cultivo de microorganismos

Microbiología GeneralTema 2.- Cultivo de microorganismos.

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Tema 2.- Cultivo de microorganismos. Crecimiento microbiano. Cultivo de microorganismos. Medios de cultivo. Métodos deaislamiento. Concepto de cultivo puro. Crecimiento microbiano en medio líquido. Cre-cimiento microbiano en medio sólido. Concepto de muerte de un microorganismo. Me-dida del crecimiento y enumeración de microorganismos. Crecimiento microbianoequilibrado. Cinética de crecimiento de un cultivo estanco. Factores físicos y químicosque influyen en el crecimiento. Rendimiento de los cultivos. Cinética de crecimiento enun cultivo continuo. Tipos de fermentadores.

Bibliografía recomendada: Cap. 1 de la 8ª edición de Brock: Biología de los microorga-nismos

CRECIMIENTO MICROBIANO

Entendemos por crecimiento microbiano el aumento del número de microorganis-mos a lo largo del tiempo. Por tanto, no nos referimos al crecimiento de un único mi-croorganismo que denominaremos ciclo celular, sino al demográfico de una población.En este tema nos centraremos en el crecimiento de bacterias, el estudio que se hacepuede servir también para entender el crecimiento de levaduras y de otros hongos. Elcrecimiento de los virus se produce de otra forma diferente y será tratada al final de estecapítulo.

Denominamos ciclo celular al proceso de desarrollo de una bacteria aislada. A lolargo del ciclo celular tiene lugar la replicación del material genético, la síntesis decomponentes celulares, la elongación de la bacteria para alcanzar un tamaño doble delinicial y su división por bipartición para dar lugar a dos células hijas. La duración delciclo celular coincide con el tiempo de generación y depende, en general, de los mismosfactores de los que depende este.

El crecimiento de una población resulta de la suma de los ciclos celulares de todoslos individuos de dicha población.

Los cultivos de microorganismos de los que hemos hablado son asincrónicos puestoque en ellos cada microorganismo se encuentra en un punto diferente del ciclo celular.Por consiguiente, en un momento determinado en un cultivo se encuentran células queacaban de dividirse, otras que están replicando su ADN, otras que están credciendo,otras que están iniciando la división celular, etc.

En un cultivo sincrónico todas las células se encuentran simultáneamente en lamisma fase del crecimiento celular.

Los cultivos sincrónicos son muy difíciles de mantener por lo que su importanciaestá principalmente ligada a los estudios básicos de biología microbiana. Sin embargo,en la naturaleza, las bacterias del suelo se encuentran en condiciones de crecimientopróximas a la fase estacionaria (en la que se produce una cierta sincronización del culti-vo) y, por consiguiente, durante cierto tiempo las poblaciones naturales probablementese comporten como relativamente sincrónicas.


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Las poblaciones de bacterias crecen de forma explosiva acumulando grandes núme-ros en un periodo de tiempo muy reducido. Puesto que el efecto de los microorganismoses en la mayoría de los casos depende de su número, entender cómo se produce el cre-cimiento microbiano es importante para poder evitar o reducir sus efectos nocivos ypotenciar los beneficiosos o aplicados.

CULTIVO DE MICROORGANISMOS

El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones físicas,químicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. Engeneral, podemos distinguir cultivos líquidos y sólidos en función de las característicasdel medio y cultivos discontinuos y continuos en función de la disponibilidad de nu-trientes en el medio.

MEDIOS DE CULTIVO

Un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten energía y elemen-tos químicos para la síntesis de sus constituyentes celulares. Dependiendo de la fuentede carbono que utilizan, los microorganismos se pueden clasificar en autotrofos si es elCO2 atmosférico (microorganismos que fotosintetizan) y heterotrofos si utilizan carbo-no orgánico.

La fórmula elemental de un microorganismo es, aproximadamente,

C4H7O2N

lo que supone que los componentes de las células son: carbono que representa alrede-dor del 50% del peso seco, oxígeno (32%), nitrógeno (14%), fósforo (3%), azufre (entorno al 1%) y otros elementos traza entre los que se encuentran Fe, K, Mg, Mn, Co,Mb, Cu y Zn.

La elaboración de medios de cultivo requiere proporcionar los elementos antes cita-dos en una forma asimilable. Así, por ejemplo, el C debe estar en forma de carbono or-gánico para los heterotrofos y como CO2 para los autotrofos, el N en forma de NH4, deNO3

- o de NO2- o en forma de aminoácidos a los que se pueda tomar su grupo amino; el

P debe estar en forma de PO43-, el S procede de aminoácidos sulfurados o de SO4

2-, etc.Además, en ciertos casos, es necesario añadir a los medios de cultivo algunos aminoáci-dos o vitaminas que determinados tipos de microorganismos no pueden sintetizar.

En el caso de la levadura del pan (Saccharomyces cerevisiae) la fórmula elementalmás concreta es:

C3.72H6.11O1.95N0.61S0.017P0.035K0.056

esta composición puede variar ligeramente en función de las condiciones de cultivo o defase de crecimiento. El conocimiento de la fórmula elemental del microorganismo quese cultiva facilita la formulación del medio de cultivo más adecuado para el mismo.


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Los medios de cultivo se pueden clasificar en definidos cuando su composiciónquímica se conoce totalmente y complejos cuando no es el caso porque están com-puestos por mezclas de extractos de materiales complejos (extracto de levadura, extractode carne, etc.).

Por otra parte, los medios de cultivo pueden ser líquidos o sólidos si se añade algúnagente solidificante que no sea consumible por los microorganismos (normalmenteagar).

En función de los microorganismos que pueden crecer en ellos, los medios puedenser generales, selectivos cuando favorecen el crecimiento de ciertos microorganismosmientras suprimen el de otros (por ejemplo, el medio SPS para clostridios), diferencia-les cuando alguno de sus componentes permite identificar las colonias de un tipo demicroorganismos (por ejemplo medios con hematíes para identificar colonias de micro-organismos hemolíticos), selectivo-diferenciales cuando combinan las dos característi-cas anteriores (por ejemplo, el agar de MacConkey para identificar Escherichia coli), ymedios de enriquecimiento que permiten aislar un tipo determinado de microorganis-mo a partir de una mezcla una población mixta de gran tamaño.

MÉTODOS DE AISLAMIENTO

El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayoría delos casos, mediante la producción de colonias aisladas en cultivos sólidos. El creci-miento explosivo de las bacterias permite producir un gran número de ellas a partir deuna única célula inicial de forma que, tras un periodo de incubación en las condicionesambientales adecuadas, se produce una colonia observable a simple vista y formada porindividuos iguales (un clon bacteriano).

Sin embargo, no todos los microorganismos presentes en las muestras ambientalesson cultivables (microorganismos no cultivables). Esto es debido a dificultades intrín-secas en el cultivo (microorganismos parásitos de otros), al desconocimiento de los re-querimientos específicos de cultivo, y a la existencia de grupos de microorganismos quedeben mantenerse en equilibrio para poder sobrevivir (casos de sintrofía por ejemplo).Se estima que en sólo en torno al 1% de las bacterias del suelo al 0,1 - 0,01 % de lasbacterias marinas son cultivables.

Existen procedimientos de enriquecimiento del número de bacterias de ambientesnaturales para facilitar su aislamiento. Uno de ellos es la Columna de Winogradskique crea un microcosmos para enriquecer el número de ciertos tipos de microorganis-mos presentes en ambientes naturales con objeto de facilitar su aislamiento.

CONCEPTO DE CULTIVO PURO

Se denomina cultivo puro (axénico) al que contiene sólo un tipo de microorganis-mos. Los cultivos puros se inician a partir de colonias aisladas, de manera que todos losindividuos del mismo tengan la misma composición genética. Los cultivos puros son


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esenciales para poder estudiar las características de los microorganismos y para poderidentificarlos con seguridad.

Sin embargo, cada vez se va conoce más sobre el funcionamiento de las comunida-des bacterianas lo que debe hacernos reflexionar sobre el hecho de que un cultivo purosupone unas condiciones no naturales y que, por consiguiente, la fisiología de los mi-croorganismos en ambientes naturales puede ser diferente de la que presentan en condi-ciones de cultivos puros.

CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO LÍQUIDO

Si la bacteria crece en un medio líquido, en la mayoría de los casos las células que seproducen en cada división continúan su vida independientemente formándose una sus-pensión de células libres.

En un cultivo discontinuo de bacterias en medio líquido, se pueden diferenciar cuatrofases en la evolución de los parámetros que miden el crecimiento microbiano:

1.- Fase lag o de adaptación durante la que los microorganismos adaptan su meta-bolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condicionesde cultivo) para iniciar la fase de crecimiento exponencial.

2.- Fase exponencial o logarítmica: en ella la velocidad de crecimiento es máxima yel tiempo de generación es mínimo. Durante esta fase las bacterias consumen a veloci-dad máxima los nutrientes del medio. La evolución del número de células durante estafase se explica con los modelos matemáticos que describiremos a continuación.

3.- Fase estacionaria: en ella no se incrementa el número de bacterias (ni la masa uotros parámetros del cultivo). Las células en fase estacionaria desarrollan un metabolis-mo diferente al de la fase exponencial y durante ella se produce una acumulación y libe-ración de metabolitos secundarios que pueden tener importancia industrial.


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Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algún nutrienteesencial del medio o porque los productos de desecho que han liberado durante la faseexponencial hacen que el medio sea inhóspito para el crecimiento microbiano.

La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente conmayor fidelidad el estado metabólico real de los microorganismos en los ambientes na-turales.

4.- Fase de muerte: se produce una reducción del número de bacterias viables delcultivo.

CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO SÓLIDO

Las fases, parámetros y cinética de crecimiento discutidas para el caso de los cultivoslíquidos se presentan también en cultivos sólidos. La cinética de crecimiento, en estecaso, se puede estudiar siguiendo la evolución del número de células viables por unidadde superficie o por unidad de masa.

Cuando una célula aislada e inmóvil comienza a crecer sobre un substrato sólido, elresultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia. Por consiguiente, se deno-mina unidad formadora de colonia (UFC) a una célula bacteriana viva y aislada que sise encuentra en condiciones de substrato y ambientales adecuadas da lugar a la produc-ción de una colonia en un breve lapso de tiempo. Si el número inicial de bacterias porunidad de superficie es muy alto, la confluencia de las colonias da lugar a lo que se lla-ma un césped cuando se realizan los cultivos en placas de laboratorio.

En el caso de microorganismos móviles (deslizantes) o en el de los hongos filamen-tosos que tienen un crecimiento trófico no se producen colonias aisladas sino forma-ciones más difusas o miceliares.

CONCEPTO DE MUERTE DE UN MICROORGANISMO

Desde el punto de vista microbiológico, un microorganismo muere cuando pierde deforma irreversible la capacidad de dividirse. Como consecuencia de esta pérdida, no seproduce aumento en el número de microorganismos y, por tanto, no hay crecimiento.Sin embargo, un microorganismo puede estar muerto desde el punto de vista microbio-lógico y continuar desarrollando una actividad metabólica que se traduzca, por ejemplo,en liberación de toxinas.

Por otra parte, hay que considerar que la capacidad de multiplicación (crecimiento)de un microorganismo puede verse transitoriamente afectada por lesiones o por las con-diciones físicas o químicas del entorno. En estos casos, podríamos considerar comomuertos microorganismos que pueden reanudar su crecimiento si las condiciones son denuevo favorables.


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MEDIDA DEL CRECIMIENTO Y ENUMERACIÓN DE MICROORGANIS-MOS

Existen diferentes sistemas para detectar y medir el crecimiento de microorganismos.Los principales, se enumeran a continuación:

1.- Recuento directo: consiste en la observación al microscopio de volúmenes muypequeños de suspensiones de bacterias. Se usan unos portaobjetos especiales denomina-dos cámaras de Petroff-Hausser. Para que la medida sea correcta es necesario que ladensidad de células sea del orden de 105 por ml.

2.- Medida de la masa de células: el sistema se basa en que las células en suspen-sión dispersan la luz causando la turbidez del cultivo. La turbidez depende de la masa ensuspensión y, por tanto, midiendo esta se puede estimar aquella. Este es el parámetro demedida más fácil de usar en los cultivos de laboratorio. La densidad de células debe serdel orden de 105 por ml.

3.- Recuento de viables: consiste en sembrar un volumen determinado de cultivo omuestra sobre el medio de cultivo sólido adecuado para estimar el número de viablescontando el número de colonias que se forman puesto que cada una de estas deriva deuna célula aislada. Para que la medida sea correcta desde el punto de vista estadístico, esnecesario contar más de 300 UFC.

En ciertas ocasiones en las que la densidad de microorganismos es demasiado baja,éstos se pueden recolectar por filtración a través de una membrana (de 0.2 µm de tama-ño de poro) y posterior colocación de la membrana en un medio de cultivo adecuadopara que se formen las colonias.

4.- Medida del número de partículas usando contadores electrónicos de partículas.Estos sistemas no nos indican si las partículas corresponden a células vivas o muertas;pero nos pueden dar una idea del tamaño de las partículas.

5.- Medida de parámetros bioquímicos tales como la cantidad de ADN, ARN,proteínas, peptidoglicano, etc. por unidad de volumen de cultivo.

6.- Medida de actividad metabólica de las bacterias como que respiran producenuna disminución del potencial redox del medio en que se encuentran como consecuenciadel consumo de oxígeno (utilización de colorantes sensibles a oxidación-reducción talescomo el azul de metileno).

CRECIMIENTO MICROBIANO EQUILIBRADO

Se denomina crecimiento equilibrado a aquél en el que todos los parámetros delcultivo (biomasa, número de células, cantidad de proteínas, de ADN, etc.) evolucionanen paralelo. El crecimiento equilibrado probablemente ocurra en muy contadas ocasio-nes en condiciones naturales. Por tanto, es principalmente un concepto de aplicación enel laboratorio (o en microbiología industrial). Sin embargo, es útil porque permite estu-diar el crecimiento microorganismos.


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CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE UN CULTIVO DISCONTINUO

En este apartado vamos a revisar el estudio de la cinética del crecimiento de micro-organismos que crecen aislados que no forman ningún tipo de estructura. Esta es laforma de crecimiento de la levadura (hongo unicelular) y de las bacterias.

Es importante conocer la cinética de crecimiento de los cultivos microbianos parapredecir cómo va a evolucionar un cultivo, cómo va a ir consumiéndose el substrato ycómo se van a ir acumulando los productos del cultivo. Sin conocer estos factores esmuy imprudente iniciar el cultivo en un fermentador de 10.000 litros, por ejemplo, conel coste que ello supone, puesto que no podemos predecir qué va a pasar, cuándo va acompletarse el crecimiento, cómo se va a acumular el producto, etc.

Las células aisladas cultivadas en un volumen finito de medio de cultivo apropiadovan utilizando los nutrientes que tienen disponibles con la mayor eficiencia y rapidezque pueden, sintetizando sus propios componentes celulares y dividiéndose en cuantohan podido duplicar su masa y su material genético. El tiempo que tarda una célula enhacer todo lo anterior es lo que conocemos como tiempo de generación (τ) y puedevariar desde unos 20 minutos en condiciones óptimas hasta varios meses en condicionesdel suelo. Cada vez que transcurre un tiempo de generación, el número de células seduplica, siguiendo, por tanto, un incremento exponencial.

TRATAMIENTO DEL CRECIMIENTO COMO PROGRESIÓN GEOMÉTRICA

Las bacterias crecen siguiendo una progresión geométrica en la que el número deindividuos se duplica al cabo de un tiempo determinado denominado tiempo de genera-ción (τ). De esta forma, podemos calcular el número de bacterias (N) al cabo de un nú-mero de generaciones (n) usando la ecuación siguiente:

N = N0 2n (ecuación 1)

siendo N0 el número de células en el momento actual. El número de generaciones sepuede calcular de la siguiente forma:

n = t / τ (ecuación 2)

donde t es el tiempo transcurrido.

Por consiguiente, combinando las ecuaciones 1 y 2:

N = N0 2t/τ (ecuación 3)

Los tiempos de generación de bacterias creciendo en ambientes favorables puedenser muy cortos (valores de τ de 20 min). Esto lleva a que una única célula (N0=1) cre-ciendo con un τ = 20 min, llegue a poder producir 4.7 x 1021 células en 24 horas.


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Las ecuaciones exponenciales son muy difíciles de manejar gráficamente, por ello esmejor transformarlas en otras más simples. Para transformar una ecuación exponencialen una recta, tomamos logaritmos en los dos términos y resulta:

lnN = lnN0 + (t/τ) ln2 (ecuación 4)

Esto es: el logaritmo del número de células crece linealmente con el tiempo a razónde una constante igual a ln2/τ. Si el tiempo de generación τ es muy grande, el creci-miento tendrá poca pendiente (será lento) y si τ es pequeño el crecimiento será rápido.

En un crecimiento equilibrado, todos los parámetros de crecimiento (número de cé-lulas, biomasa de cultivo, acumulación de metabolitos primarios, proteínas, ácidos nu-cleicos etc.) evolucionan en paralelo. Por tanto, en la ecuación anterior N puede repre-sentar cualquiera de estos factores.

TRATAMIENTO DEL CRECIMIENTO EN FUNCIÓN DE LA TASA DE CRE-CIMIENTO µ

Otra forma de representar la cinética es considerando el incremento en el número decélulas (dN) en un intervalo corto de tiempo (dt). En este caso, la ecuación que describela cinética es la siguiente:

dN/dt = µN (ecuación 5)

esto es: el incremento del número de células (dN) por unidad de tiempo (dt) es propor-cional al número de células presentes en el cultivo (N). A la constante de proporcionali-dad (µ) se le denomina tasa de crecimiento.

Integrando la ecuación anterior durante el tiempo de cultivo, se transforma en la si-guiente función exponencial:

N = N0 eµt (ecuación 6)

la transformación de esta ecuación en una recta (tomando logaritmos) rinde lo siguiente:

lnN = lnN0 + µt (ecuación 7)

esto es: el incremento del logaritmo del número de células aumenta linealmente con eltiempo siendo la constante de proporcionalidad µ.

Comparando esta ecuación (7) con la similar presentada más arriba (4), podemosconcluir que µ = ln2/τ y, por consiguiente, que τ = ln2/µ. Es decir, que hay una correla-ción inversa entre el valor de la tasa de crecimiento (µ) y el tiempo de generación (τ).

Estas ecuaciones nos permiten predecir cuál será el número de células, masa celular,etc. después de un cierto tiempo de cultivo (t) si conocemos µ; o bien, poder calcular latasa de crecimiento µ a partir de medidas experimentales del incremento en el númerode células, biomasa, etc.


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12.- FACTORES FÍSICOS Y QUÍMICOS QUE INFLUYEN EN EL CRECI-MIENTO.

1.- Temperatura: Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento ade-cuada. Si estudiamos la variación de la velocidad de crecimiento en función de la tem-peratura de cultivo, podemos observar una temperatura mínima por debajo de la queno hay crecimiento; a temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la velo-cidad de crecimiento con la temperatura de cultivo hasta que se alcanza la temperaturaóptima a la que la velocidad es máxima. Por encima de esta temperatura óptima, la ve-locidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte celular.

El incremento de la velocidad de crecimiento con la temperatura se debe al incre-mento generalizado de la velocidad de las reacciones enzimáticas con la temperatura. Sedenomina coeficiente de temperatura a la relación entre el incremento de la velocidadde reacción y el de temperatura. En términos generales, la velocidad de las reaccionesbioquímicas suele aumentar entre 1.5 y 2.5 veces al aumentar 10ºC la temperatura a laque tienen lugar.

La falta de crecimiento a temperaturas muy bajas se debe a la reducción de la veloci-dad de crecimiento por la reducción de la velocidad de reacción y al cambio de estadode los lípidos de la membrana celular que pasan de ser fluidos a cristalinos impidiendoel funcionamiento de la membrana celular.

La muerte a altas temperaturas se debe a la desnaturalización de las proteínas y a lasalteraciones producidas en las membranas lipídicas a esas temperaturas.

Es importante tener en cuenta que a temperaturas bajas, el metabolismo celular seenlentece y las células paran de crecer; aunque no tienen porqué morir. Sin embargo,cuando la temperatura es superior a la óptima, se produce la muerte celular rápidamentey las células no pueden recuperar su capacidad de división si baja posteriormente latemperatura. Esto permite esterilizar por calor y no por frío.

Hay varios tipos de microorganismos en función de sus temperaturas de creci-miento mínima, máxima y óptima.

Tipo demicroorganismo

Temperatura mínima

Temperatura

óptima

Temperatura

máximaPsicrófilo -5 +5 12 - 15 15 - 20

Psicrótrofo -5 +5 25 - 30 30 - 35Mesófilo 5 - 15 30 - 45 35 - 47Termófilo 40 - 45 55 - 75 60 - 90

Los microorganismos psicrótrofos son mesófilos que pueden crecer a temperaturasbajas. Por tanto, se les puede considerar como psicrófilos facultativos. Esto es impor-tante desde el punto de vista aplicado porque cuando se encuentran contaminando ali-mentos, son capaces de crecer en condiciones de refrigeración (4 - 8ºC) y de producirinfecciones en los consumidores del alimento (30 - 35 ºC).


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Los microorganismos capaces de producir infecciones son los mesófilos y algunospsicrótrofos ya que sus temperaturas óptimas de crecimiento coinciden con las corpora-les. sin embargo, tanto mesófilos como psicrófilos, psicrótrofos y termófilos puedenproducir toxinas causantes de intoxicaciones alimentarias.

2.- Actividad de agua: Se denomina actividad de agua a la relación entre la presiónde vapor de agua del substrato de cultivo (P) y la presión de vapor de agua del agua pura(P0). El valor de la actividad de agua está relacionado con el de la humedad relativa(HR).

El valor de la actividad de agua nos da una idea de la cantidad de agua disponiblemetabólicamente. Por ejemplo: comparemos el agua pura donde todas las moléculas deagua están libremente disponibles para reacciones químicas con el agua presente en unadisolución saturada de sal común (NaCl) donde una parte importante de las moléculasde agua participa en la solvatación de los iones de la sal disuelta. En este último caso, laactividad de agua es mucho menor que en el primero. Conforme aumenta la cantidad desolutos en el medio, disminuye su actividad de agua.

Cuando un microorganismo se encuentra en un substrato con una actividad de aguademasiado baja, su crecimiento se detiene. Esta detención del crecimiento no suele lle-var asociada la muerte del microorganismo, sino que éste se mantiene en condiciones deresistencia durante un tiempo más o menos largo. En el caso de las esporas, la fase deresistencia puede ser considerada prácticamente ilimitada.

La gran mayoría de los microorganismos requiere unos valores de actividad de aguamuy altos para poder crecer. De hecho, los valores mínimos de actividad para diferentestipos de microorganismos son, a título orientativo, los siguientes: bacterias aw >0.90,levaduras aw>0.85, hongos filamentosos aw >0.80. Como puede verse, los hongos fila-mentosos son capaces de crecer en substratos con una actividad de agua mucho menor(mucho más secos) de la que permite el crecimiento de bacterias o de levaduras. Poresta razón se puede producir deterioro de alimentos de baja actividad de agua (porejemplo, el queso o almíbares) por mohos (hongos filamentosos) y no por bacterias.

En función de su tolerancia a ambientes con baja aw, los microorganismos que pue-den crecer en estas condiciones se clasifican en halotolerantes, halófilos y xerófilossegún toleren o requieran condiciones salinas o hipersalinas, respectivamente.

La reducción de la actividad de agua para limitar el crecimiento bacteriano tiene im-portancia aplicada en industria alimentaria. La utilización de almíbares, salmueras ysalazones reduce la actividad de agua del alimento para evitar su deterioro bacteriano.

3.- pH: Es un parámetro crítico en el crecimiento de microorganismos ya que cadatipo de microorganismo sólo puede crecer en un rango estrecho de pH fuera del cualmueren rápidamente.

El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las células ya que,en muchos casos, la obtención de energía metabólica depende de la existencia de unadiferencia en la concentración de protones a ambos lados de la membrana citoplásmica.El pH interno en la mayoría de los microorganismo está en el rango de 6.0 a 7.0.


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Los rangos de pH tolerables por diferentes tipos de microorganismos son, también,distintos. Hay microorganismos acidófilos que pueden vivir a pH=1.0 y otros alcaló-filos que toleran pH=10.0

Hay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el pH del medio decrecimiento suele tender a bajar durante el cultivo. Por otra parte, la bajada del pH delmedio que producen ciertos microorganismos les confiere una ventaja selectiva frente aotros microorganismos competidores. Así, por ejemplo, las bacterias lácticas que produ-cen grandes cantidades de ácido láctico como consecuencia de su metabolismo primarioreducen el pH del medio de cultivo a valores inferiores a los soportables por otras bacte-rias competidoras (llegan a bajar el pH del medio hasta 4.5). De esta forma, las bacteriascompetidoras mueren y las lácticas se convierten en la población dominante.

La bajada del pH se puede deber a varios factores, uno de los cuales es la liberaciónde ácidos orgánicos de cadena corta (fórmico, acético, láctico) por ciertas bacterias. Eneste sentido, hay que tener en cuenta que la acción bactericida de estos ácidos orgánicosde cadena corta es más potente que la debida únicamente a la bajada del pH que produ-cen. Esto es, los ácidos orgánicos de cadena corta son tóxicos para algunas bacterias porsí mismos.

El efecto letal del pH ácido sobre los microorganismos tiene aplicación en la conser-vación de alimentos acidificándolos. De esta forma, la adición de ácido acético en formade vinagre permite la conservación de alimentos perecederos (escabeches, por ejemplo)y la producción de ácidos en el curso de fermentaciones naturales permite alargar lavida de los alimentos (coles fermentadas, por ejemplo).

4.- Potencial redox: nos indica la capacidad del substrato para aceptar o donar elec-trones, esto es: sus características oxidantes o reductoras. Uno de los factores que in-tervienen en el potencial redox, aunque no el único, es la concentración de oxígeno[O2].

Hay microorganismos que requieren ambientes oxidantes para crecer, mientras queotros necesitan ambientes reductores. El metabolismo de ambos tipos de microorganis-mos presenta diferencias notables. El requerimiento de condiciones oxidantes o reducto-ras no debe confundirse con la necesidad de presencia o ausencia de oxígeno para quese produzca el crecimiento.

En general, cuando un microorganismo requiere un ambiente oxidante se dice quedesarrolla un metabolismo oxidativo (o respirativo) mientras que los microorganismosque requieren ambientes reductores (o menos oxidantes) realizan un metabolismo fer-mentativo.

Un microorganismo es aerobio cuando necesita oxígeno para vivir y es anaerobiocuando o bien no lo necesita (anaerobios facultativos como las bacterias entéricas, ocomo Saccharomyces cerevisiae; o anaerobios aerotolerantes como las bacterias lácti-cas) o cuando muere en presencia de oxígeno (anaerobios estrictos como los clostri-dios).

Hay microorganismos que viven en ambientes carentes de oxígeno (anaerobios) que,sin embargo, llevan a cabo un metabolismo oxidativo porque usan otro aceptor final de


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electrones que actúa como oxidante ambiental. Por ejemplo, las bacterias que "respiran"nitratos (NO3

-), sulfatos (SO42-) u otros compuestos orgánicos oxidados (respiración

anaerobia).

Hay microorganismos que, aunque viven en presencia de oxígeno, no son capaces deutilizarlo como aceptor final de electrones y deben desarrollar un metabolismo fermen-tativo (las bacterias lácticas que son anaerobias aerotolerantes, por ejemplo).

Por otra parte, hay microorganismos que pueden desarrollar ambos tipos de metabo-lismo. Esto es: en presencia de oxígeno desarrollan un metabolismo oxidativo y en suausencia, fermentativo. El rendimiento de los procesos fermentativos es menor que elde los respirativos: las bacterias y las levaduras producen menos biomasa cuando crecenfermentando que cuando lo hacen respirando.

En el curso de ciertas reacciones metabólicas redox se forman compuestos altamen-te reactivos (radicales libres, formas superóxido) que pueden dañar las proteínas, mem-branas y ácidos nucleicos produciendo la muerte de las células. Las células se defiendende estos compuestos reactivos mediante las enzimas siguientes: Superóxido dismutasa(SOD) y catalasa. Los anaerobios estrictos carecen de SOD y de catalasa o tienen ni-veles muy bajos de estas enzimas de forma que no pueden sobrevivir en presencia deoxígeno. La detección de estas enzimas tiene valor taxonómico.

13.- RENDIMIENTO DE LOS CULTIVOS.

El gráfico siguiente representa la variación de la biomasa (o número de células, etc.)de un cultivo a lo largo del tiempo. En este cultivo, se va consumiendo un substrato cu-ya concentración decrece de forma proporcional al crecimiento de la biomasa.

Definiremos el rendimiento de utilización del substrato (Ys) al valor que repre-senta la cantidad de biomasa producida por unidad de substrato consumido:


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Ys = dN/dS (ecuación 8)

El rendimiento de utilización de diferentes substratos puede ser diferente (hay subs-tratos, o alimentos, que "engordan"1 más que otros), varía entre diferentes microorga-nismos (hay microorganismos que "engordan" más que otras comiendo lo mismo) yvaría también en función de otras condiciones ambientales o fisiológicas (no engorda lomismo uno al comer algo si está sano o enfermo o si está en verano o en invierno).También varía el rendimiento en función de que el metabolismo sea oxidativo o fer-mentativo (estos conceptos serán revisados más adelante).

Podemos calcular el rendimiento de la utilización del substrato en función de la can-tidad de substrato añadido al cultivo, o en función de la cantidad de carbono presente enese substrato (por ejemplo). Asimismo, podemos calcular la cantidad de biomasa total(gramos de células, por ejemplo) o de carbono presente en las células (aproximada-mente el 50% de la masa celular corresponde a carbono).

Haciendo las transformaciones que se indican a continuación sobre la fórmula querelaciona la variación de biomasa con la de substrato (8), llegamos a la definición de unnuevo concepto qs denominado tasa específica de consumo de substrato por el orga-nismo.

Ys = dN/dS (ecuación 8)

dN/dt = Ys (dS/dt) (ecuación 9)

(dN/dt)/N = Ys (dS/dt)/N (ecuación 10)

como, de acuerdo con la ecuación (5), µ = (dN/dt)/N,

µ = Ys qs (ecuación 11)

Esto es, la tasa específica de consumo de substrato (qs) la podemos considerar la"velocidad" con la que el organismo consume el substrato. Evidentemente, cuanto ma-yor sea la tasa de consumo mayor será la tasa de crecimiento (µ).

qs = Ys/µ (ecuación 12)

Asimismo, cuanto mayor sea el rendimiento del substrato consumido, también mayorserá la tasa de crecimiento.

Sin embargo, hay una cierta compensación entre la tasa de consumo del substrato yel rendimiento de forma que los microorganismos que tienen altas tasas de consumo desubstrato tienen rendimiento más bajos (o cuando se dan las condiciones para una altatasa, el rendimiento disminuye). A esta relación inversa se le conoce con el nombre deefecto Pasteur.

1 La expresión "3engordar" está usada de forma metafórica: las bacterias no engordan. La uso porqueresulta útil esta metáfora antropòmórfica para entender algunos de los conceptos relacionados con el ren-dimiento de cultivos.


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Por último, nos falta relacionar la tasa de crecimiento (µ) con la concentración desubstrato (S). En condiciones de substrato abundante, la concentración de este no afectaal valor de µ; pero cuando el substrato se hace limitante, sí existe ese efecto. La expre-sión matemática que relaciona ambos parámetros se conoce con el nombre de ecuaciónde Monod y es la siguiente:

µ = µmax [S/(Ks+S)] (ecuación 13)

En esta ecuación la tasa de crecimiento (µ) depende de la máxima que puede alcan-zar el microorganismo (µmax), de la concentración de substrato (S) y de un valor cons-tante, Ks, que representa la concentración de substrato a la que se alcanza una tasa decrecimiento igual a la mitad de la máxima. La ecuación de Monod tendrá mucha im-portancia al tratar de cultivos continuos. Para que se cumpla esta ecuación el rendi-miento debe ser independiente de la concentración de substrato.

En la práctica, los valores de Ks suelen ser muy bajos, lo que indica que los microor-ganismos crecen con tasas (µ) muy próximas a las máximas (µmax) a concentraciones desubstrato bajas y sólo cuando estas son extremadamente bajas, la velocidad de creci-miento se reduce. Esto es debido a que los sistemas de transporte de nutrientes suelentener valores de Km considerablemente reducidos (La Km indica la concentración desubstrato a la que la velocidad de transporte es la mitad de la máxima)

14.- CINÉTICA DE CRECIMIENTO EN UN CULTIVO CONTINUO.

En un cultivo continuo se mantienen los microorganismos en crecimiento constanteporque se añade de forma constante medio de cultivo fresco (que aporta nuevos nu-trientes) y se elimina cultivo (medio usado con sus microorganismos correspondientes)a la misma velocidad con objeto de mantener el volumen total del cultivo constante.

Los cultivos continuos son importantes para trabajar con microorganismos que esténcreciendo constantemente de manera que sean capaces de producir constantemente pro-ductos de interés (biomasa, metabolitos secundarios, etc.). Este tipo de cultivo es tam-bién importante en los estudios de fisiología y de ecología microbiana. En la naturalezaun ejemplo de cultivo continuo lo constituye el rumen de ciertos animales y el conjuntode procesos microbianos intestinales de todos los animales.

En un cultivo continuo se pretende mantener un ambiente constante durante todo eltiempo de cultivo. Esto es imposible en un cultivo estanco en el que los nutrientes sevan consumiendo progresivamente y el medio se va cargando de productos de desecho.

QUIMIOSTATO

El tipo más frecuente de cultivo continuo es el quimiostato en el que se introducemedio fresco a un flujo constante denominado velocidad de dilución (D) a la vez quese elimina cultivo viejo al mismo flujo. El medio de cultivo de un quimiostato contieneun nutriente esencial en una cantidad limitante (nutriente limitante). Estos parámetrosse relacionan de acuerdo a la siguiente ecuación:


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D = f/V (ecuación 14)

donde f es la velocidad de flujo (ml h-1) y V el volumen del recipiente en ml. Por consi-guiente, las dimensiones de D son [h-1]. El valor D indica el número de volúmenes dereactor (volúmenes de fermentador) que pasan a través el reactor por unidad de tiempo.Este valor es el recíproco del tiempo de residencia o tiempo que una unidad de subs-trato está dentro del reactor.

Tanto la tasa de crecimiento µ como el nivel de población microbiana están relacio-nados con el valor de D.

A velocidades de D muy bajas, pequeños incrementos de la velocidad de diluciónproducen un cierto incremento de la densidad del cultivo debido a que se aportan másnutrientes al medio y el microorganismo no ve limitada su tasa de crecimiento (µ) segúnlo indicado en la ecuación de Monod (ecuación 13).

La velocidad de crecimiento aumenta (µ aumenta y τ disminuye) cuando la energíaaportada por los nutrientes entrantes supera la energía de mantenimiento de los micro-organismos del cultivo.

A valores bajos de D la concentración de nutriente limitante (S) en el efluente es bajaporque es consumido casi completamente por los microorganismos del cultivo que al-canzan unas poblaciones de gran tamaño creciendo a una tasa (µ) baja porque se en-cuentran en condiciones de limitación de nutrientes (S<Ks). A valores más altos de D notodo el nutriente es consumido por los microorganismos del cultivo por lo que S en elefluente aumenta.

En una situación de equilibrio (steady state), velocidad de dilución D se iguala a latasa de crecimiento µ, de forma que el control de la tasa de dilución (control del flujo f)permite regular la tasa de crecimiento y, de esa forma, la situación fisiológica del orga

densidad celular o biomasa

Tiempo de generación

concentración de substrato

Velocidad de dilución


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nismo. A valores de D> µmax, el microorganismo no es capaz de crecer lo suficientecomo para evitar ser eliminado del cultivo por el rebosadero y, por consiguiente S al-canza un valor máximo (el nutriente limitante no es consumido en el cultivo y la con-centración del substrato en el efluente es igual a la del substrato en el medio inicial) y latasa de crecimiento de microorganismos (µ) dentro del cultivo se hace nula (el cultivodesaparece).

La evolución de la biomasa de un quimiostato se ajusta a la ecuación siguiente:

dX/dt = crecimiento - salida = µX - DX (ecuación 15)

Por consiguiente, si µ > D hay un incremento positivo de la población en el qui-miostato, cuando µ = D el tamaño de la población se mantendrá estable (equilibrio) y siµ < D la población disminuirá como consecuencia de la dilución de las bacterias. En elsteady-state, como (dN/dt) = 0, µ = D como se había explicado anteriormente.2

Habida cuenta de que en el estado estacionario D = µ, la ecuación de Monod ((13)puede reformularse en los siguientes términos

D = µmax [Sr/(Ks+Sr)] (ecuación 16)

donde Sr es la concentración de nutriente limitante en el efluente del cultivo continuo.

Despejando de la ecuación 16 el valor de Sr en función de los demás, se obtiene laecuación siguiente:

Sr = DKs/(µmax-D) (ecuación 17)

que permite calcular cómo varía la concentración del nutriente limitante en el efluenteen función de la tasa de dilución D.

Si llamamos SR a la concentración de nutriente limitante que entra en el fermentadory Sr la concentración de este nutriente en el efluente; considerando que el substratoconsumido en el fermentador (SR-Sr) es transformado en biomasa durante el estado es-tacionario (Ñ) con un rendimiento Ys, podemos calcular la producción de biomasa en elfermentador con las siguiente ecuaciones

Ñ = Ys(SR-Sr) (ecuación 18)

Ñ = Ys{SR-[DKs/(µmax-D)]} (ecuación 19)

Estas ecuaciones nos permiten modular la cantidad de biomasa producida o la cantidadde substrato consumido regulando la tasa de dilución del fermentador.

TURBIDOSTATOS

2 En realidad, esto no es una demostración de que en el steady state las tasas de dilución y crecimiento seigualan, ya que en los cáculos se partía de esta condición para poder reformular la ecuación de Monod.


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El segundo tipo de cultivo continuo es el turbidostato en el que se ajusta la veloci-dad de dilución de tal forma que la densidad óptica del cultivo se mantiene constante.El valor D en un turbidostato, por tanto, es variable. Por otra parte, en un turbidostato elmedio de cultivo no contiene nutrientes limitantes.

Los turbidostatos funcionan mejor valores de D altos, mientras que el quimiostato avalores de D bajos.

CULTIVO SEMI-CONTINUO

Un cultivo semi-continuo (feed-batch) es un cultivo estanco al que se añaden en di-ferentes momentos nutrientes concentrados para permitir un mayor crecimiento o unaproducción más efectiva de metabolitos secundarios. En un cultivo de estas característi-cas el nutriente añadido suele ser una fuente que aporte el carbono necesario para obte-ner energía y elementos para la síntesis de los metabolitos secundarios de interés. Porejemplo, la producción de penicilina se realiza mediante un cultivo de estas caracterís-ticas.

15.- TIPOS DE FERMENTADORES

Podemos distinguir dos grandes tipos de fermentadores según el estado del medio decultivo: fementadores líquidos y sólidos.

FERMENTADORES LÍQUIDOS

En ellos los nutrientes se encuentran en esta forma y los microorganismos se desa-rrollan flotando libremente en el volumen de medio de cultivo o formando agregadosmás o menos esféricos (pellets) en el caso de los cultivos de hongos. Este tipo de culti-vos se denomina en ocasiones cultivo sumergido.

El diseño de un fermentador líquido requiere tener en cuenta una serie de factoresque influyen en el crecimiento, y en el rendimiento del proceso: temperatura, pH, airea-ción, etc. Por consiguiente, el diseño físico de los fermentadores líquidos tienen queincluir la presencia de sondas que permitan medir estos parámetros durante el cultivo yde sistemas que permitan corregir las desviaciones que se puedan producir (sistemas derefrigeración para control de temperatura, sistemas de ajuste de pH mediante la adiciónde ácidos o bases, etc.).

Un aspecto adicional que considerar en el diseño de un fermentador es la presión hi-drostática que se alcanza en su base y que puede limitar el crecimiento de microorga-nismos. En general, la altura máxima de un tanque de fermentación se sitúa en los 15 mya que por encima de esa altura se alcanzan valores de presión inhibidores.

Tienen especial importancia dos problemas: la agitación destinada a asegurar unamezcla correcta de los ingredientes del medio y de los microorganismos que crecen enél, y la aireación.


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Fermentadores en tanque

Son los fermentadores más sencillos. La agitación se consigue por un sistema depalas unidas a un eje y un motor y por las turbulencias creadas por un sistema de baflesadosados a las paredes de la cuba de fermentación.

La aireación se consigue por un difusor de aire que emite desde la parte inferior de lacuba de fermentación. La transferencia de oxígeno al cultivo se hace por las burbujasque van ascendiendo por el volumen de cultivo.

El principal problema de estos fermentadores es el elevado coste del sistema mecá-nico de agitación, principalmente cuando se realizan cultivos de hongos filamentosos enlos que la viscosidad debida al micelio aumenta mucho.

Fermentadores Air-lift

En estos fermentadores la agitación y a aireación se logran mediante la inyección deaire por la parte inferior de la cuba de fermentación,

la entrada de aire produce un convección que se canaliza por un tubo vertical interior enla cuba. La aireación también permite reducir la cantidad de calor producida durante lafermentación.

En este fermentador, las burbujas de aire van aumentando de tamaño conforme as-cienden por el tubo interior por lo que su relación superficie/volumen disminuye y latransferencia de oxígeno al cultivo es menor.

Fermentadores Deep-Jet

En ellos el aire se inyecta a presión desde la parte superior de la cuba de fermenta-ción de forma que las burbujas de aire se van haciendo más pequeñas (mejor transferen-cia de oxígeno) hasta llegar al final del cilindro interior, y a partir de ahí las burbujasvuelven a crecer al ascender por la parte exterior de la cuba de fermentación. En lapráctica, es un fermentador similar al anterior; pero operado al revés.


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FERMENTADORES SÓLIDOS

En ellos los nutrientes se encuentran en esta forma y los microorganismos se desa-rrollan en la superficie del substrato o penetrando en él. Es un tipo de fermentación muyaplicada en la producción de algunos alimentos (setas cultivadas, koji, etc.) y también laque tiene lugar en los procesos de compostaje de residuos orgánicos.

Hay varios modelos de fermentadores sólidos:

1. Tambor2. Bandejas3. Sistema de lecho (bed system)

Por otra parte, existen sistemas semisólidos en los que los microorganismos estánadheridos a superficies estáticas y los nutrientes pasan por filtración o goteo a través deellos (sistema de la producción de vinagre por goteo), o los microorganismos se en-cuentran formando agregados que se mantienen en suspensión por medio de una co-rriente de medio de cultivo líquido (reactores de lecho fluidificado).

cultivo de microorganismos

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