3PO4 entre 0 y 0050 resultando un pH aparente final para estas fases moacuteviles de 442 282 250 y 228 respectivamente El flujo de la fase moacutevil se mantiene a 080 mLmiddotmin-1 y el fotorreactor permanece encendido en todo momento de manera que fotomeacutetricamente se observaraacuten los compuestos

trans originales y fluorimeacutetricamente sus respectivos fotoproductos Para ello el

eluato se monitoriza fotomeacutetricamente a 306 nm y fluorimeacutetricamente a λexcem = 260364 nm Los cromatogramas obtenidos en el detector fluorescente se representan en la Figura 4 donde se puede observar que la presencia de H3PO4 en la fase moacutevil origina una ligera disminucioacuten en el rendimiento cuaacutentico de los fotoproductos Por otra parte se aprecia que los tiempos de retencioacuten disminuyen a medida que aumenta el porcentaje de aacutecido


190

Figura 4- Influencia del porcentaje de H3PO4 0 (mdashmdash) 0010 (mdashmdash) 0025 (mdashmdash) y 0050 (mdashmdash) [trans-resveratrol] = 102 μgmiddotmL-1 [trans-piceido] = 111 μgmiddotmL-1 velocidad de flujo = 080 mlmiddotmin-1

Para finalizar este apartado de estudios previos es muy importante remarcar el hecho de que no se pueden utilizar filtros de nylon para filtrar disoluciones conteniendo resveratrol o piceido como trans- o cis-isoacutemeros previamente a su inyeccioacuten en el sistema cromatograacutefico ya que se ha comprobado que el 100 de los analitos resulta retenido en dicha membrana Por ello a lo largo de todo este capiacutetulo se utilizan filtros de membranas hidrofoacutebicas de politetrafluoretileno (PTFE) (Millexreg-FG) para filtrar las muestras Optimizacioacuten quimiomeacutetrica de las condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis isocraacutetico de trans-resveratrol y trans-piceido en muestras de vino A la hora de optimizar las condiciones cromatograacuteficas se han tenido en cuenta tanto los paraacutemetros relacionados con la separacioacuten cromatograacutefica como los que influyen en la fotorreaccioacuten

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18tiempo (min)

0

2

4

6

8

I F (

λ exce

m 260

364 n

m)

4 45 5 550

2

4

6


191

Asiacute como variables quiacutemicas se seleccionan las proporciones relativas de H3PO4 y de modificador como variables a optimizar

Por otra parte la reaccioacuten de derivatizacioacuten que tendraacute lugar en liacutenea es

una fotorreaccioacuten de manera que la luz ultravioleta proporcionada por la laacutempara puede ser considerada como reactivo derivatizante cuya concentracioacuten podraacute ser controlada a traveacutes del tiempo de residencia de los analitos en el fotorreactor esto es a traveacutes de la longitud del fotorreactor o bien a traveacutes del caudal de la fase moacutevil si se mantiene constante la longitud Por ello la sensibilidad del meacutetodo estaraacute directamente relacionada con el caudal de fase moacutevil siendo eacutesta la tercera variable a optimizar Por otra parte esta variable tambieacuten incidiraacute sobre el resultado de la separacioacuten cromatograacutefica

Se intenta encontrar una fase moacutevil que mediante elucioacuten isocraacutetica

permita la determinacioacuten de estos analitos en muestras de vino y para la optimizacioacuten de su composicioacuten se haraacute uso de la estadiacutestica multivariante a traveacutes del disentildeo experimental y la metodologiacutea de la superficie de respuesta Se utiliza concretamente un disentildeo central compuesto con el objetivo de calcular de forma simultaacutenea el efecto de la variacioacuten de cada una de las variables a optimizar asiacute como las posibles interacciones entre ellas Se ensayan cinco niveles para cada variable Existen tambieacuten tres muestras centrales dando lugar a un total de 17 experiencias El disentildeo presenta rotatividad lo que implica que la precisioacuten en el caacutelculo de la respuesta es uniforme en todo el rango experimental

Los rangos considerados para cada una de las tres variables a optimizar

son


192

- v acetonitrilo en la fase moacutevil 25 ndash 15 - v H3PO4 en la fase moacutevil 001 ndash 005 - Flujo 050 ndash 150 mLmiddotmin-1 La eleccioacuten de estos rangos estaacute justificada por diversos motivos el

porcentaje de acetonitrilo se variacutea alrededor de un valor central del 20 que fue el valor oacuteptimo deducido en estudios anteriores (Capiacutetulo IV) Con respecto al porcentaje de H3PO4 se elige como valor inferior 001 ya que por debajo de eacuteste la capacidad tamponadora de la fase moacutevil seriacutea miacutenima y un valor superior del 005 el cual origina una fase moacutevil ya muy aacutecida cuyo pH se calcula en torno a 23 Respecto a la velocidad de flujo no se baja de 05 mLmiddotmin-1 ya que los tiempos de anaacutelisis seriacutean excesivos

En la Figura 5 se representa la arquitectura del disentildeo asiacute como los niveles ensayados para cada variable

Figura 5- Disentildeo central compuesto y niveles ensayados para cada una de las tres variables en la optimizacioacuten de las condiciones cromatograacuteficas acetonitrilo 251 230 200 170 150 H3PO4 005 004 003 002 001 flujo 150 130 100 070 050 mLmiddotmin-1


193

Para llevar a cabo las experiencias marcadas por el disentildeo se preparan dos disoluciones Con una disolucioacuten patroacuten se evaluacutea la extensioacuten de la fotorreaccioacuten a traveacutes de la altura de los picos obtenidos Por otra parte para evaluar la eficacia de la separacioacuten de los analitos de intereacutes se introduce tambieacuten en cada punto del disentildeo una muestra de vino dopada con los analitos Asiacute en matraces de 250 mL la disolucioacuten patroacuten contiene 053 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol 058 μgmiddotmL-1 de trans-piceido y agua ultrapura hasta enrase la segunda contiene 750 mL de un pool de vinos tintos comerciales y las mismas cantidades de los analitos que en la disolucioacuten patroacuten Estas dos disoluciones mientras no se utilizan en la ejecucioacuten de los experimentos se conservan en la oscuridad a 4 ordmC Las experiencias marcadas por el disentildeo se realizan de manera aleatoria analizaacutendose en cada experiencia tanto la disolucioacuten estaacutendar como la de vino fortificada El fotorreactor se mantiene en todo momento encendido y la monitorizacioacuten del eluato se lleva a cabo fotomeacutetricamente a 306 nm y fluorimeacutetricamente a λexcem 260364 nm

Tras cada inyeccioacuten de la muestra de vino una vez que se ha producido la elucioacuten de los compuestos de intereacutes se limpia la columna para expulsar todos los componentes del vino que puedan originar picos fantasmas en los sucesivos anaacutelisis La limpieza de la columna se lleva a cabo en todos los casos por paso secuencial de acetonitriloagua 2575 5050 1000 vv a 12 mLmiddotmin-1 hasta conseguir presioacuten constante con cada disolucioacuten manteniendo acetonitrilo puro hasta obtener una liacutenea base limpia

La eleccioacuten de la funcioacuten respuesta es crucial ya que de ella dependeraacute

que las condiciones predichas como oacuteptimas sean una solucioacuten real del problema


194

Se han tenido en cuenta paraacutemetros relacionados con la sensibilidad y la selectividad Asiacute la funcioacuten de respuesta (FR) seleccionada fue

norm

hPthRtPicts

APAPRRF ⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ ++= minusminus

minus2

)()()(

υυ (AP = Aacuterea de Pico)

El primer teacutermino de la ecuacioacuten representa la eficacia de la separacioacuten cromatograacutefica mientras que el segundo estaacute relacionado con la sensibilidad del meacutetodo La resolucioacuten del pico del fotoproducto del trans-piceido con respecto a los interferentes del vino se toma como representativa de la eficacia En algunas muestras del disentildeo este pico aparece resuelto de interferentes pre-eluidos y post-eluidos mientras que en otros puntos este compuesto coeluye totalmente con los interferentes del vino Rs(t-Pic) es el valor de resolucioacuten maacutes desfavorable (respecto a los interferentes pre-eluidos o post-eluidos) para el pico correspondiente a trans-piceido multiplicado por dos cuando el otro valor de resolucioacuten sea superior a 15 con el objetivo de dar un mayor peso a la respuesta correspondiente a las condiciones en que este compuesto esteacute resuelto de todos los interferentes aunque soacutelo sea parcialmente El pico correspondiente a trans-resveratrol aparece totalmente resuelto en todas las condiciones experimentales ensayadas y por eso los valores de resolucioacuten correspondientes a este pico no han sido incluidos en la funcioacuten de respuesta El segundo teacutermino evaluacutea la sensibilidad a traveacutes de los valores de las aacutereas de pico de los fotoproductos Eacutestas dependen tanto del rendimiento de la fotorreaccioacuten como del rendimiento cuaacutentico de fluorescencia de los fotoproductos generados Su valor se calcula como la media normalizada del aacuterea de los picos de los fotoproductos de trans-resveratrol y trans-piceido Se utiliza la estrategia de normalizar el segundo teacutermino con el objetivo de dar igual importancia a ambos


195

teacuterminos Asiacute el valor de este teacutermino normalizado estaraacute siempre en torno a la unidad al igual que el teacutermino de las resoluciones Los tiempos de retencioacuten tampoco han sido incluidos en la funcioacuten de respuesta ya que en ninguacuten caso fueron superiores a 30 minutos valor bastante aceptable en comparacioacuten con otros meacutetodos propuestos Los resultados se interpretan con la Metodologiacutea de la Superficie de Respuesta y la optimizacioacuten del modelo se lleva a cabo con el software THE

UNSCRAMBLER (Unscrambler v 611 CAMO AS Olav Tryggvasonsgt N-7011 Trondheim Norway) En el correspondiente anaacutelisis de la varianza (ANOVA) se asume un modelo cuadraacutetico de segundo grado (Model Check Quadratic valor p (95 ) = 00008) El valor de p calculado (95 ) para la falta de ajuste (Lack of Fit) 00583 indica que eacutesta no es significativa a un nivel de confianza del 95 y que por tanto el modelo describe adecuadamente la forma real de la superficie de respuesta Los resultados del ANOVA revelan tambieacuten un valor para R2 de 0947 Por otra parte aplicando el ANOVA al anaacutelisis de los valores p para las variables estudiadas (Tabla 1) se deduce queacute variables influyen de forma significativa (p lt 005) en el modelo


196

Tabla 1- Anaacutelisis de los valores p para las variables estudiadas

Variable Valor p

ACN 00310 H3PO4 00765

Flujo 00067 ACN - ACN 00019

H3PO4 - H3PO4 00002 Flujo ndash Flujo 00001

ACN - H3PO4 01348 ACN ndash Flujo 01013 H3PO4 - Flujo 01725

A la vista de los resultados expuestos se deduce que el de acetonitrilo y el flujo asiacute como los teacuterminos cuadraacuteticos H3PO4 - H3PO4 ACN - ACN y flujo-flujo contribuyen significativamente al modelo para un nivel de confianza del 95 Sin embargo el efecto H3PO4 y las interacciones ACN - H3PO4 y ACN - flujo no son significativas para el modelo al nivel de confianza considerado En la Figura 6 se muestran las superficies de respuesta estimadas por el modelo para cada par de variables En estas superficies el oacuteptimo situado en la zona de maacutexima respuesta corresponde a los siguientes valores para cada una de las variables estudiadas 18 de acetonitrilo y 33middot10-2 de H3PO4 en la fase moacutevil y un flujo de 09 mLmiddotmin-1 Por tanto la fase moacutevil seleccionada como oacuteptima fue acetonitriloH3PO4 (004 ) 1882 vv y una velocidad de flujo de la fase moacutevil de 09 mLmiddotmin-1


197

Figura 6- Superficies de respuesta predichas para cada par de variables

Con el objetivo de comprobar que las condiciones predichas como oacuteptimas por el modelo quimiomeacutetrico corresponden a una solucioacuten real del problema es decir que el anaacutelisis se puede llevar a cabo de manera sensible y libre de


198

interferencias se registran los cromatogramas correspondientes a una muestra patroacuten y una muestra de vino fortificada en las condiciones determinadas como oacuteptimas Los cromatogramas registrados con el fotorreactor encendido en todo momento y monitorizando fluorimeacutetricamente el eluato a λexcem 260364 nm se recogen en la Figura 7

Figura 7- Cromatogramas correspondientes a una muestra patroacuten (mdashmdash) y a una muestra de vino tinto fortificada con los analitos (mdashmdash) [trans-resveratrol] = 053 μgmiddotmL-1 [trans-piceido] = 058 μgmiddotmL-1 fase moacutevil ACN004 H3PO4 1882 vv flujo 09 mLmiddotmin-1

Como se observa bajo las condiciones seleccionadas como oacuteptimas ambos analitos estaacuten resueltos a liacutenea base en un tiempo inferior a 15 minutos siendo los tiempos de retencioacuten y los factores de capacidad 465 y 1437 minutos y 210 y 858 respectivamente para trans-piceido y trans-resveratrol respectivamente Influencia de la Temperatura Se lleva a cabo el estudio de la precisioacuten inter-diacutea inyectando en diacuteas sucesivos y siempre a la misma hora una disolucioacuten conteniendo 050 μgmiddotmL-1 de cada analito Se observa una pobre reproducibilidad en los tiempos de retencioacuten de ambos compuestos oscilando eacutestos entre 465 y 499 minutos para trans-piceido y

0 2 4 6 8 10 12 14 16tiempo (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

I F (

λ exce

m 260

364 n

m)

trans-Piceido

trans-Resveratrol

desconocido


199

1437 y 1609 para trans-resveratrol Como es loacutegico esta falta de reproducibilidad en los tiempos de retencioacuten se traduce en una falta de reproducibilidad en la resolucioacuten de ambos picos con respecto a los interferentes del vino sobre todo en el pico de trans-piceido dada su cercaniacutea a una serie de interferencias menos retenidas que eacutel Pensamos que esta irreproducibilidad puede ser debida a fluctuaciones en la temperatura ambiente Para comprobar como afecta la temperatura se llevan a cabo dos experiencias en condiciones draacutesticamente diferentes Asiacute una misma muestra conteniendo 050 μgmiddotmL-1 de cada analito se eluye en las condiciones seleccionadas como oacuteptimas en primer lugar con los recipientes conteniendo la fase moacutevil sumergidos en hielo y en segundo lugar con los recipientes sin sumergir y con un calefactor de infrarrojos dirigido hacia la columna cromatograacutefica lo que elevaba en gran medida la temperatura en el ambiente de la columna Los tiempos de retencioacuten para el trans-piceido variacutean entre 49 y 51 minutos y para el trans-resveratrol entre 156 y 167 minutos cuando la elucioacuten se lleva a cabo a alta y baja temperatura respectivamente Comprobado el efecto de la temperatura sobre la retencioacuten de los analitos se realiza el estudio de la influencia de la temperatura La termostatizacioacuten de la columna se consigue mediante una camisa consistente en un tubo de silicona enrollado helicoidalmente sobre la misma cuyos extremos estaacuten unidos a la entrada y salida de un bantildeo termostaacutetico dando lugar a un circuito cerrado por el que circula agua cuya temperatura se controla a traveacutes del bantildeo termostaacutetico Se preparan en sendos matraces de 100 mL dos disoluciones conteniendo la primera de ellas 102 y 111 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-


200

piceido respectivamente y agua ultrapura hasta enrase y la segunda 30 mL de una muestra de vino tinto comercial diluida con agua ultrapura hasta enrase Ambas disoluciones se inyectan en el sistema cromatograacutefico y se eluyen a diferentes temperaturas comprendidas entre 10 y 30 ordmC en las condiciones establecidas anteriormente como oacuteptimas En la Figura 8 se muestran los cromatogramas correspondientes a la muestra patroacuten y de vino obtenidos a 15 y 30 ordmC

Figura 8- Influencia de la temperatura sobre los tiempos de retencioacuten de (A) disolucioacuten patroacuten conteniendo 102 y 111 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente y (B) muestra de vino a 15 ordmC (mdashmdash) y 30 ordmC (mdashmdash)

0 5 10 15 20 25t (min)

0

2

4

6

8

I F (

λ exce

m 260

364 n

m)

0 5 10 15 20 25t (min)

0

10

20

30

40

I F (

λ exc

em 26

0364

nm)

3 6t (min)0

25

A

B


201

Como se observa el aumento de la temperatura supone una disminucioacuten de los factores de capacidad de ambos compuestos Por otra parte tambieacuten se observa coacutemo a 15 ordmC el pico correspondiente a trans-piceido estaacute resuelto a liacutenea base con respecto a las interferencias del vino menos retenidas que eacutel por lo que para experiencias futuras se selecciona 15 ordmC como temperatura de trabajo

En todas las modalidades de cromatografiacutea liacutequida la retencioacuten de los solutos disminuye con el incremento de la temperatura y por lo general se obtienen relaciones lineales al representar log krsquo frente a 1T y se acepta como regla aproximada que un aumento de 30 ordmC en la temperatura supone una disminucioacuten de dos veces en el factor de capacidad krsquo4 Con el objetivo de comprobar que esta tendencia general se cumple en la separacioacuten cromatograacutefica de estos analitos se han representado sobre un eje logariacutetmico los factores de capacidad para ambos compuestos medidos sobre los picos cromatograacuteficos detectados mediante fluorescencia a las distintas temperaturas ensayadas asiacute como la presioacuten del sistema frente a la inversa de la temperatura Dicha representacioacuten se encuentra en la Figura 9 Se comprueba que existe una relacioacuten lineal al representar sobre un eje logariacutetmico los factores de capacidad de trans-resveratrol y trans-piceido frente a la inversa a la temperatura observaacutendose como los factores de capacidad disminuyen a media que aumenta la temperatura Por su parte la presioacuten del sistema disminuye al aumentar la temperatura ya que a mayor temperatura menor es la viscosidad de la fase moacutevil 4 Introduction to Modern Liquid Chromatography Second Edition LR Snyder y JJ Kirkland John Wiley amp sons inc


202

Figura 9- Efecto de la temperatura (T) sobre los factores de capacidad (krsquo) de t-resveratrol (R) y t-piceido (P) y sobre la presioacuten del sistema (p)

Rectas de Calibrado y Paraacutemetros Analiacuteticos de Calidad Establecidas las condiciones oacuteptimas para la determinacioacuten cromatograacutefica de trans-resveratrol y trans-piceido en vino antes de abordar el anaacutelisis de muestras reales se procede a estudiar la relacioacuten entre la concentracioacuten de analito puesta y la sentildeal analiacutetica medida y al establecimiento de las rectas de calibrado para ambos compuestos En matraces de 100 mL se preparan por triplicado disoluciones conteniendo entre 0010 y 015 mL de las disoluciones madre etanoacutelicas de 102 y 111 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente y agua ultrapura hasta enrase Cada una de estas muestras recieacuten preparada y aislada de la luz se inyecta en el sistema cromatograacutefico y se eluye a 09 mLmiddotmin-1 con una mezcla acetonitriloH3PO4 (004 ) 1882 vv manteniendo la temperatura de la columna

36 35 34 33 32103T (K-1)

1

10

100

2

3456789

20

30405060708090

k

10

100

1000

20

30405060708090

200

300400500600700800900

P (ba

r)


203

constante mediante una camisa de agua recirculante a 15 ordmC El fotorreactor se mantiene encendido en todo momento lo que permite el desarrollo de las fotorreacciones de ambos analitos en liacutenea y los correspondientes cromatogramas se obtienen monitorizando fluorimeacutetricamente el eluato a λexcem 260364 nm Los paraacutemetros analiacuteticos de calidad correspondientes a la determinacioacuten cromatograacutefica de ambos analitos se recogen en la Tabla 2 Tabla 2- Paraacutemetros analiacuteticos de calidad para la determinacioacuten cromatograacutefica de trans-resveratrol y trans-piceido

trans-Resveratrol trans-Piceido Rango de concentracioacuten examinado (μgmiddotmL-1) 01 ndash 15 01 ndash 15

Ordenada en el Origen (a plusmn sa) -67x102 plusmn 34x102 -43x102 plusmn 12x102

Pendiente (b plusmn sb) (mLmiddotμg-1) (1058 plusmn 35)x102 (4367plusmn 11)x102

Desviacioacuten Estaacutendar de la Regresioacuten (syx) 66 x102 23 x102



Linealidad 9664 9742


LOD (SN=3) (μgmiddotmL-1) 00012 00014

LOQ (SN=10) (μgmiddotmL-1) 00041 00047 Repetitividad inter- e intra-diacutea de los meacutetodos Con objeto de comprobar la repetitividad del meacutetodo propuesto se preparan dos series de once disoluciones cada una en un volumen final de 100 mL la primera de ellas conteniendo 0204 y 0222 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente y la segunda 102 y 111 μgmiddotmL-1 de cada analito


204

Cada una de estas disoluciones se inyecta en el sistema cromatograacutefico y se obtienen sus respectivos cromatogramas en condiciones ideacutenticas a las empleadas en el establecimiento de las rectas de calibrado En la Tabla 3 se resumen las desviaciones estaacutendar en tiempos de retencioacuten aacutereas de pico y alturas de pico paraacutemetros que permiten evaluar la repetitividad intra-diacutea del meacutetodo cromatograacutefico Por otra parte para estudiar la repetitividad inter-diacutea se preparan dos disoluciones en las mismas condiciones ya indicadas y se inyectan en el cromatograacutefo durante once diacuteas consecutivos Los resultados obtenidos de encuentran en la Tabla 3 A la vista de los resultados obtenidos se concluye que la repetitividad intra- e inter-diacutea del meacutetodo es aceptable a los dos niveles de concentracioacuten estudiados

Tabla 3- Repetitividad en la determinacioacuten de trans-resveratrol y trans-piceido

trans-Resveratrol trans-Piceido 0204

μgmiddotmL-1 102

μgmiddotmL-1 0222 μgmiddotmL-1

111 μgmiddotmL-1

tR (min) plusmn SD 1799plusmn005 1788plusmn025 534plusmn002 531plusmn008 RSD (tR) 025 14 037 14

Aacuterea Media plusmn SD (126plusmn12)x102 (867plusmn70) x102

(472plusmn037) x102

(346plusmn11) x102

RSD (Aacuterea) 98 81 80 34

Altura Media plusmn SD 288plusmn27 (1968plusmn016) x102 212plusmn18 (175plusmn020)

x102

I N T R A - D

RSD (Altura) 100 82 86 119 tR (min) plusmn SD 1760plusmn021 1777plusmn020 530plusmn002 530plusmn005 RSD (tR) 12 11 042 099


(479plusmn086) x102

(343plusmn17) x102



x102

I N T E R - D

RSD (Altura) 183 69 181 175


205

Foto-Isomeriacutea cis-trans Evidencia de la presencia de cis-isoacutemeros de resveratrol y piceido en vinos La exposicioacuten a la luz solar de manera controlada de disoluciones conteniendo los trans-isoacutemeros de resveratrol y piceido tiene como consecuencia la obtencioacuten de los correspondientes cis-isoacutemeros Este hecho ha sido ampliamente discutido en la literatura cientiacutefica y probado espectroscoacutepicamente por nosotros como se ha descrito en los capiacutetulos anteriores

En el capiacutetulo IV correspondiente al anaacutelisis cromatograacutefico de resveratrol y piceido con derivatizacioacuten off-line pre-columna no es posible diferenciar entre los picos cromatograacuteficos correspondientes a los trans- o cis-isoacutemeros de los analitos porque la irradiacioacuten en la laacutempara de mercurio de alta presioacuten supone la destruccioacuten total de los mismos en favor de sus derivados altamente fluorescentes de manera que los analitos originales no son eluidos como tal sino como sus respectivos fotoproductos Aunque la principal ventaja del meacutetodo propuesto en el capiacutetulo anterior es la sensibilidad ya que el empleo de una laacutempara de mercurio de alta presioacuten supone unos rendimientos muy altos de las fotorreacciones su principal limitacioacuten es el hecho de que soacutelo es posible determinar cantidades totales de resveratrol y piceido presentes en el vino no pudiendo determinar la distribucioacuten relativa entre las formas cis- y trans- de cada analito

En el caso de llevar a cabo las fotorreacciones en liacutenea post-columna

primero tiene lugar la separacioacuten cromatograacutefica y a continuacioacuten las respectivas fotorreacciones sobre porciones discretas del eluato Es decir en este caso dada la diferente polaridad entre los trans- y cis-isoacutemeros en primer lugar se produce su separacioacuten en la columna cromatograacutefica y a continuacioacuten cada analito transportado de manera individual en un bolo discreto del eluato sufre la


206

fotorreaccioacuten que supondraacute la obtencioacuten en cierta medida de sus fotoproductos fluorescentes lo que haraacute posible su deteccioacuten mediante fluorescencia molecular De manera que si bien al emplear una laacutempara ultravioleta en liacutenea el rendimiento de las fotorreacciones es menor no llegando a completarse en ninguacuten caso lo que supondraacute una disminucioacuten en la sensibilidad con respecto al meacutetodo de derivatizacioacuten precolumna sin embargo tiene la ventaja de que permite la determinacioacuten de las concentraciones relativas de los trans- y cis-isoacutemeros de cada analito y no cantidades totales

Al no disponer de patrones de los cis-isoacutemeros eacutestos se obtendraacuten por

exposicioacuten controlada a la luz solar de disoluciones de sus respectivos trans-isoacutemeros Para comprobar las posibilidades de este procedimiento se realiza la siguiente experiencia en un matraz de 100 mL se depositan 015 mL de sendas disoluciones madre de trans-piceido y trans-resveratrol conteniendo 111 y 102 μgmiddotmL-1 respectivamente y se completa con agua ultrapura hasta enrase Cuando esta disolucioacuten se inyecta en el sistema cromatograacutefico recieacuten preparada y se lleva a cabo su elucioacuten en las condiciones previamente determinadas como oacuteptimas en el detector fotomeacutetrico se observan uacutenicamente dos picos cromatograacuteficos a 48 y 168 minutos correspondientes a trans-piceido y trans-resveratrol respectivamente A continuacioacuten dicha disolucioacuten se expone a la luz evitando la radiacioacuten solar directa y se van aislando y guardando en la oscuridad aliacutecuotas de la misma a distintos tiempos de exposicioacuten con el objetivo de seguir el transcurso de la fotorreaccioacuten de generacioacuten de los cis-isoacutemeros durante aproximadamente dos minutos Dichas aliacutecuotas son inyectadas sucesivamente en el sistema cromatograacutefico Tres de los cromatogramas tridimensionales registrados en el DAD se muestran en forma de superficies y mapas de contorno en la Figura 10 y en ellos puede apreciarse como la exposicioacuten progresiva a la luz genera dos nuevos


207

compuestos correspondientes a los isoacutemeros cis de piceido y resveratrol a 112 y 356 minutos respectivamente Figura 10- Cromatogramas tridimensionales (tiempo ndash longitud de onda - absorbancia) y mapas de contorno en funcioacuten del tiempo de exposicioacuten a la luz de una disolucioacuten que contiene trans-resveratrol y trans-piceido [trans-resveratrol] = 153 microgmiddotmL-1 [trans-piceido] = 166 μgmiddotmL-1


208

Por otra parte ademaacutes de realizar la deteccioacuten fotomeacutetrica con el objetivo

de identificar los cis-isoacutemeros durante toda la experiencia se mantuvo encendido el fotorreactor y se monitorizoacute el eluato fluorimeacutetricamente (λexcem 260364 nm) Como se representa en la Figura 11 se comprueba que las fotorreacciones tambieacuten tienen lugar con eacutexito a partir de los cis-isoacutemeros

Figura 11- Perfiles de fluorescencia correspondientes a la muestra de trans-resveratrol y trans-piceido (azul) y a las distintas aliacutecuotas expuestas a la luz durante tiempos sucesivos (rojo verde y rosa)

Se comprueba que los picos cromatograacuteficos correspondientes a los cis-

isoacutemeros estaacuten totalmente resueltos de los correspondientes a los trans- Ademaacutes los cis-isoacutemeros son menos polares que los correspondientes trans- como revela su mayor afinidad por la fase estacionaria debido probablemente a interacciones intra-moleculares tipo puente de hidroacutegeno entre grupos hidroxilo en las moleacuteculas cis

Con el objetivo de comprobar la presencia de los cuatro isoacutemeros en el

vino se comparan los cromatogramas correspondientes a una muestra patroacuten conteniendo 143 y 155 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente y expuesta durante 30 s a la sombra en el exterior del laboratorio

min0 5 10 15 20 25 30 35 40

LU

0

50

100

150

200

250

300

FLD1 A Ex=260 Em=364 (EDIEGOPST19A22D)FLD1 A Ex=260 Em=364 (EDIEGOPST19A24D)FLD1 A Ex=260 Em=364 (EDIEGOPST19A26D)FLD1 A Ex=260 Em=364 (EDIEGOPST19A27D)


209

lo que daraacute lugar a la generacioacuten de ciertas cantidades de los cis-isoacutemeros de resveratrol y piceido y una muestra de vino diluida con agua ultrapura (050 mL de un vino tinto comercial se llevan hasta un volumen final de 100 mL) Ambas disoluciones son inyectadas en el sistema cromatograacutefico y eluiacutedas en las condiciones previamente determinadas como oacuteptimas y los cromatogramas obtenidos se recogen en la Figura 12 donde se aprecia la presencia de los cuatro isoacutemeros en la muestra de vino La resolucioacuten de los cuatro compuestos de intereacutes con respecto a las interferencias del vino es en todos los casos superior a 15 excepto en el caso del pico correspondiente a cis-piceido que solapa ligeramente con una interferencia previa No obstante la resolucioacuten en este caso es aceptable de manera que no se contempla la posibilidad de cambiar las condiciones cromatograacuteficas

Figura 12- Perfiles-FLDλexcem 260364 nm correspondientes a una muestra conteniendo 143 y 155 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente expuesta durante 30 segundos a la luz solar (mdashmdash) y a un vino comercial diluido 20 veces con agua (mdashmdash)

Para poder realizar la cuantificacioacuten en vinos es necesario realizar

previamente un calibrado a partir de disoluciones patroacuten algo realmente complejo porque como ya se ha indicado no se comercializan patrones de los cis-isoacutemeros

0 10 20 30 40t (min)

0

40

80

120

160

200

I F (

λ exce

m 260

364 n

m)

trans-piceido

cis-piceido

trans-resveratrol

cis-resveratrol

Desconocido


210

En nuestro caso para cuantificar los cis-isoacutemeros se van a emplear disoluciones patroacuten de dichos compuestos obtenidas por exposicioacuten a la luz solar de sus respectivos trans-isoacutemeros en concentraciones conocidas Para llevar a cabo el calibrado es necesario relacionar la sentildeal analiacutetica en este caso aacuterea de los picos correspondientes a cis-resveratrol y cis-piceido con sus respectivas concentraciones calculadas por diferencia entre las aacutereas de los picos de los trans-isoacutemeros antes y despueacutes de la exposicioacuten a la luz solar De manera que se prepararaacuten mezclas de trans-resveratrol y trans-piceido se inyectaraacuten raacutepidamente en el sistema cromatograacutefico y a continuacioacuten dichas disoluciones se expondraacuten a la luz solar y se volveraacuten a inyectar en el sistema relacionando el aacuterea de los dos nuevos picos correspondientes a los cis-isoacutemeros con la caiacuteda de concentracioacuten de trans-resveratrol y trans-piceido

No obstante antes de proceder al establecimiento de rectas de calibrado y

con el objetivo de no cometer errores en la cuantificacioacuten de los isoacutemeros cis es necesario asegurar las condiciones de exposicioacuten en las cuales soacutelo se obtenga el cis-isoacutemero de cada analito y no sus respectivas formas fluorescentes

Se ha comprobado la existencia de ambos pares de isoacutemeros en ausencia

total de sus formas fluorescentes cuando disoluciones conteniendo entre 020 y 150 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido son expuestas a la sombra en el exterior del laboratorio durante un periodo de 30 segundos La forma maacutes directa de realizar esta comprobacioacuten es comparando alguno de los cromatogramas obtenidos en estas condiciones con el cromatograma correspondiente a una disolucioacuten irradiada en la laacutempara de mercurio de alta presioacuten durante un tiempo tal que se haya dado en cierta extensioacuten la formacioacuten de los fotoproductos fluorescentes Para ello en un matraz de 100 mL se depositan 010 mL de las disoluciones madre de trans-resveratrol y trans-piceido de 102 y 111 μgmiddotmL-1


211

respectivamente 38 mL de etanol absoluto y agua ultrapura hasta enrase Una aliacutecuota de esta disolucioacuten se deposita en una cubeta de cuarzo de un centiacutemetro de paso de luz y se expone a la luz de una laacutempara de mercurio de alta presioacuten durante 90 segundos bajo agitacioacuten magneacutetica Por otra parte el matraz conteniendo el resto de la disolucioacuten se expone a la luz del diacutea a la sombra en el exterior del laboratorio durante 30 segundos Ambas disoluciones se inyectan en el sistema cromatograacutefico y se eluyen en las condiciones ya optimizadas Los cromatogramas registrados monitorizando fotomeacutetricamente el eluato a 260 nm se encuentran en la Figura 13

Figura 13- Cromatogramas (260 nm) correspondientes a las muestras expuestas a la luz del diacutea (superior) y a la luz ultravioleta de la laacutempara de mercurio de alta presioacuten (inferior)

A la vista de la Figura 13 se comprueba la no existencia de FP1 ni FR en

las condiciones de obtencioacuten de los cis-isoacutemeros ya que no se observan los picos correspondientes Con respecto a FP2 que coeluye con trans-resveratrol tambieacuten se comprueba que no se genera nada al ser puro el pico de trans-resveratrol en el cromatograma de la muestra expuesta a la luz solar


212

Este hecho tambieacuten ha sido corroborado monitorizando la fotorreaccioacuten a 275 nm longitud de onda correspondiente al punto isobeacutestico de los espectros de absorcioacuten obtenidos en los picos correspondientes de cada par cis-trans Figura 14 Dado que para un par cualquiera en el punto isobeacutestico las absortividades molares de ambos isoacutemeros es la misma la razoacuten aacuterea de pico vs concentracioacuten es tambieacuten la misma Por lo tanto el aacuterea total debe mantenerse constante si la concentracioacuten de cada par cis-trans hace lo mismo

Figura 14- Espectros ldquoen el picordquo obtenidos en liacutenea correspondientes a una disolucioacuten de trans-piceido antes de la exposicioacuten a la luz del diacutea (- - -) y tras un tiempo de exposicioacuten de 30 s (----) y 60 s (middotmiddotmiddotmiddot) Punto isobeacutestico a 275 nm redondeado en la figura de la derecha La comprobacioacuten matemaacutetica de este hecho basada en la ley de Lambert-

Beer es la siguiente Supongamos la siguiente fotorreaccioacuten

trans cishlt

Podemos establecer un balance de materia considerando que antes del proceso de irradiacioacuten soacutelo existen los isoacutemeros trans y que una vez que las

240 280 320 360λ (nm)

0

7

14

21

A (m

Au)

240 280 320 360λ (nm)

0

1

2

3

4

5

6

7

A (m

Au)


213

muestras comienzan a exponerse a la luz coexisten ambos isoacutemeros por lo que las concentraciones antes y despueacutes de la irradiacioacuten seriacutean

trans cis

Inicialmente ct0

rans 0

Despueacutes de la irradiacioacuten ct0rans - ccis ccis

Teniendo en cuenta que el aacuterea de los picos viene dada por

Area A dt b c dttrans= sdot = sdot sdot sdotintint ε λ

Puesto que el caudal de la fase moacutevil es constante dt seraacute sinoacutenimo de

dvol y tendremos para cada una de las especies las siguientes relaciones entre aacuterea de pico y concentracioacuten y entre aacuterea de pico y masa inyectada

Inicialmente la cantidad del isoacutemero trans es perfectamente conocida y

esto nos permite poder relacionarla con el aacuterea de pico Cuando a traveacutes de la irradiacioacuten comienza a formarse el isoacutemero cis el aacuterea de pico del trans disminuye pero asumiendo que a lo largo de todo el proceso la masa total se conserva tambieacuten lo haraacute la suma de las aacutereas de ambos picos Si definimos un paraacutemetro y como

Area b c dt b c dvol b mtrans trans trans trans trans trans trans= sdot sdot sdot = sdot sdot = sdot sdotint intε ε ελ λ λ

Area b c dt b c dvol b mcis cis cis cis cis cis cis= sdot sdot sdot = sdot sdot = sdot sdotint intε ε ελ λ λ


214

donde Areatrans0 es el aacuterea inicial del pico del trans sustituyendo en esta ecuacioacuten

las relaciones previamente establecidas entre aacuterea y masa tendremos

y como en el punto isobeacutestico λi se cumple que ε λtrans

i = ε λcis

i entonces

Por tanto si el paraacutemetro y obtenido a partir de las aacutereas medidas para los picos antes y despueacutes de irradiar es constante e igual a 100 significaraacute que la suma de las cantidades de cis y trans obtenidas al irradiar es igual a la cantidad inicial de trans y ello permitiraacute calcular la concentracioacuten de cis

Se ha comprobado que efectivamente para los picos obtenidos

detectando a la λ del punto isobeacutestico a la cual se cumple que las absortividades son iguales el aacuterea total es igual a la suma de las aacutereas de cada pico por lo que se comprueba que se conserva la masa y se confirma la existencia uacutenicamente de cis- y trans-resveratrol y cis- y trans-piceido

Comprobado este hecho es correcto proceder al calibrado de los

compuestos cis relacionando el aacuterea de sus correspondientes picos con la concentracioacuten deducida a partir de la disminucioacuten de concentracioacuten de sus respectivos isoacutemeros trans

yArea Area

Areaxtrans cis

trans=

+0 100

yb m b m

b mxtrans trans cis cis

trans trans=

sdot sdot + sdot sdotsdot sdot

ε εε

λ λ

λ 0 100

ym m

mxtrans cis

trans=

+0 100


215

Rectas de calibrado y paraacutemetros analiacuteticos de calidad para la cuantificacioacuten de los isoacutemeros cis Con el objetivo de comprobar la linealidad del meacutetodo se prepara en un matraz de 100 mL y en ausencia de luz una disolucioacuten conteniendo 153 y 166 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente Esta disolucioacuten recieacuten preparada se inyecta en el cromatoacutegrafo y se eluye en las condiciones previamente fijadas con el objetivo de relacionar el aacuterea de cada pico con las concentraciones de trans-resveratrol y trans-piceido A continuacioacuten la disolucioacuten se expone a la luz del diacutea en el exterior del laboratorio mantenieacutendola a la sombra Se van aislando de la luz aliacutecuotas de la misma durante un periodo de un minuto y se van guardando en la oscuridad lo que supone la paralizacioacuten de la fotorreaccioacuten en distintos momentos de su desarrollo Las aliacutecuotas obtenidas se conservan en ausencia total de luz y se van inyectando sucesivamente en el sistema cromatograacutefico

Excepto en la primera disolucioacuten totalmente aislada de la luz donde soacutelo

existiraacuten trans-isoacutemeros en todas las demaacutes se observan los 4 isoacutemeros y la relacioacuten entre sentildeal (aacuterea de pico) y la concentracioacuten de cada uno de los isoacutemeros se establece de la siguiente manera

1- Se van inyectando las aliacutecuotas expuestas a la luz medimos el

aacuterea de los picos correspondientes a los compuestos trans y a traveacutes de sus correspondientes rectas de calibrado (Tabla 2) se calcula la concentracioacuten que va quedando de cada isoacutemero trans en cada momento


216

2- Por diferencia entre la concentracioacuten inicial de cada trans-isoacutemero y la concentracioacuten de esta misma especie calculada en las diferentes aliacutecuotas expuestas a la luz se calcula la concentracioacuten del cis-isoacutemero correspondiente Se representan los valores de aacuterea de pico para los isoacutemeros cis frente a los valores de concentracioacuten asiacute deducidos

Los resultados obtenidos se presentan en la Figura 15 observaacutendose que no son excesivamente buenos porque sobre todo en el caso del cis-resveratrol no se ajustan a una liacutenea recta

Figura 15- Aacuterea de pico vs concentracioacuten de cada cis-isoacutemeros para muestras obtenidas por exposicioacuten continuada a la luz de una misma muestra y extraccioacuten sucesiva de aliacutecuotas

Con objeto de mejorar la linealidad se realizan diversas experiencias ensayaacutendose diferentes metodologiacuteas y finalmente proponemos el siguiente meacutetodo operatorio

En matraces de 100 mL se preparan disoluciones conteniendo entre 020 y 170 μgmiddotmL-1 de ambos analitos etanol absoluto hasta completar el 15 y agua

0 04 08 12 16[cis-isoacutemero] (μgmiddotmL-1)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

Aacuterea

de

Pico


217

ultrapura hasta enrase Cada uno de estos patrones se inyecta dos veces en el sistema cromatograacutefico la primera vez recieacuten preparado y aislado de la luz y la segunda vez tras haber sido expuesto durante 30 segundos a la luz del diacutea a la sombra en el exterior del laboratorio En todos los casos se inyectan las muestras en el sistema cromatograacutefico se eluyen a 09 mLmiddotmin-1 con una mezcla acetonitriloH3PO4 (004 ) 1882 vv manteniendo la temperatura de la columna constante a 15 ordmC El fotorreactor se mantiene encendido en todo momento lo que permite el desarrollo de las fotorreacciones de los analitos en liacutenea y los correspondientes cromatogramas se obtienen monitorizando fluorimeacutetricamente el eluato a λexcem 260364 nm Las concentraciones de cada uno de los isoacutemeros en las muestras que han estado expuestas a la luz se calculan como se ha explicado anteriormente

En la Figura 16 se representan las rectas de calibrado obtenidas para los cuatro isoacutemeros y en la Tabla 4 se recogen los paraacutemetros analiacuteticos de calidad correspondientes a la determinacioacuten cromatograacutefica de los dos cis-isoacutemeros Los valores de los coeficientes de correlacioacuten son bastante aceptables en ambos casos

Figura 16- Aacuterea de pico frente a la concentracioacuten de analito cis

500

1000

1500

2000

2500

3000

Aacuterea

de

Pico

(FLD

)

0 02 04 06 08 1[cis-Resveratrol] (μgmiddotmL-1)

0

400

800

1200

1600

2000

Aacuterea

de

Pico

(FLD

)

0 02 04 06 08[cis-Piceido] (μgmiddotmL-1)


218

Tabla 4- Paraacutemetros analiacuteticos de calidad para la determinacioacuten cromatograacutefica de cis-resveratrol y cis-piceido

cis-Resveratrol cis-Piceido

Rango de concentracioacuten examinado (μgmiddotmL-1) 010 ndash 100 010 ndash 100

Ordenada en el Origen (a plusmn sa) (32plusmn10)x102 (17plusmn11)x102

Pendiente (b plusmn sb) (mLmiddotμg-1) (282plusmn19)x102 (190plusmn 24)x102


Coeficiente de Correlacioacuten (r) 09957 09843 Coeficiente de Determinacioacuten (r2) 09914 09688 Linealidad 9344 8731 Resolucioacuten Analiacutetica (γ-1) (μgmiddotmL-1) 00368 00661

LOD (SN=3) (μgmiddotmL-1) 0014 00071 LOQ (SN=10) (μgmiddotmL-1) 0046 0023

Se comprueba que las disoluciones de cis-resveratrol y cis-piceido en el rango de concentraciones detallado en la Tabla 2 y obtenidas por exposicioacuten de disoluciones de sus trans-isoacutemeros durante 30 segundos a la luz del diacutea son estables al menos durante 24 horas Repetitividad del meacutetodo cromatograacutefico para la determinacioacuten de cis-resveratrol y cis-piceido Para estudiar la repetitividad del meacutetodo se prepara una disolucioacuten conteniendo 010 mL de cada una de las disoluciones madre etanoacutelicas de trans-resveratrol y trans-piceido de 102 y 111 μgmiddotmL-1 respectivamente 005 mL de etanol absoluto y agua ultrapura hasta completar 100 mL Esta disolucioacuten se


219

expone durante 30 segundos a la luz en el exterior del laboratorio y transcurrido ese tiempo se aiacutesla totalmente de la luz Se realizan once inyecciones de la misma para estudiar asiacute la repetitividad relativa al sistema Tabla 5- Repetitividad relativa al sistema en la determinacioacuten cromatograacutefica de los cuatro analitos

trans-resveratrol cis-resveratrol trans-piceido cis-piceido

tR (min) plusmn SD 179 plusmn 02 373 plusmn 03 530 plusmn 004 180 plusmn 02 RSD 14 082 081 16 Aacuterea Media plusmn SD (382plusmn18)x102 (282plusmn12)x102 (1075plusmn027)x102 (1246plusmn039)x102 RSD (Aacuterea) 46 41 25 32 Altura Media plusmn SD 740 plusmn15 275 plusmn 08 438 plusmn 11 256 plusmn 06 RSD (Altura) 21 30 26 24

Aplicacioacuten Anaacutelisis de los isoacutemeros de resveratrol y piceido en vino En primer lugar y para comprobar si existe o no efecto de matriz se va a llevar a cabo una adicioacuten patroacuten sobre un pool de vinos tintos comerciales Para poder realizar esta experiencia es necesario disponer de una muestra que contenga los cuatro analitos en concentracioacuten conocida Esta disolucioacuten se prepara en un matraz que en un volumen final de 500 mL contiene 147 y 160 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente 006 mL de etanol absoluto y agua ultrapura hasta enrase Esta disolucioacuten se expone a la luz evitando la radiacioacuten solar directa durante 30 segundos lo que da lugar a la transformacioacuten parcial de los trans-isoacutemeros en cis-isoacutemeros La concentracioacuten de cada isoacutemero se determina registrando el cromatograma de una aliacutecuota de esta disolucioacuten y una vez medidas las aacutereas sustituyendo estas en las ecuaciones de calibrado previamente establecidas Esta disolucioacuten se conserva en la oscuridad


220

condiciones en las que previamente se determinoacute que los cuatro analitos son estables al menos durante 24 horas Para llevar a cabo la adicioacuten patroacuten se dispone un conjunto de cuatro matraces de 100 mL y se deposita en todos ellos 050 mL del pool de vinos tintos voluacutemenes crecientes de la disolucioacuten que contiene los cuatro analitos de intereacutes (000 300 600 y 900 mL) y agua ultrapura hasta enrase Paralelamente en otra serie de tres matraces de 100 mL se preparan patrones por dilucioacuten de 300 600 y 900 mL de la disolucioacuten que contiene los cuatro analitos de intereacutes Se registran los cromatogramas y se representan las aacutereas de pico frente a la concentracioacuten de analito Figura 17

Como se aprecia en todos los casos excepto en el del trans-resveratrol existe un marcado efecto de matriz hecho que se ha comprobado por aplicacioacuten de los correspondientes tests estadiacutesticos de Fischer y de la t-student


221

Figura 17- Rectas de calibrado correspondientes a los patrones (------) y a la adicioacuten patroacuten sobre una muestra de vino tinto (-------)

Se sospecha que el origen de este efecto matriz estaacute en la fotorreaccioacuten que tiene lugar en liacutenea Para comprobarlo se miden las sentildeales correspondientes a los analitos de intereacutes sobre los cromatogramas registrados fotomeacutetricamente ya que el fotorreactor estaacute situado tras el detector fotomeacutetrico y en el caso de que la raiacutez del efecto matriz fuese la fotorreaccioacuten eacuteste efecto no se apreciariacutea sobre las sentildeales fotomeacutetricas En la Figura 18 se muestran los cromatogramas obtenidos a 306 y 290 nm de una muestra de vino contaminada con 30 mL de la disolucioacuten conteniendo los cuatro analitos Al emplear este tipo de deteccioacuten no se consigue una resolucioacuten total de los picos correspondientes a los isoacutemeros del piceido con


0

1000

2000

3000

Aacuterea

de P

ico (F

LD)

cis-Piceido

0 01 02 03 04 05[trans-Piceido] (μgmiddotmL-1)

0

1000

2000

3000

4000

Aacuterea

de P

ico (F

LD)

trans-Piceido

0 02 04 06[cis-Resveratrol] (μgmiddotmL-1)

0

1000

2000

3000

4000

5000

Aacuterea

de P

ico (F

LD)

cis-Resveratrol

0 01 02 03 04 05[trans-Resveratrol] (μgmiddotmL-1)

0

2000

4000

6000

Aacuterea

de P

ico (F

LD)

trans-Resveratrol


222

respecto a los interferentes del vino de manera que se mediraacuten alturas en vez de aacutereas de pico sobre los cromatogramas obtenidos midiendo absorbancia a 306 nm para los trans-isoacutemeros y a 290 nm para los cis-isoacutemeros

Figura 18- Cromatogramas obtenidos fotomeacutetricamente a 306 y 290 nm correspondientes a una muestra de vino tinto fortificada con los cuatro analitos de intereacutes

En estas condiciones se construyen los correspondientes graacuteficos de calibracioacuten y adicioacuten patroacuten representando las alturas de pico frente a la concentracioacuten de analito puesta o antildeadida respectivamente Figura 19

min0 5 10 15 20 25 30 35

mAU

0

1

2

3

4

5trans-Piceido

trans-Resveratrol

306 nm

min0 5 10 15 20 25 30 35

mAU

0

1

2

3

4

5

cis-Piceido cis-Resveratrol

290 nm


223

Figura 19- Alturas de pico frente a la concentracioacuten de analito antildeadida sobre la muestra de vino (-------) y frente a la concentracioacuten de analito en el patroacuten (-------)

Como se observa y posteriormente se comprueba por aplicacioacuten de los correspondientes tests estadiacutesticos de Fischer y de la t-student en este caso no existen diferencias significativas para un nivel de confianza del 95 entre las pendientes de las rectas de patrones externos y de adicioacuten patroacuten obtenidas para cada compuesto lo que confirma el hecho de que el efecto matriz se produce en la fotorreaccioacuten

Dicho efecto matriz podriacutea deberse a alguacuten tipo de cataacutelisis de la

fotorreaccioacuten en presencia de vino Para comprobarlo se lleva a cabo el estudio de la influencia del tiempo de irradiacioacuten en liacutenea para trans-piceido ya que es el


0

2

4

6

8

Altur

a de P

ico (D

AD30

6nm)

trans-Piceido


0

04

08

12

Altur

a de

Pico

(DAD

290n

m)

cis-Piceido

0 02 04 06[trans-Resveratrol] (μgmiddotmL-1)

0

2

4

6

Altur

a de P

ico (D

AD30

6nm)

trans-Resveratrol


0

04

08

12

Altu

ra de

Pico

(DAD

290n

m)

cis-Resveratrol


224

primer compuesto en eluir El tiempo de exposicioacuten del analito a la luz ultravioleta se controla a traveacutes del caudal de fase moacutevil Se prepara una disolucioacuten conteniendo 055 μgmiddotmL-1 de trans-piceido y otra conteniendo 050 mL de vino tinto y la misma cantidad de analito completando en ambos casos con agua ultrapura hasta 100 mL Ambas disoluciones se eluyen con velocidades de flujo comprendidas entre 02 y 18 mLmiddotmin-1 manteniendo en todo caso el fotorreactor encendido y monitorizando fluorimeacutetricamente el eluato La representacioacuten del aacuterea de pico de cis-piceido correspondientes a la muestra patroacuten y a la muestra de vino fortificada frente a la velocidad de flujo (Figura 20) pone de manifiesto la aceleracioacuten del proceso fotoquiacutemico en presencia de vino como puede observarse en el primer tramo de crecida de las curvas Por otra parte los valores de aacuterea de pico que se alcanzan en presencia de vino son mucho mayores que el aacuterea correspondiente seguacuten la recta de patrones externos a la suma de trans-piceido antildeadido y lo que el vino contiene

Figura 20- Influencia del tiempo de irradiacioacuten en liacutenea sobre trans-piceido en presencia (-----) y en ausencia de vino (----)

Una vez comprobado que en vinos tintos existe efecto de matriz y que por

tanto el anaacutelisis de los cuatro analitos tiene que llevarse a cabo mediante adicioacuten patroacuten se comienza el estudio de los vinos blancos

0 04 08 12 16 2Flujo (mLmiddotmin-1)

0

2000

4000

6000

8000

Aacuterea

de P

ico (F

LD)


225

En este caso se lleva a cabo una adicioacuten patroacuten operando exactamente igual que en caso anterior con la excepcioacuten de que el volumen de vino blanco es en este caso de 50 mL Las correspondientes rectas de calibrado tanto de patrones externos como de la adicioacuten patroacuten al vino blanco se representan en la Figura 21

Por aplicacioacuten de los test estadiacutesticos de Fischer y de la t-student se

deduce que en el caso de los vinos blancos no existe efecto de matriz para ninguno de los cuatro analitos pudieacutendose por tanto llevar a cabo el anaacutelisis mediante calibracioacuten externa

Figura 21- Aacuterea de pico frente a la concentracioacuten de analito antildeadida sobre la muestra de vino blanco (-------) y frente a la concentracioacuten de analito en el patroacuten (-------)

0 01 02 03 04[trans-Piceido] (μgmiddotmL-1)

0

200

400

600

800

1000

Aacuterea

de P

ico (F

LD)


0

500

1000

1500

2000

2500

Aacuterea

de

Pico

(FLD

)

0 01 02 03 04[trans-Resveratrol] (μgmiddotmL-1)

0

400

800

1200

1600

2000

Aacuterea

de P

ico (F

LD)

0 01 02 03 04[cis-Resveratrol] (μgmiddotmL-1)

0

400

800

1200

1600

2000

Aacuterea

de

Pico

(FLD

)


226

En uacuteltimo lugar nos planteamos tambieacuten el anaacutelisis de un vino blanco de podredumbre noble en concreto el vino huacutengaro Tokaji Los vinos de podredumbre noble se elaboran a partir de uvas afectadas por Botrytis de manera que estos vinos auacuten siendo vinos blancos deben tener concentraciones de resveratrol en todas sus formas superiores a las encontradas en vinos blancos normales El anaacutelisis de este vino se realiza tambieacuten mediante adicioacuten patroacuten encontraacutendose que en este caso tampoco hay efecto de matriz para ninguno de los cuatro analitos de intereacutes En la Tabla 6 se resumen los resultados del anaacutelisis para todos los vinos analizados Todos ellos fueron analizados mediante adicioacuten patroacuten por triplicado

Tabla 6- Concentraciones encontradas de los isoacutemeros de resveratrol y piceido en diferentes vinos Meacutetodo de adicioacuten patroacuten (por triplicado)

[t-Piceido] (μgmiddotmL-1)

[c-Piceido] (μgmiddotmL-1)

[t-Resveratrol] (μgmiddotmL-1)

[c-Resveratrol] (μgmiddotmL-1)

Vinos Tintos Pool 1 65 plusmn 05 29 plusmn 03 14 plusmn 01 021 plusmn 012


Pool de Vinos Blancos 0099 plusmn 0013 042 plusmn 002 0054 plusmn 0009 0068 plusmn 0010

Vino Blanco de Podredumbre Noble (Tokaji)

029 plusmn 005 070 plusmn 002 0070 plusmn 0010 0064 plusmn 0050

CAPIacuteTULO VI

UTILIZACIOacuteN DE SENtildeALES FLUORESCENTES DE TRES VIacuteAS (MATRICES DE EXCITACIOacuteN-

EMISIOacuteN) PARA CARACTERIZACIOacuteN DE VINOS

CAPIacuteTULO VI EEMs para caracterizacioacuten de vinos

228


229

ANTECEDENTES Fluorescencia front-face

La espectroscopia de fluorescencia molecular es una teacutecnica de anaacutelisis quiacutemico que cada vez estaacute adquiriendo mayor importancia como teacutecnica analiacutetica cuantitativa principalmente debido a su gran sensibilidad facilidad de utilizacioacuten versatilidad instrumental (se pueden ajustar muchos paraacutemetros instrumentales) rapidez del anaacutelisis pequentildeas cantidades de muestra y por ser ademaacutes una teacutecnica no invasiva ni destructiva Sin embargo aunque esta teacutecnica presenta un gran potencial hasta ahora ha sido poco utilizada para la caracterizacioacuten de alimentos a pesar de que muchos presentan fluorescencia nativa Esto ha sido debido a que la fluorescencia claacutesica no puede aplicarse a muestras turbias opacas o disoluciones muy concentradas Cuando la muestra en estudio presenta elevada absorcioacuten la intensidad de la radiacioacuten emitida no es proporcional a la concentracioacuten de los fluoroacuteforos presentes debido principalmente al efecto de filtro interno Los espectros de excitacioacuten y emisioacuten disminuyen y ademaacutes los espectros de excitacioacuten estaacuten distorsionados Para evitar este problema lo maacutes usual es diluir la muestra de tal forma que la absorbancia sea inferior a 01 Sin embargo los resultados obtenidos para estas disoluciones diluidas no tienen por que ser extrapolables a la matriz original de la muestra ya que con la dilucioacuten se pierde la organizacioacuten de la matriz original Este problema puede ser evitado utilizando la teacutecnica de front-face desarrollada por CA Parker en 19681 cuya principal diferencia con respecto a la modalidad tradicional es la modificacioacuten del aacutengulo de incidencia de la radiacioacuten sobre la muestra pasando de un aacutengulo de 90ordm en la teacutecnica tradicional a un aacutengulo proacuteximo a 30ordm en la teacutecnica de front-face

1 Parker CA Apparatus and experimental methods in Photoluminescence of solutions with applications to photochemistry and analytical chemistry C A Parker ed Elsevier Amsterdam The Netherlands 1968 Paacuteginas 128ndash302


230

midieacutendose la radiacioacuten emitida en la misma cara que la radiacioacuten incidente y sin que las radiaciones incidente y emitida atraviesen la disolucioacuten en medida apreciable Esta modalidad reduce los efectos de dispersioacuten debidos a la elevada concentracioacuten de las muestras no diluidas o a la presencia de turbidez En un principio su aplicacioacuten maacutes relevante fueron los estudios de fluorescencia en matrices soacutelidas pero en las dos uacuteltimas deacutecadas su aplicacioacuten en el anaacutelisis y caracterizacioacuten de alimentos se ha incrementado considerablemente Si ademaacutes las sentildeales fluorescentes obtenidas en modo front-face se combinan con teacutecnicas de anaacutelisis multivariante se consigue potenciar su uso como herramienta para la caracterizacioacuten de alimentos Los meacutetodos de anaacutelisis multivariante maacutes utilizados son PCA (Anaacutelisis de Componentes Principales) y PLS (Miacutenimos Cuadrados Parciales) para tratar datos de primer orden y en caso de datos de oacuterdenes superiores el maacutes utilizado es PARAFAC (PARAllel FACtor

analysis)

Todaviacutea son relativamente escasas las publicaciones que hacen uso de esta combinacioacuten de front-face con sentildeales multivariantes para la caracterizacioacuten y clasificacioacuten de alimentos En 2006 Christensen et al2 publican un artiacuteculo de revisioacuten acerca de las posibilidades que ofrece la autofluorescencia de diversos alimentos en combinacioacuten con meacutetodos de anaacutelisis multivariante como herramienta tanto para el anaacutelisis como para la clasificacioacuten de los mismos Casi todos los procedimientos hacen uso de datos de primer orden espectros de fluorescencia de excitacioacuten emisioacuten o en algunos casos espectros sincroacutenicos en combinacioacuten casi siempre con PCA Asiacute dichos procedimientos se aplican al estudio de proteiacutenas en harinas con gluten3 o bien para seguir la evolucioacuten de la

2 Christensen J Noslashrgaard L Bro R Engelsen SB Chem Reviews 2006 1061980-1994 3 Genot C Tonetti F Montenay-Garestier T Drapron R Sci Aliments 199212687ndash704


231

reaccioacuten de Maillard en alimentos infantiles realizando medidas de fluorescencia que permiten tomar la huella digital en base a los cambios que se producen durante la manufacturacioacuten y analizando estos datos mediante meacutetodos quimiomeacutetricos4 Los productos laacutecteos son matrices en que la fluorescencia front-face se usa ampliamente para la caracterizacioacuten y clasificacioacuten Asiacute permite el seguimiento del cambio estructural que se produce en las proteiacutenas de la leche durante el proceso de calentamiento5 o bien la cuantificacioacuten simultaacutenea de furosina y lactosa en leche lo que proporciona un meacutetodo para evaluar la calidad de la leche6 En combinacioacuten con PCA permite la discriminacioacuten entre diferentes tipos de leche seguacuten la temperatura y el tiempo utilizado en el tratamiento teacutermico7 La determinacioacuten de riboflavina en yogures se usa para evaluar la conservacioacuten de los mismos y la aplicacioacuten de PCA a los espectros de emisioacuten revela cambios en la sentildeal de fluorescencia con el tiempo de conservacioacuten8 Wold et al8 proponen el uso de fluorescencia front-face y PCA como herramienta para seguir la foto-oxidacioacuten de productos laacutecteos frescos Tambieacuten se propone la caracterizacioacuten de helados basada en la relacioacuten existente entre grasas proteiacutenas y emulsionantes9 La clasificacioacuten de cervezas procedentes de diferentes paiacuteses se lleva a cabo registrando los espectros de emisioacuten y sincroacutenicos de muestras de cervezas sin diluir y utilizando PLS para realizar el tratamiento quimiomeacutetrico de los datos10

4 Birlouez-Aragon I Locquet N de St Louvent E Jouan-Rimbaud Bouveresse D Stahl P Annals of the New York Academy of Sciences 2005 1043308ndash318 5 Dufour E Riaublanc A Lait 1997 77657-670 6 Kulmyrzaev AA Dufour E Lait 2002 82725-735 7 Kulmyrzaev AA Levieux D Dufour E J Agric Food Chem 2005 53502-507 8 Miquel Becker E Christensen J Frederiksen CS Haugaard VK J Dairy Sci 2003 862508-2515 8 Wold JP Joslashrgensen K Lundby F J Dairy Sci 2002 851693-704 9 Granger C Da Costa JP Toutain J Barey P y Cansell M Int Dairy J 2006 16489-496 10 Sikorska E Goacuterecki T Khmelinskii IV Sikorski MY Keukeleire D J Institute of Brewing 2004 110267-275


232

y en esta misma matriz la aplicacioacuten de PLS a los espectros sincroacutenicos permite determinar el contenido en vitamina B211

Karoui et al han publicado varios trabajos en los que informan del uso de la fluorescencia front-face para diferenciar entre productos de cereales diferentes12 o entre filetes de pescado fresco y congelado13 asegurar la frescura de huevos almacenados14 seguir el proceso de oxidacioacuten en quesos semicurados15 y clasificar mieles de diferente origen botaacutenico16 La cantidad de informacioacuten que puede obtenerse es auacuten mayor si las sentildeales fluorescentes no se limitan a los espectros de excitacioacuten emisioacuten o sincroacutenicos sino que se manejan las sentildeales fluorescentes totales es decir las matrices de excitacioacuten-emisioacuten (EEMs) o espectros tridimensionales que si se combinan con teacutecnicas quimiomeacutetricas ademaacutes de permitir aumentar la selectividad posibilitan que se pueda obtener informacioacuten extra sobre paraacutemetros que de forma geneacuterica nos permiten agrupar y discriminar objetos descritos mediante un vector de atributos ya sea construyendo las clases o asignando los objetos a clases previamente definidas Esta combinacioacuten permite obtener en tiempos de anaacutelisis muy pequentildeos informacioacuten que puede ser usada como ldquohuella

digitalrdquo de diversos alimentos Por tanto aplicando la teacutecnica de front-face se pueden obtener datos de segundo orden que se pueden tratar con herramientas quimiomeacutetricas con fines clasificatorios de tipificacioacuten seguimiento de procesos etc En su aplicacioacuten al 11 Sikorska E Eur Food Res Technol 2007 22543-48 12 Karoui R Cartaud G Dufour E J Agric Food Chem 2006 542027-2034 13 Karoui R Thomas E Dufour E Food Res Int 2006 39349-355 14 Karoui R Schoonheydt E Decuypere B Nicolau J De Baerdemaeker J Anal Chim Acta 2007 582 83-91 15 Karoui R Dufour E De Baerdemaeker J Food Chem 2007 1011305-1314 16 Karoui R Dufour E Bosset JO De Baerdemaeker J Food Chem 2007 101314-323


233

anaacutelisis de alimentos son muy pocos los procedimientos desarrollados Bro et al a traveacutes de las EEMs y PARAFAC evaluacutean los fluoroacuteforos responsables de la autofluorescencia de diversas muestras de azuacutecar17 El anaacutelisis mediante PARAFAC de las matrices de excitacioacuten-emisioacuten de diferentes yogures obtenidas mediante front-face pone de manifiesto la presencia de tres fluoroacuteforos riboflavina triptoacutefano y lumicromo cuya cantidad estaacute relacionada con las condiciones de almacenamiento18 Guimet et al aplican PARAFAC a las EEMs para evaluar los principales fluoroacuteforos y realizar una clasificacioacuten de diferentes tipos de aceites de oliva19 Tambieacuten se ha sugerido su aplicacioacuten como un meacutetodo potencial para comprobar la contaminacioacuten por dioxina en aceite de pescado basado en una correlacioacuten indirecta20 Caso concreto del vino

El intereacutes por el estudio acerca de la composicioacuten quiacutemica del vino se debe a su importancia en la evaluacioacuten de la calidad de este producto En los uacuteltimos antildeos los productores han mejorado la calidad de los vinos y por otra parte los consumidores son cada vez maacutes exigentes Por ello es importante desarrollar meacutetodos de anaacutelisis raacutepidos sin tratamiento previo de las muestras Las herramientas para manejar y abordar el anaacutelisis quiacutemico del vino se estaacuten convirtiendo en una necesidad en la industria del vino con el fin de automatizar la produccioacuten y estabilizar la calidad por lo que todas aquellos procedimientos que permitan la clasificacioacuten de los vinos en funcioacuten de la regioacuten de origen del tipo de uva utilizada en la elaboracioacuten o del proceso de elaboracioacuten de los vinos pueden ser uacutetiles para esta industria

17 Bro R Chemom and Intell Lab Syst 1999 46133-147 18 Christensen J Miquel Becker E Frederiksen CS Chemom Intell Lab Syst 2005 75210-208 19 Guimet F Ferre J Boque R Rius FX Anal Chim Acta 2004 51575-85 20 Pedersen DK Munck L Engelsen SB J Chemom 2002 16 451-460


234

Los uacutenicos antecedentes sobre la utilizacioacuten de sentildeales fluorescentes para clasificar vinos seguacuten la variedad y cosecha son los descritos por Dufour et al21 que estudian el potencial de las sentildeales de primer orden obtenidas mediante fluorescencia front-face combinadas con meacutetodos quimiomeacutetricos e investigan un total de 120 vinos producidos en Francia y Alemania Registran los espectros de emisioacuten (275ndash450 nm) y excitacioacuten (250ndash350 nm) de cada muestra y los relacionan con el contenido en compuestos fenoacutelicos Los espectros de emisioacuten se caracterizan por presentar un maacuteximo a 376 nm y un hombro a 315 nm y los de excitacioacuten muestran dos picos localizados en torno a 260 y 320 nm y su fisonomiacutea variacutea para las diferentes muestras de vino principalmente en cuanto a la relacioacuten de intensidades de maacuteximohombro Las muestras se evaluacutean usando anaacutelisis de componentes principales (PCA) y se clasifican mediante anaacutelisis factorial discriminatorio (FDA) En este primer estudio se muestran las posibilidades de la fluorescencia front-face en combinacioacuten con herramientas quimiomeacutetricas para asegurar la trazabilidad de vinos

Sobre la utilizacioacuten de datos de segundo orden con fines clasificatorios en

muestras de vino no se han encontrado antecedentes en la bibliografiacutea consultada No obstante el potencial de la teacutecnica debe aumentar con la dimensionalidad de los datos de manera que los datos tridimensionales seriacutean una herramienta maacutes poderosa que los bidimensionales especialmente desde el punto de vista de la clasificacioacuten de muestras Ello nos ha llevado a explorar las posibilidades de las matrices de excitacioacuten-emisioacuten obtenidas mediante la teacutecnica de front-face para la clasificacioacuten de muestras de vino y constituir una posible huella digital Asiacute en este capiacutetulo se aborda por primera vez el estudio de la matriz de excitacioacuten-emisioacuten del vino

21 Dufour E Letort A Laguet A Lebecque A Serra JN Anal Chim Acta 2006 563292-299


235

El objetivo principal de este capiacutetulo es detectar los principales compuestos fluorescentes presentes en el vino con el objetivo de mejorar en la interpretacioacuten de los espectros de fluorescencia de una matriz tan compleja Para ello se aplica PARAFAC sobre un cubo de datos construido a partir de las matrices de excitacioacuten-emisioacuten de fluorescencia del conjunto de muestras consideradas en este estudio La estrategia de muestreo que se sigue consiste en incluir en el modelo muestras de diferentes oriacutegenes lo suficientemente diferentes entre ellas con el objetivo de representar un abanico real de compuestos fluorescentes que pueden estar presentes en cualquier muestra Para la identificacioacuten de los principales fluoroacuteforos en el vino se buscaraacuten las correlaciones existentes entre los scores de cada muestra en cada uno de los componentes obtenidos en la descomposicioacuten mediante PARAFAC y las alturas de los picos correspondientes a componentes individuales separados en la columna cromatograacutefica establecieacutendose asiacute las bases para el desarrollo de futuros meacutetodos raacutepidos para la determinacioacuten cuantitativa de tales fluoroacuteforos

Por otra parte teniendo en cuenta que en el modelo se incluyen vinos de

distinta procedencia se estudiaraacute la capacidad de las sentildeales de autofluorescencia con fines clasificatorios seguacuten dicha procedencia Esta propuesta es muy importante en paiacuteses importadores de vino

RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN Muestras de vino incluidas en el modelo

Para la construccioacuten del modelo se partioacute de un conjunto de 57 muestras de vino de diferentes oriacutegenes y elaborados con distintos tipos de uva con el objetivo de que en el modelo esteacuten representados toda la variedad de compuestos


236

fluorescentes que pueden estar en una muestra real y en niveles tambieacuten lo maacutes cercanos posible a la realidad Concretamente la procedencia de las muestras es dos de Francia 16 de Chile 3 de Sudaacutefrica 6 de Australia (2 de ellas de Occidente) 3 de Espantildea 6 de Argentina 3 de USA 15 de Italia 1 de Tuacutenez y 2 de Portugal En la Tabla 1 se detalla el origen de cada muestra asiacute como el tipo de uva del que se obtienen cuando este dato estaacute disponible Las muestras se mantienen a una temperatura aproximada de 4ordm C y la matriz de fluorescencia de cada muestra se registra inmediatamente despueacutes de abrir cada botella

Tabla 1- Origen y tipo de uva de las muestras consideradas en el estudio

Muestra Nordm Origen Tipo de Uva 1 Francia Cabernet Sauvignon 2 Francia 3 Chile Cabernet Sauvignon 4 Chile Cabernet Sauvignon 5 Chile Cabernet Sauvignon 6 Chile Cabernet Sauvignon 7 Chile Cabernet Sauvignon 8 Chile Cabernet Sauvignon 9 Chile Merlot 10 Chile Cabernet Sauvignon 11 Chile Cabernet Sauvignon 12 Chile Cabernet Sauvignon 13 Chile 14 Chile 15 Sudaacutefrica Cabernet Sauvignon 16 Sudaacutefrica Cabernet Sauvignon 17 Sudaacutefrica Cabernet Sauvignon 18 Australia Occidental Syrah 19 Australia Occidental Syrah 20 Australia Syrah - Cabernet 21 Australia Syrah - Cabernet 22 Australia 23 Australia 24 Espantildea 25 Espantildea 26 Espantildea 27 Argentina Malbec ndash Syrah ndash 28 Argentina Malbec ndash Syrah ndash 29 Argentina Malbec ndash Syrah ndash 30 Argentina Syrah


237

Tabla 1- Origen y tipo de uva de las muestras consideradas en el estudio (continuacioacuten) Muestra Nordm Origen Tipo de Uva

31 Argentina Syrah 30 Argentina Syrah 31 Argentina Syrah 32 Argentina Syrah 33 USA Syrah 34 USA Ruby Cabernet 35 USA Ruby Cabernet 36 Italia 37 Italia 38 Italia (Sicilia) 39 Italia Sangiovese 40 Italia Sangiovese 41 Italia 42 Italia 43 Italia 44 Tuacutenez 45 Italia 46 Italia 47 Italia 48 Italia 49 Italia 50 Italia 51 Chile 52 Chile 53 Chile Merlot 54 Chile Merlot 55 Portugal 56 Portugal 57 Italia Sangiovese

Matrices de excitacioacuten-emisioacuten de fluorescencia

Las matrices de excitacioacuten-emisioacuten de fluorescencia (EEMs) correspondientes a las 57 muestras se registran en modo front-face con el objetivo de minimizar los efectos de filtro interno reflexioacuten dispersioacuten y despolarizacioacuten de la luz El aacutengulo de incidencia definido como el formado entre el haz de excitacioacuten y la perpendicular a la superficie de la celda se mantiene en 30ordm y el de observacioacuten en 60ordm (Figura 1) Una aliacutecuota de cada muestra de vino se transfiere directamente de la botella a una celda de cuarzo de 3 mL y 1 cm de paso de luz La


238

temperatura del laboratorio se mantiene en torno a 15 ordmC Las rendijas de excitacioacuten y emisioacuten de los monocromadores se fijan en 15 y 5 nm respectivamente La velocidad de adquisicioacuten se fija en 500 nmmin como solucioacuten de compromiso para disminuir el ruido en los espectros registrados y el tiempo de adquisicioacuten de la matriz Los rangos de longitudes de onda de excitacioacuten y emisioacuten son 245-340 nm y 300-500 nm con incrementos de 5 y 05 nm respectivamente Cada EEM se registra como muacuteltiples espectros de emisioacuten a distintas longitudes de onda de excitacioacuten de manera decreciente es decir de la radiacioacuten excitante menos energeacutetica a la maacutes energeacutetica con el objetivo de evitar en lo posible la alteracioacuten de la muestra por el haz UV de excitacioacuten El tiempo empleado en el registro de cada EEM es aproximadamente 10 minutos Todas las matrices se registran en el periodo de tiempo lo maacutes corto posible en concreto se emplearon 6 diacuteas con el objetivo de minimizar las variaciones instrumentales tales como las fluctuaciones en la intensidad de la laacutempara

Figura 1- Accesorio para realizar medidas de fluorescencia front-face


239

En la Figura 2 se recogen las EEMs de cuatro de los vinos analizados en forma de mapas de contorno asiacute como los espectros de excitacioacuten y emisioacuten extraiacutedos de las mismas como cortes horizontales y verticales respectivamente a las longitudes de onda de emisioacuten y excitacioacuten indicadas en el pie de dicha Figura

Como puede observarse en los mapas de contorno de la Figura 2 todas

las muestras emiten radiacioacuten fluorescente de longitudes de onda comprendidas entre 300 y 400 nm cuando son excitadas a longitudes de onda por debajo de 290 nm Los espectros de excitacioacuten y emisioacuten previamente publicados por Dufour et al21 empleados para discriminar entre vinos franceses y alemanes caen dentro de esta zona de fluorescencia comuacuten a todas las muestras No obstante como puede verse en la Figura 2 esta regioacuten es demasiados compleja como para obtener una visioacuten general de la misma utilizando un uacutenico par de espectros de excitacioacuten y emisioacuten Por otra parte cuando la radiacioacuten excitante es menos energeacutetica concretamente cuando es de longitudes de onda superiores a 290 nm se observa una nueva zona de emisioacuten de fluorescencia entre 350 y 450 nm


240

Muestra nuacutemero 1 Vino franceacutes

Muestra nuacutemero 7 Vino Chileno

Muestra nuacutemero 17 Vino sudafricano

Muestra nuacutemero 19 Vino australiano

Figura 2- IZQUIERDA EEMs correspondientes a las muestras nuacutemero 1 (Vino Franceacutes) 7 (Vino Chileno) 17 (Vino Sudafricano) y 19 (Vino Australiano) CENTRO Espectros de excitacioacuten extraiacutedos de la EEM a λem= 325 (negro) 363 (azul) y 388 nm (rojo) DERECHA Espectros de emisioacuten extraiacutedos de la EEM a λexc= 260 (azul) 280 (negro) y 320 nm (rojo)


241

Realizando un anaacutelisis maacutes profundo de las EEMs se describen a continuacioacuten las caracteriacutesticas maacutes relevantes de los espectros obtenidos realizando una serie de cortes horizontales y verticales en las zonas de maacutexima fluorescencia de las mismas Los espectros de emisioacuten (liacutenea azul) excitando a 260 nm presentan una banda relativamente ancha centrada a 372 nm en la cual pueden distinguirse dos maacuteximos a 363 y 380 nm La razoacuten de intensidades de emisioacuten de fluorescencia en ambos maacuteximos variacutea seguacuten la muestra como ya describieron previamente Dufour et al21 Asiacute por ejemplo en la muestra 19 la intensidad a 380 nm es mayor que a 363 nm al contrario que para las muestras 7 y 17 o en la muestra 1 en cuyo caso la razoacuten de intensidades a ambas longitudes de onda estaacute proacutexima a 1 En los espectros de excitacioacuten (liacutenea azul) obtenidos a 363 nm se observan dos maacuteximos centrados a 260 y 280 nm Al igual que ocurre con los espectros de emisioacuten previamente descritos las intensidades relativas en ambos maacuteximos de excitacioacuten variacutean con la muestra pudiendo ser la razoacuten IF(260) IF(280) mayor o menor que uno como ocurre en las muestras 19 y 1 respectivamente En otros casos como en las muestras 7 y 17 la maacutexima intensidad de excitacioacuten estaacute localizada en torno a 280 nm observaacutendose ademaacutes un simple hombro a 260 nm La maacutexima intensidad de emisioacuten de fluorescencia excitando a 280 nm (liacutenea negra) se centra a 363 nm apareciendo en algunos casos como por ejemplo en las muestras 1 y 17 un segundo maacuteximo de emisioacuten en torno a 325 nm tan importante como el primero En los espectros de excitacioacuten a 325 nm se observa para todas las muestras un uacutenico maacuteximo centrado a 275 nm

Por uacuteltimo en la zona de longitudes de onda de excitacioacuten maacutes desplazada hacia el rojo concretamente a 320 nm se obtiene el tercer espectro de emisioacuten


242

tiacutepico del vino (liacutenea roja) En este caso se observa una banda de emisioacuten centrada a 388 nm En los espectros de excitacioacuten obtenidos a 388 nm se observa un maacuteximo a 325 nm siendo la forma de dichos espectros por debajo de 300 nm similar a la de los previamente descritos a λem= 363 nm Construccioacuten del modelo PARAFAC Fundamentos del anaacutelisis factorial paralelo (PARAFAC) Cuando una muestra produce una matriz de datos de dimensiones J x K (tensor de segundo orden) tal como una EEM siendo J el nuacutemero de longitudes de onda de emisioacuten y K el nuacutemero de longitudes de onda de excitacioacuten el correspondiente conjunto de datos obtenidos apilando las matrices correspondientes a las I muestras incluidas en el modelo es un cubo de datos (matriz 3D) de dimensiones I x J x K (Figura 3)

Figura 3- Estructura del cubo de datos

Dado que las EEMs siguen un modelo bilineal dicho cubo puede

expresarse como un sumatorio de tensores producto de tres vectores extendido al nuacutemero de componentes que contribuye a la EEM Sean los vectores An Bn y Cn la contribucioacuten (I x 1) el perfil de emisioacuten (J x 1) y el perfil de excitacioacuten (K x 1) para el


243

componente n respectivamente entonces el cubo de datos F puede escribirse como2223

F = sum=

N

n 1An otimes Bn otimesCn + E

donde otimes representa un producto de tensores N es el nuacutemero total de

componentes y E es el teacutermino de error residual cuyas dimensiones son las mismas que las de F Los vectores columna an bn y cn se recogen en la matriz de los scores A conteniendo las contribuciones relativas de los diferentes componentes y en las matrices de los loadings B y C

En la Figura 4 se representa esquemaacuteticamente la descomposicioacuten mediante PARAFAC de un conjunto de EEMs

Figura 4- Descomposicioacuten mediante PARAFAC de una serie de EEMs en tres factores

Una ventaja importante del modelo PARAFAC viene dada por el hecho de que las soluciones que propone son uacutenicas (unicidad) La descomposicioacuten de F suministra los loadings y los scores de los componentes individuales en todas las muestras sean quiacutemicamente conocidos o no Esto es especialmente uacutetil en el anaacutelisis de matrices de alimentos donde no se disponen de patrones de los componentes puros

22 Ewing GW Instrumental methods of chemical analysis Mc Graw-Hill New York 1985 23 Leurgans S Ross RT Stat Sci 1992 7 289-319


244

Bro24 denomina a esta teacutecnica como ldquocromatografiacutea matemaacuteticardquo debido al hecho de que la separacioacuten (cromatografiacutea) de las sentildeales de los constituyentes se lleva a cabo matemaacuteticamente (computacionalmente) Modelo PARAFAC El anaacutelisis por PARAFAC se lleva a cabo en Matlab 710 (The Mathworks Inc MA USA) utilizando las rutinas contenidas en PLS_Toolbox (Eigenvector Research Inc WA USA) Las dimensiones del cubo de datos obtenido agrupando las EEMs correspondientes a las 57 muestras es 57 x 398 x 20 (muestras x λ excitacioacuten x λ emisioacuten) Una vez construido este cubo los datos han de ser pretratados antes de proceder a su anaacutelisis mediante PARAFAC Se procede en primer lugar a la eliminacioacuten de las sentildeales de dispersioacuten Rayleigh Para ello se inserta el teacutermino NaN (ldquonot a numberrdquo) en las liacuteneas λexc = λem y 2λexc= λem con una amplitud determinada Por otra parte en la zona triangular de la matriz donde λexc gt λem se insertan ceros ya que no es loacutegico que exista emisioacuten a longitudes de onda menores que la de excitacioacuten ya que esta situacioacuten se corresponderiacutea con una emisioacuten maacutes energeacutetica que la radiacioacuten causante de la excitacioacuten Se ha comprobado que los ceros en esta zona aceleran los caacutelculos pero no deben estar demasiado cerca de la zona λexc = λem ya que si asiacute fuera se introduciriacutean deformaciones (ldquoartefactsrdquo) en las matrices El cubo de datos ya pretratado se descompone mediante PARAFAC utilizando diferente nuacutemero de factores y aplicando en todos los casos la restriccioacuten

24 Bro R Multi-way Analysis in the Food Industry Theory Algorithms and Applications Doctoral Dissertation University of Amsterdam 1998


245

de no negatividad en los tres modos Estas restricciones se aplican para obtener una solucioacuten realista ya que tanto las concentraciones como las sentildeales de fluorescencia tienen que ser positivas Por aplicacioacuten de PARAFAC sobre el cubo de datos se obtienen los perfiles espectrales de componentes fluorescentes puros o como seriacutea maacutes correcto decir al trabajar directamente sobre una muestra tan compleja como el vino se obtendriacutean los perfiles correspondientes a conglomerados de fluoroacuteforos de comportamiento similar La eleccioacuten del nuacutemero oacuteptimo de factores es el primer paso en la construccioacuten del modelo Para tomar esta decisioacuten pueden adoptarse diferentes criterios25 entre ellos el llamado diagnoacutestico de la consistencia del modelo (core

consistency diagnostic) CORCONDIA26 seguacuten el cual cuando se incrementa de forma progresiva el nuacutemero de componentes y se representa el valor del core en funcioacuten del nuacutemero de factores se obtiene un salto brusco una vez alcanzado el nuacutemero de componentes ideal En nuestro caso los porcentajes de core calculados para modelos con uno y dos factores son 100 y 992 respectivamente Para tres cuatro y cinco factores se obtienen porcentajes de core de 509 404 y -33 respectivamente A la vista de estos resultados se rechazan los modelos con uno y dos factores asiacute como el modelo con cinco factores en cuyo caso se desembocariacutea en una situacioacuten de sobreajuste En este caso la apariencia de los perfiles fluorescentes nos ha sido especialmente uacutetil para decidir que el nuacutemero oacuteptimo de factores es cuatro ya que los perfiles fluorescentes del quinto componente tienen la apariencia de ser una combinacioacuten de los del primero y el

25 Andersen CM Bro R J Chemom 2003 17200-215 26 Bro R Kiers HAL J Chemom 2003 17274-286


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cuarto mientras que los perfiles obtenidos en el modelo con cuatro factores parecen independientes entre ellos

Por otra parte observando los valores de score se deduce que no existen muestras discrepantes al no encontrar valores extremos En la Figura 5 se muestran los perfiles espectrales de excitacioacuten y emisioacuten obtenidos En base a estos perfiles y asumiendo la bilinearidad en las EEMs se obtiene la estructura tridimiensional para cada factor obtenida por multiplicacioacuten de los vectores columna perfil de excitacioacutenotimes perfil de emisioacuten (Figura 6)

Figura 5- Perfiles fluorescentes de excitacioacuten (izquierda) y emisioacuten (derecha) para los cuatro factores (primero (mdash) segundo (mdash) tercero (mdash) y cuarto (mdash) del modelo de PARAFAC construido en base a las EEMs de las 57 muestras de vino

300 350 400 450 500λem (nm)

I F R

elativ

a

240 260 280 300 320 340λexc (nm)

I F R

elati

va


247

Figura 6- Estructura tridimensional de los factores primero (azul) segundo (rosa) tercero (naranja) y cuarto (verde) obtenidos por multiplicacioacuten de los correspondientes vectores loading

El perfil de excitacioacuten del primer componente presenta un uacutenico maacuteximo en la

zona maacutes desplazada hacia el ultravioleta concretamente a 255 nm y el perfil de emisioacuten consiste en un maacuteximo agudo a 380 nm con un hombro a 365 nm Los maacuteximos de excitacioacuten y emisioacuten para el segundo factor estaacuten situados a 275 y 323 nm respectivamente En los maacuteximos de excitacioacuten y emisioacuten del tercer componente se observa un importante desplazamiento batocroacutemico estando centrados a 330 y 410 nm respectivamente asiacute como un ensanchamiento de los mismos con respecto a los componentes previamente descritos Por uacuteltimo el cuarto componente se situacutea cercano al primero y segundo estando relacionado por tanto con la zona maacutes desplazada al azul en las EEMs y presenta un maacuteximo de excitacioacuten a 280 nm con un hombro a 260 nm y un maacuteximo de emisioacuten a 364 nm


248

Por otra parte la matriz de scores que mide la contribucioacuten o participacioacuten de cada uno de los cuatro componentes en cada EEM se analiza mediante anaacutelisis de componentes principales (PCA) con el objetivo de extraer el maacuteximo de informacioacuten

Antes de pasar a comentar los resultados de este PCA se procede a comprobar la estabilidad del modelo construido mediante ldquosplit-half analysisrdquo27 Este consiste en dividir el cubo inicial de datos en distintos subconjuntos y aplicar PARAFAC a cada uno de ellos independientemente Se ensayan distintos criterios de divisioacuten como muestras pares ndash muestras impares italianas ndash no italianas chilenas ndash no chilenas etc obtenieacutendose en todos los casos perfiles de excitacioacuten y emisioacuten similares a los obtenidos al analizar el cubo de datos completo Queda asiacute demostrada la estabilidad del modelo construido

Otra manera de comprobar la estabilidad del modelo basada en la misma idea de aplicar PARAFAC por subzonas es dividir no por muestras sino por subrangos dentro de los ejes de excitacioacuten y emisioacuten Asiacute se definen nuevos subconjuntos de datos teniendo en cuenta la zona en la que se situacutean los maacuteximos de excitacioacuten y emisioacuten de cada componente Por ejemplo seguacuten el componente uno la subzona comprenderiacutea los rangos de excitacioacuten y emisioacuten de 245 a 270 nm y de 360 a 420 nm respectivamente De esta manera se extraen cuatro nuevos subcubos de datos sobre los que se aplica PARAFAC obtenieacutendose en todos los casos ideacutenticos perfiles y quedando por tanto ratificada la estabilidad del modelo

27 Harshman RA de Sarbo WS An application of PARAFAC to a small sample problem demonstrating preprocessing orthogonality constraints and split-half diagnostic techniques In Research Methods for Multimode Data Analysis Law HG Snyder CW Hattie JA McDonald RP (eds) PraegerNew York 1984 602-642


249

Anaacutelisis de componentes principales de los valores de PARAFAC-score El anaacutelisis de componentes principales (PCA) es una poderosa herramienta de visualizacioacuten para la evaluacioacuten de datos que proporciona un modo de reducir la dimensionalidad del conjunto inicial de datos y representa graacuteficamente las posibles relaciones inter-variable e inter-muestra El PCA es un meacutetodo de anaacutelisis ldquono supervisadordquo en tanto en cuanto no se conoce o se ignora deliberadamente la existencia de categoriacuteas en el conjunto inicial de datos La proyeccioacuten sobre el plano de una nube de puntos multidimensionales puede ofrecer visiones muy ilustrativas de las estructuras que contiene Para ello es necesario seleccionar cuidadosamente mediante la aplicacioacuten de criterios racionales el plano de observacioacuten Se trata de construir modelos de la nube de puntos buscando secuencialmente las direcciones del espacio (nuevo ejes de coordenadas) que ofrecen la mejor visioacuten posible de la misma Estos nuevos ejes de coordenadas vectores propios (eigenvectors) autovectores o componentes principales - PC se construyen como combinaciones lineales de las variables manifiestas (ejes de coordenadas iniciales) Estos componentes principales son por tanto variables latentes que se utilizan para descubrir las direcciones del espacio correlacionadas con causas objetivas de varianza que son las variables fundamentales o factores subyacentes en nuestro caso paiacutes de origen y variedad de uva Se trata por tanto de encontrar las combinaciones lineales de variables manifiestas que contribuyen en mayor medida a hacer diferentes unas muestras de otras Cuando se construye un vector que modula una nube de puntos la varianza total de los datos queda dividida en varianza explicada por el vector y varianza residual Se denomina autovalor del componente principal a la varianza explicada por eacuteste Los componentes principales se hallan siguiendo el criterio de hacer maacutexima la varianza explicada o lo que es igual hacer miacutenima la varianza residual


250

El primer PC es el que contiene la mayoriacutea de la informacioacuten o en teacuterminos estadiacutesticos el que tiene el mayor valor de varianza explicada el segundo PC llevaraacute la mayor parte de la informacioacuten residual y asiacute sucesivamente Si se proyectan las muestras sobre el plano de los dos primeros componentes o de cualquiera otros dos obtenemos una representacioacuten de una parte de la informacioacuten aportada por el conjunto de las variables manifiestas que seraacute igual al porcentaje de la varianza total explicada por dichos PCs Las coordenadas de cada muestra sobre cada uno de estos ejes transformados se denominan scores o en espantildeol puntuaciones o contribuciones Las muestras que tienen valores de score muy cercanos a lo largo del mismo PC son similares en cuanto a los valores para las correspondientes variables manifiestas recogidas en dicho PC Contrariamente muestras cuyos scores difieren mucho son tambieacuten bastante diferentes en cuanto a los valores de dichas variables La representacioacuten maacutes uacutetil en cuanto a su interpretacioacuten es la del primer componente respecto al segundo ya que eacutestos contienen la mayor parte de la informacioacuten

Por otro lado resulta igualmente interesante describir la estructura de los datos en teacuterminos de correlacioacuten entre variables Cada variable manifiesta tiene una ldquocontribucioacutenrdquo ldquocargardquo o loading en cada PC Este valor refleja en queacute medida dicha variable manifiesta contribuye a dicho PC asiacute como el grado en que dicho PC toma en cuenta la variacioacuten de dicha variable en el conjunto de los datos Cuaacutento mayor el enlace entre la variable y el PC mayor el loading Si dos variables tienen loadings altos respecto al mismo PC dichas variables estaraacuten altamente correlacionadas positivamente si los loadings tienen el mismo signo o negativamente si tienen signos contrarios Si consideramos cada PC por separado podemos decir que las variables con valores de loading pequentildeos no deben considerarse en su interpretacioacuten En cuanto a las muestras podemos decir que si


251

el score de una muestra y el loading de una variable en un particular componente principal tienen el mismo signo entonces la muestra tiene un valor superior a la media de dicha variable

Los valores de los loadings se representan igualmente en graacuteficos

bidimensionales en los que se recogen los valores respecto a dos componentes principales usualmente los dos primeros Para interpretarlos hay que considerar que si el punto se halla a gran distancia del centroide del graacutefico es decir si los loadings sobre ambos componentes son altos la variable cede casi toda su varianza al plano de ambos componentes y no le queda varianza relevante que ceder a otros componentes Los aacutengulos que forma el vector que une el origen de coordenadas con el punto y con los ejes de coordenadas indican a cuaacutel de los PC cede preferentemente su varianza esto es con cuaacutel de los dos estaacute maacutes fuertemente correlacionada Si el punto se encuentra cerca del centroide no cede varianza al plano de ambos componentes Si existen dos o maacutes variables manifiestas con distancias grandes respecto al origen todas ellas ceden gran parte de su varianza a dicho plano es decir son casi coplanares con los dos PC considerados Un aacutengulo pequentildeo o proacuteximo a 180ordm indica fuerte correlacioacuten positiva o negativa entre las variables y probablemente los vectores correspondientes sentildealan la direccioacuten de una variable fundamental En cambio un aacutengulo proacuteximo a 90ordm indica ortogonalidad o independencia entre esas variables manifiestas El PCA sobre el conjunto de scores de PARAFAC se lleva a cabo mediante el paquete de software The Unscramblerreg28

28 Unscrambler v 611b CAMO AS Olav Tryggvasonsgt N-7011 Trondheim Norway


252

El conjunto de valores de score es una matriz de dimensiones 57 x 4 es decir nuacutemero de muestras x nuacutemero de factores Cada fila de la misma compuesta de cuatro valores representa la participacioacuten de cada uno de los cuatro factores en la EEM de la muestra en cuestioacuten y se denominan en adelante f1 a f4 En dicho conjunto de datos se incluyen dos variables de categoriacutea el origen de las muestras y el tipo de uva cuando dicho dato sea conocido (Tabla 1) En la Figura 7 se muestra el conjunto de las 57 muestras proyectadas sobre el plano definido por los componentes principales 1 (PC1) y 2 (PC2) agrupadas seguacuten el origen El porcentaje de varianza explicada seguacuten este modelo y con estos dos componentes principales es del 75


253

Figura 7- Scores (superior) y loadings (inferior) del PCA sobre las 57 muestras Muestras agrupadas en el mapa de scores en funcioacuten del origen

Se observa cierta discriminacioacuten entre muestras de diferentes paiacuteses

Respecto a PC1 las muestras chilenas son las que presentan valores de score maacutes negativos sobre este eje estando dichas muestras agrupadas en la parte izquierda del mapa de scores Las muestras espantildeolas y las procedentes de Australia occidental presentan los valores de score maacutes altos en dicho componente estando ambos conjuntos diferenciados entre si por los valores de score en PC2 presentando las muestras 18 y 19 los valores de score maacutes altos en


254

dicho componente Por uacuteltimo merece la pena resaltar los bajos valores de score en ambos PCs de las muestras italianas francesas sudafricanas y americanas estando claramente diferenciadas de los dos cluacutester previamente descritos

Como es natural no todas las muestras estaacuten incluidas en un cluacutester ya que hay otros muchos factores aparte del origen que influyen sobre la poblacioacuten de compuestos fluorescentes en el vino Los compuestos fluorescentes presentes en el vino son mayoritariamente generados en la pulpa semillas y pieles de la uva y son parcialmente extraiacutedos en el proceso de elaboracioacuten del vino Por lo tanto parece loacutegico pensar que la variedad de uva seraacute un factor muy influyente en los fluoroacuteforos presentes en el vino asiacute como sus concentraciones relativas Otros factores que afectan a la poblacioacuten de fluoroacuteforos en el vino son por ejemplo el clima las condiciones ambientales y del terreno en el que crecen las uvas el tratamiento de los vintildeedos (riego poda etc) la madurez del fruto en el momento de la cosecha el tipo de fermentacioacuten empleada en el proceso de elaboracioacuten la maceracioacuten el envejecimiento en barrica entre otros Tal y como se muestra en la Tabla 1 en algunos casos se conoce el tipo de uva empleado en la elaboracioacuten de alguna de las muestras siendo algunas de ellas monovarietales y otras multivarietales Se realiza entonces un PCA sobre el conjunto de muestras de las que se dispone de este dato Los resultados de este anaacutelisis se recogen en la Figura 8 en la que se representa los scores y loadings sobre el plano definido por los componentes principales 1 (PC1) y 2 (PC2) (90 de la varianza explicada)


255

Figura 8- Scores (superior) y loadings (inferior) del PCA sobre el conjunto de muestras de las que se conoce el tipo de uva Muestras agrupadas en el mapa de scores en funcioacuten del tipo de uva

Se observa que las muestras chilenas son un claro ejemplo de la influencia de esta variable Asiacute las muestras 9 53 y 54 elaboradas a partir de uvas Merlot estaacuten separadas del resto de muestras chilenas en el mapa de los scores definido por PC1 y PC2 La influencia del origen sobre muestras elaboradas con el mismo tipo de uva tambieacuten es una evidencia Se observa que las muestras nuacutemero 18 y


256

19 procedentes de Australia Occidental estaacuten situadas en el mapa de los scores muy lejos de las muestras 30 31 y 32 procedentes de Argentina y de la muestra 33 procedente de USA estando todos estos vinos elaborados con uva de tipo Sirah

Como se observa en las Figuras 7 y 8 las variables f1 y f4 ceden casi toda

su varianza al plano definido por PC1 y PC2 estando dichas variables negativamente correlacionadas

La poblacioacuten de muestras procedentes de Chile son un caso bastante particular como se comenta a continuacioacuten Los resultados del PCA sobre este conjunto de muestras incluyendo como variable de categoriacutea el tipo de uva se representan en la Figura 9 De nuevo se pone de manifiesto la discriminacioacuten entre los vinos elaborados con uva de tipo Merlot (muestras nuacutemero 9 53 54) del resto de muestras a pesar de ser todas del mismo paiacutes Como se observa en la Figura 7 estas tres uacuteltimas muestras no estaacuten dentro del cluacutester de muestras chilenas posiblemente debido al tipo de uva Ademaacutes como se observa en el mapa de los loadings el tercer componente de PARAFAC contribuye en mayor medida a PC2 que en los modelos representados en las Figuras 7 y 8 Tambieacuten se observa una inversioacuten en las posiciones relativas de f1 y f4 en esta graacutefica de loadings y por ello las muestras 9 53 y 54 estaacuten situadas en la parte izquierda en las graacuteficas de los score al contrario de lo que ocurre en las graacuteficas de las Figuras 7 y 8


257

Figura 9- Scores (superior) y loadings (inferior) del PCA sobre el conjunto de muestras chilenas Muestras agrupadas en el mapa de scores en funcioacuten del tipo de uva


258

Identificacioacuten de los fluoroacuteforos presentes en vino Caracterizacioacuten fluorescente de fluoroacuteforos presentes en vino Se registran los espectros de excitacioacuten y emisioacuten de fluorescencia de una serie de compuestos presentes en el vino que poseen propiedades fluorescentes Concretamente se ensayan los aacutecidos gaacutelico p-cumaacuterico elaacutegico ferruacutelico gentiacutesico vaniacutellico cafeacuteico y sinaacutepico trans-resveratrol trans-piceido quercetina

rutina catequina y epicatequina y los antocianos malvidina-3-O-β-glucopiranoacutesido

petunidina-3-O-β-glucopiranoacutesido y delfinidina-3-O-β-glucopiranoacutesido El

comportamiento fluorescente de estos compuestos es altamente dependiente del entorno quiacutemico en el que se encuentran estando muy influenciado por variables tales como la acidez y la composicioacuten del medio Por lo tanto se ha buscado un entorno quiacutemico lo maacutes similar posible a la matriz del vino de modo que todas las medidas de estos patrones se llevan a cabo en una matriz de vino sinteacutetica compuesta por tampoacuten tartrato de pH 37 en una concentracioacuten de 3 gL y etanol al 13 v Las condiciones instrumentales empleadas son similares a las utilizadas en el registro de las muestras de vino pero usando la geometriacutea tradicional de medida (90 ordm) al no tratarse de muestras concentradas

En la Tabla 2 se resumen las longitudes de onda de maacutexima excitacioacuten y emisioacuten de cada uno de estos compuestos asiacute como las de los cuatro factores obtenidos mediante PARAFAC


259

Tabla 2- Propiedades fluorescentes de los compuestos ensayados en medio tartaacuterico de pH 37 3 gL y etanol al 13 v y de los cuatro componentes obtenidos en la descomposicioacuten mediante PARAFAC de la EEM total del vino

Compuesto λexc (nm) λem (nm)

aacutecido gaacutelico 241 350

aacutecido p-cumaacuterico 348 410

aacutecido vaniacutellico 241 282 305 354

aacutecido cafeico 262 433

aacutecido elaacutegico 333 422

aacutecido sinaacutepico 297 335 446

aacutecido ferruacutelico - -


aacutecido gentiacutesico 320 446

trans-resveratrol 318 390

No-Flavonoides

Estilbenos trans-piceido 318 390

quercetina 427 480 Flavonoles

rutina - -

catequina 279 317 Flavanoles

epicatequina 280 316 malvidina-3-O-β-glucopiranoacutesido 280 355

delfinidina-3-O-β-glucopiranoacutesido 280 355

Flavonoides

Antocianos

petunidina-3-O-β-glucopiranoacutesido 280 355

Componente 1 260 380



Componente 4 260 280 364


260

Las longitudes de onda de maacutexima excitacioacuten y emisioacuten del par de isoacutemeros catequina y epicatequina son proacuteximas a las del componente 2 Por otra parte los maacuteximos de excitacioacuten y emisioacuten de los aacutecidos p-cumaacuterico y gentiacutesico trans-resveratrol y trans-piceido son cercanos a los del componente 3 Por uacuteltimo se deduce que el aacutecido vaniacutellico podriacutea estar relacionado con el componente 4 dada la proximidad entre sus maacuteximos de emisioacuten y entre los diferentes maacuteximos que aparecen en el espectro de excitacioacuten Con respecto al componente 1 no se encuentra ninguna similitud entre las longitudes de onda correspondientes a los perfiles de este factor y los estaacutendares medidos

Los espectros de excitacioacuten y emisioacuten correspondientes a los estaacutendares de los posibles candidatos se muestran en la Figura 10 Es importante resaltar que excepto en el caso del par de isoacutemeros catequina y epicatequina que encajan perfectamente con los perfiles del componente 2 para el resto de los compuestos ensayados no se da una similitud tan elevada entre los patrones y los perfiles de PARAFAC lo que apoya la idea de que cada componente de PARAFAC no representa un uacutenico fluoroacuteforo sino un conglomerado de fluoroacuteforos o familia de compuestos de comportamiento fluorescente similar


261

Figura 10- Espectros de excitacioacuten y emisioacuten de algunos de los compuestos ensayados

200 300 400 500λ (nm)

0

200

400

600

800

F I

Catechin

200 300 400 500λ (nm)

0

100

200

300

400

500

F I

Epicatechin

200 300 400 500λ (nm)

0

100

200

300

F I

p-Coumaric Acid

200 300 400 500λ (nm)

0

200

400

600

800

1000

F I

Gentisic Acid

200 300 400 500λ (nm)

0

200

400

600

800

1000

F I

t-Resveratrol t-Piceid

200 300 400 500λ (nm)

0

100

200

300

F I

Vanillic Acid


262

Anaacutelisis cromatograacutefico de las muestras de vino Con el objetivo de alcanzar un mayor conocimiento acerca de la poblacioacuten de moleacuteculas fluorescente en el vino se procede a cromatografiar las 57 muestras incluidas en este estudio monitorizando fluorimeacutetricamente el eluato a los pares de longitudes de onda de excitacioacuten y emisioacuten correspondientes a los componentes obtenidos en la descomposicioacuten de las EEMs mediante PARAFAC Para llevar a cabo la elucioacuten de las muestras se selecciona un programa de gradiente apropiado con el objetivo de obtener una buena separacioacuten Como fase moacutevil se emplea una mezcla metanol-aacutecido foacutermico-agua (10288 vvv) como disolvente A y metanol-aacutecido foacutermico-agua (9028 vvv) como disolvente B con el siguiente gradiente 0 minutos 100 A 15 minutos 85 A15 B 25 minutos 50 A50 B 34 minutos 30 A70 B El flujo se mantiene a 025 mLmiddotmin-1 El eluato se monitoriza fotomeacutetricamente a 255 260 275 280 y 330 nm y fluorimeacutetricamente a λexcem 260 360 nm (longitudes de onda de compromiso para los componentes 1 y 4) 275 320 nm (componente 2) y 330 410 nm (componente 3) respectivamente En la Figura 11 se recogen los tres cromatogramas registrados para una de las muestras a los tres pares de longitudes de onda de excitacioacutenemisioacuten Se observa que la fluorescencia global de la muestra al excitar a 330 nm es mucho menor que la obtenida excitando a 260 oacute 275 nm Se obtiene una buena separacioacuten entre los componentes fluorescentes a cada par de longitudes de onda lo que permite obtener una estimacioacuten de su concentracioacuten real en la muestra a traveacutes de la altura de sus picos cromatrograacuteficos


263

Figura 11- Perfiles de fluorescencia a los tres pares de longitudes de onda correspondientes a una misma muestra

Una vez que se registran los cromatogramas correspondientes a las 57

muestras se empiezan a buscar posibles correlaciones entre los valores de score obtenidos en la descomposicioacuten por PARAFAC y las alturas de los picos correspondientes a componentes individuales en los respectivos cromatogramas Con respecto al primer componente se encuentran buenas correlaciones entre los valores de score para este componente y las alturas de los picos a 300 y 345 minutos en los perfiles obtenidos a λexcem 260 360 nm No obstante la mejor correlacioacuten se encuentra con la altura del pico que aparece a 345 minutos En la Figura 12 se representa la altura de este pico para las 57 muestras frente a los scores en el componente uno

Con el fin de completar la caracterizacioacuten de los componentes fluorescentes en el vino se han registrado los espectros de emisioacuten excitando a


264

260 nm y se encuentra que el espectro de emisioacuten correspondiente al pico que aparece a 345 minutos es praacutecticamente similar al perfil de emisioacuten del componente uno (Figura 13) Con respecto al espectro en el pico a 300 minutos se encuentra que estaacute localizado en la misma regioacuten en longitudes de onda que el componente uno pero que su fisonomiacutea no se corresponde con la de este componente (Figura 13) Por dopaje de las muestras con los patrones de los que se dispone se corrobora que este pico no se corresponde con ninguno de ellos como era de esperar ya que al caracterizar estos patrones fluorimeacutetricamente no se encontroacute que ninguno de ellos presentara espectros de excitacioacuten y emisioacuten coincidentes con los perfiles del componente uno Mediante LC-MS se deduce que la masa molecular de este compuesto es de 534 un valor relativamente elevado lo que nos lleva a pensar que pudiera tratarse de un compuesto de condensacioacuten

Figura 12- Correlacioacuten entre los valores de score del componente 1 de cada muestra y la altura del pico a 345 minutos

Figure 13- Espectros de emisioacuten a λexc= 260 nm obtenidos en los aacutepices de los picos a 30 (izquierda) y 345 minutos (centro) (derecha) perfil de emisioacuten del componente uno

300 350 400 450 500λem (nm)

I F R

elativ

a


265

Como ya se comentoacute anteriormente al describir la caracterizacioacuten de fluoroacuteforos tiacutepicos presentes en el vino se piensa que el componente cuatro puede estar relacionado con el aacutecido vaniacutellico En la Figura 14 se representa la altura del pico correspondiente a este polifenol en los 57 cromatogramas obtenidos a λexcem 260360 nm frente a los valores de score para dicho componente encontrando cierta correlacioacuten si bien no muy elevada

Figura 14- Altura del pico correspondiente al aacutecido vaniacutellico (25 minutos) vs valores de score en el componente 4 para las 57 muestras

Con respecto a los cromatogramas obtenidos a λexcem 275 320 nm (en

este caso no se inyectan todas las muestras sino las maacutes representativas de la variacioacuten de este factor es decir muestras con alto medio y bajo contenido en este factor) se encuentran elevadas correlaciones entre los valores de score

correspondientes al segundo componente de PARAFAC y las alturas de los picos a 222 y 277 minutos correspondientes al par de isoacutemeros catequina y epicatequina respectivamente (Figura 15) Este hecho estaacute de acuerdo con la similitud ya comentada entre los espectros de excitacioacuten y emisioacuten de ambos compuestos con los perfiles correspondientes al componente 2 confirmaacutendose por tanto la asignacioacuten de dicho componente a ambos isoacutemeros


266

Figura 15- Altura de los picos correspondientes a catequina (superior) y epicatequina (inferior) frente a los valores de score del componente 2 para las muestras ensayadas

En uacuteltimo lugar con respecto al tercer componente se encuentran buenas correlaciones entre los valores de score para el mismo y los picos a 287 302 (aacutecido p-cumaacuterico) 330 y 363 minutos en los cromatogramas obtenidos a λexcem 330410 nm para las muestras maacutes representativas de la envergadura de este factor Esto nos indica que efectivamente este factor estaacute asociado a un conjunto de fluoroacuteforos y con los datos disponibles no podemos concluir el peso de cada uno de ellos


267

Utilizacioacuten de las sentildeales de autofluorescencia total del vino en combinacioacuten con herramientas quimiomeacutetricas para asegurar la pertenencia del vino a una DO El vino es un producto que muy comuacutenmente estaacute sometido a denominaciones de origen lo que implica la necesidad de disponer de herramientas analiacuteticas potentes que permitan llevar a cabo un control de las diferentes partidas Las sentildeales totales de autofluorescencia de este producto se perfilan como candidatas idoacuteneas para futuros meacutetodos de control analiacutetico El objetivo de este apartado es el estudio de las posibilidades de las EEMs para discriminar entre muestras de vino pertenecientes a la DO ldquoRiojardquo y las no pertenecientes asiacute como la posible diferenciacioacuten entre muestras de vino joven crianza y reserva y las capacidades para predecir el contenido total de polifenoles En este caso se construye un modelo en el que se incluyen 59 muestras de vino 48 de las cuales pertenecen a la DO y 11 son no pertenecientes Dentro de los vinos de la DO hay muestras de vinos joven de crianza y reserva Las muestras se mantienen a una temperatura aproximada de 4 ordmC y la matriz de fluorescencia de registra inmediatamente despueacutes de abrir cada botella

Las EEMs correspondientes a las 59 muestras se registran en modo front-

face En este caso el aacutengulo de incidencia definido como el formado entre el haz de excitacioacuten y la perpendicular a la superficie de la celda se mantiene en 34ordm Para el registro de la EEM una aliacutecuota de cada muestra de vino se transfiere directamente de la botella a una celda de cuarzo de 3 mL y 1 cm de paso de luz La temperatura del laboratorio se mantiene en torno a 15 ordmC Las rendijas de excitacioacuten y emisioacuten de los monocromadores se fijan en 5 nm respectivamente La velocidad de adquisicioacuten se fija en 1200 nmmin como solucioacuten de compromiso


268

entre ruido en los espectros registrados y tiempo de adquisicioacuten de la matriz Los rangos de longitudes de onda de excitacioacuten y emisioacuten son 245-345 nm y 300-500 nm respectivamente con incrementos de 2 nm en ambos casos lo que implica 51 valores de longitudes de onda de excitacioacuten y 101 de emisioacuten Cada EEM se registra como muacuteltiples espectros de emisioacuten a distintas longitudes de onda de excitacioacuten Cuando se agrupan las EEMs correspondientes a las 59 muestras se obtiene un cubo de datos de dimensiones 59 x 101 x 51 Este cubo de datos es pretratado para eliminar del mismo las sentildeales de dispersioacuten y anular la zona de las matrices en las que λexcgtλem como se ha explicado anteriormente Se procede entonces a la descomposicioacuten de este cubo de datos mediante PARAFAC En primer lugar se procede a deducir el nuacutemero oacuteptimo de factores Para ello se realizan los caacutelculos empleando un nuacutemero de factores comprendido entre uno y cuatro aplicando en todos los casos la restriccioacuten de no negatividad en los tres modos Los valores de core obtenidos para uno dos y tres factores son de 100 999 y 802 mientras que para el modelo construido con cuatro factores se obtiene un valor del 343 A traveacutes de esta caiacuteda en el valor del core y al observar la estructura de los perfiles obtenidos se deduce finalmente que el nuacutemero oacuteptimo de factores en este caso es de tres ya que los perfiles de fluorescencia del cuarto parecen uacutenicamente ruido sin una forma definida Los perfiles de excitacioacuten y emisioacuten de los tres componentes se representan en la Figura 16


269

Figura 16- Perfiles normalizados de excitacioacuten (izquierda) y emisioacuten (derecha) correspondientes a los factores 1 (mdash) 2 (mdash) y 3 (mdash) obtenidos mediante PARAFAC

El perfil de excitacioacuten del primer componente se caracteriza por un maacuteximo centrado a 260 nm y un hombro a 295 nm su perfil de emisioacuten consta de un maacuteximo principal centrado a 363 nm y cuatro pequentildeos picos a 420 470 485 y 495 nm El segundo componente estaacute caracterizado por bandas relativamente anchas de excitacioacuten y de emisioacuten centradas a 330 y 425 nm respectivamente El perfil de excitacioacuten del tercer componente presenta dos maacuteximos el maacutes intenso de ellos centrado a 285 nm y uno de menor intensidad a 335 nm en el perfil de emisioacuten de este componente se observa un maacuteximo principal centrado a 325 nm Como se hizo con el modelo anteriormente discutido en este caso tambieacuten se comprueba la estabilidad mediante ldquosplit half analysisrdquo y analizando las matrices por zonas de excitacioacuten y emisioacuten La matriz de scores obtenida en este caso mediante PARAFAC tiene dimensiones 59 x 3 Dicho set de datos se analiza por PCA Los resultados de dicho anaacutelisis se recogen en la Figura 17 en forma de graacuteficos de scores y loadings

I F R

elativ

a

240 260 280 300 320 340 360λ (nm)

I F R

elativ

a

300 350 400 450 500λ (nm)


270

Figura 17- Graacuteficos de loadings (superior) y scores (inferior) en el plano PC1-PC2 En la graacutefica de los scores se muestran en azul las muestras de las DO y en rojo las que no pertenecientes

Del graacutefico de los loadings se deduce que las variables 1 y 3 estaacuten

inversamente correlacionadas y ambas variables ceden su varianza a PC1 y PC2 Por su parte en el graacutefico de los scores las muestras se han agrupado dependiendo de su pertenencia o no a la DO asiacute las muestras azules son vinos de Rioja y las rojas son vinos de DO distintas Se observa cierto grado de discriminacioacuten Las muestras 49 (vino casero) y 53 (Ribera del Duero) presentan


271

valores negativos en el primer componente y por tanto un valor superior a la media de aquellas variables cuyos loadings respecto a este PC sean altos y negativos es decir los scores en el componente uno obtenido mediante PARAFAC El resto de muestras no pertenecientes a la DO presentan valores negativos en PC2 presentando valores inferiores a la media para las tres variables Se deduce que ambos PCs estaacuten relacionados con la variable fundamental ldquopertenencia a la DOrdquo

Por otra parte se ha realizado un nuevo anaacutelisis de componentes

principales sobre el conjunto de muestras de la DO de las cuales se conociacutea su caraacutecter de vino joven crianza o reserva Los resultados de este PCA se muestran en la Figura 18 En este caso las muestras se han agrupado en el mapa de los scores atendiendo a su caraacutecter de joacutevenes crianza o reserva En este caso no se observa una clara existencia de cluacutesteres y este hecho es bastante natural porque como se comentoacute anteriormente son muchos los factores que influyen sobre la poblacioacuten de compuestos fluorescentes en el vino No obstante parece que el PC2 siacute distingue entre muestras joacutevenes que presentan los mayores valores de score en este componente y muestras de crianza o reserva En el graacutefico de los loadings en este nuevo modelo se observa que la variable 1 cede casi toda su varianza a PC2 y la variable 3 a PC1 De modo que las muestras de vino joacutevenes tienen valores superiores a la media en la variable 1


272

Figura 18- Graacuteficos de loadings (superior) y scores (inferior) en el plano PC1-PC2 En la graacutefica de los scores se muestran en azul las muestras de vino joacutevenes en rojo las crianza y en verde las reserva


273

En este caso ademaacutes se mide el iacutendice total de polifenoles en las 59 muestras de vino mediante el meacutetodo de Folin-Ciocalteau El modo de operar experimentalmente fue el siguiente Se deposita 100 mL de vino en un matraz de 100 mL y se antildeade agua ultrapura hasta enrase Se toman 025 mL de vino diluido y se llevan a un matraz de 250 mL en el cual se antildeaden 150 mL de agua 125 mL de reactivo de Folin-Ciocalteu 375 mL de disolucioacuten de carbonato soacutedico y agua ultrapura hasta enrase La disolucioacuten resultante se deja reposar 2 horas y al cabo de este tiempo se mide la absorbancia a 755 nm El contenido total de polifenoles se mide en unidades de aacutecido gaacutelico sobre una recta de calibrado previamente construida con disoluciones patroacuten de dicho compuesto en el rango de concentraciones de 050 a 50 μgmiddotmL-1 Perspectivas de futuro Actualmente se estaacuten estudiando las posibilidades de distintos espectros de excitacioacuten y emisioacuten extraiacutedos de las EEMs asiacute como de diversas zonas de las mismas para predecir el iacutendice de polifenoles totales del vino La proposicioacuten de un meacutetodo raacutepido de medida de este paraacutemetro seraacute un gran reto ya que evitaraacute llevar a cabo el lento proceso de Folin-Ciocalteu

CAPIacuteTULO VII

ANAacuteLISIS DE RESVERATROL EN VINOS TINTOS MEDIANTE VOLTAMPEROMETRIacuteA DE

REDISOLUCIOacuteN ADSORTIVA DE ONDA CUADRADA

CAPIacuteTULO VII Resveratrol en vino tinto mediante Ad-SSWV

276


277

ANTECEDENTES

Las teacutecnicas voltamperomeacutetricas en general y en particular las teacutecnicas de redisolucioacuten se han utilizado ampliamente para el anaacutelisis de alimentos En la mayoriacutea de los casos se trata de meacutetodos para anaacutelisis de metales y entre los alimentos en que se han utilizado estas teacutecnicas se encuentra tambieacuten el vino1 2 Sin embargo son maacutes escasos los antecedentes encontrados acerca de meacutetodos electroanaliacuteticos para la determinacioacuten de otros componentes del vino si bien la mayoriacutea de ellos se refieren al anaacutelisis de antioxidantes Asiacute Kilmartin et al3 realizan un estudio mediante voltamperometriacutea ciacuteclica y describen el comportamiento de los orto-difenoles presentes en el vino que disueltos en un vino sinteacutetico originan en el electrodo de carboacuten vitrificado un pico anoacutedico a potenciales proacuteximos a 400 mV debido a la peacuterdida de dos electrones para dar orto-quinonas y atribuyen las sentildeales que aparecen a potenciales superiores a otras clases de compuestos fenoacutelicos Entre otros incluyen al trans-resveratrol entre los compuestos responsables del pico cercano a 650 mV puesto que seguacuten sus resultados tiene un potencial de pico de 667 mV

Posteriormente el mismo grupo de investigacioacuten informa de una sentildeal de

oxidacioacuten a 300 mV que atribuyen a miricetinas y de un hombro a 470 mV adscrito a la oxidacioacuten de glucoacutesidos de quercetina4 La integral de las curvas I-E hasta 500 mV se usa como una medida de los compuestos fenoacutelicos de menores potenciales de oxidacioacuten (llamados equivalentes de aacutecido gaacutelico) El pico a 640 mV que proporcionan los vinos tintos se asocia a antocianos derivados de la malvidina y

1 Daniele S Baldo MA Ugo P Mazzocchin A Anal Chim Acta 1989 2199-18 2 Brainina KhZ Stozhko NYU Belyshva GM Inzhevatova OV Kolyadina LI Cremisini C Galleti M Anal Chim Acta 2004 514227-234 3 Kilmartin PA Zou H Waterhouse AL J Agric Food Chem 2001 491957-1965 4 Kilmartin PA Zou H Waterhouse AL Am J Enol Vitic 2002 53294-302


278

oxidaciones posteriores a potenciales mayores de 700 mV a meta-difenoles o a grupos fenoacutelicos aislados

En otro artiacuteculo recogen los resultados obtenidos al examinar la

fermentacioacuten de mostos de Pinot Noir utilizando la voltamperometriacutea ciacuteclica para realizar el seguimiento de los compuestos fenoacutelicos5

Piljac et al6 comprueban que la voltamperometriacutea ciacuteclica proporciona una

estimacioacuten fiable del contenido de compuestos fenoacutelicos en vino y que es uacutetil para la identificacioacuten de clases especiacuteficas de polifenoles seguacuten sus potenciales de oxidacioacuten Los flavonoles totales expresados como equivalentes de quercetina son determinados en vino y otras bebidas mediante un meacutetodo de inyeccioacuten en flujovoltamperometriacutea de redisolucioacuten adsortiva7 que incluye un cambio de medio entre la preconcentracioacuten y la obtencioacuten de las sentildeales electroquiacutemicas utilizando un electrodo de pasta de carbono

Sin embargo en ninguno de los artiacuteculos citados se hace referencia a la

determinacioacuten individual de trans-resveratrol en vinos Siacute se encuentran en la bibliografiacutea diferentes artiacuteculos en que se describe el comportamiento electroquiacutemico de resveratrol

Asiacute Corduneanu et al8 evaluacutean la actividad antioxidante de los isoacutemeros

trans y cis mediante voltamperometriacutea ciacuteclica diferencial de pulso y de onda cuadrada en amplio rango de pH usando un electrodo de carboacuten vitrificado Seguacuten sus resultados el resveratrol presenta dos picos de oxidacioacuten el primero de ellos 5 Zou H Kilmartin PA Inglis M Frost A Australian J of Grape and Wine Research 2002 81-12 6 Piljac J Martiacutenez S Stipčević T Petrović Ž Metikoš-Huković M Am J Enol Vitic 2004 55417-422 7 Volikakis GJ Efstathiou CE Anal Chim Acta 2005 551124-131 8 Corduneanu O Janeiro P Brett A M O Electroanalysis 2006 18 757-762


279

correspondiente a la oxidacioacuten irreversibe del grupo fenoacutelico y el segundo a la oxidacioacuten de los grupos hidroxilo del anillo de resorcinol tambieacuten de forma irreversible

Zhang et al9 estudian el comportamiento de trans-resveratrol en el

electrodo de pasta de carbono mediante las teacutecnicas voltamperometriacutea ciacuteclica y de onda cuadrada Deducen de su estudio que la moleacutecula de trans-resveratrol sufre una oxidacioacuten irreversible en dicho electrodo siendo el proceso controlado por adsorcioacuten y dependiente del pH

Ensayan distintos medios de trabajo tales como disoluciones acuosas 01

M de HCl HNO3 H2SO4 H3PO4 KNO3 KCl KI KBr NaCl NH4Cl Na2CO3 tartrato soacutedico Na2B4O7 y NaOH tampoacuten Britton-Robinson de pH 47 o tampoacuten aceacuteticoacetato y observan un uacutenico pico anoacutedico del analito en medio fuertemente aacutecido Obtienen mejores resultados en presencia de aacutecido niacutetrico o aacutecido clorhiacutedrico que en medio aacutecido sulfuacuterico Ademaacutes encuentran que la adicioacuten de cloruros al medio de trabajo incrementa la intensidad del pico anoacutedico obtenido probablemente debido a que la adsorcioacuten de este ioacuten en la superficie del electrodo de pasta de carbono mejora las propiedades de esta superficie y facilita la velocidad de transferencia de electrones10 Finalmente el medio de trabajo que emplean estaacute compuesto por 10-3 M de KCl + 01 M HNO3 siendo 10 el pH del mismo Ademaacutes realizan un estudio mediante voltamperometriacutea ciacuteclica del cual se deduce el caraacutecter totalmente irreversible de la reaccioacuten electroacutedica de trans-resveratrol al no observarse pico alguno en el barrido inverso

9 Zhang H Xu L Zheng J Talanta 2007 7119-24 10 Dong SY Zheng JB Gao H Chem J Chin Universities 2003 24428


280

A traveacutes de la variacioacuten del potencial de pico con la velocidad de registro deducen que el nuacutemero de electrones que participan en la reaccioacuten es 1

asumiendo α = 05 Se encuentra tambieacuten que los potenciales de pico se

desplazan hacia valores menos negativos seguacuten se aumenta el pH deducieacutendose a traveacutes de la ecuacioacuten de Nernst que el nuacutemero de protones involucrados en la reaccioacuten es 1 Dada la similitud entre la estructura quiacutemica de resveratrol y la de los flavonoides postulan que el pico observado para este compuesto debe corresponder a la oxidacioacuten del grupo hidroxilo del anillo fenoacutelico de resveratrol y deducen la existencia de adsorcioacuten del analito sobre la superficie del electrodo al observar el efecto atenuador de la adicioacuten de pequentildeas cantidades de surfactante sobre el pico anoacutedico Por uacuteltimo ponen a punto un meacutetodo de anaacutelisis llevando a cabo los registros mediante voltamperometriacutea de onda cuadrada Encuentran una buena relacioacuten lineal entre concentracioacuten de resveratrol puesta y la sentildeal medida (intensidad de pico) y aplican el meacutetodo a la determinacioacuten de este compuesto en faacutermacos y orina Por uacuteltimo en un artiacuteculo muy reciente11 se propone un meacutetodo de redisolucioacuten adsortiva de diferencial de pulso en electrodo de grafito para determinar resveratrol en tabletas Los estudios realizados apoyan nuevamente la oxidacioacuten del grupo hidroxilo en el anillo fenoacutelico como responsable del pico que aparece a potenciales proacuteximos a 05 V a pH 60

Basaacutendonos en los resultados anteriormente descritos asumimos como principal reto llegar a proponer un meacutetodo para la determinacioacuten de trans-resveratrol en vino que nos parece interesante dada la rapidez y sensibilidad de

11 Liu XJ Wu YJ Wang F Gao L Ye BX J of the Chinese Chem Soc 2008 55264-27


281

las teacutecnicas electroanaliacuteticas Buscamos diferentes estrategias como es el cambio de medio y un tratamiento de muestra adecuado al enfrentarnos a una muestra tremendamente compleja

Nuestro electrodo de trabajo es un electrodo de carbono vitrificado y el aacutecido que utilizamos para fijar la acidez del medio de trabajo es HClO4

El objetivo de este capiacutetulo es maacutes el desarrollo de un meacutetodo para la

determinacioacuten de trans-resveratrol en muestras de vino que el estudio de los procesos electroquiacutemicos en que se basa Por ello la mayor parte de las experiencias que aquiacute se describen se llevan a cabo en presencia de la matriz del vino y partiendo de los antecedentes ya descritos por Zhang et al9 para la oxidacioacuten del trans-resveratrol en medio aacutecido RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN Eleccioacuten del sistema de limpieza del electrodo de carboacuten vitrificado

Uno de los inconvenientes que tiene la utilizacioacuten de electrodos soacutelidos y en concreto la utilizacioacuten del electrodo de carboacuten vitrificado es el frecuente deterioro de su superficie como consecuencia de la adsorcioacuten de los compuestos en estudio o de los productos resultantes de su oxidacioacuten o bien de la modificacioacuten quiacutemica de la misma Esto produce la obtencioacuten de resultados no reproducibles en barridos sucesivos y hace necesaria la utilizacioacuten de alguacuten procedimiento de limpieza de los mismos Para seleccionar el maacutes apropiado en nuestro caso se han examinado varios de entre los maacutes frecuentes atendiendo a la reproducibilidad que proporcionan en registros sucesivos de voltamperogramas del compuesto en estudio En concreto los meacutetodos de limpieza examinados han sido el pulido con


282

aluacutemina y el frotamiento con un disco de algodoacuten empapado en un disolvente orgaacutenico como etanol acetonitrilo o dimetilformamida asiacute como en hidroacutexido soacutedico 2 M seguido en todos los casos de frotamiento sobre un disco de algodoacuten empapado en agua En todos los casos se ensaya asimismo el resultado de efectuar una limpieza electroquiacutemica posterior a la mecaacutenica mediante la realizacioacuten de un barrido de potencial en sentido inverso al que pretendemos efectuar Conforme a los resultados obtenidos se ha decidido efectuar la limpieza del electrodo mediante frotamiento con un algodoacuten empapado en dimetilformamida (DMF) durante 1 minuto seguido de limpieza con algodoacuten empapado en agua durante otro minuto Antes de la obtencioacuten de los voltamperogramas se efectuacutea ademaacutes un barrido mediante voltamperometriacutea de onda cuadrada desde + 12 a 00 V sobre un blanco Este registro ademaacutes de contribuir a la limpieza del electrodo permite comprobar la efectividad del procedimiento de limpieza completo tomando como referencia la reproducibilidad del perfil I-E obtenido en el mismo Influencia de la concentracioacuten de aacutecido

Puesto que como ya se ha dicho el trans-resvetratrol origina ondas de adsorcioacuten en medio aacutecido en primer lugar estudiamos la influencia de la concentracioacuten de aacutecido percloacuterico en el medio de trabajo Para ello se preparan 4 disoluciones conteniendo todas ellas en un volumen final de 250 mL 73 ngmiddotmL-1 de trans-resveratrol voluacutemenes diferentes de HClO4 10 M y NaClO4 10 M tales que la suma de ambos se mantenga constante en 50 mL para asiacute mantener la fuerza ioacutenica del medio y agua ultrapura hasta enrase Se procede a registrar los voltamperogramas de redisolucioacuten adsortiva de onda cuadrada (Ad-SSWV) de todas ellas en las siguientes condiciones instrumentales Eac = +050 V tac = 60 s teq = 10 s frecuencia = 25 Hz paso de potencial = 10 mV amplitud = 50 mV


283

La liacutenea base de los voltamperogramas obtenidos (Figura 1 izquierda) se corrige mediante el meacutetodo de la media moacutevil (moving average) obtenieacutendose los voltamperogramas de la Figura 1-derecha Se trata de un meacutetodo automaacutetico de correccioacuten a liacutenea base el cual es bastante efectivo cuando los picos aparecen como hombros sobre perfiles escarpados De manera que los picos reales se observaraacuten como tales una vez hecha la correccioacuten El nuacutemero de puntos integrantes del voltamperograma resulta reducido una vez realizada la correccioacuten ya que se van obteniendo valores medios dentro de una ventana cuyo tamantildeo es un paraacutemetro a especificar para llevar a cabo la correccioacuten La liacutenea base se calcula posteriormente por comparacioacuten de cada punto con el valor medio de sus dos vecinos Si el valor absoluto medio es menor eacuteste sustituye al valor real La operacioacuten se repite una y otra vez hasta que ya no sea necesario reemplazar ninguacuten valor Cuando el nuacutemero de iteraciones necesarias sea superior a 1000 el proceso se para

Figura 1- Influencia de la concentracioacuten de aacutecido percloacuterico en el medio de trabajo Izquierda voltamperogramas originales derecha voltamperogramas corregidos Concentraciones ensayadas 01 M HClO4 (mdashmdash) 008 M HClO4 - 002 M NaClO4 (mdashmdash) 004 M HClO4 - 006 M NaClO4 (mdashmdash) 002 M HClO4 - 008 M NaClO4 (mdashmdash)

Se comprueba que en el intervalo examinado la concentracioacuten de HClO4

no influye sobre la intensidad de pico del trans-resveratrol y que el potencial de pico tampoco sufre un cambio apreciable En lo sucesivo se utiliza HClO4 01 M para

05 06 07 08 09E (V)

3E-006

35E-006

4E-006

45E-006

5E-006

55E-006

I (A)

05 06 07 08 09E (V)

0

2E-007

4E-007

6E-007

8E-007

I (A)


284

fijar la acidez Se comprueba ademaacutes que la sentildeal no variacutea al eliminar el NaClO4 del medio por lo que en adelante solamente se antildeadiraacute HClO4 como electrolito soporte Limpieza del vino Se ha comprobado que el vino ha de ser sometido a una serie de etapas previas de limpieza dado que en presencia de la matriz completa del vino no se observa sentildeal alguna debida al proceso adsortivo-oxidativo del trans-resveratrol Primeramente se procede al registro de un voltamperograma Ad-SSWV sobre una muestra de vino sin tratar simplemente filtrado y diluido en presencia de una concentracioacuten de HClO4 010 M producieacutendose una contaminacioacuten severa de la superficie del electrodo que obliga a la regeneracioacuten total de la misma mediante frotamiento con aluacutemina Con el fin de obtener una disolucioacuten de trans-resveratrol en una matriz maacutes simple el primer tratamiento al que se sometioacute la muestra fue a una extraccioacuten liacutequido-liacutequido con eacuteter etiacutelico seguacuten el procedimiento previamente descrito en el Capiacutetulo II de esta memoria12 y que proporciona una recuperacioacuten del 100 para el analito de intereacutes Se operoacute sobre una aliacutecuota de 025 mL de vino fortificado con 20 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol en un volumen de 100 mL Cuando se procede al registro de los voltamperogramas de estos extractos encontramos que si bien la sentildeal de fondo se reduce apreciablemente cuando el extracto se fortifica en la celda con mayores concentraciones de trans-resveratrol las sentildeales Ad-SSWV medidas no responden a dicho aumento de concentracioacuten probablemente debido a la adsorcioacuten competitiva de otros compuestos del vino en la superficie del electrodo Entonces se decide someter a este extracto a un procedimiento de limpieza adicional concretamente se procede a la limpieza del

12 Galeano-Diacuteaz T Duraacuten-Meraacutes I Airado-Rodriacuteguez D Anal Bioanal Chem 2007 3871999ndash2007


285

mismo mediante extraccioacuten en una fase soacutelida de octadecilo (C18) El procedimiento de extraccioacuten en fase soacutelida que se selecciona inicialmente consiste en hacer pasar la muestra por el cartucho previamente acondicionado por paso de 50 mL de metanol y 200 mL de agua ultrapura Una vez cargada la muestra en el cartucho se procede al lavado del mismo por paso de 30 mL de etanol al 10 en agua y posterior elucioacuten por paso de 30 mL de etanol al 50 en agua Los 30 mL de eluato se transfieren a un matraz de 100 mL y sobre ellos se antildeade 10 mL de etanol ( final de etanol = 25 ) 10 mL de HClO4 1M y agua ultrapura hasta enrase Sobre esta disolucioacuten es sobre la que se lleva a cabo el conjunto de experiencias que se describen a continuacioacuten con el objetivo de tener siempre al analito en presencia de la matriz ya que al tratarse de un meacutetodo de adsorcioacuten es importante que el analito de intereacutes esteacute siempre en presencia de posibles competidores por unirse a la superficie del electrodo En la Figura 2 se recogen los voltamperogramas correspondientes al extracto resultante de la primera extraccioacuten liacutequido-liacutequido y al extracto limpio mediante extraccioacuten en fase soacutelida Para realizar las medidas en primer lugar se lleva a cabo la acumulacioacuten sobre el electrodo a + 060 V durante un minuto y a continuacioacuten se procede al registro de los voltamperogramas en las siguientes condiciones instrumentales frecuencia = 25 Hz paso de potencial = 10 mV amplitud de onda cuadrada = 50 mV

Cabe resaltar no soacutelo la importante reduccioacuten de la sentildeal de fondo que se observa en los voltamperogramas sino tambieacuten el hecho de que cuando se antildeade trans-resveratrol al extracto doblemente limpio se obtiene el esperable aumento de sentildeal a diferencia de lo que ocurre al fortificar la disolucioacuten obtenida directamente tras el primer procedimiento de limpieza mediante extraccioacuten liacutequido-liacutequido


286

Figura 2- Voltamperogramas correspondientes a las muestras resultantes de la primera extraccioacuten liacutequido-liacutequido con eacuteter etiacutelico (mdashmdash) y de la extraccioacuten adicional en fase soacutelida del extracto sobre C18 (mdashmdash)

No obstante hay que sentildealar que estos voltamperogramas se han obtenido llevando a cabo despueacutes de la etapa de equilibrado (10 s) del electrodo en el medio de deposicioacuten un cambio de dicho electrodo a un medio conteniendo HClO4 010 M y etanol al 10 En dicho medio se efectuacutea el registro en las condiciones instrumentales detalladas anteriormente Este requisito es necesario puesto que de otro modo no se observa sentildeal alguna distinguible de la elevada sentildeal de fondo Seleccioacuten del porcentaje de etanol en cada medio Una vez demostrada la conveniencia del cambio de medio y elegido inicialmente un procedimiento de limpieza de la muestra se procede a la optimizacioacuten del porcentaje de etanol en los medios de acumulacioacuten y de registro Para optimizar el porcentaje de etanol en el medio de acumulacioacuten se prepara una muestra de la siguiente manera 050 mL de vino fortificado con 20 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y 50 mL de tampoacuten tartaacuterico 026 M de pH 50 se

06 07 08 09E (V)

3E-006

4E-006

5E-006

6E-006

7E-006

I (A)

38E-006

4E-006

42E-006

44E-006

I (A)


287

llevan a un volumen de 100 mL y se extraen con 50 mL de eacuteter etiacutelico por agitacioacuten durante un minuto Se recoge la fase orgaacutenica a traveacutes de papel de filtro y se evapora el eacuteter etiacutelico hasta sequedad El residuo se reconstituye con 020 mL de etanol y agua ultrapura hasta un volumen final de 100 mL Esta disolucioacuten se hace pasar a traveacutes de un cartucho C18 previamente acondicionado por paso de 50 mL de metanol y 200 mL de agua Una vez cargada la disolucioacuten en el cartucho se lava eacuteste con 100 mL de etanol al 10 y se procede a la elucioacuten del trans-resveratrol con 10 mL de etanol al 50 El eluato se transfiere a un matraz de 100 mL y se antildeade 10 mL de HClO4 10 M y agua ultrapura hasta enrase Al proceder de esta manera la disolucioacuten final contiene un 5 de etanol Se lleva a cabo la acumulacioacuten del trans-resveratrol de esta muestra sobre el electrodo de carboacuten vitrificado aplicando a eacuteste un potencial de + 060 V durante 1 minuto y dejando transcurrir posteriormente un tiempo de equilibrado de 10 s Posteriormente se sumerge el electrodo en otra disolucioacuten conteniendo HClO4 010 M y 25 de etanol en la cual se registra el voltamperograma de onda cuadrada en las siguientes condiciones instrumentales frecuencia = 25 Hz paso de potencial = 10 mV y amplitud = 50 mV A continuacioacuten se repiten las etapas de acumulacioacuten y obtencioacuten de los voltamperogramas antildeadiendo de manera sucesiva voluacutemenes de etanol absoluto de 05 15 10 y 20 mL en la celda que contiene la disolucioacuten de trans-resveratrol lo que implica porcentajes de etanol de 95 208 269 y 367 en el medio de acumulacioacuten manteniendo constante la composicioacuten del medio en que se registran los voltamperogramas

En la Figura 3 se representa la variacioacuten de la altura de pico corregida seguacuten el factor de dilucioacuten en cada caso con el porcentaje de etanol en el medio de acumulacioacuten Como se observa en la misma la altura de pico aumenta ligeramente con el porcentaje de etanol cuando este estaacute por debajo del 10


288

cayendo draacutesticamente para valores mayores Se fija un porcentaje de etanol del 10 en el medio de acumulacioacuten para posteriores experiencias

Figura 3- Variacioacuten de la altura de pico con el porcentaje de etanol en el medio de acumulacioacuten

Una vez fijado el porcentaje de etanol en el medio de acumulacioacuten se procede a la optimizacioacuten de dicha variable en el medio utilizado para el registro de los voltamperogramas La experiencia se realiza utilizando una muestra de vino fortificada igualmente con 20 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y sometida al tratamiento de limpieza anteriormente detallado fijando un porcentaje final de etanol en la disolucioacuten del 10 Se lleva a cabo la etapa de acumulacioacuten en todos los casos durante 60 segundos a + 060 V seguida de 10 s de equilibrado A continuacioacuten se procede al registro de los correspondientes voltamperogramas en presencia de HClO4 010 M y de distintos porcentajes de etanol y en las siguientes condiciones instrumentales frecuencia = 25 Hz paso de potencial = 10 mV y amplitud = 50 mV En la Figura 4 se representa la variacioacuten de la altura de pico con el porcentaje de etanol en el medio de medida Como se observa en la misma la intensidad de pico se mantiene constante entre el 0 y 10 de etanol aumentando ligeramente entre porcentajes de etanol comprendidos entre el 10 y el 25 mantenieacutendose para porcentajes de etanol mayores de manera que se fija un

0 10 20 30 40 v Etanol

300

400

500

600

700

I (nA

)


289

porcentaje de etanol del 30 en el medio de registro para posteriores experiencias

Figura 4- Influencia del porcentaje de etanol en el medio de medida

Eleccioacuten de la teacutecnica de barrido

Aunque en las experiencias anteriormente descritas se utilizoacute voltamperometriacutea de onda cuadrada para efectuar el registro con el fin de comprobar si efectivamente es la teacutecnica maacutes apropiada se comparan (Figura 5) los voltamperogramas registrados para una misma muestra previa acumulacioacuten a + 060 V durante 60 segundos y cambio de medio en onda cuadrada (izquierda) y diferencial de pulsos (derecha) asiacute como los correspondientes voltamperogramas corregidos a liacutenea base establecida este por el meacutetodo de la media moacutevil

0 10 20 30 40 50 v Etanol

0

100

200

300

400

500

I (nA

)


290

Figura 5- Voltamperogramas en onda cuadrada (mdashmdash) y diferencial de pulsos (mdashmdash) y los correspondientes corregidos a liacutenea base (mdashmdash) de una misma muestra de vino sometida al tratamiento especificado y fortificada con 246 ngmiddotmL-1 de trans-resveratrol en la celda

Se observa coacutemo al trabajar en la teacutecnica diferencial de pulsos en el

voltamperograma inicial el pico estaacute algo mejor definido que en onda cuadrada no obstante la sensibilidad se reduce varias veces al trabajar en diferencial de pulsos como se aprecia faacutecilmente en los voltamperogramas corregidos a liacutenea base Por lo tanto se elige onda cuadrada para posteriores experimentos Ademaacutes son varias las ventajas de la voltamperometriacutea de onda cuadrada sobre otras teacutecnicas electroanaliacuteticas entre las que cabe citar la mayor velocidad de anaacutelisis y la existencia de menos problemas de bloqueo de la superficie del electrodo Adsorcioacuten sobre el electrodo

Se comprueba que la adsorcioacuten del trans-resveratrol sobre el electrodo de carbono vitrificado se dan en presencia de la matriz del vino tras los procedimientos de limpieza establecidos en un rango de potenciales entre -060 y +060 V pasando por 0 V pero que no se produce a circuito abierto es decir con el potenciostato apagado

Por tanto se procede a estudiar coacutemo influye el potencial de deposicioacuten

sobre la acumulacioacuten del analito en presencia de la matriz del vino Sobre el fondo

06 07 08 09E (V)

88E-006

92E-006

96E-006

1E-005

104E-005

108E-005I (

A)

345E-007

35E-007

355E-007

36E-007

365E-007

37E-007

I (A)

06 07 08 09E (V)

-5E-008

0

5E-008

1E-007

15E-007

2E-007

25E-007

I corre

gido (

A)


291

de vino preparado como anteriormente se indicoacute se ensayan diferentes potenciales de acumulacioacuten manteniendo en todos los casos un tiempo de acumulacioacuten de 60 segundos y un periodo de equilibrado de 10 s y realizando el registro en HClO4 010 M en las siguientes condiciones instrumentales frecuencia = 25 Hz paso de potencial = 10 mV y amplitud = 50 mV Los voltamperogramas registrados en estas condiciones se recogen en la Figura 6

Figura 6- Influencia del potencial de acumulacioacuten sobre la adsorcioacuten de trans-resveratrol en presencia de la matriz de vino Voltamperogramas sin corregir (liacutenea continua) y corregidos a liacutenea base establecida eacutesta con el meacutetodo de la media moacutevil (liacutenea discontinua)

Se selecciona para posteriores experiencias un potencial de acumulacioacuten

de + 060 V dado que como se observa en la Figura 6 es el valor que proporciona mayores intensidades de pico medidas sobre el voltamperograma corregido a liacutenea base la cual se establece seguacuten el meacutetodo de la media moacutevil

En uacuteltimo lugar se comprueba con un patroacuten conteniendo 90 ngmiddotmL-1 de trans-resveratrol en HClO4 010 M coacutemo la adsorcioacuten del analito al electrodo aumenta seguacuten lo hace el tiempo de acumulacioacuten cuando este se variacutea entre 10 y 120 segundos (Figura 7) No obstante este paraacutemetro se optimizaraacute posteriormente para el rango de concentraciones en que se establece la recta de calibrado y en presencia de la matriz del vino ya que los compuestos presentes en

06 07 08 09E (V)

36E-006

38E-006

4E-006

42E-006

44E-006

46E-006

I (A)

Circuito Abierto0 V+ 020 V+ 040 V+ 060 V

-2E-008

0

2E-008

4E-008

6E-008

8E-008

I (A)


292

dicha matriz pueden interferir en la adsorcioacuten del analito de intereacutes sobre la superficie del electrodo siendo necesarios tiempos mayores o menores en presencia de la matriz

Figura 7- Influencia del tiempo de acumulacioacuten sobre 90 ngmiddotmL-1 de trans-resveratrol

Optimizacioacuten de las variables instrumentales

Se ha decidido llevar a cabo la optimizacioacuten de las variables instrumentales

que influyen sobre los voltamperogramas de onda cuadrada utilizando para ello una muestra conteniendo trans-resveratrol en presencia de la matriz del vino sometida al tratamiento descrito en apartados anteriores y que consiste en la extraccioacuten con eacuteter etiacutelico de una fase acuosa conteniendo 25 de vino (fortificado con 20 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol) aislamiento de la fase orgaacutenica y evaporacioacuten a sequedad del disolvente reconstitucioacuten del residuo y posterior limpieza de este extracto mediante extraccioacuten en fase soacutelida de octadecilo disponiendo el eluato en un volumen final de 100 mL en presencia de HClO4 010 M y 10 de etanol

Se procede a analizar la muestra final mediante voltamperometriacutea de

redisolucioacuten adsortiva de onda cuadrada (Ad-SSWV) La etapa de acumulacioacuten se

05 06 07 08 09E (V)

6E-006

7E-006

8E-006

9E-006

1E-005

11E-005

12E-005

I (A)

0 s10 s60 s120 s

-4E-008

0

4E-008

8E-008

12E-007

16E-007

I corre

gido (A

)


293

lleva a cabo en todos los casos durante un periodo de tiempo de 60 segundos durante los cuales se estaacute aplicando un potencial de + 060 V Transcurrido este tiempo y el periodo de equilibrado de 10 s se procede a cambiar la celda en la cual se encuentra la disolucioacuten inicial por otra celda que contiene el medio de medida cuya composicioacuten es etanol al 30 en agua en presencia de una concentracioacuten de 01 M de HClO4 y se efectuacutea el registro mediante voltamperometriacutea de onda cuadrada

La influencia de la frecuencia se ha estudiado variando la misma entre 25 y 150 Hz manteniendo constantes el resto de variables instrumentales en los siguientes valores Eac = + 06 V tac = 60 s teq = 10 s paso de potencial = 10 mV amplitud = 50 mV

La variacioacuten de la intensidad de pico con la frecuencia se recoge en la

Figura 8 Como puede observarse en la misma los valores de intensidad de pico obtenidos aumentan linealmente a medida que lo hace la frecuencia De entre los valores de frecuencia que mayor Ip proporcionan se ha elegido 65 Hz como el maacutes apropiado ya que se obtienen picos con una mejor fisonomiacutea

Figura 8- Variacioacuten de la intensidad de pico con la frecuencia

0 40 80 120 160Frecuencia (Hz)

0

100

200

300

I p (nA

)


294

Otro paraacutemetro que se ha optimizado para la determinacioacuten de trans-resveratrol mediante Ad-SSWV ha sido el paso de potencial Para ello se han registrado los voltamperogramas de la muestra con diferentes valores de paso de potencial comprendidos entre 4 y 20 mV manteniendo constantes el resto de condiciones instrumentales Eac = + 06 V tac = 60 s teq= 10 s frecuencia = 65 Hz amplitud = 50 mV

Figura 9- Voltamperogramas registrados a valores de paso de potencial de 2 mV (mdashmdash) 6 mV (mdashmdash) 10 mV (mdashmdash) y 14 mV (mdashmdash)

Como resultado de esta experiencia se observa que Ip aumenta

proporcionalmente con el paso de potencial alcanzaacutendose los valores maacuteximos de Ip para los maacuteximos de esta variable Sin embargo se ha considerado como valor de paso de potencial oacuteptimo para los estudios siguientes 10 mV ya que nos permite conseguir una sensibilidad suficientemente elevada con una buena definicioacuten del pico

Por uacuteltimo para llevar a cabo el estudio de la influencia de la amplitud de

onda cuadrada se han registrado los voltamperogramas de la muestra variando los valores de amplitud entre 20 y 100 mV y manteniendo constante el resto de

06 07 08 09E (V)

-2E-007

0

2E-007

4E-007

6E-007

I (A)


295

condiciones instrumentales Eac = +06 V tac = 60 s teq = 10 s frecuencia = 65 Hz paso de potencial = 10 mV

Se mide en los voltamperogramas corregidos a liacutenea base los valores de Ip

y se obtiene un aumento progresivo a medida que aumenta la amplitud hasta alcanzar un maacuteximo en 60 mV a partir del cual se produce una disminucioacuten de Ip

(Tabla 1) Se ha seleccionado 60 mV como valor de amplitud maacutes apropiado para estudios posteriores

Tabla 1- Variacioacuten de la intensidad de pico con la amplitud de onda cuadrada Amplitud (mV) Intensidad de pico (nA)

20 135 40 175 60 221 80 160

Optimizacioacuten del tratamiento de muestra

Como ya se ha explicado para llevar a cabo el anaacutelisis de trans-resveratrol en muestras de vino es necesario someter a las mismas a un proceso de limpieza bastante exhaustivo En el Capiacutetulo 1 se describe el proceso de extraccioacuten liacutequido-liacutequido optimizado para la separacioacuten del trans-resveratrol en muestras de vino el cual proporciona recuperaciones del 100 de dicho compuesto Este tratamiento consiste esencialmente en extraer durante 1 minuto muestras diluidas de vino con eacuteter etiacutelico utilizando una relacioacuten de fases 21 fase acuosafase orgaacutenica y ajustando el pH de la fase acuosa a 50 con un tampoacuten tartrato monoaacutecido de sodiotartrato disoacutedico Se aiacutesla la fase eteacuterea se evapora a sequedad y el residuo


296

se redisuelve con 40 mL de etanol absoluto y se antildeade agua ultrapura hasta completar 100 mL No obstante para la aplicacioacuten de teacutecnicas electroquiacutemicas se ha comprobado que este tratamiento no es suficiente ya que auacuten persisten en la muestras especies que interfieren en la determinacioacuten de resveratrol probablemente porque afectan al proceso de adsorcioacuten en el electrodo o porque contribuyen a una importante sentildeal de la matriz Por ello tras la extraccioacuten liacutequido-liacutequido con la posterior evaporacioacuten de eacuteter y reconstitucioacuten del residuo se incluye una etapa de extraccioacuten en fase soacutelida utilizando cartuchos C18 con el fin de eliminar la mayor cantidad de interferentes de dicho residuo sin sufrir la peacuterdida de trans-resveratrol antes de llevar a cabo la medida electroquiacutemica En esta uacuteltima etapa una vez depositada la muestra en el cartucho se procede a la limpieza y posterior elucioacuten del analito por paso de disoluciones acuosas de etanol de diferente concentracioacuten El lavado del cartucho tiene como finalidad eluir el mayor nuacutemero de interferencias posible sin dispersar el bolo del analito y por supuesto sin eluir parte del mismo Por otra parte la elucioacuten del analito debe hacerse de manera completa y de forma que venga acompantildeado del menor nuacutemero de interferencias posible esto es eluir exactamente la banda conteniendo el analito

En nuestro caso la eleccioacuten de la composicioacuten de las mezclas etanol-agua

utilizadas en las etapas de lavado y de elucioacuten estaacute basada en una serie de estudios previos llevados a cabo mediante espectrofotometriacutea de fluorescencia y se fija en 10 y 50 de etanol respectivamente La eleccioacuten de los voluacutemenes de lavado y elucioacuten es una etapa criacutetica de la cual dependeraacute el grado de limpieza del extracto obtenido asiacute como la recuperacioacuten del analito asiacute un volumen de elucioacuten superior al oacuteptimo generariacutea eluatos no lo suficientemente limpios y un volumen inferior al oacuteptimo implicariacutea recuperaciones inferiores al 100


297

A la vista del proceso de limpieza que hay que llevar a cabo se deduce que las variables a optimizar son las siguientes porcentaje de vino en la fase acuosa a extraer con eacuteter y relacioacuten de fases en la extraccioacuten liacutequido-liacutequido asiacute como el volumen de lavado y volumen de elucioacuten en la etapa de extraccioacuten en fase soacutelida

Se procede entonces a la optimizacioacuten de estas variables con ayuda del

disentildeo experimental y la metodologiacutea de la superficie de respuesta Concretamente se elije un disentildeo de experimentos de Box-Behnken generaacutendose la secuencia de experimentos que se resume en la Tabla 2 Para llevar a cabo este conjunto de experiencias se parte de una muestra de vino fortificada con trans-resveratrol en una concentracioacuten antildeadida de 20 μgmiddotmL-1


298

Tabla 2- Experimentos realizados para la optimizacioacuten del procedimiento de tratamiento de muestra (disentildeo Box-Behnken)

Relacioacuten de Fases (AO) Vino Volumen de

Lavado (mL) Volumen de Elucioacuten (mL)

Cube001a 1 5 275 3 Cube002a 3 5 275 3 Cube003a 1 40 275 3 Cube004a 3 40 275 3 Cube005a 1 225 5 3 Cube006a 3 225 5 3 Cube007a 1 225 50 3 Cube008a 3 225 50 3 Cube009a 1 225 275 1 Cube010a 3 225 275 1 Cube011a 1 225 275 5 Cube012a 3 225 275 5 Cube013a 2 5 5 3 Cube014a 2 40 5 3 Cube015a 2 5 50 3 Cube016a 2 40 50 3 Cube017a 2 5 275 1 Cube018a 2 40 275 1 Cube019a 2 5 275 5 Cube020a 2 40 275 5 Cube021a 2 225 5 1 Cube022a 2 225 50 1 Cube023a 2 225 5 5 Cube024a 2 225 50 5

Cent-a 2 225 275 3 Cent-b 2 225 275 3 Cent-c 2 225 275 3

En todas las experiencias el volumen de eacuteter etiacutelico se mantiene fijo en 50 mL de manera que los voluacutemenes de fase acuosa y de vino contenido en la misma vendraacuten dados por el valor de la relacioacuten de fases y de porcentaje de vino respectivamente en cada punto del disentildeo En todos los casos una vez realizada la extraccioacuten se espera hasta separacioacuten total de ambas fases recogieacutendose a traveacutes de papel de filtro la fase orgaacutenica completamente seca Esta fase orgaacutenica se evapora a sequedad en un rotavapor a temperatura ambiente y el residuo se


299

redisuelve con 020 mL de etanol absoluto se completa con agua hasta un volumen final de 100 mL y la disolucioacuten resultante se hace pasar a traveacutes de un cartucho de extraccioacuten en fase soacutelida C18 previamente acondicionado por paso de 50 mL de metanol y 20 mL de agua ultrapura Una vez cargada la muestra en el cartucho se procede a su lavado y elucioacuten por paso sucesivo de los voluacutemenes de sendas disoluciones acuosas de etanol al 10 y 50 respectivamente que marque el disentildeo Se emplea como funcioacuten de respuesta la intensidad del pico obtenido en cada caso

La optimizacioacuten del modelo se llevoacute a cabo con el paquete de software The

Unscrambler13 y los resultados fueron interpretados mediante la Metodologiacutea de la Superficie de Respuesta (RSM)

En el correspondiente anaacutelisis de la varianza (ANOVA) se asume un

modelo cuadraacutetico de segundo grado (model check quadratic p-value (95 ) = 03576) Se comprueba que el uacutenico efecto que contribuye significativamente al modelo asumiendo un nivel de confianza del 95 es el porcentaje de vino en la fase acuosa (p-value (95 ) = 00005) resultando no significativas el resto de las variables estudiadas asiacute como todas las posibles interacciones entre ellas

Las superficies de respuesta correspondientes a algunas parejas de las

variables estudiadas se representan en la Figura 10

13 Unscrambler v611 CAMO AS Olav Tryggvasonsgt N-7011 TrondheimNorway


300

Figura 10- Superficies de respuesta para algunas parejas de las variables estudiadas


301

Sin embargo en el disentildeo realizado se ve que la influencia del porcentaje de vino es tan grande que pensamos que esta variable puede desvirtuar los resultados relativos a la influencia de las restantes Ademaacutes en la tabla de experimentos puede verse que soacutelo hay 6 puntos del disentildeo con un valor de 5 para el porcentaje de vino pasando al siguiente nivel que es del 225 un valor muy elevado que dificulta la medida de los voltamperogramas resultantes Por ello se procede a comprobar dichos resultados mediante una serie de experiencias adicionales de optimizacioacuten secuencial de variables

Para llevar a cabo las siguientes experiencias se parte del mismo vino

inicial fortificado con 20 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y el tratamiento general de la muestra es el anteriormente descrito variando cada una de las variables a optimizar en tanto se mantienen los valores del resto de variables como se indica en cada caso

En primer lugar se variacutea el porcentaje de vino en la fase acuosa entre 5 y 20 manteniendo una relacioacuten de fases acuosaorgaacutenica 21 y los voluacutemenes de lavado y elucioacuten en 100 y 30 mL respectivamente A la vista de los voltamperogramas obtenidos para cada uno de los valores de porcentaje de vino ensayados (Figura 11) se observa que la sensibilidad en teacuterminos relativos a la concentracioacuten en la muestra inicial es aproximadamente la misma al 5 y al 10 ya que cuando se aumenta al doble el porcentaje de vino se obtiene praacutecticamente la mitad de la sentildeal No obstante se fija un 5 de vino para posteriores experiencias ya que la sentildeal se encuentra mejor definida


302

Figura 11- Influencia del porcentaje de vino en la muestra inicial A la derecha se muestra una ampliacioacuten de la zona sentildealada Valores de porcentaje de vino ensayados 5 (mdashmdash) 10 (mdashmdash) y 20 (mdashmdash)

Fijado el 5 de vino en la fase acuosa se procede a examinar de nuevo la

influencia del volumen de disolucioacuten utilizado en el lavado Para ello se preparan muestras conteniendo 05 mL de vino 5 mL de tampoacuten tartrato monoaacutecido de sodiotartrato disoacutedico 026 M de pH 50 y agua hasta 10 mL Se extraen con 5 mL de eacuteter etiacutelico se separa el extracto orgaacutenico y se evapora a sequedad en un rotavapor a temperatura ambiente El residuo resultante se reconstituye con 02 mL de etanol y agua hasta completar 100 mL y se pasa a traveacutes de un cartucho C18 lavaacutendose con voluacutemenes de 50 100 y 200 mL de disolucioacuten acuosa de etanol al 10 y a continuacioacuten se procede a la elucioacuten del analito contenido en los cartuchos por paso de 30 mL de disolucioacuten acuosa de etanol al 50 Los voltamperogramas registrados se recogen en la Figura 12 Se aprecia que efectivamente la influencia de esta variable no es muy importante fijaacutendose para posteriores experiencias un lavado con 10 mL de disolucioacuten de etanol al 10

05 06 07 08 09E (V)

12E-005

13E-005

14E-005

15E-005

16E-005

17E-005I (

A)

065 07 075 08 085E (V)

128E-005

13E-005

132E-005

134E-005

136E-005

I (A)


303

Figura 12- Influencia del volumen de lavado Valores ensayados 5 mL (mdashmdash) 10 mL (mdashmdash) y 20 mL (mdashmdash)

Una vez seleccionado el volumen de lavado del cartucho se procede a

revisar la influencia del volumen de disolucioacuten acuosa de etanol al 50 utilizado para llevar a cabo la elucioacuten del analito La elucioacuten del analito del cartucho se debe realizar con el menor volumen posible de eluyente o lo que es lo mismo con el volumen de eluyente necesario para eluir justamente la banda conteniendo la totalidad del analito pero no maacutes de dicha banda ya que se corre el riesgo de arrastrar interferencias indeseables Al ensayar eluyentes con diferentes porcentajes de etanol los mejores resultados se obtienen con el 50 de etanol y se ensayan voluacutemenes de 10 30 y 50 mL de esta disolucioacuten para efectuar la elucioacuten

06 07 08 09E (V)

12E-005

125E-005

13E-005

135E-005

14E-005

145E-005

I (A)


304

Figura 13- Influencia del volumen de elucioacuten Valores ensayados 1 mL (mdashmdash) 3 mL (mdashmdash) y 5 mL (mdashmdash)

A la vista de los voltamperogramas recogidos en la Figura 13 se aprecia que no mejora significativamente la sentildeal al utilizar mayores voluacutemenes de disolucioacuten en esta etapa y por tanto se decide utilizar 1 mL de etanol al 50 para eluir el trans-resveratrol de los cartuchos C18 Paraacutemetros analiacuteticos de calidad

Una vez optimizadas las variables quiacutemicas e instrumentales implicadas en el presente meacutetodo analiacutetico se procede a estudiar la linealidad entre sentildeal analiacutetica medida (intensidad de pico) y concentracioacuten de trans-resveratrol puesta

No obstante al tratarse de un meacutetodo de redisolucioacuten queda un uacuteltimo

paraacutemetro a optimizar antes del establecimiento de los paraacutemetros analiacuteticos de calidad que es el tiempo de acumulacioacuten adecuado para alcanzar maacutexima sensibilidad sin que se produzca la saturacioacuten de la superficie del electrodo y por tanto la peacuterdida de linealidad Por tanto se lleva a cabo el estudio de la influencia de esta variable a distintos niveles de concentracioacuten de trans-resveratrol en

06 07 08 09E (V)

115E-005

12E-005

125E-005

13E-005

135E-005

14E-005

145E-005

I (A)


305

presencia siempre de la matriz del vino sometida al tratamiento anteriormente optimizado Esta matriz de vino se dispone en las condiciones de medida y sobre ella se van haciendo adiciones sucesivas de pequentildeos voluacutemenes de una disolucioacuten de trans-resveratrol registrando los voltamperogramas correspondientes a los tiempos de acumulacioacuten ensayados en cada caso En la Figura 14 se representa la variacioacuten de la intensidad de pico con el tiempo de acumulacioacuten a los distintos niveles de concentracioacuten estudiados Como se observa la intensidad del pico crece en todos los casos con el tiempo de acumulacioacuten hasta cierto valor a partir del cual se mantiene o incluso empieza a caer ligeramente Se selecciona un tiempo de acumulacioacuten de 30 segundos para posteriores experiencias ya que como se ve en la Figura 14 para dicho tiempo de acumulacioacuten la intensidad auacuten sigue creciendo al aumentar tac es decir el electrodo no llega a saturarse en el rango de concentracioacuten examinado

Figura 14- Influencia del tiempo de acumulacioacuten en presencia de la matriz de vino

En estas condiciones se preparan patrones de trans-resveratrol en medio

HClO4 010 M y 10 de etanol y se encuentra una relacioacuten lineal entre concentracioacuten de trans-resveratrol puesta y intensidad del pico medida en un rango de concentraciones de 50 a 350 ngmiddotmL-1 de trans-resveratrol Los

0 20 40 60 80 100Tiempo de acumulacioacuten (s)

0

100

200

300

400

500

I (nA

)

123 ppb246 ppb369 ppb492 ppb615 ppb


306

paraacutemetros analiacuteticos de calidad correspondientes al calibrado se reflejan en la Tabla 3

Tabla 3- Paraacutemetros analiacuteticos de calidad en la determinacioacuten mediante Ad-SSWV de trans-resveratrol


Ordenada en el Origen (a plusmn sa) -767plusmn 093

Pendiente (b plusmn sb) (mLmiddotng -1) 1076 plusmn 042




Linealidad 9608

Resolucioacuten analiacutetica (γ-1) (ngmiddotmL-1) 133

LDD Long y Winefordner14 (ngmiddotmL-1) 258

LDD Clayton15 (α=β=005) (ngmiddotmL-1) 418

Es de resaltar los bajos liacutemites de deteccioacuten en el orden de las partes por billoacuten alcanzados que permitiriacutean detectar concentraciones en el vino del orden de algunas decenas de ngmiddotmL-1 de acuerdo al procedimiento propuesto

Anaacutelisis de trans-resveratrol en muestras de vino

A la hora de aplicar el meacutetodo al anaacutelisis de muestras reales es importante deducir si existe o no efecto de matriz y en caso positivo determinar en queacute momento se da este efecto si en la etapa de preparacioacuten de la muestra en cuyo caso es necesario determinar el porcentaje de recuperacioacuten a distintos niveles de concentracioacuten o bien en la de medida electroquiacutemica

14 Long GL Winefordner JD Anal Chem 1983 55712-724 15 Clayton CA Hines JW Elkins PD Anal Chem 1987 592506-2514


307

En primer lugar para ver si existe efecto matriz en la etapa de determinacioacuten se prepara una mezcla representativa de vinos con una serie de muestras comerciales y sobre una aliacutecuota de dicha mezcla se lleva a cabo todo el procedimiento de tratamiento de la muestra anteriormente optimizado El extracto final se lleva a un matraz de 100 mL se fija un porcentaje de etanol del 10 y una concentracioacuten de HClO4 de 01 M y se antildeade agua ultrapura hasta enrase Esta disolucioacuten se dispone en la celda electroquiacutemica y se lleva a cabo una adicioacuten patroacuten de trans-resveratrol por adicioacuten sucesiva de pequentildeos voluacutemenes de una disolucioacuten concentrada en la misma celda En la Figura 15 se representan algunos de los voltamperogramas registrados una vez corregidos a liacutenea base para las adiciones realizadas

Figura 15- Adicioacuten Patroacuten en la celda electroquiacutemica a una mezcla de vinos tintos comerciales Concentraciones antildeadidas en la celda 00 504 101 y 201 ngmiddotmL-1

Se construye la correspondiente recta de adicioacuten patroacuten representando las

intensidades de pico medidas frente a la concentracioacuten de analito antildeadida En la Figura 16 se encuentran representada dicha recta de adicioacuten patroacuten junto con la recta de calibrado de patrones externos anteriormente establecida deducieacutendose a la vista de las mismas que existe un importante efecto de matriz y que por tanto seraacute necesario llevar a cabo el anaacutelisis mediante adicioacuten patroacuten Se observa que el

065 07 075 08 085 09E (V)

-5E-008

0

5E-008

1E-007

15E-007

2E-007

I (A)


308

efecto de matriz es negativo debido probablemente a la adsorcioacuten de manera competitiva de otros componentes del vino en la superficie del electrodo

Figura 16- Recta de calibrado de patrones externos (negra) y de adicioacuten patroacuten en la celda (azul) de trans-resveratrol

Por otro lado con el objetivo de calcular el porcentaje de recuperacioacuten se

lleva a cabo una adicioacuten patroacuten sobre muestras independientes antes de someterlas al proceso de limpieza La experiencia se lleva a cabo sobre dos muestras distintas una mezcla de vinos de la DO ldquoRiojardquo y un vino tinto de mesa En cada caso se calcula el porcentaje de recuperacioacuten como el cociente entre las pendientes de las rectas obtenidas al practicar la adicioacuten patroacuten en la celda (678) y las obtenidas en cada caso al realizar la adicioacuten patroacuten antes de tratar las muestras (667 y 688 para los vinos de ldquoRiojardquo y el tinto de mesa respectivamente) resultando ser 1016 y 985 para los vinos de ldquoRiojardquo y el tinto de mesa respectivamente En ambos casos el porcentaje de recuperacioacuten es muy cercano al 100

Este hecho supone una importante ganancia en sencillez y rapidez para el

meacutetodo analiacutetico ya que si bien el anaacutelisis tiene que ser llevado a cabo mediante el meacutetodo de adicioacuten patroacuten dichas adiciones pueden ser hechas en la celda de

0 10 20 30 40[trans-resveratrol] (ngmiddotmL-1)

0

100

200

300

400

I p (nA

)


309

medida sobre muestras preparadas para cada vino evitando asiacute tener que realizar el tratamiento de la muestra tantas veces como adiciones se practiquen

Resumiendo a partir de los resultados anteriormente descritos se propone el siguiente procedimiento para el anaacutelisis de trans-resveratrol en vino tinto mediante Ad-SSWV Se toman 050 mL de vino sobre los que se adicionan 50 mL de tampoacuten tartaacuterico 026 M de pH 50 y agua ultrapura hasta completar aproximadamente 10 mL Esta disolucioacuten acuosa se extrae con eacuteter etiacutelico por agitacioacuten durante 60 segundos Ambas fases se dejan en contacto hasta su completa separacioacuten La fase inferior acuosa se desecha y la fase orgaacutenica se recoge en un matraz de bola sobre papel de filtro Esta fase eteacuterea se evapora a sequedad en un rotavapor a temperatura ambiente El residuo se redisuelve con 020 mL de etanol absoluto y agua hasta aproximadamente 10 mL Esta disolucioacuten se hace pasar a traveacutes de un cartucho C18 previamente acondicionado por paso de 50 mL de metanol y 200 mL de agua Una vez cargada la muestra en el cartucho se procede al lavado de eacuteste con 100 mL de etanol al 10 Finalmente se eluye el trans-resveratrol por paso de 10 mL de etanol al 50 Sobre el eluato se antildeade 10 mL de HClO4 10 M 050 mL de etanol absoluto (para fijar el 10 de etanol en el medio final) y agua ultrapura hasta completar 100 mL Esta disolucioacuten se transfiere a la celda electroquiacutemica y se procede a la acumulacioacuten del analito sobre el electrodo previamente limpiado por frotamiento durante un minuto en dimetilformamida y otro minuto en agua durante 60 segundos a + 060 V Una vez finalizada la etapa de acumulacioacuten se deja transcurrir un tiempo de equilibrado de 10 s y se cambia la celda conteniendo la muestra por otra celda conteniendo el medio de registro compuesto por HClO4 01 M y etanol al 30 Se sumergen los electrodos en el medio de registro y se obtiene el voltamperograma de onda cuadrada entre +060 y +090 V en las siguientes condiciones instrumentales frecuencia = 65 Hz paso de potencial = 10 mV y amplitud 60 mV Posteriormente


310

se realizan adiciones sucesivas de analito sobre la celda obtenieacutendose los voltamperogramas que nos permiten realizar el calibrado por el meacutetodo de adicioacuten patroacuten

En estas condiciones se procede llevar a cabo el anaacutelisis de trans-

resveratrol en una serie de muestras Concretamente se analizan tres mezclas diferentes de vinos de la DO ldquoRiojardquo en los cuales se han agrupado un total de 21 muestras en vinos agrupados seguacuten sean joacutevenes de crianza o de reserva Ademaacutes se analiza otra mezcla de vinos de la misma DO que agrupa a vinos de distintas edades y por uacuteltimo un vino tinto de mesa de menor calidad Estos anaacutelisis han sido validados por HPLC seguacuten el meacutetodo descrito en el capiacutetulo V de esta memoria16 Seguacuten este meacutetodo la elucioacuten de las muestras se lleva a cabo a 09 mLmiddotmin-1 con una mezcla acetonitriloH3PO4 (004 ) 1882 vv No se ha incorporado el fotorreactor al sistema cromatograacutefico ya que seleccionando una λ de 306 nm en el detector fotomeacutetrico se observa un pico totalmente resuelto para trans-resveratrol La calibracioacuten se ha llevado a cabo por adicioacuten patroacuten inyectando una muestra de cada vino diluida 25 veces con agua ultrapura sobre la que se realizan adiciones de 50 100 y 200 ngmiddotmL-1 lo que equivale a 125 250 y 500 ngmiddotmL-1 en vino En la Tabla 4 se recogen los resultados encontrados con el meacutetodo voltamperomeacutetrico y los encontrados en la etapa de validacioacuten

16 Duraacuten-Meraacutes I Galeano-Diacuteaz T Airado-Rodriacuteguez A Food Chem 2008 109825-833


311

Tabla 4- Concentraciones de trans-resveratrol encontradas en vinos mediante Ad-SSWV [trans-Resveratrol] (microgmiddotmL-1)

VOLTAMPEROMETRIacuteA HPLC

Mezcla ldquoriojardquo joacutevenes 020 plusmn 007 019 plusmn 006

Mezcla ldquoriojardquo crianza 019 plusmn 005 020 plusmn 005

Mezcla ldquoriojardquo reserva 016 plusmn 003 017 plusmn 006

Mezcla ldquoriojardquo 024 plusmn 001 023 plusmn 004

tinto de mesa 013 plusmn 005 016 plusmn 005

Seguimiento cromatograacutefico de las etapas de Limpieza

Con el objetivo de comprobar la efectividad de los procesos de limpieza de la muestra se inyectan en el sistema cromatograacutefico aliacutecuotas de la misma en distintos momentos de dicho proceso Las condiciones en las que se eluyen estas muestras son las similares a las empleadas en la validacioacuten del meacutetodo El eluato se monitoriza en todo momento fotomeacutetricamente a 306 nm asiacute como fluorimeacutetricamente a λexcem 260361 nm En ambos detectores se observan resultados similares y en la Figura 17 se muestran los cromatogramas obtenidos en el detector fluorimeacutetrico Como puede apreciarse en el cromatograma de la muestra inicial se observa una interferencia importante co-eluyendo con el resveratrol Esta interferencia junto con otros compuestos se elimina totalmente en la etapa de extraccioacuten liacutequido-liacutequido mientras que la extraccioacuten soacutelido-liacutequido posterior hace desaparecer los picos maacutes cercanos al frente del disolvente La recuperacioacuten final del trans-resveratrol seguacuten esta experiencia es en torno al 85 de trans-


312

resveratrol si bien no se han efectuado reacuteplicas para obtener un valor medio maacutes fiable Figura 17- Perfiles fluorescentes a λexcem 260 364 nm correspondientes a la disolucioacuten original de 050 mL de vino en 100 mL (mdashmdash) la fase acuosa una vez extraiacuteda con eacuteter etiacutelico (mdashmdash) el residuo seco de la fase eteacuterea reconstituido (mdashmdash) las aguas madre resultado de pasar el extracto reconstituido por el cartucho C18 (mdashmdash) las aguas de lavado del cartucho (mdashmdash) y el eluato (mdashmdash) Perspectivas de futuro Se ha comprobado que tanto trans-resveratrol como su glucoacutesido trans-piceido no son electroactivos en reducciones sobre el electrodo de gotas de mercurio (MDE) no obstante la irradiacioacuten de sus disoluciones con luz ultravioleta proveniente de una laacutempara de mercurio de alta presioacuten induce la generacioacuten de grupos electroacuteforos haciendo que los fotoproductos de ambos analitos presenten importantes ondas de reduccioacuten

Se estudia la influencia del tiempo de irradiacioacuten tanto en el caso de trans-

resveratrol como en el caso de trans-piceido y se observa una evolucioacuten de los polarogramas con el tiempo de irradiacioacuten que se muestra en la Figura 18

0 4 8 12 16 20t (minutos)

20

40

60

80

I F (λ

exce

m 260

364 n

m)


313

Figura 18- Evolucioacuten de los polarogramas de resveratrol y piceido (9 microgmiddotmL-1) con el tiempo de irradiacioacuten Nos parece interesante continuar con estos estudios con el objetivo de llegar a proponer un meacutetodo de anaacutelisis de resveratrol en vino maacutes selectivo que evite la necesidad de realizar un tratamiento previo de la muestra tan complejo

-09 -08 -07 -06E (V)

-12E-008

-8E-009

-4E-009

0

I (A)

PiceidoFondo0 s90 s150 s300 s600 s

-09 -08 -07 -06E (V)

-3E-008

-2E-008

-1E-008

0

I (A)

ResveratolFondo0 s60 s120 s150 s180 s

CONCLUSIONES

1- Se han estudiado las propiedades espectroscoacutepicas de intereacutes analiacutetico de

resveratrol y su 3-β-glucoacutesido piceido los cuales se presentan en dos formas

isoacutemeras cis y trans Estos derivados se han caracterizado fotomeacutetrica y fluorimeacutetricamente en distintos medios de trabajo concluyeacutendose que las mejores sentildeales se obtienen en medios hidroalcohoacutelicos Se han aportado valores de pKa de 82 y 97 para trans-resveratrol y un valor de pKa de 96 para trans-piceido en medio acuoso calculados mediante fotometriacutea 2- La irradiacioacuten UV de resveratrol y piceido origina fotorreacciones en las que los fotoproductos generados son maacutes fluorescentes que los analitos de partida En base a estas fotorreacciones se han propuesto sendos meacutetodos espectrofluorimeacutetricos de segunda derivada para la determinacioacuten de dichos analitos en muestras de vino previa extraccioacuten liacutequido-liacutequido de las mismas 3- Se ha desarrollado un meacutetodo mediante cromatografiacutea de liacutequidos para la determinacioacuten de las cantidades totales (trans + cis) de resveratrol y piceido a traveacutes de sus fotoproductos en muestras de vino previa irradiacioacuten de las mismas En dicho meacutetodo se utiliza elucioacuten isocraacutetica y deteccioacuten fluorescente Se obtiene una buena resolucioacuten para los picos de intereacutes y la principal ventaja de dicho meacutetodo es su elevada sensibilidad 4- La fotorreaccioacuten que sufren estos compuestos se ha acoplado con la cromatografiacutea de liacutequidos disentildeando un sistema de LC con fotoderivatizacioacuten post-columna en liacutenea La incorporacioacuten de un fotorreactor antes de la entrada al detector de fluorescencia permite llevar a cabo de manera muy sensible el anaacutelisis de los dos isoacutemeros de resveratrol y piceido en el vino Se obtiene una buena resolucioacuten para los cuatro analitos en modo isocraacutetico

5- Se han estudiado las sentildeales de fluorescencia total obtenidas en modo front-

face proporcionadas por muestras de vino sin tratamiento previo de las mismas La descomposicioacuten de las matrices de excitacioacuten ndash emisioacuten de fluorescencia se ha efectuado mediante PARAFAC Por combinacioacuten de los resultados obtenidos mediante fluorescencia con las medidas realizadas sobre patrones y ensayos de cromatografiacutea liacutequida se ha alcanzado un mejor conocimiento de la poblacioacuten de compuestos fluorescentes presentes en el vino Se demuestra tambieacuten la potencia de dichas sentildeales en combinacioacuten con meacutetodos quimiomeacutetricos de anaacutelisis multivariante en concreto Anaacutelisis por Componentes Principales (PCA) con fines clasificatorios atendiendo a variables tales como el origen de la muestra el tipo de uva o la pertenencia a una denominacioacuten de origen 6- El estudio del comportamiento voltamperomeacutetrico de trans-resveratrol en el electrodo de carboacuten vitrificado pone de manifiesto su oxidacioacuten asiacute como su adsorcioacuten a la superficie del electrodo Se ha propuesto un meacutetodo de redisolucioacuten adsortiva en onda cuadrada para la determinacioacuten de trans-resveratrol en vino previa extraccioacuten liacutequido-liacutequido de las muestras y limpieza de los extractos mediante extraccioacuten en fase soacutelida sobre con cartuchos C18

ANEXO

ARTIacuteCULOS RESULTANTES DE ESTE TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteN

ORIGINAL PAPER

Determination of resveratrol in wine by photochemicallyinduced second-derivative fluorescence coupledwith liquidndashliquid extraction

T Galeano Diacuteaz amp I Duraacuten Meraacutes amp D Airado Rodriacuteguez

Received 29 September 2006 Accepted 8 November 2006 Published online 20 December 2006 Springer-Verlag 2006

Abstract Basic studies on the photochemical behaviour oftrans-resveratrol and its photoproduct are reported Photo-metrically and fluorimetrically calculated acidity constantsof the former were determined The usefulness of thedetermination of resveratrol by photochemically inducedfluorescence and second-derivative photochemically in-duced fluorescence was also examined The very weaklyfluorescent trans-resveratrol is converted into a highlyfluorescent photoproduct by irradiating hydroethanolicsolutions of trans-resveratrol containing 40 vv of ethanolfor 60 s with intense UV radiation The photoproductpresents excitation and emission maxima centred at260 nm and 364 and 382 nm respectively Under theseconditions a linear relationship between fluorescenceintensity and trans-resveratrol concentration was foundbetween 66 and 66 ng mLminus1 Optimum conditions for theextraction of trans-resveratrol from an aqueous phase at pH50 with diethylether were a phase ratio (aqueousorganic)of 2 a shaking time of 60 s and a buffer concentration of015 mol Lminus1 An extraction recovery of 100 was reachedunder these conditions The optimized extraction procedurewas applied to the analysis of resveratrol in wine samplesemploying the amplitude between 356 and 364 nm of thesecond-derivative photoinduced emission spectrum asanalytical signal It was found that there is not matrixeffect and recoveries around 100 were obtained atdifferent fortification levels

Keywords Photochemically induced fluorescence

Second-derivative Liquidndashliquid extraction

Resveratrol Wine

Introduction

Resveratrol (34prime5-trihydroxystilbene Scheme 1) is astilbene produced by plants in response to fungal infectionor abiotic stresses eg produced by heavy metal ionsResveratrol occurs in mulberries peanuts and grapesGrapes contain a large amount of different phenoliccompounds in skins pulp and seeds that are partiallyextracted during winemaking [1] The determination ofphenolic compounds in wine is very important since thisgroup of substances are responsible for several sensorialcharacteristics such as colour flavour astringency andhardness of wine There is a broad range in the concentra-tion of resveratrol in different wines Intervals from 660 toless than 068 μg mLminus1 and from 100 to less than023 μg mLminus1 within red and white wines respectivelyhave been reported [2] the higher concentrations in redwines are partially due to the winemaking process but alsothey depend on the grape variety environmental factors inthe vineyard and wine processing techniques [3]

trans-Resveratrol has been suggested as a cause forreduced mortality from coronary heart disease in winedrinkers Numerous studies describe potential mechanismsby which trans-resveratrol could reduce heart diseaseinhibiting platelet aggregation [4ndash7] and low densitylipoprotein oxidation [8] and protecting the liver from lipidperoxidation [9] trans-Resveratrol has received attention inrecent years owing to its capacity to protect against globalcerebral ischemic injury and to ameliorate oxidativedamage it can also inhibit cellular events associated withtumour initiation promotion and progression [10]

Intense UV irradiation of alcoholic solutions of trans-resveratrol first induces isomerization into cis-resveratroland then leads to the formation of an unidentified highlyfluorescent compound [11]

Anal Bioanal Chem (2007) 3871999ndash2007DOI 101007s00216-006-1007-z

T Galeano Diacuteaz I Duraacuten Meraacutes () D Airado RodriacuteguezDepartment of Analytical Chemistry University of Extremadura06071 Badajoz Spaine-mail iduranunexes

Separation techniques such as liquid chromatography(LC) or capillary electrophoresis (CE) have been widelyexploited for the analysis of trans-resveratrol [12 13] in avariety of food samples but no spectroscopic methods havebeen published so far In recent years reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) by acidicsolvent gradient elution has been the most commonly usedprocedure for the determination of trans-resveratrol inwine either with diode array detection (DAD) [14ndash18]fluorimetric detection [19 20] DAD-fluorimetric detection[21 22] chemiluminiscent detection [23 24] electrochem-ical detection [25] or with mass spectrometry (MS) [26ndash28]and DAD-MS [29 30] The detections based on electro-chemistry luminiscence and MS offer higher sensitivitythan DAD Gas chromatography tandem MS with previousderivatization normally with bis-[trimethylsilyl]-trifluoro-acetamide (BSTFA) before column application [31] andmicellar electrokinetic chromatography (MEKC) with UVdetection [32] capillary zone electrophoresis (CZE) withDAD [33 34] or electrochemical detection [35 36] or non-aqueous CZE with DAD [37] have also been employed forthe analysis of this compound

Lowest reported limits of detection (SN=3) are in the orderof ppb [16 19ndash22 24 25 30] and the best one 0166 μgLwas reached by using chemiluminiscent detection [23]

The present paper reports basic spectral studies onresveratrol Moreover the photochemical behaviour ofresveratrol has been exploited for an analytical goal forthe first time and a new fast simple and sensitive methodfor its determination in wine samples by second-derivativeemission spectra of the photochemically produced fluores-cent product (2D-RTPF) coupled with liquidndashliquid ex-traction has been developed

Experimental

Reagents

For all experiments analytical reagent grade chemicals andsolvents were used Ultrapure water was obtained from aMillipore Milli-Q System

trans-Resveratrol was obtained from Sigma and used asreceived A 500 μg mLminus1 stock solution was prepared in a500-mL coloured volumetric flask by dissolving thesuitable amount of the commercial product and diluting tothe mark with absolute ethanol This solution was stored at4 degC avoiding exposure to direct light Fresh solutions oflower concentrations were prepared by appropriate dilutionof the stock solution with absolute ethanol and water

Buffer solution of sodium hydrogen tartratedisodiumtartrate (total concentration 026 mol Lminus1) was prepared bydissolving the suitable amount of disodium tartrate dihy-drate in water and adjusting the pH of the resulting solutionto 50 with small volumes (in the order of microlitres) ofdiluted hydrochloric acid

Wine samples

Several samples of young red wines barrel-aged red winesand white wines were provided by ldquoVintildeaoliva CooperativeSocietyrdquo (Almendralejo Badajoz Extremadura Spain) andthree different pools were made with the whole samplesAll the samples were previously filtered through a 045-μmcellulose acetate filter Samples were kept at 4 degC avoidingexposure to direct light

Apparatus

Fluorescence spectral measurements were performed using aVarian Cary Elipse fluorescence spectrophotometerequipped with two Czerny-Turner monochromators and axenon flash lamp and connected to a PC microcomputer viaan IEEE 488 (GPIB) serial interface The Cary Elipsesoftware was used for data acquisition Fluorescencemeasurements were recorded in a 10-mm quartz cell at 20plusmn01 degC by use of a thermostatically controlled cell holder anda Selecta Model 382 thermostatically controlled water bath

An Osram 200-W mercury lamp with an Oriel model8500 power supply was used for the UV irradiation ofresveratrol solutions

A Milton Roy Spectronic 3000 diode-array spectropho-tometer provided with the Milton Roy Rapid Scan softwarepackage V22 was used for acquisition and treatment of

a bOH

HO

OH

OH

OH

HO

Scheme 1 Chemical structuresof trans-resveratrol (a)and cis-resveratrol (b)

2000 Anal Bioanal Chem (2007) 3871999ndash2007

spectrophotometric data Photometric measurements wererecorded in a 10-mm quartz cell at 20 degC by use of athermostatic cell holder and a Selecta thermostatic bath

Procedures for the study and determination of resveratrol

Photometric studies of trans-resveratrol

Suitable aliquots of the 50 μg mLminus1trans-resveratrol ethanolicstock solution containing different amounts of the analytebetween 15 and 184 μg are transferred to the cellcontaining 30 mL of ultrapure water The absorptionspectrum of each solution is recorded in the range from200 to 500 nm and the absorbance at 306 nm is employed asanalytical signal

Fluorimetric studies of trans-resveratrol

A 18-mL aliquot of ultrapure water and 12 mL of absoluteethanol are transferred to the cell in order to keep theoptimum composition of the solvent media (40 vvethanol) The resulting mixture must be shaken anddegassed by ultrasonication and suitable aliquots of the50 μg mLminus1 trans-resveratrol ethanolic stock solution areadded maintaining the final concentration between 0080and 080 μg mLminus1 The fluorescence intensity is measuredat 385 nm (λexc=318 nm)

Photochemically induced fluorimetric determinationof resveratrol

A 30-mL sample of degassed hydroethanolic mixturecontaining 40 vv of ethanol and different volumes ofethanolic diluted trans-resveratrol stock solution containingbetween 200 and 200 ng of analyte are transferred to thecell The resulting solutions are irradiated for 60 s under ahigh pressure mercury lamp and their emission spectra(λexc=260 nm) are registered The fluorescence intensity at364 nm is employed as analytical signal

Recommended procedure for determining resveratrolin wine

In a separatory funnel 010 mL of red wine or 050 mL ofwhite wine at pH 50 fixed by the addition of 60 mL ofsodium hydrogen tartratedisodium tartrate buffer solution(026 mol Lminus1) are diluted with ultrapure water up to100 mL and extracted with 50 mL of diethylether byshaking for 60 s The upper organic phase is separated andevaporated to dryness by a stream of nitrogen at roomtemperature The residue is re-dissolved with 40 mL ofabsolute ethanol and water is added up to 100 mL Thissolution is irradiated under a high pressure mercury lamp

for 60 s and its emission spectrum is registered (λexc=260 nm) The emission spectrum is smoothed by themoving average method with a segment of seven datapoints its second derivative is obtained by Savitzky-Golayalgorithm and it is smoothed again using the sameconditions The amplitude of the derivative between 356and 364 nm is taken as analytical signal

Results and discussion

Basic photometric and fluorimetric studiesof trans-resveratrol

Absorption and fluorescence spectra of different hydroetha-nolic solutions of trans-resveratrol were recorded A singleabsorption band was observed around 310 nm with abandwidth of 20 nm and two little maxima centred at 306and 319 nm in water (Fig 1a) ethanol and hydroethanolicmedia at acid and neutral pH and it was proven that theethanol percentage has no influence on the absorption signaltrans-Resveratrol itself is weakly fluorescent showing twoexcitation maxima centred at 225 and 318 nm and a singleemission maximum centred at 385 nm in a hydroethanolicmedium containing 40 of absolute ethanol at acid andneutral pH (Fig 1b) The influence of the acidity on thespectral properties of trans-resveratrol has been studiedphotometrically and fluorimetrically The pH was varied bythe addition of small volumes (in the order of microlitres) ofaqueous hydrochloric acid or sodium hydroxide solutions inthe 001ndash10 mol Lminus1 concentration range in the presence ofpotassium chloride 010 mol Lminus1 in order to maintain theionic strength The photometric study (Fig 1a) was carriedout in aqueous medium and no spectral changes for theabsorption band centred at 310 nm were observed for pHvalues less than 65 however a bathochromic shift wasobserved in basic medium with a new maximum appearingcentred at 343 nm for pH values higher than 100 In contrastthe fluorimetric study was carried out in aqueous andhydroethanolic media (40 vv ethanol) A bathochromicshift and a decay of the signal was observed in the excitationand emission fluorescence maxima in both media centred at352 and 459 nm respectively for pH values higher than 100as shown in Fig 1b A constant fluorescent signal (λexcem=318385 nm) was observed in the pH range from 20 to 60followed by a drastic decay up to pH 11 remaining constantand negligible for higher pH values The reversibility of theacidndashbase processes was photometrically and fluorimetri-cally proven Ionization constants have been calculated basedon the variation of the photometric and the fluorescentsignals with the pH The variation of the photometric signalat 306 and 343 nm is shown in Fig 2a and the pKa valuescorresponding to the two ionizations photometrically ob-

Anal Bioanal Chem (2007) 3871999ndash2007 2001

served are too close to allow application of classic methodseg the Wilson and Lester method [41] to calculate themTherefore they were calculated by means of absorbancediagrams (A-diagrams) [38] An A-diagram is a plot of theabsorbance at one wavelength against the absorbance (A) atanother wavelength (Fig 2b) Consequently an A-diagramshows the relative absorbance changes at two wavelengths asa function of the pH of the solutions For a one-step systemthe absorbance at any wavelength must be proportional tothe absorbance at any other wavelength so an A-diagram forsuch a system will be linear However if the system isgoverned by two or more equilibria the A-diagrams willchange direction every time a new equilibrium becomesdominant in the system [38] These diagrams are particularlyuseful for systems where the spectra alone do not clearlyreveal the number of equilibria involved In this case A(306 nm) is plotted against A (343 nm) as shown in Fig 2band the plot clearly consists of two linear segmentssuggesting the existence of two successive equilibria in thepH 72ndash114 interval The first ionization predominates inthe pH 72ndash89 range (first lineal segment) and the secondone in the pH 100ndash114 range (second lineal segment)

Thus we calculated pKa1=82 and pKa2=97 in comparisonwith the reported values of pKa1=81 pKa2=99 and pKa3=105 photometrically calculated in aqueous medium byextrapolation of experimental values in different hydro-methanolic media [39] or pKa1=949 electrophoreticallycalculated [40] These ionizations correspond to the depro-tonation of the hydroxyl groups present in the molecule Asingle ionization was fluorimetrically observed in aqueousand hydroethanolic (40 vv ethanol) media and pKa valuesof 83 and 92 respectively were calculated by the Wilsonand Lester method [41] It was found that the pKa value ofthis polyphenol is highly influenced by the alcoholicpercentage in the working medium

Photometric and fluorimetric determinationof trans-resveratrol analytical parameters

The photometric or fluorescent determination of trans-resveratrol involves the construction of the correspondingcalibration curves The analytical figures of merit for thephotometric and fluorimetric determination in aqueous andhydroethanolic (40 vv ethanol) media respectively are

250 300 350 400 450λ (nm)

0

01

02

03

Abs

orba

nce

0

200

400

600

Fluo

resc

ence

Int

ensi

ty

200 300 400 500 600λ (nm)

20-65

92

122

36

109

a bFig 1 a Absorption spectracorresponding to an aqueoussolution of 152 μg mLminus1trans-resveratrol at different pH val-ues in the presence of potassiumchloride (010 mol Lminus1) b Ex-citation (dashed line) and emis-sion (solid line) fluorescencespectra corresponding to anhydroethanolic (40 vv etha-nol) solution of098 μg mLminus1trans-resveratrolin acidic (λexcem=318385 nm)and basic (λexcem=342459 nm)media in the presence of010 mol Lminus1 potassium chloride

2 4 6 8 10 12 14pH

004

008

012

016

02

024

Abs

orba

nce

004

008

012

016

02

024

Abs

orba

nce

(306

nm

)

004 008 012 016 02 024Absorbance (343 nm)

a bFig 2 a Absorbance values at306 nm () and 343 nm ()as a function of the pH inaqueous media b Absorbancediagram of trans-resveratrol pHrange 72ndash114


summarized in Table 1 As can be observed there is a linearrelationship between analytical signal and trans-resveratrolconcentration in the range 05ndash50 and 008ndash08 μg mLminus1

for molecular absorption and fluorescence respectively Onthe other hand better limits of detection are obtainedfluorimetrically

The repeatability of the methods was analysed bymeasuring eleven identical solutions under similar conditionsas employed in the construction of the calibration curves

Photometric and fluorimetric studies of trans-resveratrolphotoreaction and photoproducts

It is known that intense irradiation of trans-resveratrolsolutions induces the formation of a new compoundfluorescing in the ultraviolet range [11] The photochemicalprocess was monitored photometrically and fluorimetricallyin different hydroethanolic media

Photometric study

It was proven that the ethanol percentage has no influencein the shape or intensity of the absorption spectra of trans-resveratrol exhibiting a single maximum centred to 310 nmwith a bandwidth of 20 nm as previously stated On theother hand the absorption spectra corresponding to thephotoproduct obtained by irradiation of trans-resveratrolsolutions under a high pressure mercury lamp in differentmedia are highly influenced by the ethanol percentage(Fig 3a) Thus when trans-resveratrol solutions are UVirradiated a new absorption maximum centred at 290 nmappears immediately corresponding to cis-resveratrol [11]When the ethanol percentage is between 40 and 60 and

the solutions are irradiated for at least 60 s another equallyimportant maximum centred at 260 nm can be observedwhich is negligible in purely ethanolic medium and veryweak in hydroethanolic media containing more than 60 ofwater The maximum centred at 260 nm could be associatedwith the highly fluorescent photoproduct discussed below

The study of the influence of the acidity on the absorptionproperties of the fluorescent resveratrol photoproduct wascarried out with a hydroethanolic (40 vv ethanol) solutionof 12 μg mLminus1trans-resveratrol irradiated for 60 s under ahigh pressure mercury lamp (irradiation time for thisconcentration level and medium composition were deter-mined as optimum conditions for obtaining the fluorescentphotoproduct as discussed below) The pH of this solutionwas varied by the addition of small volumes (in the order ofmicrolitres) of aqueous hydrochloric acid and sodiumhydroxide in the 001ndash10 mol Lminus1 concentration range inthe presence of potassium chloride in order to maintain theionic strength Some absorption spectra at different pHvalues are collected in Fig 3b Two maxima are observed inacidic and neutral media the main one centred at 261 nmand a smaller one centred at 287 nm and their position andintensity are practically constant in acid and neutral media Abathochromic shift and a decay are observed in basic mediawith regard to the 261 nm maximum a new maximumappearing perfectly centred at 303 nm for pH values higherthan 105 The reversibility of the acidndashbase process wasstudied by acidifying the solution from highly basic toacidic pH values but the original spectrum corresponding tothe acid form was not recovered The variation of theabsorbance at 261 nm with the pH shows a drastic decaywhereas the signal measured at 303 nm increases for pHvalues higher than 75 The inflection point of both curves

Table 1 Analytical figures of merit

Method Linearconcentrationrange(ng mLminus1)

Intercept (a)plusmnSa

Slope (b)plusmnSb(mL ngminus1)

Determinationcoefficient(r2)

LODa

(ng mLminus1)LODb

(ng mLminus1) RSDc

(concentrationlevel ng mLminus1)

Photometric determination of trans-resveratrol (λ=306 nm)

05ndash5 minus37times10minus3plusmn25times10minus3

0127plusmn0001 09989 0058 014 44 (14)

Fluorescent determination of trans-resveratrol (λexcem=318385 nm)

80ndash800 128plusmn55 0939plusmn0013 09972 179 345 47 (3245)

Photoinduced fluorescentdetermination of resveratrol(λexcem=260365 nm)


Second-derivative photoinducedfluorescent determination ofresveratrol 2D356ndash364 (λexc=260 nm)


0182plusmn0004 09907 22 50 48 (192)

a Long and Winefordner method (k=3) [43]b Clayton et al method (α=β=005) [44]c Relative standard deviation (n=11)Units are μg mLminus1


was calculated around a pH value of 96 but this value doesreally not correspond to a pKa value because the alkalinetransformation is not fully reversible probably due to apartial hydrolysis

Fluorescence study

It has been proven that intense UV irradiation of trans-resveratrol solutions under a high pressure mercury lamptransforms trans-resveratrol into a highly fluorescentcompound [11] with a sharp excitation maximum (λem=364 or 382 nm) at 260 nm and two emission maxima (λexc=260 nm) centred at 364 and 382 nm respectively asshown in Fig 4a The intensity of the photoinduced signaland the optimum irradiation time are highly influenced bythe solvent but not the identity of the photoproduct becauseno changes were observed in the shape of spectra recordedin different media Water organic solvents of differentpolarities like methanol ethanol acetonitrile dimethylsulf-oxide NN-dimethylformamide 14-dioxane cyclohexaneand hexane and some hydro-organic mixtures wereassayed The photoreaction rate is higher in any purelyorganic media than in hydro-organic ones but the fluores-cence quantum yield of the photoproduct is higher inhydroethanolic media Finally different hydroethanolicmedia were assayed in order to obtain the greatest photoin-duced signal in a reasonable irradiation time The influenceof the irradiation time on the photoinduced signal in different

hydroethanolic mixtures was studied and the results areshown in Fig 4b In all cases the fluorescence intensityincreases when increasing irradiation time No changes inthe optimum wavelengths were observed when changingthe proportion of ethanol and water but different optimumirradiation times and different photoinduced intensitieswere obtained in different hydroethanolic media Themaximum photoinduced signal in purely ethanolic solutionsis reached in just 25 s but this signal increases withincreasing the water percentage and is at a maximum forethanol percentages between 30 and 50 Thereforehydroethanolic medium containing 40 vv of ethanolwas selected as optimum for subsequent experimentsobtaining the maximum photoinduced signal with anirradiation time of 120 s for the assayed concentration(23 μg mLminus1) Nevertheless it was proven that theoptimum irradiation time is directly related to a certainextent to the concentration of trans-resveratrol in theoriginal solution and this parameter has to be optimizeddepending on the concentration range

The influence of the acidity on the spectrofluorimetricbehaviour of the photoproduct obtained under optimumconditions was studied A hydroethanolic (40 vvethanol) solution containing 0098 μg mLminus1trans-resvera-trol in the presence of potassium chloride 010 mol Lminus1was prepared and irradiated for 60 s (previously determinedas the optimum irradiation time at this concentration level)This solution was divided into two portions and their pH

250 300 350 400 450λ (nm)

0

01

02

03

Abs

orba

nce

0

005

01

015

Abs

orba

nce

225 250 275 300 325 350λ (nm)

(5)

(1)(2)

(3)(4)

20-70

98116

a b

Fig 3 a Absorption spectra corresponding to 204 μg mLminus1 of trans-resveratrol in absolute ethanol irradiated for 120 s (1) in hydro-ethanolic medium containing 60 vv of ethanol irradiated for 120 s(2) in aqueous medium irradiated for 120 s (3) in hydroethanolicmedium containing 40 vv of ethanol irradiated for 5 s (4) and in

any hydroethanolic medium without being irradiated (5) b Absorptionspectra corresponding to a hydroethanolic (40 vv ethanol) solutionof 12 μg mLminus1trans-resveratrol irradiated for 60 s in the presence ofpotassium chloride (010 mol Lminus1) at different pH values


values were varied by the addition of small volumes (in theorder of microlitres) of aqueous hydrochloric acid orsodium hydroxide in the 001ndash10 mol Lminus1 concentrationrange The emission fluorescence spectra were recorded atdifferent pH values and it was found that the fluorescentsignal (λexcem=260364 nm) was maximum and constantin acid and neutral media but a drastic decay occurs at pHvalues higher than 70 and a negligible signal is obtainedfrom pH 11 and above In addition the reversibility of theacidndashbase process was studied by acidifying the solutionfrom highly basic pH values through neutral pH to acidicvalues however the original signal was reduced by halfThe inflection point of the curve of fluorescence intensityversus pH value was calculated at a pH value of 98 butthis value cannot be assigned to a pKa because a hydrolysisprobably occurs in parallel with the alkaline transformation

Photoinduced fluorimetric determination of resveratrolanalytical parameters

A linear relationship between the photoinduced signal(λexcem=260364 nm) and the original concentration oftrans-resveratrol was found between 66 and 66 ng mLminus1selecting an irradiation time of 60 s and a hydroethanolicmedium containing 40 vv ethanol The analytical figuresof merit are shown in Table 1 and a great enhancement ofthe sensitivity with regard to the photometric or fluorescentdetermination of trans-resveratrol can be observed

The repeatability of the methodwas analysed bymeasuringeleven identical solutions under similar conditions asemployed in the construction of the calibration curve

Extraction of resveratrol

A liquidndashliquid extraction of resveratrol from the aqueousphase with organic solvents is necessary prior to its analysisin wine samples by photoinduced fluorescence in order toreduce the matrix signal Firstly the behaviour of the

analyte with regard to the extraction in different organicsolvents (eg ethers esters or chlorinated hydrocarbons)was studied by molecular absorption obtaining satisfactoryrecoveries with diethylether or ethyl acetate However thephotoinduced fluorescent signal obtained in these media isweaker than that obtained in the optimum hydroethanolicmedium and it is advisable to evaporate the organic extractsto dryness and re-dissolve the residue with the optimumhydroethanolic mixture Diethylether was finally chosen asextractant for two reasons it afforded extraction recoveriesaround 100 and its higher volatility substantially reducedthe analysis time in the evaporation stage

The neutral polyphenol species is the predominantspecies present in acid and neutral media and the pH ofthe aqueous phase was fixed at 50 by the addition of60 mL of 026 mol Lminus1 hydrogen sodium tartratedisodiumtartrate buffer solution in a final volume of aqueous phaseof 100 mL (final concentration of buffer 016 mol Lminus1)The shaking time and phase ratio were also optimized and ashaking time of 60 s and a phase ratio aqueousorganic of20 were selected as optimum values After the extractionstage the developed procedure was used to obtain thephotoproduct (ie hydroethanolic medium containing 40vv of ethanol and irradiation time of 60 s for trans-resveratrol concentrations lower than 01 μg mLminus1) Theextraction recovery reached under optimum conditions was100 The evaporated and reconstituted ethereal extractwas stable at least up to 12 h after its preparation whenstored at 4 degC in the dark

Determination of resveratrol in wines by meansof 2D-RTPF analytical parameters

In previous assays carried out with wine samples it wasevident that the matrix made an important contribution tothe emission fluorescence spectrum under the conditionsnecessary to obtain the photoproduct despite extractingwine samples Nevertheless this contribution was reduced

200 250 300 350 400 450 500

λ (nm)

0

100

200

300

Flu

ore

scen

ce I

nte

nsi

ty

100

200

300

400

500

F I

(λ e

xc

em=

2603

64 n

m)

0 50 100 150 200 250 300Irradiation Time (s)

(1)

(2)30-50

3

100

a bFig 4 a Excitation (dashedline) and emission (solid line)spectra corresponding to570 ng mLminus1 of trans-resvera-trol in hydroethanolic mediumcontaining 40 vv of ethanolisolated from light (1 λexcem318385 nm) and irradiated for60 s under a high pressuremercury lamp (2 λexcem 260364 nm) b Photoreaction pro-files corresponding to23 μg mLminus1 of trans-resveratrolin hydroethanolic media con-taining different percentages ofethanol


to a great extent by obtaining derivative signals particularlythe second-derivative emission spectra as shown in Fig 5where the emission spectra corresponding to a wine samplenon-spiked and spiked with trans-resveratrol and their firstand second derivatives are represented This also proved thelinearity between different signals measured on the second-derivative emission spectra and the original trans-resvera-trol concentration (Table 1) the best linear relationship wasobtained by employing the amplitude of the second-derivative emission spectra between 356 and 364 nm asanalytical signal (2D356ndash364)

The optimized derivative photoinduced fluorescenceextractive method was applied to the analysis of resveratrolin wine samples Young and barrel-aged red wine and whitewine pools were analysed in order to represent thecommonest interferences in any future wine analysis Astandard addition was applied in triplicate and thecorresponding curves of analytical signal versus addedconcentration of trans-resveratrol were constructed Theslopes comparison test was applied between these plots andthe calibration curves and it was found that there was notmatrix effect RP-HPLC-FLD method with isocratic elution(C18 column mobile phase acetonitrileacetic acid (10 vv)water 193348 vvv) and photochemical pre-columnderivatization developed by the authors [42] was used toprove that the concentration of resveratrol in the analysedpools was under the limit of detection of the methodCalculated average recoveries at different fortificationlevels are shown in Table 2 A commercial red winecontaining a higher concentration of resveratrol wasanalysed and the result (112 μg mLminus1 8 RSD) wassatisfactorily ratified by the chromatographic methoddeveloped by the authors [42]

Conclusions

A very weakly fluorescent analyte (trans-resveratrol) hasbeen photochemically converted into a highly fluorescentproduct Acidndashbase ionization constants have been photo-metrically and fluorimetrically calculated for trans-resver-atrol but not for the photoproduct because it has beenproven that its alkaline transformation is not fully revers-ible A new simple and fast method has been developed forthe determination of total resveratrol (trans- and cis-isomers) in wine by second-derivative photochemicallyinduced fluorescence coupled with liquidndashliquid extraction

Table 2 Averages recoveries (n=3) and RSD (n=3) obtained in theanalysis of different wine pools fortified with trans-resveratrol

Wine pool Added(μg mLminus1)

Recovery ( RSD)

Young red or barrel-aged red 063 107 (5)a

109 (4)b

094 110 (4)a

108 (8)b

16 104 (2)a

111 (3)b

31 98 (4)a

105 (3)b

47 104 (3)a

101 (3)b

White 013 100 (8)019 94 (7)031 102 (4)063 96 (5)094 102 (3)

a Young redb Barrel-aged red

320 360 400 440λ em (nm) (λ exc= 260 nm)

0

200

400

600

800

Flu

ores

cenc

e In

tens

ity

-10

0

10

20

1D

320 360 400 440λem (nm) (λ exc= 260 nm)

-1

-05

0

05

1

15

2D

320 360 400 440 em (nm) (λ exc= 260 nm)λ

Fig 5 Emission spectra and their first and second derivatives corresponding to barrel-aged red wines pool non-spiked (dashed line) and spiked(solid line) with 157 μg mLminus1 of trans-resveratrol extracted under optimal conditions and subjected to a final 100-fold dilution


It has been demonstrated that there is not matrix effect fromthe wine Satisfactory recoveries are obtained at differentfortification levels

Acknowledgements The authors acknowledge to Consejeriacutea deEducacioacuten y Ciencia de la Junta de Extremadura (Exp 2PR03A073)for financial support Diego Airado Rodriacuteguez is grateful to theConsejeriacutea de Infraestructura y Desarrollo Tecnoloacutegico de la Junta deExtremadura for a fellowship (DOE 220604) Lda Dolores LoacutepezSoto (Vintildeaoliva SC) is also thanked for providing wine samples

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31 Flamini R Dalla Vedona A (2004) Rapid Commun MassSpectrom 181925ndash1931

32 Fan E Zhang K Yao C Yan C Bai Y Jiang S (2005)Chromatographia 62289ndash294

33 Dobiaacutesovaacute Z Pazourek J Havel J (2002) Electrophoresis 23263ndash26734 Spanilaacute M Pazourek J Farkovaacute M Havel J (2005) J Chromatogr

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Igarashi S (2005) Anal Sci 21183ndash18640 Cao J Chen GH Du YS Hou FF Tian YL (2006) J Liq

Chromatogr Rel Technol 291457ndash146341 Wilson RF Lester GW (1963) Talanta 10319ndash32242 Galeano T Duran-Meras I Airado D (in preparation)43 Long GL Winefordner JD (1983) Anal Chem 55712ndash72444 Clayton CA Hines JW Elkins PD (1987) Anal Chem 592506ndash2514


Abstract

trans-Picehydroethanospectrum beand 21 ng mdesign (Cenprocedure Fafter being edeterminedorganic phapiceid in difcopy 2007 Else

Keywords Pi

1 Introdu

Piceid (a glucosidecompoundsrelated prodietary sou

The detimportant beral sensorand hardne

lowast CorresponE-mail ad

0039-9140$doi101016j

Available online at wwwsciencedirectcom

Talanta 74 (2008) 675ndash682

Determination of piceid by photochemically inducedfluorescence and second-derivative

Response surface methodology for the optimizationof a liquidndashliquid extraction procedure for

its analysis in wine samples

Isabel Duran Meras lowast Teresa Galeano Dıaz Diego Airado RodrıguezDepartment of Analytical Chemistry University of Extremadura 06071 Badajoz Spain

Received 21 February 2007 received in revised form 25 June 2007 accepted 25 June 2007Available online 25 July 2007

id itself is weakly fluorescent but the fluorescence signal (λexcem = 260361 nm) is greatly enhanced by UV-irradiation of itslic solutions Employing the photoinduced emission signal at 361 nm or the amplitude of the second-derivative-photoinduced emissiontween 353 and 361 nm a linear relation is found in the assayed range 57ndash314 ng mLminus1 of trans-piceid and limits of detection of 17Lminus1 respectively are obtained A previous liquidndashliquid extraction is necessary for the determination of piceid in wine Experimental

tral Composite Design) together with the Response Surface Methodology have been used to find optimum conditions for the extractionor this purpose the difference between the photoinduced-fluorescence signal (λexcem = 260361 nm) of the aqueous phase before andxtracted has been considered as Response Function A tartrate buffer (pH 50) concentration of 015 mol Lminus1 and a phase ratio of 1 areas optimum conditions The amplitude of the second-derivative-emission spectrum corresponding to the evaporated and re-dissolvedse between 353 and 361 nm has been employed as analytical signal Standard addition method has been applied to the analysis of

ferent wine samples under optimum conditions Results of wine analysis have been satisfactorily validated by HPLCvier BV All rights reserved

ceid Wine Photochemically-induced fluorescence Second-derivative Response surface methodology Liquidndashliquid extraction

velyaceuveraal stlly hen sure o

ly fr

eid h

ction

34prime5-trihydroxystilbene-3--mono-d-glucoside) isof the stilbene-like resveratrol These are phenolicpresent in many families of plants but grapes and

ducts eg wine are considered the most importantrces of these substances [1]ermination of phenolic compounds in wine is veryecause most of them play an important role in sev-

ial characteristics such as colour flavour astringency

intensipharm

Reschemicgenerahas beexposupossib[4]

Pic

ss of wine [23] Some others like piceid have been

ding author Tel +34 924289375 fax +34 924289375dress iduranunexes (ID Meras)

grape prodsignificantlbution betwis dependeecological

ndash see front matter copy 2007 Elsevier BV All rights reservedtalanta200706049

studied in the past decade due to their biological ortical importance as discussed belowtrol and piceid occur as trans- and cis-isomers Theructure of trans-piceid is shown in Fig 1 Due to theigh ratio of trans- to cis-isomers found in wines itggested that the cis-isomers could arise from light

f must or wine during the wine-making process orom light exposure of wine bottles during storage

as received such attention as resveratrol because inucts the concentration of the glucoside is usuallyy higher than the aglycone [4] The relative distri-een the glycosylated and aglycone forms in wines

nt on a number of factors such as fermentation andconditions [5] On the other hand resveratrol in all

676 ID Meras et al Talanta 74 (2008) 67

its forms ivarieties co

Piceid iscuspidatuma treatment[67] Thethe use ofPiceid isominhibiting phuman lowactive manelevations[7]

Howevecosidase aresveratrol

Liquid cthe analysitroscopic mlast yearsraphy (RP-the most cpiceid in wfluorimetriDADndashfluorspectrometbased on esensitivitywith DADcompound

Regardisolvent cotion and re-although aphy has bein the chrocommon t

electrophorreported infilters and[151718]

Piceid istrated thagrape skinsvery quickorescent inhave exploanalytical pof piceid hand inexpeamplitudecal signal hsamples pr

In the dedesign (Ce

dolothe] Thimument

erim

hem

all ets weilli-s-Pis rec0 gightilutireshriateterfer sol L

um tultin

ine

eralite wlme

nt porevi

Sam

stru

Fig 1 Chemical structure of trans-piceid

s found in much higher concentration in red grapempared with white grape varietiesthe major polyphenol found in the root of Polygonum The powder of this root is used in China and Japan asfor atherosclerosis and for other therapeutic purposesevidence for piceid in red wines was established bya piceid standard extracted from P cuspidatum [4]ers have properties similar to those of resveratrol inlatelet aggregation [8ndash10] and inhibiting oxidation of-density-lipoproteins [11] On the other hand in a lessner than trans-resveratrol trans-piceid reduces theof lipid levels [12] and inhibits eicosanoid synthesis

r the human digestive tract is known to have gly-ctivity [13] so it is possible that the glucoside ofcould release the aglycone on ingestionhromatography (LC) has been widely exploited fors of piceid in several food samples but no spec-ethods have been published so far Thus in the

reverse phase high performance liquid chromatog-HPLC) by acidic solvent gradient elution has beenommonly used procedure for the determination ofine either with diode array detection (DAD) [14ndash17]c detection [18] DADndashfluorimetric detection [19]imetricndashelectrochemical detection [20] or with massry (MS) [20] and DAD-MS [2122] The detectionlectrochemistry luminiscence and MS offer higherthan DAD Capillary zone electrophoresis (CZE)[23] has been also employed for the analysis of thisng to the sample preparation extraction with organicmmonly ethyl acetate followed by solvent evapora-dissolution of the residue is widely employed [2022]n additional stage of cation-exchange chromatogra-en also employed [14] previously to the injection

Methowhich[2526the optexperi

2 Exp

21 C

Forsolvenpore M

tranused aing 50by weThis solight Fappropand wa

Buf026 mdisodithe res

22 W

Sevand whetyrdquo (Adifferewere pfilterlight

23 In

matographic system Solid phase extraction is otherreatment previous to the chromatographic [21] or

FluorescVarian Car

5ndash682

etic [23] analysis Nevertheless some methods arewhich wine samples are filtered through cellulose

directly injected into the chromatographic system

tself is weakly fluorescent but it has been demon-t intense UV irradiation of piceid contained in the

gives rise to the formation of the cis-isomer whichly disappears in favour of a compound highly flu-

the ultraviolet range [24] For the first time weited the photochemical behaviour of piceid with anurpose The photoinduced-spectrofluorimetric studyas been carried out and a sensitive new simple

nsive extractive-fluorimetric method employing theof the second-derivative-emission spectra as analyti-as been proposed for the analysis of piceid in wine

evious liquidndashliquid extractionvelopment of the extractive procedure experimentalntral Composite Design) and the Response Surfacegy (RSM) have been used to elucidate the manner inassayed variables affect the response function (RF)e use of these tools has the advantage of reaching

m values of the variables with the smallest number ofs and in the shortest time possible

ental

icals

xperiments analytical reagent grade chemicals andre used Ultrapure water was obtained from a Milli-

Q Systemceid was purchased from Aldrich Chem Co andeived Standard ethanolic stock solutions contain-mLminus1 were prepared in colored volumetric flasks

ng and suitable dilution of the commercial producton was stored at 4 C avoiding the exposure to direct

solutions of lower concentrations were prepared bydilution of the stock solution with absolute ethanol

olution sodium hydrogen tartratedisodium tartrateminus1 was prepared by dissolving the suitable amount ofartrate dihydrate with water and adjusting the pH ofg solution to 50 with hydrochloric acid

samples

samples of young red wines barrel-aged red winesines were provided by ldquoVinaoliva Cooperative Soci-ndralejo Badajoz Extremadura Spain) and threeols were made with the whole samples All of them

ously filtered through a 045 m cellulose acetateples were kept at 4 C avoiding exposure to direct

mentation and software

ence spectral measurements were performed using ay Elipse fluorescence spectrophotometer equipped

8) 67

with two Clamp and(GPIB) serdata acquisa 10-mm qcontrolledcontrolled

An Osrapower supsolutions

A Miltoter provideV22 wastometric da10-mm quaand a Selec

The soCAMO ASthe applica

24 Procefluorimetri

241 CaliIn a qua

of an ethanbetween 57added Thehigh pressuthe irradiatrespondingthe fluorescsignal

242 Recpiceid in w

Aliquotwere dilutein a final petions were

in ans w

fer sol Lminused wganire in

ofmL

rredt by

rd souted260movThe

algoe co

1 nmine

ults

eterd flu

ultrlic owideo littA)rderf traties othe sr of

ium he to

Fig 2 (A) Atimes and witsolution of tra

ID Meras et al Talanta 74 (200

zerny-Turner monochromators and a xenon flashconnected to a PC microcomputer via an IEEE 488ial interface The Cary Elipse software was used forition Fluorescence measurements were recorded inuartz cell at 20 plusmn 01 C by use of a thermostaticallycell holder and a Selecta Model 382 thermostaticallywater-bathm 200-W mercury lamp with an Oriel model 8500

ply was used for the UV-irradiation of resveratrol

n Roy Spectronic 3000 diode-array spectrophotome-d with the Milton Roy Rapid Scan software packageused for acquisition and treatment of spectropho-ta Photometric measurements were recorded in artz cell at 20 C by use of a thermostatic cell holderta thermostatic bathftware package THE UNSCRAMBLERreg 611bA [27] running under Windows XP was used for

tion of chemometrics

dures for the photochemically inducedc determination of total piceid

bration graph of total piceidrtz cell 50 mL of ultrapure water different volumesolic diluted stock trans-piceid solution containingand 320 ng of analyte and ethanol up to 2 wereresulting solution was irradiated for 180 s under are mercury lamp Ethanol and water were added to

ed solution up to 10 mL (40 vv ethanol) The cor-emission spectra (λexc = 260 nm) were registered andence intensity at 361 nm was employed as analytical

ommended procedure for determining totalines of 010 mL of red wine or 050 mL of white wined to 50 mL with ultrapure water and absolute ethanol

lampsolutioof buf026 mextractThe orperatu40 mLto 100transferied oustandathe dil(λexc =by thepointsGolaythe samand 36every w

3 Res

31 Dinduce

Theethanosingleand tw(Fig 2

In oistics oproperpH ofin ordeor sodchlorid

rcentage 298 ethanolwater (vv) The resulting solu-irradiated for 180 s under a high pressure mercury

343 nm andin basic m

bsorption spectra corresponding to 114 g mLminus1 of trans-piceid in hydroethanolichout being irradiated (B) Excitation (left) and emission (right) fluorescence spectra cns-piceid non-irradiated (- - -) (λexcem = 318380 nm) and irradiated for 180 s under

5ndash682 677

quartz cell with magnetic stirring The irradiatedere transferred to a separatory funnel and 50 mL

olution (sodium hydrogen tartratedisodium tartrate1 pH 50) were added These aqueous phases wereith 100 mL of ethyl acetate by shaking for 150 s

c phases were evaporated to dryness at room tem-a rota-evaporator The residues were re-dissolved inabsolute ethanol and ultrapure water was added up Aliquots of 30 mL of the resulting solutions wereto the measure cell and a standard addition was car-adding successively small volumes of trans-piceidlution irradiated for 180 s in the same conditions aswine sample The corresponding emission spectranm) were registered These spectra were smootheding average method with a segment of seven datair second derivatives were calculated by Savitzky-rithm (λ = 5 nm) and they were smoothed again innditions as the spectra The amplitude between 353was employed as analytical signal The analysis of

sample was carried out by triplicate

and discussion

mination of piceid by means of photochemicallyorescence

aviolet absorption spectra of trans-piceid in aqueousr any hydroethanolic media are characterized by aband around 312 nm with a band width of 15 nm

le maxima centered to 306 and 318 nm respectively

to establish the basic chemico-physical character-ns-piceid the influence of acidity on the absorbentf trans-piceid in aqueous medium was studied The

olution was varied by the addition of small volumesmicrolitres of diluted solutions of hydrochloric acidydroxide in presence of 010 mol Lminus1 of potassiumkeep the ionic strength A bathochromic shift to

a narrowing of the absorption band was observed

edium The absorbance at 343 nm keeps minimum

medium containing 40 (vv) of ethanol irradiated for differentorresponding to a 12 g mLminus1 hydroethanolic (40 vv ethanol)a high pressure mercury lamp (mdash) (λexcem = 260380 nm)


Fig 3 Influence of irradiation time on the fluorescence intensity(λexcem = 260380 nm) of 060 g mLminus1 trans-piceid in ethanolwater4060 (vv) medium in presence of sodium chloride 01 mol Lminus1 in neutral acidand basic med

to pH 75 aconstant anBased on tand Lesterreported va

When tsolutions apiceid discorrespondshown in Fmaximumsolutions ccorrespondbelow whimum is neghydroethanThe highesation timestimes and t

probably dphotoprodu

A similcence Hyfluorescenttered to 2Intense UVtrans-piceiexcitation memission mrespectiveltoinducedinfluencedproducts bof spectrasolvents oftrile dimetcyclohexanassayed Thmedia than

f theorpt

ed atoprin a

allythane inhemgenem fore wed biceiddit

remeh reonta(vv

minus1

Table 1Analytical an

Assayed concIntercept (a) plusmnSlope (b) plusmn sb

DeterminatioAnalytical senLODa (ng mLLODb (ng mL RSDc (143

a Long andb Clayton ec Relative s

ia

nd increases in the 75ndash110 pH interval remainingd independent of the acidity for higher pH valueshis experience pKa = 93 was calculated by Wilsonmethod [28] for trans-piceid in accordance with thelue of 94 [29]rans-piceid aqueous ethanolic or hydroethanolicre UV-irradiated the band corresponding to trans-appears and a new maximum centered to 290 nming to cis-piceid [2430] appears immediately asig 2A For irradiation times higher than 60 s anothercentered to 260 nm (Fig 2A) can be observed inontaining between 40 and 60 (vv) of ethanoling to the highly fluorescent photoproducts discussedle the absorptivity at 290 is kept This new maxi-ligible in purely ethanolic solutions and very weak inolic media containing more than 60 (vv) ethanolt intensity of this maximum is reached for irradi-

yield oAbs

obtainits phopletely

Finhydroecentagphotocof themediumeasuobtaintrans-pquent ameasu

Wittions c4060

around 180 s but decreases for higher irradiationurns negligible for irradiation times higher than 600 s

010 mol Laqueous hy

d statistical parameters for the determination of total piceid

Photoinduced-fluorescentmethod (λexcem = 260361 nm)

entration range (ng mLminus1) 57ndash31sa 18 plusmn 2(mL ngminus1) 67 plusmn 01

n coefficient (r2) 09967sitivity (γminus1) (ng mLminus1) 068minus1) 085minus1) 17ng mLminus1) 23

Winefordner method (k = 3) [33]t al method (α = β = 005) [34]tandard deviation (n = 11)

5ndash682

ue to the UV-destruction of the highly fluorescentcts

ar photochemical study was carried out by fluores-droethanolic solutions of trans-piceid are slightly

and present excitation and emission maxima cen-30 and 300 and 395 nm respectively (Fig 2B)-irradiation of trans-piceid solutions transforms

d into a highly fluorescent compounds with a sharpaximum (λem = 361 or 380 nm) at 260 nm and two

axima (λexc = 260 nm) centered to 361 and 380 nmy (Fig 2B) It was found that the intensity of the pho-signal and the optimum irradiation time are highlyby the solvent but not the identity of the photo-ecause no changes were observed in the shape

recorded in different media Water organicdifferent polarities like methanol ethanol acetoni-

hylsulfoxide NN-dimethylformamide 14-dioxanee and hexane and some hydro-organic mixtures weree photoreaction rate is higher in any purely organicin hydro-organic ones but the fluorescence quantumphotoproducts is higher in hydroethanolic media

ion and fluorescence spectra have been on-linefter chromatographic separation for trans-piceid andoducts [32] and the shape of these spectra are com-greement with the reported data [2430]

the photoreaction was studied in differentolic media and it was found that the ethanol per-fluenced in different ways to the kinetic of theical process and to the quantum yield fluorescencerated photoproducts The ethanol percentage in ther the photochemical reaction and for the fluorescenceas varied between 0 and 100 The best results werey irradiating for 180 s hydroethanolic solutions ofd containing 2 (vv) ethanol followed by a subse-ion of ethanol up to 40 (vv) before the fluorescencentgard to the influence of the acidity several solu-ining 060 g mLminus1 of trans-piceid in ethanolwater) were prepared in presence of sodium chloride

at different pH values fixed by the addition ofdrochloric acid or sodium hydroxide The influence

Second-derivative-photoinduced-fluorescentmethod 2D353ndash361 (λexc = 260 nm)

57ndash31minus017 plusmn 006018 plusmn 00109947086132159

ID Meras et al Talanta 74 (2008) 675ndash682 679

Table 2Optimization of the extractive procedure (experiments resulting of a central composite design)

Experiment Design position [Buffer] (mol Lminus1) Shaking time (s) Phase ratio

1 Low Aa 0026 155 252 High Aa 019 155 253 Low Ba 011 12 254 High Ba 011 298 255 Low Ca 011 155 0996 High Ca 011 155 407 Cube 1 006 70 168 Cube 2 016 70 169 Cube 3 006 240 16

10 Cube 4 016 240 1611 Cube 5 006 70 3412 Cube 6 016 70 3413 Cube 7 006 240 3414 Cube 8 016 240 3415 Central a 011 155 2516 Central b 011 155 2517 Central c 011 155 25

a Experime

of the irradfound (Figsignal is ob

The usechemicallypresence othe aglycontimes longe

Finallyout in presecretely 4-hacid gallictial change

Underbetween fluwas foundAnalyticalare summa

32 Applic

A previois necessafluorescencthe behavidifferent otion and itobtained bywith ethylthe photopthe optimuwould be nand re-dissmixture

It was pspecies is t

theen swayandg timase

nse S

ptim

thehase

comulta

variare ficludesignof th

aquontaL (2ted fecaurrad

flus phkedce inracti

FI(

nts in a star point in the model

iation time was carried out in all of them and it was 3) that the greatest enhancement of the fluorescenttained in acid and neutral mediaof an irradiation time of 180 s makes the photo-

induced-fluorescent determination of trans-piceid inf its aglycone possible because the fluorescence ofe photoproducts becomes negligible for irradiationr than 60 s probably because they are destroyed [31]

the influence of the irradiation time was also carriednce of other typical polyphenols found in wines con-ydroxy-3-methoxybenzoic acid quercetin caffeicacid (minus)-epicatechin and (+)-catechin and substan-

s in the photochemical process were not observedoptimum conditions satisfactory linear relationorescence intensity and trans-piceid concentration

in the assayed concentration range 57ndash31 ng mLminus1figures of merit for the determination of trans-piceidrized in Table 1

ation analysis of piceid in wine samples

us liquidndashliquid extraction of diluted wine samplesry to analyse piceid by means of photoinduced-e in order to reduce the background signal Firstly

our of the analyte with regard to the extraction inrganic solvents was studied by molecular absorp-was found that the better extraction recoveries wereextracting not the trans-piceid but its photoproducts

acetate However the quantum fluorescence yield ofroducts in ethyl acetate is minor than the obtained inm hydroethanolic medium (40 vv ethanol) and itecessary to evaporate the organic extracts to drynessolve the residue with the optimum hydroethanolic

pH ofhydrog

Any100shakinous phRespovalue

33 O

Forand pcentraling simtheseels wealso inThis dlationfield

Thetions c100 mirradiation bwhen i

Theaqueouas marrescenthe ext

RF =

roven that the dihydroxy-stilbene-glucoside neutralhe predominant in acid and neutral media Thus the

(λexc

aqueous phase was fixed at 50 by the addition ofodium tartratedisodium tartrate buffer

the extraction recovery was much lower thanthe implied physicalndashchemical variables such ase phase ratio and buffer concentration in aque-

were optimized chemometrically by means of theurface Methodology (RSM) to get the better recovery

ization of the extraction procedure by the RSM

optimization of buffer concentration shaking timeratio (aqueousorganic) an experimental designposite design was used with the aim of calculat-neously the effect of the change in each one of

bles and also their possible interactions Five lev-xed for each variable Three central samples wereed giving rise to a total of 17 experiments (Table 2)is rotatable and therefore the precision in the calcu-

e response is uniform over the whole experimental

eous samples were constituted by standard solu-ining 57 ng mLminus1 of trans-piceid in a final volume of ethanol) in presence of different amounts of bufferor 180 s previously to the addition of the buffer solu-se a decrease in the photoinduced signal was observediating in presence of bufferorescence emission spectra (λexc = 260 nm) of theases were recorded before and after extracting themby the design and the difference between the fluo-tensity of aqueous phase at 361 nm before and afteron was employed as RF

λexcem 260361)before extracting minus FI

em 260361)after extracting

680 8) 675ndash682

The opUNSCRAMinterpretedance (ANO

From thTable 3 ittribute signthis case bvariables bthem Fig 4for each paappreciabletwo specifiied In thesfollowing vratio of 07of phase radesign nevobtained wphase ratiowas finallyvalue of 15

The extlated as thand a calibresulted to

34 Deter

Despitesignal fromtions to obNevertheleby obtainiderivative-between diemission spit was founsecond-deranalytical

Fig 4 Estimated response surfaces for each pair of variables

Table 3Optimization

Effect

A ([Buffer])B (Shaking tiC (Phase ratioABACBCAABBCCTotal errorTotal (correct

a Degrees ob Effect is d


timization of the model was made with THEBLERreg software package [27] and the results were

with the RSM In the corresponding analysis of vari-VA) a second-grade quadratic model is assumedis ANOVA the results of which are summarized inwas deduced which of the considered effects con-ificantly to the model for a 95 confidence level Inuffer concentration and phase ratio were significantut not the shaking time or the interactions betweenshows the response surfaces estimated by the model

ir of variables In these diagrams it can be noticed thatvariations in the response function occurs when the

ed factors buffer concentration or phase ratio are var-e surfaces the maximum value of RF is located at thealues of the variables 016 mol Lminus1 of buffer phase

considered optimum conditions The predicted valuetio was out of the assayed points in the experimentalertheless it was proven that the extraction percentageith a phase ratio of 1 is similar to the obtained with aof 07 Because of this an optimum phase ratio of 1selected The shaking time was fixed at an arbitrary0 sraction recovery under these conditions was calcu-e ratio between the slopes of the calibration curveration curve constructed extracting standards and itbe 61

mination of piceid in wine samples

extracting wine samples an important backgroundthe matrix was observed in the optimum condi-

tain the fluorescent spectra of the photoproductsss this contribution was reduced to a great extentng derivative signals fundamentally the second-emission spectra It was also examined the linearityfferent signals measured on the second-derivative-ectra and the original trans-piceid concentration and

d a linear relationship employing the amplitude of the

ivative-emission spectra between 353 and 361 nm assignal The analytical and statistical parameters for

of the extractive procedure (results from the ANOVA of effects contributing to the model (by RSM))

Sum of squares dfa Mean square F-ratio p-valueb

11750 1 11750 6614 00422me) 362705 1 362705 0204 06673) 47950 1 47950 26981 00020

1128 1 1128 0635 0456117645 1 17645 0009929 09239167952 1 167952 009451 076892359 1 2359 1327 029314562 1 4562 2567 016022055 1 2055 1156 0323510660 6 1777

ed) 77260 15 5150

f freedomeclared significant if p-value lt005

ID Meras et al Talanta 74 (2008) 67

Table 4Piceid concentration found by the extractive-derivative-photoinduced-fluorescence method and by HPLC [32] in the validation stage

Method [Piceid] (g mLminus1)

Young red wine Barrel-aged red wine White wine

Extractive-derivative-photoinduced-fluorescencea

075 plusmn 011 084 plusmn 014 017 plusmn 003

HPLCb 072 plusmn 005 076 plusmn 008 020 plusmn 001

a Standard addition (three additions by triplicate)b Average plusmn standard deviation (n = 3)

the determmarized in

Thederivative mwine samppools wereinterferencmethod waby addingstock solutanalyticalwere consbetween thstandards othere wasnecessary i

Lastly imethod it wout on the fisuccessivelirradiated iinstead ofing We haaccount theslopes whthe extracticence measper wine sa

The conaccount thein compariisocratic elacid (10photochemdetection (in the valid

4 Conclu

It has banalyte hasrescent prothat phenanUV-irradia

cidation forresearch wple fast anin wine bycence coupof the variachemometrSurface Meproposed mmatographapplied suc

ccordrepo

RShenminus1)

t usetheendpre

wled

authrojecRod

Desaships als

nces

La RobMazz

Lare Bo Morcol J

imurd 49KimuI Chu92) 2rsini

97) 1Shan Merceedis ComAricharm B

Hady E

MedT Ribteren6

ination of trans-piceid in these conditions are sum-Table 1optimized extractive-photoinduced-fluorescence-

ethod was applied to the analysis of total piceid inles Young and barrel-aged red wine and white wine

analyzed in order to representing the commonestes in any future wine analysis The standard additions applied in any case on the diluted wine samplesthem increasing volumes of a trans-piceid ethanolicion before irradiating and the correspondent plotssignal vs added concentration of trans-piceid

tructed The slopes comparison test was appliedese plots and the constructed by extracting irradiatedf trans-piceid without wine and it was found that

matrix effect and the standard addition method isn order to eliminate itn order to improve the simplicity and speed of theas proven that the standard addition can be carriednal hydroethanolic reconstituted solution by addingy small volumes of a trans-piceid standard solutionn the same conditions as the diluted wine sampleson separated diluted wine solutions before extract-ve found that these two calibration plots taking into

recovery percentage in the extraction have similarich involves that the matrix effect does not occur inon nor in the photoreaction stage but in the fluores-ure This means that a single extraction is necessarymple and the results are not alteredcentrations of piceid in wines calculated taking into61 extraction recovery are summarized in Table 4

son with those calculated by a HPLC method withution (C18 column mobile phase acetonitrileacetic vv)water 193348 vvv 08 mL minminus1) andical pre-column derivatization and fluorescenceλexcem 260364 nm) developed by the authors [32]ation stage

sions

een demonstrated that a very weakly fluorescentbeen photochemically converted into highly fluo-

ducts Based on literature data [35] it is possible

tion (abettersion ([14] w(g mLsolvensis sothe expsample

Ackno

Thecia (PAiradotura yfellowSC) i

Refere

[1] RM184

[2] JL[3] G[4] RM

Tor[5] JF

Mi[6] Y K

Me[7] Y[8] M

(19[9] F O

(19[10] C

527[11] JM

Pronol

[12] HPh

[13] AMCoand

[14] Mcau266

threne derivatives to be originated as a result of thetion of piceid solutions The complete structural elu-

[15] J BurnsChem 5

5ndash682 681

these photoproducts is a new challenge for the futureork of this group It has been proposed a new sim-d inexpensive method for the determination of piceidsecond-derivative-photochemically induced fluores-led with liquidndashliquid extraction The optimizationbles involved in the extraction procedure by usingic tools (Central Composite Design and Responsethodology) gives good results The accuracy of theethod has been validated by comparison with a chro-

ic method developed by the authors and it has beencessfully to different wine samples Limits of detec-ing to Clayton criteria [34]) five times lower than the

rted [18] (SN = 3) have been achieved Better preci-D) values than ours have been previously reported

precision is evaluated at higher concentration levels Although a previous clean-up stage is needed thed is rapidly eliminated which implies a fast analy-

spent time in the whole procedure is comparable toed time in the fastest reported HPLC methods whenparation is not necessary [151719]

gements

ors acknowledge to Ministerio de Educacion y Cien-t CTQ2005-02389) for financial support Diegorıguez is grateful to the Consejerıa de Infraestruc-rrollo Tecnologico de la Junta de Extremadura for a(DOE 220604) Dra Dolores Lopez Soto (Vinaolivao acknowledged for providing wine samples

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no Dıaz I Duran Meras D Airado Rodrıguez Anal Bioanal87 (2007) 1999no I Duran-Meras D Airado J Sep Sci in press

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Teresa Galeano-DazIsabel Durn-MersDiego Airado-Rodrguez

Departamento de QumicaAnaltica Facultad de CienciasUniversidad de ExtremaduraBadajoz Spain

Original Paper

Isocratic chromatography of resveratrol and piceidafter previous generation of fluorescentphotoproductsWine analysis without samplepreparation

Resveratrol and its 3-glucoside (piceid) are stilbene-like molecules produced byplants Both of them are weakly fluorescent but highly fluorescent compounds areobtained when their hydroethanolic solutions are UV-irradiated which implies asubstantial improvement in the sensitivity of analytical methods Experimentaldesign (central composite design) together with the response surface methodologyhave been used to find optimum conditions for the fast sensitive and precise chro-matographic analysis (with isocratic elution) of resveratrol and piceid in wine sam-ples These compounds have been UV-transformed into their respective photoprod-ucts which have been separated in a C18 column (Novapack C18 150639 mm4 lm) by isocratic elution using a mobile phase made up of acetonitrile and41 vol aqueous acetic acid 1981 vv at a flow rate of 08 mLmin and fluorimetri-cally detected at 364 nm (kexc = 260 nm) Detection limits (SN = 3) are 029 and028 lgL for resveratrol and piceid respectively The method has been applied tothe analysis of these compounds in wine samples without a clean-up step The anal-ysis is completed in only 20 min The standard addition method has been applied tothe analysis of a commercial red wine and average recoveries near 100 wereobtained for resveratrol and piceid Three wine pools were satisfactorily analysed byexternal calibration

Keywords Isocratic HPLC Photochemical-derivatization Piceid Response surface methodo-logy Resveratrol Wine

Received June 28 2007 revised August 6 2007 accepted August 6 2007

DOI 101002jssc200700285

1 Introduction

Resveratrol (3495-trihydroxystilbene) is a stilbene phy-toalexin and it has been identified as a constituent ofvarious plant species Its production increases inresponse to stress of the plant or fungal infection [1]among other causes It appears in grapes as well as inwine [1ndash3] In wine resveratrol occurs free and as gluco-side (piceid) in their respective isomeric forms (Fig 1)

Piceid is the major polyphenol found in the root of themedicinal plant Polygonum cuspidatum The powder of this

root is used in China and Japan for treatment of somecardiac ailments including atherosclerosis and inflam-mation [4] The evidence for piceid in red wines was estab-lished by the use of a piceid standard extracted from Pcuspidatum [5]

Resveratrol can inhibit cellular events associated withtumour initiation promotion and progression [6]reduce cell death from oxidative stress [7] inhibit the oxi-dation of human low-density lipoprotein (LDL) [8] andinhibit platelet aggregation and eicosanoid synthesis [9]and it is an agonist for the estrogen receptor Piceid iso-mers have properties similar to those of resveratrol ininhibiting platelet aggregation [10] and inhibiting oxida-tion of human low-density lipoproteins On the otherhand in a less active manner than trans-resveratrol trans-piceid reduces the elevations of lipid levels and inhibitseicosanoid synthesis [11]

However the human digestive tract is known to haveglycosidase activity so it is possible that the glucoside ofresveratrol could release the aglycone on ingestion

Correspondence Professor Teresa Galeano-Daz Departamentode Qumica Analtica Facultad de Ciencias Universidad de Ex-tremadura Avda de Elvas sn CP 06071 Badajoz SpainE-mail tgaleanounexesFax +34 924289375

Abbreviations BSTFA bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamideCLD chemiluminiscent detection DAD diode array detectionECD electrochemical detection FLD fluorimetric detectionRSM response surface methodology

i 2007WILEY-VCH Verlag GmbH ampCo KGaAWeinheim wwwjss-journalcom

3110 T Galeano-Daz et al J Sep Sci 2007 30 3110ndash3119

J Sep Sci 2007 30 3110ndash3119 Liquid Chromatography 3111

In a recently published review the levels of resveratroland piceid in red wines from different regions are com-pared [12] Based on this paper red wine contains asmuch as 143 mgL and 292 mgL of trans-resveratrol andtrans-piceid respectively On the other hand levels ofresveratrol and piceid in red and white wines are quitedifferent thus 100 lgL has been reported as the maxi-mum level of resveratrol in white wines [2] the higherconcentrations in red wines are partially due to the wine-making process but they also depend on the grape vari-ety environmental factors in the vineyard and wineprocessing techniques [13] Piceid has received similarattention to resveratrol because in grape products theconcentration of the glucoside is usually significantlyhigher than the aglycone [14] The relative distributionbetween the glucosylated and aglycone forms in wine isdependent on a number of factors such as fermentationand ecological conditions [15] Resveratrol in all its formsis found in much higher concentration in red grape vari-eties than in white grapes

On the other hand due to the generally high ratio oftrans- to cis-isomers found in wines it has been suggestedthat the cis-isomers could arise from light exposure ofmust or wine during the wine-making process or possi-bly from light exposure of wine bottles during storage[5]

In recent years reverse phase high performance liquidchromatography with acidic solvent gradient elutionhas been the most commonly used procedure for thedetermination of resveratrol andor piceid in wine witheither diode array detection (DAD) [16ndash19] fluorimetricdetection (FLD) [20 21] DADndashFLD [22 23] chemilumi-nescent detection (CLD) [24 25] electrochemical detec-tion (ECD) [23] or mass spectrometry (MS) [23] and DADndashMS [26] Detection based on electrochemistry lumines-cence and MS offers higher sensitivity than DAD Gaschromatography tandem MS previous derivatizationnormally with bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) before column application [27] and micellarelectrokinetic chromatography (MEKC) with UV-detec-tion [28] capillary zone electrophoresis (CZE) with DAD[29] or ECD [30] or non-aqueous CZE with DAD [31] havebeen also employed for the analysis of resveratrol Piceidhas been also analyzed by CZE with DAD [32] In liquidchromatographic methods acetonitrile or methanol andacetic or formic acids are the most widely employedorganic solvent and acid respectively in mobile phasesto carry out the elution (always in gradient programs)

trans-Piceid and trans-resveratrol themselves are weaklyfluorescent but intense UV-irradiation of their alcoholicsolutions first induces their isomerization into cis-iso-mers also weakly fluorescent which very quickly disap-


Figure 1 Chemical structures of resveratrol and piceid isomers and suggested structures for their respective photoproducts


pear in favour of highly fluorescent compounds [33 34]by means of which total (trans-isomer plus cis-isomer)resveratrol and piceid present in a sample can be ana-lyzed We have exploited for the first time this photo-chemical behaviour to develop a sensitive chromato-graphic method for the analysis of these compounds byprevious UV-irradiation of the samples before injectingthem into the chromatographic system

As with other analytical techniques optimization ofthe variables in HPLC can be carried out by using chemo-metric techniques such as experimental design andresponse surface methodology (RSM) The use of thesetools has the advantage of attaining the optimal valuesof the variables with the smallest number of experi-ments and in the shortest time

Thus the goal of the present study is the developmentof a sensitive and fast method for the simultaneous chro-matographic determination of total (trans-isomer plus cis-isomer) resveratrol and piceid in wine samples quantify-ing them through the peaks of their fluorescent photo-products

Finally themethod was validated in terms of linearitylimits of detection and repeatability and it was appliedto the analysis of wine samples Detection limits havebeen calculated and were found to be significantly lowerthan the expected levels of these compounds in winesThus the method allows easy determination withoutprior stages of sample cleaning or concentration

2 Experimental

21 Chemicals and solutions

All solvents were of gradient grade for liquid chromatog-raphy (Merck Spain) All other chemicals were of analyti-cal reagent grade and used without further purificationUltrapure water obtained from a Millipore Milli-Q Sys-tem was used throughout

trans-Resveratrol and trans-piceid were obtained fromSigma and Aldrich Chem Co respectively and used asreceived 500 lgmL ethanolic stock solutions were pre-pared and stored at ndash48C in darkness Fresh workingstandard solutions were prepared by appropriate dilu-tion of stock solutions in absolute ethanol and water4060 vv

22 Wine samples

Several samples of young red wines barrel-aged redwines and white wines were provided by ldquoViaolivaSociedad Cooperativardquo (Almendralejo Badajoz Extrema-dura Spain) and three different pools were made withthe whole samples Samples were kept at 48C avoidingexposure to direct light

23 Instrumentation and software

The chromatographic studies were performed on a Hew-lett-Packard Mod 1100 LC instrument equipped withdegasser quaternary pump manual six-way injectionvalve with a 20-lL loop UV-visible diode-array detectorrapid scan fluorescence spectrophotometer detectorand the Chemstation software package to control theinstrument data acquisition and data analysis The ana-lytical column used was a Nova-Pak C18 150639 mm id4 lm particle size and 60 pore size (Waters Millipore)The mobile phase consisted of a mixture acetonitrilendashacetic acid (41) 1981 vv Mobile phase componentswere filtered through a 022-lm membrane nylon filterand degassed by ultrasonication before use The flow-ratewas 08 mLmin UV detection was performed at 306 nmand fluorescence detection was performed at 364 nm(kexc = 260 nm) Samples were filtered through 022-lmmembrane nylon filters before injection

An Osram 200-W mercury lamp with an Oriel model8500 power supply was used for the UV-irradiation of sol-utions

The software package The Unscrambler 611b CAMOASA [35] running under Windows XP was used for che-mometrics work

24 General procedure Calibration curves

Aliquots of trans-resveratrol and trans-piceid ethanolicsolutions containing between 01 and 100 lg of eachcompound were placed in 100 mL volumetric flasksethanol was added up to 40 mL (final medium composi-tion ethanolndashwater 4060 vv) and ultrapure water wasadded to the mark The resulting solutions were irradi-ated for 90 s under a high pressure mercury lamp and a20-lL volume of each irradiated solution was injectedinto the chromatographic system after previous filtra-tion through a 022 lm membrane nylon filter The elu-ate was fluorimetrically monitored at 364 nm (kexc =260 nm)

25 Procedure for the analysis of total resveratroland piceid in wine samples

Aliquots of 20 mL of wine (12 ethanol) were placed in100 mL volumetric flasks and 375 mL of ethanol andwater to the mark were added (final medium composi-tion ethanolndashwater 4060 vv) The resulting solutionswere irradiated for 90 s under a high pressure mercurylamp and a 20-lL volume of each one of the irradiatedsolutions was injected into the chromatographic systemafter previous filtration through a 022 lm membranenylon filter The eluate was fluorimetrically monitoredat 364 nm (kexc = 260 nm)



3 Results and discussion

The photoinduced spectrofluorimetric behaviour ofresveratrol and piceid has been previously studied by usand the results reported in recent papers [36 37] Inshort hydroethanolic solutions of trans-resveratrol andtrans-piceid are weakly fluorescent showing excitationmaxima centred at 225 and 318 nm and 230 and300 nm respectively and emission maxima centred at385 and 395 nm respectively It has been proven thatintense UV-irradiation of those solutions under a highpressure mercury lamp totally transforms resveratroland piceid into highly fluorescent compounds with asingle and sharp excitation maximum at 260 nm andtwo emission maxima at 364 and 382 nm and 361 and380 nm respectively

The optimum values of irradiation time and ethanolpercentage in the reaction medium are different for thetwo photoreactions Thus it was previously determinedby this research group [36 37] that 60 and 180 s were theoptimum irradiation times for resveratrol and piceidrespectively and in both cases longer irradiation timesled to the photo-destruction of the fluorescent photo-products On the other hand the ethanol percentage inthe photoreaction medium has a pronounced influenceon the yield of these reactions and for this reason etha-nolndashwater 4060 vv and purely aqueous media wereselected as optimum solvents for resveratrol and piceidphotoreactions respectively Thus it was necessary tochoose compromise values for these variables to performsimultaneous chromatographic determination of resver-atrol and piceid in a single run Taking into accountfirst that resveratrol concentrations in wine are lowerthan piceid concentrations and secondly that the elu-tion time for resveratrol is higher than for piceid whichimplies that dispersion has a greater effect on the resver-atrol peak the compromise irradiation time and ethanolproportion were selected to be more favourable forresveratrol determination and further experiments onirradiated samples were carried out by irradiating solu-tions in a 4060 vv ethanolndashwatermedium for 90 s

31 Previous chromatographic studies

In order to study the respective photodecompositionprocesses by chromatography aliquots of non-irradiatedand irradiated standard solutions of resveratrol andpiceid were injected into the chromatographic systemThese samples were initially eluted in isocratic modewith a mixture of acetonitrilendashacetic acid (32) 2278vv Chromatograms corresponding to a mixture of trans-resveratrol and trans-piceid and their corresponding pho-toreaction products are depicted in Fig 2-top As shownin Fig 2A trans-resveratrol and trans-piceid were UV-detected at 306 nm in non-irradiated samples at 61 and

24 min respectively but these compounds were not flu-orescently detected (Fig 2B) as they themselves areweakly fluorescent When these solutions were UV-irradi-ated for 90 s the peaks corresponding to trans-isomerspreviously observed by UV-detection became negligibleand three new peaks were fluorimetrically observed

The products of the photoreactions were fluorimetri-cally monitored at 364 nm (kexc = 260 nm) and it was pro-ven that a single photoproduct originated from resvera-trol designated FR in accordance with previous resultsreported by Roggero et al [33] On the other hand two flu-orescent photoproducts designated FP1 and FP2 wereobtained from piceid The fluorescence spectra corre-sponding to FP1 and FP2 are identical and assumingthat the photoproducts are phenanthrene derivativesthe formation of two isomers namely 26-dihydroxyphe-nanthrene-4-b-D-glucopyranoside and 46-dihydroxyphe-nanthrene-2-b-D-glucopyranoside from piceid and a sin-gle compound 246-trihydroxyphenanthrene fromresveratrol appears logical on the basis of literature data[38] As shown in Fig 2B FP2 is much more abundantthan FP1 and because of this FP2 will be used for thequantification of piceid in the interests of method sensi-tivity

Before optimizing the mobile phase composition forthe analysis of resveratrol and piceid in wine the photo-decomposition process was studied in wine samples inorder to determine whether the wine matrix interfereswith generation of the photoproducts An aliquot of20 mL of a commercial red wine was fortified with 98and 114 lg of trans-resveratrol and trans-piceid respec-tively and diluted to a final volume of 100 mL with etha-nol and water (final percentage of ethanol 40 vol) Thissample was injected into the chromatographic systembefore and after being irradiated for 90 s and was elutedunder the same conditions as the standard mixture Therecorded chromatograms are depicted in Fig2-bottomWith this mobile phase only trans-resveratrol is photo-metrically detected at 306 nm as a separated peak andtrans-piceid co-elutes with other compounds of the wineFig 2C By carrying out the photoreaction on a wine sam-ple it was proven that the photoreaction proceeds in thesame way in the wine matrix and the correspondingphotoproducts were observed

32 Optimization of themobile phase for wineanalysis by the RSM

Previously proposed methods for the analysis of resvera-trol and piceid used a gradient solvent program for elu-tion [16ndash26] Methanol and acetonitrile are the mostwidely employed organic solvents and formic and aceticacids are most widely employed to fix the pH of the aque-ous phase We chose acetic acid to fix the pH of themobile phase and acetonitrile as organic solvent Thus



we have selected an isocratic mobile phase acetonitrilendashwaterndashacetic acid in order to simplify the analysisobtaining an adequate resolution of the peaks of interestwith respect to other fluorescent compounds typicallypresent in wine Also we have taken into account thatthe selected mobile phase could be used in the future tostudy the photodecomposition process in wine and todevelop an on-line post-column photoderivatizationmethodology which requires consideration of the reso-lution of the peaks corresponding to the trans-isomerswith respect to the peaks corresponding to other interfer-ents of wine in the optimization procedure

For optimization of the percentage of acetic acid andorganic solvent in the isocratic mobile phase an experi-mental design central composite design (Fig 3A) wasused with the aim of calculating simultaneously theeffect of the change in each one of these variables andalso its possible interaction Five levels were fixed foreach variable There are also three central samples giv-ing rise to a total of 11 experiments (Fig 3A) This designis rotatable and therefore the precision in the calcula-tion of the response is uniform over the whole experi-mental field

The selected response function (RF) was RF = (k9 N RRs)twhere RRs is the sum of the resolution (Rs) correspondingto peaks FP1 (FLD) FP2 (FLD) and trans-resveratrol (UVD)

with respect to the main interfering peaks correspond-ing to wine components k9 is the capacity factor for trans-piceid (UVD) which is the first-eluted peak near to non-retained compounds in some points of the design and tis the time corresponding to the elution of the last peak(FR) which is always resolved but at very high retentiontimes with some of the assayed mobile phases Rs hasbeen maintained at 15 for the resolution values greaterthan this With this RF the best separation of the analytesof interest from the interfering compounds in the winewould be achieved in the shortest time

RF = (k N RRs)t

Each experiment was carried out on two independentsamples corresponding to wine samples non-irradiatedand UV-irradiated for 90 s A sample containing 20 mL ofa pool of commercial red wines (12 ethanol) volumesof trans-resveratrol and trans-piceid stock solutions con-taining 98 and 114 lg respectively ethanol up to34 mL and water to a final volume of 100 mL wasinjected into the chromatographic system withoutbeing irradiated and irradiated for 90 s under a highpressure lamp after previous conditioning of the systemwith each one of the assayed mobile phases marked bythe model Elution was carried out at a flow rate 08 mL


Figure 2 Chromatograms corresponding to a sample containing 098 and 114 mgL of trans-resveratrol and trans-piceidrespectively (A and B) and to an aliquot of 2 mL of a commercial red wine fortified with 98 and 114 lg of trans-resveratrol andtrans-piceid respectively and diluted to a final volume of 100 mL (C and D) non-irradiated ( N N N ) and irradiated for 90 s (mdash)Mobile phase acetonitrilendashacetic acid (32) 2278 vv 08 mLmin UV-detection at 306 nm and FLD at kexcem 260364 nm


min and the eluate was photometrically and fluorimet-rically monitored at 306 nm and kexcem 260364 nmrespectively

Optimization of the model was performed with TheUnscrambler software package [35] and the results wereinterpreted with RSM In the corresponding analysis ofvariance (ANOVA) a second-grade quadratic model isassumed (Model Check Quadratic p-value (95) =00004) It was proven that the effect of ACN (p-value =00002) and the interactions ACNndash ACN (p-value =00002) and ACNndash acetic acid (p-value = 00010) con-tribute significantly to the model for a 95 confidencelevel Nevertheless the effect of acetic acid (p-value = 00639) and the interaction acetic acidndash ace-tic acid (p-value = 00539) are not significant in the modelfor the considered confidence level On the other handthe p-value (95) calculated for lack of fit was 00760which means that the model describes the true shape ofthe response surface Fig 3B shows the response surface

estimated by the model for the studied pair of variablesThe maximum point of this surface corresponds to thevalues of the variables 19 ACN and 33 acetic acidThus the mobile phase selected as optimum for thedetermination of resveratrol and piceid in wines was ace-tonitrilendashacetic acid (41) 1981 vv Under these condi-tions the three fluorescent photoproducts are baselineresolved in less than 20 min as shown in Fig 4 and theretention times and capacity factors are 51 73 and179 and 27 44 and 122 respectively for FP1 FP2 andFR respectively

33 Method validation Analytical parameters

The linearity of the method was assessed by preparingcalibration standards with concentrations ranging from10 to 1000 lgL of each analyte Each standard was intro-duced into the chromatographic system in triplicatewith the mobile phase determined as optimum and


Figure 3 (A) Central composite design and variable levels used for the optimization of the mobile phase Vol Acetonitrile1492 17 22 27 2907 Acetic acid 024 09 25 41 476 (B) Estimated response surface for the pair of effects ACN and acetic acid

Figure 4 Chromatogram (FLDkexcem 260364 nm) correspondingto a standard sample containing290 and 340 lgL of resveratroland piceid respectively irradiatedfor 90 s and eluted under optimumconditions


eluted at a flow rate of 08 mLmin after previous irradia-tion of samples for 90 s under a high pressure mercurylamp Resveratrol and piceid were quantified through FRand FP2 respectively Calibration curves were built byplotting the mean of the obtained area as a function ofthe standard concentration The results obtained aresummarized in Table 1

The limits of detection and quantification wereobtained as 3 and 10 times respectively the signal-to-noise ratio Thus the average amplitude of the baseline ofstandard chromatograms measured in different zonesfor time intervals of around twominutes was multipliedby 3 or 10 and the concentrations of resveratrol or piceidcorresponding to these signals were calculated with therespective calibration curves constructed employing thepeak height as analytical signal

Repeatability was evaluated by performing 11 succes-sive injections of analytes at the concentration levels490 lgL for resveratrol and 570 lgL for piceid

34 Determination of total resveratrol and piceid inwine samples

The optimized method was applied to the analysis ofwine samples

First a standard addition was carried out on a com-mercial red wine in order to examine the possible matrixeffect and to calculate the recoveries at different concen-tration levels It was proven that there is no matrix effectby comparing the slope of the calibration graph obtainedby external calibration with that of the standard addi-tion plot and then recoveries at four different concentra-tion levels were calculated for resveratrol and piceid Asshown in Table 2 the recoveries are highly satisfactory ataround 100 in all cases

Secondly the method was applied to the analysis of alarge number of samples by external calibration All thewine samples were divided into three groups young andbarrel-aged red wine and white wine in order to repre-sent the commonest interferences in any future wineanalysis Samples of each pool were prepared in triplicate


Table 1 Analytical and statistical parameters for the chromatographic determination of total resveratrol and piceid

Resveratrol Piceid

Linearity range (lgL) 1ndash1000 1ndash1000Calibration curve (Peak area vs lgL) y = (122 l 001) x ndash (125 l 25) y = (0732 l 0004) x ndash (736 l 156)r2 0999 0999LODa) (lgL) 029 028LOQb) (lgL) 097 095Repeatability RSDc) 95 46

a) SN = 3b) SN = 10c) n = 11490 and 570 lgL of trans-resveratrol (FR) and trans-piceid (FP2) respectively

Table 2 B) Results obtained in the analysis (mgL) of totalresveratrol and piceid in wine pools by external calibration

Young redwine

Barrel-agedred wine

White wine

Resveratrol 028 l 001 027 l 002 015 l 001Piceid 072 l 005 076 l 008 020 l 001

Table 2 A) Results of the chromatographic procedure for the determination of resveratrol and piceid in a commercial red wineusing the standard addition method

Resveratrol Piceid

Added (mgL) Found (mgL)a) Recovery ()a) Added (mgL) Found (mgL)a) Recovery ()a)

000 212 l 004 ndash 000 3154 l 039 ndash102 374 l 011 119 l 4 111 3498 l 019 107 l 1255 482 l 031 103 l 7 278 3371 l 084 98 l 2357 636 l 016 112 l 3 389 3556 l 038 106 l 1510 739 l 068 102 l 9 555 3731 l 21 101 l 6Slope calibrationb)

In absence of wine 1154In presence of wine 1180

Slope calibrationb)


a) Average l standard deviation (n = 2)b) Peak area vs mgL


according to the sample preparation protocol previouslydetailed A 20 lL volume of each one of the resulting sam-ples was injected into the chromatographic system andthe eluate was fluorimetrically monitored at 364 nm(kexc = 260 nm)

Chromatograms corresponding to the three pools arerepresented in Fig 5 in comparison with a standard sol-ution containing 290 and 340 lgL of resveratrol andpiceid respectively

The results obtained on analysis of the three pools arealso summarized in Table 2

To sum up the concentration of these two stilbenesare correctly determined at low concentration levels in asimple and fast manner

The content of resveratrol and piceid in these winepools was also determined spectrofluorimetrically bymethods previously proposed by us [36 37] and theresults obtained agree with those presented here

Finally in the chromatograms obtained under opti-mized conditions for some of the analysed red wines apeak very close to that of FP2 is observed (Fig 6A) How-ever the emission spectrum of the interferent compoundand that corresponding to FP2 are slightly different (Fig6B) which led us to eliminate the contribution of theinterferent by selecting as analytical signal the differencebetween the peak areas obtained on detection at 369 and348 nm (kexc = 260 nm) isoemissive points in the emissionspectrumof the interferent butnot in that of FP2


Figure 5 Chromatograms (FLDkexcem 260364 nm) correspondingto a standard sample containing290 and 340 lgL of resveratroland piceid respectively ( N N N )and young red (A ndashndashndashndash) barrel-aged red (B mdash) and white (Cndashndashmdash) wine pools irradiated for90 s and eluted under optimalconditions


4 Concluding remarks

Very weakly fluorescent analytes (trans-resveratrol andtrans-piceid) have been photochemically converted intohighly fluorescent products and on that basis a newfast and sensitive isocratic chromatographic methodwith fluorescence detection has been proposed for theanalysis of resveratrol and piceid in wine samples Satis-factory results have been obtained in the analysis ofdifferent wine pools

It is very important to highlight that the photochemi-cal behaviour of the two compounds has been exploitedhere for the first time with the aim of improving theirchromatographic analysis in wines and the results openthe way for other interesting alternatives

Lowest LOD (SN = 3) in reported HPLC methods withDAD FLD or MS detection are in the order of ppb [16 1820 21 25 26] The LOD for the method reported in thispaper is 10 or even 100 times lower than these There isonly one reported HPLC method with chemiluminiscentdetection in which a LOD of 02 lgL has been reached[24]

Nowadays our main challenges in this field are on theone hand the study of the photodecomposition processand the identification of the photoproducts (elucidationof their structures) and on the other hand the design ofa system for the post-column derivatization on-line

The authors acknowledge the Ministerio de Educacin y Ciencia(Project CTQ2005-02389) for financial support Diego AiradoRodrguez is grateful to Consejera de Infraestructura y Desar-rollo Tecnolgico de la Junta de Extremadura for a fellowship(DOE 220604) Dra Dolores Lpez Soto (Viaoliva SC) is alsoacknowledged for providing wine samples

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Figure 6 (A) Chromatogram (FLD excem 260364 nm) corresponding to a standard sample containing 290 and 340 lgL of resver-atrol and piceid respectively ( N N N ) and chromatograms obtained at kem 348 (ndash ndash ndash) and 369 nm (ndashndash mdash) (kexc 260 nm) and thechromatogram difference between them (ndash) for a commercial red wine (B) Emission spectra (kexc 260 nm) at the marked pointsof the chromatogram


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Analytical Methods

Post-column on-line photochemical derivatizationfor the direct isocratic-LC-FLD analysis of resveratrol

and piceid isomers in wine

Isabel Duran-Meras Teresa Galeano-Dıaz Diego Airado-Rodrıguez

Departamento de Quımica Analıtica Facultad de Ciencias Universidad de Extremadura Avda de Elvas sn CP 06071 Badajoz Spain

Received 24 July 2007 received in revised form 28 December 2007 accepted 31 December 2007

Abstract

Resveratrol is a stilbene produced by plants eg grapes in response to stress Resveratrol is extracted during winemaking being pres-ent in wine as 3-O-b-D-gluocoside (piceid) and as aglycone Both resveratrol and piceid exist in two isomeric forms trans and cis Res-veratrol and piceid are weakly fluorescent in both of their isomeric forms but highly fluorescent compounds are obtained when theoriginal molecules are UV-irradiated A chromatographic method with post-column on-line photoderivatization has been developedfor the analysis of resveratrol and piceid isomers The four analytes are firstly separated in a C18 column (150 mm 39 mm id4 lm) by isocratic elution at 15 C with a mobile phase consisting of a mixture acetonitrileo-phosphoric acid (004) 1882 vv at09 mL min1 and secondly they are on-line phototransformed into their fluorescent photoproducts in a 3 m PTFE tube coiled arounda 4 W xenon lamp The elution conditions have been chemometrically optimized by means of the experimental design and the responsesurface methodology Linearity ranges from 010 to 150 and from 010 to 100 lg mL1 and LOD around 0001 and 001 lg mL1 havebeen calculated for trans- and cis-isomers respectively The method has been satisfactorily applied to red and white wine samples bystandard addition and external calibration respectively 2008 Elsevier Ltd All rights reserved

Keywords Resveratrol Piceid Post-column photochemical derivatization LC Response surface methodology Wine

1 Introduction

Resveratrol (3405-trihydroxystilbene) is a stilbene pro-duced by plants in response to fungal infection or abioticstresses such eg produced by heavy metal ions It occursin mulberries peanuts and grapes Grapes contain a largeamount of different phenolic compounds in skins pulpand seeds that are partially extracted during winemaking(Jackson 1994)

It is believed that the high level of this compound in redwine (01ndash15 mgL of total trans-resveratrol ie aglyconeand glucoside forms) (Fremont 2000) is linked to the lowincidence of heart diseases in some regions of France the

so-called lsquolsquoFrench paradoxrdquo ie despite high fat intakemortality from coronary heart disease is lower due to theregular drinking of wine (Corder et al 2001 SoleasDiamandis amp Goldberg 1997)

This compound has attracted considerable attention dueto its various biological and pharmacological activitiesincluding antioxidative and anticancer activities beingimplied in the inhibition of cellular events associated withtumour initiation promotion and progression (Savouretamp Quesne 2002)

Resveratrol-3-O-b-D-glucoside (piceid) is the main com-ponent of the Polygonum cuspidatum root used in Japaneseand Chinese folk medicine for the treatment of some car-diac ailments including atherosclerosis and inflammation

trans-Resveratrol trans-piceid and their cis-isomershave been found in wines (Lamuela-Raventos Romero-Perez Waterhouse amp de la Torre-Bororat 1995)

0308-8146$ - see front matter 2008 Elsevier Ltd All rights reserved

doi101016jfoodchem200712080

Corresponding author Telfax +34 924289375E-mail address iduranunexes (I Duran-Meras)

wwwelseviercomlocatefoodchem


Food Chemistry 109 (2008) 825ndash833


c-Resveratrol t-piceid and c-piceid are physiologicallyas important as t-resveratrol It seems that t-piceid can bemore effectively absorbed than the aglycone according toHollman (1997) the absorption of some phenols from thediet is enhanced by conjugation with glucose

Piceid has received such attention as resveratrol becausein grape products the concentration of the glucoside isusually significantly higher than the aglycone (LamuelaRaventos amp Waterhouse 1999) The relative distributionbetween the glucosilated and aglycone forms in wines isdependent on a number of factors such as fermentationand ecological conditions (Moreno-Labanda et al 2004)It is a fact that resveratrol in all its forms is found in muchhigher concentration in red grape varieties compared withwhite grape ones

On the other hand due to the generally high ratio of t-to c-isomers found in wines it has been suggested that thec-isomers could arise from light exposure of must or wineduring the winemaking process or possibly from light expo-sure of wine bottles during storage (Lamuela-Raventoset al 1995)

Numerous methods have been described to determinethe concentration of the four resveratrol derivatives inwine most of them HPLC methods by acidic solventgradient elution Currently HPLC detection proceduresare based upon UV absorption (Abril Negueruela PerezJuan amp Estopanan 2005 Castellari Sartini FabianiArfelli amp Amati 2002 Vitrac et al 2005) fluorimetry(Bravo Silva Coelho Vilas Boas amp Bronze 2006 PineiroPalma amp Barroso 2006 Vitrac Monti Vercauteren Def-fieux amp Merillon 2002) electrochemistry (Bravo et al2006 Kolouchova Hanzlıkova Melzoch Filip amp Smidr-kal 2004) and mass spectrometry (Bravo et al 2006Loredana La Torre Saitta Vilasi Pellicano amp Dugo2006 Pozo-Bayon Hernandez Martın-Alvarez amp Polo2003)

t-Piceid and t-resveratrol themselves are weakly fluores-cent but intense UV-irradiation of their alcoholic solu-tions first induces the isomerization into c-isomers alsoweakly fluorescent which very quickly disappear in favourof highly fluorescent compounds (Roggero amp Garcıa-Parrilla 1995 Roggero 2000) With the objective ofexploiting this photochemical behaviour in favour of themethod sensitivity a chromatographic method for theanalysis of total (t- plus c-) resveratrol and piceid in wineprevious off-line irradiation of samples has been proposed(Galeano-Dıaz Duran-Meras amp Airado-Rodrıguez2007b) The aim of the present work was to design a systemin which the photochemical process occurs on-line after theseparation of isomers in the chromatographic column iean on-line post-column LC method

An isocratic mobile phase has been optimized for wineanalysis by using the experimental design and the responsesurface methodology (RSM) The method has been vali-dated in terms of linearity and limits of detection andhas been successfully applied to the analysis of winesamples

2 Experimental


All solvents were gradient grade for liquid chromatogra-phy (Merck VWR International Eurolab SL Carreterano 152 km10 08100 Mollet del Valles Barcelona Spain)All other chemicals were of analytical reagent grade andused without further purification Ultrapure waterobtained from a Millipore Milli-Q System was usedthroughout

t-Resveratrol and t-piceid were obtained from Sigmaand Aldrich Chem Co (Sigma Aldrich Quımica SAAvda Valdelaparra 53 28100 Alcobendas MadridSpain) respectively and used as received Ethanolic stocksolutions (100 lg mL1) of each compound were preparedand stored at 4 C in darkness Fresh working standardsolutions were prepared by appropriate dilution of stocksolutions in ultrapure water

c-Resveratrol and c-piceid were in situ obtained by expo-sure of solutions of their t-isomers containing 15 lg mL1

to the sunlight for a period of thirty seconds The concen-tration of the obtained c-isomers was calculated throughthe decrease of the chromatographic peaks of their respec-tive t-isomers

22 Wine samples

Several samples of red and white wine were obtained inthe market Samples were kept at 4 C avoiding exposureto direct light


The chromatographic studies were performed on a Hew-lettndashPackard Mod 1100 LC instrument equipped withdegasser quaternary pump manual six-way injection valvecontaining a 20 lL loop UVndashvisible diode-array detectorrapid scan fluorescence spectrophotometer detector andthe CHEMSTATION software package to control theinstrument data acquisition and data analysis The analyt-ical column used was a Nova-Pak C18 150 mm 39 mmid 4 lm particle size and 60 A pore size (Waters Milli-pore) The column temperature was controlled by a coilwith re-circulating water which temperature was selectedthrough a thermostatic bath A post-column photoreactor(Softron Gynkotek HPLC Germany) consisting of aPTFE tube (3 m 03 mm ID 16 mm ED) coiledaround a 4 W xenon lamp was placed between the UVndashvis-ible diode-array detector and the fluorescence detector Themobile phase consisted of a mixture acetonitrileo-phos-phoric acid (004) 1882 vv Mobile phase componentswere filtered through a 022 lm membrane nylon filterand degassed by ultrasonication before use The flow ratewas 09 mL min1 Fluorescence detection was performedat 364 nm (kexc = 260 nm) A scan range from 200 to500 nm was performed in DAD Samples were filtered

826 I Duran-Meras et al Food Chemistry 109 (2008) 825ndash833


through 020 lm membrane PTFE filters (Millex-FG)before injection

The software package THE UNSCRAMBLER 611b

CAMO ASA (Unscrambler v 611 CAMO AS Olav Try-ggvasonsgt N-7011 Trondheim Norway) running underWindows XP was used for the application ofchemometrics

24 General procedure calibration curves

Aliquots of t-resveratrol and t-piceid ethanolic solu-tions containing between 10 and 10 lg of each one ofthem were placed in 100 mL volumetric flasks and ultra-pure water was added up to the mark Aliquots (20 lL) ofeach solution were injected into the chromatographic sys-tem previous filtration through 020 lm membrane PTFEfilters The eluate was fluorimetrically monitored at 364 nm(kexc = 260 nm)

To obtain the calibration curves for the c-isomers theprocedure was solutions containing 15 lg mL1 of t-res-veratrol and t-piceid were exposed to the sunlight forthirty seconds The resulting solutions were injected intothe chromatographic system and the concentration ofc-resveratrol and c-piceid in this solution was calculatedthrough the decrease observed in the chromatographicpeaks corresponding to their t-isomers quantifiablethrough their respective calibration curves previouslyestablished It was proven that the solutions containingc-isomers kept in the dark were stable at least for 24 hCalibration curves for c-isomers were established fromc-resveratrol and c-piceid samples prepared by successivedilution of the sun-irradiated solutions in the concentra-tion range from 010 to 10 lg mL1 Aliquots (20 lL) ofeach standard solution were injected into the chromato-graphic system and eluted and monitored as previouslyspecified

25 Procedure for the analysis of resveratrol and piceidisomers in wine samples

251 Red wines

The analysis of the four compounds in red wine was car-ried out by the standard addition method Identical ali-quots of wine were added into a set of flasks andincreasing volumes of a standard mixture of the four iso-mers previously quantified and ultrapure water wereadded to the mark Aliquots (20 lL) of each one of thesesolutions were injected into the chromatographic system

252 White wines

In this case the analysis was carried out by externalstandard calibration Aliquots of 50 mL of wines andultrapure water up to the mark were added in a 10-mL vol-umetric flask 20 lL of the resulting solutions were directlyinjected into the chromatographic system The concentra-tion of the four analytes in white wine was calculated fromtheir respective calibration graphs


The study about the photoinduced spectrofluorimetricbehaviour of resveratrol and piceid has been recently pub-lished (Duran Meras Galeano Dıaz amp Airado Rodrıguez2008 Galeano Dıaz Duran Meras amp Airado Rodrıguez2007a) In short hydroethanolic solutions of t-resveratroland t-piceid are weakly fluorescent showing two excitationmaxima centered to 225 and 318 nm amp 230 and 300 nmrespectively and a single emission maxima centered to385 and 395 nm respectively It has been proven thatintense UV-irradiation of those solutions under a highpressure mercury lamp totally transforms resveratrol andpiceid into highly fluorescent compounds with a sharp exci-tation maxima at 260 nm and two emission maxima at 364and 382 nm amp 361 and 380 nm respectively

On the other hand this photochemical behaviour hasbeen also exploited for the chromatographic analysis resve-ratrol and piceid in wine previous photochemical derivati-zation (Galeano-Dıaz et al 2007b) However the maindrawback of that method is the fact that total amounts(t- plus c-isomer) of each one of the analytes are determinedand it is not possible to determine the relative isomeric distri-bution of each one of them because no the original analytespresent in the sample but their photoproducts are injectedand separated into the chromatographic system In themethod reported in this paper t- and c-isomers of resveratroland piceid are eluted in their original state and once elutedand photometrically detected they are phototransformedinto their respective fluorescent photoproducts in order toincrease the sensibility and selectivity in the detection

Most of the previously proposed chromatographic meth-ods for the analysis of these analytes in wine are reversephase methods and carry the elution out by a gradientbeing the mobile phases mixtures of diluted acid solutionsand organic solvents Acetic and formic acids and metha-nol and acetonitrile are the most common acidic andorganic components of mobile phases respectively In thedevelopment of a chromatographic method in which apost-column derivatization reaction goes on-line it is highlyimportant the composition of the mobile phase not only forthe separation but for the detection Thus some previousassays were carried out by fluorescence spectroscopy Itwas proven that the post-column photoreaction goesequally in neutral and acidic media when the pH was fixedby the addition of diluted hydrochloric acid It was also pro-ven the minor photoinduced fluorescent signals obtained inpresence of any other acid specially the organic ones andfinally o-phosphoric acid was chosen as a compromisingsolution Regarding to the organic component of the mobilephase it was proven that the rate of the photoreactions andthe maximum photoinduced signal were similar in presenceof different percentages of methanol or acetonitrile Finallyacetonitrile was chosen mainly because of its lower viscos-ity higher elution strength and lower UV absorptivity

A study was first done to evaluate the effect of thephotoreactor on the fluorimetric detection of a mixture of

I Duran-Meras et al Food Chemistry 109 (2008) 825ndash833 827


t-resveratrol and t-piceid For this purpose a mixture ofboth t-isomers was injected and eluted with a mobile phaseconsisting in acetonitrilewater 1981 vv with the photore-actor turned OFF Two chromatographic peaks wereobserved at 487 and 1535 min corresponding to t-piceidand t-resveratrol respectively A second injection underthe same conditions but with the photoreactor turnedON showed that both compounds were greatly modifiedby photoreaction and their fluorescent photoproducts dis-cussed above had been obtained in a certain extensionFig 1A shows a comparison of the obtained FLD-profileswith and without post-column photoderivatization

Besides it was chromatographically proven that increas-ing the content of o-phosphoric acid in the mobile phaseimplies a slight reduction in the retention times and a lossof sensitivity in t-resveratrol and t-piceid chromatographicpeaks

Lastly it is too important to highlight that nylon filterscannot be used to filter solutions containing resveratrolor piceid because it was proven that 100 of the analytewas retained in the membrane Hydrophobic fluoropore(PTFE) filters are used throughout this work

31 Optimization of the chromatographic conditions by the

RSM for the sensitive analysis of wine samples

Separation and photoreaction results have to be takeninto account to select the best mobile phase Thus the nat-ure of the mobile phase components was chosen looking

for the best environment for the reaction course namelyacetonitrile as organic modifier and o-phosphoric acid tofix the pH were finally selected as said above On the otherhand in the present case a photochemical reaction is goingto take place which implies that ultraviolet light could beconsidered as one of the reactants and its concentrationwill be controlled through the residence time of the ana-lytes in the photoreactor that is the mobile phase flowBecause of this the sensitivity of the method will be mainlycontrolled through the mobile phase flow

An isocratic mobile phase has been looked for and forthe optimization of its composition ie the percentage ofacetonitrile and o-phosphoric acid and its flow rate theexperimental design namely a central composite designhas been used with the aim of calculating simultaneouslythe effect of the change in each one of the variables andalso their possible interactions Five levels were fixed foreach variable There are also three central samples givingrise to a total of 17 experiments The assayed levels for eachone of the variables were vol acetonitrile 251 230200 170 150 vol H3PO4 005 004 003 002001 flow 150 130 100 070 050 This design is rotat-able and therefore the precision in the calculation of theresponse is uniform over the whole experimental field

A standard solution containing 050 lg mL1 of t-resve-ratrol and t-piceid respectively and a sample containing750 mL of a pool of commercial red wines fortified with13 lg of t-resveratrol and t-piceid respectively in a finalvolume of 250 mL were eluted under the conditions indi-

0 10 12 14 16 18t (min)

0

2

4

6

8

10

F I

(λex

cem

260

364

nm

)F

I (λ

exc

em 2

603

64 n

m)

t-Piceidt-Resveratrol

t (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

t-Piceid

t-Resveratrol

unknown

A

B

8642

0 10 12 14 16 188642

Fig 1 (A) Chromatograms corresponding to a mixture containing 100 lg mL1 of t-resveratrol and t-piceid obtained with the photoreactor turnedOFF (mdashmdash) and ON ( ) Mobile phase acetonitrilewater 1981 vv 09 mL min1 FLD at kexcem 260364 nm (B) FLD-profiles (FLD kexcem 260364 nm) corresponding to a standard sample containing 050 lg mL1 of trans-resveratrol and trans-piceid respectively (mdashmdash) and a sample containing750 mL of a pool of commercial red wines fortified with 130 lg of trans-resveratrol and trans-piceid respectively in a final volume of 250 mL ( )eluted under conditions predicted as optimum and submitted to post-column photoderivatization



cated by the design The photoreactor was turned ON dur-ing all the experiments and the eluate was photometricallyand fluorimetrically monitored at 306 nm and kexcem 260364 nm respectively

In the selection of the response function (RF) sensitivityand sensibility parameters have been taken into accountThe selected response function was

RF frac14 Rsetht-PicTHORN thornPAt-RethhtTHORN thorn PAt-PethhtTHORN

2

norm

ethPA frac14 Peak AreaTHORN

The first term represents the performance of the chro-matographic separation and the second one the methodsensitivity The resolution of the t-piceid peak with respectto the wine interferences is taken as representative of theperformance In some samples of the design this peakappears resolved from the pre-eluted or the post-elutedinterferences and in some other points it is completelyco-eluted with wine interferences So Rsetht-PicTHORN is the lessfavourable resolution value for the peak corresponding tot-piceid multiplied by two when the other resolution valuefor this peak is higher than 15 The peak corresponding tot-resveratrol was fully resolved in all of the assayed condi-tions and because of this the resolution of this peak wasnot included in the response function The second termevaluates the sensitivity through peak areas values Thesedepend on the photoreaction yield and fluorescence quan-tum yield of the on-line generated photoproducts Thisterm has been obtained by normalizing the mean value ofthe peak areas of phototransformed t-resveratrol andt-piceid measured in the standard mixture chromatogramsThe strategy of normalizing the second term has been car-ried out to give a similar importance to both terms Theretention times were not considered as in any case theywere not longer than 30 min an acceptable analysis timefor an isocratic method

The optimization of the model was made with THEUNSCRAMBLER software package (Unscrambler v611 CAMO AS Olav Tryggvasonsgt N-7011 Trond-heim Norway) and the results were interpreted with theResponse Surface Methodology In the correspondinganalysis of variance (ANOVA) a second-grade quadraticmodel is assumed (model check quadratic p-value(95) = 00008) It was proven that the effects ACN(p-value = 00310) and flow (p-value = 00067) and theinteractions ACNndash ACN (p-value = 00019) H3PO4ndash H3PO4 (p-value = 00002) and flowndashflow(p-value = 00001) contribute significantly to the modelfor a 95 confidence level Nevertheless the effect H3PO4 (p-value = 00765) and the interactions ACNndash H3PO4 (p-value = 01348) ACNndashflow (p-value =01013) and H3PO4ndashflow (p-value = 01725) are not sig-nificant to the model for the considered confidence levelOn the other hand the p-value (95) calculated for lackof fit was 00583 which means that the model describesthe true shape of the response surface Fig 2 shows theresponse surfaces estimated by the model for each pair

of variables In these surfaces the maximum value of RFcorresponds to the values of variables 18 ACN33 102 H3PO4 and flow 09 mL min1 Thus themobile phase selected as optimum was acetonitrileo-phos-phoric acid (004) 1882 vv at a flow rate of09 mL min1 Under these conditions both analytes are




resolved to the baseline in less than 15 min as shown inFig 1B and the retention times and capacity factors are465 and 1437 min and 21 and 858 respectively fort-piceid and t-resveratrol respectively

32 Influence of the temperature

In a study of the interday precision a poor reproducibil-ity in the retention times for both compounds and in theresolution of the peak corresponding to t-piceid withregard to the wine interferences was observed when injec-tions were carried out without fixing the column tempera-ture and because of this the influence of the temperaturewas thoroughly studied at this point

Thus a standard sample containing 10 lg mL1 of t-resveratrol and t-piceid and a commercial red wine samplethree-times diluted with ultrapure water were eluted underoptimum conditions keeping constant the column temper-ature by a coil with re-circulating water which temperaturewas controlled through a thermostatic bath The assayedvalues were 10 15 20 25 and 30 C

An increase in the capacity factors of both compoundswas observed as decreasing the temperature On the otherhand it was found that when the temperature was higherthan 15 C a wine interference coeluted with t-piceidFinally a temperature of 15 C was selected as optimumand it was fixed for further analysis

33 cisndashtrans Isomery

It has been described in the literature (Roggero 2000Roggero amp Garcıa-Parrilla 1995) and spectrophotometri-cally proven (Duran Meras et al 2008 Galeano Dıazet al 2007a) the cisndashtrans photoisomery of resveratroland piceid

c-Resveratrol and c-piceid are originated by exposingthe corresponding t-isomers to sunlight as shown inFig 3A When the sunlight-exposed sample is eluted underconditions previously deducted as optimum two new peaksare observed at 1130 and 3504 min corresponding toc-piceid and c-resveratrol respectively apart from peakscorresponding to t-resveratrol and t-piceid The establish-ment of the nature of those peaks has been carried outby obtaining the spectra in the peak with the diode-arraydetector The peaks corresponding to c-isomers are totallyresolved with regard to the corresponding to the t-ones Onthe other hand c-isomers are less polar than the t-onesprobably due to the intra-molecular interaction typehydrogen-bond between hydroxyl groups

In Fig 3B the FLD-chromatogram corresponding to acommercial red wine sample 20-times diluted and a stan-dard mixture of t-resveratrol and t-piceid 30 s exposed tothe sunshine are shown In both cases the photoreactoris turned ON and the corresponding fluorescent photo-products from t- and c-isomers are successfully obtained

0 10 20 30 40t (min)

0 10 20 30 40t (min)

-2

0

2

4

6

8

A 290

nm (m

Au)

240 3600

4

240 3600

4

240 3600

05

240 3600

05

0

40

80

120

160

200

F I

(λex

cem

260

364

nm

)

t-Pic

c-Pic

t-Res

c-Res

Unknown

t-Pic

c-Pic

t-Res

c-Res

A

B

Fig 3 (A) A290 nm-profiles corresponding to a sample containing 080 lg mL1 of trans-resveratrol and trans-piceid before ( ) and after (mdash-) a 30 sexposure to the sunshine and apex-spectra on-line registered (B) FLD-profiles corresponding to a sample containing 140 lg mL1 of trans-resveratroland trans-piceid 30 s exposed to sunshine ( ) and a commercial red wine 20-times diluted (mdash-)



As it is observed the four isomers are present in the realsample It is also observed a total resolution between thefour compounds of interest and the wine interferencesand because of that it was not considered to change themobile phase

It has been proven that intense ultraviolet irradiationunder a high pressure mercury lamp totally transformt- and c-resveratrol and t- and c-piceid in highly fluorescentphotoproducts A single photoproduct (FR) is originatedfrom resveratrol and two photoproducts (FP1 and FP2)isomers between them from piceid (Galeano-Dıaz et al2007b) It is very important to highlight that the expositionto the sunshine has to be carried out for a time not so longin order to avoid the appearance of the corresponding fluo-rescent photoproduct FP1 FP2 and FR and thus avoid-ing errors in the c-quantification It has been proven thatonly c-isomers and not the fluorescent forms are gener-ated when samples are exposed for 30 s under the sunshineby comparing the chromatograms obtained for a sampleirradiated under a high pressure mercury lamp in the nec-essary conditions to obtain the fluorescent compoundsand the corresponding to a 30 s exposed to the sunshineThis fact has also been proven by following the photoreac-tion at the wavelength (275 nm) corresponding to the iso-bestic point of the on-line obtained spectra for each pairof t- and c-isomers This isobestic point is shown inFig 4 where the spectra obtained in the peak apex forthe pair c- and t-piceid are represented Since at this wave-length the molar absorptivity of both isomers is the same

the peak area vs concentration ratio is also the same forthe two peaks Thus the total area must be kept constantas the concentration of each pair cisndashtrans does This hasbeen proven to be true in the present case and it was alsoconfirmed by the absence of any other photoproducts

With the aim of quantifying the four isomers in winethe corresponding calibration graphs for the c-isomerswere obtained by relating the area of the new peak attrib-uted to the c-isomers with the difference between the con-centrations of t-isomers prior and after exposure tosunshine

34 Method validation analytical parameters

The linearity of the method was assessed by preparingcalibration standards with concentration from 010 to150 lg mL1 of t-resveratrol and t-piceid and from 010to 100 lg mL1 of c-resveratrol and c-piceid as previouslyexplained Each standard was introduced in the chromato-graphic system in triplicate and eluted under optimumconditions Calibration curves for each one of the four ana-lytes were built by plotting the mean of the obtained areafor the phototransformed analytes as a function of thestandard concentration The results obtained are summa-rized in Table 1

The limits of detection (LOD) and quantification (LOQ)were obtained as 3 and 10 times respectively the ratio sig-nalnoise So the average amplitude of the baseline of stan-dard chromatograms measured in different zones for timeintervals around 2 min was multiplied by 3 or 10 and theconcentrations of the respective analyte to these signalswere calculated with the respective calibration curves con-structed employing the peak height as analytical signalThe obtained values are summarized in Table 1

35 Determination of resveratrol and piceid isomers in wine

samples


Firstly a standard addition was carried out on commer-cial red and white wines pools in order to examine the pos-sible matrix effect Within the assayed whites wines it wasproven the absence of matrix effect and because of thatfurther analysis were carried out by external calibration

240 280 320 360λ (nm)

0

7

14

21

A (m

Au)

A (m

Au)

240 280 320 360λ (nm)

0

1

2

3

4

5

6

7

Fig 4 Apex-spectra on-line obtained corresponding to a solutioncontaining trans-piceid before exposure to sunshine (mdash-) and after aexposure of 30 s (mdash-) and 60 s ( ) Isobestic point at 275 nm is roundedin the right figure

Table 1Analytical and statistical parameters for the chromatographic determination of resveratrol and piceid isomers (FLD kexcem 260364 nm)

t-Resveratrol c-Resveratrol t-Piceid c-Piceid

Linearity range (lg mL1) 010ndash150 010ndash100 010ndash150 010ndash100Calibration curve

(peak area vs lg mL1)y = (10581 plusmn 355)x (673 plusmn 340)

y = (28202 plusmn 1851)x+ (3203 plusmn 1047)

y = (43669 plusmn 1126)x (4329 plusmn 1170)

y = (19025 plusmn 2415)x+ (1664 plusmn 1167)

r 09944 09957 09967 09843LODa (lg mL1) 00012 0014 00014 00071LOQb (lg mL1) 00041 0046 00047 0023

a SN = 3b SN = 10



In red wines unlike in the white ones it was found the exis-tence of matrix effect which implies that the analysis has tobe carried out by the standard addition method Besides itwas deducted that the origin of this matrix effect is in thephotochemical process because no matrix effect wasobserved when peak areas were measured in the DAD-pro-file being this detector before the photochemical reactor inthe experimental device

Two commercial red wines pools and a white one wereanalyzed Besides a noble rot white wine from Hungary(Tokaji) was also analyzed Results are summarized inTable 2 Higher levels of the four compounds mainly ofpiceid isomers are found in this wine than in an ordinarywhite wine because this one is made from botrytized grapes

4 Conclusions

Resveratrol and piceid molecules are stilbenoids onesand as such they suffer interesting photochemical reactionsOur research group following with the aim of exploitingthis photochemical behaviour proposes an isocratic-LCmethod with post-column on-line photoderivatizationwhich let us firstly separate the cisndashtrans-pairs and thenphototransform each compound in a highly fluorescentone The photochemical reaction has been doubly exploitedin this case firstly to obtain the c-compounds which arenot commercially available and secondly to improve thefluorimetric detection

As far as we know this is the first time that an on-linepost-column photoderivatization system is proposed forresveratrol and piceid isomers analysis

The analysis of four compounds in wine samples hasbeen carried out in a total time of 35 min without sampletreatment

Acknowledgement

The authors acknowledge to Ministerio de Educacion y

Ciencia (Project CTQ2005-02389) for financial supportDiego Airado Rodrıguez is grateful to Consejerıa de Infrae-structura y Desarrollo Tecnologico de la Junta de Extrema-

dura for a fellowship (DOE 220604)

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Table 2Concentration of resveratrol and piceid isomers found in the analyzed wines Analysis was done in triplicate in all cases

t-Piceid(lg mL1)

c-Piceid(lg mL1)

t-Resveratrol(lg mL1)

c-Resveratrol(lg mL1)

Commercial red wines POOL 1 65 plusmn 05 29 plusmn 03 14 plusmn 01 021 plusmn 012Commercial red wines POOL 2 12 plusmn 01 15 plusmn 01 0070 plusmn 0050 0060 plusmn 0020Commercial white wines POOL 0099 plusmn 0013 042 plusmn 002 0054 plusmn 0009 0068 plusmn 0010Noble rot white wine (Tokaji) 029 plusmn 005 070 plusmn 002 0070 plusmn 0010 0064 plusmn 0050



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USEFULNESS OF FLUORESCENT LANDSCAPES IN

COMBINATION WITH PARAFAC AS FINGERPRINTS OF RED

WINES

1- INTRODUCTION

The interest in studying the chemical composition of wine is prompted by

its importance for the assessment of wine quality It is important to develop

fast analytical methods without sample pre-treatment In the last years the

quality of wines has been highly improved by the wine industry and also

the customers are raising their demand on the quality Tools to handle and

address the chemical analysis of these wines are becoming a necessity in

wine industry in order to automate the production and stabilize the quality

Tools that allow classification of the wine depending on the region of

origin type of grapes used in the elaboration or winemaking process can be

helpful for this industry

Multidimensional fluorescence techniques such as total luminescence is

particularly useful for the analysis of complex food matrices Total

luminescence spectroscopy involves sequential acquisition of excitation or

emission spectra at multiple emission or excitation wavelengths

respectively The resulting emission-excitation data matrix (EEM) provides

a total intensity profile of the sample over the range of excitation and

emission wavelengths scanned These methods are fast non-invasive

sensitive and relatively low-cost In addition these techniques provide

information about fluorescent molecules and their environment in

biological and food samples and are reported to be 100-1000 times more

sensitive than other spectroscopic techniques1

1 GM Strasburg RD Ludescher Trends Food Sci Technol 6 (1995) 69-75

In recent years research has focused on the development of rapid and non-

destructive techniques for the assessment of authenticity and classification

of food products Fluorescence spectroscopy is widely used to characterize

the food quality because of its high sensitivity and specificity and its

possible use as non-destructive technique

Conventional right angle fluorescence is as a common detection technique

mostly used in transparent and diluted solutions extracted from the sample

either directly or after chromatographic separation More recently front

face fluorescence is recorded directly on the turbid or solid intact samples

to rapidly and non-destructively assess food authenticity or monitor some

parameters The front-face illumination angle may vary between 30ordm and

60ordm Thus fluorophores such as riboflavin chlorophyll tryptophan tyrosin

phenylalanine NADH collagenous connective tissue and various oxidation

products can be detected and quantified non-destructively

Dufour and co-workers have previously assayed the usefulness of single

excitation (250-350 nm λem 376 nm) and emission (275-450 nm λexc 261

nm) spectra of wines for the purpose of investigating the variety typicality

and vintage of French and German wines Emission spectra were

characterized by a maximum at 376 nm with a shoulder at 315 nm The

most important variation within the set of registered spectra for the studied

samples was found in the ratio peakshoulder intensity This preliminary

study shows that front-face fluorescence spectroscopy combined with

chemometrics offers a promising approach for the authentification of

wines2

Bilinear models have been successfully applied to evaluate single

autofluorescence spectra of meat3 fish4 dairy products5 cereals6 fruit

2 Eacute Dufour A Letort A Laguet A Lebecque JN Serra Anal Chim Acta 563 (2006) 292-299 3 J P Wold M Mielnik M K Pettersen K Aaby P Baardseth J Food Sci 67 (2002) 2397-2404

juices7 and honey8 EEMs however have been shown to follow the three-

way PARAFAC (PARAllel FACtor analysis) decomposition model910 and

such multiway models have been applied to autofluorescence landscapes of

intact food systems11 such as sugar12 meat13 fish oil14 cheese15 yogurt16

and edible oils1718 Nevertheless no previous references to the usefulness

of fluorescence landscapes of wines have been found The potential of

fluorescent signals for the classification purpose is most likely increased

when increasing the dimensionality of the data thus 3D-data would often

be more powerful than 2D ones especially for interpretation purposes Thus

the total excitation-emission fluorescent matrices of red wines have been

deeply studied in the present paper

The main aim of this work was to detect the main fluorescent components

in red wine in order to improve the interpretation of the rather complex

fluorescence spectra as well as better understand the potential of the

method This was done by the use of a PARAFAC model applied on

fluorescence landscapes of different wine samples A wide variety of red

4 C M Andersen J P Wold J Agric Food Chem 51 (2003) 470-476 5 J P Wold A Veberg A Nilsen V Iani P Jucenas J Moan Int Dairy J 15 (2005) 343-353 6 A Kissmeyer-Nielsen S A Jensen L Munck J Cereal Sci 3 (1985) 181-192 7 P Seiden R Bro L Poll L Munck J Agric Food Chem 44 (1996) 3202-3205 8 K Ruoff R Karoui E Dufour W Luginbuhl J O Bosset S Bogdanov R Amado J Agric Food Chem 53 (2005) 1343-1347 9 R Bro ChemomIntellLabSyst 38 (1997)149-171 10 C M Andersen R Bro JChemom 17 (2003) 200-215 11 J Christensen L Norgaard R Bro S B Engelsen Chemical Reviews 106 (2006) 1979-1994 12 R Bro Chemom Intell Lab Syst 38 (1997) 149-171 13 J K S Moller G Parolari L Gabba J Christensen L H Skibsted J Agric Food Chem 51 (2003) 1224-1230 14 D K Pedersen L Munck S B Engelsen J Chemom 16 (2002) 451-460 15 J Christensen E M Becker C S Frederiksen Chemom Intell Lab Syst 75 (2005) 201-208 16 J Christensen V T Povlsen J Sorensen J Dairy Sci 86 (2003) 1101-1107 17 E Sikorska A Romaniuk I V Khmelinskii R Herance J L Bourdelande M Sikorski J Koziol J Fluoresc 14 (2004) 25-35 18 F Guimet J Ferre R Boque F X Rius Anal Chim Acta 515 (2004) 75-85

wine samples from different origins were collected in order to span the

quality variation and reveal corresponding differences in fluorescence

properties A tentative identification of the fluorophores in wine was done

by matching the PARAFAC-scores from each sample with HPLC results

laying down qualitative principles for further development of quantitative

methods for the fast measure of the concentration of such fluorophores

Furthermore taking into account that wines from different countries are

included in the model the capability of the intrinsic fluorescence of wines

for the purpose of classification according to the origin is assessed This

purpose is highly important for wine importing countries

2- MATHERIALS AND METHODS

21- WINE SAMPLES

57 red wines from different origin were included in this study Two samples

from France 16 from Chile 3 from South Africa 6 from Australia (2 of

them from the Western zone) 3 from Spain 6 from Argentina 3 from

USA 15 from Italy 1 from Tunisia and 2 from Portugal Samples were

stored at 4ordm C and the fluorescence landscape was registered immediately

after opening the bottle Origin of samples and type of grape when this data

is available is summarized in Table 1

22- FLUORESCENCE SPECTROSCOPY

Fluorescence measurements were collected with a Perkin Elmer LS50B

fluorescence spectrophotometer mounted with a variable angle front-face

accessory to ensure that reflected light scattered radiation and

depolarisation phenomena were minimised The angle of incidence defined

as the angle between the excitation beam and a perpendicular to the cell

surface was 30ordm Wine samples were placed in a 3 mL quartz cell and

spectra were recorded at 15ordmC Slits at excitation and emission

monochromators were set at 15 and 5 nm respectively Acquisition speed

was fixed at 500 nmmin as a compromising solution between noise in the

spectra and collection time Excitation and emission wavelengths ranges

were 245-340 and 300-4985 nm respectively with wavelengths

increments of 5 and 05 nm respectively The landscape was registered as

multiple emission spectra at decreasing excitation wavelengths starting at

340 and finishing at 245 nm to avoid sample alteration by the UV

excitating beam Total scanning time per sample was approximately 10

minutes Measurements were performed within a short period of time (6

days) to minimize the effect of instrumental fluctuation (eg lamp

intensity)

23- FLUORESCENCE MEASUREMENTS ON STANDARDS

All chemicals were of analytical grade Ultrapure water obtained from a

Millipore Milli-Q System was used throughoutGallic acid p-coumaric

acid ellagic acid ferulic acid gentisic acid trans-resveratrol trans-piceid

quercetin rutin catequin and epicatequin were obtained from Sigma

Vanillic acid caffeic acid and sinapic acid were obtained from Fluka

Stock solutions of standards were prepared in ethanol Diluted solutions

were prepared in a synthetic wine matrix containing 3 gL of tartrate buffer

at pH 37 and 13 v of ethanol Instrumental settings were similar to

those employed in wine analysis but in the 90ordm geometry

24- HPLC ANALYSIS

With the objective of reaching a better knowledge of fluorescent molecules

in wine samples the 57 samples were chromatographied and the eluate was

fluorimetrically monitored at the excitationemission wavelengths pairs

corresponding to the resulting PARAFAC components An appropriate

gradient program was chosen to carry out the elution of samples with the

objective of getting a good separation and a good profile of the fluorescent

compounds in wine at each specific excitationemission pair Thus three

injections were made of each sample monitoring the eluate at λexcem

260360 (compromising wavelengths for PARAFAC component 1 and 4)

275320 (PARAFAC component 2) 330410 nm (PARAFAC component

3) respectively

The chromatographic separation was carried out using as mobile phase

methanol-formic acid-water (10288 vv) as solvent A and methanol-

formic acid-water (9028 vv) as solvent B with the following gradient

program 0 min 100 A 15 min 85 A 15 B 25 min 50 A 50

B 34 min 30 A 70 B The flow rate was set at 025 mLmiddotmin-1

All solvents were gradient grade for liquid chromatography (Merck) All

other chemicals were of analytical reagent grade and used without further

purification Ultrapure water obtained from a Millipore Milli-Q System

was used throughout

25- MATHEMATICAL ANALYSIS OF DATA

251- PRETREATMENT OF DATA SET

Rayleigh signals in all of the EEM were removed by inserting the Matlab

term NaN (Not a Number) in the Rayleigh zones and zeros in the zones

where λemltλexc because there is no emission at wavelengths below the

excitation wavelength as this would correspond to higher energy being

emitted than the energy causing the excitation Zeros in this zone speeds up

the calculations10

252- PARAFAC analysis

When a sample produces a J x K matrix (a second order tensor) such as an

EEM (J = number of emission wavelengths K = number of excitation

wavelengths) the corresponding set obtained by ldquostackingrdquo all the

registered matrices is a cube Appropriate dimensions of such a cube are I x

J x K (I = number of samples) Since EEMs follow a trilinear model the

cube can be written as a sum of tensor product of three vectors for each

fluorescent component If An Bn and Cn collect the relative concentration

(I x 1) emission (J x 1) and excitation (K x 1) profiles for component n

respectively the data cube F can be written as1920

F = sum=

N

n 1An otimes Bn otimes Cn + E

where otimes indicates the tensor product N is the total number of fluorescent

components and E is a residual error term of the same dimensions as F

The column vectors An Bn and Cn are usually collected into the three

loading matrices A B and C

A characteristic property of F is that it can be uniquely decomposed

providing access to spectral profiles (B and C) and relative concentrations

(A) of individual components in the I mixtures whether they are chemically

known or not This constitutes the basis of the so-called second-order

advantage (ldquosecond-orderrdquo refers to the tensor order of a single sample data

matrix in contrast to ldquothird-orderrdquo as referred to the cube formed by the

matrices of I samples)

The PARAFAC analysis was performed in Matlab ver 710 (The

Mathworks Inc MA USA) by use of the PLS_Toolbox (Eigenvector

Research Inc WA USA)

To look into the whole set of fluorescence data the EEMs of the 57 samples

were arranged in a three-dimensional structure of size 57 x 398 x 20

(samples x number of emission wavelengths x number of excitation


wavelengths) The array was decomposed by PARAFAC using different

number of factors In all cases non-negative constrains for the resolved

profiles in all modes were applied This was done to obtain a realistic

solution because the concentrations and the spectra should be positive

253- PRINCIPAL COMPONENT ANALYSIS OF

SCORE VALUES

Principal component analysis (PCA) is a powerful visualisation tool for

data evaluation which can graphically represent inter-sample and inter-

variable relationships and provides a way to reduce the dimensionality of

the data PCA is an unsupervised method of pattern recognition in the sense

that no grouping of the data has to be known before the analyses Using

PCA class membership is easy to indicate on a score plot

The set of sample score values obtained in the PARAFAC decomposition

were analysed by PCA to analyse possible discrimination among origin

and type of grape PCA was run by means of The Unscramblerreg software

package21

3- RESULTS AND DISCUSSION

31- EXCITATION-EMISSION MATRICES OF RED WINES

The EEMs corresponding to four of the analysed wines samples are shown

in Figure 1 in the form of landscapes and also the emission and excitation

spectra extracted from these matrices at the specified wavelengths in the

Figure caption All samples fluoresce in the emission region between 300

and 400 nm when they are excited at wavelengths under 290 nm The

excitation and emission spectra previously published by Dufour et al2 for

discrimination of French and German wines belong to this fluorescent 21 Unscrambler v 611b CAMO AS Olav Tryggvasonsgt N-7011 Trondheim Norway

zone However as shown in Figure 1 this region is too complex to obtain a

full overview by using sets of single pairs of excitation and emission

spectra Another fluorescent region can be found in some of these maps

more red-shifted in the excitation axis in the emission zone around 350 and

450 nm when exciting the sample at wavelengths longer than 290 nm

In the emission spectra at an excitation wavelength of 260 nm (blue) a

wide band centred to 372 nm is observed in which two maxima can be

distinguished at 363 and 380 nm The intensity ratio for these two maxima

is dependent on the sample as previously described by Dufour et al2 Thus

for example in sample number 19 the fluorescence intensity at 380 nm is

higher than at 363 unlike in samples 7 and 17 or in sample 1 in which the

intensity ratio is close to one Regarding the excitation spectra obtained at

363 nm (blue) two excitation maxima can be located at 260 and 280 nm

The relative intensities of these two peaks vary with the samples like the

emission do being for example the ratio FI (260 nm) FI (280 nm)

higher than 1 for sample 19 and smaller than 1 for sample 1 also in other

cases like in samples 7 and 17 the maximum excitation is centred at 280

nm and a simple shoulder is observed at 260 nm

Interesting emission spectra are obtained at an excitation wavelength of 280

nm (black) In this case the highest fluorescent emission is reached around

363 nm but in some cases like for example in samples 1 and 17 a second

maximum is observed around 325 nm as important as the first one

Furtermore a single excitation maximum at 275 nm is observed at λem= 325

nm for all samples

Lastly the third typical emission spectra can be obtained more red-shifted

in the excitation axis around 320 nm (red) A wide emission maximum is

obtained in this case centred at 388 nm An excitation maximum is

observed at 325 nm when the emission wavelength is fixed at 388 nm

being the shape of these excitation spectra below 300 nm similar to the

previously described excitation spectra at λem = 363 nm

32- PARAFAC RESULTS

The excitation and emission profiles of ldquopurerdquo components where extracted

from the set of fluorescent landscapes by applying PARAFAC Choosing

the appropriate number of components is the first step for constructing the

PARAFAC model and this decision may be done under different criteria10

among them the so-called core consistency diagnostic Core consistency

percentages of 100 and 997 were calculated for one and two

components respectively and 509 404 and -33 for the three four and

five-component models respectively It seemed to be clear that a one or

two-components model was not adequate and also a number of five

components was excessive and it could originate an overfitting situation

The visual appearance of the loadings was helpful to finally decide that the

optimal number of components in the present case was four because it was

observed that in the 5-component model the fifth component was a

combination of the first and the fourth while in the four-components case

all of the excitation and emission profiles seemed to be independent from

each other

It was deducted that there were no outlier samples by observing the score

values in the sample mode because no extreme values were found

Lastly the stability and appropriateness of the built model was tested by

split-half analysis22 Thus different subsets of data were extracted

according to several split criteria (even-odd Italian - non-Italian and

Chilean - non-Chilean samples) and each one of them was independently

22 Harshman RA and de Sarbo WS An application of PARAFAC to a small sample problem demonstrating preprocessing orthogonality constraints and split-half diagnostic techniques In Research Methods for Multimode Data Analysis Law HG Snyder CW Hattie JA McDonald RP (eds) PraegerNew York 1984 602-642

analysed The same spectral profiles were obtained in all cases

demonstrating the validity of the constructed model

The results from the PARAFAC model are shown in Figures 2 and 3 in the

form of PARAFAC loadings in excitation and emission modes and 3D

structure of PARAFAC components respectively 3D structures of factors

were obtained by multiplying the corresponding excitation and emission

profiles of each component First component excitation profile is the more

hypsochromically shifted showing a narrow maximum centred around 260

nm and a sharp emission maximum at 380 nm with a shoulder at 365 nm

The optimum excitation emission wavelength pair for the second

component is 275 323 nm An important bathochromic shift and an

increase in the band width is observed in the excitation and emission

profiles corresponding to the third component being centred at 330 and 410

nm respectively And lastly the fourth component is situated close to the

first and the second one which implies that this component models the

more blue-shifted region of landscapes namely the excitation profile

centred at 280 nm with a shoulder at 260 and the emission one at 364 nm

33- PCA ANALYSIS OF SCORES VALUES COLLECTION

PCA was performed on the 57 x 4 data matrix corresponding to the

PARAFAC scores of the 57 samples Category variables were included in

the data set corresponding to the origin of samples and type of grape when

these last data were available The similarity maps defined by the principal

components 1 (PC1) and 2 (PC2) and also PCA loadings are shown in

Figure 4 grouping samples according to the origin and to the type of grape

(explaining 79 and 90 of total variance respectively) These two models

are slightly different due to the fewer samples included in the grape PCA

because the grape data is not available for all samples as reflected in Table

1 Regarding the loadings it is important to highlight how factor 1 and 4

span the variation in PC1 while PC2 represents a variation component

where factor 1 and 4 are opposed to factor 2 and 3

When the origin is taken into account as category variable (figure 4A)

including all the samples in the PCA some discrimination for samples

coming from different countries is observed According to PC1 Chilean

samples have the most negative score values making up the cluster on the

left side of the map and the rest of samples on the right Western-

Australian and Spanish samples have the higher scores values in this

component being different from them because of the higher scores values

of Western-Australian samples in PC2 Lastly regarding Italian French

South African and American samples all of them have low score values in

both PCs being different from the two previously described clusters Not

all samples are included in clusters which is natural

There are other factors apart from the origin affecting the total fluorescent

population in wines Fluorescent compounds are mostly generated in the

grape pulp seeds and skins and they are partially extracted into wine in the

winemaking process and therefore the variety of grapes should influence in

their relative amounts Other factors influencing are the environmental

conditions in which grapes have grown the treatment of the vineyard (eg

irrigation and pruning) the ripeness of the fruit in the vintage moment the

fermentation techniques employed in the winemaking the maceration

process the ageing of wine in barrels among others are factors which

might affect the fluorescent properties in wine As summarized in table 1

the type of grape was specified for some of the analysed wines some of

them being monovarietal and some others multivarietal Thus the PCA

similarity map defined by the two first principal components can also be

studied from the point of view of type of grape including just samples in

which this parameter is known as represented in figure 4B A clear

evidence of the effect of grape variety can be observed within Chilean

wines Samples 9 53 and 54 made from Merlot grapes are grouped

separated from the rest of Chilean samples Also the influence of the origin

is evidenced in the group of samples made from the same grape variety

samples 18 and 19 from Australian-Western are far away from samples 30

31 and 32 from Argentina and sample 33 from USA even though all of

them are made from Shiraz grapes

Finally a PCA was performed on the Chilean wines group and the

similarity map for the two first components (90 of explained variance) is

represented in figure 4C Again a clear discrimination between wines from

Merlot grapes (samples 9 53 and 54) and the rest of wines is observed

These samples are parted from the Chilean cluster in figure 4A possibly

caused by the different type of grape Besides as it can be observed in the

loading plot the third PARAFAC component contributes in a higher

extension to PC2 than in the models represented in 4A and 4B and an

inversion in the relative positions of factor 1 and factor 4 is observed as a

consequence samples 9 54 and 53 are in the left side of the scores plot

unlike in maps represented in 4A and 4B

34- IDENTIFICATION OF FLUOROPHORES

341- FLUORESCENCE OF TYPICAL FLUORESCENT

COMPOUNDS PRESENT IN WINE

Fluorescent properties of compounds present in wines are highly dependent

of the working medium being influenced by variables such as the acidity or

the composition of the medium It is known that fluorescent behaviour is

highly affected by the pH of the medium and sometimes by the content of

organic solvents such as ethanol Thus a chemical environment similar to

wine matrix has been looked for and fluorescent measurements of

standards were therefore in all cases made in a synthetic wine matrix

containing 3 gL of tartrate buffer at pH 37 and 13 v of ethanol

The fluorescent properties of assayed fluorophores are summarized in table

2 in the form of maximum excitation and emission wavelengths together

with the maximum wavelengths corresponding to the four PARAFAC

components It is deducted from this table that catechin and epicatechin

wavelengths match well with those of PARAFAC component 2 p-

Coummaric acid trans-resveratrol trans-piceid and gentisic acid

fluorescent properties are close to PARAFAC component 3 Lastly vanillic

acid could be related with PARAFAC component 4 because of the

proximity of emission spectra and various maxima in the excitation one

Excitation and emission spectra for these candidates are presented in Figure

5 Except for catechin and epicatechin no exact match with the PARAFAC

loadings is found which support the idea that each PARAFAC component

does not correspond to a single fluorescent molecule but more probably to

a conglomerate or family of fluorescent molecules

342- HPLC ANALYSIS OF WINE SAMPLES

Three chromatograms corresponding to the same sample monitoring the

eluate at the three different wavelengths pairs λexcem 260360

(compromising wavelengths for PARAFAC component 1 and 4) 275320

(PARAFAC component 2) 330410 nm (PARAFAC component 3) are

represented in Figure 6 The global fluorescent intensity when exciting at

330 nm is quite small compared to those obtained for excitation at 260 nm

or even at 275 nm

Once the chromatograms had been registered for all samples possible

correlations between PARAFAC score values of each component and the

heights of single peaks in the corresponding chromatogram were looked for

Regarding to the first PARAFAC component it was found high

correlations between scores for this component and the heights of peaks at

30 and 345 minutes in the FLD-profiles at λexcem 260360 nm Between

these two peaks the better correlation was found with the second one as

shown in Figure 7A Besides the emission spectra (λexc= 260 nm) in these

peaks were on-line registered It was found that the emission profile at 345

minutes is very similar to factor one The molecular weight of this

compound was deducted by LC-MS resulting to be 534 a very high value

suggesting a condensation compound Regarding the spectrum at 30

minutes it was located in the same wavelengths region as the PARAFAC

component one but the shape of the peak was not the same that this

component By spiking samples with the assayed standards it was stated

that these peaks did not correspond with any of them With the set of

chromatograms at λexcem 260360 nm it was proven by plotting the scores

of PARAFAC component 4 vs the height of the peak corresponding to

vanillic acid (retention time = 25 minutes) that these components are

correlated (Figure 7B) Very good correlations were found between the

scores corresponding to the second PARAFAC component and the heights

of the peaks corresponding to catechin and epicatechin (retention time =

222 and 277 minutes respectively) in the set of chromatograms obtained

at λexcem = 275320 nm (Figure 7C) indicating the identity of this

PARAFAC component Lastly regarding to the third component good

correlations were found with some of the peaks in the chromatograms

obtained at λexcem 330410 nm namely peaks at 287 302 (p-coummaric

acid) 33 and 363 minutes

CONCLUSIONS

The potential of fluorescence excitation emission matrices as fingerprints of

red wine samples has been demonstrated Evidently chemometric tools are

necessary to handle this kind of complex data and PARAFAC

decomposition has proven to work properly

The same methodology could be applied to study wines from an appellation

in order to develop chemical tools to avoid the fraud in a field highly

controlled like this

A better knowledge of the fluorescent properties of red wines has been

achieved establishing basis for further studies Certain identification of all

the detected PARAFAC components is one of the main future challenges

ACKNOWLEDGEMENTS

We would like to thank Arcus AS (Oslo Norway) for supplying the

carefully selected set of red wines

Table 1- Origin and type of grape in analysed wine samples

Sample Number Origin Type of Grape

1 France Cabernet Sauvignon 2 France 3 Chile Cabernet Sauvignon 4 Chile Cabernet Sauvignon 5 Chile Cabernet Sauvignon 6 Chile Cabernet Sauvignon 7 Chile Cabernet Sauvignon 8 Chile Cabernet Sauvignon 9 Chile Merlot

10 Chile Cabernet Sauvignon 11 Chile Cabernet Sauvignon 12 Chile Cabernet Sauvignon 13 Chile 14 Chile 15 South Africa Cabernet Sauvignon 16 South Africa Cabernet Sauvignon 17 South Africa Cabernet Sauvignon

18 Australia (Western) Shiraz


20 Australia Shiraz ndash Cabernet Sauvignon 21 Australia Shiraz ndash Cabernet Sauvignon 22 Australia 23 Australia 24 Spain 25 Spain 26 Spain 27 Argentina Malbec ndash Syrah ndash Bonarda 28 Argentina Malbec ndash Syrah ndash Bonarda 29 Argentina Malbec ndash Syrah ndash Bonarda 30 Argentina Syrah 31 Argentina Syrah 32 Argentina Syrah 33 USA Syrah 34 USA Ruby Cabernet 35 USA Ruby Cabernet 36 Italia 37 Italia 38 Italia (Sicilia) 39 Italia Sangiovese 40 Italia Sangiovese 41 Italia 42 Italia 43 Italia 44 Tunisia 45 Italia 46 Italia 47 Italia 48 Italia 49 Italia 50 Italia

51 Chile 52 Chile 53 Chile Merlot 54 Chile Merlot 55 Portugal 56 Portugal 57 Italia Sangiovese

Table 2- Fluorescent properties of assayed fluorescent molecules in 3 gL tartrate buffer at pH 37 and ethanol 13 v and PARAFAC four components

Compound λexc (nm) λem (nm)

gallic acid 241 350 p-coumaric acid 348 410

vanillic acid 241 282 305 354

caffeic acid 262 433 ellagic acid 333 422 sinapic acid 297 335 446 ferulic acid - -

Phenolic Acids

gentisic acid 320 446 trans-resveratrol 318 390

Non-Flavonoids

Stilbenes trans-piceid 318 390 quercetin 427 480 Flavonols rutin - - catechin 279 317 Flavanols epicatechin 280 316

malvidine-3-O-β-glucopyranoside 280 355

delphinidin-3-O-β-glucopyranoside 280 355

Flavonoids

Anthocyanins

petunidin-3-O-β-glucopyranoside 280 355

PARAFAC Component 1 260 380 PARAFAC Component 2 275 323 PARAFAC Component 3 330 410 PARAFAC Component 4 260 280 364

Sample 1

Sample 7

Sample 17

Sample 19

Figure 1- LEFT Fluorescence landscapes (as contour plots) corresponding to wine samples number 1 (French Wine) 7 (Chilean Wine) 17 (South African Wine) and 19 (Australian Wine) MIDDLE Extracted excitation spectrum at λem= 325 (black) 363 (blue) and 388 nm (red) RIGHT Extracted emission spectra at λexc= 260 (blue) 280 (black) and 320 nm (red)

EXCITATION

EMISSION

Figure 2- PARAFAC fluorescent loadings for the four components (FIRST Blue SECOND Green THIRD Red FOURTH Light Blue) of the non-negativity constrained PARAFAC model constructed based on the fluorescent landscapes of 57 wine samples

Figure 3- 3D structure of PARAFAC first (blue) second (pink) third (orange) and fourth (green) factors obtained by multiplying the corresponding loading-vectors

A) Sample grouping according to origin B) Sample grouping according to type of grape C) Chilean wines grouped according to type of grape Figure 4- PCA loadings (left) and scores (right) defined by principal components 1 and 2 for the set of PARAFAC scores values according to different grouping criteria

Figure 5- Excitation and emission spectra of some of the assayed standards in 3 gL tartrate buffer at pH 37 and ethanol 13 v

200 300 400 500λ (nm)

0

200

400

600

800F

ICatechin

200 300 400 500λ (nm)

0

100

200

300

400

500

F I

Epicatechin

200 300 400 500λ (nm)

0

100

200

300

F I

p-Coumaric Acid

200 300 400 500λ (nm)

0

200

400

600

800

1000

F I

Gentisic Acid

200 300 400 500λ (nm)

0

200

400

600

800

1000

F I


200 300 400 500λ (nm)

0

100

200

300

F I

Vanillic Acid

Figure 6- FLD-profiles at λexcem 260360 (top) 275320 (middle) and 330410 nm (bottom) corresponding to the same sample eluted under specified gradient conditions

min10 20 30 40

mAU

50

60

70

80

90

ADC1 B ADC1 CHANNEL B (DRESVER~1MATFORSKBERITDA2111A013-0601D)

min10 20 30 40

mAU

45505560657075


min10 20 30 40

mAU

392

393

394

395

396

397

398


A B C Figure 7- Correlations between scores values and single peaks in the chromatograms

Portada

Visado

Informe

Objeto de la Tesis Doctoral

Doctoral Thesis objective

IacuteNDICE

CAPIacuteTULO I INTRODUCCIOacuteN


Resveratrol en vino

Efectos bioloacutegicos de resveratrol




a) Aparatos

b) Reactivos

c) Disoluciones

d) Disolventes


Bibliografiacutea

CAPIacuteTULO II DETERMINACIOacuteN DE RESVERATROL EN VINO MEDIANTE FLUORESCENCIA FOTOINDUCIDA DE SEGUNDA DERIVADA Y EXTRACCIOacuteN LIacuteQUIDO-LIacuteQUIDO

ANTECEDENTES

RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

Estudio baacutesico sobre las propiedades de intereacutes analiacutetico de trans-resveratrol

Efecto de la irradiacioacuten ultravioleta externa sobre las propiedades absorbentes y fluorescentes de trans-resveratrol


Perspectivas de futuro

CAPIacuteTULO III ANAacuteLISIS DE PICEIDO EN VINOS MEDIANTE FLUORESCENCIA FOTOINDUCIDA APLICANDO SEGUNDA-DERIVADA A LOS ESPECTROS DE EMISIOacuteN

ANTECEDENTES


Estudio baacutesico sobre las propiedades de intereacutes analiacutetico de trans-pieido




CAPIacuteTULO IV DETERMINACIOacuteN DE RESVERATROL Y PICEIDO TOTALES EN VINO SIN TRATAMIENTO PREVIO MEDIANTE DERIVATIZACIOacuteN FOTOQUIacuteMICA OFF LINE-HPLC

ANTECEDENTES


Estudios fluorescentes previos

Estudios cromatograacuteficos previos

Optimizacioacuten quimiomeacutetrica de la composicioacuten de la fase moacutevil para el anaacutelisis de vino

Determinacioacuten de las cantidades totales de resveratrol y piceido en muestras de vino


CAPIacuteTULO V ANAacuteLISIS DE LOS ISOacuteMEROS DE RESVERATROL Y PICEIDO EN VINOS MEDIANTE HPLC ISOCRAacuteTICA CON DETECCIOacuteN FLUORESCENTE PREVIA DERIVATIZACIOacuteN POST-COLUMNA EN LIacuteNEA

ANTECEDENTES


Estudios Fluorescentes Previos


Optimizacioacuten quimiomeacutetrica de las condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis isocraacutetico de trans-resveratrol y trans-piceido en muestras de vino

Foto-Isomeriacutea cis-trans Evidencia de la presencia de cis-isoacutemeros de resveratrol y piceido en vinos

Aplicacioacuten Anaacutelisis de los isoacutemeros de resveratrol y piceido en vino

CAPIacuteTULO VI UTILIZACIOacuteN DE SENtildeALES FLUORESCENTES DE TRES VIacuteAS (MATRICES DE EXCITACIOacuteN-EMISIOacuteN) PARA CARACTERIZACIOacuteN DE VINOS

ANTECEDENTES


Muestras de vino incluidas en el modelo


Construccioacuten del modelo PARAFAC

Anaacutelisis de componentes principales de los valores de PARAFAC-score

Identificacioacuten de los fluoroacuteforos presentes en vino

Utilizacioacuten de las sentildeales de autofluorescencia total del vino en combinacioacuten con herramientas quimiomeacutetricas para asegurar la pertenencia del vino a una DO


CAPIacuteTULO VII ANAacuteLISIS DE RESVERATROL EN VINOS TINTOS MEDIANTE VOLTAMPEROMETRIacuteA DE REDISOLUCIOacuteN ADSORTIVA DE ONDA CUADRADA

ANTECEDENTES


Puesta a punto del procedimiento

Paraacutemetros analiacuteticos de calidad


Seguimiento cromatograacutefico de las etapas de limpieza


CONCLUSIONES

ANEXO ARTIacuteCULOS RESULTANTES DE ESTE TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteN

Anal Bioanal Chem 387 (2007) 1999-2007

Talanta 74 (2008) 675-682

J Sep Sci 30 (2007) 3110-3119

Food Chem 109 (2008) 825-833

J Agric Food Chem Enviado

ltlt ASCII85EncodePages false AllowTransparency false AutoPositionEPSFiles true AutoRotatePages None Binding Left CalGrayProfile (Dot Gain 20) CalRGBProfile (sRGB IEC61966-21) CalCMYKProfile (US Web Coated 050SWOP051 v2) sRGBProfile (sRGB IEC61966-21) CannotEmbedFontPolicy Error CompatibilityLevel 14 CompressObjects Tags CompressPages true ConvertImagesToIndexed true PassThroughJPEGImages true CreateJDFFile false CreateJobTicket false DefaultRenderingIntent Default DetectBlends true DetectCurves 00000 ColorConversionStrategy CMYK DoThumbnails false EmbedAllFonts true EmbedOpenType false ParseICCProfilesInComments true EmbedJobOptions true DSCReportingLevel 0 EmitDSCWarnings false EndPage -1 ImageMemory 1048576 LockDistillerParams false MaxSubsetPct 100 Optimize true OPM 1 ParseDSCComments true ParseDSCCommentsForDocInfo true PreserveCopyPage true PreserveDICMYKValues true PreserveEPSInfo true PreserveFlatness true PreserveHalftoneInfo false PreserveOPIComments true PreserveOverprintSettings true Start SubsetFonts true TransferFunctionInfo Apply UCRandBGInfo Preserve UsePrologue false ColorSettingsFile () AlwaysEmbed [ true ] NeverEmbed [ true ] AntiAliasColorImages false CropColorImages true ColorImageMinResolution 300 ColorImageMinResolutionPolicy OK DownsampleColorImages true ColorImageDownsampleType Bicubic ColorImageResolution 300 ColorImageDepth -1 ColorImageMinDownsampleDepth 1 ColorImageDownsampleThreshold 150000 EncodeColorImages true ColorImageFilter DCTEncode AutoFilterColorImages true ColorImageAutoFilterStrategy JPEG ColorACSImageDict ltlt QFactor 015 HSamples [1 1 1 1] VSamples [1 1 1 1] gtgt ColorImageDict ltlt QFactor 015 HSamples [1 1 1 1] VSamples [1 1 1 1] gtgt JPEG2000ColorACSImageDict ltlt TileWidth 256 TileHeight 256 Quality 30 gtgt JPEG2000ColorImageDict ltlt TileWidth 256 TileHeight 256 Quality 30 gtgt AntiAliasGrayImages false CropGrayImages true GrayImageMinResolution 300 GrayImageMinResolutionPolicy OK DownsampleGrayImages true GrayImageDownsampleType Bicubic GrayImageResolution 300 GrayImageDepth -1 GrayImageMinDownsampleDepth 2 GrayImageDownsampleThreshold 150000 EncodeGrayImages true GrayImageFilter DCTEncode AutoFilterGrayImages true GrayImageAutoFilterStrategy JPEG GrayACSImageDict ltlt QFactor 015 HSamples [1 1 1 1] VSamples [1 1 1 1] gtgt GrayImageDict ltlt QFactor 015 HSamples [1 1 1 1] VSamples [1 1 1 1] gtgt JPEG2000GrayACSImageDict ltlt TileWidth 256 TileHeight 256 Quality 30 gtgt JPEG2000GrayImageDict ltlt TileWidth 256 TileHeight 256 Quality 30 gtgt AntiAliasMonoImages false CropMonoImages true MonoImageMinResolution 1200 MonoImageMinResolutionPolicy OK DownsampleMonoImages true MonoImageDownsampleType Bicubic MonoImageResolution 1200 MonoImageDepth -1 MonoImageDownsampleThreshold 150000 EncodeMonoImages true MonoImageFilter CCITTFaxEncode MonoImageDict ltlt K -1 gtgt AllowPSXObjects false CheckCompliance [ None ] PDFX1aCheck false PDFX3Check false PDFXCompliantPDFOnly false PDFXNoTrimBoxError true PDFXTrimBoxToMediaBoxOffset [ 000000 000000 000000 000000 ] PDFXSetBleedBoxToMediaBox true PDFXBleedBoxToTrimBoxOffset [ 000000 000000 000000 000000 ] PDFXOutputIntentProfile () PDFXOutputConditionIdentifier () PDFXOutputCondition () PDFXRegistryName () PDFXTrapped False Description ltlt CHS ltFEFF4f7f75288fd94e9b8bbe5b9a521b5efa7684002000410064006f006200650020005000440046002065876863900275284e8e9ad88d2891cf76845370524d53705237300260a853ef4ee54f7f75280020004100630072006f0062006100740020548c002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee553ca66f49ad87248672c676562535f00521b5efa768400200050004400460020658768633002gt CHT ltFEFF4f7f752890194e9b8a2d7f6e5efa7acb7684002000410064006f006200650020005000440046002065874ef69069752865bc9ad854c18cea76845370524d5370523786557406300260a853ef4ee54f7f75280020004100630072006f0062006100740020548c002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee553ca66f49ad87248672c4f86958b555f5df25efa7acb76840020005000440046002065874ef63002gt DAN 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SUO 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 SVE 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 ENU (Use these settings to create Adobe PDF documents for journal articles and eBooks for online presentation Created PDF documents can be 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por











de Extremadura

I N F O R M A























CAPIacuteTULO I

INTRODUCCIOacuteN


2


3






HO

OH

OH

4 3

5


4










5












6







7







8








9





10











11







12






OH

HO

HO

OH

HOOH OH

HO

OHOH

O

HHO

H

HO

H

H

HO

H

O

OH

O

H

OHH OH

H

H HO

H

O

OH




13






34


USA (California)



Australia y Europa



43



Francia



Sauvignon

44


Espantildea




39



Suiza 69



14









USA (California)








15










vivordquo como son


16










17





18










19








20






R

OHCC

H

H

C

O

OHC

COOH

CHHO

COOH

OH

OH

OH

HOOC


21





O

O

A C

B1

2

3

45

6

7

8

9

10

1

2

3

4

5

6


22

Flavonoles








O

OH

HO

OH

R

R

OH

O


23







O

4

6

8

OH

HO

OH

R3

OH

R1

R2

O

OH

HO

OH

R

O

O

Ramnosil


24






O

A

B

2

3

45

6

7

8 1

2

3

4

5

6

+


25





O

A

B

2

3

45

6

7

8 1

2

3

4

5

6

+

OH

OH

HO

OH

R

R


26








27








O

4

6

8

OH

HO

OH

R3

OH

R1

R2

n


28












29


CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

30Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os

Anali

to(s

)Si

stem

a cr

omat

ograacute

fico

Col

umna

F

Moacutev

il S

istem

a de D

etec

cioacuten

Paraacute

met

ros a

naliacutet

icos

de ca

lidad

Obse

rvac

ione

s Mu

estra

Tra

tam

iento

Refe

renc

ia

cis y

trans

-re

sver

atrol

ODS2

(35 ordm

C)

Grad

iente

de aacutec

ido ac

eacutetico

6 a

agua

aceto

nitrilo

aceacuteti

co 6

5305

DA

D (2

90 nm

bar

ridos

250 a

600 n

m)

FLD

( exc

em

= 30

0392

nm b

arrid

os

de em

isioacuten

y ex

citac

ioacuten)

MS (A

PCI m

odo f

ull sc

an) c

on el

ucioacuten

iso

craacutetic

a ace

tonitri

loag

ua 3

070

Es

tudio

de lo

s pro

ceso

s de

trans

forma

cioacuten f

otoqu

iacutemica

con l

uz

UV de

difer

ente

y co

n luz

solar

Tr

ansfo

rmac

ioacuten cu

antita

tiva d

e tra

nsen

cis co

n irra

diacioacute

n de 3

60 nm

Ide

ntific

acioacuten

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ro fo

topro

ducto

no

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ro de

resv

eratr

ol de

men

or P

M

83

trans

-resv

eratr

olep

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uina y

ca

tequin

a

C18

Grad

iente

de ac

etonit

rilo

Aacutecido

aceacuteti

co ac

uoso

al 5

991

a ac

etonit

riloaacutec

ido ac

eacutetico

acuo

so al

5

257

5 FL

D ( e

xc e

m=

2803

15nm

10 m

in y

3243

70 nm

en ad

elante

)

Ce

ntrifu

gacioacute

n e in

yecc

ioacuten di

recta

Ide

ntific

acioacuten

de an

alitos

por

co

mpar

acioacuten

de su

s tR y

espe

ctros

UV

en el

pico

con l

os de

patro

nes

20 m

in po

r cro

matog

rama

Au

mento

de la

conc

entra

cioacuten d

e los

tre

s des

de el

mos

to ha

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vino

84

trans

- y ci

s-

resv

eratr

ol y

piceid

o y ot

ros

polife

noles

ODS2

(35 ordm

C)

Grad

iente

de ag

uaac

etonit

riloaacutec

ido

aceacuteti

co

DAD

(280

nm)

FLD

((ex

cem

= 30

0392

nm)

RSDa i

ntra-

diacutea e

inter

-diacutea

(n=6

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e 04

y

4

LODb 0

02 μ

gmiddotmL

-1 pa

ratra

ns- y

cis-

resv

eratr

ol y

trans

-pice

ido

Inyec

cioacuten d

irecta

de la

mue

stra

Cuan

tifica

cioacuten d

e cis

partir

de la

dis

minu

cioacuten d

e tra

ns85

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

31

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

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n)

Anali

to(s

)Si

stem

a cr

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ograacute

fico

Col

umna

F

Moacutev

il S

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Paraacute

met

ros a

naliacutet

icos

de ca

lidad

Obse

rvac

ione

s Mu

estra

Tra

tam

iento

Refe

renc

ia

Comp

uesto

sfen

oacutelico

s aacutec

idos

fenoacuteli

cos

estilb

e-no

s (isoacute

mero

s tra

ns y

cis de

re

sver

atrol

ypic

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flav

o-

noles

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la

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a(a

glico

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C18

Grad

iente

de 10

0 A

a 10

0 B

A

(Aacutecid

o foacuter

mico

05

o

aacutecido

fosfoacute

rico

01

) B

(Aac

etonit

rilo a

gua

5400

595)

07

mLmiddotm

in-1

MS (M

odo f

ull sc

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DAD

(200

-800

nm

) FL

D e

xem 2

8032

0 26

0400

(cis-

resv

e-ra

trol y

cis-p

iceido

) y 30

0390

(tr

ans-r

esve

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l y tr

ans-p

iceido

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D (in

tegra

cioacuten d

e volt

ampe

rogr

ama

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-1 y

1 V)

DA

D y M

S E

xtrac

cioacuten c

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DAD

FLD

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D F

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an

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cto

Conte

nido f

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co to

tal po

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Cioc

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os is

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os de

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eratr

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o pre

senta

n pro

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electr

oquiacutem

icas

86

Polife

noles

an

tocian

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trans

-re

sver

atrol

Fase

inve

rsa y

elucioacute

n gra

diente

DA

D (2

80 y

520 n

m po

lifeno

les y

306 n

m tra

ns-re

sver

atrol)

El

conte

nido e

n tra

ns-re

sver

atrol

depe

nde e

n gra

n med

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la

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del a

ntildeo de

cose

cha

87

Deriv

ados

de re

s-ve

ratro

l res

vera

-tro

l y pi

ceido

isoacute

mero

s

Fase

inve

rsa y

elucioacute

n gra

diente

DA

D (3

10 nm

para

tran

s-isoacute

mero

s y

286 n

m pa

ra ci

s-isoacute

mero

s)

No se

detec

ta nin

guacuten

deriv

ado p

or de

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de 3

ngmiddotm

L-1

Filtra

cioacuten d

e las

mue

stras

e iny

eccioacute

n dire

cta en

el si

stema

cro

matog

raacutefic

oCo

ntenid

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l de p

olifen

oles p

or el

meacute

todo d

e Foli

n-Ci

ocalt

eu

Capa

cidad

antio

xidan

te T

EAC-

test

88

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

32Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

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y otr

as be

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med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

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n)

Anali

to(s

)Si

stem

a cr

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fico

Col

umna

F

Moacutev

il S

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Paraacute

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ros a

naliacutet

icos

de ca

lidad

Obse

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ione

s Mu

estra

Tra

tam

iento

Refe

renc

ia

Comp

uesto

sfen

oacutelico

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tre

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tran

s y ci

s-re

sver

atrol

C18

Grad

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rmico

en ag

ua

pH 3

(A) y

aacutecido

foacuterm

ico en

ac

etonit

rilo p

H 3 (

B) a

02 m

Lmiddotmi

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(200

- 600

nm 3

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m pa

ra

trans

- y ci

s-res

vera

trol

resp

ectiv

amen

te)MS

(ESI

SCA

N m

z 50

-700

mod

o SIM

LOD

(SN

= 3)

1 y 4

ng

middotmL-1

para

tran

s- y c

is-re

sver

atrol

resp

ectiv

amen

te

Vino

s alm

acen

ados

a 4ordm

C en

la

oscu

ridad

Bote

llas a

bierta

s inm

ediat

amen

te an

tes de

l anaacute

lisis

Fil

trado

e iny

eccioacute

n dire

cta de

las

mues

tras

89

trans

-resv

eratr

ol C1

8 (40

ordmC)

Grad

iente

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uam

etano

l 55

a ag

uaac

etonit

rilo 7

3 0

6 mLmiddot

min-1

DAD

(308

y 28

8 nm)

Recta

de C

alibr

ado e

ntre

05 y

16 μ

gmiddotmL

-1Ca

ntida

des e

ncon

trada

s en v

inos

tintos

(035

2-19

9 μgmiddot

mL-1

) may

ores

qu

e en b

lanco

s (5-

570 n

gmiddotmL

-1)

Anaacuteli

sis cu

alitat

ivo de

cis-r

esve

ratro

l

90

trans

-resv

eratr

olFa

se in

versa

colum

nas m

onoliacute

ticas

El

ucioacuten

isoc

raacutetic

a 30

(aacutecid

o aceacute

tico

01

en m

etano

l) ndash 70

(aacute

cido

aceacuteti

co 0

1 en

agua

) 5 m

Lmiddotmi

n-1

FLD

exem

3104

03 nm

DAD

310 n

m

Rang

o line

al 01

1-27

5 μg

middotmL-1

LOD

3 ngmiddot

mL-1

LOQc 4

ngmiddotm

L-1

Uvas

Acop

lamien

to en

tre S

PE co

n sis

temas

de ex

tracc

ioacuten co

n liacutequ

idos

a pre

sioacuten (

PLE)

66

trans

- y ci

s-res

ve-

ratro

lC1

8Gr

adien

te de

aacutecido

aceacuteti

co p

H 24

a aacutec

ido ac

eacutetico

aceto

nitrilo

208

0 15

mL

middotmin-1

DAD

(285

y 30

6 nm

para

cis y

tran

s)

trans

-resv

eratr

ol 03

2 ndash 4

44 y

012 ndash

28

0 μgmiddot

mL-1

en tin

tos y

rosa

dos

resp

ectiv

amen

tecis

-resv

eratr

ol 02

0 ndash 5

84 y

002 ndash

317

μgmiddot

mL-1

en

tintos

y ro

sado

s re

spec

tivam

ente

91

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

33

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)

Anali

to(s

)Si

stem

a cr

omat

ograacute

fico

Col

umna

F

Moacutev

il S

istem

a de D

etec

cioacuten

Paraacute

met

ros a

naliacutet

icos

de ca

lidad

Obse

rvac

ione

s Mu

estra

Tra

tam

iento

Refe

renc

ia

Estilb

enos

-

vinife

rina

trans

-as

tringin

atra

ns-

piceid

ocis

- y

trans

-resv

eratr

ol y

-vini

ferina

C18

Grad

iente

de aacutec

ido ac

eacutetico

en ag

ua

pH 2

4 a aacutec

ido ac

eacutetico

en ag

ua p

H 24

ace

tonitri

lo 20

80 0

5 mL

middotmin-1

UV (2

80 2

86 3

06 y

321 n

m)

LOD

02 μ

gmiddotmL

-1 0

2 μg

middotmL-1

y 03

2 μgmiddot

mL-1

para

trans

-pice

idotr

ans-

ycis-

resv

eratr

olre

spec

tivam

ente

Extra

ccioacuten

con a

cetat

o de e

tilo

limpie

za co

n res

ina in

terca

mbiad

ora

de ca

tione

s y m

edian

te cro

matog

rafiacutea

de pa

rticioacuten

(ce

ntrif

ugal

parti

tion

chro

mat

o-gr

aphy

) y H

PLC

semi

prep

arati

va

92

20 co

mpue

stos

fenoacuteli

cos

entre

ell

ostra

ns-

resv

eratr

ol

XDB-

C8Gr

adien

te de

meta

nol y

aacutecido

aceacuteti

co 1

D

AD (3

06 nm

para

tran

s-res

vera

trol)

CLD

(Ce(

IV) ndash

roda

mina

6G ndash

comp

uesto

fenoacute

lico e

n med

io aacutec

ido

sulfuacute

rico)

trans

-Res

vera

trol

Rang

o line

al 00

3- 15

0 μg

middotmL-1

LOD

(SN

=3) 8

47 y

66

ngmiddotm

L-1 en

DAD

y CL

D

resp

ectiv

amen

te

Inyec

cioacuten d

irecta

de m

uestr

as

filtra

das

Detec

cioacuten C

L alta

mente

sens

ible

(LOD

de 1

a 2 oacuter

dene

s de m

agnit

ud

meno

res q

ue lo

s liacutem

ites e

n DAD

)

93

Isoacuteme

ros c

is y

trans

de

resv

eratr

ol y

piceid

o

C18 m

onoliacute

tica (

Chro

moli

thPe

rform

ance

RP-

18e)

Grad

iente

de ag

uaaacutec

ido ac

eacutetico

946

a a

guaa

ceton

itrilo

aacutecido

aceacuteti

co

6530

5 7

mLmiddotm

in-1

DAD

(285

y 30

6 nm

para

cis-

y tra

ns-

resv

eratr

ol re

spec

tivam

ente)

LOD

32 y

34 ng

middotmL-1

y LO

Q 01

0 y 0

11 μ

gmiddotmL

-1

para

tran-

y cis

-re

sver

atrol

resp

ectiv

amen

te

El em

pleo d

e una

colum

na

mono

liacutetica

impli

ca ba

jas pr

esion

es y

corto

s tiem

pos d

e anaacute

lisis

94

trans

- y ci

s- re

sve-

ratro

l y pi

ceido

Fa

se in

versa

Estud

ia la

influe

ncia

de la

varie

dad

del la

leva

dura

en la

conc

entra

cioacuten

de lo

s cua

tro co

mpue

stos e

n vino

95

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

34Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

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adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Aacutecido

s hidr

oxibe

n-zo

icos

aacutecido

s hid

roxic

inaacutemi

cos y

de

rivad

os e

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-no

s (isoacute

mero

sde

resv

eratr

ol y

piceid

o) a

lcoho

les

fenoacuteli

cos y

com

-pu

estos

relac

io-na

dos

flava

noles

y f

lavon

oles

Se si

gue e

l patr

oacuten de

evolu

cioacuten d

e es

tos co

mpue

stos e

n el v

ino du

rante

el

enve

jecim

iento

en bo

tella

96

trans

-resv

eratr

ol y

trans

-pice

ido97

cis- y

tran

s- re

sve-

ratro

l y pi

ceido

Hype

rsil C

18Gr

adien

te lin

eal a

ceton

itrilo-

agua

DA

D (2

88 y

306 n

m pa

ra ci

s- y t

rans

-isoacute

mero

s

SP

E 98

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

35

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

trans

-resv

eratr

olC8 El

ucioacuten

isoc

raacutetic

a con

meth

anol

agua

35

65 1

mLmiddot

min-1

DAD

(306

nm)

CLD

(Elua

to +

lumino

l + K

3Fe(

CN) 6)

Linea

lidad

007

5-10

μg

middotmL-1

y 05

-750

ngmiddotm

L-1 en

DAD

y CL

D

resp

ectiv

amen

teLO

D(S

N=3)

25 y

0166

ng

middotmL-1

en D

AD y

CLD

re

spec

tivam

ente

Inyec

cioacuten d

irecta

de m

uestr

as

filtra

das

Conti

ene u

na re

visioacuten

impo

rtante

de

meacutetod

os en

tre 19

96 y

2002

En

cuen

tra en

tre 0

y 160

7 μgmiddot

mL-1

en vi

nos t

intos

chino

s

99

cis- y

tran

s-res

ve-

ratro

lC1

8El

ucioacuten

isoc

raacutetic

a con

25

ac

etonit

rilo 0

1

de H

3PO 4

y Na

Cl (5

mm

olmiddotL-1

) 1 m

Lmiddotmi

n-1

DAD

(306

nm pa

ra am

bos i

soacuteme

ros)

ECD

(elec

trodo

de ca

rboacuten

vitrif

icado

a+0

75 V

)

Linea

lidad

001

-10

μgmiddotm

L-1tra

ns-re

sver

atrol

LOD

(SN

=3) m

enor

es de

30

y 10

0 ngmiddot

mL-1

(306

nm

) y 3

y 15 n

gmiddotmL

-1

(075

V) p

ara t

rans

- y ci

s-re

sver

atrol

resp

ectiv

amen

te

Vino

Filtr

ado e

inye

ccioacuten

dire

cta

Uvas

y ho

jas M

acer

acioacuten

con e

tanol

al 80

Equil

ibrio

entre

los d

os is

oacutemer

os tr

as

5 hor

as de

expo

sicioacuten

a la

luz de

l diacutea

Equ

ilibrio

no in

fluen

ciado

por la

tem

pera

tura

100

Resv

eratr

ol tot

alDA

D (2

87 y

307 n

m pa

ra ci

s- y t

rans

-isoacute

mero

s)

Hidr

oacutelisis

enzim

aacutetica

(-g

lucos

idasa

)de

resv

eratr

ol-glu

coacutesid

osSP

E10

1

cis- y

tran

s- re

sve-

ratro

l y pi

ceido

Fa

se in

versa

DA

D

Se en

cuen

tra de

l 82 a

l 91

de

resv

eratr

ol co

mo gl

ucoacutes

ido en

estos

vin

os es

pantildeo

les de

uvas

Mon

astre

ll10

2

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

36Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Scre

ening

de

polife

noles

entr

e ell

ostra

ns-

resv

eratr

ol

Fase

inve

rsaDA

D - M

SMS

Piele

s y pe

pitas

de uv

as bl

anca

s y

tintas

Se en

cuen

tran h

asta

13 an

tocian

os

11 aacutec

idos h

idrox

ibenz

oicos

e hid

roxic

inaacutemi

cos y

13 ca

tequin

as y

flava

noles

asiacute

como

2 es

tilben

os en

pie

les y

pepit

as

103

Aacutecido

s org

aacutenico

s y

polife

noles

((-)-

epi-

cateq

uina

quer

cetin

a y

resv

eratr

ol)

Fase

inve

rsa (e

n sil

ica m

odific

ada

con

grup

os fe

nilo)

Grad

iente

de aacutec

ido tr

ifluoa

ceacutetic

o al 0

2

en ag

ua y

aceto

nitrilo

15

mLmiddotm

in-1

DAD

a 210

y 28

0 nm

Linea

lidad

resv

eratr

ol 00

25-0

4 mg

middotmL-1

104

Flavo

noles

an

tocian

inas

aacutecido

s fen

oacutelico

s y

trans

-resv

eratr

ol

C18

Grad

iente

de aacutec

ido ac

eacutetico

al 5

en

ag

ua y

aceto

nitrilo

1 m

Lmiddotmi

n-1

DAD

(313

nm pa

ra tr

ans-r

esve

ratro

l y

aacutecido

s fen

oacutelico

s)

105

cis- y

tran

s- re

sve-

ratro

l y pi

ceido

Es

tudian

el ef

ecto

de di

stinto

s meacute

todos

de m

acer

acioacuten

sobr

e la

conc

entra

cioacuten d

e esto

s cua

tro

estilb

enos

106

Polife

noles

ECD

(dete

ccioacuten

coulo

meacutetric

a mu

ltielec

trodo

) 10

7

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

37

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Resv

eratr

olpic

eido y

fla

vono

ides

Vino

s exp

erim

ental

es de

uvas

so

metid

as a

difer

entes

trata

mien

tos

con p

estic

idas

Conte

nido f

enoacuteli

co to

tal po

r el

meacutetod

o de F

olin-

Cioc

alteu

108

27 co

mpue

stos

fenoacuteli

cos

inclu-

yend

o der

ivado

s de

los aacute

cidos

ben-

zoico

y cin

aacutemico

fla

vona

s y n

uevo

s glu

coacutesid

os

relac

ionad

os

Detec

cioacuten e

lectro

quiacutem

ica m

ultica

nal

con d

etecto

r cou

lomeacutetr

ico

Cerve

za

109

cis- y

tran

s- re

sve-

ratro

l y pi

ceido

C1

8El

ucioacuten

isoc

raacutetic

a etan

olaacutec

ido ac

eacutetico

al

005

237

7 1 m

Lmiddotmi

n-1

DAD

a 306

nm

Linea

lidad

para

los c

uatro

isoacute

mero

s 02-

50 μ

gmiddotmL

-1

LOD

081

120

040 y

04

6 ng p

ara c

is- y

trans

-re

sver

atrol

y cis-

y tra

ns-

piceid

o re

spec

tivam

ente

Hidr

oacutelisis

con

-gluc

osida

sa pa

ra

liber

acioacuten

de ag

licon

as

conte

nidos

de ci

s- y t

rans

- res

ve-

ratro

l ante

s y de

spueacute

s de l

a hidr

oacutelisis

Resv

eratr

ol tot

al 08

4-73

3 y 0

12-6

μg

middotmL-1

en vi

nos t

intos

y zu

mos

resp

ectiv

amen

te

110

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

38Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Comp

uesto

sar

omaacuteti

cos

entre

ell

ostra

ns-

resv

eratr

ol

NMR

NMR

MS

Vino

pre

para

cioacuten d

e extr

acto

fenoacuteli

co co

n ace

tato d

e etilo

Ce

rveza

deg

asific

acioacuten

y co

ncen

tracioacute

n a 2

3 del

volum

en

inicia

l Zu

mo de

uva

diluc

ioacuten co

n agu

a

111

Antoc

ianina

syes

tilben

os (c

is- y

trans

- res

vera

trol y

pic

eido)

Fase

inve

rsaAn

tocian

os D

AD (5

20 nm

) Es

tilben

os F

LD (

exem

3303

74 nm

) 11

2

32 P

olifen

oles d

e ba

jo pe

so

molec

ular

entre

ell

oscis

- y tr

ans-

resv

eratr

ol y

piceid

o

C18

Grad

iente

de ag

ua y

aceto

nitrilo

co

ntenie

ndo a

mbos

1 de

aacutecido

ac

eacutetico

06

mLmiddotm

in-1

PDAD

API

-MS

113

Estilb

enos

(resv

eratr

ol)Inf

luenc

ia de

difer

entes

teacutecn

icas d

e ma

cera

cioacuten e

n el c

onten

ido en

es

tilben

os11

4

Estilb

enos

(res

ve-

ratro

l pice

ido

picea

tanno

l)

DAD-

MSM

SInd

uccioacute

n de e

stilbe

nos m

edian

te irr

adiac

ioacuten U

V po

st-co

sech

a 11

5

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

39

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Flava

noles

an

tocian

inas

y 6

deriv

ados

de

resv

eratr

oltra

ns-

astrin

gina

trans

- y

cis-p

iceido

tran

s-yc

is-re

sver

atrol

y pa

llidol

(diacutem

ero d

e re

sver

atrol)

C18

Grad

iente

de 1

aacutec

ido tr

ifluor

oaceacute

tico

a ace

tonitri

lo1

aacutecid

o trifl

uoro

aceacuteti

-co

802

0 1 m

Lmiddotmi

n-1

DAD

(290

nm)

FLD

( exe

m 290

390

2903

90 2

6040

0 30

0390

260

400 y

2604

00 nm

para

tra

ns-a

string

inatr

ans-p

iceido

cis-

piceid

otra

ns-re

sver

atrol

cis-

resv

eratr

ol y p

allido

l

Linea

lidad

05-

10 0

1-10

1-

10 0

5-10

1-1

0 y 0

5-10

μgmiddot

mL-1

y LO

D (F

LD) 0

01 0

01

003

001

002

y 00

2 μg

middotmL-1

par

a tra

ns-

astrin

gina

trans

-pice

ido

cis-p

iceido

tran

s-re

sver

atrol

cis-

resv

eratr

ol y p

allido

l

Filtra

do e

inyec

cioacuten d

irecta

de la

s mu

estra

sSe

apor

tan po

r prim

era v

ez da

tos

sobr

e con

tenido

de pa

llidol

en vi

nos

tintos

y no

se en

cuen

tra en

vino

s bla

ncos

Conte

nidos

de lo

s isoacute

mero

s de

resv

eratr

ol maacute

s elev

ados

en vi

nos

tintos

116

trans

-resv

eratr

olC1

8Gr

adien

te de

meta

nol

aacutecido

aceacuteti

co

agua

102

88 a

metan

olaacutec

ido ac

eacutetico

ag

ua 90

28

1 mLmiddot

min-1

DAD

(280

nm)

FLD

exem

3603

74 nm

LOD

en m

uestr

as re

ales

20 y

3 ngmiddot

mL-1

en D

AD y

FLD

resp

ectiv

amen

te

SPE-

C18

Nive

l med

io en

contr

ado e

n vino

s tin

tos em

botel

lados

289

μgmiddot

mL-1

117

cis- y

tran

s-re

sver

atrol

y pic

eido

ODS

Hype

rsil

Eluc

ioacuten is

ocraacute

tica

aceto

nitrilo

aacutecido

foacuter

mico

acuo

so 0

5 1

mLmiddot

min-1

25

75DA

D (3

07 nm

)

Vi

nos

uvas

cac

ahue

tes m

antec

a de

caca

huete

y teacute

Uvas

cac

ahue

tes y

teacute co

ntien

en

funda

menta

lmen

tetra

ns-p

iceido

Vi

nos t

intos

son f

uente

de ag

licon

as

29

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

40Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Oligoacute

mero

s de e

s-tilb

enos

(vini

ferina

y p

allido

l) y

estilb

ina

DAD

Pr

imer

infor

me so

bre c

onten

idos d

e vin

iferin

a y pa

llidol

en di

feren

tes

tipos

de vi

no

118

Resv

eratr

ol tot

al Hy

persi

l ODS

Gr

adien

te de

meta

nol c

on aacutec

ido foacute

r-mi

co al

05

en ag

ua0

25 m

Lmiddotmi

n-1

APCI

-MS

(SIM

mz

229)

Linea

lidad

en el

rang

o 05

2-22

60 pm

ol de

tran

s-re

sver

atrol

Vino

jugo

de uv

a y ju

go de

ar

aacutenda

nos

Hidr

oacutelisis

de vi

no co

n -D

-glu

cosid

asa

extra

ccioacuten

con a

cetat

o de

etilo

eva

pora

cioacuten y

redis

olucioacute

n co

n meta

nol

agua

119

Polife

noles

inc

luyen

do es

tilbe-

nos c

omo t

rans

- y

cis-re

sver

atrol

Colum

na m

onoliacute

tica C

18

Grad

iente

de m

etano

lagu

a 25

975

a 50

50 p

H 3 c

on H

3PO 4

21

mLmiddotm

in-1

DAD

(256

324

y 36

5 nm)

LOD

(SN

=3) 1

0 y 30

ng

middotmL-1

par

a tra

ns- y

cis-

resv

eratr

olre

spec

tivam

ente

Filtra

cioacuten e

inye

ccioacuten

dire

cta de

la

mues

tra12

0

Resv

eratr

ol y

piceid

o

La

conc

entra

cioacuten d

e pice

ido y

resv

eratr

ol en

el vi

no y

zumo

de uv

a de

pend

e del

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o de e

xtrac

cioacuten d

e la

piel L

os ni

veles

may

ores

se

encu

entra

n en v

inos t

intos

por e

star

maacutes t

iempo

en co

ntacto

con l

a piel

du

rante

la fe

rmen

tacioacuten

79

trans

- y ci

s-re

sver

atrol

y

Mo

sto V

ariab

ilidad

en el

conte

nido

de re

sver

atrol

seguacute

n el p

roce

so de

12

1

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

41

piceid

o fer

menta

cioacuten

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

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adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Resv

eratr

olCo

mbina

cioacuten d

e NP-

HPLC

y RP

-HPL

C

Efec

to de

las c

ondic

iones

me

teoro

loacutegica

s y de

mad

urac

ioacuten en

la

conc

entra

cioacuten d

e res

vera

trol e

n vin

os tin

tos

122

trans

-resv

eratr

ol y

otros

polife

noles

C1

8Gr

adien

te de

meta

nol

aacutecido

aceacuteti

co

agua

102

88 a

902

8 1 m

Lmiddotmi

n-1

DAD

280 n

m

Linea

lidad

trans

-re

sver

atrol

002-

40

μgmiddotm

L-1

Prep

arac

ioacuten de

mue

stra

mejor

es

resu

ltado

s extr

ayen

do co

n eacuteter

etiacute

lico a

pH 2

Valor

es m

edios

de 2

26 3

10 y

380

μgmiddotm

L-1de

trans

-resv

eratr

ol en

vin

os de

Gra

n Can

aria

Lanz

arote

y Te

nerife

res

pecti

vame

nte

123

trans

-resv

eratr

olOD

S-Hy

persy

lGr

adien

te de

aacutecido

percl

oacuterico

(06

mLmiddotL

-1) e

n agu

a y ac

etonit

rilo 1

mL

middotmin-1

DAD

a 310

nm

Linea

lidad

072

-18

μgmiddotm

L-1

LOD

2 ngmiddot

mL-1

SPE-

C18

lavad

o a pH

8 e

lucioacuten

de

trans

-resv

eratr

ol co

n ace

tato d

e etilo

ev

apor

acioacuten

y re

cons

titucioacute

n en

metan

olNi

veles

entre

055

y 25

34 μ

gmiddotmL

-1

124

Polife

noles

entr

e ell

ostr

ans-

y cis-

resv

eratr

ol y

piceid

o

RP-1

8Gr

adien

te de

aacutecido

aceacuteti

co al

1 y 6

en ag

ua y

aacutecido

aceacuteti

co a

gua

ac

etonit

rilo 5

6530

05

mLmiddotm

in-1

DAD

280

y 313

nm

Un

pool

de 14

polife

noles

y 25

vino

s se

some

ten a

un te

st en

fluido

s gaacute

strico

s e in

testin

ales

Se de

termi

-na

la co

ncen

tracioacute

n de p

olifen

oles

antes

y de

spueacute

s del

tratam

iento

125

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

42Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Flavo

noide

s y

estilb

enos

(tra

ns- y

cis

-resv

eratr

ol)

Fase

inve

rsaES

I-MS

MSDA

D (3

20 y

377 n

m pa

ra es

tilben

os y

flavo

noide

s re

spec

tivam

ente)

FL

D

Linea

lidad

50 ng

middotmL-1

ndash50

μgmiddot

mL-1

Detec

cioacuten f

luore

scen

te alt

amen

te se

nsibl

e par

a res

vera

trol

126

Aacutecido

gaacutelic

o tra

ns-re

sver

atrol

quer

cetin

a y ru

tina

ODS

Hype

rsyl

Grad

iente

entre

aacutecido

aceacuteti

co m

etano

l y a

gua

DAD

(306

nm pa

ra tr

ans-r

esve

ratro

l)

01 a

15 μ

gmiddotmL

-1Fil

trado

e iny

eccioacute

n dire

cta de

la

mues

tra12

7

trans

- y ci

s-re

sver

atrol

y pic

eido

C18

grad

iente

de ag

ua a

pH 2

5 con

aacutecido

su

lfuacuteric

o y ac

etonit

rilo 0

2 mL

middotmin-1

DAD

(280

y 30

5 nm

para

cis y

tran

sre

spec

tivam

ente)

SIM

a mz

228

LOD

1202

094

8 25

58

y 083

4 μgmiddot

mL-1

para

trans

- y ci

s-res

vera

trol e

n MS

y DA

D 12

8

Cateq

uina

aacutecido

va

niacutellic

o aacutec

ido

siriacuteng

ico

epica

tequin

a y

trans

-resv

eratr

ol

C18

Grad

iente

de m

etano

l aacutec

ido ac

eacutetico

ag

ua 1

0288

a 90

28

1 mLmiddot

min-1

DAD

280 n

m FL

D

LOD

20 y

3 ngmiddot

mL-1

enDA

D y F

LD

resp

ectiv

amen

te

Extra

ccioacuten

con eacute

ter et

iacutelico a

pH 2

129

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

43

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

trans

-resv

eratr

ol C1

8 El

ucioacuten

isoc

raacutetic

a agu

aace

tonitri

lo 75

25 D

AD a

306 n

m

Co

mpar

acioacuten

RP-

HPLC

-MS

y CE

-MS

Nive

les en

tre 0

82 y

575 μ

gmiddotmL

-113

0

Polife

noles

Extra

ctos e

teacutereo

s Ma

yor e

ficac

ia de

la se

para

cioacuten e

n CE

per

o may

or po

der d

e eluc

idacioacute

n es

tructu

ral e

n LC

22 co

mpue

stos

identi

ficad

os m

edian

te LC

-MC

y solo

13

med

iante

CE-M

S

131

Comp

uesto

sfen

oacutelico

s con

pr

opied

ades

antio

xidan

tes

entre

ellos

tran

s-re

sver

atrol

C18 (

40 ordmC

) Gr

adien

te de

agua

aceto

nitrilo

955

a 50

50 a

pH 1

8 de

955

a 554

5 DA

D (2

80 3

50 y

520 n

m)

Vi

no y

Uva

Inyec

cioacuten d

irecta

de

vinos

y ex

tracto

s de u

va

Dado

el ba

jo pH

de la

fase

moacutev

il los

an

tocian

os so

n dete

ctado

s en f

orma

de

catioacute

n flav

ilium

y ello

no re

fleja

su si

tuacioacute

n en l

a mue

stra r

eal

132

Resv

eratr

ol FL

D ex

cem 2

7037

2 nm

Tr

ansfo

rmac

ioacuten de

resv

eratr

ol en

un

comp

uesto

altam

ente

fluor

esce

nte

con i

rradia

cioacuten u

ltravio

leta i

ntens

a co

n luz

En vi

no g

ener

acioacuten

de un

com-

pues

to sim

ilar p

rove

niente

de pi

cei-

do a

siacute co

mo un

o des

cono

cido

F-3

133

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

44Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

trans

- y ci

s-re

sver

atrol

cateq

uina

epica

tequin

aqu

erce

tina y

rutin

a

ODS-

2Gr

adien

te de

aceto

nitrilo

aacutecido

aceacuteti

co

al 5

de 9

91 a

7030

DA

D (2

80 3

00 y

360 n

m)FL

D ( e

xcem

2803

15 pa

ra ca

tequin

a y

epica

tequin

a 32

4370

para

tran

s-re

sver

atrol

y 260

370 p

ara c

is-re

sver

atrol)

300 n

m LO

D 00

6 y 0

21

gmiddotmL

-1 pa

ra tr

ans-

y cis

-re

sver

atrol

FLD

Ran

go de

linea

lidad

de

001

ndash 1 y

001

ndash 01

gmiddot

mL-1

y LO

D de

3 y 1

ngmiddotm

L-1 p

ara t

rans

- y ci

s-re

sver

atrol

Obten

cioacuten d

e cis-

resv

eratr

ol po

r irr

adiac

ioacuten a

254 n

m du

rante

20 m

in de

trans

-resv

eratr

ol Iny

eccioacute

n dire

cta de

las m

uestr

as

Cateq

uina y

epica

tequin

a pre

sente

s en

todo

s los

vino

s ana

lizad

os

nivele

s de l

a prim

era

cons

idera

bleme

nte su

perio

res

Altos

nive

les de

quer

cetin

a en

much

as m

uestr

as r

utina

se de

tecta

soacutelo

en m

osto

Nive

les de

resv

eratr

ol me

nore

s que

los

del re

sto de

polife

noles

pre

do-

mina

ndo s

iempr

e su f

orma

tran

s

134

Estilb

enoid

es(tr

ans-p

iceido

tra

ns-re

sver

atrol

trans

-astr

ingina

cis

-pice

idoc

is-re

sver

atrol)

C18 (

30 ordmC

) Gr

adien

te de

100

A (aacute

cido a

ceacutetic

o en

agua

a pH

240

) has

ta 10

0 B

(A

meta

nol 2

080)

DA

D 28

6 nm

LOD

(25

L) 8

8 5

5 y

8 ng

para

tran

s-as

tringin

acis

-resv

eratr

ol

trans

-resv

eratr

oltra

ns-

piceid

o y ci

s-pice

ido

resp

ectiv

amen

te

Extra

ccioacuten

con a

cetat

o de e

tilo

evap

orac

ioacuten a

sequ

edad

y re

disolu

cioacuten e

n meta

nol-a

gua

Limpie

za en

resin

a inte

rcamb

iador

a de

catio

nes

135

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

45

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

trans

- y ci

s-re

sver

atrol

y pic

eido

C18 (

40 ordmC

) Gr

adien

te de

aacutecido

aceacuteti

co en

agua

y ac

etonit

rilo

Mu

estra

s de j

ugo d

e uva

blan

ca y

tinta

Inye

ccioacuten

dire

cta de

la m

uestr

a sin

trata

rOb

tencioacute

n de c

is- is

oacutemer

os po

r ex

posic

ioacuten de

los t

rans

- a la

luz

solar

90

de co

nver

sioacuten e

n 10 m

in y c

uanti

ficac

ioacuten de

cis-i

soacuteme

ros

Nive

les en

jugo

s de u

va tin

ta 10

ve-

ces s

uper

iores

a los

de uv

a blan

ca

Canti

dade

s de r

esve

ratro

l com

o glu

coacutesid

o sup

erior

es a

las de

ag

licon

a

136

trans

-resv

eratr

ol C1

8 (40

ordmC)

Grad

iente

linea

l de aacute

cido f

oacutermi

co 50

mM

meta

nol 8

020

a aacutecid

o foacuter

mico

50

mMm

etano

l 208

0 FL

D ( e

xcem

3303

74 nm

)

Pi

eles d

e uva

jugo

de uv

a y vi

no

Vino

SPE

-C18

Co

ncen

tracio

nes d

e tra

ns-re

sver

atrol

en vi

nos j

apon

eses

blan

cos

(Cha

rdon

nay)

y tint

os (C

aber

net

Sauv

ignon

) baja

s de

l ord

en de

las

enco

ntrad

as en

vino

s de l

as m

ismas

va

rieda

des

de C

alifor

nia S

uiza

Fran

cia y

Nuev

a Yor

k

137

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

46Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Dive

rsas

fitoale

xinas

de la

vid

C18

Eluc

ioacuten en

grad

iente

con a

ceton

itrilo

y ag

ua d

esde

el 10

al 85

de

ac

etonit

rilo

FLD

a ex

cem 3

3037

4 nm

para

tran

s-re

sver

atrol

trans

-pter

ostilb

eno y

tran

s--vi

nifer

ina

DAD

a 285

nm pa

ra ci

s-res

vera

trol

Cu

antifi

cacioacute

n de t

rans

-pice

ido a

traveacute

s de l

a rec

ta de

calib

rado

de

trans

-resv

eratr

ol ya

que a

mbos

co

mpue

stos p

rese

ntan s

emeja

ntes

prop

iedad

es flu

ores

cente

s Cu

antifi

cacioacute

n de c

is-pic

eido

utiliz

ando

la re

cta de

calib

rado

de

cis-re

sver

atrol

a 285

nm

138

trans

- y ci

s-re

sver

atrol

y pic

eido

cateq

uina

epica

tequin

aqu

erce

tina y

ru

tina

ODS

Hipe

rsil

Eluc

ioacuten en

grad

iente

entre

aceacuteti

co

metan

ol y a

gua

desd

e 515

80 ha

sta

5455

0DA

D 26

5 28

0 30

6 31

7 y 36

9 nm

LOD

oscil

ando

entre

30

ngmiddotm

L-1 pa

ra tr

ans-

resv

eratr

ol y 1

5 gmiddot

mL-1

para

cateq

uina (

48 7

5 y

135 n

gmiddotmL

-1pa

ratra

ns-

piceid

ocis

-pice

ido y

cis-

resv

eratr

olre

spec

tivam

ente)

40 m

inutos

por c

roma

togra

ma

Recu

pera

cione

s en t

orno

al 10

0

para

todo

s los

anali

tos en

vino

s bla

nco

tinto

y ros

ado

Nive

les es

tables

una v

ez ab

ierta

la bo

tella

dura

nte un

a sem

ana

pero

peacute

rdida

s que

oscil

an en

tre el

10 y

el 40

a

las se

is se

mana

s

139

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

47

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

trans

- y ci

s-re

sver

atrol

como

ag

licon

a y

glucoacute

sido

C18

Grad

iente

entre

aacutecido

aceacuteti

co en

agua

(p

H 24

0)ac

etonit

rilo

Ob

tencioacute

n de c

is-isoacute

mero

s por

ex

posic

ioacuten a

la luz

del s

ol de

los

trans

Cua

ntific

acioacuten

de lo

s isoacute

mero

s de

pice

ido as

umien

do id

eacutentic

os

que p

ara t

rans

- y ci

s-re

sver

atrol

a 30

6 y 28

5 nm

resp

ectiv

amen

teAn

aacutelisis

de vi

nos t

intos

y ro

sado

s sin

tratam

iento

prev

io C

once

ntrac

ioacuten

por e

vapo

racioacute

n de v

inos b

lanco

s pa

ra la

cuan

tifica

cioacuten d

e los

cis-

isoacuteme

ros

140

Isoacuteme

ros d

e re

sver

atrol

ODS

Hipe

rsil (4

0ordm C

)Gr

adien

te de

agua

meta

nol 1

000

a 01

00 en

15 m

inutos

DA

D (3

06 y

286 n

m m

aacutexim

os de

ab

sorci

oacuten de

tran

s- y

cis-re

sver

atrol

re

spec

tivam

ente)

LOD

(SN

= 3)

de 0

6 mo

lmiddotL-1

para

ambo

s an

alitos

a 28

6 nm

Se co

mpru

eba l

a tra

nsfor

macioacute

n de

trans

en ci

s-res

vera

trol p

or

irrad

iacioacuten

con l

uz U

V a 2

54 nm

Se ap

ortan

valor

es de

288

nm y

308

nm de

cis y

tran

sIso

meriz

acioacuten

de ci

s a la

form

a tra

ns- m

aacutes es

table

en m

edio

aacutecido

141

Isoacuteme

ros d

e re

sver

atrol

y pic

eido

Al ig

ual q

ue ot

ros p

olifen

oles

son

buen

os m

arca

dore

s quim

iotax

a-noacute

mico

s del

vino

perm

itiend

o la

distin

cioacuten e

ntre v

aried

ades

de vi

no

blanc

o de d

ifere

ntes D

Oy

bode

gas

142

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

48Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

trans

-resv

eratr

ol C1

8 El

ucioacuten

isoc

raacutetic

a con

ag

uaac

eacutetico

aceto

nitrilo

755

20

DAD

(306

nm)

Se

conc

luye q

ue el

seca

do de

las

uvas

no es

una p

raacutecti

ca qu

e ind

uzca

la

siacutentes

is de

resv

eratr

olNi

veles

en vi

nos d

e uva

s sec

as

(Rec

ioto y

Ama

rone

) entr

e 005

y 08

mg

middotL-1

25

Resv

eratr

ol C1

8 El

ucioacuten

isoc

raacutetic

a con

agua

aceto

nitrilo

55

45

DAD

(307

nm tr

ans-r

esve

ratro

l) 28

0 nm

cis-

resv

eratr

ol)

Se

estud

ia la

influe

ncia

del p

roce

so

de vi

nifica

cioacuten y

el ni

vel d

e po

dred

umbr

e por

Bot

ritis

en la

uva

sobr

e el c

onten

ido en

resv

eratr

ol Vi

nos m

acer

ados

pres

entan

ca

ntida

des1

0 sup

erior

es

143

Isoacuteme

ros d

e re

sver

atrol

y pic

eido

C18 (

40 ordmC

) Gr

adien

te de

aacutecido

aceacuteti

co en

agua

(p

H 24

0) y

aceto

nitrilo

DAD

(306

nm tr

ans

y 285

nm c

is)

LOD

y LOQ

par

a tra

ns-

resv

eratr

ol 3 y

10 ng

middotmL-1

Obten

cioacuten d

e cis

isoacuteme

ros p

or

expo

sicioacuten

de lo

s tra

ns a

la luz

solar

Pr

oduc

cioacuten d

e esti

lbeno

ides e

n uva

pa

rece

depe

nder

de la

varie

dad

posib

le co

ntrol

geneacute

tico d

e su

biosiacuten

tesis

Elev

ados

valor

es de

la re

lacioacuten

tra

nsci

s qu

e apo

yan a

l tran

s com

o uacuten

ico is

oacutemer

o natu

ral n

atura

lmen

te es

el o

riginaacute

ndos

e el c

ispo

rex

posic

ioacuten a

la luz

del m

osto

o vino

39

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

49

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Resv

eratr

ol

C18

Eluc

ioacuten en

grad

iente

desd

e ac

eacutetico

agua

199

a ac

eacutetico

agua

694

y a

ceacutetic

oagu

aace

tonitri

lo 56

530

DAD

(306

y 26

2 nm)

FL

D ( e

xcem

2703

72 nm

)

Es

tudian

los e

fectos

de la

irrad

iacioacuten

de

resv

eratr

ol y s

us de

rivad

os en

pie

les de

uva

En pr

imer

luga

r se p

rodu

ce la

iso

meriz

acioacuten

de tr

ans a

cis

gene

raacutend

ose a

conti

nuac

ioacuten

deriv

ados

altam

ente

fluor

esce

ntes

144

Isoacuteme

ros d

e re

sver

atrol

y pic

eido

Lichr

osph

ere 1

00 C

N

Eluc

ioacuten is

ocraacute

tica c

on

agua

acton

itrilo

metan

ol 9

055

UVD

(306

nm)

LOD

011 y

016

molmiddot

L-1

para

trans

-resv

eratr

ol y

piceid

o re

spec

tivam

ente

02

0 y 0

30 m

olmiddotL-1

para

cis

-resv

eratr

ol y p

iceido

re

spec

tivam

ente

Gene

racioacute

n de c

is-re

sver

atrol

por

irrad

iacioacuten

de tr

ans-r

esve

ratro

l a 25

4 nm

dura

nte 5-

10 m

inutos

Cu

antifi

cacioacute

n de c

is-re

sver

atrol

basa

da en

la ca

iacuteda de

l tran

sTr

ansfo

rmac

ioacuten de

cis e

n tra

ns-

resv

eratr

ol a 7

0 ordmC

dura

nte 30

mi

nutos

Identi

ficac

ioacuten de

gluc

osido

s me

diante

hidr

oacutelisis

enzim

aacutetica

con

-glu

cosid

asa

145

Resv

eratr

ol y

piceid

oC1

8Gr

adien

te de

aacutecido

aceacuteti

coag

ua 1

99

a aacutecid

o aceacute

ticoa

gua 6

94 y

aacutecid

o ac

eacutetico

agua

aceto

nitrilo

565

30

DAD

(entr

e 230

y 45

0 nm

)

Iny

eccioacute

n dire

cta de

la m

uestr

a sin

tratam

iento

prev

io38

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

50Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

trans

-resv

eratr

ol y

trans

-pter

ostilb

eno

C18

Grad

iente

de m

etano

laacutecid

o foacuter

mico

DA

D (3

056

y 306

4 nm

para

re

sver

atrol

y pter

ostilb

eno)

FL

D ( e

xcem

3303

74 nm

para

ambo

s)

No

es ne

cesa

rio tr

atami

ento

prev

io de

la m

uestr

a de v

ino g

racia

s a la

es

pecif

icida

d de l

a FLD

14

6

Pice

ido

Desc

riben

el pr

imer

proc

edim

iento

de ex

tracc

ioacuten de

pice

ido de

P

Cusp

idatu

m37

trans

-resv

eratr

ol C1

8 El

ucioacuten

con

A (aacute

cido f

osfoacuter

ico 0

2 M a

pH 1

5 por

adici

oacuten de

amon

iaco)

y B

(Aac

etonit

rilo 20

80)

al 23

5

B

DAD

a 306

316

280

y 25

0 nm

trans

-resv

eratr

ol sin

tetiza

doVi

no p

reco

ncen

tracioacute

n en e

l ro

tavap

or li

mpiez

a con

clor

oform

o ex

tracc

ioacuten co

n ace

tato d

e etilo

lav

ado c

on ag

ua sa

turad

a en c

lorur

o soacute

dico

La fa

se or

gaacutenic

a es

evap

orad

a a se

qued

ad y

se

redis

uelve

en ag

uaac

etonit

rilo 1

1

42

Resv

eratr

ol Co

lumna

de siacute

lice L

ichro

sorb

El

ucioacuten

isoc

raacutetic

a con

meta

nolc

lorur

o de

meti

leno 3

97

Vi

no E

xtrac

cioacuten c

on ac

etato

de et

ilo

se re

uacutenen

los e

xtrac

tos or

gaacutenic

os y

se la

vado

con a

gua d

estila

da

Evap

orac

ioacuten a

sequ

edad

se

redis

uelve

en m

etano

l

34

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

51

Tabla

3- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol me

diante

elec

trofor

esis

capil

ar

Anali

to(s

)Si

stem

a elec

trofo

reacutetic

o M

odali

dad

In

yecc

ioacuten

Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

trans

- y ci

s-re

sver

atrol

Crom

atogr

afiacutea e

lectro

cineacuteti

ca m

icelar

Iny

eccioacute

n elec

trocin

eacutetica

(2 kV

5s)

306 n

m14

7

Resv

eratr

olCZ

EIny

eccioacute

n hidr

odinaacute

mica

(4 s

50 m

bar)

305 n

m

Optim

izacioacute

n del

proc

eso S

PE

media

nte re

des n

euro

nales

ar

tificia

les y

disentilde

o de e

xper

imen

tos14

8

trans

-resv

eratr

ol(-)

-epic

atequ

ina y

(+)-c

atequ

ina

Detec

cioacuten e

lectro

quiacutem

ica

Elec

trodo

de di

sco d

e car

boacuten a

+08

5 V

149

Resv

eratr

ol y

piceid

oCZ

E15

0

Polife

noles

entr

e ell

os r

esve

ratro

l NA

CE

Capil

ares

recu

bierto

s a el

evad

o pH

y me

tanol

UV (2

14 y

223 n

m)

LOD

25 μ

molmiddotL

-1

resv

eratr

olSP

EVa

lores

de pK

ade r

esve

ratro

l 922

10

55 1

116

151

Polife

noles

entr

e ell

ostra

ns- y

cis-

resv

eratr

ol

CZE

DAD

LOD

18 y

50 ng

middotmL-1

pa-

racis

- y tr

ans-r

esve

ratro

l15

2

a Des

viac

ioacuten

estaacute

ndar

rela

tiva

bLiacute

mite

de

dete

ccioacute

n c

Liacutem

ite d

e cu

antif

icac

ioacuten

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

52Tabla

3- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol me

diante

elec

trofor

esis

capil

ar (c

ontin

uacioacute

n)

Anali

to(s

)Si

stem

a elec

trofo

reacutetic

o M

odali

dad

In

yecc

ioacuten

Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

trans

-resv

eratr

ol y aacute

cido s

oacuterbic

o CZ

EDA

D a 3

05 nm

LO

D 00

4 μgmiddot

mL-1

trans

-re

sver

atrol

SPE-

C18

para

resv

eratr

ol e i

nyec

-cioacute

n dire

cta pa

ra aacutec

ido soacute

rbico

Ut

iliza l

a mism

a rec

ta de

calib

rado

de

trans

-resv

eratr

ol pa

ra ci

s-re

sver

atrol

divid

iendo

la pe

ndien

te en

tre la

razoacute

n de l

os co

eficie

ntes d

e ab

sorci

oacutentra

nsci

s a 30

5 nm

(269

)

153

trans

-resv

eratr

olIny

eccioacute

n elec

trocin

eacutetica

(10 k

V 6s

) De

teccioacute

n elec

troqu

iacutemica

Elec

trodo

de

disco

de ca

rboacuten

a +0

85 V

Rang

o line

al 05

-100

μg

middotmL-1

LOD

596

ngmiddotm

L-115

4

Resv

eratr

ol y

piceid

oDA

D

Deter

mina

cioacuten m

edian

te CE

siacutent

esis

y esta

bilida

d de r

esve

ratro

l y pi

ceido

15

5

trans

-resv

eratr

ol Ul

tra-lo

w-te

mpe

ratu

reNA

CE-7

7K F

LD

Ide

ntific

acioacuten

on-lin

e de l

os

fotop

rodu

ctos d

e tra

ns-re

sver

atrol

Se pr

opon

e un e

sque

ma de

fot

orre

accioacute

n par

a res

vera

trol s

imila

r al

de es

tilben

o tra

ns-re

sver

atrol

cis-re

sver

atrol

246-

trihidr

oxife

nantr

eno

156

trans

- y ci

s-re

sver

atrol

NACE

-77K

FL

D

Incluy

e estu

dio de

fotoe

stabil

idad d

e re

sver

atrol

157

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

53

Tabla

4- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

gase

s-mas

as

Anali

to(s

)Si

stem

a cro

mat

ograacute

fico

Col

umna

Ca

ract

eriacutest

icas

Ioacuten

para

det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Resv

eratr

ol tot

al lib

reHP

Inno

wax (

30 m

x 02

5 mm

x 025

μm

)Me

tano c

omo g

as po

rtado

r An

aliza

dor

de tr

ampa

de io

nes

Para

la cu

anti-

ficac

ioacuten se

selec

ciona

el ioacute

n mz

135

Linea

lidad

entre

125

y 25

0 μgmiddot

mL-1

5 mL d

e vino

se di

luyen

con a

gua

(13)

y la

disolu

cioacuten s

e pas

a por

un

cartu

cho C

18 E

l resv

eratr

ol se

eluy

e co

n meta

nol E

l con

tenido

en vi

nos

oscil

a entr

e 118

y 17

2 mg

L-1

158

trans

-resv

eratr

ol HP

-5MS

(30 m

x 02

5 mm

x 025

μm)

He

lio co

mo ga

s por

tador

Gra

diente

de

tempe

ratur

a des

de 10

0 has

ta 30

0 ordmC

Ion

izacioacute

n med

iante

impa

cto

electr

oacutenico

Se t

raba

ja en

mod

o full

sc

an en

un in

terva

lo de

mz

entre

35 a

550 a

mu

Linea

lidad

entre

002

ndash 20

μgmiddot

mL-1

Micro

extra

ccioacuten

en fa

se soacute

lida

reali

zand

o pos

terior

mente

y en

la

mism

a fibr

a un

a der

ivatiz

acioacuten

con

bis-[t

rimeti

lsilil]

-triflu

oro-

aceta

mida

o co

n anh

iacutedrido

aceacuteti

co

Se re

aliza

una c

ompa

racioacute

n con

cro

matog

rafiacutea

bidim

ensio

nal

159

trans

-resv

eratr

ol HP

-5MS

(30 m

x 02

5 mm

x 025

μm)

He

lio co

mo ga

s por

tador

Ioniz

acioacuten

me

diante

impa

cto el

ectroacute

nico

Se

traba

ja en

mod

o SIM

Gra

diente

de

tempe

ratur

a des

de 11

0 has

ta 30

0 ordmC

se

leccio

nand

o par

a cua

ntific

ar el

ioacuten

de m

asa m

olecu

lar 44

4 y pa

ra id

en-

tifica

r los i

ones

de m

asa 4

43 y

446

Linea

lidad

entre

10

pgmiddotm

L-1 y

1 μgmiddot

mL-1

LOD

5 pg

middotmL-1

Micro

extra

ccioacuten

en fa

se soacute

lida

reali

zand

o pos

terior

mente

y en

la

mism

a fibr

a un

a silil

azioacuten

con b

is-[tr

imeti

lsilil]

-triflu

oro-

aceta

mida

La

deso

rcioacuten

se re

aliza

a 28

0 ordmC

dura

nte 7

min

160

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

54Tabla

4- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

gase

s-mas

as (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema c

rom

atog

raacutefic

o C

olum

na

Cara

cter

iacutestica

s Ioacute

n pa

ra d

etec

cioacuten

Paraacute

met

ros a

naliacutet

icos

de ca

lidad

Obse

rvac

ione

s Mu

estra

Tra

tam

iento

Refe

renc

ia

trans

- y ci

s-

resv

eratr

olDB

-5HT

(30 m

x 02

5 mm

x 010

μm)

Gr

adien

te de

110 h

asta

300 ordm

C S

IM

(ioacuten d

e mas

a mole

cular

444)

ione

s de

masa

445 y

446 p

ara i

denti

ficar

LOD

10 ng

middotmL-1

SPE-

C18

elucioacute

n con

aceta

to de

eti-

lo y e

vapo

racioacute

n a se

qued

ad D

eri-

vatiz

acioacuten

con b

is-[tr

imeti

lsilil]

-triflu

o-o-

aceta

mida

a 70

ordmC du

rante

60 m

in

161

trans

-resv

eratr

ol DB

-5Gr

adien

te de

temp

eratu

ra de

sde 1

90

hasta

315 ordm

C P

ara c

uanti

ficar

ioacuten d

e ma

sa m

olecu

lar 22

8 ion

es cu

alitat

ivos

de 22

9 y 22

7 de m

asa

Linea

lidad

hasta

10

μgmiddotm

L-1SP

E-C1

8 elu

cioacuten c

on ac

etato

de

etilo

e intr

oduc

cioacuten d

irecta

del

extra

cto en

el cr

omatoacute

grafo

Se a

na-

lizan

vino

s de l

os pr

incipa

les pa

iacuteses

prod

uctor

es E

l con

tenido

en vi

nos

blanc

os es

infer

ior a

01 μ

gmL-1

162

trans

- y ci

s-

resv

eratr

olDB

-17(

15 m

x 02

5 mm

x015

μm)

Gr

adien

te de

150 h

asta

305 ordm

C

Detec

tor de

mas

as de

cuad

rupo

lo Lo

s da

tos se

adqu

ieren

en m

odo S

IM (ioacute

n de

mas

a mole

cular

228)

ione

s de

masa

227 y

229 p

ara i

denti

ficar

LOD

10 ng

middotmL-1

SPE-

C18

elucioacute

n con

aceta

to de

eti

lo e i

ntrod

uccioacute

n dire

cta de

l ex

tracto

en el

crom

atoacutegr

afo

Tiemp

os de

reten

cioacuten d

e cis

y tra

ns

43 y

57 m

in re

spec

tivam

ente

45

trans

-resv

eratr

olDB

-5 (3

0 m x

025 m

m x 0

25 μ

m)

Detec

tor de

mas

as de

cuad

rupo

lo

Grad

iente

de te

mper

atura

desd

e 150

ha

sta 30

5 ordmC

Se s

elecc

iona p

ara

cuan

tifica

r el ioacute

n de m

asa m

olecu

lar

228

Linea

lidad

hasta

10

μgmiddotm

L- 1LO

D 0

05 μ

gmiddotmL

-1

SPE-

C18

elucioacute

n con

aceta

to de

eti

lo e i

ntrod

uccioacute

n dire

cta de

l ex

tracto

en el

crom

atoacutegr

afo (1

μl de

l 1er

ml e

luido

) 43


55












56













57





plusmn 01 mg

















58












c) Disoluciones







d) Disolventes





59









Colorado Usa 2001








60





61



62




63




64








65




66






67






68








69





CAPIacuteTULO II




72


73







74






75








76





77

disolvente



240 280 320 360 400λ (nm)

0

004

008

012

Abso

rban

cia


78



200 250 300 350 400 450λ (nm)

0

40

80

120In

teni

sidad

de

Fluo

resc

encia


79




0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

01

02

03

Abso

rban

cia

306 nm

343 nm

B

250 300 350 400λ (nm)

0

005

01

015

02

025

Abso

rban

cia

10 - 70

92

100

122A

2 4 6 8 10 12 14pH

0

005

01

015

02

025

Abso

rban

cia

343 nm

306 nmB

102

20 - 60121

250 300 350 400λ (nm)

0

01

02

03

Abso

rban

cia

A


80








81




004

008

012

016

02

024

Abso

rban

cia (3

06 n

m)

004 008 012 016 02 024Absorbancia (343 nm)

H3ReHRe2-

H2Re-


82







200 300 400 500 600λ (nm)

0

200

400

600

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia

gt 100

lt 60A

0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

200

400

600

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia




83






200 300 400 500 600λ (nm)

0

50

100

150

200

250

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia

gt 100

lt 60A

0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

50

100

150

200

250

Inte

nsid

ad d

e Fl

uore

scen

cia



B


84





FOTO

METR

IacuteA


pKa2= 97



FLUO

RESC

ENCI

A







85





86



trans-resveratrol









Linealidad 993 986






87







88






89



240 280 320 360λ (nm)

0

01

02

03

Abso

rban

cia

A

240 280 320 360λ (nm)

0

01

02

03

Abso

rban

cia

B

240 280 320 360λ (nm)

0

01

02

03

Abso

rban

cia

C

240 280 320 360λ (nm)

0

01

02

03

Abso

rban

cia

D


90





91



200 300 400 500λ (nm)

0

100

200

300

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia


92




0

100

200

300

400

500

I F (

364 n

m) (λ

exc =

260 n

m)

A

0 20 40 60 80 100 v Etanol

0

100

200

300

400

500

I F (

364 n

m) (λ

exc =

260 n

m)

B


93








94





240 260 280 300 320 340 360λ (nm)

0

004

008

012

Abs

orba

ncia

35

84

98

107

110

A

0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

004

008

012

Abso

rban

cia

261 nm

303 nm

B


95






200 250 300 350 400 450λ (nm)

0

200

400

600

800

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia

lt 70

gt 120

99

0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

200

400

600

800

I F (

364

nm) (

λ exc=

260

nm

)

A B


96







97








Linealidad 985







98






99








100







330 360 390 420 450λem (nm)

0

200

400

600

800

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia

A

330 360 390 420 450λem (nm)

-8

-4

0

4

8

2 D

B


101







102




2 3 4 5 6 7pH

0

20

40

60

80

100

120

R

ecup

erac

ioacuten


103











104







105








Linealidad 976








es 48


106







107


320 360 400 440λem (nm) (λexc= 260 nm)

0

200

400

600

800

Inten

sidad

de

Fluo

resc

encia

-10

0

10

201D

320 360 400 440λ


-1

-05

0

05

1

152D

320 360 400 440λem (nm) (λexc= 260 nm)


108




109




063 107 (5) 109 (4)

094 110 (4) 108 (8)

16 104 (2) 111 (3)

31 98 (4) 105 (3)

Tinto

47 104 (3) 101 (3)

013 100 (8)

019 94 (7)

031 102 (4)

063 96 (5)

Blanco




CAPIacuteTULO III




112


113






114






115






116



240 280 320 360 400λ (nm)

0

002

004

006

008Ab

sorb

ancia


117



0

4

8

12

16

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia

200 300 400 500λ (nm)


118






240 280 320 360 400λ (nm)

0

004

008

012

016

02

Abso

rban

cia

lt 70 gt 120

105

A

0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

004

008

012

016

02

Abso

rban

cia

344 nm

306 nm

B


119






240 280 320 360 400λ (nm)

0

004

008

012

016

02

Abso

rban

cia

lt 70 gt 110

98

A

0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

004

008

012

016

02

Abso

rban

cia

306 nm

344 nm

B


120


200 300 400 500 600λ (nm)

0

200

400

600

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia

gt 110

gt 60

A

0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

200

400

600

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia

λexcem= 344457 nm

λexcem= 318405 nm

B

200 300 400 500λ (nm)

0

20

40

60

80

100

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia

lt 70gt 115

A

0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

20

40

60

80

100

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia

λexcem= 292392 nm

λexcem= 344447 nm

B


121





FOTO

METR

IacuteA




FLUO

RESC

ENCI

A




122








123











Linealidad 996 984






124









125





126






127


240 280 320 360λ (nm)

0

003

006

009

Abso

rban

cia

D

A

0

003

006

009

Abso

rban

cia

240 280 320 360λ (nm)

B

240 280 320 360λ (nm)

0

003

006

009

Abso

rban

cia

C

240 280 320 360λ (nm)

0

003

006

009

Abso

rban

cia


128







200 300 400 500λ (nm)

0

400

800

1200

1600

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia


129





130








0

200

400

600

I F (

361 n

m) (λ

exc =

261 n

m)

A

0 20 40 60 80 100 v Etanol

0

200

400

600

I F (

361 n

m) (λ

exc =

261 n

m)

B


131



240 260 280 300 320 340 360λ (nm)

0

01

02

03Ab

sorb

ancia

0 2 4 6 8 10 12 14pH

008

012

016

02

024

028

Abso

rban

cia

261 nm

282 nm

80

100104

108111

gt 12


132




0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

200

400

600

I F (3

61 n

m) (λ

exc=

261 n

m)

200 250 300 350 400 450λ (nm)

0

200

400

600Int

ensid

ad de

Fluo

resc

encia

lt 80

gt 115

99


133







134









Linealidad 984







135



Estudios previos



136











137


y en general






138







139







140










nm


141



Experiencia Nordm




Low A 1 0026 25 155

High A 2 019 25 155

Low B 3 011 25 12

High B 4 011 25 298

Low C 5 011 099 155

High C 6 011 40 155

Cube 1 7 006 16 70

Cube 2 8 016 16 70

Cube 3 9 006 16 240

Cube 4 10 016 16 240

Cube 5 11 006 34 70

Cube 6 12 016 34 70

Cube 7 13 006 34 240

Cube 8 14 016 34 240

Central a 15 011 25 155

Central b 16 011 25 155

Central c 17 011 25 155


142










143



Variable Valor p




AB 04561

AC 09239

BC 07689

AA 02931

BB 01602

CC 03235





144



145








146










Linealidad 980





RSD (n = 11) 59





147





148












149

Interferencias





CAPIacuteTULO IV



HPLC


152


153

ANTECEDENTES






154




155




156



157






158



159




160






0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14t (min)

0

3

6

9

12

15

18

A (3

06 nm

)

0

1

2

3

4

5

F I (λ e

xcem

260

364

)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14t (min)

0

10

20

30

40

F I (λ e

xcem

260

364

)

0

3

6

9

A (30

6 nm

)

A

B

FP1

FP2

FR


FR

cis-resveratrol

FP2

cis-piceido


161










162





OH

OHGlc

O

-524401 1194 FP2

HO

OH

GlcO

-524298 4524 FP1



HO

OH

OH

OH

OH

HO

OH

OHHO

hν hν

hν hν

OH

OHGlc

O

OH

OHGlc O

OH

OHGlc

O

HO

OH

GlcO


163






164




0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14t (min)

0

20

40

60

80

100

A (3

06 n

m)

0

20

40

60

80

F I (λ e

xcem

260

364

)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14t (min)

2 3 4 5 6 7

07


trans-resveratrol

B

A


165




166







12

24

36

v

Aacutecid

o Aceacute

tico

16 20 24 28

12

24

36

tRkRF ssum

=middot


167



168




169






0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20t (min)

0

4

8

12

16

F I

(λex

cem 2

6036

4)

FP1

FP2

FR


170




171



Resveratrol Piceido












172






0

500

1000

1500

2000

2500

Aacuterea

FR


0

500

1000

1500

2000

2500

Aacuterea

FP2


173





(μgmL-1)

Encontrado en vino


()a Puesto en vino

(μgmL-1)

Encontrado en vino


()a







174









175



0 4 8 12 16 20t (min)

0

20

40

60

80

I F (λ e

xcem

2603

64)

0 4 8 12 16 20t (min)

0

20

40

60

80

I F (λ e

xcem

2603

64)

0 4 8 12 16 20t (min)

0

20

40

60

80

I F (λ e

xcem

2603

64)

A

B

C

16 20

1

6 8 10

0

5

FP1FP2

FR


176



65 7 75 8t (min)

0

20

40

60

80

I F (λ e

xcem

2603

64)

280 320 360 400 440λ (nm)

0

4

8

12

16

20

I F

A B


177



CAPIacuteTULO V




180


181

ANTECEDENTES











182







183









184





185





186








187






0

20

40

60

80

I F (

λ exce

m 260

364 n

m)



188





0 2 4 6 8 10 12 14 16 18tiempo (min)

0

2

4

6

8

I F (

λ exce

m 260

364 n

m)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18tiempo (min)

0

4

8

12

A (3

06 nm

)

trans-Piceido

trans-Resveratrol

A

B


(trans-Piceido)hν



189







190



0 2 4 6 8 10 12 14 16 18tiempo (min)

0

2

4

6

8

I F (

λ exce

m 260

364 n

m)

4 45 5 550

2

4

6


191







son


192






193






194


norm

hPthRtPicts

APAPRRF ⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ ++= minusminus

minus2

)()()(




195




196


Variable Valor p

ACN 00310 H3PO4 00765






197




198




0 2 4 6 8 10 12 14 16tiempo (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

I F (

λ exce

m 260

364 n

m)

trans-Piceido

trans-Resveratrol

desconocido


199



200



0 5 10 15 20 25t (min)

0

2

4

6

8

I F (

λ exce

m 260

364 n

m)

0 5 10 15 20 25t (min)

0

10

20

30

40

I F (

λ exc

em 26

0364

nm)

3 6t (min)0

25

A

B


201




202



36 35 34 33 32103T (K-1)

1

10

100

2

3456789

20

30405060708090

k

10

100

1000

20

30405060708090

200

300400500600700800900

P (ba

r)


203













204




μgmiddotmL-1 102


111 μgmiddotmL-1



(472plusmn037) x102

(346plusmn11) x102



x102

I N T R A - D



(479plusmn086) x102

(343plusmn17) x102



x102

I N T E R - D

RSD (Altura) 183 69 181 175


205






206





207



208








min0 5 10 15 20 25 30 35 40

LU

0

50

100

150

200

250

300



209





0 10 20 30 40t (min)

0

40

80

120

160

200

I F (

λ exce

m 260

364 n

m)

trans-piceido

cis-piceido

trans-resveratrol

cis-resveratrol

Desconocido


210







211






212




trans cishlt


240 280 320 360λ (nm)

0

7

14

21

A (m

Au)

240 280 320 360λ (nm)

0

1

2

3

4

5

6

7

A (m

Au)


213


trans cis

Inicialmente ct0

rans 0











214




i = ε λcis

i entonces






yArea Area

Areaxtrans cis

trans=

+0 100

yb m b m


trans trans=


ε εε

λ λ

λ 0 100

ym m

mxtrans cis

trans=

+0 100


215







216







0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

Aacuterea

de

Pico


217




500

1000

1500

2000

2500

3000

Aacuterea

de

Pico

(FLD

)


0

400

800

1200

1600

2000

Aacuterea

de

Pico

(FLD

)



218











219






220




221




0

1000

2000

3000

Aacuterea

de P

ico (F

LD)

cis-Piceido


0

1000

2000

3000

4000

Aacuterea

de P

ico (F

LD)

trans-Piceido


0

1000

2000

3000

4000

5000

Aacuterea

de P

ico (F

LD)

cis-Resveratrol


0

2000

4000

6000

Aacuterea

de P

ico (F

LD)

trans-Resveratrol


222




min0 5 10 15 20 25 30 35

mAU

0

1

2

3

4

5trans-Piceido

trans-Resveratrol

306 nm

min0 5 10 15 20 25 30 35

mAU

0

1

2

3

4

5


290 nm


223






0

2

4

6

8

Altur

a de P

ico (D

AD30

6nm)

trans-Piceido


0

04

08

12

Altur

a de

Pico

(DAD

290n

m)

cis-Piceido


0

2

4

6

Altur

a de P

ico (D

AD30

6nm)

trans-Resveratrol


0

04

08

12

Altu

ra de

Pico

(DAD

290n

m)

cis-Resveratrol


224






0

2000

4000

6000

8000

Aacuterea

de P

ico (F

LD)


225






0

200

400

600

800

1000

Aacuterea

de P

ico (F

LD)


0

500

1000

1500

2000

2500

Aacuterea

de

Pico

(FLD

)


0

400

800

1200

1600

2000

Aacuterea

de P

ico (F

LD)


0

400

800

1200

1600

2000

Aacuterea

de

Pico

(FLD

)


226












CAPIacuteTULO VI




228


229





230


analysis)




231




232





233





234






235







236





237






238




239





240







241




242






243


F = sum=

N









244




245





246




300 350 400 450 500λem (nm)

I F R

elativ

a

240 260 280 300 320 340λexc (nm)

I F R

elati

va


247





248






249



250




251






252



253





254




255




256






257



258







259













No-Flavonoides



rutina - -




Flavonoides

Antocianos







260




261


200 300 400 500λ (nm)

0

200

400

600

800

F I

Catechin

200 300 400 500λ (nm)

0

100

200

300

400

500

F I

Epicatechin

200 300 400 500λ (nm)

0

100

200

300

F I

p-Coumaric Acid

200 300 400 500λ (nm)

0

200

400

600

800

1000

F I

Gentisic Acid

200 300 400 500λ (nm)

0

200

400

600

800

1000

F I


200 300 400 500λ (nm)

0

100

200

300

F I

Vanillic Acid


262



263






264




300 350 400 450 500λem (nm)

I F R

elativ

a


265







266




267





268



269



I F R

elativ

a

240 260 280 300 320 340 360λ (nm)

I F R

elativ

a

300 350 400 450 500λ (nm)


270





271





272



273


CAPIacuteTULO VII




276


277

ANTECEDENTES






278











279








280







281







282




283





05 06 07 08 09E (V)

3E-006

35E-006

4E-006

45E-006

5E-006

55E-006

I (A)

05 06 07 08 09E (V)

0

2E-007

4E-007

6E-007

8E-007

I (A)


284




285




286



06 07 08 09E (V)

3E-006

4E-006

5E-006

6E-006

7E-006

I (A)

38E-006

4E-006

42E-006

44E-006

I (A)


287




288




0 10 20 30 40 v Etanol

300

400

500

600

700

I (nA

)


289





0 10 20 30 40 50 v Etanol

0

100

200

300

400

500

I (nA

)


290







06 07 08 09E (V)

88E-006

92E-006

96E-006

1E-005

104E-005

108E-005I (

A)

345E-007

35E-007

355E-007

36E-007

365E-007

37E-007

I (A)

06 07 08 09E (V)

-5E-008

0

5E-008

1E-007

15E-007

2E-007

25E-007

I corre

gido (

A)


291






06 07 08 09E (V)

36E-006

38E-006

4E-006

42E-006

44E-006

46E-006

I (A)


-2E-008

0

2E-008

4E-008

6E-008

8E-008

I (A)


292








05 06 07 08 09E (V)

6E-006

7E-006

8E-006

9E-006

1E-005

11E-005

12E-005

I (A)

0 s10 s60 s120 s

-4E-008

0

4E-008

8E-008

12E-007

16E-007

I corre

gido (A

)


293







0

100

200

300

I p (nA

)


294







06 07 08 09E (V)

-2E-007

0

2E-007

4E-007

6E-007

I (A)


295






20 135 40 175 60 221 80 160




296





297





298








299










300



301






302




05 06 07 08 09E (V)

12E-005

13E-005

14E-005

15E-005

16E-005

17E-005I (

A)

065 07 075 08 085E (V)

128E-005

13E-005

132E-005

134E-005

136E-005

I (A)


303




06 07 08 09E (V)

12E-005

125E-005

13E-005

135E-005

14E-005

145E-005

I (A)


304






06 07 08 09E (V)

115E-005

12E-005

125E-005

13E-005

135E-005

14E-005

145E-005

I (A)


305






0

100

200

300

400

500

I (nA

)



306









Linealidad 9608









307





065 07 075 08 085 09E (V)

-5E-008

0

5E-008

1E-007

15E-007

2E-007

I (A)


308








0

100

200

300

400

I p (nA

)


309




310






311











312




0 4 8 12 16 20t (minutos)

20

40

60

80

I F (λ

exce

m 260

364 n

m)


313


-09 -08 -07 -06E (V)

-12E-008

-8E-009

-4E-009

0

I (A)


-09 -08 -07 -06E (V)

-3E-008

-2E-008

-1E-008

0

I (A)


CONCLUSIONES






ANEXO


ORIGINAL PAPER







Resveratrol Wine

Introduction









Experimental

Reagents




Wine samples


Apparatus




a bOH

HO

OH

OH

OH

HO






















250 300 350 400 450λ (nm)

0

01

02

03

Abs

orba

nce

0

200

400

600

Fluo

resc

ence

Int

ensi

ty

200 300 400 500 600λ (nm)

20-65

92

122

36

109


2 4 6 8 10 12 14pH

004

008

012

016

02

024

Abs

orba

nce

004

008

012

016

02

024

Abs

orba

nce

(306

nm

)

004 008 012 016 02 024Absorbance (343 nm)








Photometric study









LODa

(ng mLminus1)LODb

(ng mLminus1) RSDc




0127plusmn0001 09989 0058 014 44 (14)







0182plusmn0004 09907 22 50 48 (192)




Fluorescence study




250 300 350 400 450λ (nm)

0

01

02

03

Abs

orba

nce

0

005

01

015

Abs

orba

nce

225 250 275 300 325 350λ (nm)

(5)

(1)(2)

(3)(4)

20-70

98116

a b














200 250 300 350 400 450 500

λ (nm)

0

100

200

300

Flu

ore

scen

ce I

nte

nsi

ty

100

200

300

400

500

F I

(λ e

xc

em=

2603

64 n

m)


(1)

(2)30-50

3

100





Conclusions




Recovery ( RSD)


109 (4)b

094 110 (4)a

108 (8)b

16 104 (2)a

111 (3)b

31 98 (4)a

105 (3)b

47 104 (3)a

101 (3)b

White 013 100 (8)019 94 (7)031 102 (4)063 96 (5)094 102 (3)


320 360 400 440λ em (nm) (λ exc= 260 nm)

0

200

400

600

800

Flu

ores

cenc

e In

tens

ity

-10

0

10

20

1D

320 360 400 440λem (nm) (λ exc= 260 nm)

-1

-05

0

05

1

15

2D

320 360 400 440 em (nm) (λ exc= 260 nm)λ





References








































Abstract


Keywords Pi

1 Introdu




0039-9140$doi101016j













ly fr

eid h

ction




intensipharm


Pic

















In the dedesign (Ce

dolothe] Thimument

erim

hem


um tultin

ine

eralite wlme

nt porevi

Sam

stru






2 Exp

21 C

Forsolvenpore M



22 W


23 In


FluorescVarian Car

5ndash682









ental

icals






samples





8) 67





24 Procefluorimetri

241 CaliIn a qua


242 Recpiceid in w


in ans w


ofmL

rredt by

rd souted260movThe

algoe co

1 nmine

ults

eterd flu


ium he to












3 Res

31 Dinduce






5ndash682 677





and discussion















f theorpt

ed atoprin a


remeh reonta(vv

minus1





ia


yield oAbs



Wittions c4060


010 mol Laqueous hy






5ndash682


















a Experime





32 Applic




nse S

ptim

thehase

comulta




FI(











pH ofhydrog


33 O




RF =


(λexc











680 8) 675ndash682




34 Deter



Table 3Optimization

Effect
















11750 1 11750 6614 00422me) 362705 1 362705 0204 06673) 47950 1 47950 26981 00020

1128 1 1128 0635 0456117645 1 17645 0009929 09239167952 1 167952 009451 076892359 1 2359 1327 029314562 1 4562 2567 016022055 1 2055 1156 0323510660 6 1777

ed) 77260 15 5150














4 Conclu



ccordrepo

RShenminus1)

t usetheendpre

wled

authrojecRod

Desaships als

nces

La RobMazz

Lare Bo Morcol J



Hady E

MedT Ribteren6








sions




Ackno


Refere

[1] RM184

[2] JL[3] G[4] RM

Tor[5] JF

Mi[6] Y K

Me[7] Y[8] M

(19[9] F O

(19[10] C

527[11] JM

Pronol

[12] HPh

[13] AMCoand

[14] Mcau266


[15] J BurnsChem 5

5ndash682 681






gements










682 8) 67

[16] X VitraJM Me

[17] M AberChromat

[18] X VitraChim A

[19] P JeandG Maum

[20] MN BrChim A

[21] C Domı303

[22] MA PoAgric F

[23] V BrandJ Agric

RoggP B Mo







[24] JP[25] GE[26] DC

Ne[27] Un

hei[28] RF[29] J C

Re[30] JP[31] T

Ch[32] T



5ndash682








Original Paper





DOI 101002jssc200700285

1 Introduction






















2 Experimental




22 Wine samples




























RF = (k N RRs)t























Resveratrol Piceid




Young redwine

Barrel-agedred wine

White wine



Resveratrol Piceid




Slope calibrationb)



















5 References



















































Analytical Methods






Abstract



1 Introduction




















2 Experimental






22 Wine samples













251 Red wines


252 White wines


















0 10 12 14 16 18t (min)

0

2

4

6

8

10

F I

(λex

cem

260

364

nm

)F

I (λ

exc

em 2

603

64 n

m)


t (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

t-Piceid

t-Resveratrol

unknown

A

B

8642

0 10 12 14 16 188642







2

norm

















0 10 20 30 40t (min)

0 10 20 30 40t (min)

-2

0

2

4

6

8

A 290

nm (m

Au)

240 3600

4

240 3600

4

240 3600

05

240 3600

05

0

40

80

120

160

200

F I

(λex

cem

260

364

nm

)

t-Pic

c-Pic

t-Res

c-Res

Unknown

t-Pic

c-Pic

t-Res

c-Res

A

B












samples



240 280 320 360λ (nm)

0

7

14

21

A (m

Au)

A (m

Au)

240 280 320 360λ (nm)

0

1

2

3

4

5

6

7






y = (28202 plusmn 1851)x+ (3203 plusmn 1047)

y = (43669 plusmn 1126)x (4329 plusmn 1170)

y = (19025 plusmn 2415)x+ (1664 plusmn 1167)


a SN = 3b SN = 10





4 Conclusions




Acknowledgement




References























t-Piceid(lg mL1)

c-Piceid(lg mL1)














WINES

1- INTRODUCTION














































wines2
































21- WINE SAMPLES


























intensity)











24- HPLC ANALYSIS











3) respectively









was used throughout








the calculations10











F = sum=

N

























SCORE VALUES










package21

































nm for all samples







32- PARAFAC RESULTS
















each other


















































































































or even at 275 nm





























CONCLUSIONS











ACKNOWLEDGEMENTS
















Phenolic Acids


Non-Flavonoids




Flavonoids

Anthocyanins



Sample 1

Sample 7

Sample 17

Sample 19


EXCITATION

EMISSION





200 300 400 500λ (nm)

0

200

400

600

800F

ICatechin

200 300 400 500λ (nm)

0

100

200

300

400

500

F I

Epicatechin

200 300 400 500λ (nm)

0

100

200

300

F I

p-Coumaric Acid

200 300 400 500λ (nm)

0

200

400

600

800

1000

F I

Gentisic Acid

200 300 400 500λ (nm)

0

200

400

600

800

1000

F I


200 300 400 500λ (nm)

0

100

200

300

F I

Vanillic Acid


min10 20 30 40

mAU

50

60

70

80

90


min10 20 30 40

mAU

45505560657075


min10 20 30 40

mAU

392

393

394

395

396

397

398



Portada

Visado

Informe



IacuteNDICE



Resveratrol en vino





a) Aparatos

b) Reactivos

c) Disoluciones

d) Disolventes


Bibliografiacutea


ANTECEDENTES







ANTECEDENTES







ANTECEDENTES








ANTECEDENTES








ANTECEDENTES










ANTECEDENTES







CONCLUSIONES



Talanta 74 (2008) 675-682

J Sep Sci 30 (2007) 3110-3119

Food Chem 109 (2008) 825-833





MENUacute

SALIR









por











de Extremadura

I N F O R M A























CAPIacuteTULO I

INTRODUCCIOacuteN


2


3






HO

OH

OH

4 3

5


4










5












6







7







8








9





10











11







12






OH

HO

HO

OH

HOOH OH

HO

OHOH

O

HHO

H

HO

H

H

HO

H

O

OH

O

H

OHH OH

H

H HO

H

O

OH




13






34


USA (California)



Australia y Europa



43



Francia



Sauvignon

44


Espantildea




39



Suiza 69



14









USA (California)








15










vivordquo como son


16










17





18










19








20






R

OHCC

H

H

C

O

OHC

COOH

CHHO

COOH

OH

OH

OH

HOOC


21





O

O

A C

B1

2

3

45

6

7

8

9

10

1

2

3

4

5

6


22

Flavonoles








O

OH

HO

OH

R

R

OH

O


23







O

4

6

8

OH

HO

OH

R3

OH

R1

R2

O

OH

HO

OH

R

O

O

Ramnosil


24






O

A

B

2

3

45

6

7

8 1

2

3

4

5

6

+


25





O

A

B

2

3

45

6

7

8 1

2

3

4

5

6

+

OH

OH

HO

OH

R

R


26








27








O

4

6

8

OH

HO

OH

R3

OH

R1

R2

n


28












29


CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

30Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os

Anali

to(s

)Si

stem

a cr

omat

ograacute

fico

Col

umna

F

Moacutev

il S

istem

a de D

etec

cioacuten

Paraacute

met

ros a

naliacutet

icos

de ca

lidad

Obse

rvac

ione

s Mu

estra

Tra

tam

iento

Refe

renc

ia

cis y

trans

-re

sver

atrol

ODS2

(35 ordm

C)

Grad

iente

de aacutec

ido ac

eacutetico

6 a

agua

aceto

nitrilo

aceacuteti

co 6

5305

DA

D (2

90 nm

bar

ridos

250 a

600 n

m)

FLD

( exc

em

= 30

0392

nm b

arrid

os

de em

isioacuten

y ex

citac

ioacuten)

MS (A

PCI m

odo f

ull sc

an) c

on el

ucioacuten

iso

craacutetic

a ace

tonitri

loag

ua 3

070

Es

tudio

de lo

s pro

ceso

s de

trans

forma

cioacuten f

otoqu

iacutemica

con l

uz

UV de

difer

ente

y co

n luz

solar

Tr

ansfo

rmac

ioacuten cu

antita

tiva d

e tra

nsen

cis co

n irra

diacioacute

n de 3

60 nm

Ide

ntific

acioacuten

de ot

ro fo

topro

ducto

no

isoacuteme

ro de

resv

eratr

ol de

men

or P

M

83

trans

-resv

eratr

olep

icateq

uina y

ca

tequin

a

C18

Grad

iente

de ac

etonit

rilo

Aacutecido

aceacuteti

co ac

uoso

al 5

991

a ac

etonit

riloaacutec

ido ac

eacutetico

acuo

so al

5

257

5 FL

D ( e

xc e

m=

2803

15nm

10 m

in y

3243

70 nm

en ad

elante

)

Ce

ntrifu

gacioacute

n e in

yecc

ioacuten di

recta

Ide

ntific

acioacuten

de an

alitos

por

co

mpar

acioacuten

de su

s tR y

espe

ctros

UV

en el

pico

con l

os de

patro

nes

20 m

in po

r cro

matog

rama

Au

mento

de la

conc

entra

cioacuten d

e los

tre

s des

de el

mos

to ha

sta el

vino

84

trans

- y ci

s-

resv

eratr

ol y

piceid

o y ot

ros

polife

noles

ODS2

(35 ordm

C)

Grad

iente

de ag

uaac

etonit

riloaacutec

ido

aceacuteti

co

DAD

(280

nm)

FLD

((ex

cem

= 30

0392

nm)

RSDa i

ntra-

diacutea e

inter

-diacutea

(n=6

) entr

e 04

y

4

LODb 0

02 μ

gmiddotmL

-1 pa

ratra

ns- y

cis-

resv

eratr

ol y

trans

-pice

ido

Inyec

cioacuten d

irecta

de la

mue

stra

Cuan

tifica

cioacuten d

e cis

partir

de la

dis

minu

cioacuten d

e tra

ns85

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

31

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)

Anali

to(s

)Si

stem

a cr

omat

ograacute

fico

Col

umna

F

Moacutev

il S

istem

a de D

etec

cioacuten

Paraacute

met

ros a

naliacutet

icos

de ca

lidad

Obse

rvac

ione

s Mu

estra

Tra

tam

iento

Refe

renc

ia

Comp

uesto

sfen

oacutelico

s aacutec

idos

fenoacuteli

cos

estilb

e-no

s (isoacute

mero

s tra

ns y

cis de

re

sver

atrol

ypic

eido)

flav

o-

noles

como

la

quer

cetin

a(a

glico

na y

glucoacute

sido)

C18

Grad

iente

de 10

0 A

a 10

0 B

A

(Aacutecid

o foacuter

mico

05

o

aacutecido

fosfoacute

rico

01

) B

(Aac

etonit

rilo a

gua

5400

595)

07

mLmiddotm

in-1

MS (M

odo f

ull sc

an)

DAD

(200

-800

nm

) FL

D e

xem 2

8032

0 26

0400

(cis-

resv

e-ra

trol y

cis-p

iceido

) y 30

0390

(tr

ans-r

esve

-ratro

l y tr

ans-p

iceido

)EC

D (in

tegra

cioacuten d

e volt

ampe

rogr

ama

entre

-1 y

1 V)

DA

D y M

S E

xtrac

cioacuten c

on ac

etato

de et

ilo e

vapo

racioacute

n a se

qued

ad y

reco

nstitu

cioacuten e

n meta

nola

gua

DAD

FLD

y EC

D F

iltrad

o del

vino y

an

aacutelisis

dire

cto

Conte

nido f

enoacuteli

co to

tal po

r el

meacutetod

o de F

olin-

Cioc

alteu

Los d

os is

oacutemer

os de

resv

eratr

ol y

piceid

o pre

senta

n pro

pieda

des

electr

oquiacutem

icas

86

Polife

noles

an

tocian

os y

trans

-re

sver

atrol

Fase

inve

rsa y

elucioacute

n gra

diente

DA

D (2

80 y

520 n

m po

lifeno

les y

306 n

m tra

ns-re

sver

atrol)

El

conte

nido e

n tra

ns-re

sver

atrol

depe

nde e

n gra

n med

ida de

la

varie

dad y

del a

ntildeo de

cose

cha

87

Deriv

ados

de re

s-ve

ratro

l res

vera

-tro

l y pi

ceido

isoacute

mero

s

Fase

inve

rsa y

elucioacute

n gra

diente

DA

D (3

10 nm

para

tran

s-isoacute

mero

s y

286 n

m pa

ra ci

s-isoacute

mero

s)

No se

detec

ta nin

guacuten

deriv

ado p

or de

bajo

de 3

ngmiddotm

L-1

Filtra

cioacuten d

e las

mue

stras

e iny

eccioacute

n dire

cta en

el si

stema

cro

matog

raacutefic

oCo

ntenid

o tota

l de p

olifen

oles p

or el

meacute

todo d

e Foli

n-Ci

ocalt

eu

Capa

cidad

antio

xidan

te T

EAC-

test

88

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

32Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)

Anali

to(s

)Si

stem

a cr

omat

ograacute

fico

Col

umna

F

Moacutev

il S

istem

a de D

etec

cioacuten

Paraacute

met

ros a

naliacutet

icos

de ca

lidad

Obse

rvac

ione

s Mu

estra

Tra

tam

iento

Refe

renc

ia

Comp

uesto

sfen

oacutelico

s en

tre

ellos

tran

s y ci

s-re

sver

atrol

C18

Grad

iente

de aacutec

ido foacute

rmico

en ag

ua

pH 3

(A) y

aacutecido

foacuterm

ico en

ac

etonit

rilo p

H 3 (

B) a

02 m

Lmiddotmi

n-17

DAD

(200

- 600

nm 3

05 y

285 n

m pa

ra

trans

- y ci

s-res

vera

trol

resp

ectiv

amen

te)MS

(ESI

SCA

N m

z 50

-700

mod

o SIM

LOD

(SN

= 3)

1 y 4

ng

middotmL-1

para

tran

s- y c

is-re

sver

atrol

resp

ectiv

amen

te

Vino

s alm

acen

ados

a 4ordm

C en

la

oscu

ridad

Bote

llas a

bierta

s inm

ediat

amen

te an

tes de

l anaacute

lisis

Fil

trado

e iny

eccioacute

n dire

cta de

las

mues

tras

89

trans

-resv

eratr

ol C1

8 (40

ordmC)

Grad

iente

de ag

uam

etano

l 55

a ag

uaac

etonit

rilo 7

3 0

6 mLmiddot

min-1

DAD

(308

y 28

8 nm)

Recta

de C

alibr

ado e

ntre

05 y

16 μ

gmiddotmL

-1Ca

ntida

des e

ncon

trada

s en v

inos

tintos

(035

2-19

9 μgmiddot

mL-1

) may

ores

qu

e en b

lanco

s (5-

570 n

gmiddotmL

-1)

Anaacuteli

sis cu

alitat

ivo de

cis-r

esve

ratro

l

90

trans

-resv

eratr

olFa

se in

versa

colum

nas m

onoliacute

ticas

El

ucioacuten

isoc

raacutetic

a 30

(aacutecid

o aceacute

tico

01

en m

etano

l) ndash 70

(aacute

cido

aceacuteti

co 0

1 en

agua

) 5 m

Lmiddotmi

n-1

FLD

exem

3104

03 nm

DAD

310 n

m

Rang

o line

al 01

1-27

5 μg

middotmL-1

LOD

3 ngmiddot

mL-1

LOQc 4

ngmiddotm

L-1

Uvas

Acop

lamien

to en

tre S

PE co

n sis

temas

de ex

tracc

ioacuten co

n liacutequ

idos

a pre

sioacuten (

PLE)

66

trans

- y ci

s-res

ve-

ratro

lC1

8Gr

adien

te de

aacutecido

aceacuteti

co p

H 24

a aacutec

ido ac

eacutetico

aceto

nitrilo

208

0 15

mL

middotmin-1

DAD

(285

y 30

6 nm

para

cis y

tran

s)

trans

-resv

eratr

ol 03

2 ndash 4

44 y

012 ndash

28

0 μgmiddot

mL-1

en tin

tos y

rosa

dos

resp

ectiv

amen

tecis

-resv

eratr

ol 02

0 ndash 5

84 y

002 ndash

317

μgmiddot

mL-1

en

tintos

y ro

sado

s re

spec

tivam

ente

91

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

33

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)

Anali

to(s

)Si

stem

a cr

omat

ograacute

fico

Col

umna

F

Moacutev

il S

istem

a de D

etec

cioacuten

Paraacute

met

ros a

naliacutet

icos

de ca

lidad

Obse

rvac

ione

s Mu

estra

Tra

tam

iento

Refe

renc

ia

Estilb

enos

-

vinife

rina

trans

-as

tringin

atra

ns-

piceid

ocis

- y

trans

-resv

eratr

ol y

-vini

ferina

C18

Grad

iente

de aacutec

ido ac

eacutetico

en ag

ua

pH 2

4 a aacutec

ido ac

eacutetico

en ag

ua p

H 24

ace

tonitri

lo 20

80 0

5 mL

middotmin-1

UV (2

80 2

86 3

06 y

321 n

m)

LOD

02 μ

gmiddotmL

-1 0

2 μg

middotmL-1

y 03

2 μgmiddot

mL-1

para

trans

-pice

idotr

ans-

ycis-

resv

eratr

olre

spec

tivam

ente

Extra

ccioacuten

con a

cetat

o de e

tilo

limpie

za co

n res

ina in

terca

mbiad

ora

de ca

tione

s y m

edian

te cro

matog

rafiacutea

de pa

rticioacuten

(ce

ntrif

ugal

parti

tion

chro

mat

o-gr

aphy

) y H

PLC

semi

prep

arati

va

92

20 co

mpue

stos

fenoacuteli

cos

entre

ell

ostra

ns-

resv

eratr

ol

XDB-

C8Gr

adien

te de

meta

nol y

aacutecido

aceacuteti

co 1

D

AD (3

06 nm

para

tran

s-res

vera

trol)

CLD

(Ce(

IV) ndash

roda

mina

6G ndash

comp

uesto

fenoacute

lico e

n med

io aacutec

ido

sulfuacute

rico)

trans

-Res

vera

trol

Rang

o line

al 00

3- 15

0 μg

middotmL-1

LOD

(SN

=3) 8

47 y

66

ngmiddotm

L-1 en

DAD

y CL

D

resp

ectiv

amen

te

Inyec

cioacuten d

irecta

de m

uestr

as

filtra

das

Detec

cioacuten C

L alta

mente

sens

ible

(LOD

de 1

a 2 oacuter

dene

s de m

agnit

ud

meno

res q

ue lo

s liacutem

ites e

n DAD

)

93

Isoacuteme

ros c

is y

trans

de

resv

eratr

ol y

piceid

o

C18 m

onoliacute

tica (

Chro

moli

thPe

rform

ance

RP-

18e)

Grad

iente

de ag

uaaacutec

ido ac

eacutetico

946

a a

guaa

ceton

itrilo

aacutecido

aceacuteti

co

6530

5 7

mLmiddotm

in-1

DAD

(285

y 30

6 nm

para

cis-

y tra

ns-

resv

eratr

ol re

spec

tivam

ente)

LOD

32 y

34 ng

middotmL-1

y LO

Q 01

0 y 0

11 μ

gmiddotmL

-1

para

tran-

y cis

-re

sver

atrol

resp

ectiv

amen

te

El em

pleo d

e una

colum

na

mono

liacutetica

impli

ca ba

jas pr

esion

es y

corto

s tiem

pos d

e anaacute

lisis

94

trans

- y ci

s- re

sve-

ratro

l y pi

ceido

Fa

se in

versa

Estud

ia la

influe

ncia

de la

varie

dad

del la

leva

dura

en la

conc

entra

cioacuten

de lo

s cua

tro co

mpue

stos e

n vino

95

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

34Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Aacutecido

s hidr

oxibe

n-zo

icos

aacutecido

s hid

roxic

inaacutemi

cos y

de

rivad

os e

stilbe

-no

s (isoacute

mero

sde

resv

eratr

ol y

piceid

o) a

lcoho

les

fenoacuteli

cos y

com

-pu

estos

relac

io-na

dos

flava

noles

y f

lavon

oles

Se si

gue e

l patr

oacuten de

evolu

cioacuten d

e es

tos co

mpue

stos e

n el v

ino du

rante

el

enve

jecim

iento

en bo

tella

96

trans

-resv

eratr

ol y

trans

-pice

ido97

cis- y

tran

s- re

sve-

ratro

l y pi

ceido

Hype

rsil C

18Gr

adien

te lin

eal a

ceton

itrilo-

agua

DA

D (2

88 y

306 n

m pa

ra ci

s- y t

rans

-isoacute

mero

s

SP

E 98

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

35

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

trans

-resv

eratr

olC8 El

ucioacuten

isoc

raacutetic

a con

meth

anol

agua

35

65 1

mLmiddot

min-1

DAD

(306

nm)

CLD

(Elua

to +

lumino

l + K

3Fe(

CN) 6)

Linea

lidad

007

5-10

μg

middotmL-1

y 05

-750

ngmiddotm

L-1 en

DAD

y CL

D

resp

ectiv

amen

teLO

D(S

N=3)

25 y

0166

ng

middotmL-1

en D

AD y

CLD

re

spec

tivam

ente

Inyec

cioacuten d

irecta

de m

uestr

as

filtra

das

Conti

ene u

na re

visioacuten

impo

rtante

de

meacutetod

os en

tre 19

96 y

2002

En

cuen

tra en

tre 0

y 160

7 μgmiddot

mL-1

en vi

nos t

intos

chino

s

99

cis- y

tran

s-res

ve-

ratro

lC1

8El

ucioacuten

isoc

raacutetic

a con

25

ac

etonit

rilo 0

1

de H

3PO 4

y Na

Cl (5

mm

olmiddotL-1

) 1 m

Lmiddotmi

n-1

DAD

(306

nm pa

ra am

bos i

soacuteme

ros)

ECD

(elec

trodo

de ca

rboacuten

vitrif

icado

a+0

75 V

)

Linea

lidad

001

-10

μgmiddotm

L-1tra

ns-re

sver

atrol

LOD

(SN

=3) m

enor

es de

30

y 10

0 ngmiddot

mL-1

(306

nm

) y 3

y 15 n

gmiddotmL

-1

(075

V) p

ara t

rans

- y ci

s-re

sver

atrol

resp

ectiv

amen

te

Vino

Filtr

ado e

inye

ccioacuten

dire

cta

Uvas

y ho

jas M

acer

acioacuten

con e

tanol

al 80

Equil

ibrio

entre

los d

os is

oacutemer

os tr

as

5 hor

as de

expo

sicioacuten

a la

luz de

l diacutea

Equ

ilibrio

no in

fluen

ciado

por la

tem

pera

tura

100

Resv

eratr

ol tot

alDA

D (2

87 y

307 n

m pa

ra ci

s- y t

rans

-isoacute

mero

s)

Hidr

oacutelisis

enzim

aacutetica

(-g

lucos

idasa

)de

resv

eratr

ol-glu

coacutesid

osSP

E10

1

cis- y

tran

s- re

sve-

ratro

l y pi

ceido

Fa

se in

versa

DA

D

Se en

cuen

tra de

l 82 a

l 91

de

resv

eratr

ol co

mo gl

ucoacutes

ido en

estos

vin

os es

pantildeo

les de

uvas

Mon

astre

ll10

2

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

36Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

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adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Scre

ening

de

polife

noles

entr

e ell

ostra

ns-

resv

eratr

ol

Fase

inve

rsaDA

D - M

SMS

Piele

s y pe

pitas

de uv

as bl

anca

s y

tintas

Se en

cuen

tran h

asta

13 an

tocian

os

11 aacutec

idos h

idrox

ibenz

oicos

e hid

roxic

inaacutemi

cos y

13 ca

tequin

as y

flava

noles

asiacute

como

2 es

tilben

os en

pie

les y

pepit

as

103

Aacutecido

s org

aacutenico

s y

polife

noles

((-)-

epi-

cateq

uina

quer

cetin

a y

resv

eratr

ol)

Fase

inve

rsa (e

n sil

ica m

odific

ada

con

grup

os fe

nilo)

Grad

iente

de aacutec

ido tr

ifluoa

ceacutetic

o al 0

2

en ag

ua y

aceto

nitrilo

15

mLmiddotm

in-1

DAD

a 210

y 28

0 nm

Linea

lidad

resv

eratr

ol 00

25-0

4 mg

middotmL-1

104

Flavo

noles

an

tocian

inas

aacutecido

s fen

oacutelico

s y

trans

-resv

eratr

ol

C18

Grad

iente

de aacutec

ido ac

eacutetico

al 5

en

ag

ua y

aceto

nitrilo

1 m

Lmiddotmi

n-1

DAD

(313

nm pa

ra tr

ans-r

esve

ratro

l y

aacutecido

s fen

oacutelico

s)

105

cis- y

tran

s- re

sve-

ratro

l y pi

ceido

Es

tudian

el ef

ecto

de di

stinto

s meacute

todos

de m

acer

acioacuten

sobr

e la

conc

entra

cioacuten d

e esto

s cua

tro

estilb

enos

106

Polife

noles

ECD

(dete

ccioacuten

coulo

meacutetric

a mu

ltielec

trodo

) 10

7

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

37

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Resv

eratr

olpic

eido y

fla

vono

ides

Vino

s exp

erim

ental

es de

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so

metid

as a

difer

entes

trata

mien

tos

con p

estic

idas

Conte

nido f

enoacuteli

co to

tal po

r el

meacutetod

o de F

olin-

Cioc

alteu

108

27 co

mpue

stos

fenoacuteli

cos

inclu-

yend

o der

ivado

s de

los aacute

cidos

ben-

zoico

y cin

aacutemico

fla

vona

s y n

uevo

s glu

coacutesid

os

relac

ionad

os

Detec

cioacuten e

lectro

quiacutem

ica m

ultica

nal

con d

etecto

r cou

lomeacutetr

ico

Cerve

za

109

cis- y

tran

s- re

sve-

ratro

l y pi

ceido

C1

8El

ucioacuten

isoc

raacutetic

a etan

olaacutec

ido ac

eacutetico

al

005

237

7 1 m

Lmiddotmi

n-1

DAD

a 306

nm

Linea

lidad

para

los c

uatro

isoacute

mero

s 02-

50 μ

gmiddotmL

-1

LOD

081

120

040 y

04

6 ng p

ara c

is- y

trans

-re

sver

atrol

y cis-

y tra

ns-

piceid

o re

spec

tivam

ente

Hidr

oacutelisis

con

-gluc

osida

sa pa

ra

liber

acioacuten

de ag

licon

as

conte

nidos

de ci

s- y t

rans

- res

ve-

ratro

l ante

s y de

spueacute

s de l

a hidr

oacutelisis

Resv

eratr

ol tot

al 08

4-73

3 y 0

12-6

μg

middotmL-1

en vi

nos t

intos

y zu

mos

resp

ectiv

amen

te

110

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

38Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Comp

uesto

sar

omaacuteti

cos

entre

ell

ostra

ns-

resv

eratr

ol

NMR

NMR

MS

Vino

pre

para

cioacuten d

e extr

acto

fenoacuteli

co co

n ace

tato d

e etilo

Ce

rveza

deg

asific

acioacuten

y co

ncen

tracioacute

n a 2

3 del

volum

en

inicia

l Zu

mo de

uva

diluc

ioacuten co

n agu

a

111

Antoc

ianina

syes

tilben

os (c

is- y

trans

- res

vera

trol y

pic

eido)

Fase

inve

rsaAn

tocian

os D

AD (5

20 nm

) Es

tilben

os F

LD (

exem

3303

74 nm

) 11

2

32 P

olifen

oles d

e ba

jo pe

so

molec

ular

entre

ell

oscis

- y tr

ans-

resv

eratr

ol y

piceid

o

C18

Grad

iente

de ag

ua y

aceto

nitrilo

co

ntenie

ndo a

mbos

1 de

aacutecido

ac

eacutetico

06

mLmiddotm

in-1

PDAD

API

-MS

113

Estilb

enos

(resv

eratr

ol)Inf

luenc

ia de

difer

entes

teacutecn

icas d

e ma

cera

cioacuten e

n el c

onten

ido en

es

tilben

os11

4

Estilb

enos

(res

ve-

ratro

l pice

ido

picea

tanno

l)

DAD-

MSM

SInd

uccioacute

n de e

stilbe

nos m

edian

te irr

adiac

ioacuten U

V po

st-co

sech

a 11

5

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

39

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Flava

noles

an

tocian

inas

y 6

deriv

ados

de

resv

eratr

oltra

ns-

astrin

gina

trans

- y

cis-p

iceido

tran

s-yc

is-re

sver

atrol

y pa

llidol

(diacutem

ero d

e re

sver

atrol)

C18

Grad

iente

de 1

aacutec

ido tr

ifluor

oaceacute

tico

a ace

tonitri

lo1

aacutecid

o trifl

uoro

aceacuteti

-co

802

0 1 m

Lmiddotmi

n-1

DAD

(290

nm)

FLD

( exe

m 290

390

2903

90 2

6040

0 30

0390

260

400 y

2604

00 nm

para

tra

ns-a

string

inatr

ans-p

iceido

cis-

piceid

otra

ns-re

sver

atrol

cis-

resv

eratr

ol y p

allido

l

Linea

lidad

05-

10 0

1-10

1-

10 0

5-10

1-1

0 y 0

5-10

μgmiddot

mL-1

y LO

D (F

LD) 0

01 0

01

003

001

002

y 00

2 μg

middotmL-1

par

a tra

ns-

astrin

gina

trans

-pice

ido

cis-p

iceido

tran

s-re

sver

atrol

cis-

resv

eratr

ol y p

allido

l

Filtra

do e

inyec

cioacuten d

irecta

de la

s mu

estra

sSe

apor

tan po

r prim

era v

ez da

tos

sobr

e con

tenido

de pa

llidol

en vi

nos

tintos

y no

se en

cuen

tra en

vino

s bla

ncos

Conte

nidos

de lo

s isoacute

mero

s de

resv

eratr

ol maacute

s elev

ados

en vi

nos

tintos

116

trans

-resv

eratr

olC1

8Gr

adien

te de

meta

nol

aacutecido

aceacuteti

co

agua

102

88 a

metan

olaacutec

ido ac

eacutetico

ag

ua 90

28

1 mLmiddot

min-1

DAD

(280

nm)

FLD

exem

3603

74 nm

LOD

en m

uestr

as re

ales

20 y

3 ngmiddot

mL-1

en D

AD y

FLD

resp

ectiv

amen

te

SPE-

C18

Nive

l med

io en

contr

ado e

n vino

s tin

tos em

botel

lados

289

μgmiddot

mL-1

117

cis- y

tran

s-re

sver

atrol

y pic

eido

ODS

Hype

rsil

Eluc

ioacuten is

ocraacute

tica

aceto

nitrilo

aacutecido

foacuter

mico

acuo

so 0

5 1

mLmiddot

min-1

25

75DA

D (3

07 nm

)

Vi

nos

uvas

cac

ahue

tes m

antec

a de

caca

huete

y teacute

Uvas

cac

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tes y

teacute co

ntien

en

funda

menta

lmen

tetra

ns-p

iceido

Vi

nos t

intos

son f

uente

de ag

licon

as

29

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

40Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

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adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Oligoacute

mero

s de e

s-tilb

enos

(vini

ferina

y p

allido

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estilb

ina

DAD

Pr

imer

infor

me so

bre c

onten

idos d

e vin

iferin

a y pa

llidol

en di

feren

tes

tipos

de vi

no

118

Resv

eratr

ol tot

al Hy

persi

l ODS

Gr

adien

te de

meta

nol c

on aacutec

ido foacute

r-mi

co al

05

en ag

ua0

25 m

Lmiddotmi

n-1

APCI

-MS

(SIM

mz

229)

Linea

lidad

en el

rang

o 05

2-22

60 pm

ol de

tran

s-re

sver

atrol

Vino

jugo

de uv

a y ju

go de

ar

aacutenda

nos

Hidr

oacutelisis

de vi

no co

n -D

-glu

cosid

asa

extra

ccioacuten

con a

cetat

o de

etilo

eva

pora

cioacuten y

redis

olucioacute

n co

n meta

nol

agua

119

Polife

noles

inc

luyen

do es

tilbe-

nos c

omo t

rans

- y

cis-re

sver

atrol

Colum

na m

onoliacute

tica C

18

Grad

iente

de m

etano

lagu

a 25

975

a 50

50 p

H 3 c

on H

3PO 4

21

mLmiddotm

in-1

DAD

(256

324

y 36

5 nm)

LOD

(SN

=3) 1

0 y 30

ng

middotmL-1

par

a tra

ns- y

cis-

resv

eratr

olre

spec

tivam

ente

Filtra

cioacuten e

inye

ccioacuten

dire

cta de

la

mues

tra12

0

Resv

eratr

ol y

piceid

o

La

conc

entra

cioacuten d

e pice

ido y

resv

eratr

ol en

el vi

no y

zumo

de uv

a de

pend

e del

tiemp

o de e

xtrac

cioacuten d

e la

piel L

os ni

veles

may

ores

se

encu

entra

n en v

inos t

intos

por e

star

maacutes t

iempo

en co

ntacto

con l

a piel

du

rante

la fe

rmen

tacioacuten

79

trans

- y ci

s-re

sver

atrol

y

Mo

sto V

ariab

ilidad

en el

conte

nido

de re

sver

atrol

seguacute

n el p

roce

so de

12

1

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

41

piceid

o fer

menta

cioacuten

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

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adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Resv

eratr

olCo

mbina

cioacuten d

e NP-

HPLC

y RP

-HPL

C

Efec

to de

las c

ondic

iones

me

teoro

loacutegica

s y de

mad

urac

ioacuten en

la

conc

entra

cioacuten d

e res

vera

trol e

n vin

os tin

tos

122

trans

-resv

eratr

ol y

otros

polife

noles

C1

8Gr

adien

te de

meta

nol

aacutecido

aceacuteti

co

agua

102

88 a

902

8 1 m

Lmiddotmi

n-1

DAD

280 n

m

Linea

lidad

trans

-re

sver

atrol

002-

40

μgmiddotm

L-1

Prep

arac

ioacuten de

mue

stra

mejor

es

resu

ltado

s extr

ayen

do co

n eacuteter

etiacute

lico a

pH 2

Valor

es m

edios

de 2

26 3

10 y

380

μgmiddotm

L-1de

trans

-resv

eratr

ol en

vin

os de

Gra

n Can

aria

Lanz

arote

y Te

nerife

res

pecti

vame

nte

123

trans

-resv

eratr

olOD

S-Hy

persy

lGr

adien

te de

aacutecido

percl

oacuterico

(06

mLmiddotL

-1) e

n agu

a y ac

etonit

rilo 1

mL

middotmin-1

DAD

a 310

nm

Linea

lidad

072

-18

μgmiddotm

L-1

LOD

2 ngmiddot

mL-1

SPE-

C18

lavad

o a pH

8 e

lucioacuten

de

trans

-resv

eratr

ol co

n ace

tato d

e etilo

ev

apor

acioacuten

y re

cons

titucioacute

n en

metan

olNi

veles

entre

055

y 25

34 μ

gmiddotmL

-1

124

Polife

noles

entr

e ell

ostr

ans-

y cis-

resv

eratr

ol y

piceid

o

RP-1

8Gr

adien

te de

aacutecido

aceacuteti

co al

1 y 6

en ag

ua y

aacutecido

aceacuteti

co a

gua

ac

etonit

rilo 5

6530

05

mLmiddotm

in-1

DAD

280

y 313

nm

Un

pool

de 14

polife

noles

y 25

vino

s se

some

ten a

un te

st en

fluido

s gaacute

strico

s e in

testin

ales

Se de

termi

-na

la co

ncen

tracioacute

n de p

olifen

oles

antes

y de

spueacute

s del

tratam

iento

125

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

42Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Flavo

noide

s y

estilb

enos

(tra

ns- y

cis

-resv

eratr

ol)

Fase

inve

rsaES

I-MS

MSDA

D (3

20 y

377 n

m pa

ra es

tilben

os y

flavo

noide

s re

spec

tivam

ente)

FL

D

Linea

lidad

50 ng

middotmL-1

ndash50

μgmiddot

mL-1

Detec

cioacuten f

luore

scen

te alt

amen

te se

nsibl

e par

a res

vera

trol

126

Aacutecido

gaacutelic

o tra

ns-re

sver

atrol

quer

cetin

a y ru

tina

ODS

Hype

rsyl

Grad

iente

entre

aacutecido

aceacuteti

co m

etano

l y a

gua

DAD

(306

nm pa

ra tr

ans-r

esve

ratro

l)

01 a

15 μ

gmiddotmL

-1Fil

trado

e iny

eccioacute

n dire

cta de

la

mues

tra12

7

trans

- y ci

s-re

sver

atrol

y pic

eido

C18

grad

iente

de ag

ua a

pH 2

5 con

aacutecido

su

lfuacuteric

o y ac

etonit

rilo 0

2 mL

middotmin-1

DAD

(280

y 30

5 nm

para

cis y

tran

sre

spec

tivam

ente)

SIM

a mz

228

LOD

1202

094

8 25

58

y 083

4 μgmiddot

mL-1

para

trans

- y ci

s-res

vera

trol e

n MS

y DA

D 12

8

Cateq

uina

aacutecido

va

niacutellic

o aacutec

ido

siriacuteng

ico

epica

tequin

a y

trans

-resv

eratr

ol

C18

Grad

iente

de m

etano

l aacutec

ido ac

eacutetico

ag

ua 1

0288

a 90

28

1 mLmiddot

min-1

DAD

280 n

m FL

D

LOD

20 y

3 ngmiddot

mL-1

enDA

D y F

LD

resp

ectiv

amen

te

Extra

ccioacuten

con eacute

ter et

iacutelico a

pH 2

129

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

43

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

trans

-resv

eratr

ol C1

8 El

ucioacuten

isoc

raacutetic

a agu

aace

tonitri

lo 75

25 D

AD a

306 n

m

Co

mpar

acioacuten

RP-

HPLC

-MS

y CE

-MS

Nive

les en

tre 0

82 y

575 μ

gmiddotmL

-113

0

Polife

noles

Extra

ctos e

teacutereo

s Ma

yor e

ficac

ia de

la se

para

cioacuten e

n CE

per

o may

or po

der d

e eluc

idacioacute

n es

tructu

ral e

n LC

22 co

mpue

stos

identi

ficad

os m

edian

te LC

-MC

y solo

13

med

iante

CE-M

S

131

Comp

uesto

sfen

oacutelico

s con

pr

opied

ades

antio

xidan

tes

entre

ellos

tran

s-re

sver

atrol

C18 (

40 ordmC

) Gr

adien

te de

agua

aceto

nitrilo

955

a 50

50 a

pH 1

8 de

955

a 554

5 DA

D (2

80 3

50 y

520 n

m)

Vi

no y

Uva

Inyec

cioacuten d

irecta

de

vinos

y ex

tracto

s de u

va

Dado

el ba

jo pH

de la

fase

moacutev

il los

an

tocian

os so

n dete

ctado

s en f

orma

de

catioacute

n flav

ilium

y ello

no re

fleja

su si

tuacioacute

n en l

a mue

stra r

eal

132

Resv

eratr

ol FL

D ex

cem 2

7037

2 nm

Tr

ansfo

rmac

ioacuten de

resv

eratr

ol en

un

comp

uesto

altam

ente

fluor

esce

nte

con i

rradia

cioacuten u

ltravio

leta i

ntens

a co

n luz

En vi

no g

ener

acioacuten

de un

com-

pues

to sim

ilar p

rove

niente

de pi

cei-

do a

siacute co

mo un

o des

cono

cido

F-3

133

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

44Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

trans

- y ci

s-re

sver

atrol

cateq

uina

epica

tequin

aqu

erce

tina y

rutin

a

ODS-

2Gr

adien

te de

aceto

nitrilo

aacutecido

aceacuteti

co

al 5

de 9

91 a

7030

DA

D (2

80 3

00 y

360 n

m)FL

D ( e

xcem

2803

15 pa

ra ca

tequin

a y

epica

tequin

a 32

4370

para

tran

s-re

sver

atrol

y 260

370 p

ara c

is-re

sver

atrol)

300 n

m LO

D 00

6 y 0

21

gmiddotmL

-1 pa

ra tr

ans-

y cis

-re

sver

atrol

FLD

Ran

go de

linea

lidad

de

001

ndash 1 y

001

ndash 01

gmiddot

mL-1

y LO

D de

3 y 1

ngmiddotm

L-1 p

ara t

rans

- y ci

s-re

sver

atrol

Obten

cioacuten d

e cis-

resv

eratr

ol po

r irr

adiac

ioacuten a

254 n

m du

rante

20 m

in de

trans

-resv

eratr

ol Iny

eccioacute

n dire

cta de

las m

uestr

as

Cateq

uina y

epica

tequin

a pre

sente

s en

todo

s los

vino

s ana

lizad

os

nivele

s de l

a prim

era

cons

idera

bleme

nte su

perio

res

Altos

nive

les de

quer

cetin

a en

much

as m

uestr

as r

utina

se de

tecta

soacutelo

en m

osto

Nive

les de

resv

eratr

ol me

nore

s que

los

del re

sto de

polife

noles

pre

do-

mina

ndo s

iempr

e su f

orma

tran

s

134

Estilb

enoid

es(tr

ans-p

iceido

tra

ns-re

sver

atrol

trans

-astr

ingina

cis

-pice

idoc

is-re

sver

atrol)

C18 (

30 ordmC

) Gr

adien

te de

100

A (aacute

cido a

ceacutetic

o en

agua

a pH

240

) has

ta 10

0 B

(A

meta

nol 2

080)

DA

D 28

6 nm

LOD

(25

L) 8

8 5

5 y

8 ng

para

tran

s-as

tringin

acis

-resv

eratr

ol

trans

-resv

eratr

oltra

ns-

piceid

o y ci

s-pice

ido

resp

ectiv

amen

te

Extra

ccioacuten

con a

cetat

o de e

tilo

evap

orac

ioacuten a

sequ

edad

y re

disolu

cioacuten e

n meta

nol-a

gua

Limpie

za en

resin

a inte

rcamb

iador

a de

catio

nes

135

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

45

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

trans

- y ci

s-re

sver

atrol

y pic

eido

C18 (

40 ordmC

) Gr

adien

te de

aacutecido

aceacuteti

co en

agua

y ac

etonit

rilo

Mu

estra

s de j

ugo d

e uva

blan

ca y

tinta

Inye

ccioacuten

dire

cta de

la m

uestr

a sin

trata

rOb

tencioacute

n de c

is- is

oacutemer

os po

r ex

posic

ioacuten de

los t

rans

- a la

luz

solar

90

de co

nver

sioacuten e

n 10 m

in y c

uanti

ficac

ioacuten de

cis-i

soacuteme

ros

Nive

les en

jugo

s de u

va tin

ta 10

ve-

ces s

uper

iores

a los

de uv

a blan

ca

Canti

dade

s de r

esve

ratro

l com

o glu

coacutesid

o sup

erior

es a

las de

ag

licon

a

136

trans

-resv

eratr

ol C1

8 (40

ordmC)

Grad

iente

linea

l de aacute

cido f

oacutermi

co 50

mM

meta

nol 8

020

a aacutecid

o foacuter

mico

50

mMm

etano

l 208

0 FL

D ( e

xcem

3303

74 nm

)

Pi

eles d

e uva

jugo

de uv

a y vi

no

Vino

SPE

-C18

Co

ncen

tracio

nes d

e tra

ns-re

sver

atrol

en vi

nos j

apon

eses

blan

cos

(Cha

rdon

nay)

y tint

os (C

aber

net

Sauv

ignon

) baja

s de

l ord

en de

las

enco

ntrad

as en

vino

s de l

as m

ismas

va

rieda

des

de C

alifor

nia S

uiza

Fran

cia y

Nuev

a Yor

k

137

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

46Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Dive

rsas

fitoale

xinas

de la

vid

C18

Eluc

ioacuten en

grad

iente

con a

ceton

itrilo

y ag

ua d

esde

el 10

al 85

de

ac

etonit

rilo

FLD

a ex

cem 3

3037

4 nm

para

tran

s-re

sver

atrol

trans

-pter

ostilb

eno y

tran

s--vi

nifer

ina

DAD

a 285

nm pa

ra ci

s-res

vera

trol

Cu

antifi

cacioacute

n de t

rans

-pice

ido a

traveacute

s de l

a rec

ta de

calib

rado

de

trans

-resv

eratr

ol ya

que a

mbos

co

mpue

stos p

rese

ntan s

emeja

ntes

prop

iedad

es flu

ores

cente

s Cu

antifi

cacioacute

n de c

is-pic

eido

utiliz

ando

la re

cta de

calib

rado

de

cis-re

sver

atrol

a 285

nm

138

trans

- y ci

s-re

sver

atrol

y pic

eido

cateq

uina

epica

tequin

aqu

erce

tina y

ru

tina

ODS

Hipe

rsil

Eluc

ioacuten en

grad

iente

entre

aceacuteti

co

metan

ol y a

gua

desd

e 515

80 ha

sta

5455

0DA

D 26

5 28

0 30

6 31

7 y 36

9 nm

LOD

oscil

ando

entre

30

ngmiddotm

L-1 pa

ra tr

ans-

resv

eratr

ol y 1

5 gmiddot

mL-1

para

cateq

uina (

48 7

5 y

135 n

gmiddotmL

-1pa

ratra

ns-

piceid

ocis

-pice

ido y

cis-

resv

eratr

olre

spec

tivam

ente)

40 m

inutos

por c

roma

togra

ma

Recu

pera

cione

s en t

orno

al 10

0

para

todo

s los

anali

tos en

vino

s bla

nco

tinto

y ros

ado

Nive

les es

tables

una v

ez ab

ierta

la bo

tella

dura

nte un

a sem

ana

pero

peacute

rdida

s que

oscil

an en

tre el

10 y

el 40

a

las se

is se

mana

s

139

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

47

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

trans

- y ci

s-re

sver

atrol

como

ag

licon

a y

glucoacute

sido

C18

Grad

iente

entre

aacutecido

aceacuteti

co en

agua

(p

H 24

0)ac

etonit

rilo

Ob

tencioacute

n de c

is-isoacute

mero

s por

ex

posic

ioacuten a

la luz

del s

ol de

los

trans

Cua

ntific

acioacuten

de lo

s isoacute

mero

s de

pice

ido as

umien

do id

eacutentic

os

que p

ara t

rans

- y ci

s-re

sver

atrol

a 30

6 y 28

5 nm

resp

ectiv

amen

teAn

aacutelisis

de vi

nos t

intos

y ro

sado

s sin

tratam

iento

prev

io C

once

ntrac

ioacuten

por e

vapo

racioacute

n de v

inos b

lanco

s pa

ra la

cuan

tifica

cioacuten d

e los

cis-

isoacuteme

ros

140

Isoacuteme

ros d

e re

sver

atrol

ODS

Hipe

rsil (4

0ordm C

)Gr

adien

te de

agua

meta

nol 1

000

a 01

00 en

15 m

inutos

DA

D (3

06 y

286 n

m m

aacutexim

os de

ab

sorci

oacuten de

tran

s- y

cis-re

sver

atrol

re

spec

tivam

ente)

LOD

(SN

= 3)

de 0

6 mo

lmiddotL-1

para

ambo

s an

alitos

a 28

6 nm

Se co

mpru

eba l

a tra

nsfor

macioacute

n de

trans

en ci

s-res

vera

trol p

or

irrad

iacioacuten

con l

uz U

V a 2

54 nm

Se ap

ortan

valor

es de

288

nm y

308

nm de

cis y

tran

sIso

meriz

acioacuten

de ci

s a la

form

a tra

ns- m

aacutes es

table

en m

edio

aacutecido

141

Isoacuteme

ros d

e re

sver

atrol

y pic

eido

Al ig

ual q

ue ot

ros p

olifen

oles

son

buen

os m

arca

dore

s quim

iotax

a-noacute

mico

s del

vino

perm

itiend

o la

distin

cioacuten e

ntre v

aried

ades

de vi

no

blanc

o de d

ifere

ntes D

Oy

bode

gas

142

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

48Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

trans

-resv

eratr

ol C1

8 El

ucioacuten

isoc

raacutetic

a con

ag

uaac

eacutetico

aceto

nitrilo

755

20

DAD

(306

nm)

Se

conc

luye q

ue el

seca

do de

las

uvas

no es

una p

raacutecti

ca qu

e ind

uzca

la

siacutentes

is de

resv

eratr

olNi

veles

en vi

nos d

e uva

s sec

as

(Rec

ioto y

Ama

rone

) entr

e 005

y 08

mg

middotL-1

25

Resv

eratr

ol C1

8 El

ucioacuten

isoc

raacutetic

a con

agua

aceto

nitrilo

55

45

DAD

(307

nm tr

ans-r

esve

ratro

l) 28

0 nm

cis-

resv

eratr

ol)

Se

estud

ia la

influe

ncia

del p

roce

so

de vi

nifica

cioacuten y

el ni

vel d

e po

dred

umbr

e por

Bot

ritis

en la

uva

sobr

e el c

onten

ido en

resv

eratr

ol Vi

nos m

acer

ados

pres

entan

ca

ntida

des1

0 sup

erior

es

143

Isoacuteme

ros d

e re

sver

atrol

y pic

eido

C18 (

40 ordmC

) Gr

adien

te de

aacutecido

aceacuteti

co en

agua

(p

H 24

0) y

aceto

nitrilo

DAD

(306

nm tr

ans

y 285

nm c

is)

LOD

y LOQ

par

a tra

ns-

resv

eratr

ol 3 y

10 ng

middotmL-1

Obten

cioacuten d

e cis

isoacuteme

ros p

or

expo

sicioacuten

de lo

s tra

ns a

la luz

solar

Pr

oduc

cioacuten d

e esti

lbeno

ides e

n uva

pa

rece

depe

nder

de la

varie

dad

posib

le co

ntrol

geneacute

tico d

e su

biosiacuten

tesis

Elev

ados

valor

es de

la re

lacioacuten

tra

nsci

s qu

e apo

yan a

l tran

s com

o uacuten

ico is

oacutemer

o natu

ral n

atura

lmen

te es

el o

riginaacute

ndos

e el c

ispo

rex

posic

ioacuten a

la luz

del m

osto

o vino

39

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

49

Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Resv

eratr

ol

C18

Eluc

ioacuten en

grad

iente

desd

e ac

eacutetico

agua

199

a ac

eacutetico

agua

694

y a

ceacutetic

oagu

aace

tonitri

lo 56

530

DAD

(306

y 26

2 nm)

FL

D ( e

xcem

2703

72 nm

)

Es

tudian

los e

fectos

de la

irrad

iacioacuten

de

resv

eratr

ol y s

us de

rivad

os en

pie

les de

uva

En pr

imer

luga

r se p

rodu

ce la

iso

meriz

acioacuten

de tr

ans a

cis

gene

raacutend

ose a

conti

nuac

ioacuten

deriv

ados

altam

ente

fluor

esce

ntes

144

Isoacuteme

ros d

e re

sver

atrol

y pic

eido

Lichr

osph

ere 1

00 C

N

Eluc

ioacuten is

ocraacute

tica c

on

agua

acton

itrilo

metan

ol 9

055

UVD

(306

nm)

LOD

011 y

016

molmiddot

L-1

para

trans

-resv

eratr

ol y

piceid

o re

spec

tivam

ente

02

0 y 0

30 m

olmiddotL-1

para

cis

-resv

eratr

ol y p

iceido

re

spec

tivam

ente

Gene

racioacute

n de c

is-re

sver

atrol

por

irrad

iacioacuten

de tr

ans-r

esve

ratro

l a 25

4 nm

dura

nte 5-

10 m

inutos

Cu

antifi

cacioacute

n de c

is-re

sver

atrol

basa

da en

la ca

iacuteda de

l tran

sTr

ansfo

rmac

ioacuten de

cis e

n tra

ns-

resv

eratr

ol a 7

0 ordmC

dura

nte 30

mi

nutos

Identi

ficac

ioacuten de

gluc

osido

s me

diante

hidr

oacutelisis

enzim

aacutetica

con

-glu

cosid

asa

145

Resv

eratr

ol y

piceid

oC1

8Gr

adien

te de

aacutecido

aceacuteti

coag

ua 1

99

a aacutecid

o aceacute

ticoa

gua 6

94 y

aacutecid

o ac

eacutetico

agua

aceto

nitrilo

565

30

DAD

(entr

e 230

y 45

0 nm

)

Iny

eccioacute

n dire

cta de

la m

uestr

a sin

tratam

iento

prev

io38

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

50Tabla

2- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

liacutequid

os (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

raacutefic

o C

olum

na

F M

oacutevil

Sist

ema d

e Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

trans

-resv

eratr

ol y

trans

-pter

ostilb

eno

C18

Grad

iente

de m

etano

laacutecid

o foacuter

mico

DA

D (3

056

y 306

4 nm

para

re

sver

atrol

y pter

ostilb

eno)

FL

D ( e

xcem

3303

74 nm

para

ambo

s)

No

es ne

cesa

rio tr

atami

ento

prev

io de

la m

uestr

a de v

ino g

racia

s a la

es

pecif

icida

d de l

a FLD

14

6

Pice

ido

Desc

riben

el pr

imer

proc

edim

iento

de ex

tracc

ioacuten de

pice

ido de

P

Cusp

idatu

m37

trans

-resv

eratr

ol C1

8 El

ucioacuten

con

A (aacute

cido f

osfoacuter

ico 0

2 M a

pH 1

5 por

adici

oacuten de

amon

iaco)

y B

(Aac

etonit

rilo 20

80)

al 23

5

B

DAD

a 306

316

280

y 25

0 nm

trans

-resv

eratr

ol sin

tetiza

doVi

no p

reco

ncen

tracioacute

n en e

l ro

tavap

or li

mpiez

a con

clor

oform

o ex

tracc

ioacuten co

n ace

tato d

e etilo

lav

ado c

on ag

ua sa

turad

a en c

lorur

o soacute

dico

La fa

se or

gaacutenic

a es

evap

orad

a a se

qued

ad y

se

redis

uelve

en ag

uaac

etonit

rilo 1

1

42

Resv

eratr

ol Co

lumna

de siacute

lice L

ichro

sorb

El

ucioacuten

isoc

raacutetic

a con

meta

nolc

lorur

o de

meti

leno 3

97

Vi

no E

xtrac

cioacuten c

on ac

etato

de et

ilo

se re

uacutenen

los e

xtrac

tos or

gaacutenic

os y

se la

vado

con a

gua d

estila

da

Evap

orac

ioacuten a

sequ

edad

se

redis

uelve

en m

etano

l

34

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

51

Tabla

3- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol me

diante

elec

trofor

esis

capil

ar

Anali

to(s

)Si

stem

a elec

trofo

reacutetic

o M

odali

dad

In

yecc

ioacuten

Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

trans

- y ci

s-re

sver

atrol

Crom

atogr

afiacutea e

lectro

cineacuteti

ca m

icelar

Iny

eccioacute

n elec

trocin

eacutetica

(2 kV

5s)

306 n

m14

7

Resv

eratr

olCZ

EIny

eccioacute

n hidr

odinaacute

mica

(4 s

50 m

bar)

305 n

m

Optim

izacioacute

n del

proc

eso S

PE

media

nte re

des n

euro

nales

ar

tificia

les y

disentilde

o de e

xper

imen

tos14

8

trans

-resv

eratr

ol(-)

-epic

atequ

ina y

(+)-c

atequ

ina

Detec

cioacuten e

lectro

quiacutem

ica

Elec

trodo

de di

sco d

e car

boacuten a

+08

5 V

149

Resv

eratr

ol y

piceid

oCZ

E15

0

Polife

noles

entr

e ell

os r

esve

ratro

l NA

CE

Capil

ares

recu

bierto

s a el

evad

o pH

y me

tanol

UV (2

14 y

223 n

m)

LOD

25 μ

molmiddotL

-1

resv

eratr

olSP

EVa

lores

de pK

ade r

esve

ratro

l 922

10

55 1

116

151

Polife

noles

entr

e ell

ostra

ns- y

cis-

resv

eratr

ol

CZE

DAD

LOD

18 y

50 ng

middotmL-1

pa-

racis

- y tr

ans-r

esve

ratro

l15

2

a Des

viac

ioacuten

estaacute

ndar

rela

tiva

bLiacute

mite

de

dete

ccioacute

n c

Liacutem

ite d

e cu

antif

icac

ioacuten

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

52Tabla

3- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol me

diante

elec

trofor

esis

capil

ar (c

ontin

uacioacute

n)

Anali

to(s

)Si

stem

a elec

trofo

reacutetic

o M

odali

dad

In

yecc

ioacuten

Det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

trans

-resv

eratr

ol y aacute

cido s

oacuterbic

o CZ

EDA

D a 3

05 nm

LO

D 00

4 μgmiddot

mL-1

trans

-re

sver

atrol

SPE-

C18

para

resv

eratr

ol e i

nyec

-cioacute

n dire

cta pa

ra aacutec

ido soacute

rbico

Ut

iliza l

a mism

a rec

ta de

calib

rado

de

trans

-resv

eratr

ol pa

ra ci

s-re

sver

atrol

divid

iendo

la pe

ndien

te en

tre la

razoacute

n de l

os co

eficie

ntes d

e ab

sorci

oacutentra

nsci

s a 30

5 nm

(269

)

153

trans

-resv

eratr

olIny

eccioacute

n elec

trocin

eacutetica

(10 k

V 6s

) De

teccioacute

n elec

troqu

iacutemica

Elec

trodo

de

disco

de ca

rboacuten

a +0

85 V

Rang

o line

al 05

-100

μg

middotmL-1

LOD

596

ngmiddotm

L-115

4

Resv

eratr

ol y

piceid

oDA

D

Deter

mina

cioacuten m

edian

te CE

siacutent

esis

y esta

bilida

d de r

esve

ratro

l y pi

ceido

15

5

trans

-resv

eratr

ol Ul

tra-lo

w-te

mpe

ratu

reNA

CE-7

7K F

LD

Ide

ntific

acioacuten

on-lin

e de l

os

fotop

rodu

ctos d

e tra

ns-re

sver

atrol

Se pr

opon

e un e

sque

ma de

fot

orre

accioacute

n par

a res

vera

trol s

imila

r al

de es

tilben

o tra

ns-re

sver

atrol

cis-re

sver

atrol

246-

trihidr

oxife

nantr

eno

156

trans

- y ci

s-re

sver

atrol

NACE

-77K

FL

D

Incluy

e estu

dio de

fotoe

stabil

idad d

e re

sver

atrol

157

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

53

Tabla

4- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

gase

s-mas

as

Anali

to(s

)Si

stem

a cro

mat

ograacute

fico

Col

umna

Ca

ract

eriacutest

icas

Ioacuten

para

det

eccioacute

nPa

raacutem

etro

s ana

liacutetico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Resv

eratr

ol tot

al lib

reHP

Inno

wax (

30 m

x 02

5 mm

x 025

μm

)Me

tano c

omo g

as po

rtado

r An

aliza

dor

de tr

ampa

de io

nes

Para

la cu

anti-

ficac

ioacuten se

selec

ciona

el ioacute

n mz

135

Linea

lidad

entre

125

y 25

0 μgmiddot

mL-1

5 mL d

e vino

se di

luyen

con a

gua

(13)

y la

disolu

cioacuten s

e pas

a por

un

cartu

cho C

18 E

l resv

eratr

ol se

eluy

e co

n meta

nol E

l con

tenido

en vi

nos

oscil

a entr

e 118

y 17

2 mg

L-1

158

trans

-resv

eratr

ol HP

-5MS

(30 m

x 02

5 mm

x 025

μm)

He

lio co

mo ga

s por

tador

Gra

diente

de

tempe

ratur

a des

de 10

0 has

ta 30

0 ordmC

Ion

izacioacute

n med

iante

impa

cto

electr

oacutenico

Se t

raba

ja en

mod

o full

sc

an en

un in

terva

lo de

mz

entre

35 a

550 a

mu

Linea

lidad

entre

002

ndash 20

μgmiddot

mL-1

Micro

extra

ccioacuten

en fa

se soacute

lida

reali

zand

o pos

terior

mente

y en

la

mism

a fibr

a un

a der

ivatiz

acioacuten

con

bis-[t

rimeti

lsilil]

-triflu

oro-

aceta

mida

o co

n anh

iacutedrido

aceacuteti

co

Se re

aliza

una c

ompa

racioacute

n con

cro

matog

rafiacutea

bidim

ensio

nal

159

trans

-resv

eratr

ol HP

-5MS

(30 m

x 02

5 mm

x 025

μm)

He

lio co

mo ga

s por

tador

Ioniz

acioacuten

me

diante

impa

cto el

ectroacute

nico

Se

traba

ja en

mod

o SIM

Gra

diente

de

tempe

ratur

a des

de 11

0 has

ta 30

0 ordmC

se

leccio

nand

o par

a cua

ntific

ar el

ioacuten

de m

asa m

olecu

lar 44

4 y pa

ra id

en-

tifica

r los i

ones

de m

asa 4

43 y

446

Linea

lidad

entre

10

pgmiddotm

L-1 y

1 μgmiddot

mL-1

LOD

5 pg

middotmL-1

Micro

extra

ccioacuten

en fa

se soacute

lida

reali

zand

o pos

terior

mente

y en

la

mism

a fibr

a un

a silil

azioacuten

con b

is-[tr

imeti

lsilil]

-triflu

oro-

aceta

mida

La

deso

rcioacuten

se re

aliza

a 28

0 ordmC

dura

nte 7

min

160

CAPIacute

TULO

I In

trodu

ccioacuten

54Tabla

4- A

naacutelis

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fiacutea de

gase

s-mas

as (c

ontin

uacioacute

n)An

alito

(s)

Sist

ema c

rom

atog

raacutefic

o C

olum

na

Cara

cter

iacutestica

s Ioacute

n pa

ra d

etec

cioacuten

Paraacute

met

ros a

naliacutet

icos

de ca

lidad

Obse

rvac

ione

s Mu

estra

Tra

tam

iento

Refe

renc

ia

trans

- y ci

s-

resv

eratr

olDB

-5HT

(30 m

x 02

5 mm

x 010

μm)

Gr

adien

te de

110 h

asta

300 ordm

C S

IM

(ioacuten d

e mas

a mole

cular

444)

ione

s de

masa

445 y

446 p

ara i

denti

ficar

LOD

10 ng

middotmL-1

SPE-

C18

elucioacute

n con

aceta

to de

eti-

lo y e

vapo

racioacute

n a se

qued

ad D

eri-

vatiz

acioacuten

con b

is-[tr

imeti

lsilil]

-triflu

o-o-

aceta

mida

a 70

ordmC du

rante

60 m

in

161

trans

-resv

eratr

ol DB

-5Gr

adien

te de

temp

eratu

ra de

sde 1

90

hasta

315 ordm

C P

ara c

uanti

ficar

ioacuten d

e ma

sa m

olecu

lar 22

8 ion

es cu

alitat

ivos

de 22

9 y 22

7 de m

asa

Linea

lidad

hasta

10

μgmiddotm

L-1SP

E-C1

8 elu

cioacuten c

on ac

etato

de

etilo

e intr

oduc

cioacuten d

irecta

del

extra

cto en

el cr

omatoacute

grafo

Se a

na-

lizan

vino

s de l

os pr

incipa

les pa

iacuteses

prod

uctor

es E

l con

tenido

en vi

nos

blanc

os es

infer

ior a

01 μ

gmL-1

162

trans

- y ci

s-

resv

eratr

olDB

-17(

15 m

x 02

5 mm

x015

μm)

Gr

adien

te de

150 h

asta

305 ordm

C

Detec

tor de

mas

as de

cuad

rupo

lo Lo

s da

tos se

adqu

ieren

en m

odo S

IM (ioacute

n de

mas

a mole

cular

228)

ione

s de

masa

227 y

229 p

ara i

denti

ficar

LOD

10 ng

middotmL-1

SPE-

C18

elucioacute

n con

aceta

to de

eti

lo e i

ntrod

uccioacute

n dire

cta de

l ex

tracto

en el

crom

atoacutegr

afo

Tiemp

os de

reten

cioacuten d

e cis

y tra

ns

43 y

57 m

in re

spec

tivam

ente

45

trans

-resv

eratr

olDB

-5 (3

0 m x

025 m

m x 0

25 μ

m)

Detec

tor de

mas

as de

cuad

rupo

lo

Grad

iente

de te

mper

atura

desd

e 150

ha

sta 30

5 ordmC

Se s

elecc

iona p

ara

cuan

tifica

r el ioacute

n de m

asa m

olecu

lar

228

Linea

lidad

hasta

10

μgmiddotm

L- 1LO

D 0

05 μ

gmiddotmL

-1

SPE-

C18

elucioacute

n con

aceta

to de

eti

lo e i

ntrod

uccioacute

n dire

cta de

l ex

tracto

en el

crom

atoacutegr

afo (1

μl de

l 1er

ml e

luido

) 43


55












56













57





plusmn 01 mg

















58












c) Disoluciones







d) Disolventes





59









Colorado Usa 2001








60





61



62




63




64








65




66






67






68








69





CAPIacuteTULO II




72


73







74






75








76





77

disolvente



240 280 320 360 400λ (nm)

0

004

008

012

Abso

rban

cia


78



200 250 300 350 400 450λ (nm)

0

40

80

120In

teni

sidad

de

Fluo

resc

encia


79




0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

01

02

03

Abso

rban

cia

306 nm

343 nm

B

250 300 350 400λ (nm)

0

005

01

015

02

025

Abso

rban

cia

10 - 70

92

100

122A

2 4 6 8 10 12 14pH

0

005

01

015

02

025

Abso

rban

cia

343 nm

306 nmB

102

20 - 60121

250 300 350 400λ (nm)

0

01

02

03

Abso

rban

cia

A


80








81




004

008

012

016

02

024

Abso

rban

cia (3

06 n

m)

004 008 012 016 02 024Absorbancia (343 nm)

H3ReHRe2-

H2Re-


82







200 300 400 500 600λ (nm)

0

200

400

600

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia

gt 100

lt 60A

0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

200

400

600

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia




83






200 300 400 500 600λ (nm)

0

50

100

150

200

250

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia

gt 100

lt 60A

0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

50

100

150

200

250

Inte

nsid

ad d

e Fl

uore

scen

cia



B


84





FOTO

METR

IacuteA


pKa2= 97



FLUO

RESC

ENCI

A







85





86



trans-resveratrol









Linealidad 993 986






87







88






89



240 280 320 360λ (nm)

0

01

02

03

Abso

rban

cia

A

240 280 320 360λ (nm)

0

01

02

03

Abso

rban

cia

B

240 280 320 360λ (nm)

0

01

02

03

Abso

rban

cia

C

240 280 320 360λ (nm)

0

01

02

03

Abso

rban

cia

D


90





91



200 300 400 500λ (nm)

0

100

200

300

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia


92




0

100

200

300

400

500

I F (

364 n

m) (λ

exc =

260 n

m)

A

0 20 40 60 80 100 v Etanol

0

100

200

300

400

500

I F (

364 n

m) (λ

exc =

260 n

m)

B


93








94





240 260 280 300 320 340 360λ (nm)

0

004

008

012

Abs

orba

ncia

35

84

98

107

110

A

0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

004

008

012

Abso

rban

cia

261 nm

303 nm

B


95






200 250 300 350 400 450λ (nm)

0

200

400

600

800

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia

lt 70

gt 120

99

0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

200

400

600

800

I F (

364

nm) (

λ exc=

260

nm

)

A B


96







97








Linealidad 985







98






99








100







330 360 390 420 450λem (nm)

0

200

400

600

800

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia

A

330 360 390 420 450λem (nm)

-8

-4

0

4

8

2 D

B


101







102




2 3 4 5 6 7pH

0

20

40

60

80

100

120

R

ecup

erac

ioacuten


103











104







105








Linealidad 976








es 48


106







107


320 360 400 440λem (nm) (λexc= 260 nm)

0

200

400

600

800

Inten

sidad

de

Fluo

resc

encia

-10

0

10

201D

320 360 400 440λ


-1

-05

0

05

1

152D

320 360 400 440λem (nm) (λexc= 260 nm)


108




109




063 107 (5) 109 (4)

094 110 (4) 108 (8)

16 104 (2) 111 (3)

31 98 (4) 105 (3)

Tinto

47 104 (3) 101 (3)

013 100 (8)

019 94 (7)

031 102 (4)

063 96 (5)

Blanco




CAPIacuteTULO III




112


113






114






115






116



240 280 320 360 400λ (nm)

0

002

004

006

008Ab

sorb

ancia


117



0

4

8

12

16

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia

200 300 400 500λ (nm)


118






240 280 320 360 400λ (nm)

0

004

008

012

016

02

Abso

rban

cia

lt 70 gt 120

105

A

0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

004

008

012

016

02

Abso

rban

cia

344 nm

306 nm

B


119






240 280 320 360 400λ (nm)

0

004

008

012

016

02

Abso

rban

cia

lt 70 gt 110

98

A

0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

004

008

012

016

02

Abso

rban

cia

306 nm

344 nm

B


120


200 300 400 500 600λ (nm)

0

200

400

600

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia

gt 110

gt 60

A

0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

200

400

600

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia

λexcem= 344457 nm

λexcem= 318405 nm

B

200 300 400 500λ (nm)

0

20

40

60

80

100

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia

lt 70gt 115

A

0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

20

40

60

80

100

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia

λexcem= 292392 nm

λexcem= 344447 nm

B


121





FOTO

METR

IacuteA




FLUO

RESC

ENCI

A




122








123











Linealidad 996 984






124









125





126






127


240 280 320 360λ (nm)

0

003

006

009

Abso

rban

cia

D

A

0

003

006

009

Abso

rban

cia

240 280 320 360λ (nm)

B

240 280 320 360λ (nm)

0

003

006

009

Abso

rban

cia

C

240 280 320 360λ (nm)

0

003

006

009

Abso

rban

cia


128







200 300 400 500λ (nm)

0

400

800

1200

1600

Inten

sidad

de F

luore

scen

cia


129





130








0

200

400

600

I F (

361 n

m) (λ

exc =

261 n

m)

A

0 20 40 60 80 100 v Etanol

0

200

400

600

I F (

361 n

m) (λ

exc =

261 n

m)

B


131



240 260 280 300 320 340 360λ (nm)

0

01

02

03Ab

sorb

ancia

0 2 4 6 8 10 12 14pH

008

012

016

02

024

028

Abso

rban

cia

261 nm

282 nm

80

100104

108111

gt 12


132




0 2 4 6 8 10 12 14pH

0

200

400

600

I F (3

61 n

m) (λ

exc=

261 n

m)

200 250 300 350 400 450λ (nm)

0

200

400

600Int

ensid

ad de

Fluo

resc

encia

lt 80

gt 115

99


133







134









Linealidad 984







135



Estudios previos



136











137


y en general






138







139







140










nm


141



Experiencia Nordm




Low A 1 0026 25 155

High A 2 019 25 155

Low B 3 011 25 12

High B 4 011 25 298

Low C 5 011 099 155

High C 6 011 40 155

Cube 1 7 006 16 70

Cube 2 8 016 16 70

Cube 3 9 006 16 240

Cube 4 10 016 16 240

Cube 5 11 006 34 70

Cube 6 12 016 34 70

Cube 7 13 006 34 240

Cube 8 14 016 34 240

Central a 15 011 25 155

Central b 16 011 25 155

Central c 17 011 25 155


142










143



Variable Valor p




AB 04561

AC 09239

BC 07689

AA 02931

BB 01602

CC 03235





144



145








146










Linealidad 980





RSD (n = 11) 59





147





148












149

Interferencias





CAPIacuteTULO IV



HPLC


152


153

ANTECEDENTES






154




155




156



157






158



159




160






0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14t (min)

0

3

6

9

12

15

18

A (3

06 nm

)

0

1

2

3

4

5

F I (λ e

xcem

260

364

)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14t (min)

0

10

20

30

40

F I (λ e

xcem

260

364

)

0

3

6

9

A (30

6 nm

)

A

B

FP1

FP2

FR


FR

cis-resveratrol

FP2

cis-piceido


161










162





OH

OHGlc

O

-524401 1194 FP2

HO

OH

GlcO

-524298 4524 FP1



HO

OH

OH

OH

OH

HO

OH

OHHO

hν hν

hν hν

OH

OHGlc

O

OH

OHGlc O

OH

OHGlc

O

HO

OH

GlcO


163






164




0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14t (min)

0

20

40

60

80

100

A (3

06 n

m)

0

20

40

60

80

F I (λ e

xcem

260

364

)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14t (min)

2 3 4 5 6 7

07


trans-resveratrol

B

A


165




166







12

24

36

v

Aacutecid

o Aceacute

tico

16 20 24 28

12

24

36

tRkRF ssum

=middot


167



168




169






0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20t (min)

0

4

8

12

16

F I

(λex

cem 2

6036

4)

FP1

FP2

FR


170




171



Resveratrol Piceido












172






0

500

1000

1500

2000

2500

Aacuterea

FR


0

500

1000

1500

2000

2500

Aacuterea

FP2


173





(μgmL-1)

Encontrado en vino


()a Puesto en vino

(μgmL-1)

Encontrado en vino


()a







174









175



0 4 8 12 16 20t (min)

0

20

40

60

80

I F (λ e

xcem

2603

64)

0 4 8 12 16 20t (min)

0

20

40

60

80

I F (λ e

xcem

2603

64)

0 4 8 12 16 20t (min)

0

20

40

60

80

I F (λ e

xcem

2603

64)

A

B

C

16 20

1

6 8 10

0

5

FP1FP2

FR


176



65 7 75 8t (min)

0

20

40

60

80

I F (λ e

xcem

2603

64)

280 320 360 400 440λ (nm)

0

4

8

12

16

20

I F

A B


177



CAPIacuteTULO V




180


181

ANTECEDENTES











182







183









184





185





186








187






0

20

40

60

80

I F (

λ exce

m 260

364 n

m)



188





0 2 4 6 8 10 12 14 16 18tiempo (min)

0

2

4

6

8

I F (

λ exce

m 260

364 n

m)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18tiempo (min)

0

4

8

12

A (3

06 nm

)

trans-Piceido

trans-Resveratrol

A

B


(trans-Piceido)hν



189







190



0 2 4 6 8 10 12 14 16 18tiempo (min)

0

2

4

6

8

I F (

λ exce

m 260

364 n

m)

4 45 5 550

2

4

6


191







son


192






193






194


norm

hPthRtPicts

APAPRRF ⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ ++= minusminus

minus2

)()()(




195




196


Variable Valor p

ACN 00310 H3PO4 00765






197




198




0 2 4 6 8 10 12 14 16tiempo (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

I F (

λ exce

m 260

364 n

m)

trans-Piceido

trans-Resveratrol

desconocido


199



200



0 5 10 15 20 25t (min)

0

2

4

6

8

I F (

λ exce

m 260

364 n

m)

0 5 10 15 20 25t (min)

0

10

20

30

40

I F (

λ exc

em 26

0364

nm)

3 6t (min)0

25

A

B


201




202



36 35 34 33 32103T (K-1)

1

10

100

2

3456789

20

30405060708090

k

10

100

1000

20

30405060708090

200

300400500600700800900

P (ba

r)


203













204




μgmiddotmL-1 102


111 μgmiddotmL-1



(472plusmn037) x102

(346plusmn11) x102



x102

I N T R A - D



(479plusmn086) x102

(343plusmn17) x102



x102

I N T E R - D

RSD (Altura) 183 69 181 175


205






206





207



208








min0 5 10 15 20 25 30 35 40

LU

0

50

100

150

200

250

300



209





0 10 20 30 40t (min)

0

40

80

120

160

200

I F (

λ exce

m 260

364 n

m)

trans-piceido

cis-piceido

trans-resveratrol

cis-resveratrol

Desconocido


210







211






212




trans cishlt


240 280 320 360λ (nm)

0

7

14

21

A (m

Au)

240 280 320 360λ (nm)

0

1

2

3

4

5

6

7

A (m

Au)


213


trans cis

Inicialmente ct0

rans 0











214




i = ε λcis

i entonces






yArea Area

Areaxtrans cis

trans=

+0 100

yb m b m


trans trans=


ε εε

λ λ

λ 0 100

ym m

mxtrans cis

trans=

+0 100


215







216







0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

Aacuterea

de

Pico


217




500

1000

1500

2000

2500

3000

Aacuterea

de

Pico

(FLD

)


0

400

800

1200

1600

2000

Aacuterea

de

Pico

(FLD

)



218











219






220




221




0

1000

2000

3000

Aacuterea

de P

ico (F

LD)

cis-Piceido


0

1000

2000

3000

4000

Aacuterea

de P

ico (F

LD)

trans-Piceido


0

1000

2000

3000

4000

5000

Aacuterea

de P

ico (F

LD)

cis-Resveratrol


0

2000

4000

6000

Aacuterea

de P

ico (F

LD)

trans-Resveratrol


222




min0 5 10 15 20 25 30 35

mAU

0

1

2

3

4

5trans-Piceido

trans-Resveratrol

306 nm

min0 5 10 15 20 25 30 35

mAU

0

1

2

3

4

5


290 nm


223






0

2

4

6

8

Altur

a de P

ico (D

AD30

6nm)

trans-Piceido


0

04

08

12

Altur

a de

Pico

(DAD

290n

m)

cis-Piceido


0

2

4

6

Altur

a de P

ico (D

AD30

6nm)

trans-Resveratrol


0

04

08

12

Altu

ra de

Pico

(DAD

290n

m)

cis-Resveratrol


224






0

2000

4000

6000

8000

Aacuterea

de P

ico (F

LD)


225






0

200

400

600

800

1000

Aacuterea

de P

ico (F

LD)


0

500

1000

1500

2000

2500

Aacuterea

de

Pico

(FLD

)


0

400

800

1200

1600

2000

Aacuterea

de P

ico (F

LD)


0

400

800

1200

1600

2000

Aacuterea

de

Pico

(FLD

)


226












CAPIacuteTULO VI




228


229





230


analysis)




231




232





233





234






235







236





237






238




239





240







241




242






243


F = sum=

N









244




245





246




300 350 400 450 500λem (nm)

I F R

elativ

a

240 260 280 300 320 340λexc (nm)

I F R

elati

va


247





248






249



250




251






252



253





254




255




256






257



258







259













No-Flavonoides



rutina - -




Flavonoides

Antocianos







260




261


200 300 400 500λ (nm)

0

200

400

600

800

F I

Catechin

200 300 400 500λ (nm)

0

100

200

300

400

500

F I

Epicatechin

200 300 400 500λ (nm)

0

100

200

300

F I

p-Coumaric Acid

200 300 400 500λ (nm)

0

200

400

600

800

1000

F I

Gentisic Acid

200 300 400 500λ (nm)

0

200

400

600

800

1000

F I


200 300 400 500λ (nm)

0

100

200

300

F I

Vanillic Acid


262



263






264




300 350 400 450 500λem (nm)

I F R

elativ

a


265







266




267





268



269



I F R

elativ

a

240 260 280 300 320 340 360λ (nm)

I F R

elativ

a

300 350 400 450 500λ (nm)


270





271





272



273


CAPIacuteTULO VII




276


277

ANTECEDENTES






278











279








280







281







282




283





05 06 07 08 09E (V)

3E-006

35E-006

4E-006

45E-006

5E-006

55E-006

I (A)

05 06 07 08 09E (V)

0

2E-007

4E-007

6E-007

8E-007

I (A)


284




285




286



06 07 08 09E (V)

3E-006

4E-006

5E-006

6E-006

7E-006

I (A)

38E-006

4E-006

42E-006

44E-006

I (A)


287




288




0 10 20 30 40 v Etanol

300

400

500

600

700

I (nA

)


289





0 10 20 30 40 50 v Etanol

0

100

200

300

400

500

I (nA

)


290







06 07 08 09E (V)

88E-006

92E-006

96E-006

1E-005

104E-005

108E-005I (

A)

345E-007

35E-007

355E-007

36E-007

365E-007

37E-007

I (A)

06 07 08 09E (V)

-5E-008

0

5E-008

1E-007

15E-007

2E-007

25E-007

I corre

gido (

A)


291






06 07 08 09E (V)

36E-006

38E-006

4E-006

42E-006

44E-006

46E-006

I (A)


-2E-008

0

2E-008

4E-008

6E-008

8E-008

I (A)


292








05 06 07 08 09E (V)

6E-006

7E-006

8E-006

9E-006

1E-005

11E-005

12E-005

I (A)

0 s10 s60 s120 s

-4E-008

0

4E-008

8E-008

12E-007

16E-007

I corre

gido (A

)


293







0

100

200

300

I p (nA

)


294







06 07 08 09E (V)

-2E-007

0

2E-007

4E-007

6E-007

I (A)


295






20 135 40 175 60 221 80 160




296





297





298








299










300



301






302




05 06 07 08 09E (V)

12E-005

13E-005

14E-005

15E-005

16E-005

17E-005I (

A)

065 07 075 08 085E (V)

128E-005

13E-005

132E-005

134E-005

136E-005

I (A)


303




06 07 08 09E (V)

12E-005

125E-005

13E-005

135E-005

14E-005

145E-005

I (A)


304






06 07 08 09E (V)

115E-005

12E-005

125E-005

13E-005

135E-005

14E-005

145E-005

I (A)


305






0

100

200

300

400

500

I (nA

)



306









Linealidad 9608









307





065 07 075 08 085 09E (V)

-5E-008

0

5E-008

1E-007

15E-007

2E-007

I (A)


308








0

100

200

300

400

I p (nA

)


309




310






311











312




0 4 8 12 16 20t (minutos)

20

40

60

80

I F (λ

exce

m 260

364 n

m)


313


-09 -08 -07 -06E (V)

-12E-008

-8E-009

-4E-009

0

I (A)


-09 -08 -07 -06E (V)

-3E-008

-2E-008

-1E-008

0

I (A)


CONCLUSIONES






ANEXO


ORIGINAL PAPER







Resveratrol Wine

Introduction









Experimental

Reagents




Wine samples


Apparatus




a bOH

HO

OH

OH

OH

HO






















250 300 350 400 450λ (nm)

0

01

02

03

Abs

orba

nce

0

200

400

600

Fluo

resc

ence

Int

ensi

ty

200 300 400 500 600λ (nm)

20-65

92

122

36

109


2 4 6 8 10 12 14pH

004

008

012

016

02

024

Abs

orba

nce

004

008

012

016

02

024

Abs

orba

nce

(306

nm

)

004 008 012 016 02 024Absorbance (343 nm)








Photometric study









LODa

(ng mLminus1)LODb

(ng mLminus1) RSDc




0127plusmn0001 09989 0058 014 44 (14)







0182plusmn0004 09907 22 50 48 (192)




Fluorescence study




250 300 350 400 450λ (nm)

0

01

02

03

Abs

orba

nce

0

005

01

015

Abs

orba

nce

225 250 275 300 325 350λ (nm)

(5)

(1)(2)

(3)(4)

20-70

98116

a b














200 250 300 350 400 450 500

λ (nm)

0

100

200

300

Flu

ore

scen

ce I

nte

nsi

ty

100

200

300

400

500

F I

(λ e

xc

em=

2603

64 n

m)


(1)

(2)30-50

3

100





Conclusions




Recovery ( RSD)


109 (4)b

094 110 (4)a

108 (8)b

16 104 (2)a

111 (3)b

31 98 (4)a

105 (3)b

47 104 (3)a

101 (3)b

White 013 100 (8)019 94 (7)031 102 (4)063 96 (5)094 102 (3)


320 360 400 440λ em (nm) (λ exc= 260 nm)

0

200

400

600

800

Flu

ores

cenc

e In

tens

ity

-10

0

10

20

1D

320 360 400 440λem (nm) (λ exc= 260 nm)

-1

-05

0

05

1

15

2D

320 360 400 440 em (nm) (λ exc= 260 nm)λ





References








































Abstract


Keywords Pi

1 Introdu




0039-9140$doi101016j













ly fr

eid h

ction




intensipharm


Pic

















In the dedesign (Ce

dolothe] Thimument

erim

hem


um tultin

ine

eralite wlme

nt porevi

Sam

stru






2 Exp

21 C

Forsolvenpore M



22 W


23 In


FluorescVarian Car

5ndash682









ental

icals






samples





8) 67





24 Procefluorimetri

241 CaliIn a qua


242 Recpiceid in w


in ans w


ofmL

rredt by

rd souted260movThe

algoe co

1 nmine

ults

eterd flu


ium he to












3 Res

31 Dinduce






5ndash682 677





and discussion















f theorpt

ed atoprin a


remeh reonta(vv

minus1





ia


yield oAbs



Wittions c4060


010 mol Laqueous hy






5ndash682


















a Experime





32 Applic




nse S

ptim

thehase

comulta




FI(











pH ofhydrog


33 O




RF =


(λexc











680 8) 675ndash682




34 Deter



Table 3Optimization

Effect
















11750 1 11750 6614 00422me) 362705 1 362705 0204 06673) 47950 1 47950 26981 00020

1128 1 1128 0635 0456117645 1 17645 0009929 09239167952 1 167952 009451 076892359 1 2359 1327 029314562 1 4562 2567 016022055 1 2055 1156 0323510660 6 1777

ed) 77260 15 5150














4 Conclu



ccordrepo

RShenminus1)

t usetheendpre

wled

authrojecRod

Desaships als

nces

La RobMazz

Lare Bo Morcol J



Hady E

MedT Ribteren6








sions




Ackno


Refere

[1] RM184

[2] JL[3] G[4] RM

Tor[5] JF

Mi[6] Y K

Me[7] Y[8] M

(19[9] F O

(19[10] C

527[11] JM

Pronol

[12] HPh

[13] AMCoand

[14] Mcau266


[15] J BurnsChem 5

5ndash682 681






gements










682 8) 67

[16] X VitraJM Me

[17] M AberChromat

[18] X VitraChim A

[19] P JeandG Maum

[20] MN BrChim A

[21] C Domı303

[22] MA PoAgric F

[23] V BrandJ Agric

RoggP B Mo







[24] JP[25] GE[26] DC

Ne[27] Un

hei[28] RF[29] J C

Re[30] JP[31] T

Ch[32] T



5ndash682








Original Paper





DOI 101002jssc200700285

1 Introduction






















2 Experimental




22 Wine samples




























RF = (k N RRs)t























Resveratrol Piceid




Young redwine

Barrel-agedred wine

White wine



Resveratrol Piceid




Slope calibrationb)



















5 References



















































Analytical Methods






Abstract



1 Introduction




















2 Experimental






22 Wine samples













251 Red wines


252 White wines


















0 10 12 14 16 18t (min)

0

2

4

6

8

10

F I

(λex

cem

260

364

nm

)F

I (λ

exc

em 2

603

64 n

m)


t (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

t-Piceid

t-Resveratrol

unknown

A

B

8642

0 10 12 14 16 188642







2

norm

















0 10 20 30 40t (min)

0 10 20 30 40t (min)

-2

0

2

4

6

8

A 290

nm (m

Au)

240 3600

4

240 3600

4

240 3600

05

240 3600

05

0

40

80

120

160

200

F I

(λex

cem

260

364

nm

)

t-Pic

c-Pic

t-Res

c-Res

Unknown

t-Pic

c-Pic

t-Res

c-Res

A

B












samples



240 280 320 360λ (nm)

0

7

14

21

A (m

Au)

A (m

Au)

240 280 320 360λ (nm)

0

1

2

3

4

5

6

7






y = (28202 plusmn 1851)x+ (3203 plusmn 1047)

y = (43669 plusmn 1126)x (4329 plusmn 1170)

y = (19025 plusmn 2415)x+ (1664 plusmn 1167)


a SN = 3b SN = 10





4 Conclusions




Acknowledgement




References























t-Piceid(lg mL1)

c-Piceid(lg mL1)














WINES

1- INTRODUCTION














































wines2
































21- WINE SAMPLES


























intensity)











24- HPLC ANALYSIS











3) respectively









was used throughout








the calculations10











F = sum=

N

























SCORE VALUES










package21

































nm for all samples







32- PARAFAC RESULTS
















each other


















































































































or even at 275 nm





























CONCLUSIONS











ACKNOWLEDGEMENTS
















Phenolic Acids


Non-Flavonoids




Flavonoids

Anthocyanins



Sample 1

Sample 7

Sample 17

Sample 19


EXCITATION

EMISSION





200 300 400 500λ (nm)

0

200

400

600

800F

ICatechin

200 300 400 500λ (nm)

0

100

200

300

400

500

F I

Epicatechin

200 300 400 500λ (nm)

0

100

200

300

F I

p-Coumaric Acid

200 300 400 500λ (nm)

0

200

400

600

800

1000

F I

Gentisic Acid

200 300 400 500λ (nm)

0

200

400

600

800

1000

F I


200 300 400 500λ (nm)

0

100

200

300

F I

Vanillic Acid


min10 20 30 40

mAU

50

60

70

80

90


min10 20 30 40

mAU

45505560657075


min10 20 30 40

mAU

392

393

394

395

396

397

398



Portada

Visado

Informe



IacuteNDICE



Resveratrol en vino





a) Aparatos

b) Reactivos

c) Disoluciones

d) Disolventes


Bibliografiacutea


ANTECEDENTES







ANTECEDENTES







ANTECEDENTES








ANTECEDENTES








ANTECEDENTES










ANTECEDENTES







CONCLUSIONES



Talanta 74 (2008) 675-682

J Sep Sci 30 (2007) 3110-3119

Food Chem 109 (2008) 825-833





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