curso pas sesi.n 3 - servicio de selección y … · o amplio rango de masas 40kda (hasta 200kda...

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CURSO TEÓRICOCURSO TEÓRICO--PRÁCTICO DE PRÁCTICO DE ESPECTROMETRÍA DE MASASESPECTROMETRÍA DE MASAS

Dra. Pilar Blasco Dr. Pablo Candela

CURSO FORMACIÓN ESPECÍFICA PAS - 2012

El ANALIZADOR es la parte principal del espectrómetro de masas.

Partes del Espectrómetro de MasasPartes del Espectrómetro de Masas

El resto de componentes deben seleccionarse en función de su compatibilidad y sus prestaciones.

2

¿Qué ocurre en la Fuente de Ionización?¿Qué ocurre en la Fuente de Ionización?

IONES en FASE GAS

IONIZACIÓN FRAGMENTACIÓN? C6H5CO+

C6H5+

C4H3+

CH3CO+

C3H3+

+·

39

105

77

51

43VOLATILIZACIÓN

C6H5COCH5+

120

¿Qué ocurre en el Analizador?¿Qué ocurre en el Analizador?

m/z

Abu

ndan

cia

3

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CONDUCE los iones desde la fuente de ionizaciónhasta el detector.

SEPARA los iones en función de su RELACIÓNMASA/CARGA ( / )

Funciones del AnalizadorFunciones del Analizador

MASA/CARGA (m/z).

SELECCIONA iones actuando como filtro.

4

MOVIMIENTO de IONES (o del HAZ de IONES) mediante una OPTICA IÓNICA equivalente a la óptica del haz luminoso.

Movimiento de iones (o del haz iónico)Movimiento de iones (o del haz iónico)

5

MOVIMIENTO de IONES emplea diferentes elementos: rendijas, lentes, uso de campos eléctricos, magnéticos, de radiofrecuencia, …

Movimiento de iones (o del haz iónico)Movimiento de iones (o del haz iónico)

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Sector MagnéticoSector Magnético

CuadrupolarCuadrupolar

Trampa de ionesTrampa de iones

Tiempo de vueloTiempo de vuelo

Analizadores de MasasAnalizadores de Masas


Transformada de Fourier/Ión Transformada de Fourier/Ión ciclotrónicociclotrónico

OrbitrapOrbitrap

Sistemas híbridosSistemas híbridos

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RESOLUCIÓN

PRECISIÓN DE MASA

RANGO de MASAS

SENSIBILIDAD

Características que definen el analizadorCaracterísticas que definen el analizador

SENSIBILIDAD

VELOCIDAD de ADQUISICIÓN

RANGO DINÁMICO LINEAL

8

¿¿¿Hay analizador ideal???

Cronología de los Analizadores en E.M.Cronología de los Analizadores en E.M.

1899-1912 Primer espectrómetro de masas

1946 Tiempo de vuelo

1949 ICR1974 FT-ICR 2004 LITs

1900 1950 2000

2000 Orbitrap

9

1918 Enfoque simple (sector)

1952 Doble enfoque(sector)

1953 Quads

1950 FT-MS 1978 Triple Quads

1980 Trampa de iones

1900 1950 2000

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OrbitrapOrbitrap


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IÓN EN UN CAMPO MAGNÉTICO

m2 m3m1

m1 < m2 < m3

m B2R2

z 2V=

ECUACIÓN FUNDAMENTAL EC = ½ mv2 = zVFc = mv2 /RFm = zvB

zvB = mv2 /R v2 = 2zV/m

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Sector MagnéticoSector Magnético m B2R2

z 2V=

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Sector MagnéticoSector Magnético m B2R2

z 2V=MODOS DE TRABAJO:

B y V CONSTANTES, R VARIABLE

• VARIABLE B (BARRIDO MAGNÉTICO)• VARIABLE V (BARRIDO ELÉCTRICO)• PEAK-MATCHING

R CONSTANTE, B o V VARIABLE

13


m/z =74m/z =87m/z =143 BARRIDO

V o B

m B2R2

z 2V=

t0 t1 t2 tSCANt3

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RESOLUCIÓN: es baja debido a la gran dispersidad de energías cinéticas de los iones formados en la fuente. Solución:ANALIZADOR ELECTROSTÁTICO

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GEOMETRÍAS:

ENFOQUE SIMPLE

DOBLE ENFOQUE GEOMETRÍA NIER-JOHNSON

DOBLE ENFOQUE GEOMETRÍA INVERSA

TRIPLE ENFOQUE

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CARACTERÍSTICAS

o Capacidad de medida de masa exacta

o Capacidad de realizar estudios cinéticos y de iones metastables.

o Modo de trabajo Peak-Matching

o Complejidad de manejo, elevado Coste y Mantenimiento

o IRMS

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En la unidad de Espectrometría de Masas de los SSTTI


DOBLE ENFOQUE (BE) TRIPLE ENFOQUE (EBE)

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OrbitrapOrbitrap


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IÓN EN UN CUADRUPOLO

Un CUADRUPOLO está formado por CUATRO superficies

“barras” hiperbólicas, EQUIDISTANTES entre sí una

distancia R, sobre las que se aplica un voltaje de radio

frequencia (RF) y una corriente directa (DC).20


Las barras positivas actúan como un filtro de paso alto,

Cada pareja de barras opuestas están conectadas entre sí. Una de las parejas toma polaridad positiva y la otra negativa.

IÓN EN UN CUADRUPOLO: en la PRÁCTICA

pfiltrando las masas que tienen un valor de m/z por debajo del valor deseado.

Las barras negativas actuan como un filtro de paso bajo, filtrando las masas que tenga un valor de m/z por encima del valor deseado.

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ECUACIÓN FUNDAMENTAL

Ecuaciones de Mathieu.

Solo ciertas combinaciones de U (α) y V (q) producen trayectorias estables para una determinada relación masa/carga.

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DIAGRAMAS DE ESTABILIDAD

Línea de barrido

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BARRIDOMODOS DE TRABAJO:

BARRIDO (SCAN)

SELECCIÓN DE IONES (SIM o SIR)


o Información estructuralo Comparación con librerías

S/N ~1559.4

SELECCIÓN DE IONES (SIM o SIR)

o Mejor Sensibilidad (S/N)o Mayor Selectividad SIM

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S/N ~18630.2

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CARACTERÍSTICAS

o Baja resolución (unidad)

o Rango de masas 5-4000 (dependiendo del modelo)

o Baja sensibilidad (en modo barrido)

o Elevada velocidad adquisición (2-10 espectros/segundo)

o Compacto, robusto, económico y de fácil manejo

25

Los CUADRUPOLOS cuando trabajan SOLO con RF no filtran iones, actúan como transmisores de iones. Para este fin también son usados HEXAPOLOS y OCTAPOLOS.


MULTIPOLOS

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En la unidad de Espectrometría de Masas de la UA los equipos de GC/MS de baja resolución presentan este tipo de analizador (5 en total).


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OrbitrapOrbitrap



IÓN EN UN TRAMPA DE IONES

Consiste en un ELECTRODO con forma DE ANILLO y dos “TAPAS” ELIPSOIDES

en la parte superior e inferior, que crean un campo cuadrupolar 3D donde los

iones son RETENIDOS de forma indefinida en una trayectoria circular.

También conocida como “Cuadrupolo Circular”, Trampa de iones de PAUL, QIT,

QUISTOR, Trampa 3D. 29



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DIAGRAMAS DE ESTABILIDAD

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MODOS DE TRABAJO:


La Trampa de Iones trabaja por ETAPAS:

1. ACUMULACIÓN de Iones en la Trampa

2. CIERRE de la trampa

Ó3. EXPULSIÓN Secuencial de los Iones atrapados hacia el detector o

SELECCIÓN de Ión para su aislamiento.

4. FRAGMENTACIÓN del ión Seleccionado.

5. …

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MODOS DE TRABAJO:

BARRIDO (SCAN)Expulsión en el límite de estabilidadExpulsión resonante

SELECCIÓN DE IONESSELECCIÓN DE IONES

TRANSICIONES (MRM)

EXPERIMENTOS MS/MS o MSn

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MODOS DE TRABAJO:

BARRIDO (SCAN)

SELECCIÓN DE IONES


170 210 250 290

210

222

268 280165

190 210

210

1

21. AISLAMIENTO2. FRAGMENTACIÓN3 AISLAMIENTO

ION PRECURSOR

SELECCIÓN DE IONES

TRANSICIONES (MRM)

EXPERIMENTOS MS/MS o MSn

150 170 190 210

210158

191

160

158

190

191 3

3. AISLAMIENTO

210 → 158210 → 191

TRANSICIONES

IONES PRODUCTO

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1-Acumulación

La energía de Fragmentación se aplica selectivamente. Sólo la

recibe el Ión Precursor o rango de iones que interese

fragmentar


+

3-Excitación3

4-Fragmentación421

2-AislamientoIón

Precursor

Espectrode Masasn

(n=1-11)

(C.I.D.: Disociación Inducida por Colisión (con helio) del ión precursor)

EspectroMSn

MS/MSMS/…

En una Trampa el proceso de transmisión de Iones

de “Fuente a Detector” es un proceso discontinuo

35

6-Detección6

5-Acumulación de Fragmentos

5

He

He


CARACTERÍSTICAS

o Resolución variable, con la velocidad de barrido

o El cut-off (no permite el atrapado de todos los iones, 1/3).

o Elevada sensibilidad (en modo scan más que Q 100veces)

o Elevadas velocidades adquisición 2-10 espectros/s (=Q)

o MS/MS/MS/…(MSn) con MS/MS en el tiempo

o Aplicaciones en ANALISIS ESTRUCTURAL 36

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TRAMPAS LINEALES (2D)


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En la unidad de Espectrometría de Masas de la UA

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OrbitrapOrbitrap



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IÓN EN UN TIEMPO DE VUELO (TOF)

ACELERACIÓNde los iones

≠ VELOCIDADES

DETECCIÓN

≠ TIEMPOS

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EC = zV = 1/2 mv2

m/z = 2V / v2 = 2Vt2 / L2

41


IONIZACIÓN

RETARDO

EXTRACCIÓNEXTRACCIÓN

ACELERACIÓN

ANÁLISIS (VUELO)

DETECCIÓN

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Distribuciones temporalesDistribuciones de E.Cinética inicialDistribuciones espaciales.

Tiempo de vueloTiempo de vueloRESOLUCIÓN.La resolución de iones se obtiene a partir de dt, por ello los iones deben abandonar la fuente al mismo tiempo (pulsos de nanosegundos).

Extracción pulsada (1-2 etapas)Voltajes elevados de aceleraciónTiempo de retardoReflectores (1-2 etapas)

REFLECTOR

Reflectores (1 2 etapas)

s/REFLECTOR

c/REFLECTOR

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MODOS DE TRABAJO:

BARRIDO (SCAN)MALDI-TOF

100 fmol digerido de BSA

44


CARACTERÍSTICAS

o Alta resolución (FWHM<0.1), masa exacta

o Amplio rango de masas 40kDa (hasta 200KDa con MALDI)

o Elevada sensibilidad (100veces más que Q y IT (scan) y = en SIM)

o Elevadas velocidades adquisición espectros (ht 10 espectros/sec) µs

o Pulsos de iones, Uso de Reflectores hacen que Resolución TOF>TRAP>Q

o Precio TOF>TRAP>Q45

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En los SSTTI, actualmente en la Unidad de Proteómica de la UA, disponemos de un equipo MALDI-TOF.

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OrbitrapOrbitrap


Transformada de Fourier/Ión ciclotrónicoTransformada de Fourier/Ión ciclotrónico


IÓN EN UN FT-ICR


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MODO DE TRABAJO:

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La parte fundamental de un instrumento de transformada deFourier es una trampa de iones en la cual los iones circulan enórbitas bien definidas durante largos periodos. Tales cavidadesse construyen aprovechando el fenómeno de resonancia iónicaciclotrónica.


CARACTERÍSTICAS

o Alta resolución - Masa exacta Es posible alcanzar una resolución

extremadamente elevada (superior a 106) dado que las medidas de

frecuencia se pueden realizar con elevada precisión.

o Los espectrómetros de masas FT proporcionan mejores relaciones

señal/ruido, velocidades mayores y sensibilidad y resolución más

elevadas. 50






51



OrbitrapOrbitrap


OrbitrapOrbitrap

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OrbitrapOrbitrap

Í

o Trabaja solo con DC.

o FT.

CARACTERÍSTICAS

52






53



OrbitrapOrbitrap

Sistemas híbridosSistemas híbridosSistemas híbridosSistemas híbridos

COMBINAR varios analizadores.

Para FAVORECER las VENTAJAS de cada uno, y EVITAR los

INCONVENIENTES.

Se simbolizan mediante la combinación de las ABREVIATURAS en


Se simbolizan mediante la combinación de las ABREVIATURAS en

su orden.

Es posible casi CUALQUIER COMBINACIÓN.

Permite realizar análisis de MS/MS en el ESPACIO.

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ENERGÍA CINÉTICA DE LOS IONES

/ E E E P E E E P

CLASIFICACIÓN de los ANALIZADORES

MS/MS EN EL ESPACIO o EN EL TIEMPO

PODER DE RESOLUCIÓN o PRECISIÓN DE MEDIDA

55

Instrumentos Híbridos “Beam-Beam”

Instrumentos Híbridos “Beam-Trap”

QqQ, QTOF, BEBE, BEqQ o EBqQ, …


CLASIFICACIÓN

p

Instrumentos Híbridos “Trap-Beam”

Instrumentos Híbridos “Trap-Trap”

QIT, QqLIT, Q/FTICR, …

QIT/TOF, LIT/TOF, QTRAP, …

LIT/FT-ICR, LIT/Orbitrap, …

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57

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ALGUNOS EJEMPLOS

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QqQ QqTOF (QTOF)


ALGUNOS EJEMPLOS

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QqTRAP (QTRAP)

EJERCICIOEJERCICIO

o Sector doble enfoque

(BE o EB)

o Químico de síntesis orgánico que quiere conocer la

masa exacta de un compuesto

o Bioquímico que quiere conocer el peso molecular de

Para cada aplicación elegir la opción más adecuada

de analizador, teniendo en cuenta que no podemos

repetir!!!

60

o Cuadrupolo

o Tiempo de vuelo

o FT-ICR

una proteína relativamente grande (MW=300 000).

o EPA quiere confirmación del benceno en extractos

de 3000 muestras sólidas

o Químico de la industria petrolera quiere confirmar

la presencia de 55 compuestos únicos en un único

valor de masas nominal (m/z) en un espectro de

masas

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EJERCICIOEJERCICIO

o Sector doble enfoque (BE o EB)

Ordenar los analizadores siguientes según su

capacidad de realizar experimentos MS/MS en el

tiempo o en el espacio

o Trampa de iones

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o Cuadrupolo

o QTOF

o FT-ICR

o QqQ (triple cuadrupolo)

o QTrap

o Tiempo de Vuelo

RESUMENRESUMEN

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El DETECTOR es la parte final del espectrómetro de masas, donde se

li l d


realiza el recuento de los iones separados por el analizador, generando el espectro de masas.

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¿Qué ocurre en ¿Qué ocurre en el detector?el detector?

+ + + +SEÑAL+

+

+

HAZ IONICO

REGISTRO Y AMPLIFICACIÓN

I (V)

(-1200V TO -3000V)E.M. VOLTS (CDEM)

QUADS

Diagrama de BarrasAbundancia vs m/z 64

AMPLIFICACIÓN

RANGO de MASAS

SENSIBILIDAD

Características que definen el DetectorCaracterísticas que definen el Detector

VELOCIDAD de ADQUISICIÓN

65

Sensibilidad, tiempo de respuesta y precisión son los factores quedeterminan el detector más adecuado.

La sensibilidad está determinada por los iones que alcanzan el detector/moléculas introducidas y por la ganancia.

Algunos detectores son tan sensibles como para detectar un simple ión.

Consideraciones generalesConsideraciones generales

Puede ser deseable una posterior amplificación de la señal en eldetector. También podemos diferenciar entre aquellos detectores quepermiten una medida directa de las cargas que alcanzan el detector, comoson las placas fotográficas y la Copa de Faraday, de aquellos que aumentanla intensidad de la señal como los detectores multiplicadores de electroneso fotones y los detectores “array”.

Los detectores de iones pueden situarse en el eje del haz de iones ofuera de éste, dependiendo del diseño del instrumento.

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Los detectores de iones pueden dividirse en dos clases:aquellos que detectan la llegada de todos los iones de formasecuencial en un punto (detector de iones puntual) y aquellosque detectan la llegada de iones de forma simultánea a lolargo de un plano (detector “array”).

ClasificaciónClasificación

67

Placa FotográficaPlaca Fotográfica

Copa de Copa de FaradayFaraday

Multiplicador de Electrones Multiplicador de Electrones

de Dinodos Discretosde Dinodos Discretos

DetectoresDetectores



ChanneltronChanneltron

Conversión Conversión fotónicafotónica, , DalyDaly o de centelleoo de centelleo

MulticanalMulticanal

MicrochannelMicrochannel PlatePlate

68


Empleado en los primeros espectrómetros

Detector simultaneo

No cuantitativo

69

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24












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Gran sencillez y robustez

Baja sensibilidad

Puede trabajar a presiones relativamente altas

Gran linealidad de respuesta


Combinado con un SEM

Muy precisos. Respuesta independiente de la energía, de

la masa y de la naturaleza del ión

Baja velocidad de barrido

Situado en el eje óptico del haz de iones

71















72

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a) Multiplicador de electrones secundarios (SEM) de dinodos discretos

Multiplicador de ElectronesMultiplicador de Electrones

73

b) Detector Channeltron (CEM)Multiplicador de ElectronesMultiplicador de Electrones

74

Multiplicador de ElectronesMultiplicador de Electrones

El más empleado en MS

Tanto para iones positivos como negativos

Amplificación del orden 106-108

75

Requiere alta tensión y mejor vacío

Detector de vida limitada

Robustos y seguros

Ganancias elevadas

Dinodos de conversión

Tiempos de respuesta (ns)

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76


Elevada sensibilidad

77

Larga duración

Elevada velocidad de respuesta

Buena estabilidad

Detección fuera del eje óptico

Consta de dinodo, pantalla fosforescente y tubo

fotomultiplicador.










MicrochannelMicrochannel PlatePlateMulticanalMulticanal

78

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27


79

Detector simultáneo


Medida rápida

Amplificación (104-107)

Diferentes configuraciónes










MicrochannelMicrochannel PlatePlateMicrochannelMicrochannel PlatePlate

80


81


Se pueden conectar varios placas

Amplificación 108

Actúa como un ÚNICO detector puntual que conecta

todos los multicanales.

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DETECTORES SECUENCIAL (puntual)

SIMULTÁNEA(array)

“medida directa” COPA FARADAY PLACA FOTOGRAFICA


“con amplificación” SEMCENTELLEO

DETECTORES MÚLTIPLESMCP

Analizadores Q, Sector, TOF, IT Sector

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CONCLUSIÓN:Todos los E. de Masas no son i liguales.

Selección del instrumento que necesitamos para nuestro análisis.

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