UNIVERSITARIOS POTOSINOS 236 JUNIO 20194 ALCÁNTARA, L. PÁGINAS 4 A 10

Recibido: 03.03.2019 I Aceptado: 05.04.2019

Palabras clave: Cáncer, cultivo celular, esferoides, microambiente del tumor (MAT) y tumor.

Cultivo celular 3D como modelopara estudiar el

cáncerLUZ EUGENIA ALCÁNTARA QUINTANAlealcantara@conacyt.mxluz.alcantara@uaslp.mxCÁTEDRA CONACYT ADSCRITA A FACULTAD DE ENFERMERÍA Y NUTRICIÓN, UASLP

JUNIO 2019 236 UNIVERSITARIOS POTOSINOS 5MODELOS 3D PARA ESTUDIAR CÁNCER

El número de publicaciones en mode-

los 3D en la década de 1990 apenas

llegó a 10 por año, en los últimos 10

años el aumento ha sido exponencial,

alcanzando casi 1 000 publicaciones

tan sólo en 2018 (Hoarau_Vechot

et al., 2018). Esto se debe principal-

mente a la aparición de nuevas técni-

cas potenciales y de gran valor en el

contexto de los estudios de interac-

ción tumoral.

Desde sus inicios, en la década de

1970, el cultivo de células en 3D ha

revelado información trascendental so-

bre los mecanismos de la homeostasis

(estabilidad y compensación interna

de un organismo, pese a los cambios

en su entorno. Esto regula el inter-

cambio con el exterior) del tejido y el

cáncer, y ha acelerado la investigación

traslacional (que facilita la transición de

la investigación básica en aplicaciones

clínicas) en biología del cáncer e inge-

niería de tejidos. En este texto tratamos

de proporcionar una visión general de

esta metodología y resaltar los bene-

ficios de los cultivos 3D en el campo

de la expansión de las interacciones

tumor-microambiente tumoral.

¿Qué es un modelo 3D?

Trabajar en 3D implica la formación

de esferoides agregados que pueden

crecer en suspensión, encapsularse

o en la parte superior de una matriz

3D; cada uno tiene sus ventajas y des-

ventajas específicas, como lo señala

Katt et al. (2016): “Los métodos 3D

se pueden dividir en las siguientes

categorías: (i) método de la gota col-

gante; (ii) método de superficie no

adherente y (iii) cultivo en suspen-

sión”, que se detallan a continuación

(Hoarau-Vechot et al., 2018).

Tipos de modelos 3D

Método de la gota colgante

Originalmente fue un método de

microbiología usado para estudiar

bacterias en un ambiente confinado

y controlado. En esta técnica se colo-

can gotas de suspensiones celulares

(conjunto de células aisladas, de agre-

A pesar de los avances registrados en las últimas décadas para el tratamiento del cáncer, éste sigue siendo una de las principales causas de muerte en el mundo, lo cual se debe —en parte— a la complejidad y heterogeneidad de los tumores. El cultivo tridimensional (3D) está motivado por la necesidad de crear modelos celulares que capten mejor las complejidades de la biología del tumor. El modelo 3D ideal eliminaría las diferencias relacionadas con las especies que generalmente se encuentran, permitiendo las pruebas de fármacos directamente en modelos humanos. Es de creciente interés para la comunidad científica estandarizar los modelos 3D óptimos que mejor imiten la especificidad del microambiente del tumor (MAT).

UNIVERSITARIOS POTOSINOS 236 JUNIO 20196 ALCÁNTARA, L. PÁGINAS 4 A 10

gados celulares, de 2 a 100 células,

distribuidos en un medio de cultivo lí-

quido en constante movimiento) en la

parte inferior de la tapa de una placa

de Petri.

La tapa en que las células cuelgan de-

bido a la tensión superficial, se coloca

luego en una placa de Petri que con-

tiene la solución salina tamponada

con fosfato conocida como PBS, para

evitar la deshidratación de las gotas.

Las células se acumulan en la punta

de la gota en la interfaz aire-líquido,

luego se agregan espontáneamen-

te y, finalmente, forman esferoides

(Jorgensen et al., 2014).

El método de la gota colgante no re-

quiere el uso de ninguna sustancia

que pueda afectar negativamente

los esferoides, ya que las células se

adhieren entre sí de manera natural y

no tienen que depender de matrices

(la matriz extracelular se considera

un componente extracelular multi-

funcional fundamental que participa

en la morfología, supervivencia, de-

sarrollo, migración y en las relaciones

inter e intracelulares de un tejido) ni

andamios (soporte para las células,

también actúa como una estación

repetidora para varias moléculas de

señalización). Sin embargo, las gotas

con volúmenes de líquido de más de

50 microlitros (μl) no se adhieren a

la placa de Petri, ya que la tensión de

la superficie del líquido se supera por

gravedad (Jorgensen et al., 2014).

También puede ser un desafío cam-

biar el medio sin molestar al esferoide.

Recientemente, se han utilizado pla-

cas colgantes en lugar de las de placa

de Petri, lo que permite la producción

de un mayor número de esferoides

3D por placa. Las placas colgantes tie-

nen una bandeja inferior llena de un

líquido que mantendrá una atmósfera

húmeda dentro de la placa para evi-

tar la evaporación y el secado. En la

parte superior de la bandeja hay una

placa colgante con orificios de acce-

so donde pueden colocarse muestras

de la suspensión celular para formar

gotas colgantes.

En general, el método de caída col-

gante es bastante simple y consisten-

te, y puede producir un esferoide por

gota para diferentes líneas celulares

(figura 1).

Figura 1.

Técnica 3D utilizada para la creación de esteroides.

a) Método de la gota colgante. Las células se depositan en la tapa de

una placa de Petri, que se voltea sobre otra igual que

contiene PBS.

Dispense la suspensión celular en una gota en la

caja de petri

Voltear la tapa para formar una gota

colgante

Las célulasse agregan

Los esteroidesse forman

Método de la gota colgante

JUNIO 2019 236 UNIVERSITARIOS POTOSINOS 7MODELOS 3D PARA ESTUDIAR CÁNCER

Método de superficie no adherente

Formación espontánea de

esferoides

Sutherland, McCredie e Inch fueron pio-

neros en técnicas de producción de es-

feroides en 1970, al utilizar un modelo

de sistema in vitro 3D para recrear las

complejidades de un tumor multicelular

para estudiar la respuesta de las célu-

las tumorales humanas al efecto de la

radioterapia. En este método, las placas

de fijación ultrabajas (que contienen

una capa de hidrogel unida covalente-

mente que inhibe de forma eficaz la

fijación celular) se usan recubriéndolas

con un sustrato inerte (agar o poli-2-hi-

droxietil metacrilato poli-HEMA, un polí-

mero que forma un hidrogel en agua),

que evita que las células se adhieran a la

superficie de los pozos, lo que las obliga

a agregarse y formar esferoides.

El método fue mejorado por Andrea

Ivasku y colaboradores en 2006, utili-

zando placas de 96 pocillos de fondo

redondo y cónico (es una microplaca

que contiene hidrogel unido de forma

covalente que minimiza la adhesión

celular, la absorción de proteínas, la

activación de enzimas y la activación

celular) para producir de forma eficien-

te esferoides en 3D a partir de células

cancerosas y no cancerosas. Las placas

utilizadas se recubrieron con 0.5 por

ciento de poli-HEMA y se secaron du-

rante tres días antes de agregarles las

células. Se estudiaron diferentes líneas

celulares y cuando las líneas celulares

específicas no pudieron formar esfe-

roides, se añadió 2.5 por ciento de la

membrana basal reconstituida líquida

(capa de matriz extracelular de sostén

y de un pequeño espesor variable que

se encuentra en la base de los tejidos

epiteliales) a las suspensiones. Esto

llevó a la generación de esferoides 3D

compactos dentro de las 24 horas des-

pués de la centrifugación.

También es posible utilizar placas

prerecubiertas comercialmente donde

la superficie del fondo es hidrófila. La

superficie inferior tiene una carga neu-

tra y se une covalentemente (es decir,

compartiendo sus pares de electrones)

a la superficie de un recipiente de po-

liestireno. Este recubrimiento evita la

adherencia de las células a la superficie,

obligándolas a estar en suspensión y,

en consecuencia, a formar esferoides

3D. El recubrimiento es estable, no cito-

tóxico y no degradable.

Figura 2.

Técnica 3D utilizada para la creación de esteroides.b) Método de superficie no adherente. Las células se siembran en una placa de adhesión ultrabaja que evita que se adhieran.

Método de superficie no adherente

Cultivo de células adherentes

Sembrar las células en una placa de

adhesión ultrabaja

Formación espontánea de

esteroides

UNIVERSITARIOS POTOSINOS 236 JUNIO 20198 ALCÁNTARA, L. PÁGINAS 4 A 10

Las técnicas de formación de esferoi-

des espontáneos son fáciles de usar y

permiten un alto rendimiento de esfe-

roides (placas de 96 o 384 pocillos).

El método es relativamente barato

cuando las placas se recubren interna-

mente, pero las placas prerecubiertas

comercialmente pueden ser más ca-

ras. Los esferoides pueden cultivarse

durante un largo periodo de tiempo y

pueden recuperarse después del culti-

vo. Sin embargo, existen algunos desa-

fíos, como el tamaño y la composición

de los esferoides resultantes (los ta-

maños de esferoides pueden ser de-

masiado heterogéneos), la formación

de esferoides a partir de un pequeño

número de células y el establecimien-

to de la proporción correcta de dos

tipos de células diferentes al realizar

cocultivos en los esferoides (figura 2).

Cultivo en suspensión

El principio de este método es colocar

una suspensión celular dentro de un

contenedor y mantener las células en

suspensión por agitación o aumentando

la viscosidad del medio (agregando car-

boximetilcelulosa, un compuesto orgáni-

co derivado de la celulosa, integrado por

grupos carboximetil enlazados a algunos

grupos hidroxilo). En el enfoque basado

en la agitación, el recipiente puede agi-

tarse o rotarse suavemente. La agitación

continua de las células evitará que se

adhieran a las paredes del recipiente y

promoverá su interacción.

Principalmente hay dos aparatos que

se utilizan en el método de cultivo en

suspensión: matraces giratorios y bio-

rreactores. Los primeros son recipien-

tes en los que se coloca la suspensión

celular y un elemento de agitación

que la mantiene en continuo movi-

miento. Este método simple produce

grandes rendimientos de esferoides.

Cambiar el medio de cultivo de los

matraces giratorios es relativamente

fácil; dado que el fluido de cultivo está

en constante movimiento, los nutrien-

tes y el O2 se transportan a los esferoi-

des y pueden eliminar sus desechos.

Sin embargo, la fuerza de cizallamiento

(o corte) aplicada a las células en ma-

traces giratorios, como resultado del

movimiento de la barra de agitación a

través de la suspensión celular, puede

modificar su fisiología celular.

Cultivos de suspensión

Figura 3.

Técnica 3D utilizada para la creación de esteroides.

c) Cultivos de suspensión. Las células se colocan en matraces giratorios

(izquierda) o biorreactores (derecha) y se ponen bajo

fuerzas gravitacionales.

Sembrar células Esteroides Sembrar células

Bior

eact

or

Mat

race

s gira

torio

s

Esteroides

JUNIO 2019 236 UNIVERSITARIOS POTOSINOS 9MODELOS 3D PARA ESTUDIAR CÁNCER

Otro inconveniente del método es la

producción de una amplia gama de

tamaños de esferoides, que pueden

ser un problema cuando se utilizan

para ensayos de detección de drogas,

ya que para éstos se necesita unifor-

midad en el tamaño de los esferoides.

Para abordar esto, los esferoides pue-

den formarse, en un primer paso, uti-

lizando placas de fijación ultrabajas, y

luego pueden transferirse a matraces

giratorios después de seleccionar el

tamaño correcto de esferoides. Esto

es necesario cuando se miden conti-

nuamente los tamaños de esferoides

para determinar los efectos del trata-

miento en su crecimiento.

Por su parte, los biorreactores son si-

milares a los matraces giratorios, pero

en lugar de mezclar la suspensión ce-

lular con una barra de agitación o una

varilla, se gira el recipiente de cultivo.

Fueron diseñados por la Administra-

ción Nacional de Aeronáutica y del Es-

pacio (NASA, por sus siglas en inglés)

en 1992 para cultivar células y tejidos

durante un vuelo espacial.

Los biorreactores están disponibles en

diferentes tamaños para permitir la pro-

ducción de grandes cantidades de esfe-

roides. De manera similar a los matraces

giratorios, los biorreactores no permiten

el control del tamaño de los esferoides,

por lo que puede incluirse un paso

previo para seleccionarlos del mismo

tamaño. Las fuerzas de cizallamiento

aplicadas a las células no son tan signifi-

cativas en los biorreactores como en los

matraces giratorios (figura 3).

¿Que es el microambiente tumoral?

Durante mucho tiempo se observó

que la iniciación, progresión y me-

tástasis (propagación) de un tumor

se debía simplemente a cambios en

la población de células neoplásicas

(es decir, cualquier crecimiento des-

controlado de células o tejidos anor-

males —benignos o malignos— en el

organismo) y los tejidos adyacentes

no neoplásicos se consideraban es-

pectadores. La importancia del mi-

croambiente tumoral surgió de la

observación, cuando se encontraron

cambios en histopatología (exámenes

microscópicos de tejido), en la inter-

faz (comunicación) entre las células

tumorales y los tejidos no neoplásicos

circundantes durante la carcinogéne-

sis (proceso por el cual una célula

sana se convierte en cancerosa).

Ahora se sabe que el microambiente

tumoral es una entidad especializada,

Figura 4.

a) Cultivo 3D utilizado para la creación de esteriodes.b) Esteroides mostrando sus características y su composición celular.

CO2, lactato

Célula cancerosa Sitio de adhesión

Debris celular

Capa exterior

Capa interior y núcleo hipóxico

Organización de diferentes tipos celulares

O2 Factores de crecimientodrogas, citocinas

UNIVERSITARIOS POTOSINOS 236 JUNIO 201910 ALCÁNTARA, L. PÁGINAS 4 A 10

Doctora en ciencias biológicas por la UNAM. Es Catedra Conacyt adscrita a la Facultad de Enfermería y Nutrición de la UASLP. Trabaja en el proyecto “Cultivo celular de células mesenquimales extraídas de diferentes fuentes y su interacción con biomateriales para la aplicación clínica”.

LUZ EUGENIAALCÁNTARA QUINTANA

dinámica, interactiva y en constante

cambio. Comprende diferentes células

que son colectivamente importantes

para la homeostasis (autorregulación)

del tejido normal, así como la progre-

sión del tumor, la migración y la resis-

tencia a la quimioterapia (figura 4).

Entender el cáncer

Para comprender mejor dichos meca-

nismos y desarrollar las estrategias de

bloqueo adecuadas, es necesario utili-

zar modelos complejos apropiados de

cultivo de tumores y microambientes.

Las plataformas de cultivo celular en

3D ayudan a sortear limitaciones, al

preservar la forma original, la polariza-

ción, el perfil genético y la heteroge-

neidad del cáncer y las células estro-

males (son células multipotenciales

primitivas con morfología fibroblastoi-

de, originadas a partir de la capa ger-

minal mesodermal y con la capacidad

de diferenciarse en diversos tejidos).

Además, la evaluación de la eficacia o

el desarrollo de un fármaco requerirá

la medición precisa de la viabilidad y

del metabolismo de las células.

El cultivo celular es una herramienta

indispensable para ayudar a descubrir

procesos fundamentales del cáncer y

nuevas terapias. Está claro que la in-

vestigación ha cambiado la dirección

del cultivo al utilizar estructuras 3D,

con microentornos bioquímicos y bio-

mecánicos más realistas. En general,

es probable que los sistemas 3D ofrez-

can un sustituto cada vez más atractivo

para el cultivo de células, ya que los

avances en el campo producen una

variedad más amplia de métodos.

Un enfoque sensato por ahora sería

combinar el método 3D adaptado de

mejor forma con un cultivo clásico,

para mejorar la selección de nuevas

dianas terapéuticas (una diana tera-

péutica o blanco molecular puede

definirse como el lugar del organismo

donde un fármaco ejerce su acción),

antes de la evaluación preclínica de

quimioterapias.

Su relevancia clínica se debe a que

permitirá comprender los mecanis-

mos que confieren resistencia a las

células cultivadas en esferoides de

cada paciente que se trata, y realizar

una terapia personalizada que impac-

te en su calidad de vida.

Referencias bibliográficas:Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C. y Pasquier, J. (2018).

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