INTRODUCCION

Con el nombre de cumarinas se conoce a un grupo muy amplio de principios activos fenólicos que se encuentran en plantas medicinales y tienen en común una estructura química de 2H-1- benzopiran-2-ona, denominada cumarina. Sobre esta estructura, que se origina biosintéticamente por lactonización del ácido cumarínico (2-hidroxi-Z-cinámico), se disponen sustituyentes de distinta naturaleza química lo que da lugar a distintos tipos de cumarinas: sencillas y complejas.

Las cumarinas son compuestos ampliamente distribuidos en las plantas principalmente en la familia de las Umbeliferae y Rutaceas, se encuentra en todas partes de la planta desde la raíz a flores y frutas.

Las cumarinas son esteres cíclicos de la orto – hidroxi del acido cinámico, en realidad son lactonas de los ácidos o – hidroxicinamicos. El nombre de cumarina proviene de un árbol nativo de la Guayana “Coumarona” o árbol de la Tonka de donde se obtuvo cristalizado. Después se ha encontrado en estado libre bajo forma de glucósido en diversos vegetales a los que da su agradable olor.

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PRINCIPIOS TEORICOS

CUMARINAS

Las cumarinas constituyen un grupo importante de compuestos naturales, se le considera derivados de la lactona del ácido o-hidroxicinámico, usualmente llamada cumarina:

Prácticamente todas las cumarinas, a excepción de la cumarina propiamente dicha, poseen un sustituyente hidroxílico en posición 7, ya sea libre, como sucede en la umbeliferona, o combinado (metilo, azúcares, etc.). Las cumarinas sencillas pueden poseer además hidróxilos adicionales también libres o combinados. Ejemplo de ellas son el esculetol del castaño de Indias con dos hidróxilos libres sobre los carbonos C-5 yC-7 o el escopoletol presente en algunas Solanáceas (belladona) que posee un hidroximetilo en C-5 y un hidróxilo libre en C-7.

Las cumarinas son compuestos ampliamente distribuidos en las plantas, principalmente en las familias Umbelíferas y Rutaceae; se encuentran en todas las partes de la planta, desde la raíz a flores y frutos siendo más abundante en estos últimos; se presentan a menudo como mezclas, en forma libre o como glicósidos.

Clasificación de las cumarinas

1. Hidroxicumarinas.2. Cumarinas preniladas: cadenas isoprénicas.3. Furanocumarinas: anillo de furano condensado.4. Piranocumarinas: anillo pirano condensado.5. Dicumarinas.6. Cumarinas sustituidas.

La cumarina se puede encontrar en las plantas como tal o en forma de ácido hidroxicinámico (pérdida de agua)

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Hidroxicumarinas

a) 7-hidroxicumarina; (umbeliferona) aislada por primera vez a partir de resinas de umbeliferas

b) 6,7-dihidroxicumarina (esculetina) encontrada en el Castaño de Indias en forma de 6-glucósido, llamado esculina

c) 6-metoxi-7,8-dihidroxicumarina (fraxetina) encontrado en forma de heterósido, llamado fraxina

d) 6-metoxi-7hidroxicumarina (escopoletina) que también se puede encontrar en forma de 7-glucosido, llamado escopolina

Furanocumarinas

Pueden ser de dos tipos:a) Lineales, el anillo se condensa en 6-7 ( 6,7-furanocumarinas)b) Angulares, el anillo se condensa en 7,8 (7,8-furanocumarinas)

PiranocumarinasPueden ser:a) Lineales, 6,7 piranocumarinasb) Angulares: 7,8 piranocumarinas

DicumarinasCondensación por un metileno (dicumarol)

Propiedades

Las cumarinas son sólidos cristalizables, blancos o amarillentos, algunos son sublimables.a) Las hidroxicumarinas sencillas son solubles en etanol, acetato de etilo y agua.b) Las pirano y furanocumarinas son solubles en agua en etanol, pero también en

disolventes orgánicos apolares: éter de petróleo.c) Las hidroxicumarinas sencillas presentan al ultravioleta fluorescencia azul o

verde.d) Lo más típico es el anillo de lactona, que se puede aprovechar para la

identificación pero también para la extracción.

Detección de cumarinas por su anillo de lactona

El clorhidrato de hidroxilamina en presencia de tricloruro de hierro es bastante específico de lactonas, pero poco sensible.La cromatografía en papel o capa delgada y observación al ultravioleta o pulverización con reactivo.

Las cumarinas sublimables se pueden detectar poniendo la droga en agua en un tubo de ensayo, se tapa con papel de filtro impregnado con NaOH, calentamos el tubo y

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después se observa el papel de filtro al ultravioleta, tiene que verse una fluorescencia, donde la sosa juega el papel de aumentarla.

ExtracciónA partir de las plantas desecadas, como hay variación de estructura y

solubilidad, es mejor hacer extracción con distintos disolventes, empezando por los menos polares y aumentando progresivamente. Eter de petróleo, cloroformo, éter, acetato de etilo, metanol, agua.

Purificación

Se usan distintas columnas cromatográficas con distintos adsorbentes y una vez aislados se hace la caracterización por espectroscopia.

Para las hidroxicumarinas, extraemos con álcali diluido y caliente, se abre el anillo de lactona y se forman las sales correspondientes del ácido hidroxicinámico, para lavar las impurezas el álcali diluido se extrae con éter, acidificamos y la cumarina vuelve a formarse. Se extrae con éter la cumarina pero es frecuente que existan otros ácidos fenólicos junto a la cumarina. Para eliminarlos, extraemos con bicarbonato de sodio, ahí pasarán los ácidos y en el éter quedarán las cumarinas puras.

EnsayosNormalmente la extracción se hace con metanol caliente y se lleva el extracto a

cromatografía. Se pueden usar reacciones de color:a) Clorhidrato de hidroxilamina más tricloruro de hierrob) Ester amino etílico del ácido difenilbórico

Valoracióna) Fluorimetría, Castaño de Indias.b) Colorimetría.c) Coagulación con sales de diazonio de fenoles.

Importancia en farmacognosia

a) La cumarina es un aromatizante.b) Tienen propiedades vitamínicas, disminuyen la permeabilidad capilar y

aumentan la resistencia de las paredes de capilares (protegen la fragilidad capilar y actúan como tónico venoso)

c) Las furanocumarinas son fotosensibilizadoras de la piel.d) Las piranocumarinas tienen acción antiespasmódica y vasodilatadora de

coronarias.e) Algunos tienen propiedades sedantes, como la angelicina.f) Pueden tener propiedades hipnóticas.g) Propiedades estrogénicas.h) Acción antiinflamatoria.i) Acción antibacteriana.j) Acción hipodérmica.

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k) Acción analgésica.l) Acción anticoagulante.m) Reconocimiento de algunas drogas (mana, solanáceas midriáticas, castaño de

indias).

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Muestra: Ruda

1. Reacción de identificación

Colocar 2 gotas de extracto en una tira de papel whatman y colocar sobre ella una gota de NaOH 10%. La observación de fluorescencia verde amarillenta bajo la lámpara UV 365 nm indica la presencia de cumarinas fijas.

2. Análisis cromatográficos

Sistemas:

Solventes ProporciónCHCl3:CH3OH (9:1)Hexano:EtOAc (3:1)CH2Cl2:MeOH (12:1)CHCl3:CH3OH (1:1)Tolueno:EtOAc (97:7)

La fluorescencia verde indica la presencia de furanocumarinas como el bergapteno. La fluorescencia púrpura indica la presencia de alcoxicumarinas.

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RESULTADOS

Muestra:(foto cortesía: de otro grupo)

Ruda

1. Reacción de identificación

Cromatograma con NaOH 10%

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DISCUSION DE RESULTADOS

En la presente practica se determino la presencia de cumarinas, para ello el extracto etanólico de ruda es colocado en papel de filtro y otro en algodón tratado con una gota de NaOH, mediante una lámpara ultravioleta (UV) 365 nm se observan fluorescencia verde – amarillenta, la cual nos indica la presencia de cumarinas fijas. La adición de la sosa juega el papel de aumentar la fluorescencia.

En la practica se realizo el análisis gromatográfico en capa fina (CCD) ya que la mayoría de las cumarinas carecen de la polaridad adecuada para separarse bien por cromatografía en papel; pero con la cromatografía en capa delgada es muy conveniente para determinar cumarinas y aun para aislarlas. El sistema fue hexano: EtOAc (3:1).

Luego de desarrollar la cromatografía y preceder el revelado mediante un agente físico UV se detecto la presencia de furanocumarinas como el bergaptano (componente cumárico principal en la Ruda).

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CONCLUSIONES

El extracto etanolico presenta cumarinas.

Mediante la propiedad de fluorescencia que presenta la cumarina (especialmente la furanocumarina y las alcoxicumarinas) estas serán detectadas fácilmente mediante lámpara UV (a 365nm).

Todas las cumarinas se caracterizan por la estructura benzo - - pirona y su carácter lactónico hacen que sean solubilizadas en solventes polares como el etanol.

La adición de sosa (NaOH) es importante en la adición de las cumarinas, ya que aumenta la fluorescencia.

El extracto etanolico de Ruda revela furanocumarinas, esencialmente Bergaptano componente cumárico de la Ruda (Ruta graveolens L.).

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RECOMENDACIONES

El calentamiento por reflujo (en Soxhlet) se debe realizar por un tiempo de 2 horas para nuestro caso, para poder extraer las cumarinas presentes en la muestra vegetal. Este tiempo será en función de la cantidad de la muestra.(Lo hicieron los otros grupos)

Realizar un cartucho adecuado de tal forma que no permita la salida de partículas posibles de muestra seca de Ruda. El papel debe ser tupido.

Se debe recuperar el etanol una vez extraídas las cumarinas, en el mismo equipo retirando el cartucho y poniendo en reflujo solo el solvente hasta concentrar por lo menos 30 mL del extracto.

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BIBLIOGRAFIA

Domínguez Xorge Alejandro, “Métodos de investigación Fitoquímica”, Editorial Limusa, 1973, Páginas: 111 – 114.

Lock de Ugaz, Olga “Investigación Fitoquímica”, 2da. Edición, 1994, Editorial Fondo Pontificia Universidad Católica del Perú, Páginas: 146 - 154.

SALIBA, Eloísa de Oliveira Simoes, RODRIGUEZ, Norberto Mário, MORAIS, Sérgio Antonio Lemos de et al. Lignins: isolation methods and chemical characterization. Cienc. Rural, sep./oct. 2001, vol.31, no.5, p.917-928.

Internet:

http://www.racve.es/actividades/zootecnia/2000-06-09LeopoldoCuellar Carrasco.htm

http://www.elergonomista.com/fitoterapia/cumarinas.htm

http://www.ucm.es/info/ffarma/Proyecto/Asignaturas/Farmacognosia-I/Tema13.htm

http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/toxico/micotoxinas.html

http://www.portalfarma.com/pfarma/taxonomia/general/gp000011.nsf/voDocumentos/4DE2A2030B26B6F0C1256A790048D68C/$File/233.pdf

http://www.fibra-salud.com/.%5CObra%5C9.htm

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CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son las funciones de actividad biológica conocida de estos compuestos? De cinco ejemplos con su actividad biológica.

Tienen propiedades vitamínicas, disminuyen la permeabilidad capilar y aumentan la resistencia de las paredes de capilares (protegen la fragilidad capilar y actúan como tónico venoso).

Las piranocumarinas tienen acción antiespasmódica y vasodilatadora de coronarias.

Algunos tienen propiedades sedantes, como la angelicina. Pueden tener propiedades hipnóticas. Propiedades estrogénicas (cumestrol). Acción antiinflamatoria. Acción anticoagulante y antibacterial (dicumarol). Acción hipodérmica. Acción analgésica. Acción insecticida (surangin A y B). Acción hepatoxicidad y carcinogenicidad (flatoxinas). Acción antibiótica (novobiocina).

Reconocimiento de algunas drogas (mana, solanacaeas midriáticas, castaño de indias), utilidad en el tratamiento de algunas alteraciones de la piel como por ejemplo la psoriasis debido a sus propiedades fotosensibilizantes (furanocumarinas: bergapteno y xantotoxina). Las cumarinas inhiben la germinación de semillas y en pequeñas concentraciones favorecen el crecimiento de las raíces, lo cual es probable que tenga significación fisiológica.

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2. Nombre cinco cumarinas (las más importantes) con su estructura.

3. ¿A que cree Ud que se debe la fotosensibilidad de estos compuestos?

La actividad fotosensibilizante de las furanocumarinas sobre las células, se manifiesta como fototoxicidad que altera y desorganiza numerosos procesos biológicos en diferentes tipos de células como células bacteriales o fúngicas, en virus a nivel de DNA, en células de mamíferos in Vitro, en tejidos vegetales, y en células epidérmicas en aves y mamíferos. Esta actividad fotosensibilizante es explicable debido a la reactividad del estado triplete de las furanocumarinas que se genera cuando éstas interactúan con la radiación U.V., y cuyas posibles reacciones se pueden agrupar en dos categorías:

Los fotoenlaces directos con macromoléculas como el DNA, el RNA y las proteínas.

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Las fotomodificaciones indirectas a los sustratos biológicos a través de formas reactivas del oxígeno.

Las furanocumarinas se han usado, junto con la radiación U.V., en el tratamiento de varias enfermedades de la piel como la psoriasis, el vitiligo y la micosis fungoides; el bergapteno, además se usan como protectores solares en preparaciones cosméticas.

4. ¿Por qué usa la cromatografía para su detección? ¿Cual es la diferencia de usar una cromatografía de celulosa y una de silicagel?

Se usa la cromatografía porque permite la separación de componentes cumarios de una determinada muestra. La cromatografía es una técnica fisicoquímica que permite separar los componentes o sustancias integrantes de una mezcla en movimiento por absorción o separación diferencial de estos componentes sobre una superficie estacionaria o inmóvil. La diferencia de una cromatografía de celulosa y una silicagel radica en que la mayoría de las cumarinas carecen de la polaridad adecuada para separarse bien por cromatografía en papel; pero con la cromatografía en capa delgada es muy conveniente determinar cumarinas y aun para aislarlas. El adsorbente mas usado ha sido la gel de sílice.

5. ¿Qué son aflatoxinas? ¿Cómo se forman? ¿Quién las produce? ¿Cómo se les puede identificar?

Las aflatoxinas (AF) son un grupo de mohos, micotoxinas producidas por hongos del género Aspergillus (especialmente A. Flavus, A. Parasiticus y A. nominus). Se trata de mohos toxigénicos, capaces de desarrollarse en gran variedad de sustratos, pudiendo contaminar los alimentos cuando éstos son cultivados, procesados, transformados o almacenados en condiciones adecuadas que favorezcan su desarrollo. El crecimiento de estos mohos y la producción de toxinas dependen de muchos factores como el alimento en cuestión, su grado de acidez, la temperatura o humedad ambientales y la presencia de microflora competidora La composición química de las aflatoxinas varía con las cepas, el sustrato o materia orgánica sobre el cual crece y las condiciones ambientales del crecimiento del hongo.En los alimentos (leche y carne, entre otros) y granos (maíz, trigo etc.), generalmente se han identificado cuatro tipos de aflatoxinas, que son aflatoxina B1 (AFB1), aflatoxina B2 (AFB2), aflatoxina G1 (AFG1) y aflatoxina G2 (AFG2). La AFB1 es la más tóxica y carcinogénica y generalmente es la que predomina. En rumiantes la AFB1 se metaboliza por la microflora ruminal a aflatoxina M1, identificándose concentraciones sanguíneas apreciables de ésta. La glándula mamaria constituye una ruta de eliminación importante para estas sustancias. Se reporta que del 1 al 3 % de la AFB1 ingerida por el organismo, se elimina en la leche en forma de AFM1. Los micelios de ésta y otras especies afines productoras de aflatoxinas, son capaces de colonizar semillas y tortas de oleaginosas de maní, girasol, algodón, soja, sésamo, avellanas, almendras y cereales y sus derivados dispuestos en sacos o silos. El

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crecimiento de este hongo se ve afectado por la termohigrotropía, es decir que responde al estímulo de la temperatura y la humedad relativa de la atmósfera y del sustrato.

Así, la formación de aflatoxinas en el maní tiene lugar si este se almacena entre 20° y 40°C con un 10-20% de humedad y con un 70-90% de humedad relativa en el aire: el crecimiento del hongo se ve favorecido si los granos están dañados por insectos o roedores. Para el análisis de aflatoxinas totales se utiliza un método de cromatografía de afinidad con anticuerpos monoclonales (AFLATEST) y su confirmación e identificación se realizó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con detección por fluorescencia. Entre las principales manifestaciones asociadas a la exposición de estas sustancias, están el daño hepático y renal, mutagénesis, teratogénesis, carcinogénesis, inmunosupresión y citotoxicidad. Algunas características importantes de estas toxinas son su capacidad de bioconcentración, bioacumulación y su gran estabilidad.

6. En que tipos de alimentación se pueden formar las aflatoxinas y cuales serian las consecuencias en el ser humano.

Los mayores niveles de contaminación por aflatoxinas se han descrito en semillas de algodón y maíz, cacahuates, nueces, avellanas y otros frutos secos. En cereales como el trigo, arroz, centeno o cebada, la presencia de estos tóxicos suele ser menor. Se cree que las condiciones climáticas de las zonas tropicales favorecen la contaminación por aflatoxinas, aunque están pueden estar presentes también en zonas templadas. Se han identificado hasta 18 tipos de aflatoxinas, de las cuales la B1, secretada en la leche de los animales que consumen alimentos contaminados ostenta una preocupación sanitaria especial. Estudios fisiológicos han revelado que las aflatoxinas poseen una actividad mutágena y carcinógena, así como que la variedad B1 es la mas toxica. Un comité mixto de la FAO y la OMS, integrado por expertos en aditivos, ha definido a las aflatoxinas como “potentes carcinógenos humanos”, si bien no existe aun información suficiente para establecer una cifra fija sobre grados de exposición tolerable. Los expertos se limitan a aconsejar que no se abuse en el consumo de frutos secos.Los efectos nocivos de la intoxicación por aflatoxinas en los animales (y presumiblemente en humanos) ha sido clasificada en dos formas generales:

Se produce aflatoxicosis aguda cuando se consumen niveles medios a altos de aflatoxinas. Los efectos de esta intoxicación pueden incluir hemorragia, daño agudo del hígado, el edema, la alteración en la digestión, la absorción y/o el metabolismo de alimentos, y posiblemente la muerte.

La aflatoxicosis crónica resulta del consumo de niveles bajos a moderados de aflatoxinas. Los efectos son generalmente subclínicos y difíciles de reconocer. Algunos de los síntomas comunes son una difícil y deteriorada absorción de los alimentos e índices de crecimiento mas lento.Para que un animal (o ser humano) haya muerto por causa de las alfatoxinas debió ser suministrado con grandes dosis de las mismas y “posiblemente” durante largo tiempo,

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esto pone en duda la cadena entera de control de calidad sobre la que el gobierno nacional (además de la empresa) tiene una gran cuota de responsabilidad.

7. ¿Que son ligninas? De ejemplos con sus respectivas estructuras.

La lignina se caracteriza por ser un complejo aromático (no carbohidrato) del que existen muchos polímeros estructurales (ligninas). Resulta conveniente utilizar el término lignina en un sentido colectivo para señalar la fracción lignina de la fibra. Después de los polisacáridos, la lignina es el polímero orgánico más abundante en el mundo vegetal. Es importante destacar que la lignina es la única fibra no polisacárido que se conoce La lignina realiza múltiples funciones que son esenciales para la vida de las plantas. Por ejemplo, posee un importante papel en el transporte interno de agua, nutrientes y metabolitos. Proporciona rigidez a la pared celular y actúa como puente de unión entre las células de agua, nutrientes y metabolitos. Proporciona rigidez a la pared celular y actúa como puente de unión entre las células de la madera, creando un material que es notablemente resistente a los impactos, compresiones y flexiones. Realmente, los tejidos lignificados resisten el ataque de los microorganismos, impidiendo la penetración de las enzimas destructivas en la pared celular. La estructura de la lignina está compuesta por polímeros fenilpropílicos en las paredes celulares, son altamente condensados y muy resistentes a la degradación. Ellos son compuestos de unidades p-hidroxifenil (H), guaiacil (G) y siringila (S), en proporciones diferentes, de acuerdo con su origen.

8. ¿Por qué es importante el uso de bloqueadores solares?

Los bloqueadores solares constituyen la primera línea de defensa contra el cáncer. Estos productos protegen la piel absorbiendo, reflejando y diseminando las radiaciones ultravioleta (UVA y UVB). Estas radiaciones no producen calor, por lo que pueden ocurrir quemaduras por descuido, cuando hay brisa o cielo nublado. Por otra parte, la sombra ofrece poca protección ya que las radiaciones ultravioleta se reflejan en el agua y la arena, además penetran algunos metros bajo el agua. La mayoría de bronceadores bloquean la radiación ultravioleta B (UVB), que produce bronceado, quemaduras y riesgo de cáncer, pero pocos productos protegen contra la radiación ultravioleta A (UVA) que penetra mas lentamente, causando cambios en al vasculatura sanguínea, manchas, envejecimiento cutáneo y riesgo de cáncer. Para reconocer los diferentes tipos de bloqueadores, se utiliza la escala SPF (Sun Protection Factor). A mayor SPF, mayor será la protección que el producto ofrecerá. La escogencia del bloqueador solar dependerá de su tipo de piel: si se quema fácilmente con exposición solar mínima, debería utilizar un bloqueador con SPF alto. Por ejemplo:

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un factor SPF de 10, permitiría a una persona que se quema en media hora de exposición solar, recibir sol durante 5 horas, es decir, 10 veces mas tiempo que el usual.

Los compuestos importantes en los bloqueadores solares son las cumarinas: umbeliferota, esculetina y herniarina, estos se agregan a los preparados de protección solar principalmente por su capacidad de absorción en la región UV (280 a 315 nm), cuya radiación causa la formación de eritemas en la piel.

9. ¿Qué tipo de cumarinas están presentes en la ruda y el apio?

En la ruda se encuentran especialmente la furocumarinas como el bergapteno.En el apio se encuentran los piranocumarinas con la rutaretina.

10. ¿Dónde se encuentran a las cumarinas generalmente?

Las cumarinas se encuentran generalmente en frutos, tallos, semillas, hojas.Famila: Rutaceae, Umbeliferaceae,, Solanaceae, Gramineceae, laminaceae.

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