denominaciÓn del proyecto - cluster de la...

1

DENOMINACIÓN DEL PROYECTO:

“Desarrollo de un Centro de Investigación y Servicios en Nuez Pecán en la

Provincia de Entre Ríos”

RESULTADOS

AISLAMIENTOS

Los productores intervinientes en el proyecto fueron visitados (Figura 1), junto con

personal de la Estación Experimental INTA Concordia, y se recorrieron sus fincas

realizando un monitoreo de desórdenes sanitarios presentes, lo que permitió

revelar información con respecto a las enfermedades presentes, su incidencia y/o

severidad, las condiciones de cultivo, las variables ambientales, entre otros.

Figura 1. Visita a productores intervinientes en el proyecto.

Durante las visitas también se tomaron muestras para su procesamiento en el

Laboratorio.

2

Se tomaron muestras de tallo, hojas y frutos para describir los síntomas y signos e

identificar agentes responsables de los mismos y determinar enfermedades claves

provenientes del campo. El trabajo con estas muestras comenzó con la evaluación

de distintas técnicas de siembras y asilamientos para el diagnóstico de los

desórdenes desconocidos.

Para facilitar la expresión de microorganismos, distintas muestras fueron colocadas

en cámara húmeda (Figura 2). Esto consistió en colocar esas muestras en bandeja

plástica de 26,5 cm de largo, 18 cm de ancho y 5 cm de alto de dimensiones, se

incorporó en su interior una delgada capa de algodón y encima una toalla de papel

absorbente. Posteriormente se humidificó y se colocó la muestra en estudio, se

rotuló y el conjunto se incubó en condiciones óptimas de temperatura, humedad

relativa y fotoperiodo, según requerimiento, para que se desarrolle la enfermedad.

Figura 2. Acondicionamiento de muestras en cámaras húmedas.

3

A partir de las expresiones desarrolladas en las cámaras húmedas se realizó la

siembra medios de cultivo para dar inicio al proceso de aislamiento e identificación

(Figura 3).

Figura 3. Siembra de muestras en medios de cultivo.

Simultáneamente se realizó siembra directa de las muestras, obteniéndose

desarrollos como los señalados en la (Figura 4).

4

Figura 4.Siembra directa de las muestras.

5

Luego, se llevaron adelante numerosos repiques en tubos pico de flauta y

purificación de cultivos (Figura 5).

Figura 5. Repiques en tubos pico de flauta y purificación de cultivos.

Una vez aislado el microorganismo, se procedió con la purificación de los cultivos.

Para ello, se recurrió a la técnica de cultivo a partir de una única espora (cultivos

monospóricos).

6

A partir de una suspensión concentrada de microorganismos se realizaron una serie

de diluciones para obtener una menor concentración de esporas. Cada una de estas

diluciones se sembró en superficie en una placa con medio agar-agua. Transcurridas

las 24 horas de incubación se observaron las esporas al microscopio para luego ser

trasladadas a una placa con un medio de cultivo apto para el desarrollo de las

mismas.

Mediante observación macro y microscópica (Figura 6) y el empleo de claves

taxonómicas se fue realizando la identificación de microorganismos encontrados.

Figura 6. Lupa y microscopios utilizados para las observaciones macro y

microscópicas.

El trabajo minucioso y sistemático realizado permitió obtener cepas de aisladas de

nuez pecán cultivas en la provincia de Entre Ríos.

7

SÍNTOMAS

Durante la visita al establecimiento y en la recorrida en campo, junto al productor se

tomaron muestras de fruto, tallo y hoja con síntomas de enfermedad. También se

fotografiaron in situ, sintomatología observada, insectos en hojas, como así también

se registraron el manejo de los lotes con las distintas variedades, entre otros.

Posteriormente, las muestras fueron acondicionadas para su estudio fitopatológico.

FINCA 1

En la visita se encontraron ramas secas, con hojas adheridas, afectando a las

distintas variedades. Este síntoma se asoció a daño por insectos en ramas

(“taladros”), que generaron galerías internas y provocó la muerte de ramas

terminales. No fue posible colectar ejemplares de larvas o adultos para su

identificación.

Material recolectado:

Variedad Material recolectado

Choctaw

Descripción de síntomas:

8

Variedad Choctaw: En hoja, se encontró necrosis con borde irregular, de hasta 3 cm

de largo y 1 cm de ancho. Además se observó clorosis marginal y pequeñas

puntuaciones negras.

En los frutos verdes se observaron con síntomas “típicas de sarna”.

9

FINCA 2

Se tomaron muestras de frutos y hojas con síntomas de enfermedad. También se





Success Frutos, algunos con síntomas de

sarna y costras en la superficie.

Shoshoni


Variedad Succes: frutos con sarna, algunos vanos, con pudrición seca y coloración

negra de los embriones. Otros con costras en la superficie del fruto. Las mismas

presentaron aspectos de placas corchosas, lignificadas.

Variedad Shoshoni: Síntoma A. Las hojas presentan fumagina en el haz,

encontrándose presencia de pulgones en el envés.

Síntoma B: en folíolos se observó necrosis con borde irregular, de hasta 4 cm de

largo y 1 cm de ancho ubicadas en ambos lados de la nervadura central, esta no fue

afectada.

A B

10

FINCA 3






Varieda

d

Material recolectado

Harris

Súper


Harris Súper:

Síntoma A: se observó clorosis en toda la hoja.

Síntoma B: en folíolos se observó necrosis con borde irregular, de hasta 5 cm de

largo y 0,7 cm de ancho ubicadas a lo largo y en ambos lados del limbo. La

nervadura central no fue afectada.

De los frutos y raquis se aislaron varios patógenos de origen fúngico. Se identificó

Colletotrichum sp., agente causal de antracnosis.

A B

11

FINCA 4







Cheyenne


Variedad Cheyenne: En hojas, se observó manchas necróticas con tamaño y forma

variable, borde irregular, de hasta 1,5 cm de largo y 0,5 de ancho ubicadas a lo largo

y en ambos lados del limbo. La nervadura central fue afectada.

De los frutos recolectados, se aislaron varios patógenos de origen fúngico. Se

identificó Colletotrichum sp., agente causal de antracnosis.

12

FINCA 5






Variedad Hojas

Mohawk


Variedad Mohawk:

Síntoma A: Se observó en hoja necrosis con borde irregular, de hasta 2,5 cm de

largo y 1cm de ancho ubicadas en ambos lados de la nervadura y en ambos lados del

limbo. La nervadura central no fue afectada.

Síntoma B: Por otro lado, en folíolos se observaron manchas con bordes oscuros

irregulares con centro plateado, en cuyo envés presenta tejido necrótico. Se aislaron

colonias con micelio de color gris oscuro, que no se pudo identificar.

A B

13

FINCA 6



Choctaw Ramas con muerte regresiva y

necrosis interna.

Mahan

Mohawk


Variedad Mahan:

Síntoma A: Las hojas presentan fumagina en el haz, encontrándose presencia de

pulgones en el envés.

Síntoma B: En hojas, se observó necrosis con borde irregular, de hasta 4 cm de largo

y 2 de ancho ubicadas a lo largo y en ambos lados del limbo. La nervadura central no

fue afectada.

A

B

AS

B

14

Se aislaron colonias con micelio de color blanco y otras con micelio de color gris

oscuro elevado, cuya identificación quedarán para posteriores estudios.

Variedad Mahawk:

Síntoma A y B: Se halló en hojas lesiones necróticas con bordes irregulares,

distribuidas por toda la hoja. La nervadura central no fue afectada.

15

FINCA 7



Desirable

Starking Ramas con necrosis en la medula.


Variedad Desirable: Se observó en la hoja manchas necróticas localizadas en las

puntas y los extremos. La nervadura central fue afectada.

Se aislaron colonias con micelio de color blanquesino y otras con micelio de color

gris elevado, no identificados. También se aislaron levaduras.

Variedad Succes: Se halló ramas con necrosis en la medula.

A partir de las siembras realizadas se aisló e identifico a Fusarium sp.

16

FINCA 8



fotografiaron in situ, sintomatología observada, daño por granizo, insectos en hojas,

como así también se registraron el manejo de los lotes con las distintas variedades,

entre otros.


Varieda

d

Material

recolectado

Succes

Pawnee

Starkin

g

17

Mahan

Mohaw

k


Variedad Succes: en fruto se observó manchas necróticas, profundas con abundante

micelio blanco. El agente causal identificado fue Trichotecium sp.

En hojas, se observó necrosis con borde irregular, de hasta 2,5 cm de largo y 0,7 de

ancho ubicadas a lo largo y en ambos lados del limbo. La nervadura central no fue

afectada.

A partir de las siembras realizadas se aisló e identifico a Fusarium sp.

Variedad Pawnne: en la superficie del fruto se observó placas corchosas de color

marrón claro, con tejido quebradizo.

En hoja, se encontró necrosis con borde irregular, en un solo lado de la nervadura

de hasta 3 cm de largo y 0,8 cm de ancho. Se aislaron colonias con micelio de color

rosa y otras con micelio de color gris oscuro, no identificadas.

B A

A

18

Variedad Starking: En folíolos se observaron manchas necróticas pequeñas con

bordes definidos y color marrón oscuro, en cuyo envés presenta tejido necrótico. La

nervadura central también presentaba manchas necróticas.

Variedad Mahan y Variedad Mohawk: En folíolos se observaron manchas con

bordes definidos (Figura A) con centro plateado, en cuyo envés presenta tejido

necrótico. De las siembras se obtuvieron numerosas colonias de forma y aspectos

diferentes, que se ilustran a continuación.

En muestras con síntomas necróticos (Figura B), alargados en los márgenes y puntas,

con aspecto de quemado. Se aislaron colonias de Colletotrichum sp. agente causal

de antracnosis.

19

PATÓGENOS PRESENTES EN FRUTO DE NUEZ PECAN

Objetivo

Identificación de microorganismos patógenos asociados a la almendra y a la cáscara

de frutos de cuatro variedades de pecan: Mahan, Harris Súper, Kernodle y Pawnee,

cultivados en la provincia de Entre Ríos.

Materiales y Métodos

Desinfección de las muestras

Durante la campaña 2015, se recolectaron muestras de frutos de pecan de las

variedades Mahan, Harris Súper, Kernodle y Pawnee, con o sin síntomas de

enfermedad en sus embriones.

Los frutos seleccionados se enjuagaron con agua destilada y luego fueron

desinfectados superficialmente con una solución de etanol al 96 % por 10 minutos.

A continuación se flamearon las nueces y se procedió con la apertura aséptica de las

mismas (Larre, 2006). Luego de este tratamiento de desinfección se tomaron

muestras de tejido vegetal, asintomático y visiblemente enfermo y se sembraron en

medio de cultivo agar papa glucosado 2% (APG) (Britania) suplementado con ácido

láctico 25 % e incubados durante 10 días a 28°C en oscuridad (Figura 1). Además, los

frutos pelados y con cáscara se colocaron en cámaras húmedas, para favorecer el

desarrollo óptimo del agente causal, en condiciones controladas de humedad

relativa y temperatura.

20

Figura 1. Nuez de pecan: almendras asintomática (izquierda) y con síntomas visibles

(derecha).

Aislamiento

Para los aislamientos fúngicos, a partir de los frutos con presencia de mohos se

extrajeron muestras de micelio o estructuras de reproducción mediante raspado de

la superficie, las que fueron cultivadas en placas de Petri en medio APG 2%

suplementado con ácido láctico 25% durante 10 días a 28°C en estufa marca Raypa

(España).

Identificación

La etiología de todos los microorganismos patógenos asociados con enfermedades

de postcosecha fue determinada sobre los síntomas y sobre las características de los

signos tales como el tipo de estructuras de fructificación de origen asexual,

presencia o ausencia de micelio y morfología de los conidios mediante preparados

microscópicos y el empleo de claves taxonómicas (Teviotdale et al, 2002; Terabe et

al 2007; Larre 2006).

21

Resultados

A partir de los frutos con y sin cáscara, los patógenos identificados fueron

Aspergillus, Cladosporium, Epicoccum, Pestalotia, Colletotrichum, Penicillium,

Rhizopus, Trichothecium, y Fusarium aislados o en infecciones mixtas (Figura 2).

Figura 2. Microflora presente en fruto de nuez pecán con y sin cáscara.

La identificación del agente responsable y de los síntomas que induce en el fruto,

constituyen el paso inicial para caracterizar las enfermedades de postcosecha en

pecan. Desde el punto de vista práctico, el reconocimiento de los síntomas

asociados a un determinado agente causal, complementado con conocimientos

epidemiológicos, permitirán la toma de decisiones de control en forma rápida y

eficaz.

22

EFICACIA DE CONTROL DE FUNGICIDAS

Evaluación “in vitro” de fungicidas: Eficacia comparativa de fungicidas para el

control de Fusicladium sp., agente causal de sarna en pecán.

Objetivo

Evaluar la eficacia de fungicidas en el control de Fusicladium sp.

Metodología

Para la prueba “in vitro”, se utilizó un cultivo puro de Fusicladium sp. de 20 días de

edad, aislados y purificados previamente de muestras fruto de nuez pecan.

Los fungicidas seleccionados según literatura consultada y en función a entrevistas

realizadas a distintos productores y técnicos fueron:

Carbendazim

Tebuconazole

Amistar Top

Sphere Max.

Por cada fungicida utilizado se evaluaron las concentraciones: 0 (testigo), 0,1; 1; 10 y

100 ppm.

El diseño experimental se realizó con 5 repeticiones por tratamiento a excepción del

tratamiento testigo que tuvo 8 repeticiones. Las cajas de Petri fueron incubadas a

una temperatura 25°C ± 1 y fotoperiodo controlado.

23

Figura 1. Preparación del material.

Finalizado el periodo de incubación y cuando se visualizó que el micelio del hongo

en el tratamiento testigo alcanzó la mitad de la caja de Petri se midió el diámetro de

las colonias.

Para cuantificar el diámetro de las colonias se utilizó un calibre digital profesional

Black Jack modelo D056.

24

Figura 2. Placas con Fusicladium sp. con diferentes fungicidas y concentraciones.

Los diámetros de las colonias obtenidos para cada uno de los tratamientos fueron

los que se muestran en la tabla a continuación.

Los tratamientos resaltados en gris fueron los que tuvieron una mayor inhibición del

crecimiento micelial.

Fungicida Dosis Diámetro

(mm)

Carbendazim

0 46

0,1 34

1 47 10 44

100 44

Tebuconazole

0 46

0,1 44 1 36

10 23

100 12

Sphere

0 46

0,1 44 1 37

25

10 27 100 9

Amistar Top

0 46 0,1 39

1 34

10 26 100 12

26


control de Colletotrichum spp., agente causal de antracnosis en pecán.

Objetivo

Evaluar la eficacia de fungicidas en el control de Colletotrichum spp.

Metodología

Para la prueba “in vitro”, se utilizó un cultivo puro de Colletrotrichum spp. de 10

días de edad, aislados y purificados previamente de muestras de fruto y hoja de

nuez pecan.

Los fungicidas fueron seleccionados según literatura consultada y en función a

entrevista realizada a distintos productores y técnicos fueron:

Carbendazim,

Tebuconazole,

Amistar Top,

Boscalid,

Priaxor.

Se evaluaron por cada uno de ellos las concentraciones: 0,1; 1; 10 y 100 ppm.

A continuación se procedió a extraer discos con micelio de 0,6 cm. que fueron

colocados en el centro de las cajas de Petri de 9 cm sobre el medio de PDA para

realizar el ensayo con los productos químicos in vitro.

27

Figura 1. Preparación del material.


tratamiento testigo que tuvo 8 repeticiones. Las cajas de petri fueron incubadas a



en el tratamiento testigo alcanzó el borde de las cajas de Petri se midió el diámetro

de las colonias.



28

Testigo 0,1 ppm 1 ppm 10 ppm 100 ppm

Figura 2. Placas con Colletotrichum sp. con diferentes fungicidas y concentraciones.






(mm)

Amistar

0 79

0,1 56 1 33

10 17 100 5

Boscalid

0 79

0,1 81 1 81

10 76

29

100 81

Carbendazim

0 79

0,1 42 1 Contaminado

10 Contaminado 100 Contaminado

Priaxor

0 79

0,1 71 1 51

10 32 100 25

Tebuconazole

0 79 0,1 77

1 54

10 17 100 16

30


control de Fusarium sp., agente causal de mancha foliar en pecán.

Objetivo

Evaluar la eficacia de fungicidas en el control de Fusarium sp.

Metodología

Para la prueba “in vitro”, se utilizó un cultivo puro de Fusarium sp. de 10 días de

edad, aislados y purificados previamente de muestras hoja de nuez pecan.

Los fungicidas fueron seleccionados según literatura consultada y en función a

entrevista realizada a distintos productores y técnicos fueron:

Carbendazim,

Tebuconazole,

Iprodione

Cercobin.

Cada uno de estos fungicidas se evaluaron las concentraciones: 0 (testigo); 0,1; 1; 10

y 100 ppm.

A continuación se procedió a extraer discos con micelio de 0,6 cm que fueron

colocados en el centro de las cajas de Petri sobre el medio de PDA para realizar el

ensayo con los productos químicos in vitro.


tratamiento testigo que tuvo 8 repeticiones. Las cajas de Petri fueron incubadas a


31


en el tratamiento testigo alcanzó el borde de las cajas de Petri se midió el diámetro

de las colonias (Figura 1).



Figura 1. Placas con Fusariumum sp. con diferentes fungicidas y concentraciones.






(mm)

Carbendazim

0 83 0,1 62

1 11 10 6

32

100 6

Tebuconazole

0 83

0,1 47 1 57

10 6

100 8

Cercobin

0 88

0,1 80 1 70

10 67 100 43

Irpdine

0 88

0,1 54 1 75

10 40 100 37

33

DIAGNÓSTICO DE ESTADO NUTRICIONAL:

Al Laboratorio LAMAS fueron remitidas muestras de suelo y foliar para su análisis.

Cada una de las muestras fue tomada por el productor y/o su técnico asesor de la

finca. A cada productor se le proporcionó instructivo para toma de muestra y

envases rotulados.

Análisis de suelo.

Los ensayos realizados fueron:

Ensayos Profundidad de muestreo

0 - 30 cm 30 - 60 cm 60 - 100 cm

Carbono total y materia

orgánica. Nitrógeno, fósforo,

hierro y zinc.

X

pH y conductividad eléctrica X X X

Porcentaje de limo, arena y

arcilla; textura X X X

Bases intercambiables: Calcio,

Magnesio, sodio, potasio y

capacidad de intercambio

catiónico

X X X

Análisis foliar

Los ensayos realizados y la metodología empleada fueron:

34

Fósforo: Método colorimétrico.

Nitrógeno total: Kjeldahl.

Calcio, magnesio, potasio, hierro, cobre, zinc: Espectroscopia de absorción atómica

con llama / horno de grafito (Atomic Absorption Spectrophotometry Cookbook

Shimadzu Corporation, Standard Methods, 1999).

Cada uno de los ensayos se realizó por triplicado.

Resultados

Los resultados de las muestras fueron remitidos a los productores correspondientes.

Por razones de confidencialidad no se identifican a los productores.

35

Suelo

Ensayo

Muestra

1220 1221 1222

Identificación del laboratorio

0-30 30-60 60-100

pH 6,57 ± 0,02 6,29 ± 0,11 5,59 ± 0,06

Conductividad eléctrica (mS/cm)

0,29 ± 0,01 0,24 ± 0,01 0,41 ± 0,02

Fósforo extractable (mg/kg)

0,17 ± 0,02 - -

Nitrógeno total (g/100g)

0,21± 0,01 - -

Sodio (cmol(+)/kg) 0,24 ± 0,17 0,56 ± 0,04 0,48 ± 0,19

Potasio (cmol(+)/kg)

0,81 ± 0,15 0,58 ± 0,07 0,57 ± 0,13

Magnesio (cmol(+)/kg)

2,76 ± 0,22 4,72 ± 0,81 5,63 ± 0,01

Calcio (cmol(+)/kg) 12,83 ± 0,96 17,33 ± 2,50 32,06 ± 1,63

Carbono total (%) 2,19 ± 0,12 - -

Materia orgánica (%)

3,77 ± 0,21 - -

Hierro (mg/kg) 3573,81 ± 87,06 - -

Zinc (mg/kg) 4,75 ± 0,27 - -

Textura

Arena (%)

Limo (%)

Arcilla (%)

74

16

10

78

8

14

78

6

16

Franco arenoso Franco arenoso Franco arenoso

36

Ensayo

Muestra

1214 1215 1216


0-30 30-60 60-100

pH 5,33 ± 0,04 7,58 ± 0,04 6,56 ± 0,08


0,37 ± 0,04 0,22 ± 0,02 0,34 ± 0,08


0,14 ± 0,01 - -


0,18 ± 0,00 - -

Sodio (cmol(+)/kg) 0,03 ± 0,00 0,08 ± 0,00 0,35 ± 0,20


0,39 ± 0,00 0,42 ± 0,15 1,05 ± 0,12


1,11 ± 0,03 1,59 ± 0,07 4,06 ± 0,20

Calcio (cmol(+)/kg) 5,72 ± 0,27 6,95 ± 1,04 15,59 ± 0,18

Carbono total (%) 2,32 ± 0,17 - -


4,00 ± 0,30 - -

Hierro (mg/kg) 2802,04 ± 57,52 - -

Zinc (mg/kg) 3,23 ± 0,200 - -

Textura

Arena (%)

Limo (%)

Arcilla (%)

50

25

25

50

24

26

51

22

27

Franco arcillo

arenoso Franco arcillo

arenoso Franco arcillo

arenoso

37

Ensayo

Muestra

0081 0082 0083


0-30 30-60 60-100

pH 5,70 ± 0,03 5,54 ± 0,10 5,03 ± 0,02


0,17 ± 0,05 0,10 ± 0,04 0,09 ± 0,01


0,35 ± 0,01 - -


0,17 ± 0,01 - -

Sodio (cmol(+)/kg) 0,16 ± 0,05 0,21 ± 0,11 0,33 ± 0,01


0,99 ± 0,07 1,25 ± 0,04 0,97 ± 0,10


1,27 ± 0,02 2,34 ± 0,02 3,33 ± 0,26

Calcio (cmol(+)/kg) 7,64 ± 0,13 10,05 ± 0,05 13,84 ± 2,44

CIC (cmol(+)/kg) 10,08 13,91 18,48

Carbono total (%) 2,36 ± 0,31 - -


4,76 ± 0,54 - -

Hierro (mg/kg) 3772,39 ± 401,44 - -

Zinc (mg/kg) 17,12 ± 1,47 - -

Textura

Arena (%)

Limo (%)

Arcilla (%)

69

23

7

58

24

16

13

73

11

Arenoso franco Franco arenoso Franco limoso

38

Ensayo

Muestra

0101 0102 0103


0-30 30-60 60-100

pH 5,37 ± 0,04 5,55 ± 0,05 6,22 ± 0,06


0,20 ± 0,01 0,11 ± 0,03 0,24 ± 0,08


0,21 ± 0,01 - -


0,06 ± 0,00 - -

Sodio (cmol(+)/kg) 0,11 ± 0,00 0,01 ± 0,00 0,08 ± 0,02


0,21 ± 0,00 0,15 ± 0,00 0,10 ± 0,00


0,20 ± 0,00 0,17 ± 0,00 0,26 ± 0,01

Calcio (cmol(+)/kg) 0,37 ± 0,03 0,72 ± 0,02 1,01 ± 0,19

CIC (cmol(+)/kg) 0,91 1,05 1,46

Carbono total (%) 1,40 ± 0,68 - -


2,41 ± 1,18 - -

Hierro (mg/kg) 1206,52 ± 149,52 - -

Zinc (mg/kg) 5,43 ± 1,57 - -

Textura

Arena (%)

Limo (%)

Arcilla (%)

87

2

2

95

4

1

91

7

1

Arenoso/ Franco arenoso Arenoso Arenoso

39

Foliar

Ensayo Muestra

1213 0010 0008

Nitrógeno (%) 2,67 ± 0,02 0,0002 ± 0,00 0,0002 ± 0,00

Fósforo (%) 0,11 ± 0,00 0,06 ± 0,00 0,06 ± 0,00

Potasio (%) 0,32 ± 0,07 0,20 ± 0,07 0,48 ± 0,00

Calcio (%) 3,08 ± 0,94 2,01 ± 0,04 3,19 ± 0,13

Magnesio (%) 0,59 ± 0,03 0,21 ± 0,00 0,35 ± 0,06

Hierro (mg/kg) 99,14 ± 9,30 0,007 ± 0,00 0,01 ± 0,00

Cobre (mg/kg) 4,59 ± 0,42 0,0004 ± 0,00 0,0001 ± 0,00

Zinc (mg/kg) 67,21 ± 5,98 0,005 ± 0,00 0,01 ± 0,00

denominaciÓn del proyecto - cluster de la...

Documents