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CURSO DE CULTIVOS CELULARES

Coordinadores: Milagros Ramos Gómez

Alberto Martínez-Serrano

Universidad Autónoma de Madrid

Junio 2008.

Docentes (según calendario):

Alberto Martínez Serrano Ignacio Tardieu Juan Rebelles

Carmen Punzón Angeles Sánchez

José Antonio López Elena Rodríguez

Isabel Liste Elena Holguín

Miguel Remacha Milagros Ramos

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Contenido: • Introducción y normas de trabajo. • Cultivo de células de mamíferos: aspectos básicos • Funcionamiento y uso de aparatos generales de laboratorio de cultivos •Lavado de material, esterilización y preparación de medios de cultivos celulares •Microbiología: Medios de cultivo, siembra y observación de microorganismos • Virología: Titulación de virus y transducción • Células de insectos: Generación de proteínas recombinantes mediante el uso de baculovirus •Células de mamíferos: Descongelación de líneas establecidas Cultivos primarios de linfocitos de ratón Células ES Cultivos primarios neuronas de cerebro de ratón • Células de plantas • Seguridad Biológica

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INTRODUCCIÓN Y NORMAS DE TRABAJO. Alberto Martínez Serrano • Normas de trabajo Laboratorio de cultivos Es de extrema importancia lavarse las manos antes, después, y frecuentemente durante el trabajo en cultivos, para evitar contaminaciones en los experimentos, y contaminación del usuario con material biológico, y posible diseminación de éste. Se debe trabajar siempre con material estéril (pipetas, puntas, etc). El material estéril sólo puede abrirse, lógicamente, dentro de la campana de cultivos, o a la llama del mechero. Por defecto, todo aquello de lo que no se esté seguro al 100% de su esterilidad ha de ser considerado como no estéril. “Asumir” que algo está estéril cuando no lo está supone, sin ninguna duda, contaminar (esto es, destruir) el experimento. Se requiere de todos los asistentes al curso un elevado grado de responsabilidad, para no arruinar el trabajo del grupo. En caso de contaminar algo involuntariamente (o incluso sospechar que ésto ha pasado), se debe poner inmediatamente en conocimiento del profesor, para evitar males mayores. Marcar siempre cualquier tubo o recipiente que contenga algo útil, de la forma más segura posible, por ejemplo tanto en la tapa como en el tubo. Marcar siempre las placas de cultivos en la tapa y en un lateral de la base, de manera distinta para cada placa, para evitar intercambiar tapas. Si se ha de pipetear repetidamente un stock de una solución (p.ej. botella con medio de cultivo) es conveniente sacar de una vez la alícuota que se vaya a usar a una botella o tubo de menor volumen, para disminuir el número de veces que se introducen pipetas en la botella con el stock, y el consiguiente riesgo de contaminación. Si faltasen cabinas de cultivo para llevar a cabo todo el trabajo necesario, algunas partes de los experimentos se harán en la mesa de laboratorio, previamente descontaminada con hipoclorito, y trabajando en el ambiente estéril proporcionado por la llama del mechero. • Seguridad biológica Es obligatorio lavarse las manos después del trabajo de laboratorio, para evitar contaminación del usuario con material biológico, y la potencial dispersión de éste. Todo el material biológico, p. ej. células o material que haya estado en contacto con éstas, ha de ser inactivado con hipoclorito antes de tirarlo. Tanto el plástico desechable como el vidrio que haya estado en contacto con material biológico ha de ser inactivado antes de tirarlo, o disponerlo para su lavado y esterilización. Los residuos acumulados en vasos de precipitados han de ser inactivados con hipoclorito antes de tirarlos, y los vasos se dejarán con un poco de hipoclorito hasta su próximo uso. La mesa de trabajo y las campanas se descontaminarán antes y después de trabajar con material biológico. Cualquier material biológico derramado ha de ser descontaminado inmediatamente con hipoclorito, antes de proceder a secar y lavar con jabón la superficie manchada.

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CULTIVO DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS. ASPECTOS BÁSICOS. Plásticos, densidades y medio de cultivo SUPERFICIES DE CULTIVO (*) usadas en este curso Placas multipocillo (multiwell-plates) Nombre común Pocillos Diámetro Area/pocillo Area /placa P96 96 8mm 0.5 cm2 48 cm2 P48 48 11mm 1 cm2 48 cm2 P24 24 16mm 2 cm2 48 cm2 P12 12 22mm 4 cm2 48 cm2 P6 * 6 35 mm 10 cm2 60 cm2

placas tipo Petri-dish Nombre común Pocillos Diámetro Area /placa P35 1 35 mm 10 cm2 P60 1 60 mm 28 cm2 P100 * 1 100 mm 78 cm2 Botellas (flasks) Nombre común Pocillos Diámetro Area/botella T-25 1 ---- 25 cm2 T-75 1 ---- 75 cm2 DENSIDADES DE CÉLULAS (en millones) Y VOLÚMENES (en ml) millones de células volumen (ml) Nombre común Siembra Confluencia Medio Lavados Trip/EDTA P96 0.015 0.06 0.1 0.1 0.060 P48 0.03 0.12 0.25 0.25 0.125 P24 0.06 0.24 0.5 0.5 0.25 P12 0..12 0.5 1 1 0.5 P6 * 0.3 1.2 2 2 1 millones de células volumen (ml) placas tipo Petri-dish Nombre común Siembra Confluencia Medio Lavados Trip/EDTA P35 0.3 1.2 2 2 1 P60 0.8 3.2 3 3 2 P100 * 2.2 8.8 10 10 3 millones de células volumen (ml) Botellas (flasks) Nombre común Siembra Confluencia Medio Lavados Trip/EDTA T-25 0.7 2.8 5 5 0.75 T-75 2.2 8.8 10 10 3

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MEDIO DE CULTIVO (DMEM COMPLETO): DMEM suplementado con suero de ternera al 10%, glutamina 2mM, antibióticos (100 unidades/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina) y aa no esenciales. INACTIVACIÓN de proteínas del complemento del suero ("des-complementación"): Descongelar una botella de suero a 37oC, aumentar entonces la temperatura del baño (con la botella dentro) hasta 56oC, incubar a esta temperatura 45min, enfriar la botella en baño de hielo y agua, filtrar (opcional, aunque no recomendable), distribuir en alícuotas (25-50 ml) y guardar a -20oC. Para preparar medio de cultivo, usar una alícuota recién descongelada. TEMPERATURA de los medios: Los medios y soluciones que entren en contacto con las células han de estar preferiblemente a 37oC (o, como muy bajo, temperatura ambiente), para no alterar el metabolismo celular. Siempre desinfectar con etanol las botellas que pasen por el baño antes de trabajar con ellas. ALMACENAMIENTO de distintos componentes de medios de cultivo, y otros medios/reactivos. A 4oC, stock DMEM, PBS, PBS/EDTA, DMEM completo, suero inactivado con DMSO A -20oC, suero inactivado, tripsina/EDTA, stocks de tripsina, glutamina, antibióticos, aa. Congelación y siembra de células MEDIO DE CONGELACIÓN. Dependiendo de la disponibilidad de suero, las células se pueden congelar en los siguientes medios: DMEM completo, DMEM con 20% suero, o en 100% suero, en cualquier caso suplementados con 10% di-metil-sulfóxido (DMSO), como agente crioprotector. El DMSO es bastante tóxico a esta concentración, habiendo células que lo soportan peor que otras. En cualquier caso, hay que minimizar el tiempo que las células pasan a temperatura ambiente en presencia de DMSO. Por ello, es conveniente enfriar las células a 4oC cuando se preparan para congelar. Al descongelar, diluir las células (que están en medio de congelación conteniendo DMSO) con DMEM completo, centrifugar y resuspender en DMEM completo cuanto antes. GRADIENTES DE TEMPERATURA para congelación y descongelación. La congelación de células ha de hacerse partiendo de una suspensión de células en suero 10% DMSO, a una densidad tal que, cuando vayan a ser sembradas adquieran inmediatamente la densidad adecuada para su óptimo crecimiento. Una cifra bastante estándar es una densidad de 1 millón de células / ml, congeladas en alícuotas de 1ml. Tras preparar esta suspensión y separar en alícuotas, las células se enfrían a 4oC y posteriormente se congelan a -20 oC, 24h, -70 oC, 24h y N2 l (-170 oC), indefinidamente. Si se dispone de un recipiente aislante, que permite una bajada de temperatura gradual, las células se pueden poner directamente a -70 oC (24h) y después transferir a N2 l. El almacenamiento en N2 l es para guardar células indefinidamente. Si se requiere sólo conservar las células unas pocas semanas (1-2 meses), se pueden guardar a -70 oC. Para descongelar células, pasar las células de N2 l ó -70oC a un recipiente con hielo seco (-70oC). Una vez que todo el material y medios estén preparados, descongelar las células transfiriéndolas del hielo seco a un baño a 37oC, agitando el criotubo en el agua con la mano hasta su completa descongelación. Rociar etanol abundantemente, transferir las células a un tubo con 10 ml medio completo, centrifugar 5 min a 700 rpm (centrífuga de mesa, temperatura ambiente [room temp., RT]), descartar sobrenadante, resuspender células en el

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volumen de medio adecuado y transferir a su placa de cultivo a la densidad adecuada (ver Tabla en página 4-5). Colocar placa en incubador con 95% humedad y 5% CO2. MEDIDAS ESPECIALES DE ESTERILIDAD al congelar y descongelar células. La manipulación de células durante la congelación y descongelación es un proceso que conlleva riesgo de contaminar las células. Habrá de prestarse especial atención a no tocar las roscas de los tapones de los criotubos, y tras descongelar las células en el baño, es esencial esterilizar el exterior del tubo con abundante etanol, antes de abrirlo y manipularlo. Pases de células CAMBIOS DE MEDIO. MANTENIMIENTO. La mayoría de líneas celulares doblan en cultivo en 24-48h, cuando las condiciones de crecimiento son adecuadas. De esta manera, el número de células se multiplica en cualquier cultivo en unos pocos días, ocupando toda la superficie de la placa (en el caso de células adherentes), y empobreciendo el medio al consumirse los nutrientes y acumularse productos de deshecho en éste. Es por ésto que si se desea mantener una línea en cultivo por más de unos pocos días, de manera periódica hay que reponer nutrientes y eliminar productos de degradación. Como normal general, cuando no se disminuye la densidad de células, se cambian 2/3 del medio cada 2-3 días; al dejar 1/3 del medio antiguo, si bien se arrastran productos de deshecho, también se mantienen sustancias producidas por las células y secretadas al medio que son positivas para su crecimiento (en cierta manera, las células no se sienten “solas” en el cultivo, como lo harían con un medio completamente nuevo, lo que induciría una parada o retraso en su crecimiento). Los cambios de medio pueden hacerse con una frecuencia ligeramente flexible, aumentando ésta al aumentar la densidad de células. Es fácil observar cómo el pH del medio tiende a acidificarse más rápidamente (se torna naranja-amarillento) cuando la densidad es elevada, al aumentar los productos de deshecho liberados. DILUCIÓN DE LA DENSIDAD (PASE) DE CÉLULAS La mayoría de líneas celulares que crecen adheridas a plástico sufren una parada en su crecimiento a densidades elevadas, impuesta por el proceso de inhibición por contacto. Dependiendo de la morfología y propiedades de cada línea, las células paran de dividirse, bien cuando ocupan toda la superficie de la placa, o bien cuando todas están en contacto con otras (sin necesidad de cubrir completamente el plástico). A este momento, situación (o densidad) se le denomina confluencia del cultivo. Nunca se debe dejar un cultivo en confluencia por periodos prolongados, debiendo reducirse la densidad de células en ése momento, para permitir su crecimiento de forma continuada. Si se quiere mantener la línea dividiéndose en una superficie igual a la usada hasta entonces, se descartarán parte de las células; si lo que se pretende es expandir las células, para aumentar su número total, se distribuirán todas las células a un número mayor de placas, sin tirar ninguna célula. En cualquiera de los dos casos, la densidad de células se reduce en un porcentaje que varía para cada línea, y que suele ser desde un 80% a un 90% (pase 1/5 o 1/10, respectivamente). (Diluciones excesivas o periodos prolongados en confluencia pueden alterar seriamente las propiedades de la línea celular, aspecto que se discutirá en más detalle en clase) Cuando se disminuye un 90% la densidad de células, se dice que las células “se pasan 1/10” (la densidad de reduce a 1/10 de la inicial). Si es un 80%, el pase es de 1/5.

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Como ejemplo, si queremos pasar unas células 1/5 manteniendo el cultivo en una placa de las mismas dimensiones, simplemente hay que descartar el 80% de las células. Si se quiere conservar todas las células, para expandirlas, las células se habrán de distribuir en 5 placas de la misma superficie que la original. En cualquiera de los dos casos, la densidad se reduce a 1/5, las células sufren un pase 1/5, etc. Si las células se dividen cada 24h, se puede predecir que (tras 12-24 h de parada del crecimiento tras su siembra), al día 2 habrá el doble de células que las sembradas, al día 3, cuatro veces, y así sucesivamente. Como ejemplo, tras un pase 1/10, y asumiendo que las células no se dividen durante las primeras 24h, día 0 densidad= 100%, por lo que las células se pasan dejando densidad 10%. día 1 densidad= 10% día 2 densidad= 20% día 3 densidad= 40% (cambio de medio) día 4 densidad= 80% día 5, las células necesitarán ser pasadas de nuevo TRIPSINIZACIÓN (y otros métodos de pasar células). Para la mayoría de líneas celulares que crecen adheridas a un substrato, la forma más conveniente de levantarlas en una suspensión celular (para poder manejarlas fácilmente en suspensión), es mediante el uso de tripsina (proteasa), que digiere aquéllas proteínas celulares implicadas en la adhesión celular al soporte. [En caso que sea importante preservar proteínas de membrana, se suele desaconsejar este procedimiento, habiendo de recurrirse a procedimientos mecánicos, como el pipeteo repetido, o el barrido/arañado de la superficie de cultivo.] Para que la tripsinización sea efectiva, y para contribuir a debilitar la adherencia de las células al soporte, aparte de tripsina, hay que asegurarse de eliminar el suero del medio (que contiene inhibidor de tripsina), así como cationes divalentes presentes en el medio y que median la interacción célula-sustrato (mediante el uso de EDTA). Para ello, el procedimiento estándar de tripsinización es el siguiente (p. ej. para una placa P100) (para otros tamaños de placa ver la tabla anterior): • Materiales: * PBS conteniendo 0.004% EDTA (PBS/EDTA) (Mezclar botella 80ml EDTA al 0.02% con 320ml PBS) * Tripsina 0.05% en EDTA (Trip/EDTA) (Mezclar botella 20ml tripsina 0.25% con 80ml EDTA 0.02%) • Procedimiento: - retirar el medio de cultivo - lavar 1x (una vez) con PBS/EDTA. - incubar con 1-2 ml solución de Trip / EDTA, 5 min, RT ó 37oC (si es posible), hasta que las células se vean redondas bajo el microscopio, señal de que su adherencia está muy desminuida. - diluir la tripsina / EDTA en la placa con 8-9 ml de medio completo (con suero); esto detiene la tripsinación (por el aporte de proteínas del suero, el inhibidor de tripsina presente en el suero, y el aporte de Calcio y Magnesio con el medio y el suero). Además., en el volumen final de 10 ml es fácil pipetear la suspensión para acabar de levantar la células (pipetear arriba y abajo, esparciendo la suspensión por toda la superficie de la placa, unas 5-10 veces, con la energía suficiente (y no más) como para despegar la células). Evitar hacer vacío al pipetear, así como hacer demasiadas burbujas, ya que ambas cosas matan muchas células). - si la tripsinazción ha sido efectiva, todas las células de la placa se encontrarán en los 10ml de suspensión, como células aisladas, no como agregados. Transferir este

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volumen a un tubo estéril, y centrifugar 5min a 700rpm. Descartar sobrenadante (este paso es necesario para eliminar tripsina, y sobre todo el EDTA, ya que si no, no se adherirán de nuevo las células al sembrarlas) - resuspender el sedimento celular en un volumen adecuado de medio de cultivo (dependiendo de si se van a descartar células o no, y del pase elegido) y sembrar en la superficie adecuada. Recuento de células Para mantener unas condiciones de cultivo reproducibles entre pases y experimentos, es recomendable sembrar las células a la misma densidad (ver tabla arriba), lo cual supone la necesidad de conocer el número de células en la suspensión preparada (ver punto anterior). La manera más común de determinar el número de células es contando éstas en un hemocitómetro (ver Figura 1); como la tripsinización y pipeteo de las células siempre conlleva algo de muerte celular, es conveniente teñir de alguna manera las células de forma que se puedan contar células vivas y muertas, y el total. Para sembrar de nuevo las células, habrá que contar, por supuesto, con el número de células vivas. La distinción entre células vivas y muertas se lleva a cabo utilizando colorantes vitales, entre ellos, el más usado es Azul de Tripano (Trypan Blue), cuyo stock está a una concentración del 0.4% en tampón fisiológico (pej. PBS) Continuando con el ejemplo de la tripsinización anterior, tomar 20 µl de células (que al final se van a descartar, o sea que desde este momento no se necesita esterilidad), y mezclar en un tubo eppendorf con 20 µl de solución de trypan blue. Pipetear 10 µl de esta nueva suspensión en cada lado del hemocitómetro. (ver Figura 1). Bajo el microscopio, se observará que el hemocitómetro esta equipado con una cuadrícula de 9 cuadrados grandes cada uno subdividido en otros 16 más pequeños. Debido al diseño de la cámara, el volumen de medio sobre uno de los cuadrados grandes es 0.1 µl. El recuento se lleva a cabo sobre dos cuadrados grandes en cada lado de la cámara, de manera que se tengan cuatro determinaciones del número de células en cuadrado grande, y cuya media será el número de células en 0.1 µl de la suspensión de células en trypan blue. (Para reducir el error de recuento se habrá de contar tantos cuadrados como sean necesarios para al menos acumular un mínimo de 100 células en total; por tanto, preparar una suspensión que resulte en unas 50 células por cuadrado grande es lo más conveniente.). Teniendo en cuenta las diluciones realizadas, es inmediato llegar a saber el número total de células en los 10 ml de suspensión preparados en el apartado anterior. Una manera muy intuitiva de hacer estos cálculos es como sigue: por ejemplo, si se obtiene 50 células por cuadrado grande, habrá 50 células por cada 0.1 µl en el eppendorf, o sea 50x 400= 20.000 células en el eppendorf, que proceden de 20 µl de la suspensión, o sea 20.000 x (10.000/20) = 10 x 106 células en los 10 ml

APARATOS GENERALES DE LABORATORIO DE CULTIVOS Ignacio Tardieu de Chorro

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¿Qué es y de qué consta un laboratorio de cultivos celulares? Un laboratorio de cultivos celulares debe contar con una infraestructura básica de áreas independientes para:

• Preparación de Medios de Cultivo. • Esterilización de Medios y Reactivos. • Lavado, esterilización y preparación de materiales. • Aparataje de un Laboratorio de Cultivos. Funcionamiento y uso. • Y trabajo con cultivos celulares.

Preparación de Medios y Reactivos. En este caso utilizaremos como ejemplo el sistema de trabajo que se realiza en el CBMSO. En este ejemplo, existen una serie de Técnicos dedicados enteramente a la preparación de Medios y Reactivos para uso común de los usuarios del laboratorio de cultivos. Estos Técnicos se encargan enteramente de los stocks de medios y demás reactivos para un funcionamiento más productivo de los trabajos realizados con los diferentes tipos de cultivos celulares. Un buen apoyo Técnico por parte de estas personas ayuda a una mayor comodidad y un mayor rendimiento, puesto que los usuarios no tienen que preocuparse de la preparación de Medios y Reactivos. Esterilización de Medios, Reactivos.

Desde el punto de vista de los sistemas de esterilización se pueden citar los siguientes:

• Calor Húmedo: Mediante el empleo de autoclaves los cuales proporcionan una temperatura de 121oC y una presión de 15 lb. Utilizados para la esterilización de soluciones cuyos componentes no se degradan por éste método, material plástico y de vidrio y equipos de filtración.

• Calor Seco: lo constituye el uso de hornos a temperatura de 200oC por espacio de 3 horas. Es empleado para la esterilización de material de vidrio particularmente.

• Filtración: A través del uso de equipos con membrana de nitrocelulosa o acetato de celulosa con poro de 0.22 ó 0.1 u de diámetro, mediante la aplicación de presión positiva o negativa. Por éste sistema se esterilizan la mayor parte de los medios de cultivo, suero, solución de antibiótico-antimicótico y suplementos

• Equipos de filtración.

En la actualidad se dispone de unidades de filtración estéril (por ej. Millipore, Gelman, ...), muy recomendables para el trabajo rutinario. Sin embargo, su elevado

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coste por unidad hace que en muchos casos aún se empleen unidades reutilizables como pueden ser las unidades Swimmex de Millipore.

Estos equipos de filtración constan o bien de una fuente de vacio conectada a un kitasato dotado de una unidad de filtración esterilizada por autoclavado, o bien de una bomba peristáltica que fuerza el flujo de solución a través de una unidad de filtración hermética (por ejemplo las ya citadas Swimmex de la empresa Millipore). En ambos casos la esterilización se produce al atravesar la solución un filtro de poro 0.22 um.

• Autoclave.

Un autoclave es un instrumento que permite la esterilización por calor tanto de sólidos como de líquidos. La esterilización se realiza habitualmente a 121 ºC, 1 atmósfera de sobre presión durante un tiempo superior a 20 min. Un autoclave de uso normal en el laboratorio de cultivo de tejidos suele disponer de temporizador y regulador de presión, y en algunos casos de un ciclo de secado para permitir secar el material sólido (material de vidrio, instrumentos quirúrgicos, tubos,...). Lavado, esterilización y preparación de materiales. Los Materiales más comunes en un laboratorio de cultivos son:

• Vidrio: Prácticamente todos los Medios se preparan y esterilizan para su almacenamiento y clasificación, en botellas de vidrio. También utilizaremos diferentes tipos de pipetas de cristal, probetas, vasos y matraces para el trabajo rutinario del Laboratorio.

• Plástico: Todo el trabajo que se desarrolla en un Laboratorio de cultivos se hace en

plástico. Todos los cultivos se hacen en diferentes modelos de placas de plástico y en botellas.

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MODELOS DE DIFERENTES PLACAS Y BOTELLAS PARA CULTIVOS CELULARES

• Contamos también con una gran variedad de tubos de ensayo para el desarrollo de una forma efectiva de diferentes técnicas y rutinas dentro del laboratorio.

• Cada tipo de material se utiliza para diferentes funciones, así como todos los materiales de cristal se utilizaran para la preparación y almacenamiento de medios y reactivos, todo el plástico nos servirá para la preparación de alícuotas de los diferentes reactivos y con esto conseguiremos realizar diferentes stocks para una rápida preparación de medios y reactivos utilizados en las rutinas de un Laboratorio.

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• El lavado, preparación y esterilización de dicho material será hecho en los cuartos destinados a dicho fin.

Aparataje de un Laboratorio de Cultivos. Funcionamiento y uso. Los aparatos más comunes dentro de un Laboratorio de cultivos son:

• Cabinas de Flujo

Su función es la de mantener un área libre de partículas, especialmente de posibles contaminantes (bacterias, levaduras,...) que puedan acceder al cultivo. Esto se consigue mediante un dispositivo mecánico que fuerza el paso del aire a través de un filtro de gran superficie (filtro HEPA) situado o bien en el techo (flujo vertical) o en la pared frontal (flujo horizontal) y que con una eficiencia del 99.999 % retiene las partículas por debajo de un cierto calibre que es en general de 0.2 um. En la Figura 2.1 se representa una sección de filtro HEPA. El flujo del aire es laminar, sin turbulencias en las que puedan quedar retenidas partículas contaminantes. El flujo laminar se asegura tanto por la gran superficie del filtro HEPA como por la velocidad constante del aire, como por la ausencia de fuentes intensas de calor (mecheros bunsen) en el interior de las cabinas, generadores de intensas corrientes de convección.

Tal como ya se ha indicado, las cabinas de flujo laminar pueden ser de dos tipos: flujo vertical y flujo horizontal, dependiendo de la posición del filtro HEPA y por ello de la dirección del flujo laminar (ver figura 2.2).

Los diferentes tipos de cabinas de flujo laminar se diseñan con diferentes propósitos:

a. Protección personal: protección del personal de los posibles agentes dañinos del interior de la cabina.

b. Protección del producto, experimento o cultivo que se encuentra en el interior de la cabina de los contaminantes exteriores o de la contaminación cruzada con otros productos o cultivos situados en la misma cabina.

c. Protección medioambiental: evitar la salida al medio ambiente de productos o agentes contaminantes.

Las cabinas de flujo laminar horizontal son muy adecuadas para una buena protección del producto, pero no son adecuadas para el trabajo con materiales peligrosos o con algún tipo de riesgo pues el operador queda completamente expuesto. En las cabinas de flujo vertical, más sofisticadas, se segura una buena protección del producto, y, dependiendo de su diseño se puede asegurar una protección total del operador. Son por ello más adecuadas para el trabajo con agentes

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peligrosos.

Dependiendo de la importancia que se le conceda a cada uno de estos factores en el diseño de la cabina se trata de cabinas de clase I, II o III.

1. Cabina de clase I.

Se trata de una unidad de contención parcial adecuada para la manipulación de agentes de bajo riesgo, donde existe una necesidad de protección del operario y del medio pero no del producto. Este es el tipo de cabinas normalmente denominadas "de gases", y no son de uso común en el laboratorio de cultivo de tejidos. Figure de "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories", 3rd edit, CDC (Center for Disease Control) / NIH (National Institutes of Health), p. 142.

2. Cabina de clase II. Este tipo de cabinas protegen el producto, al personal y al medio ambiente. En general las cabinas de clase II se describen como un equipo de protección con un panel frontal de acceso y que mantienen un flujo laminar estable en el interior, con una filtración HEPA para el aire recircularizado en cada ciclo y una filtración HEPA del aire exhausto (de salida al medio). Los sucesivos diseños que se han realizado para cubrir necesidades diferentes permiten clasificar asimismo las cabinas de tipo II en tres subclases : a. Tipo A. En este tipo (figura 2.3.B) el 30 % del aire es eliminado en cada ciclo y el 70 % es recircularizado. El escape al medio de los agentes potencialmente peligrosos se previene mediante una corriente de aire entrante en una rejilla frontal. b. Tipo B. Se trata de una cabina de flujo laminar para uso general (figura 2.3.C), y en ella se recirculariza sólo el 30 % del aire en cada ciclo, eliminándose el 70 % del aire restante. c. Tipo 100 % exhausto. Se trata de una cabina en la que el 100 % del aire de cada ciclo es eliminado hacia dispositivos que puedan retener los posibles agentes peligrosos (figura 2.3.D). Este tipo de cabinas se emplean fundamentalmente en laboratorios de toxicología en los que se requieren áreas de contención limpias y eliminación del aire posiblemente contaminado. Las diferencias entre estos tres subtipos se refieren especialmente a la protección del usuario, superior en el caso del tipo A, y a la eliminación de la cabina de posibles contaminaciones de tipo aerosol, no retenibles por el filtro HEPA. La tipo A, que es la más adecuada para el trabajo con agentes patógenos particulados (filtrables) es la menos adecuada para el trabajo con vapores o aerosoles peligrosos. Asimismo se ha de tener en cuenta que el funcionamiento correcto para la protección del producto y del personal depende de una correcta calibración del instrumento, especialmente de las velocidades respectivas de entrada de aire en el sistema y de flujo vertical. El punto de calibración o ajuste es

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dependiente del instrumento y debe ser realizado por personal especializado cada 6 a 9 meses de funcionamiento para asegurar la protección al usuario. Figure de "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories", 3rd edit, CDC (Center for Disease Control) / NIH (National Institutes of Health), p. 143. 3. Cabina de clase III. Se trata de una cabina de seguridad, estanca, para el trabajo con agentes biológicos de alto riesgo. Permite mantener al agente patógeno en un ambiente completamente estanco. Permiten controlar tanto los contaminantes particulados como aerosoles y contaminantes gaseosos mediante sistemas de filtración y disolución de éstos. Figure de "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories", 3rd edit, CDC (Center for Disease Control) / NIH (National Institutes of Health), p. 145.

• Incubadores de CO2.

El mantenimiento de la temperatura en una atmósfera con una tensión controlada de CO2 y adicionalmente de humedad elevada es el objetivo del incubador de CO2.

Un incubador moderno dispone de :

1. dispositivos de control de temperatura, con un termostato de seguridad que desconecta la función en caso de anomalía. La estabilidad de la temperatura es una característica esencial del incubador, y por ello suelen estar equipados con camisas de agua ('water jacketed') que incrementan notablemente la inercia térmica. Como consecuencia la estabilización de un incubador puede tardar varios días.

2. dispositivo de inyección de una mezcla de aire y CO2, en la proporción deseada, entre el 4 y el 7 %. El CO2 de elevada pureza se suministra en botellas presurizadas, y se mezcla en el dispositivo de inyección. El control de la mezcla se realiza fundamentalmente mediante un dispositivo IRGA ("infra-red gas analyzer") . En incubadores modernos este dispositivo analiza constantemente el porcentaje de CO2 presente en la cámara de incubación, y realiza las correcciones necesarias. Un problema usual del dispositivo de medida de CO2 es la pérdida de calibración que se produce periódicamente. para evitarlo algunos fabricantes dotan al sistema de un mecanismo de autocalibración periódica (basado en la toma de una muestra de aire exterior que se considera tiene un valor x de CO2).

3. dispositivo de control de la humedad ambiente. Para mantener el cultivo se requiere una humedad ambiente elevada, a fin de reducir la evaporación de

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agua del medio de cultivo. En los incubadores menos sofisticados esto se consigue mediante bandejas de agua en el fondo del incubador. Este recurso es peligroso pues son una fuente importante de contaminaciones al convertirse a los pocos días en caldos de cultivo. En los instrumentos más modernos se dispone de dispositivos que controlan la humedad atmosférica, inyectando agua estéril y filtrada.

4. dispositivo de recircularización de aire. Es importante una recirculación del aire en el interior del incubador, a fin de homogeneizar la temperatura en su interior. Si además en el circuito de circulación de aire se intercala un filtro HEPA se consiguen eliminar las posibles partículas contaminantes, y se asegura la esterilidad del ambiente.

Las condiciones del cultivo: temperatura, humedad atmosférica y niveles de CO2 son característicos de cada línea celular. El nivel de CO2 se establece para mantener el equilibrio carbonato-bicarbonato en el medio de cultivo, habitualmente al 5%.

Puedes encontrar información de actualidad en los sitios Web de las empresas que fabrican estos incubadores: Forma, Revco, Jouan, ...

• Microscopios.

El control morfológico del cultivo se realiza mediante el uso de un microscopio. El hecho de que las muestras a observar se encuentren en recipientes de un cierto grosor (más de 3 cm. en el caso de frascos de Roux de 250 ml) hace que un microscopio convencional no sea adecuado (por su pequeña distancia frontal), por lo que se han desarrollado microscopios de diseño original, en los cuales la fuente de iluminación y los objetivos se encuentran invertidos respecto a la platina de un microscopio óptico convencional (figura 2.5).

La segunda característica que condiciona el instrumento óptico es su ausencia de color, es decir se trata de muestras vivas y con poco contraste. El microscopio se equipa con el dispositivo de contraste de fases (diafragmas anulares a nivel del condensador y placa de fases entre las lentes del objetivo). De esta forma el contraste de la imagen aumenta y la calidad obtenida es muy superior.

Es de gran utilidad disponer asimismo de un dispositivo de captación de imágenes, fotográfico o de video acoplado al microscopio a fin de documentar el estado de los cultivos.

Congeladores e instalación de criogenia (depósito de N2 líquido)

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Es recomendable que los congeladores y la instalación de criogenia estén en recintos separados a la unidad de cultivo propiamente dicha pues los ventiladores y compresores son una fuente importante de turbulencias y suciedad en el laboratorio.

Es preciso el almacenamiento de soluciones y células a diferentes temperaturas, para lo que se requiere:

1. neveras (4 ºC) para el almacenamiento de medios, PBS, ...

2. congeladores de -20 ºC para el almacenamiento de suero, aditivos (glutamina, antibióticos) y soluciones enzimáticas (tripsina, colagenasa,...).

3. congeladores de -80 ºC para el almacenamiento a largo plazo de los aditivos del medio (suero, glutamina, antibióticos,...) y de sustancias especialmente sensibles (factores de crecimiento, mitogenos, inductores,...).

4. unidad de almacenamiento en nitrógeno líquido (-196 ºC), para el almacenamiento de las líneas celulares.

Otros instrumentos : centrífugas, contador de células electrónico ("cell counter"), equipo de purificación de agua, balanzas, pH-metro, pipeteadores...

Además del equipo antes citado el laboratorio de cultivo de tejidos deberá estar equipado con otros instrumentos que, o bien no son imprescindibles para un laboratorio de tamaño pequeño (por ej. el contador electrónico de células), o bien son instrumentos que forman parte de un laboratorio de uso más general (centrífugas, equipo de purificación de agua, balanzas, pH-metro, pipeteadores...).

Centrífugas.

En el laboratorio de cultivo de tejidos es necesario disponer de una centrífuga refrigerada, preferentemente con posibilidades de usar en ella desde tubos de pequeño volumen (1 a 2 ml) a botellas de gran capacidad (250 a 500 ml). Normalmente, para la mayor parte de las aplicaciones bastará con un instrumento que desarrolle hasta 2000 xg.

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La centrífuga se ha de instalar dentro de lo posible alejada de las cabinas de flujo laminar, para evitar las turbulencias de aire que genera.

Contador electrónico de células ("cell counter").

Un contador electrónico de células es un instrumento capaz de contar y medir partículas en suspensión. Este instrumento fue comercializado por Coulter Electronics, y a pesar que posteriormente se han desarrollado métodos alternativos es aún hoy en dia el mecanismo más empleado.

El sistema está formado por los siguientes elementos :

1. dos electrodos, uno en el interior de un tubo con un pequeño orificio que se introduce en la suspensión de partículas a contar, y un segundo electrodo que se introduce directamente en dicha suspensión. El tubo con el orificio está conectado a un manómetro de mercurio y a una bomba. El manómetro controla mediante el desplazamiento del mercurio la conexión y desconexión de los electrodos.

2. un amplificador electrónico de la señal, un analizador de altura de los pulsos, y una escala, conectados a los electrodos.

Cuando la válvula que controla el manómetro se abre 0.5 ml de la suspensión entran en el interior del tubo por el pequeño orificio. Durante ese tiempo los electrodos están conectados y registran y transmiten al equipo de amplificación y análisis de la señal las oscilaciones de resistencia que detectan. Cada vez que una célula atraviesa el orificio se produce una variación de la resistencia proporcional al tamaño. Estos datos se registran y se analizan.

Cámara de Neubauer.

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La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos lineas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada L corresponde a 1 milimetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro.

Equipo de purificación de agua.

Es de gran importancia en la preparación de los medios, de los aditivos, o en cualquier solución que pueda estar en contacto con el cultivo, una absoluta esterilidad y ausencia de sustancias que puedan provocar alguna alteración al cultivo. Por ello se utiliza siempre agua de la máxima calidad (tipo MilliQ, Millipore) obtenida mediante equipos de doble destilación o de intercambio iónico y filtración. Es muy importante la eliminación de apirógenos, y restos de materia orgánica.

Pipeteadores y Micropipetas

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Se trata de dispositivos o instrumentos para el trasvase o medición de fluidos. Los de uso común en el laboratorio como las pipetas automáticas y las pipetas, pero con la salvedad del uso de bombas acopladas a la pipeta, manuales o eléctricas que permiten la aspiración mecánica del fluido. Importante para mantener la asepsia y al mismo tiempo para la protección del operador. El aire bombeado es filtrado previamente.

LAVADO, ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES DE CULTIVOS, PREPARCIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS, MANTENIMIENTO DE STOCKS, GESTIÓN DE TODO EL TRABAJO.

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Juan Rebelles

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ESTERILIZACION Y PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVOS CELULARES Tanto en cultivos celulares de céllas eucarióticas, así como de microorganismoses imprescindible que todo el material que se utilice esté privado de toda clase de microorganismos, ya sean saprofitos o patógenos. Esterilizar es destruir todo vestigio de vida.

Métodos físicos de esterilización

Calor directo Flameado Asas, Varillas, Placas, Tubos

Calor seco Horno Pasteur Material de vidrio, Placas, Tubos , pipetas

Calor Húmedo Autoclave tyndalizador Hervidor Medios de cultivos, Apósitos

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Filtración Bujías filtrantes filtros de membrana filtros Seitz de placa

Líquidos

COMPOSICIÓN DE DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVOS: HSC 2002

76 DMEM / F-12 comercial 1 litro

77 HEPES 1M (comercial) 5 ml

78 GLUCOSA G- 7021 de Sigma 6 gs

79 Albumax al 0.5 % 5 gs

Se agita durante 1 hora exacta HSC 2002 medio de congelación

76 DMEM / F-12 comercial 100 ml

77 HEPES 1M (comercial) 500 µl

78 GLUCOSA G- 7021 de Sigma 0.6 gr

79 Albumax al 5 % 5 gr

Tripsina 0,25 % (Edificio nuevo) Difco rf. 215240 81 Tripsina 2,5 gr

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PBS 10 X 100 ml

8 glucosa 1,1 gr

Rojo fenol 1 % 1,5 ml

H2O hasta 1 litro

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PBS –BSA 1 % PBS 10 X 100 ml

8 Glucosa 1.19 gr

80 BSA 1 % 10 gr

H2O hasta 1 litro

LOCKE’S Solución PH 7.4

3 Cloruro sodico Na CL 9 gr

4 Cloruro potasico K CL 0.32 gr

10 Bicarbonato sodico Na H CO3 0.30 gr

2 Cloruro calcico Ca CL2 (2H2O) 0.29 gr

8 Glucosa 1.11 gr

47 Hepes 2.38 gr

H2O hasta 1 litro

McCoY’s PH= 7,2

82 McCoY’s 11.9 gr

10 Bicarbonato sodico Na H CO3 2.2 gr

H2O hasta 1 litro

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GLUTAMINA 200 mM

21 L - glutamina 29,23

dH2 O hasta 1 litro

Se añade 10 ml / litro de medio de cultivo Se esteriliza por filtración a presión con membranas de 0,2 μ, 0,45 μ, y prefiltro Se reparte en alicuotas de 10 ml Se almacena a –20ºC AMINOACIDOS NO ESENCIALES 100 X 16 L -alanina 3,92 gr

18 L –asparagina dH2 O 6 gr

14 L – ácido aspartico 5,32 gr

15 L –ácido glutamico 5,88 gr

29 L - prolina 4,6 gr

dH2 O hasta 1 litro

Se reparte en alicuotas de 10 ml Se esteriliza por filtración a presión con membranas de 0,2 μ, 0,45 μ, y prefiltro Se almacena a – 20ºC Se ajusta con NaOH (sosa) 10 N el pH a 7 ROJO FENOL 1 %

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37 Rojo fenol 2,5 gr

13 NaOH 1N 8,12 ml

dH2 O hasta 250 ml

Se esteriliza en autoclave 15 min. a 120 ºC Se almacena a 4ºC BSS

2 Ca CL2 2H2 O 1,5 gr

3 Na CL 80 gr

4 K CL 4 gr

42 Mg SO4 7H2 O 2 gr

44 CL2 Mg 6H2 O 2 gr

11 KH2 PO4 0,6 gr

12 Na2 H PO4 5 gr

Rojo fenol 1% 10 ml

dH2 O hasta 10 litros

pH 7,2…..7,4 (se filtra y se guarda a 4ºC) EDTA 0,02%

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45 EDTA 0,2 gr

PBS 10 X 100 ML

37 Rojo fenol 1% 1,5 ml

dH2 O hasta 1 litro

Se reparte en alicuotas de 80 ml Se esteriliza en autoclave 15 min. a 120º C Se almacena a –20 º C PBS 10 X

3 Na CL 800 gr

4 K CL 20 gr

12 PO4 HNa2 12H2O 289,6 gr

11 PO4 H2K 20 gr

dH2O hasta 10 litros

Se esteriliza en autoclave 20 min. a 120º C Se hacen alicuotas de 1 litro Se almacena a 4ºC

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PBS 1X

3 Na CL 8 gr

4 K CL 0,2 gr

12 PO4 HNa2 12H2O 2,9 gr

11 PO4 H2K 0,2 gr

dH2O hasta 1 litro

Se esteriliza en autoclave 20 min. a 120º C Se almacena a 4ºC CLORURO POTÁSICO 20%

Se guarda a 4ºC

ANTIMICOTICO 200 Mg / L ( 0,02 % )

1 Antimicotico 0,2 gr

dH2O hasta 1 litro

Se guarda a 4ºC Se disuelve calentando a 60 ºC MEDIO M 3 42 Sulfato de magnesio 7H2O 4,40 gr

2 Cloruro cálcico 2H2O 1 gr

59 Glutamato potasico 7,88 gr

4 Cloruro potásico 50 gr

dH2O hasta 250 ml

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63 Glutamato sódico 6,53 gr

39 dihidrogeno fosfato Na dihidratado (Na H2 PO4 2H2O) 0.8 gr

8 Glucosa 10 gr

61 Acido Oxalacético 0,25 gr

62 Bis-tris 1,05 gr

66 TC- yeastolate 1 gr

14 Ácido aspartico 0,30 gr

31 Threonina 0,50 gr

30 Serina 0,35 gr

18 Asparagina 0,30 gr

21 Glutamina 0,60 gr

29 Prolina 0 40 gr

20 Glicina 0,50 gr

16 Alanina 1,50 gr

34 Valina 0,40 gr

27 methionina 0,25 gr

24 Isoleucina 0,25 gr

25 Leucina 0,40 gr

32 tirosina 0,25 gr

28 Phenylalanina 0,25 gr

64 B- alanina 0,25 gr

22 Histidina HCl 0,55 gr

33 Trytophano 0,10 gr

17 Arginina 0,50 gr

26 Lisina HCl 0,85 gr

69 cisteina HCl 0,20 gr

65 Colina HCl 0,05 gr

9 Hidrogeno carbonato K (ojo) 0,50 gr

dH2O hasta 1 litro Se ajusta el pH a 6,6 con Na OH 1% (ojo) se añade el hidrogeno carbonato k después de ajustar el pH a 6,6 y se vuelve a ajustar el pH a 6,8

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TC- 100

49 TC-100 20 gr

Se ajusta a pH a 5 con ácido clorhídrico (H CL)

10 Bicarbonato Na (HCO3 Na) 0,35 gr

Se ajusta el pH a 6,2 con Hidróxido potasico 10 N

dH2O hasta 1 litro

Se esteriliza por filtración a presión con membranas de 0,2 μ, 0,45 μ, y prefiltro Se almacena a 4ºC

Hidróxido potasico 10N

51 Hidróxido potasico (KOH) 28 gr

dH2O hasta 50 ml

Se almacena a 4ºC Tripsina EDTA 10X comercial

54 Tripsina EDTA 10X 100 ml

PBS 10 X 100 ml

dH2O hasta 1 litro

Se esteriliza por filtración a presión con membranas de 0,2 μ, 0,45 μ, y prefiltro Se almacena a – 20ºC

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PBS 1X completo

PBS 10 X 1 litro

2 Cloruro cálcico (Ca Cl2 2H2 O) 1,32 gr

44 Cloruro de magnesio (Mg Cl2 2H2O) 1 gr

dH2O hasta 10 litros

Se esteriliza por filtración a presión con membranas de 0,2 μm, 0,45 μm, y prefiltro Se almacena a 4ºC RPMI

38 RPMI 104,2 gr

10 Bicarbonato Na (CO3 H Na) 20 gr

dH2O hasta 10 litros

Se gasea con CO2 Se esteriliza por filtración a presión con membranas de 0,2 μ, 0,45 μ, y prefiltro Se almacena a 4ºC Mezcla de antibióticos

6 Estreptomicina sulfato 10 gr

35 Penicilina G 1580 u / mg 6,32 gr

dH2O hasta 100 ml

Estreptomicina sulfato (100 mg / ml) Penicilina G 1580 u / mg (105 u / ml)

Se utiliza a 1 / 1000 Se esteriliza por filtración a presión con membranas de 0,2 μ, 0,45 μ, y prefiltro Se almacena a – 20ºC

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CARMEN PUNZON Células linfocitarias, y cultivos en suspensión. Congelación de lineas celulares

1. Crecer la linea celular en placas p100 (o flash 75 ) en fase media de crecimiento logaritmico.

2. Marcar el vial de congelación con nombre de la linea celular, número de células, y fecha.

3. Transferir las celulas a un tubo de centrifuga. En caso de células adherentes al plastico se deben despegar.

4. Centrifugar las células 5 min. A 1200rpm, temperatura ambiente. Deshechar el sobrenadante.

5. Añadir medio de congelación al pellet celular lentamente (gota a gota hasta aproximadamente 1ml), concentración final de células debe ser de 5-10 millones células/ml. El medio de congelación es Suero con 10%de DMSO.

6. Transferirle vial con las células resuspendidas en medio de congelación a una caja de congelación a -70ºC.

7. Transferir las células a un tanque de nitrogeno liquido. Descongelación de lineas celulares

1. Coger el vial congelado de -70ºC o tel tanque de nitrógeno y ponerlo en nieve Carbónica para disminuir el proceso de descongelación.

2. Colocar el vial en un Baño a 37ºC. Mover el vial hasta que las células esten descongeladas.

3. Limpiar el vial con etanol 70%. 4. Transferir con una pipeta del pellet a un tubo de centrífuga y añadir lentamente 9ml de medio, tapar el tubo y centrifugar a 1200 rpm, temperatura ambiente y

Deshechar el sobreadante. 5. Resuspender las células en medio y transferir a una placa de cultivo o flask. 6. Mirar las células en un microscopio invertido.

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Obtención de esplenocitos

1. Depositar el bazo en una placa Petri (p100) que contenga de 8-10ml de medio RPMI completo sin suero.

2. Se coge por la parte inferior una jeringa de 20ml estéril de tal forma que lo que

tenemos en el extremo superior es el émbolo. Con el embolo, se aplastan los bazos depositados en un filtro de nylon situado en un tubo falcon de 50ml, asi hasta que queden completamente disgregados., añadiendo medio RPMI.

3. La suspensión de células obtenidas de los bazos que hay en el tubo, se centrifugan a

1500 rpm, temperatura ambiente y descartar el sobrenadante.

4. Lisis de eritrocitos: resuspender el pellet celular en 1-3 ml de tampón de lisis a 4ºC y dejar en esta solución 1-2 minutos sobre hielo.

5. Añadir 20ml de RPMI sin suero y centrifugar de nuevo.

6. Resuspender el pellet de las células en RPMI con 5% de suero, contar las células y

plaquear .

7. Dejar las células 48-72 horas para ver proliferación.

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Clonaje de hibridomas

1. Contar células viables usando un hemocitometro y azul tripan. Las células

resuspendidas en RPMI con 10% de suero.

2. Preparar una placa de 96 pocillos.

3. Cacular las células para poner una célula por pocillo y 10 células por pocillo.

4. Esperar que las células formen clones.

5. Una vez formado los clones expandir a una placa de 48 pocillos y asi sucesivamente .

Es conveniente congelar en cada paso por posibles contaminaciones.

6. Recoger sobrenadante para testar el anticuerpo monoclonal.

Isabel Liste Noya Cultivo y diferenciación de células ES. Guión Curso de Cultivos Celulares 2008 Técnicas de cultivo y diferenciación de células madre embrionarias (ESCs) Isabel Liste; CBMSO, lab 305 Objetivo del curso: El estudio de las células madre, y en concreto, de las células madre embrionarias (ESCs), esta teniendo una enorme importancia en el desarrollo de futuras terapias celulares para

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enfermedades degenerativas y el cáncer, siendo además una excelente herramienta para el estudio del desarrollo embrionario temprano. Este curso pretende introducir y familiarizar al alumno con la puesta en cultivo y el posible uso/aplicación de estas células. Partes del Curso: El curso se dividirá en: 1 - Una introducción teórica 2 - Demostración/observación al microscopio de los distintos tipos celulares y técnicas antes descritas. 3 - Prácticas en el laboratorio de cultivos: 1. Introducción teórica: - Definición de células madre, características y tipos. - Definición de células ESCs (embryonic stem cells), características, obtención, cultivo y aplicaciones. 2. Demostración/Observación: - Observación al microscopio de los distintos tipos celulares y técnicas descritas en la introducción teórica. 3. Prácticas en el laboratorio de cultivos: - Obtención/derivación de fibroblastos embrionarios de raton (MEF); cultivo, congelación/descongelación. - Cultivo, congelación y descongelación de células estromales (PA6). - Preparación de las células nodrizas para su uso en el crecimiento y diferenciación de células ESCs. - Siembra y observación de células ESCs. Tipos celulares que se van a utilizar: A) Células nodrizas o ”feeder-layers” - Fibroblastos de ratón (MEF) (cultivo primario obtenido de embriones de ratón) y humanos (hFF) (derivados de la piel); usados para el crecimiento, expansión de células ES. Derivación, cultivo, congelación y descongelación. - Células estromales de ratón (PA6; OP9…); usados como nodrizas para la diferenciación de células ES. Cultivo, congelación y descongelación. B) Células ES de ratón - Usaremos una o dos líneas comúnmente utilizadas y ampliamente caracterizadas (R1 y/o E14). BREVE INTRODUCCION TEORICA Definición de célula troncal o “stem cell” y tipos: Podemos definir, a nivel muy general, una célula troncal como: aquella célula capaz de autoreplicarse/ renovarse y que puede diferenciarse hacia células mucho mas especializadas. En

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función de su capacidad de “diferenciación” se pueden distinguir distintos tipos de células troncales: 1) Totipotentes. Son las células procedentes de las primeras divisiones después de la fertilización del óvulo (estadio de mórula); pueden dar origen tanto a tipos embrionarios como extra-embrionarios. 2) Pluripotentes: Células derivadas del blastocisto embrionario, que pueden dar lugar, tras su diferenciación , a células de las tres líneas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo). Recientemente se ha conseguido la inducción de células pluripotentes (iPS) a partir de células somáticas humanas, simplemente mediante la introducción genética de 4 factores (Takahashi y col., 2007). 3) Multipotentes: Solo pueden producir un determinado tipo de linaje, próximo a ellas ( por ejemplo, las células troncales neurales pueden diferenciarse solo hacia: neuronas y glia). 4) Unipotentes: Células que solo pueden producir un tipo celular, aunque si tienen la capacidad de auto-renovación (por ejemplo stem cells del músculo). Fig. 1. Esquema representando los distintos tipos de células troncales atendiendo a su capacidad de diferenciación. Definición, características y cultivo de las células troncales embrionarias o ES. Son células derivadas de la masa celular interna del blastocisto embrionario (3.5 días postfertilización en ratón y 5-6 días post-fertilización en humano) (Thomson y col., 1998; Evans y Kaufman, 1981; Martin, 1981). Se caracterizan por su capacidad de proliferación o autorenovación y por su pluripotencia y gran plasticidad a nivel de diferenciación. De tal forma, que podrían generar todos los tipos celulares de un organismo si se les diferencia en las condiciones adecuadas. En general, para el mantenimiento de sus propiedades durante la proliferación/expansión necesitan de una capa de células nodrizas. Las nodrizas mas ampliamente usadas son los fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) que se han venido utilizando tanto para el crecimiento de ES de ratón (mES) como ES humanas (hES). Sin embargo, en estas ultimas, se tiende a sustituir los MEF por fibroblastos humanos (hFF), con el fin de evitar contaminaciones cruzadas o infección con virus de origen murino. Las celulas mES necesitan para su proliferación

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de la adición al medio de una citoquina, LIF (Leukemia inhibitory factor), mientras que en hES se usa un factor de crecimiento, el FGF2. Fig. 2. Fotos en contraste de fase de colonias de células troncales embrionarias de ratón (mES; foto izquierda) y de hES (foto derecha) creciendo sobre células las nodrizas, MEF. Diferenciación de células ES en cultivo: métodos Para la diferenciación de las células ES se han usado tres métodos diferentes (según el tipo celular a generar) (Keller, 2005). 1) Formación de cuerpos embrionarios (EBs), en el cual las células ES se agregan entre ellas generando estructuras tridimensionales en flotación, no se usan células nodrizas. 2) El segundo método consiste en la diferenciación de ES directamente sobre células nodrizas, generalmente se usan células estromales de ratón. 3) Como método alternativo también se ha usado la diferenciación sobre una monocapa de proteínas de la matriz extracelular. Mediante el empleo de los protocolos anteriores, se han conseguido generar hasta el momento un elevado número de células especializadas o precursores representativos de las tres líneas germinales (ver tabla adjunta a modo de resumen). 1) Diferenciación hacia ectodermo: incluyendo células de la piel, cornea, y diferentes tipos de células neurales y neuronales (neuronas dopaminérgicas, motoneuronas, oligodendrocitos, etc.). 2) Diferenciación hacia linaje mesodérmico: como la derivación de osteoblastos, condrocitos, cardiomiocitos, células hematopoyéticas y diferentes tipos de células sanguíneas. 3) Diferenciación hacia endodermo: cabe destacar principalmente la derivación de células pancreáticas y hepatocitos a partir de células ES. Fig.3. Esquema representativo de los 3 diferentes protocolos usados para diferenciar células ES (Keller, 2005). Tabla 1. Tabla resumen de los diferentes tipos celulares especializados obtenidos hasta el momento despues de la diferenciación de celulas ES humanas. (Metallo y col. 2008). Posibles aplicaciones de las células troncales embrionarias: Dadas sus características, las posibles aplicaciones de las células ES son múltiples: A) Terapia celular: se podrían utilizar para generar células y tejidos de reemplazo para tratar muchas enfermedades y lesiones, incluyendo: Enfermedad de Parkinson, diabetes, lesión

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traumática de la medula espinal, lesiones de la piel, etc. B) Estudio a nivel molecular y celular del desarrollo embrionario temprano. Muy poco conocido hasta el momento, sobre todo en humanos. C) Screening y desarrollo de nuevas drogas/fármacos. Las células especializadas derivadas de ES (diferentes subtipos neuronales, células pancreáticas, etc.) podrían, en un futuro, servir para el testaje de nuevos fármacos y para estudios de excitotoxicidad. D) Modelos de enfermedades “in vitro”. Al igual que en el caso anterior, las células diferenciadas pueden servir para la obtención de modelos de diferentes enfermedades en una placa de cultivo, disminuyendo la necesidad del uso de animales. A pesar del enorme potencial que suponen las células ES, existen limitaciones en su uso por el momento, asociadas a : 1) La gran controversia a nivel ético/moral que suscitan. 2) Falta todavía de condiciones definidas de cultivo y diferenciación. 3) La gran heterogeneidad de los cultivos celulares obtenidos tras la diferenciación y la presencia de células indiferenciadas que podrían causar tumores “in vivo”, etc. Bibliografía - Bryja V. y col. (2006). Derivation of mouse embryonic stem cells. Nat. Protoc. 1: 2082-87. - Evans MJ. And Kaufman M. (1981). Establishment in culture of pluripotential stem cell lines from mouse embryos. Nature 292: 151-56. - Hovatta O. y col. (2003). A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Human Reproduction 18: 1404-09. - Keller G. (2005). Embryonic stem cell differentiation: emergence of aa new era in biology and medicine. Genes Dev. 19: 1129-55. - Martin GR. (1981). Isolation of a pluripotent stem cell line from early Mouse embryos cultured in médium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 7634-38. - Metallo CM. Y col. (2008). Engineering tissue from human embryonic stem cells. J. Cell. Mol. Med. 12: 709-29. - Takahashi K. y col. (2007). Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131: 861-72. - Thomson JA. y col. (1998). Embryonic stem cells derived from human blastocysts. Science 282: 1142-45.

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COMPOSICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO DE LOS DISTINTOS TIPOS CELULARES. Mouse stromal cells (PA6) medium • αMEM (Gibco, ref: 32571-028) • 10% FBS (Gibco, ref: 10270-106) • 1% L-Glutamine PA6 freezing medium • 80% PA6 medium • 10% FBS • 10% DMSO hF/ MEF medium • DMEM • 10% FB hF/ MEF freezing medium • 80% medium • 10% FBS • 10% DMSO Mitomycin C (Roche) • Use 10 μg/ml (stock 1mg/ml), medium (PA6 or MEF). Remove the old medium and add new medium with Mitomycin for 2-4 hours (at 37oC). After that, wash the cells with PBS, trypsinize, count the cells, and plate them again in plates of your election. • Mitomycin C can be used also at 1 μg/ml for overnight treatment of the cells. mESC proliferation medium (500ml) • 500 ml Knockout medium (Gibco) • 75 ml 15% Knockout Serum Replacement (Gibco) • 5 ml 200 mM L-Glutamine (Gibco) • 5ml 1:100 non-essential aminoacids • 5ml 10.000 U/ml pen/strep • 500μl 1000U/ml LIF (ESGRO) • 1ml 0.1 mM β-ME mES freezing medium • 90% FBS (Gibco) • 10% DMSO ) mESC differentiation medium (example of differentiation into dopaminergic neurons, Barberi et al., 2003; Nat. Biotechnol.) • SRM (=proliferation medium without LIF) • 200 ng/ml Shh (2 μl Shh/3 ml medium) stock: 0,311 μg/ μl • 20-100 ng/ml FGF8 (0,8-4 μl/ml medium) stock: 25 ng/ μl • 10 ng/ml bFGF (1 μl/ml) stock: 10ng/ μl • 200 μM AA (2 μl/ml) stock: 100mM • 20ng/μl BDNF (1 μl/ml) stock: 20ng/ μl • 30 ng/ μl GDNF (3 μl/ml) stock: 10ng/ μl • N2 mESC differentiation protocol (Barberi et al., 2003) Basically the protocol is based on plating mES cells in low density on stromal-feeders (we use PA6

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cell line, from Riken Cell Bank, Japan), and posterior factor and media addition as follows: Day: 0 5 8 11 14 SRM SRM + FGF8 N2 + FGF8 + Shh N2 + AA +BDNF + Shh + FGF2 + GDNF Derivación de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) Equipamiento requerido: - Cabina de cultivos - Incubador a 37oC con 5% de C02 - Lupa de disección - Centrifuga Material requerido: - Ratones (hembras) de 13-14 días de gestación - Tijeras de disección - Etanol 70% - Pinzas - Pipetas - Placas cultivo - Tubos Falcon Medios y Tampones: - PBS frío (sobre hielo) - Tripsina (0.25%) - Medio cultivo MEF (DMEM 1X + 10 % FBS + Antibiótico) - Medio congelación MEF (medio MEF + 10% FBS + 10% DMSO). Protocolo a seguir: - Decapitación de la hembra gestante - Rociar el abdomen con etanol 70% - Separar el útero conteniendo los embriones, depositarlo directamente en PBS frío (placa Petri o tubo de 50 ml) - Abrir los sacos embrionarios vitelinos dejando los embriones al descubierto - Lavar los embriones con PBS limpio y frio. - Eliminar la cabeza y todas las visceras de cada embrión. - Pasar a otra placa con PBS y seccionar lo mas posible. - Pasar los trozos a un falcon y añadir 3 ml de tripsina/EDTA (0.25%). - Incubar a 37º aprox. 30 min. - Añadir 7 ml de medio (MEF) y pipetear 20-30 veces. - Dejar reposar hasta que se forme un pellet en el fondo del falcon. - Eliminar el sobrenadante y repetir el proceso de disgregación. - Añadir mas medio y centrifugar 5 min a 900 rpm. - Resuspender en suficiente medio, según pellet. - Sembrar en placas de 10 o 15 cm. - Dejar crecer las células hasta que estén confluentes y congelar parte de ellas. - Otra parte puede ser tripsinizada y pasada a nuevas placas, para su uso y mantenimiento.

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MICROBIOLOGIA Miguel Remacha MEDIOS DE CULTIVO PARA MICROORGANISMOS

El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los microorganismos. Composición de un medio de cultivo: - componentes indispensables: agua, nutrientes orgánicos (hidratos de carbono, aminoácidos, vitaminas, etc.), nutrientes inorgánicos (P, N, Mg, S, etc.) - componentes alternativos: isosmotizantes (NaCl), agente solidificante (agar-agar), tampones, indicadores de pH, etc. Tipos de medios de cultivo: a) En función de su consistencia: - medios líquidos - medios sólidos (en tubo, en placa) - medios semisólidos b) En función de su composición: - medios complejos (caldo ordinario, extracto de levadura) - medios sintéticos c) Existen medios de cultivo cuya composición permite el crecimiento de una gran diversidad de microorganismos (agar nutritivo, caldo ordinario). Otros en cambio, se utilizan para la selección de determinados grupos de organismos, o se desarrollan para el estudio de determinadas pruebas fisiológicas o test bioquímicos. - medios selectivos - medios diferenciales - enriquecimientos - medios para test bioquímicos (utilización de citratos, acidificación a partir de azúcares, etc.).

Preparación de medios de cultivo:

Caldo común. Composición por litro: Extracto de carne 3 g Peptona bacteriológica 10 g Cloruro sódico 5 g Para prepararlo, se añaden los distintos componentes en un matraz, se disuelven en agua, se ajusta el pH a 7.2-7.4 y se lleva al volumen final correspondiente. Posteriormente, se reparten en tubos o matraces. Los recipientes se aíslan con tapones metálicos o de algodón graso envuelto en gasa y se esterilizan a 1 atm de sobrepresión durante 20 minutos.

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Agar nutritivo. La composición es la misma que la del caldo común, pero se añade antes de esterilizar 15 g de agar por litro, disolviéndolo durante la esterilización. Cuando aún está caliente, se agita para hacer la disolución de agar homogénea y se extiende en placas (a 45ºC) y en tubos, que seguidamente son inclinados para obtener una superficie más extensa. Medios selectivos. El resto de los medios utilizados ya vienen premezclados en forma deshidratada y listos para su reconstitución. Las principales características a destacar de su composición son: Agar de McConkey (MC). Contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro) que vira hacia rojo a pH ácido cuando la lactosa es fermentada. Además, contiene sales biliares que inhiben el crecimiento de muchas bacterias, especialmente Gram positivas. Agar Baird Parker (BP). Contiene telurito potásico, que lo hace selectivo (al inhibir a las bacterias gram negativas) y diferencial (al utilizarlo como acceptor electrónico) además de yema de huevo (para detectar actividad lecitinasa).

ESTERILIZACIÓN

La presencia de microorganismos en todos los medios ambientales hace imprescindible que para estudiar una bacteria determinada sea necesario destruir todas aquellas que pudieran encontrarse contaminando los medios o los instrumentos de trabajo. Esto se consigue mediante la ESTERILIZACION, consistente en la destrucción de todo microorganismo. Vamos a utilizar especialmente el calor como método de esterilización. Los medios con contenido acuoso han de ser esterilizados en el AUTOCLAVE mediante calor húmedo, obtenido por calentamiento en un depósito hermético que contiene agua y del que previamente ha sido evacuado el aire. En este sistema el vapor de agua sobrecalentado difunde muy rápidamente, haciendo que los elementos termosensibles de las células se desnaturalicen, especialmente sus enzimas. Por lo tanto, una vez preparados los medios de cultivo hay que proceder a su esterilización en autoclave, realizada habitualmente a 1 atm de sobrepresión (121ºC) durante 15 ó 20 min., salvo en el caso de medios cuyos componentes sufran alteraciones tales que los hagan inadecuados para el crecimiento. Este es el caso de los azúcares, urea, antibióticos, etc

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Por otra parte, todo el material de vidrio se esteriliza mediante calor seco en el Horno Pasteur. Una vez limpio, el material se envuelve en aluminio o se introduce en un contenedor (ej: pipetas en pipetero) y se mantiene en el horno durante dos horas a 160ºC. En el caso de los portainóculos que se están utilizando constantemente, se utiliza el calor directo del mechero, que también sirve para flamear los bordes de tubos, matraces, pipetas, etc.

SIEMBRA DE MICROORGANISMOS

En Microbiología se entiende como siembra el proceso mediante el cual se lleva una porción de una población de microorganismos, denominada entonces inóculo, de un cultivo crecido a un medio nutritivo para su crecimiento. Todo este proceso hay que llevarlo a cabo con instrumentos y medios previamente esterilizados. Es fundamental trabajar siempre próximos a la llama del mechero que, debido a las corrientes de convección verticales que genera son capaces de crear un ambiente estéril en la zona inmediatamente alrededor y debajo de la llama. Como instrumento portainóculos más frecuente se utiliza el asa de siembra, con el que se puede tomar inóculo a partir de colonias o de medio líquido, debido a que mantiene un pequeño volumen de agua por tensión superficial. Para depositar el inóculo en líquido basta con introducir el extremo en el medio y agitar ligeramente. Sobre sólido hay que hacer un recorrido largo sobre la superficie. Procedimiento: Inocular una serie de tres bacterias conocidas: Escherichia coli 37ºC Gram negativa Pseudomonas aeruginosa 37ºC Gram negativa Staphylococcus aureus 37ºC Gram positiva Se inocularán cada una de estas bacterias en un tubo de caldo común y en un tubo de agar inclinado. Se inocularán las tres bacterias en otro tubo de caldo común (las tres en el mismo tubo) para tener un cultivo mixto. A partir de los cultivos anteriores anteriores, se inocularán: a) Crecimiento en medios selectivos-diferenciales. Con las tres bacterias, los medios sólidos preparados anteriormente: McConkey y Baird-Parker. b) Aislamiento de cultivos puros. Con el cultivo mezclado, en una placa de agar común, otra de McConkey y otra de Baird-Parker, al objeto de

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obtener colonias aisladas, bien por agotamiento de la siembra o bien por siembra y esterilización entre recorridos solapantes. c) Estimar la cantidad de bacterias presentes en un cultivo. A partir del cultivo en caldo, se harán diluciones decimales seriadas y vertido de las mismas en una placa de Petri con agar nutritivo,.

I. Preparar una serie de 8 tubos con 0,9 ml de caldo común. II. Mediante una pipeta con una punta estéril, tomar 0,1 ml del cultivo

mixto, y depositarlo 1ml en el primer tubo con 0,9ml (dilución 10-1). Agitar hasta conseguir una suspensión homogénea

III. Con otra punta estéril, transferir de esta primera dilución 0,1ml al siguiente tubo con 0,9 ml de caldo ( dilución 10-2), y así sucesivamente.

IV. Poner 0,1 ml de cada dilución (a partir de 10-4) sobre el centro de una placa con agar nutritivo. Extender por toda la superficie con ayuda de bolas de vidrio estériles.

V. Tras incubar se podrán obtener colonias aisladas. El recuento de estas colonias permitirá conocer el número de células existentes en el cultivo original: Ci = N x D x 10 ( donde Ci=concentración inicial de ufc/ml, N=nº de colonias, D factor de dilución).

OBSERVACION MACROSCOPICA

El tamaño de las bacterias impide verlas a simple vista, para observarlas se necesita un microscopio óptico. Sin embargo, las colonias que forman sobre medios sólidos sí son visibles, y en ellas se puede estudiar una serie de características que nos ayudan a su identificación. A nivel morfológico, podemos estudiar la forma de las colonias, su tamaño, aspecto del borde (liso, rugoso, ondulado, ramificado, etc.), presencia de brillo, color, etc. Incluso sobre medio líquido las bacterias producen modificaciones de interés para su clasificación y que tienen que ver esencialmente con las características de su metabolismo. Así se observa si la turbidez es uniforme, si crecen en el fondo, si lo hacen en la zona superficial, si producen pigmentos, etc. En medios diferenciales/selectivas se pueden observar características adicionales que reflejan el metabolismo de las bacterias sembradas.

OBSERVACION MICROSCOPICA

Puesto que la inmensa mayoría de las bacterias son incoloras, la única forma de observarlas bien en el microscopio óptico consiste en incrementar su contraste con respecto al medio. Esto se consigue mediante su teñido con colorantes o mediante la disposición de una óptica especial de contraste, generalmente de fases, en el microscopio.

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La disponibilidad de sistemas de contraste de fases permite observar a las bacterias vivas y determinar algunas características tales como su movimiento. Procedimiento a) Contraste de fases. Disponer una gota de cultivo líquido, previamente agitado, sobre un portaobjetos y taparlo con un cubre de forma que se establezca una delgada película entre ambos cristales. Posteriormente, se observa con el objetivo de contraste de 40x y el condensador anular en la posición adecuada. Con este sistema se deben de poder distinguir aquellas bacterias con flagelación polar, que se mueven en zig-zags muy rápidos, de la peritricas, de movimientos más suaves y ondulados. En las inmóviles se producen desplazamientos generales por la existencia de corrientes y vibraciones en el medio de observación. b) Tinción. Para observar las bacterias teñidas, hay que proceder previamente a su fijación. Inicialmente se prepara un frotis a partir de medio líquido o dispersando en una gota de agua una porción de células crecidas en sólido. Posteriormente se deshidrata el frotis por calentamiento suave utilizando el reverso de la mano como control de temperatura tras pasar repetidamente el portaobjetos sobre la llama del mechero. Tras la fijación por calor se procede a la tinción.

1) Hacer un frotis y fijar según se indica anteriormente. 2) Cubrir con cristal violeta durante 1 minuto. En este paso, todas

las células quedan teñidas por el colorante. 3) Eliminar el cristal violeta volcando el porta y lavar con agua. 4) Observar al microscopio, sin contraste de fases, con aceite de

inmersión en el objetivo de 100x.

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VIROLOGIA TITULACION DE UN VIRUS BACTERIANO y TRANSDUCCION

Base teórica: Titular una suspensión de virus consiste en determinar el número de unidades

infectivas por ml presente en la misma. En el caso de los virus bacterianos líticos, la titulación se realiza asumiendo que cada unidad infectiva es capaz de producir una placa de lisis sobre un césped bacteriano, lo que es cierto para bajas multiplicidades de infección. Así, determinando el número de placas de lisis producidas al infectar con distintas diluciones de la suspensión de virus, podremos calcular el número de unidades infectivas presentes en la muestra original. Utilizaremos la estirpe de E. coli JM83 que permite la expresión de un bacteriófago lambda utilizado en ingeniería genética (derivado de λRS45) que porta el gen de la β-galactosidasa bajo el control de un potente promotor de transcripción constitutivo, y un gen de resistencia a kanamicina, de forma que podremos seleccionar y detectar la integración en la práctica simultánea de transducción. Como medios para el cultivo e infección se puede utilizar directamente caldo y agar común a los que se añade siempre Cl2Mg a una concentración final de 10mM, al objeto de evitar la disgregación de los componentes de la cápsida del virus. También se utilizará agar blando, que se obtiene añadiendo 0.6% (p/v) de agar al caldo común (con el Cl2Mg presente), y que tiene como función el permitir una difusión limitada de la progenie vírica tras la lisis de la bacteria. Para el ensayo de transducción emplearemos placas de agar de McConkey con el antibiótico kanamicina

Procedimiento:

1) Se prepara un inóculo de la cepa de E. coli a infectar en un medio que contiene 10 mM de Cl2Mg y maltosa al 0.2%, y se deja incubando a 37ºC y con agitación durante la noche anterior (Esto lo hacen los monitores para todo el grupo). 2) Se funden los matraces con el agar blando (con 10mM de Cl2Mg) y se mantienen en estado líquido en los baños a 50ºC (Los monitores hacen esto). 3) Preparar diluciones decimales (tantas como indiquen los monitores) de la suspensión de virus utilizando el caldo común con el magnesio. 4) Disponer 0.2 ml del cultivo de bacterias ya crecido en cinco tubos estériles, y añadir a cada uno 0.1 ml de tres diluciones consecutivas del virus, siguiendo las indicaciones de los monitores. Homogeneizar suavemente e incubar a 37ºC durante 15 minutos con el fin de permitir la adsorción del virus a la superficie de las bacterias.

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5) Añadir también 0,1 ml de la dilución 10-1a otro tubo con 0,1 ml de la bacteria para la práctica de transducción. Incubar en la estufa como en el punto 4. Hacer un control paralelo con igual cantidad de bacterias, pero sin virus.

0.1ml

10 10 10 10 10-1 -2 -3 -4 -5MUESTRA

0.1ml 0.1ml

0.9 ml CC+Mg +20.1ml 0.1ml

6) Añadir 3-4 ml del agar blando (a 45-50ºC) sobre los tres tubos más diluídos, homogeneizar y extender sobre placas de agar común procurando que no queden burbujas. Dejar que se solidifique este agar manteniendo las placas sobre la mesa durante 5-10 minutos. 7) Extender directamente los tubos para la transducción sobre placas de selección de McConkey con kanamicina, empleando para ello bolitas de cristal estériles. 8) Incubar a 37ºC en posición invertida durante toda la noche. 9) Al día siguiente contar las placas de lisis que se han formado en las placas con el agar blando. Puesto que cada una de ellas corresponde a un proceso de infección por un virus único, multiplicando por los factores de dilución correspondientes en cada caso se podrá determinar el TITULO del fago, esto es, el número de unidades infectivas por ml. 10) En las placas de Mc con kanamicina observar si aparecen colonias y el color de éstas. La aparición de colonias rojas indicará que el fago se ha integrado en el cromosoma confiriendo a esta bacteria resistencia al antibiótico de selección y capacidad de utilización de lactosa mediante la introducción de genes procedentes de otras bacterias (Transducción).

Repartir: - Una gradilla para tubos eppendorf - Tres tubos de plástico de 5 ml - Caldo con Magnesio para diluciones - P1000, P200 y puntas estériles - Que esté el baño a 50 ºC con el agar blando - Tres placas de agar común - Dos placas de agar de Mc con kanamicina (AMcK) - Que haya bolitas estériles.

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CÉLULAS DE INSECTOS GENERACIÓN DE UNA PROTEÍNA RECOMBINANTE EN CÉLULAS DE INSECTO

MEDIANTE EL USO DE BACULOVIRUS.

1.- Introducción.

Los baculovirus son una familia de virus infectivos para invertebrados. Poseen un genoma de DNA de doble cadena circular con un tamaño de 80-180 Kb. Se caracterizan por albergar dicha información genética en una cápside recubierta de envoltura viral. Durante la infección se generan dos formas de progenie viral: partículas extracelulares (ECV) y partículas de virus en cuerpos de oclusión, que están formados por la proteína viral poliedrina y que protegen al virus de la inactivación por el entorno. El virus entra en la célula por endocitosis o fusión, la replicación del DNA tiene lugar 6 horas después y, a partir de las 10 horas, el virus empieza a liberarse al medio extracelular, alcanzándose los niveles máximos 36-48 horas. El gen de la poliedrina se ha clonado y secuenciado y se ha visto que no es esencial para el ciclo de infección o replicación del virus en cultivo de tejidos. La sustitución del gen de poliedrina por un “gen de interés”, que lleva a la generación de ECV únicamente, ha sido utilizado para el control de plagas y la producción de proteínas recombinantes,

La utilización del sistema de baculovirus ha surgido como un sistema popular de producción de

proteína recombinante en células eucariotas. Distintos factores han contribuido a su popularidad:

• Al contrario que los sistemas de expresión en células procariotas, el sistema de expresión en células de insecto mediante baculovirus es un sistema eucariótico por lo que las modificaciones posttraduccionales que sufrirán las proteínas recombinantes serán las propias de este sistema.

• El sistema de expresión de baculovirus posibilita la propagación del virus y la obtención de títulos altos que permitirán la infección de un gran número de células de insecto y, por tanto, la producción de una gran cantidad de proteína.

• La mayoría de las proteínas permanecen solubles (cuando son citosólicas) y no embebidas en cuerpos de inclusión, como ocurre en sistemas bacterianos.

• Debido a que el genoma viral es grande, es posible la inclusión segmentos de DNA extraño grandes.

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El sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac está diseñado para generar

baculovirus recombinantes que permitan obtener altos niveles de expresión del gen de interés

en células de insecto.

El sistema Bac-to-Bac consiste en la generación de un baculovirus recombinante por

transposición en un sitio específico de E. Coli en lugar de por recombinación homóloga en

células de insecto. El gen de interés se clona en el vector pFastBacTM y se transformar

bacterias E. Coli competentes DH10Bac. La transposición ocurre entre el vector pFastBac y

el ADN genómico bacteriano en presencia de las proteinas de transposición proporcionadas

por el plásmido Helper. Cuando la transposición tiene lugar correctamente, el cassette de

expresión se inserta dentro del gen LacZ y se visualizan colonias bacterianas blancas. El

DNA genómico se extrae y se transfectan células Sf9 (línea celular derivada de Spodoptera

frugiperda). Después de dos días, se puede aislar el baculovirus recombinante para su

amplificación o expresión.

En esta práctica vamos a infectar células Sf9 con el baculovirus recombinate de GRK2

(quinasa de receptores acoplados a proteínas G) y vamos a analizar la expresión de la

proteína mediante electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS.

2.- Materiales y métodos.

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- Células Sf9. - Medio X-Press (CAMBREX). - Aminoácidos no esenciales. - Gentamicina. - Mezcla de antibióticos. - Baculovirus recombinante de GRK2. - Placas de cultivo p6. - Incubadores a 27ºC y sin CO2. - Tampón fosfato (PBS) (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 2mM, pH 7.4). - Tampón de lisis (Tris-HCl 10 mM pH7.4, EDTA 2mM pH 7.4).

- Inhibidores de proteasas: Benzamidina (10 μg/ml), Inhibidor de Tripsina (10 μg/ml), aprotinina

1x y PMSF (200 μM).

- Albúmina 1 mg/ml. - Reactivo de Bradford.

3.- Infección de las células con el baculovirus.

Levantar las células Sf9 de la placa en el mismo medio en el que se encuentran (no hace falta tripsina) y transferir la suspensión celular a un falcon. A continuación, contar las células utilizando un hemocitómetro y sembrar tres pocillos con 800.000 células/pocillo de p6, completando con medio X-Press (+10 % FBS + aaee + gentamicina + mezcla antibióticos) hasta 2 ml. Incubar a 27ºC sin CO2 durante 1 hora para que las células se adhieran a la placa.

Transcurrido este tiempo, eliminar el medio, añadir 2 ml de medio fresco por las

paredes para no levantar las células y poner en dos pocillos el baculovirus GRK2

previamente diluido 1/100 y 1/1000 en medio X-Press y dejar un tercer pocillo como control.

Incubar a 27ºC sin CO2 durante 48 horas. 4.- Lisis celular (se debe hacer a 4ºC para que las proteínas no se alteren).

Eliminar el medio de la placa utilizando una pipeta pasteur. Lavar las células 2 veces

con 1 ml de tampón fosfato, añadiéndolo con cuidado para que no se levanten las células. A

continuación, añadir otro ml de PBS, levantar y transferir cada pocillo a un tubo eppendorf.

Centrifugar 5 minutos/ 1200 rpm/ 4ºC.

Resuspender el pellet en 100 μl de tampón de lisis (con inhibidores de proteasas) y

homogeneizar con una jeringuilla (10 veces). Centrifugar 15 min./ máx. rpm / 4ºC.

Transferir el sobrenadante a tubos eppendorf nuevos y medir proteína mediante el

método Bradford.

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5.- Determinación de la concentración de proteínas mediante el método Bradford.

Para ello, primero se hace una recta patrón con albúmina, en la cual se interpolarán los

valores obtenidos para los diferentes puntos.

- Trazar la recta patrón con 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 μg de albúmina y completar con

agua hasta 200 μl. Añadir 50 μl de reactivo de Bradford y agitar.

- Preparar, así mismo, duplicados con 4 μl de cada muestra, completar hasta 200 μl

con agua, añadir 50 μl de reactivo Bradford y agitar.

- Medir la densidad óptica a 595 nm.

- Determinar la concentración de proteínas en mg/ml.

Plantilla:

ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA-SDS

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1.- Introducción. El principio básico de la electroforesis es el movimiento que experimenta una partícula cargada en un determinado medio cuando se ve sometida a la acción de un campo eléctrico. Dada una partícula de carga neta Q sometida a un campo eléctrico de intensidad E, se moverá por la acción de una fuerza igual a: F = Q E = Q V/d siendo V la diferencia de potencial y d la distancia entre los electrodos. Esta técnica es utilizada frecuentemente en el laboratorio para la separación de proteínas y ácidos nucleicos. Uno de los medios de soporte más empleado en la electroforesis, es el gel de poliacrilamida. Este gel o red tridimensional se consigue mediante la polimerización lineal de la acrilamida, y el entrecruzamiento de cadenas provocado por la bisacrilamida. El gel se organiza en una serie de fibras que al entrecruzarse, y según el grado de entrecruzamiento, deja poros a través de los cuales circulan las proteínas a separar. El tamaño de los poros depende de la concentración absoluta y de la proporción de acrilamida y bisacrilamida del gel. La polimerización de la acrilamida y bisacrilamida es promovida por radicales libres generados por el persulfato amónico y que son estabilizados por el TEMED. La poliacrilamida presenta la ventaja de ser a la vez criba y soporte, no presenta fenómenos de adsorción de tipo iónico ni flujo electro-osmótico, y ofrece la posibilidad de utilizar un amplio rango de pH. Los pesos moleculares de las proteínas pueden ser determinados midiendo la movilidad en geles de poliacrilamida en presencia del detergente dodecilsulfato sódico (SDS). Esto es debido a que la cantidad de SDS, detergente aniónico, que se une a una proteína es proporcional al peso molecular del polipéptido y es independiente de su secuencia; a saturación, se unen aproximadamente 1,4 g. de detergente por gramo de proteína. Así, si una serie de proteínas de peso molecular conocido son sometidas a electroforesis y se separan en una serie de bandas, la representación gráfica de la distancia recorrida en función del logaritmo del peso molecular, da una línea recta. Este sistema de electroforesis en poliacrilamida-SDS se conoce como método de Laemmli. 2.- Materiales y reactivos. - Acrilamida/bisacrilamida al 30/0.8% (p/v). - Tris-HCl 1M, pH 6,8. - Tris-HCl 1M, pH 8,8. - SDS 10% (p/v).

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- Persulfato amónico (APS) 10% (p/v). - TEMED. Importante: no se puede almacenar en tubos o botellas de plástico. - Isobutanol saturado con agua destilada. - Tampón de electroforesis: SDS 0,1%, Tris 0,025M/glicina 0,192M, pH 8,3 - Tampón de carga 2x: SDS 4% (p/v), glicerol 20% (v/v), 2-mercaptoetanol 10% (v/v), EDTA 15 mM, azul de bromofenol 0,008% (p/v), Tris-HCl 0,125 M, pH 6,8 - Cubetas de electroforesis, cristales y fuentes. - Marcadores de peso molecular de proteínas - Solución de fijación: etanol / ác. acético / agua en proporciones 5/1/5. - Solución de tinción: 0,1% de azul de Coomassie en 40% de etanol, 10% de ácido acético. - Solución de destinción: 7% de ácido acético.

3.- Preparación del gel de poliacrilamida. Limpiar perfectamente los cristales. Colocar los espaciadores que definirán el grosor del gel entre los cristales y sellar perfectamente con grasa y la ayuda de pinzas. En la práctica se va a preparar un gel discontinuo constituido por un gel concentrador y un gel separador. Las cantidades y características se muestran en la siguiente tabla. Utilizar recipiente de vidrio.

[Madre o Sotck] Gel Separador (7.5%) Vt = 10ml

Gel Empaquetamiento (3%) Vf = 5 ml

Sol. AA/BA al 30% 2,50 ml 0,84 ml

Tris-HCl 1.5M, pH 8,8 2,50 ml ---------------

Tris-HCl 1M, pH 6,8 ---------------- 1,25 ml

SDS 10% 100 μl 100 μl

TEMED 5 μl 5 μl

APS 10% 100 μl 50 μl

Agua destilada 4,85 ml 2,80 ml

El APS y el TEMED serán los últimos componentes a incluir en la mezcla. Preparar primero la solución del gel separador y verter cuidadosamente entre los cristales hasta 1 cm por debajo del nivel que será ocupado por el peine formador de los pocillos. Colocar cuidadosamente un poco de isobutanol saturado con agua sobre la solución del gel y dejar polimerizar a temperatura ambiente. Una vez polimerizado, retirar el isobutanol lavando con agua destilada y preparar la solución del gel concentrador. Verter esta solución y colocar el peine. Dejar polimerizar a temperatura ambiente.

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Cuando el gel concentrador haya polimerizado, retirar el peine e instalar el gel en el aparato de electroforesis siguiendo las instrucciones del Profesor. Rellenar las cámaras de los electrodos con el tampón de electroforesis.

4.- Preparación y carga de las muestras. Mezclar 1:1 las muestras a desarrollar en la electroforesis con el tampón de carga (descrito en el apartado 2). Las muestras a desarrollar serán: a) Patrones de peso molecular (mezcla de diferentes proteínas que se indican a continuación)

b) 10 μg de proteína de cada una de las muestras.

Marcadores coloreados:

5.- Tinción del gel de proteínas. Colocar el gel de proteínas, con cuidado para que no se rompa, en una tartera donde se añadirá la solución fijadora. Incubar 30 min a temperatura ambiente con agitación leve. Tras retirar el fijador, añadir la solución de tinción e incubar durante 30 min a temperatura ambiente, retirar la solución de tinción y pasar a desteñir. El proceso de destinción se prolongará hasta que las bandas de proteínas sean claramente visibles. En este punto, el gel está listo para ser secado y/o fotografiado.

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CULTIVOS DE CÉLULAS DE PLANTAS Elena Ramírez

• La célula vegetal: peculiaridades y características específicas versus la célula animal. • Equipamiento e incubadores específicos para los cultivos de células de plantas

(control temperatura, humedad y luminosidad). • Medios para el cultivo de células vegetales (macronutrientes, micronutrientes,

vitaminas y hormonas). • Tipos de cultivos (células, tejidos y plántulas). Cultivos en suspensión y en soporte

sólido. • Preparación de protoplastos y callos. • Métodos de transformación. Células y plantas transgénicas • Especies más empleadas en laboratorio. • Aplicaciones biotecnológicas de los cultivos vegetales.

Información adicional, protocolos, etc, en Anexos

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Cultivos primarios de cerebro fetal de ratón. Milagros Ramos. Objetivos:

1. Anestesia y obtención de fetos de ratón de los cuernos uterinos de dos ratonas preñadas.

2. Disección de la región cerebral de interés. 3. Disgregación del tejido hasta suspensión de célula única. 4. Siembra y observación al cabo de 3 días de la generación de redes

neuronales en los cultivos. PROTOCOLO DE CULTIVO PRIMARIO NEURONAS CORTEZA DE RATA Corteza rata o ratón E18 (1 embrión aprox. 5x106 cels)

Poner cubres de vidrio de 12mm de diámetro en las placas P24 Añadir 0.5ml de poli-lisina por pocillo de P24 Polilisina: stock: 500μg/ml en H2O. Conc final: 10μg/ml en PBS1x Dejar la poliLys durante 1h mínimo. Lavar 2 veces con PBS y 1 vez con H2O. Dejar secar las placas, destapadas, 30min en la cabina con luz ultravioleta. Añadir la laminina a las placas secas, 30min a 37ºC en el incubador (0.3ml/well P24). Laminina: stock 1mg/ml. Conc final 1.5μg/ml en NB + B27 + Gln 500μM + Antibióticos 1x + 50% Horse Serum. Disección cortezas de cerebro. Poner los embriones en PBS1x + 6mM Glucosa + 1% BSA (PBS completo), trocear con tijeras el tejido. Añadir 200μl papaína en 5ml de PBS completo, calentar a 37ºC hasta que se disuelva (se tiene que quedar transparente). Filtrar con filtro de 0.22μm directamente sobre el tejido. Dejar 5min a 37ºC. Retirar la papaína y añadir 1ml de PBS completo. Añadir unos grumos de DNAsa en polvo. Pasar por pipetas Pasteur o capilares de diferente tamaño hasta que se disgregue todo el tejido. Añadir PBS completo hasta 15ml finales. Centrifugar 5min a 900rpm

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Retirar sobrenadante Resuspender en 1ml de NB+B27+ Gln 500μM+ Antibióticos 1x Contar Sembrar 200.000 cels/pocillo de P24 en 0.4ml medio (sobre los 0.3ml de laminina) Hacer un cambio total de medio a las 3h (NB+B27+ Gln 500μM+ Antibióticos 1x) Cambio de medio parcial cada 3 dias (NB+B27+ Gln 500μM+ Antibióticos 1x). Material para cultivo primario: Lupa y material de disección P24 Cubres 12mm diámetro Polilisina PBS1x H2O estéril Lamimina Horse Serum NB+B27 Glutamina Antibióticos PBS+Glucosa+BSA Papaína DNAsa SEGURIDAD BIOLÓGICA - OBJETIVOS Conocimiento en la manipulación, gestión de residuos y diseño de instalaciones especificas de bioseguridad para prevenir los riesgos de exposición a agentes biológicos en laboratorios de cultivos celulares

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- PROGRAMA: Teoría: (10 horas)

• Características y clasificación de agentes biológicos. • Legislación sobre agentes biológicos • Riesgos biológicos específicos en laboratorios de cultivos • Características y diseño de laboratorios de contención biológica. • Organización de la bioseguridad. Manual de bioseguridad. • Medios, equipos, e instrumentación en bioseguridad. • Vigilancia personal. Procedimientos de emergencia. • Medidas de prevención y control en laboratorios de cultivos. • Gestión de residuos biológicos. Legislación. • Gestión de otros riesgos específicos en laboratorios de cultivos celulares

Visita Práctica ( 2 horas)

• Visita a laboratorios de cultivos con nivel de contención 2 ( Nivel Bioseguridad 2 ) y laboratorio de marcajes celulares laboratorio de isótopos del CBMSO

Resumen de loa contenidos: Riesgos biológicos La manipulación y/o la exposición a los agentes biológicos: virus, bacterias, parásitos, hongos, y organismos genéticamente modificados puede suponer un riesgo real para los trabajadores y el medio ambiente Las áreas donde se manipulan estos agentes biológicos en la experimentación son principalmente las siguientes: microbiología, inmunología, parasitología biología celular y molecular, genética y neurobiología. En los laboratorios de investigación biológica, en las técnicas de cultivos celulares, las muestras biológicas están constituidas bien por cultivos de células animales infectadas experimentalmente o no, en medio líquido dentro de frascos y placas de cultivo (laboratorios de cultivo "in vitro" de células animales), o bien por cultivos de bacterias, hongos o parásitos en medio sólido dentro de placas Petri y tubos de ensayo en medio líquido dentro de matraces y tubos de ensayo. En los laboratorios de diagnóstico el tipo de muestras puede ser

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muy variado pero básicamente están constituidas por tejidos procedentes de biopsias y necropsias y por fluidos corporales como: sangre, orina, etc. Además, también se realizan cultivos de células animales, de bacterias y de hongos con objeto de caracterizar el o los microorganismos causantes de la infección en el paciente o en el animal infectado. Las vías de transmisión de estos agentes biológicos son: la vía respiratoria, la vía dérmica, la vía y la digestiva, y la vía parenteral. Debido a esto es necesario establecer un plan específico de prevención de riesgos biológicos.

Están descritos diferentes niveles de bioseguridad de acuerdo con la probabilidad del riesgo de infección y las medidas disponibles que van del nivel 1 hasta el 4, que están descritos en la legislación vigente, tanto para los laboratorios cómo para animalarios.

El objetivo de un plan de prevención de riesgos biológicos es reducir o eliminar la exposición de los trabajadores y el medio ambiente Esto implica la utilización de prácticas y técnicas de laboratorio específicas y de los equipos de seguridad ( barreras primarias), principalmente cabinas de seguridad biológica y/o equipos de protección personal y un diseño y construcción del laboratorio específico ( barreras secundarias) de acuerdo con los niveles de contención Para establecer el mencionado plan es preciso realizar una evaluación de cada uno de los puestos de trabajo y para reducirlos es necesario tener en cuenta diferentes aspectos: mínimo número de trabajadores expuestos, medidas de seguridad en la recepción, manipulación y transporte de agentes biológicos, medidas de protección colectiva y/o equipos de protección personal, gestión de residuos biológicos, medidas higiénicas, señalización de bioriesgo, plan de emergencia, vigilancia de la salud de los trabajadores y establecer planes de formación en bioseguridad. Toda la información, a disposición de los trabajadores, deberá estar contenida en el Manual de Bioseguridad . LEGISLACIÓN Y DOCUMENTACIÓN TÉCNICA DE REFERENCIA La legislación aplicable a la manipulación de material biológico es la siguiente: � Ley 31/1995 de 8 de noviembre, de Prevención de Riesgos Laborales � Real Decreto 39 / 1997, de 17 de enero, por el que se aprueba el Reglamento de los Servicios de Prevención.

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� Real Decreto 664/1997, de 12 de mayo . BOE nº 124, de 24 de mayo de protección de los trabajadores contra los riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos durante el trabajo. � Real Decreto 773/97 ,de 30 de mayo sobre Disposiciones mínimas de seguridad y salud relativa a la utilización por los trabajadores de equipos de protección individual. � Real Decreto 485/1997, de 14 de abril, sobre disposiciones mínimas en materia de señalización de seguridad y salud en el trabajo. � Ley 15/1994, de 3 de junio (BOE nº 133 de 4 de junio de 1994, por el que se establece el régimen jurídico de la utilización confinada, liberación voluntaria y comercialización de Organismos Modificados Genéticamente, a fin de prevenir los riesgos para la salud humana y el medio ambiente. � Real Decreto 178/2004, de 30 de enero, por el que se aprueba el Reglamento General para el Desarrollo y Ejecución de la Ley 9/2003 de 25 de abril por lo que se establece el régimen jurídico de la utilización confinada, liberación voluntaria y comercialización de organismos modificados genéticamente (BOE nº 27 de 31 de enero de 2004). � Ley 5/2003, de residuos de la Comunidad de Madrid � Guía técnica para la evaluación y prevención de los riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos. Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. (2001). � Manual de Bioseguridad en el laboratorio. Organización Mundial de la Salud (2005). � Prevención de riesgos biológicos en el laboratorio.Martí Solé MC et al. Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. (1997).

� Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes of Health. US Government Printing Office (2007).

� NTP 571: Exposición a agentes biológicos. Equipos de protección i

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