PRÁCTICA # 5

“TÉCNICAS BÁSICAS PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS: SIEMBRA Y ESTUDIO DE BACTERIAS”

INTRODUCCIÓN

Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos métodos que permiten cultivarlos bajo condicione artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de las técnicas más usadas en el laboratorio de microbiología consiste en transferir una muestra microbiológica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos. A l efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el área de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que éstos penetren y contaminen los cultivos en estudio. Por otra parte, para considerar no sólo el aspecto nutricional, sino también las condiciones ambientales de su hábitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar el pH y concentración de sales y durante la incubación condiciones tales como la temperatura, aireación la luminosidad.

La aplicación de estos procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, así como su aislamiento y la obtención de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio, caracterización, aplicación y control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propósito específico del estudio.

OBJETIVOS:

Aplicar la técnica adecuada para preparar el área de trabajo y evitar contaminaciones.Organizar el material para su fácil manejo e identificación.Manipular adecuadamente los cultivos puros.Seleccionar y aplicar las técnicas de siembra adecuadas para alcanzar propósitos específicos. Identificar y describir correctamente las características culturales y microscópicas de algunas bacterias.Organizar e interpretar los resultados del estudio macroscópico y microscópico de bacterias.

MARCO TEÓRICO:

Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de éste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La población de microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo. Cuando éste contiene una sola especie de microorganismo, se denomina cultivo puro o axénico, cuando contiene más de una especie de microorganismos se denomina cultivo mixto. Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios.

Un cultivo axénico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola célula. Los cultivos axénicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano- existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo axénico se obtiene artificialmente en el laboratorio. A la hora de obtener un cultivo axénico se han de tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos están por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio y en los instrumentos y recipientes usados en los experimentos. Estos microorganismos no deseados o contaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que éste pueda ser axénico. El segundo paso para obtener un cultivo axénico es inocular o introducir, una sola célula de un microorganismo en un medio sólido o liquido, esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se podrá multiplicar en condiciones favorables. Un clon está constituido por una población de células descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio sólido.

Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o matraz, debe ser transferido a un medio de cultivo nuevo, de otra manera el crecimiento y sobrevivencia no pueden continuar. En esta transferencia se deben considerar dos aspectos básicos referentes a: no introducir microorganismos indeseables (contaminantes) y concentración o carga microbiana de la muestra (inóculo) a sembrar.

Para impedir la contaminación de los cultivos, es necesario tener plena conciencia de la ubicuidad de los microorganismos, lo que determina que el aíre y todas las superficies estén densamente pobladas por microorganismos, de este modo en la transferencia de una muestra microbiológica a otro recipiente, se deben tener una serie de cuidados que eliminen los riesgos de contaminación. Estos incluyen el área de trabajo, el lavado de las manos, la esterilización de todos los utensilios y medios de cultivo a emplear y realizar la transferencia del microorganismo en una zona estéril, la que se obtiene trabajando cerca de la flama del mechero. Al conjunto de procedimientos realizados para prevenir o evitar la contaminación se le llama técnica aséptica; el seguimiento cuidadoso y detallado de la misma evita accidentes tales como:

o La contaminación y pérdida del cultivo en estudioo La salida y dispersión de microorganismos del cultivo, lo que ocasionaría la contaminación de utensilios,

productos y del personal. Este último aspecto es particularmente importante cuando se trabaja con cultivos de microorganismos patógenos.

Con relación a la concentración del inóculo, un error frecuente del principiante consiste en tomar muestras grandes, lo que es innecesario. Una colonia de bacterias del tamaño de la cabeza de un alfiler contiene varios millones de microorganismos, es obvio que con una cantidad pequeñísima (casi invisible) que se adhiera al asa, será más que suficiente para efectuar una transferencia exitosa.

Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas: hisopo, pipeta (para uso microbiológico son terminales y la parte superior o boquilla debe estar protegida con filtro de algodón), pipeta pasteur, cable de Kolle o portasa con alambre de platino dispuesto en forma de: aguja, asa, espátula y/o gancho.

En la transferencia de microorganismos se emplean agujas, asas de inoculación, hisopos, pipetas o pipetas pasteur que deberán esterilizarse previamente. La utilización de estos dispositivos, así como de los diferentes medios de cultivo tienen aplicaciones específicas. Por ejemplo: los medios líquidos se preparan en tubos o matraces que se cubren con tapones de algodón o tapones especiales. Un cultivo líquido puede ser transferido mediante un asa microbiológica, un hisopo, pipeta o pipeta pasteur; el inóculo se deposita dentro del caldo o medio líquido. En este tipo de cultivos los microorganismos presentan un desarrollo particular que se manifiesta en la superficie o a través de todo el líquido. Una de las ventajas que presenta este tipo de cultivo se refiere a la posibilidad de agitarlos acelerando la velocidad de microorganismos anaerobios, por otra parte, en este tipo de cultivos, las poblaciones se encuentran suspendidas y e fácil homogenizarlas, lo que permite estandarizar la concentración del inóculo. La desventaja que presentan, e que en ellos e difícil detectar contaminación a simple vista.

Los medios semisólidos e preparan en tubos, se inoculan con aguja de siembra (asa recta) o pipeta pasteur; en este último caso es necesario calentar el medio y cuando se encuentra en estado líquido y a una temperatura de aproximadamente 42ºC se agrega el inóculo, se homogeniza y se deja solidificar. Estos medios se emplean para estudiar la movilidad de los microorganismos y para favorecer la separación de microorganismos con diferentes requerimientos de oxígeno.

Los medios sólidos e preparan en tubos o matraces dependiendo de la cantidad o de las necesidades, después de esterilizarlos, estos se inclinan o vierten en cajas de petri. La siembra se realiza con el asa, inoculando la superficie del agar con mucha suavidad; en estos medios, los microorganismos al multiplicarse forman agregados que se hacen visibles a simple vista; a estos agregados se les denominan colonias, las que presentan características que varían con el tipo de microorganismo cultivado y el medio de cultivo empleado.

En cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya que aún cuando la mayoría de los microorganismos crecen mejor en pH neutro, algunos requieren de pH alcalino o ácido, por lo que al proporcionar un pH adecuado se favorecerá el crecimiento del microorganismo de interés y la obtención del cultivo. Con este mismo propósito durante la incubación se deben proporcionar las condiciones adecuadas para el microorganismo en estudio. El crecimiento óptimo de los microorganismos se presenta a temperaturas que la mayoría de las veces están relacionadas con la de su hábitat natural.

Algunos microorganismos crecen por debajo de 15ºC, otros requieren temperaturas más elevadas (30 a 45ºC) y algunos hasta 80ºC. Para alcanzar y mantener estas temperaturas se puede usar una incubadora microbiológica o un baño de agua a temperatura constante, en tanto que para lo microorganismos que presentan su crecimiento óptimo a temperaturas entre 20 y 25ºC se pueden incubar en la gaveta o cajón del laboratorio, a temperatura ambiente.

En general las incubadoras microbiológicas satisfacen las necesidades en cuanto a los rangos de temperatura requeridas por los microorganismos. La desventaja que tienen es que estos aparatos funcionan con aíre seco, lo que determina la deshidratación de los medios de cultivo. Por lo tanto, el crecimiento de cualquier cultivo experimental que se realice en incubadora no debe prolongare por más de nueve días. Con relación a las

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necesidades gaseosas, no todos los microorganismo crecen en presencia de oxígeno atmosférico; los que sólo crecen en presencia de aíre se llaman aerobios obligados; los que sólo crecen en ausencia de oxígeno se denominan anaerobios obligados o estrictos, un tercer grupo se adapta a las dos condiciones y se le conoce como facultativos. Existe una cuarta categoría que comprende bacterias que requieren oxígeno, pero sólo lo utilizan cuando éste existe en concentraciones reducidas; a estos se les llama microaerofílicos. El desarrollo de estos diferentes grupos e favorece mediante la agitación de los cultivos o mediante la exclusión de oxígeno para lo que se emplean sustancias reductoras o equipos especiales.

Las bacterias son organismos procarióticos, se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, habitan en el agua, el suelo, en la superficie o en el interior de plantas y animales incluyendo al hombre. Pueden vivir en forma libre o en simbiosis con otros organismos, ya sea como parásitos, comensales o mutualistas. Fisiológicamente este grupo presenta características muy variables, hay bacterias móviles e inmóviles fotosintéticas y quimiotróficas, autótrofas y heterótrofas; se desarrollan en un rango muy amplio de temperatura, pH y condiciones gaseosas.

En el estudio de cultivos bacterianos algunos de los criterios que se emplean para caracterizarlas incluyen: tamaño, morfología celular, forma de agrupación, reacción a la tinción de Gram, formación de esporas, movilidad, presencia de inclusiones de reserva y características culturales en medios líquidos y sólidos en los que presentan patrones de desarrollo en cuanto a la forma, tamaño, elevación y color de las colonias.

Técnicas de siembra:

El método de siembra por estría en placa

Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para ello, con un asa de siembra se toma una muestra de la población mixta y a continuación se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido preparado en una placa Petri (a las placas Petri también se les denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. A continuación, se flamea el asa, se toca en la región donde se han realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar células individuales. A continuación, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las células aisladas experimenten un número suficiente de divisiones para formar colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado de una sola célula, no podemos asegurarlo. Quizás, dos células quedaron depositadas tan juntas que han originado una única colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axénico, conviene repetir el procedimiento a partir de una colonia bien aislada en la primera placa. Las colonias que se desarrollen la segunda vez, serán, casi con toda seguridad, cultivos axénicos.

Los métodos de vertido en placa y extensión en placa

En estos métodos, las suspensiones de células microbianas se diluyen antes de su siembra en placa. Se siguen estas técnicas cuando la muestra contiene tantos microorganismos, que la dilución no se puede realizar en una sola etapa. Por ejemplo, una suspensión con mil millones de células por mililitro debe ser diluida 10 7 veces para obtener una suspensión con un centenar de células por mililitro, Por tanto, se realizan diluciones seriadas (en varias etapas), normalmente de diez en diez, pero a veces de cien en cien. Para realizar diluciones de diez en diez, se añade 1 ml de la suspensión bacteriana a 9 ml (le medio estéril o solución salina, igualmente estéril. Se agita vigorosamente para diluir las células y el proceso se repite cuantas veces sea necesario. A continuación, se puede proceder de dos maneras diferentes.

En el método de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se vierten en placa. Algunas colonias quedarán embebidas en el agar y otras crecerán en la superficie. Las colonias superficiales se extenderán y serán más grandes. En el segundo método (extensión en placa), las muestras diluidas se siembran directamente en la superficie de la placa de agar, extendiéndolas con avuda de un asa de Diralsky de cristal estéril. La suspensión se absorbe en el agar, dejando las células microbianas sobre la superficie. En ambas técnicas las placas se incuban hasta la aparición de las colonias. Como en el método de siembra por estría, no existe la seguridad de que las colonias que aparecen en las placas sembradas por extensión o en el agar solidificado sembrado por el método del vertido en placas sean cultivos axénicos hasta que se repita el proceso.Las dos técnicas de siembra por dilución presentan la ventaja de que permiten obtener un mayor número de colonias aisladas que el método de siembra por estría, por tanto se eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de microorganismos.

Para obtener un cultivo axénico mediante este método:(a) Hacer diluciones seriadas de la suspensión bacteriana hasta obtener una muestra con sólo unos pocos cientos de bacterias

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(b) verter la muestra en un tubo con agar a sobrefusión, mezclar y verter el contenido en una placa Petri. (c) Después de la incubación, se desarrollan colonias en el agar (más pequeñas) y en su superficie (más grandes).Método de aislamiento por siembra por estría en placa: Para obtener un cultivo axénico:

(a) esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero(b) introducirla en la suspensión bacteriana para recoger una muestra(c) sembrar haciendo estrías sobre la superficie de un medio sólido en una placa Petri, y (d) volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un segundo grupo de estrías en una región nueva de la placa. Repetir el proceso una tercera y una cuarta vez, hasta conseguir que los grupos de células se diluyan y se separen células aisladas. (e) Después de la incubación, se desarrollan colonias aisladas. Para estar seguro de que el cultivo es puro, repetir el proceso entero; para ello tomar una colonia aislada y sembrar por estrías una segunda placa.

El crecimiento de los cultivos axénicos

Una vez que se obtiene un cultivo puro, normalmente se ha de propagar (se le hace crecer de nuevo). Para cultivar microorganismos en el laboratorio, se ha de preparar un medio de cultivo, líquido o sólido, con todos los nutrientes necesarios para su crecimiento. Los medios sólidos se hacen generalmente, añadiendo agar a los líquidos.

Tipos de medios de cultivo

El tipo de medio que utiliza un microbiólogo depende del microorganismo que está cultivando y el porqué de dicho cultivo. Los microorganismos presentan una enorme variedad de requerimientos nutricionales. Se utiliza un medio mínimo para determinar los requerimientos nutricionales de un organismo y un medio rico si se desea obtener masa celular de una forma rápida. Los medios se pueden formular para el desarrollo de una especie o para distinguir entre especies o cepas. Por tanto, los medios se clasifican en definidos, complejos o indefinidos, selectivos, diferenciales, selectivos-diferenciales y de enriquecimiento, dependiendo de su composición y uso.

Medios definidos

Un medio definido es aquel del cual conocemos su composición química exacta, porque ha sido preparado a partir de compuestos químicos puros. Echerichia coli es capaz de crecer en un medio químicamente definido, de composición bastante sencilla. Este microorganismo requiere una fuente de carbono orgánica (por ejemplo, glucosa), pero puede obtener el resto de los nutrientes esenciales a partir de sales minerales. En cambio, otros

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organismos, denominados exigentes, requieren medios químicamente muy complejos. Por ejemplo, la bacteria Leuconostoc citrovorum es extraordinariamente exigente ya que requiere un medio con muchos ingredientes. Los medios definidos se usan generalmente para realizar estudios genéticos, pero sus inconvenientes a menudo sobrepasan sus ventajas. Así, se requiere un tiempo considerable para preparar un medio definido y las bacterias crecen más despacio en ellos. Además, no conocemos los requerimientos nutricionales de todas las bacterias y, por tanto, no siempre pueden utilizarse.

Medios complejos

Se desconoce la composición química exacta de un medio complejo. Estos medios se preparan a partir de extractos de productos naturales tales como carne, sangre, caseína (la proteína de la leche), levaduras o soja. Un medio líquido complejo se denomina caldo. La caseína u otras proteínas que se añaden a los medios son usualmente hidrolizadas con enzimas o en medio ácido, para hacerlas más solubles y, por tanto, más fáciles de utilizar nutricionalmente. Una hidrólisis parcial rompe las proteínas en péptidos. Una hidrólisis total las degrada hasta aminoácidos. A las proteínas parcialmente hidrolizadas se les denomina peptonas. Entre las peptonas comerciales se encuentra la proteosa-peptona, la triptona y la triptosa. A la caseína totalmente hidrolizada se le denomina hidrolizado de caseína.

Los diversos componentes de un medio complejo se venden como polvos deshidratados. También existen ya cientos de mezclas complejas que se comercializan como medios complejos específicos. Uno de estos medios es el caldo nutritivo, probablemente el medio complejo que más se utiliza. Cuando este medio se solidifica con agar, se denomina agar nutritivo. Generalmente se prefiere la utilización de los medios complejos, ya que son fáciles de preparar y permiten un crecimiento rápido de los microorganismos.

Medios selectivos

Un medio selectivo favorece el crecimiento de ciertos microorganismos, mientras suprime el crecimiento de otros. Los medios selectivos se utilizan para aislar especies particulares a partir de una mezcla compleja. Por ejemplo, se utiliza un medio selectivo, para aislar Salmonella typhi, agente causal de la fiebre tifoidea, a partir de heces donde existen cientos de microorganismos diferentes. Algunos medios son selectivos porque contienen un producto químico, como la azida sódíca, el telurito potásico o el cristal violeta, que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos pero no de otros. El agar SPS (denominado de esta forma porque contiene sulfadiacina y sulfato de polimixina) se utiliza para identificar Clostridium botulinum, agente causal de una grave intoxicación alimentaria. El medio SPS permite el crecimiento de esta bacteria, pero inhibe el de otras especies de Clostridium. otros medios de cultivo selectivos utilizan un valor extremo de pH o una fuente de carbono poco común. Medios diferenciales

Se utiliza un medio diferencial para identificar las colonias de un determinado microorganismo. Por ejemplo, para identificar Streptococcus pyogenes, la bacteria que causa la escarlatina, se utiliza el medio de agar sangre es un agar que contiene hematíes. Las colonias de esta bacteria muestran a su alrededor una zona transparente debido a que producen hemólisis (muerte y lisis de los hematíes). Escherichia coli y las bacterias relacionadas con ella se identifican en medios con un indicador de pH porque originan productos metabólicos ácidos, que cambian el color del indicador y por tanto de sus colonias.

Medios selectivos-diferenciales

Algunos medios son selectivos y diferenciales al mismo tiempo. El agar MacConkey es un ejemplo de medio selectivo-diferencial, utilizado para detectar cepas de Salmonella y Shigella, bacterias entéricas (del intestino) que causan disenterías. Cualquier muestra de heces enviada al laboratorio esta plagada de bacterias pertenecientes a muchas especies. El agente selectivo del MacConkey actúa como una especie de tamiz grosero que disminuye el campo de identificación. El cristal violeta y las sales del medio inhiben el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram positivas (Salmonella y Shigella son Gram negativas). A partir de aquí, el componente diferencial del medio, en este caso la lactosa, comienza a ser importante. Salmonella y Shigella no fermentan la lactosa, pero la mayor parte de las enterobacterías sí lo hacen. Por tanto, las colonias de estas dos bacterias serán rojas, mientras que las restantes no lo serán.

Medios de enriquecimiento

Un medio de enriquecimiento se utiliza para aislar un tipo particular de microorganismo a partir de una población mixta de gran tamaño. Por ejemplo, las bacterias formadoras de endosporas pueden aislarse hirviendo una muestra de suelo y cultivando los supervivientes. Solamente las endosporas resistirán el tratamiento y podrán

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crecer. Las bacterias lijadoras de nitrógeno pueden seleccionarse cultivando el inóculo de suelo en un medio libre de nitrógeno, donde sólo ellas podrán crecer porque obtienen el nitrógeno de la atmósfera. Los ecólogos microbianos usan frecuentemente medios de enriquecimiento. Por ejemplo, para encontrar un microorganismo que degrade un determinado compuesto químico tóxico, se puede inocular la muestra de suelo en un medio en el cual la única fuente de carbono sea dicho compuesto. El microorganismo que prospere en él podrá ser utilizado en biorremediación.

Condiciones ambientales idóneas para el cultivo en el laboratorio

Un medio se formula para suministrar todos los nutrientes que un microorganismo necesita para crecer, pero esto no es suficiente. En el laboratorio, también es preciso aportar las condiciones ambientales adecuadas. Tanto la temperatura como el pH deben estar dentro del intervalo apropiado; con respecto al oxigeno, según el caso, será aportado o eliminado.

Temperatura

Cada especie bacteriana se caracteriza por un intervalo de temperatura en el cual presenta su crecimiento óptimo. Pero, en general, los microorganismos crecen más rápidamente cuando se aumenta la temperatura, sin llegar hasta un punto en el cual se dañan las proteínas. Así pues, para favorecer un crecimiento rápido, las bacterias se suelen cultivar a la temperatura más alta a la cual crecen bien, y que suele ser la de su medio natural. Escherichia coli la bacteria que más frecuentemente se utiliza en investigación, se encuentra en el intestino humano y de otros mamíferos. Este microorganismo crece óptimamente a 37ºC, la temperatura del cuerpo humano.

Los cultivos se mantienen a temperatura constante en incubadores o en baños de agua, ambos controlados termostáticamente. Los incubadores, o estufas, son cámaras con aire adecuados para el crecimiento tanto de cultivos sólidos como líquidos, preparados en cualquier recipiente, incluyendo placas Petri, tubos de ensayo, o matraces. Los medios líquidos, distribuidos en tubos o matraces, también pueden ser incubados en baños de agua caliente. Estos baños resultan cómodos para incubar los cultivos que tienen que manipularse con frecuencia, en la misma mesa de trabajo.

pH

El pH óptimo depende de la especie bacteriana, pero cada una de ellas crece en un intervalo de pH relativamente estrecho. Casi todas las bacterias crecen mejor a valores de pH próximos a la neutralidad, en el intervalo de 6,5 a 7,5. Sin embargo, los hongos crecen mejor entre 4,5 y 6,0.

Aunque el pH de un medio sea el adecuado cuando se inicia el cultivo, a menudo el crecimiento microbiano lo modifica. Esto sucede porque algunos microorganismos usan selectivamente algún componente ácido o básico del medio; o bien, porque algún producto de su metabolismo es un ácido o una base. Para disminuir los cambios de pH en los medios definidos se suelen utilizar tampones. En los medios complejos no suele ser esencial, porque sus materiales naturales actúan como tampones débiles. Los tampones más eficaces para valores neutros de pH son los fosfatos y el carbonato cálcico. Ambos se añaden normalmente como nutrientes (fuente de fósforo y calcio); pero si se desea que actúen como tampones se precisarán cantidades mayores. Oxígeno

La concentración de oxígeno del medio es un determinante crítico para el crecimiento bacteriano. Algunos microorganismos, a los cuales se denomina aerobios estrictos, no pueden vivir sin oxígeno porque lo necesitan para obtener energía. Otros microorganismos, llamados anaerobios estrictos, no pueden vivir en presencia de oxígeno, para ellos es un agente tóxico. Otros tipos de organismos, como los anaerobios facultativos o los anaerobios aerotolerantes, pueden crecer tanto en presencia de oxígeno como en su ausencia. Los anaerobios facultativos utilizan el oxígeno si disponen de él, pero también pueden crecer sin él. Los anaerobios aerotolerantes no utilizan el oxígeno, pero tampoco les afecta negativamente. Los organismos microaerófilos requieren ambientes con bajas tensiones de oxígeno; las altas tensiones, como las que existen en el aíre son tóxicas para ellos. Por tanto, dependiendo del microorganismo que se vaya a cultivar, se tendrá que suministrar, restringir o eliminar el oxígeno.

Suministrar oxígeno a las bacterias que lo necesitan para crecer, o que crecen más rápidamente en su presencia, representa una dificultad técnica. Los organismos aerobios que crecen en la superficie de las placas de agar, obtienen suficiente cantidad de oxígeno de la atmósfera, aunque el interior de toda colonia es completamente anaerobio. Cuando los microorganismos crecen en medios líquidos es más difícil, porque no existe demasiado oxígeno disuelto en el agua y los microorganismos aerobios lo consumen rápidamente. Todos los cultivos líquidos con más de uno o dos centímetros de profundidad deben oxigenarse. Esto se lleva a cabo haciendo pasar una

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corriente de aire a través del cultivo o agitándolo vigorosamente de forma continua. En casi todos los laboratorios de microbiología existen agitadores, que son plataformas en las cuales se pueden colocar los matraces convenientemente sujetos, para ser sometidos a un movimiento de rotación o a una agitación de vaivén, que mezclan el aire con el cultivo. El suministro de oxígeno a los cultivos de cientos de litros, como los que se utilizan para producir antibióticos, es un desafió para la ingeniería. Estos cultivos se remueven vigorosamente mediante grandes propulsores, mientras se fuerza a que pasen a través de ellos enormes cantidades de aire.

La exclusión del oxígeno del ambiente de los anaerobios también plantea problemas técnicos. Muchos microorganismos anaerobios se pueden cultivar en tubos de ensayo expuestos al oxígeno, sí el medio contiene un compuesto químico que reaccione con el mismo, como el tioglicalato, que reacciona con el oxigeno manteniendo la parte inferior del tubo libre de oxígeno. Los anaerobios también pueden cultivarse en placas Petri, si estas se incuban dentro de unos contenedores, en los cuales se haya eliminado totalmente el oxígeno y se haya reemplazado por un gas inerte como nitrógeno o argón. También se puede llevar a cabo una eliminación química del oxigeno. Para ello, se comercializan paquetes con unas mezclas (le reactivos que producen hidrógeno cuando se les añade agua; el hidrógeno reacciona con el oxígeno en presencia de un catalizador; la reacción consume el oxígeno produciendo agua. Un método muy sencillo para disminuir la concentración de oxigeno (y al mismo tiempo producir anhídrido carbónico, el cual es beneficioso para ciertos microorganismos) es encender una vela dentro de un recipiente y cerrarlo herméticamente; la vela consumirá oxígeno hasta que se extinga. Esta técnica se utilizaba para cultivar anaerobios aerotolerantes, como las bacterias del ácido láctico. También ha sido utilizada para microacrófilos, especialmente cuando el dióxido de carbono les favorece.

Los microorganismos anaerobios estrictos, que mueren incluso con una breve exposición al aire, pueden cultivarse en jarras de cristal herméticamente cerradas. Cuando se abren estos contenedores para añadir medio o tomar muestras, se utiliza una corriente de nitrógeno para sacar el aire de la vasija. A veces, se requieren técnicas más elaboradas. Es frecuente el uso de cámaras libres de oxígeno, en las cuales se trabaja usando unos guantes conectados a las mismas. Algunos laboratorios tienen habitaciones libres de oxígeno, donde los técnicos trabajan con máscaras de oxígeno.

Conservación de los cultivos axénicos

Una vez que se obtiene un cultivo axénico, hay que mantenerlo en el laboratorio para poder trabajar con él o intercambiarlo con otros científicos. Esto se puede llevar a cabo haciendo resiembras en un medio fresco, mensualmente o con otra periodicidad. Pero un cultivo puro también puede mantenerse viable durante años sin hacerlo crecer periódicamente. A los cultivos que se mantienen en el laboratorio para su estudio y como referencia se les denomina cultivos de colección. Muchos laboratorios poseen una colección de cepas que se han aislado en el mismo o que han obtenido de las denominadas colecciones de cultivos tipo, que son organizaciones que mantienen un número enorme de cultivos microbianos como un servicio a los microbiólogos. Existen muchas técnicas de mantenimiento de los cultivos puros, pero casi todas consisten en una desecación (eliminación del agua) o en un almacenamiento a baja temperatura.

Los cultivos generalmente se desecan por liofilización (congelación y desecación). El método consiste en lo siguiente: el cultivo líquido se vierte en un pequeño vial o ampolla de vidrio y se añade leche descremada para proteger las células durante el proceso. La mezcla se congela en hielo seco y se expone al vació para su sublimación (eliminación del agua congelada). Durante el proceso de sublimación las células permanecen congeladas. Posteriormente se procede al sellado de los viales, mientras aún se mantiene el vacío. Los cultivos liofilizados se almacenan a temperatura ambiente.

Para almacenar un cultivo empleando bajas temperaturas, se mezcla con sustancias protectoras, como la leche descremada, el glicerol, o el dimetilsulfóxido (DMSO). Los tubos de ensayo se sellan y se almacenan por debajo de los - 50oC, en nitrógeno líquido o en un ultracongelador, capaz de alcanzar tan bajas temperaturas.

Observación de las bacterias:

a) Observación macroscópica: El tamaño de las bacterias impide verlas a simple vista. Sin embargo, las colonias que forman sobre medios sólidos sí son visibles, y en ellas se puede estudiar una serie de características que nos ayudan a su identificación. A nivel morfológico, podemos estudiar la forma de las colonias, su tamaño, aspecto del borde (liso, rugoso, ondulado, ramificado, etc.), presencia de brillo, color, etc. Incluso sobre medio líquido las bacterias producen modificaciones de interés para su clasificación y que tienen que ver esencialmente con las características de su metabolismo. Así se observa si la turbidez es uniforme, si crecen en el fondo, si lo hacen en la zona superficial, si producen pigmentos, etc.

b) Observación microscópica: Puesto que la inmensa mayoría de las bacterias son incoloras, la única forma de observarlas bien en el microscopio óptico consiste en incrementar su contraste con respecto al medio. Esto se

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consigue mediante su teñido con colorantes o mediante la disposición de una óptica especial de contraste, generalmente de fases, en el microscopio.

Para observar las bacterias teñidas, hay que proceder previamente a su fijación. Inicialmente se prepara un frotis a partir de medio líquido o dispersando en una gota de agua una porción de células crecidas en sólido. Posteriormente se deshidrata el frotis por calentamiento suave utilizando el reverso de la mano como control de temperatura tras pasar repetidamente el portaobjetos sobre la llama del mechero. Tras la fijación por calor se procede a la tinción.

CUADRO DE CARÁCTERÍSTICAS DE BACTERIAS PATÓGENAS:

GÉNERO Y ESPECIE

MACROSCÓPICAS MICROSCÓPICAS TINTORIALES

Micrococcus luteus

Aerobio estricto, coagulasa negativa, forma colonias amarillo brillantes en agar nutritivo

cocos Gram +

Escherichia Coli Móviles, aerobias, anaerobias facultativas, mesòfilas, pH 6-8, indol, lactosa y glucosa positivo

Bacilos, capsula o microcápsula, flagelos perìtricos

Gram -

Pseudomona aeruginosa

Móviles, colonias gris con brillo metálico, aroma semejante a uva fermentada

Bacilos, un flagelo polar o un mechón de 2 a 3 flagelos, pillis

Gram -

Staphylococcus aureus

Inmóviles, colonias pequeñas, circulares, borde continuo, cremosas, anaerobios facultativos, fermentadores de maltosa, lactosa, glucosa, manitol, producción de ácido láctico, catalasa

Cocos, racimos o cadenas cortas, 0.7 a 1.2 micras

Gram +

Streptococcus sp Inmóviles, colonias elevadas, lisas, circulares, aerobio y anaerobio facultativo

Cocos en racimos, capsuladas

Gram +

Bacillus anthracis Móviles o inmóviles, esporulados, aerobios

bacilos Gram+

Bacillus cereus Aerobio o anaerobio facultativo, móvil, hidroliza la lecitina de huevo y no fermenta el manitol

Bacilos esporulado Gram +

Bacillus subtilis Catalasa +, aerobio Bacilos que esporulan Gram +Yersinia pestis inmóviles, aerobios, anaerobios

facultativos, fermentadores, ureasa y catalasa+, en ocasiones prod gas

Bacilos con extremos redondeados, flagelos perìtricos o anfitricos, pillis, cápsula de poco espesor

Gram -

Mycobacterium leprae

No se puede cultivar in Vitro, inmóvil

Bacilo delgado recto, en empalizada o haces

Ácido alcohol resistente Gram.+

Kleibsella pneumoniae

Inmóviles, aerobios, anaerobios facultativos, fermentadores y catalasa+, prod. gas

Bacilos capsulados Gram -

Clostridium tetani Móviles, colonias brillantes, traslucidas, gris amarillas borde irregular rizoide, anaerobios estrictos, pH 7.2-7.6 T 37ºC, prod gas y olor desagradable

Bacilos solos en cadena o pares, flagelos perìtricos, prod esporas redondas terminales

Gram +

Clostridium botullinum

Colonias pequeñas, traslucidas, borde filamentoso, centro opaco, blanco grisáceo, anaerobios estrictos

Bacilos aislados en parejas o cadenas cortas, flagelos perìtricos

Gram +

Mycobacterium tuberculosis

Forman un pigmento amarillo en incubación, aerobios estrictos

bacilo delgado, extremos redondeados

Acido-alcohol resistente, Gram.+

Nocardia Microaerofìlicos, anaerobios, fermentadores +

Bacilos y cocobacilos Gram +; débilmente acido-alcohol resistentes

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Salmonella Typhi Móviles, colonias grandes de 2 a 4mm rugosas o lisas, aerobios, anaerobios facultativos, mesòfilos, fermentadores, prod. H2SO4

Bacilos, flagelos perìtricos no esporulados

Gram -

Shigella dysenteriae

Inmóvil, colonias redondas 2mm, convexas, transparentes, aerobios, anaerobios facultativos, glucosa + indol+ o -

bacilos Gram -

Chlamydia trachomatis

Inmóviles, filtrables cocoides Gram - ; tinción con giemsa, castañeda o machiavello

Brucella sp Inmóviles, aerobio, catalasa, oxidasa y ureasa positivos

Bacilos cortos; cocobacilos

Gram -

Neisseria gonnorrhoeae

Inmóviles, aerobios, anaerobios facultativos, pH de 6 a 8, oxidasa y glucosa positiva

Cocos en pares, capsulados de 0.6 a 1micra

Gram -

Streptococcus pyogenes

Inmóviles, colonias en forma de disco, mucosas, mate, lisas o rugosas con hemólisis alrededor, anaerobios facultativos, producen ácido láctico

Cocos en cadena, 0.5 a 2mm

Gram+

Rickettsia pallidum

Inmóviles, intracelulares obligados Bacilos o cocobacilos, pared formada por 3 capas a manera de cápsula, cubierta mucilaginosa

Gram - ; tinción con Giemsa, Machiavello o Jiménez

Vibrio Cholerae Móvil, aerobio, anaerobio facultativo, sensible a la acidez, catalasa, indol, oxidasa, rojo de metilo, sacarosa y fermentador +

Bacilo curvo, un flagelo polar

Gram -

Corynebacterium diphtheriae

Aerobio y microaerofìlico, inmóviles, catalasa + fermentadores + T 35ºC pH 7.6

Bacilo en forma de basto con uno de sus extremos más angosto, agrupación en empalizadas.

Gram +; la tinción no es uniforme debido a los gránulos que contiene en su citoplasma, que se tiñen más intensamente

MATERIAL:

Pipeta pasteur estéril

4 tubos con caldo

4 tubos con medio SIM

2 mecheros Asa y portasa Etiquetas o marcador

Cultivos de las siguientes bacterias:

Escherichia coli Bacillus Subtillis Staphylococcus AureusStreptococcus

FaecallisPseudomona

AureginosaStaphylococcus

Epidermis

MÉTODOLOGÍA:

o Limpiar y esterilizar el área de trabajoo Prender los mecheros, ajustar la flama hasta que esta presente un cono azul bien marcado.o Identificar y organizar el material dentro del área de trabajo.o Marcar los tubos con iniciales de la cepa a sembrar y fecha.

a) Siembra en medio líquido:

Transferir asépticamente, con el asa de siembra, una pequeña muestra de los microorganismos, desde el tubo que contiene el material problema al tubo con medio de cultivo estéril. Sumergir el asa en el líquido y agitar para

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desprender y diluir la muestra. Incubar el tubo recién sembrado en estufa, durante 24-48 horas a la temperatura óptima de crecimiento.

b) Siembra en medio semisólido: La siembra en este tipo de medio, que contiene una proporción menor de agar que los medios sólidos y que se envasa en tubos, se lleva a cabo con un hilo de siembra esterilizado, con el cual se toma la muestra. El medio queda inoculado al introducir el hilo en profundidad hasta el fondo del tubo, retirándolo posteriormente por la misma trayectoria utilizada al realizar

Técnicas de estriado:

a) estriado simple: estriado continuo: Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cercas del mechero espera que se enfríe el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera, ahora, toma una placa con agar estéril (donde se vaya a sembrar) y con cuidado de no romper el agar, inocula la muestra en un extremo de la placa y con el asa en posición ligeramente horizontal realiza las estrías (muy juntas), oscilando el asa de siembra sobre la superficie de una porción pequeña del agar; mediante un balanceo sucesivo y rápido de la muñeca.

b) estriado en cuadrantes: la mayor parte del inóculo e descarga en los cuadrantes 1y 2, lo que permite obtener colonias separadas en 3 y 4; Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre un área pequeña de la superficie de la placa con medio, en forma de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para no dañar el medio. Se flamea el asa, se enfría y después de rozar la siembra realizada previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estrías. Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estría. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada, siempre en posición invertida. Mediante esta técnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado número de bacterias.

Guía de observación:

o Observe las características culturales de las colonias formadas para cada sembrado en los diferentes medios de cultivo.

o Describa las observaciones en la tabla correspondiente.o De cada microorganismo hacer un frote y teñir mediante la técnica de gram.o Observe al microscopio describir las características de las diferentes bacterias en estudio en la tabla

correspondiente.o Compare el desarrollo de las bacterias inoculadas en los diferentes medios para anaerobios.o Con base en los resultados obtenidos, indicar cuál bacteria es aerobia, anaerobia, anaerobia facultativa o

microaerofílica.

Aspectos más comunes de las diversas colonias microbianas aisladas sobre medio sólido:

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RESULTADOS:

Tabla de las características de cultivos bacterianos:

CULTURALESBacteria E.

FaecallisStaphylococc

us AureusBacillus Subtillis

Staphylococcus Epidermis

Escherichia coli Pseudomona

Aureginosa1) En medio líquido:

Crecimiento superficial

Anaerobio

facultativo

Anaerobiofacultativo

aerobio anaerobio - -

Opacidad mediana nula mediana nula - -Sedimento grumoso compacto Compacto viscoso - -

2) En medio semi-sólidoForma de la línea de la picadura

Papilar móvil - - -

Papilar móvil Vellosa móvil

3) Colonias en placaMedio Mc Conkey - Sal Manitol - Mc Conkey EMB EMB

Forma Fusiforme - fusiforme - Circular Circular Circular

Elevación Plana - convexa - Convexa Convexa Convexa

Bordes Filamentoso

- Ondulado - Ondulado Ondulado Ondulada

Textura Plana - Membranoso

- Membranoso

membranoso

Butirosa

Color rosado - morado - rojizo morado Metalico

MICROSCÓPICASForma Cocos Cocos Bacilos Cocos Bacilos bacilosAgrupación

Cadenas Racimos En pares y en cadena

Racimos Cadenas Cadenas

Gram Gram + Gram + Gram + Gram + Gram - Gram -

DISCUSIÓN DE RESULTADOS:

Se realizaron 3 técnicas para sembrado de cultivo: en medio líquido (con caldo nutritivo), en medio semi-sólido (medio SIM) y en placa (con estriado simple y en cuadrantes), con 6 diferentes bacterias para después dejar incubar las bacterias.

Una vez incubadas las bacterias se observaron sus características macroscópicas o culturales y sus características microscópicas; Los resultados de estas observaciones realizadas se pueden ver en la tabla anterior, en la que se puede observar que cada una de ellas varía de a cuerdo a sus características específicas de crecimiento en los diferentes medios.

CONCLUSIONES:

Por medio de esta práctica se logró utilizar las técnicas aprendidas durante el transcurso del curso. Se logró aprender a realizar algunos de los métodos que existen para cultivar bacterias y de esta manera observar sus características tanto macroscópicas como microscópicas e interpretación de las mismas, con lo que se observó que para cada bacteria existen características diferentes que son las que las identifican y diferencian de otras bacterias, por lo que de esta manera se le puede llegar a identificar con su correcta siembra y observación para análisis posteriores o simplemente para la identificación de una bacteria en algún medio u organismo.

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BIBLIOGRAFÍA:

Romero Cabello, R. Microbiología y Parasitologìa Humana: Bases etiológicas de las enfermedades infecciosas. Editorial Panamericana, México 2001. 2ºed. Pp.257-429

http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/jolope/GUIONPRACTICAS0506.dochttp://es.wikipedia.org/wiki/http://www.ucm.es/info/mfar/pdfs/GuiaMicro2.pdf

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